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Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Caracterización molecular de los genes SEP3 y AGL6 de Lacandonia schismatica y Triuris brevistylis T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGO PRESENTA: JOEL HERRERA MARTÍNEZ DIRECTORA DE TESIS: DRA. ADRIANA GARAY ARROYO 2014 Lourdes Texto escrito a máquina Ciudad Universitaria, D. F. UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Para mis padres A la memoria de mi bisabuela Aurelia Cortés Serrano (1926-2014) Para Adriana Garay Para todos los que han sido asesinados Terra autem erat inanis et vacua, et tenebrae super faciem abyssi, et spiritus Dei ferebatur super aquas Genesis 1:2 Hoja de datos Datos del alumno Apellido paterno: Herrera Apellido materno: Martínez Nombre: Joel Universidad: Universidad Nacional Autónoma de México Facultad: Facultad de Ciencias Carrera: Biología Número de cuenta: 410001752 Datos del tutor Grado: Doctora Apellido paterno: Garay Apellido materno: Arroyo Nombre: Adriana Adscripción: Instituto de Ecología, UNAM Datos del sinodal 1 Grado: Doctora Apellido paterno: Vázquez Apellido materno: Santana Nombre: Sonia Adscripción: Facultad de Ciencias, UNAM Datos del sinodal 2 Grado: Doctora Apellido paterno: Sánchez Apellido materno: Jiménez Nombre: Ma. de la Paz Adscripción: Instituto de Ecología, UNAM Datos del sinodal 3 Grado: Doctora Apellido paterno: Álvarez-Buylla Apellido materno: Roces Nombre: María Elena Adscripción: Instituto de Ecología, UNAM Datos del sinodal 4 Grado: Doctora Apellido paterno: Covarrubias Apellido materno: Robles Nombre: Alejandra Alicia Adscripción: Instituto de Biotecnología, UNAM Datos del trabajo escrito Título: Caracterización molecular de los genes SEP3 y AGL6 de Lacandonia schismatica y Triuris brevistylis Fecha: 2014 Páginas: 88 Agradecimientos Esta tesis se realizó bajo la dirección de la Dra. Adriana Garay Arroyo, en el Laboratorio de Genética Molecular, Desarrrollo y Evolución de Plantas del Instituto de Ecología, de la Universidad Nacional Autónoma de México, bajo la coordinación académico-cientí�ca de las Dras. Elena Alvarez-Buylla Roces, Berenice Garcia Ponce de León y Ma. de la Paz Sánchez Jiménez, la ayuda técnica del M. en C. Rigoberto Vicencio Pérez Ruiz y la coordinación administrativa y logística de Diana Romo; así como el apoyo de Laura Rodríguez y la Dra. Teresa Romero, en la preparación de soluciones, medios, y materiales diversos importantes para realizar la investigación de esta tesis. Agradezco la colaboración y apoyo de Juan Cubillos, Dr. Renato Capello, Dr. Juan Estévez y Dra. Alma Piñeyro; de manera especial a la Dra. Laura Adalid y a la Dra. Edda Sciutto del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la UNAM. Estephania Zluhan me proporcionó las ilustraciones de Lacandonia y Triuris. Este trabajo fue apoyado económicamente por el proyecto 167705 del Conacyt: Estudio de los complejos de proteínas MADS-box tipo II en el establecimiento del meristemo y la determinación de los órganos de la �or de Lacandonia schismatica. y por los proyectos CONACyT 180098, 180380, 152649; DGAPA UNAM: IN203214-3, IN203113-3, IN203814-3, IN226510; UC Mexus: ECO-IE415 y ECO-IE416. Apoyo de estancia sabática: 204001. Índice Resumen iii 1. Introducción 1 1.1. Las plantas con �ores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.2. El desarrollo �oral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1.2.1. La familia MADS-box de factores de transcripción . . . . 2 1.2.2. Las bases genéticas del desarrollo �oral . . . . . . . . . . . 4 1.2.2.1. El modelo ABC . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1.2.2.2. El modelo del Cuarteto Floral . . . . . . . . . . 6 1.2.3. Los genes SEPALLATA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.2.4. Los genes AGAMOUS-LIKE6 . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.3. El fenotipo homeótico de Lacandonia . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.3.1. El género Lacandonia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.3.2. El origen ontogenético de las �ores de Lacandonia . . . . 10 1.3.3. La especie Triuris brevistylis . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 2. Hipótesis 12 3. Antecedentes 13 4. Objetivos 14 4.1. Objetivo general . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 4.2. Objetivos particulares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 i 5. Métodos 15 5.1. Búsqueda de ortólogos SEP y AGL6 en el transcriptoma de L. schismatica y T. brevistylis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 5.2. Análisis bioinformático de LsSEP3, TbSEP3, LsAGL6 y TbAGL6 . . 15 5.3. Ampli�cación y clonación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 5.4. Pruebas de transactivación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 6. Resultados y discusión 20 6.1. Identi�cación de ortólogos de SEP3 y AGL6 por medio de un análisis in silico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 6.2. Caracterización molecular de LsSEP3 y TbSEP3 . . . . . . . . . . . 26 6.3. Caracterización molecular de LsAGL6 y TbAGL6 . . . . . . . . . . 29 6.4. Ensayo de transactivación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 7. Conclusiones 36 8. Perspectivas 37 Literatura citada 39 Apéndices 46 A. Posible «splicing» alternativo de LsAG y TbAG 47 B. Base de datos para el análisis �logenético 55 C. Evolución molecular 66 D. Cebadores para LOFSEP 78 ii Resumen De acuerdo con el modelo del Cuarteto Floral, la identidad de los órganos �orales está determinada por diversos complejos proteicos formados a partir de los produc- tos de los genes AP1, AP3, PI, AG, SEP y AGL6; miembros de la familia de factores de transcripción MADS-box tipo II. Cambios en la acumulación de transcritos y duplicaciones en estos genes se han relacionado con la aparición de innovacio- nes morfológicas en diversos grupos de angiospermas. Especí�camente, los genes MADS box tipo II se han caracterizado por su participación en el desarrollo �oral de las angiospermas cuyo arreglo de los verticilos, de afuera hacia adentro es: sépalos, pétalos, estambres y carpelos. Los géneros de monocotiledoneas Lacandonia y Triuris son los únicos conocidos en donde los estambres se sitúan al centro de la �or rodeados por los carpelos. En Lacandonia, este fenotipo es producto de un cambio en el patrón de expresión de LsAP3, gen ortólogo de AP3 de Arabidopsis thaliana; lo cual modi�ca espacialmente la red de interacciones proteicas y, por lo tanto, el desarrollo de los diferentes órganos �orales. En este trabajo se identi�caron y clonaron ortólogos de los genes SEP3 y AGL6 de Lacandonia schismatica y Triuris brevistylis y se identi�caron sitios en estos genes que han sido sujeto de selección diversi�cadora. Adicionalmente se identi�caron dos posibles variantes del ortólogo del gen AG de L. schismatica y de T. brevistylis1. 1Debido a que la caracterización de estas dos isoformas de AG no es parte de los objetivos de la tesis, se decidió incluir estos resultados en el apéndice A iii 1. Introducción 1.1. Las plantas con �ores Las angiospermas o plantas con �or colonizan la mayoría de los hábitats terrestres, son un componente clave de los ecosistemas y constituyen la principal fuente de alimento para los seres humanos. De acuerdo con el registro fósil, las angiospermas diversi�caron durante el Cretácico temprano. Actualmente representanel grupo más amplio de traqueó�tas con cerca de 260 mil especies descritas (Soltis y Soltis, 2004). Algunas de las sinapomorfías que de�nen al grupo de las angiospermas están relacionadas con el desarrollo y la función de las �ores; entre las más importantes se encuentran: la presencia de carpelos con óvulos bitegmicos, la doble fecundación que da lugar al embrión y al endospermo y los estambres con dos pares de sacos polínicos (Frohlich, 2006; Soltis y Soltis, 2004; Specht y Bartlett, 2009). Diversos autores coinciden en describir a la �or como una estructura bisexual compuesta al menos por estambres y carpelos (Frohlich, 2006; Specht y Bartlett, 2009); si bien hay casos de �ores unisexuales, esta condición se considera derivada (Álvarez-Buylla et al., 2010b). Los estambres son los órganos donde se desarrollan los gametos masculinos y los carpelos son los órganos en los que tiene lugar la for- mación de los gametos femeninos y ocurre la fecundación. Además de los estambres y carpelos, las �ores pueden exhibir un perianto compuesto por órganos estériles, generalmente vistosos, involucrados en diversas tareas como la protección de los órganos reproductivos o la atracción de polinizadores. El 75 % de las angiospermas pertenecen al grupo «core eudicots2»; las cuales presentan una arquitectura �oral 2El nombre cientí�co del taxón es Gunneridae. Cantino y colaboradores (2007) lo de�nen como el clado menos inclusivo que incluye a Gunnera perpensa y Helianthus annuus. 1 típica, formada por cuatro verticilos concéntricos integrados, del exterior hacia el interior de la �or, por sépalos, pétalos, estambres y carpelos (Specht y Bartlett, 2009). La �gura 1a representa una �or de A. thaliana, miembro de las «core eudicots», en donde resulta evidente la disposición concéntrica de los órganos de la �or. Los órganos �orales presentan una enorme variación tanto en número como en forma; no obstante esta diversidad morfológica, la posición de un verticilo con respecto a otro, es constante en la mayoría de las angiospermas. Hasta la fecha solo se conocen dos géneros de angiospermass (Lacandonia y Triuris, �guras 1b, 1c y 1d) en donde la posición de los verticilos está alterada (Martínez y Ramos, 1989). 1.2. El desarrollo �oral Durante los últimos veinte años se han logrado avances importantes en desentrañar los mecanismos moleculares que controlan el desarrollo de las �ores. 1.2.1 La familia MADS-box de factores de transcripción es especí�ca de eucariontes y participa en distintos procesos vitales como la respuesta a feromo- nas en levaduras, el desarrollo del músculo cardiaco en animales y el desarrollo �oral en plantas (Álvarez-Buylla et al., 2000; Lawton-Rauh et al., 2000). El término MADS es un acrónimo de los primeros genes de esta familia que fueron identi�ca- dos: MINICHROMOSOME-MAINTENANCE1 en levaduras, AGAMOUS (AG) en A. thaliana, DEFICIENS (DF ), en Antirrinhhum majus y SERUM RESPONSE FACTOR en humanos (Nurrish y Treisman, 1995). A lo largo de la evolución, los genes MADS han sufrido diversos procesos de duplicación y divergencia que han producido una gran variedad de parálogos divididos en diversos clados. A nivel general se reconocen dos linajes principales: la subfamilia de genes MADS-box tipo I y la subfamilia de genes MADS-box tipo II (Álvarez-Buylla et al., 2000). En plantas, los genes MADS tipo II participan en todos los procesos de desa- rrollo conocidos aunque principalmente se les ha estudiado como reguladores del desarrollo �oral. Los MADS tipo II de plantas presentan una estructura modular única, conocida como estructura tipo MIKC (Kaufmann et al., 2005; Figura 2), acrónimo de los distintos dominios que conforman a la proteína: dominio MADS, región «Intervening» , dominio «Keratin-like» y región C (Kaufmann et al., 2005; Lawton-Rauh et al., 2000). En el extremo amino-terminal se localiza el domino 2 (a) Arabidopsis thaliana (b) Lacandonia schismatica (c) Flor femenina de Triuris brevistylis (d) Flor masculina de Triuris brevistylis Figura 1: Diversas morfologías �orales En (a) se representa la �or de Arabidopsis thaliana sin sépalos; en (b) la �or de Lacandonia schismatica y en (c) y (d) las �ores femeninas y masculinas, respectivamente, de Triuris brevistylis. Los pétalos, en A. thaliana, se repre- sentan en blanco; los tépalos, en L. schismatica y T. brevistylis, en gris; los estambres en azul y los carpelos en amarillo. Las ilustraciones son cortesía de Estephania Zluhan y no se encuentran a escala. 3 MADS, de aproximadamente 60 aminoácidos; este es un dominio de unión a ADN altamente conservado en todas las proteínas de la familia (Kaufmann et al., 2005). El dominio MADS junto a la región adyacente I están involucrados en la union de los dímeros a regiones de ADN conocidas como cajas CArG cuya secuencia consenso es CC[A/T]6GG (Kaufmann et al., 2005; Riechmann et al., 1996). Posterior a la región I se localiza el domino K, estructurado por tres α-hélices, encargadas de modular las interacciones proteína-proteína responsables tanto de la formación de dímeros como de tetrámeros proteicos (Fan et al., 1997; Immink et al., 2009; Kaufmann et al., 2005). En el extremo carboxilo-terminal se localiza la región C, una región altamente variable (Lawton-Rauh et al., 2000), cuya función se ha re- lacionado con la estabilización de complejos de proteínas y la capacidad de tener activación transcripcional (Chen et al., 2012; Cho et al., 1999; Immink et al., 2009; Kaufmann et al., 2005; Yang y Jack, 2004). 1.2.2 Las bases genéticas del desarrollo �oral comenzaron a ser descritas, durante los años ochenta, gracias a estudios genéticos llevados a cabo tanto en A. thaliana como en A. majus. En estas especies se identi�caron tres tipos de mutantes homeóticas3, con alteraciones en los órganos de la �or denominadas de clase A, B y C. En los mutantes de clase A, se observa la conversión de sépalos en carpelos en el primer verticilo �oral, mientras que los pétalos del segundo verticilo son reemplazados por estambres (Coen y Meyerowitz, 1991). En el segundo tipo de mutantes, la clase B, el primer verticilo no se ve alterado, pero el segundo verticilo desarrolla sépalos en lugar de pétalos a la vez que el tercer y cuarto vertcilo están ocupados por carpelos (Bowman et al., 1989; Meyerowitz et al., 1989). En las plantas mutantes de clase C, el primer verticilo no se altera, el segundo y tercer verticilo desarrollan petalos y en lugar de los carpelos del cuarto verticilo se desarrollan sepalos y petalos ( Figura 3, Bowman et al., 1989, 1991; Meyerowitz et al., 1991). El modelo ABC del desarrollo �oral se estableció a partir de los fenotipos de las mutantes de clase A, B y C (Coen y Meyerowitz, 1991; Meyerowitz et al., 1991). 1.2.2.1 El modelo ABC postula que la identidad de los órganos �orales está determinada por la acción conjunta de tres funciones génicas. La función A establece la identidad de los sépalos, la función A en conjunto con la función B controlan el 3Una mutación homeótica es aquella que modi�ca la identidad de un órgano. Uno de los ejemplos más conocidos es el mutante antenappedia de Drosophila, en donde se desarrollan patas en lugar de antenas. 4 Interacciones entre proteínas Unión a DNA Dimerización Diversas funciones Figura 2: Estructura modular de una proteína MADS-box tipo II Se esquematizan los diferentes dominios que forman a la proteína además de su función asociada. Las tres α-helices del dominio K, encargadas de modular las interacciones proteína-proteína, se marcan como K1, K2 y K3. Los números representan la posición de los residuos de aminoácidos. Modi�cada de Kaufmann et al. (2005). 5 desarrollo de los pétalos, la función B más la función C determinan la identidad de los estambres y, �nalmente, la función C por sí sola establece la identidad de los carpelos (Bowman et al., 1991; Coen y Meyerowitz, 1991; Meyerowitz et al., 1991). Durante la década de los noventa se clonaron los genes responsables de los fenotipos que se habían asignado a las tres diferentesclases: A, B y C. En A. thaliana la función A se ejecuta mediante la acción de APETALLA1 (AP1) y APETALLA2 (AP2), la función B por los genes APETALLA3 (AP3) y PISTILATA (PI ) y la función C por el gen AG (Bowman et al., 1991; Meyerowitz et al., 1991; Yanofsky et al., 1990; ver �gura 3). Con excepción de AP2, todos los genes del modelo ABC pertenecen a la subfamilia de factores de transcripción MADS-box tipo II (Martínez-Castilla y Álvarez-Buylla, 2003). El modelo ABC ha servido como marco conceptual para numerosos estudios del desarrollo y evolución de la �or y, con excepción de la función A, ha resultado ser válido para todas las angiospermas estudiadas (Bowman et al., 2012); sin embargo, el modelo presenta algunas limitaciones. Por ejemplo, se ha demostrado que la expresión ectópica de los genes A, B y C no modi�can la identidad de órganos vegetativos en órganos �orales como se esperaba. Por lo tanto, estos genes son necesarios pero no su�cientes para la especi�cación de los órganos de la �or (Honma y Goto, 2001; Pelaz et al., 2000). Investigaciones posteriores revelaron que el componente faltante para inducir el desarrollo ectópico de órganos �orales son los genes SEPALLATA (SEP) (Honma y Goto, 2001; Pelaz et al., 2001) que, al igual que la mayoría los genes del modelo ABC, forma parte de los factores de transcripción MADS-box tipo II (Malcomber y Kellogg, 2005; Zahn et al., 2005). Además de su papel en el desarrollo de los órganos �orales, los genes SEP están involucrados en la especi�cación del meristemo �oral (Ditta et al., 2004; Khanday et al., 2013) y se cree que su aparición fue determinante para la evolución de la �or (Malcomber y Kellogg, 2005; Zahn et al., 2005; subsección 1.2.3). Su identi�cación como reguladores de la identidad de los órganos �orales llevó al desarrollo del modelo del Cuarteto Floral (Theißen, 2001). 1.2.2.2 El modelo del Cuarteto Floral se desarrolló como una extensión del modelo ABC que incluye la función de los genes SEP (Theißen, 2001). Este modelo establece que la identidad de los órganos �orales está determinada por complejos tetraméricos, especí�cos para cada órgano, formados a partir de los 6 (a) Arabidopsis thaliana (b) Lacandonia schismatica Figura 3: Genes que participan en el modelo ABC en A. thaliana y L. schismatica En (a) se representan las combinaciones de genes MADS necesarias para el desarrollo de la �or de A. thaliana; en (b) se representan las combinaciones correspondientes para L. schismatica. Las abreviaturas representan sépalos (SE), pétalos (PE), tépalos (TE), estambres (ST) y carpelos (CA). Tomado de Álvarez-Buylla et al. (2010a). 7 productos de los genes de función A, B, C y SEP (Theißen, 2001). De esta manera, en A. thaliana, el complejo AG-SEP-AG-SEP regula el desarrollo de los carpelos, el complejo AP3-PI-AG-SEP especifíca el desarrollo de los estambres y el complejo PI- AP3-AP1-SEP determina el desarrollo de los pétalos (Theißen, 2001). La identidad de los genes encargados de la determinación de los sépalos aún no está bien establecida, aunque existe evidencia de que un complejo PI-SEP-PI-SEP podría ser el involucrado (de Folter et al., 2005; Ditta et al., 2004; Theißen y Saedler, 2001). De acuerdo con la información disponible hasta el momento, las proteínas MADS se unen como dímeros a las cajas CArG localizadas en la región reguladora de sus genes blanco (Fan et al., 1997). Una vez unidos al ADN, esto dímeros son capaces de inducir la formación de asas (Melzer y Theißen, 2009; Mendes et al., 2013) que provocan la interacción física con otros dímeros cercanos para formar un tetrámero o cuarteto (Melzer y Theißen, 2009; Mendes et al., 2013). Los diferentes cuartetos llevarían a cabo la especi�cación de los órganos �orales mediante la regulación transcripcional de genes órgano-especí�cos mediado por la función tanto de los genes SEP como de AP1, puesto que se ha demostrado que éstos poseen capacidad de transactivación (de Folter et al., 2005; Immink et al., 2009; Smaczniak et al., 2012). 1.2.3 Los genesSEP son un clado de genes MADS-box tipo II exclusivos de angiospermas (Malcomber y Kellogg, 2005; Zahn et al., 2005) que se divide en dos subclados: el primero lo conforman los ortólogos de SEP3 y el segundo, que se conoce como clado LOFSEP, se compone de ortólogos de LEAFY HULL STERILE1 (LSH1), Oryza sativa MADS5, FLORAL BINDING PROTEIN9, SEP1, SEP2 y SEP4 (Christensen y Malcomber, 2012; Malcomber y Kellogg, 2005). La función de estos genes se ha asociado a la regulación de la identidad de los órganos �orales y a la determinación del meristemo �oral (Ditta et al., 2004; Honma y Goto, 2001; Immink et al., 2009; Pelaz et al., 2000). Dada la importancia de los genes SEP en el desarrollo �oral, su aparición y diversi�cación es un evento fundamental en la evolución de las plantas con �ores (Malcomber y Kellogg, 2005; Zahn et al., 2005). 1.2.4 Los genes del clado AGAMOUS-LIKE6 (AGL6) son el grupo her- mano de los genes SEP y, a diferencia de éstos, se encuentran presentes tanto en angiospermas como en gimnospermas (Melzer et al., 2010). Los análisis �logenéticos sugieren un origen del clado SEP anterior a la aparición de las angiospermas como 8 resultado de una duplicación AGL6 (Zahn et al., 2005). Este último, y sus ortólgos, se expresan en las estructuras reproductivas de angiospermas y gimnospermas, lo que indíca un papel ancestral en el desarrollo de estos órganos (Theißen y Melzer, 2007; Wang et al., 2010). Los genes AGL6, al igual que los genes SEP, están involucrados en la determinación del meristemo �oral y en el establecimiento de los patrones �orales (Ohmori et al., 2009; Rijpkema et al., 2009); los genes de ambos clados tienen capacidad intrínseca de transactivación (Immink et al., 2009; Ohmori et al., 2009). En algunas angiospermas los genes AGL6 tienen una acumulación de transcritos similar a la de los genes SEP (Rijpkema et al., 2009). Toda esta información tomada en conjunto sugiere cierto grado de redundancia funcional entre los genes SEP y AGL6. Diversas publicaciones han relacionado las duplicaciones genéticas y alteracio- nes en la acumulación de transcritos de los genes del modelo del Cuarteto Floral con cambios e innovaciones morfológicas en las �ores (Álvarez-Buylla et al., 2010a; Bartlett y Specht, 2010; Mondragón-Palomino y Theißen, 2009). Entre los trabajos más resientes que apoyan esta idea se encuentra el de Yockteng et al. (2013) y colaboradores quienes llevaron a cabo estudios �logenéticos y análisis de evolución molecular de los genes SEP y AGL6 de las Zingiberales y concluyeron que los pa- trones de duplicación y diversi�cación de los genes SEP/AGL6 pudieron contribuir en la aparición de novedades morfológicas dentro de este orden de plantas. 1.3. El fenotipo homeótico de Lacandonia 1.3.1 El género Lacandonia, integrado por las especies Lacandonia schis- matica y Lacandonia brasiliana, se caracteriza por el arreglo inusual de sus órganos reproductivos: los estambres se ubican al centro de la �or, rodeados por los carpelos (Martínez y Ramos, 1989; Melo y Alves, 2012; Figura 1b). Lacandonia se encuentra ubicada en la familia Triuridaceae del orden Pandanales; su distribución geográ�ca es limitada; sólo se conocen poblaciones en la selva Lacandona al sureste de México y en el estado brasileño de Paraíba (Martínez y Ramos, 1989; Melo y Alves, 2012). Es una planta pequeña, de no más de nueve centímetros de altura, hialina, á�la y micoheterotró�ca. Crece entre la materia orgánica en descomposición de suelos muy húmedos y poco iluminados (Coello et al., 1993; Márquez-Guzmán et al., 1989; 9 Martínez y Ramos, 1989; Melo y Alves, 2012; Vergara-Silva et al., 2003). Obtiene nutrientes a través de complejas asociaciones simbióticas que involucran a hongos y a otras plantas (Coello et al., 1993; Vergara-Silva et al., 2003). Las �ores de Lacandonia (ver �guras 1b y 3b) son actinomorfas, de cuatro mi- límetros de diámetro, pueden ser solitarias o estar arregladas en in�orescencias racemosas. Presentanseis tépalos deltoides que se fusionan desde la base hasta la parte media (Martínez y Ramos, 1989; Melo y Alves, 2012; Vergara-Silva et al., 2003). Lacandonia �orece todo el año, pero las �ores son más frecuentes después de la temporada de lluvias y la fecundación es por cleistogamia preantesis (Már- quez Guzmán et al., 1993). Actualmente L. schismatica está catalogada como una especie en riesgo de extinción debido a sus distribución geográ�ca restringida y a la destrucción de su hábitat (NOM-059, 2010). 1.3.2 El origen ontogenético de las �ores de Lacandonia ha sido motivo de controversia. La descripción original de Martínez y Ramos (1989) y Márquez- Guzmán et al. (1989) sostiene que Lacandonia posee �ores verdaderas y que la posición heterotópica de sus estambres es producto de una mutación homeótica. En contraposición a esta interpretación, Rudall (2003) propone que las estructuras reproductivas de Lacandonia no son �ores verdaderas, sino in�orescencias muy comprimidas o «pseudanthia», con �ores masculinas apicales y �ores femeninas basales. Esta teoría se sustenta en estudios que colocan a la familia Triuridaceae, a la que pertenece Lacandonia, como taxón hermano de Pandanaceae (Chase et al., 2000), una familia cuyos miembros exhiben estructuras pseudoanthiales (Rudall, 2003). Sin embargo, este criterio no es con�able ya que las relaciones �logenéticas de Triuridaceae aún no se encuentran bien resueltas, tan es así que otros análisis �logenéticos colocan a Triuridaceae como grupo hermano de Velloziaceae o Ste- monaceae, que tienen �ores verdaderas, en lugar de Pandanaceae (Piñeyro-Nelson, 2013). Actualemte, la interpretación más aceptada es la propuesta originalmente por Martínez y Ramos (1989) y Márquez-Guzmán et al. (1989); ésta es apoyada por estudios detallados del desarrollo de las estructuras reproductivas de L. schismatica y T. brevistylis, una especie cercana, no se observó la aborción de órganos ni la torsión secundaria de los carpelos, ambos, hechos que apoyarían la teoría pseudo- anthial (Ambrose et al., 2006; Espinosa-Matías, Silvia et al., 2012; Márquez-Guzmán et al., 1989). Además, Álvarez-Buylla y colaboradores (2010a) demostraron que en 10 Lacandonia, la función B está desplazada hacia el centro de la �or como resultado de una alteración en el patrón de expresión de LsAP3, gen ortólogo de AP3. Como consecuencia de esta alteración, los estambres se desarrollan en el verticilo central a la vez que los carpelos se desarrollan en el verticilo adyacente (ver �gura 3b). 1.3.3 T. brevistylis se distribuye en la selva Lacandona. Es una especie mi- coheterótrofa de 10 a 20 cm de alto; su época de �oración se extiende de agosto a noviembre. Es una especie poligamodioica, tanto las �ores masculinas como las �ores femeninas tienen simetría radial con tres tépalos (Espinosa-Matías, Silvia et al., 2012). Al igual que Lacandonia, el género Triuris está conformado por plantas hialínas y á�las. Las características más conspicuas de las �ores masculinas son los tépalos (6.5-9mm) que tienden a ser más largos que los de las �ores femeninas (1-4 mm) y el andróforo que sostiene a las anteras bitecadas. Pese a ser una especie predominantemente dioica, T. brevistylis presente un reducido número de indivi- duos con �ores hermafroditas, algunas de las cuales exhiben �ores con fenotipos similares a Lacandonia: �ores hermafroditas con estambres centrales rodeados de carpelos (Ambrose et al., 2006; Espinosa-Matías, Silvia et al., 2012; Vergara-Silva et al., 2003). Este hecho permite rastrear el origen del fenotipo de Lacandonia por lo menos hasta antes de la divergencia de estas dos especies (Vergara-Silva et al., 2003). Dada la importancia de los diferentes cuartetos proteicos, mencionados ante- riormente (sección 1.2.2.2), es importante caracterizar los genes que codi�can para estas proteínas tanto en Lacandonia como en Triuris para entender el desarrollo de los diferentes órganos que componen a la �or. Además es razonable suponer que dada la morfología inusual de Lacandonia algunos componentes de los cuartetos, tales como las proteínas que los componen o la a�nidad con las que éstas se unen entre sí, pueden estar modi�cados. Por lo anterior, se propuso en este trabajo la caracterización de los genes SEP y AGL6 de L. schismatica T. brevistylis. 11 2. Hipótesis Las proteínas codi�cadas por los genes SEP y AGL6 de L. schismatica y T. brevistylis presentan modi�caciones en su estructura molecular que son responsables del fenotipo homeótico de Lacandonia y T. brevistylis. 12 3. Antecedentes En el Laboratorio de Genética Molecular, Desarrollo y Evolución de Plantas han sido clonadas las regiones codi�cantes completas de los genes ortólogos de AP3 (LsAP3) y PI (LsPI ), además de la región codi�cante parcial de un ortólogo de AG (LsAG) de L. schismatica (Álvarez-Buylla et al., 2010a). En T. brevistylis se han identi�cado ortólogos de los genes AP3 (TbAP3-1 y TbAP3-2), PI (TbPI) y AG (TbAG) sin que se haya clonado ninguno de éstos (Álvarez-Buylla et al., 2010a; Dolores Fuentes, 2013). Nuestro Laboratorio cuenta con el transcriptoma (no publicado) de tejido �oral del L. schimatica y T. brevistylis. Hasta la fecha no se han identi�cado ortólogos de los genes SEP y AGL6 de ninguna especie de la familia Pandanaceae, incluyendo a L. schismatica y T. brevistylis. 13 4. Objetivos 4.1. Objetivo general Identi�car y caracterizar los ortólogos de SEP y AGL6 de L. schismatica y T. brevistylis. 4.2. Objetivos particulares Identi�car los ortólgos de genes SEP y AGL6 en el transcriptoma de L. schismatica y T. brevistylis. Clonar la región codi�cante de los genes SEP y AGL6 de L. schismatica y T. brevistylis. Caracterización molecular de los genes SEP y AGL6 de L. schismatica y T. brevistylis mediante un análisis comparativo con sus ortólogos en otras monocotiledóneas. 14 5. Métodos 5.1. Búsqueda de ortólogos SEP y AGL6 en el transcriptoma de L. schismatica y T. brevistylis Secuencias similares a los genes SEP y AGL6 se buscaron en el transcriptoma de L. schismatica y T. brevistylis con el que cuenta nuestro laboratorio, utilizando la variante «tblastn» del algoritmo BLAST. Como «query» se utilizaron las secuencias de aminóacidos de las proteínas correspondientes de A. thaliana y Oryza sativa; los números de acceso de estas secuencias se pueden consultar en el apéndice B. Se recuperaron todas las secuencias con valor de e mayor o igual a 1x10−6, se tradujeron con la herramienta «ExPAsy translate» (Gasteiger et al., 2003) y se hizo una búsqueda de secuencias similares en las bases de datos del NCBI. Las secuencias con el mayor porcentaje de similitud (>95 %) con genes SEP o AGL6 se utilizaron en los análisis subsecuentes. 5.2. Análisis bioinformático de LsSEP3, TbSEP3, LsAGL6 y TbAGL6 Con la �nalidad de probar la ortología de las secuencias obtenidas de los transcrip- tomas, éstas se incluyeron en una base datos con secuencias de proteínas SEP, AGL6 y AG de diferentes especies (Dolores Fuentes, 2013; Malcomber y Kellogg, 2005; Yockteng et al., 2013; Zahn et al., 2005). La base de datos fue alineada con el progra- 15 ma «Clustal X» (Larkin et al., 2007). El alineamiento resultante fue editado con la herramienta «Gblocks» (Talavera y Castresana, 2007; http://www.phylogeny.fr) para eliminar regiones alineadas de forma ambigua. Posteriormente se determi- nó el modelo de sustituciones que mejor se ajustara al alineamiento editado y se llevó a cabo un análisis �logenético con un algoritmo de máxima verosimilitud en «MEGA5» (Tamura et al., 2011). Para los análisis de evolución molecular se construyó una base de datos con secuencias de genes SEP3 y AGL6 de diversas fa- milias de monocotiledóneas. Esta base de datos se alineó en el programa «Seaview» (http://doua.prabi.fr/software/seaview) que permite hacer el alineamiento tomando en cuenta la secuencias de aminoácidos, de tal manera que se conservan los tri- pletes una vez alineadas las secuencias. Los números de acceso de las secuencias utilizadasy los alineamientos resultantes se pueden consultar en el apéndice C. El radio (ω) entre sustituciones no sinónimas (β) sobre sinónimas (α) se calculó con el algoritmos «Mixed E�ects Model of Evolution» (MEME) implementado en el sitio Datamonkey.org (Pond y Frost, 2005). Posteriormente, mediante el algoritmo «Property Informed Model of Evolution» (PRIME) del mismo sitio, se determinaron las diferentes propiedades químicas que pueden estar bajo presión selectiva en un determinado sitio. 5.3. Ampli�cación y clonación El tejido vegetal utilizado para este trabajo fue colectado en las localidades chia- panecas de Nahá y San Javier durante la temporada de lluvias del año 2011 por la Dra. Alma Piñeyro y el Biól. Esteban Martínez. Aproximadamente 250 µl de tejido, principalmente �oral, se congelaron en nitrógeno líquido y se maceraron. El ARN se extrajo del tejido macerado con el sistema «RiboPureTM (Ambion®)» y se utilizó para la síntesis de ADNc con la enzima «SuperScrip® II Reverse Transcriptase (InvitrogenTM)» de acuerdo con las especi�caciones del fabricante. La región codi- �cante de cada gen se ampli�có mediante PCR utilizando ADNc como templado. Las condiciones de la PCR y las secuencias de los cebadores se detallan en los cuadros 1 y 2 respectivamente. Los productos de PCR se aislaron a partir de gel de agarosa y se clonaron en el vector pCR®8/GW/TOPO® (InvitrogenTM). En la Unidad Síntesis y Secuenciación de ADN del Instituto de Biotecnología de la UNAM 16 se secuenciaron por lo menos tres clones diferentes de cada gen y se escogieron aquellos que contenían el inserto en la orientación adecuada y no presentaban mutaciones. Cuadro 1: Condiciones utilizadas en la reacción de PCR Ciclos Etapa Temperatura Tiempo 1 Desnaturalización inicial 94 ◦C 1 m 35 Ampli�cación Desnaturalización 94 ◦C 10 s Acoplamiento 60 ◦C 30 s Extensión 72 ◦C 1 m 1 Extensión �nal 72 ◦C 10 m 17 Cuadro 2: Secuencias de los cebadores utilizados en las reacciones de PCR Especie Gen Primer Secuencia (5’-3’) Primer Secuencia (5’-3’) sentido antisentido L. schismatica LsAG_a y b AP3AGF ATGGGVMGGGGGAAGATYG AGR3 TCACCCTARTTGGAGRGCAGTG LsSEP3 TbSEP3F ATGGGGAGGGGCAGGG Primer2 GCCCGGGTGGCTTGCATAAAAA LsAGL6 LsAGL6F ATGGGAAGAGGAAGAGTGG AGL6R CATGGCTGGGTGCTGTGA T. brevistylis TbAG_a y b AP3AGF ATGGGVMGGGGGAAGATYG AGR3 TCACCCTARTTGGAGRGCAGTG TbSEP3 TbSEP3F ATGGGGAGGGGCAGGG TbSEP3R2 YYAGGCGAGCCATCCGGGC TbAGL6 TbAGL6F ATGGGGAGGGGGAGGG AGL6R CATGGCTGGGTGCTGTGA V= A/C/G, M= A/C, Y= C/T, R= A/G 18 5.4. Pruebas de transactivación Para la prueba de transactivación, las clonas seleccionadas se trans�rieron al vector pDEST32 de acuerdo con las especi�caciones del fabricante (InvitrogenTM) y se transfectaron en la cepa de levaduras Y187, según el protocolo reportado por De Folter e Immink (2011). El genotipo de la cepa utilizada se detalla en el cuadro 3. Estas levaduras se sembraron en cajas Petri con medio mínimo SD sin leucina (SD -Leu) o medio mínimo SD sin leucina e histidina (SD -Leu/-His) y se incubaron a 21 grados centígrados por 5 días como máximo. Cuadro 3: Genotipo de la cepa de levaduras Y187 Cepa Genotipo Y187 MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4∆, met–, gal80∆, MEL1, URA3::GAL1UAS -GAL1TATA-lacZ Información tomada de Clontech Laboratories (www.clontech.com) 19 6. Resultados y discusión 6.1. Identi�cación de ortólogos de SEP3 y AGL6 por medio de un análisis in silico En esta sección se establecieron las relaciones evolutivas de las secuencias clonadas para poder determinar su homología con las secuencias SEP y AGL6 reportadas en otras especies. Como resultado de la búsqueda de genes similares a SEP y AGL6 en los transcriptomas de L. schismatica y T. brevistylis, se recuperaron más de 100 secuencias con un valor e4 superior o igual a 1x10−6; si bien los valores de e utiliza- dos son relativamente bajos, la búsqueda fue exhaustiva. Las secuencias obtenidas se tradujeron y fueron utilizadas para llevar a cabo una búsqueda de secuencias similares, ahora en la base de datos del NCBI. De esta manera se eliminaron todas aquellas secuencias que de forma evidente pertenecían a otro clado de genes MADS o incluso a otras familias de genes. En total se identi�caron para L. schismatica un posible ortólogo de SEP3 y uno de AGL6 denominados de aquí en adelante como LsSEP3 y LsAGL6 respectivamente. En T. brevistylis se identi�có un posible ortólogo de SEP3 denominado TbSEP3 y uno de AGL6 nombrado TbAGL6. Las secuencias de nucleótidos de LsSEP3, TbSEP3, LsAGL6 y TbAGL6 y su correspondiente secuencia de aminoácidos se pueden consultar en las �guras 4 y 5 respectivamente. Para comprobar la ortología de las secuencias identi�cadas se construyó un alineamiento con secuencias de aminoácidos de varios genes SEP, AGL6 y AG. Dado que el objetivo de este análisis es identi�car posibles ortólogos de genes SEP y AGL6 4El parámetro e describe el número de resultados que se pueden obtener por azar en una base de datos. 20 Apéndice E Secuencias E.1. Secuencias de LsSEP3 >LsSEP3 ATGGGGAGGGGCAGGGTGGAGCTGAAGAGGATCGAGAACAAGATCAACCGGCAGGTCACC TTCGCCAAGCGCCGGAATGGCCTCCTCAAGAAGGCATACGAGCTCTCCGTCCTCTGCGAC GCCGAGGTCGCCCTCATCATCTTCTCCAACCGGGGAAAGCTCTACGAGTTCTGCTCCAGC CCCAGTATGATGAGAACCCTTGAGAGGTACCAGAAATGCAGCTACAGTGGACCAGAGACA AATTTGCAGATAAGGGAGACACAGCTGATGCAAAGCAGTCACCAAGAGTACCTAAAACTG AAGGCGCGCGTTGAGGCTCTCCAGCGATCACAGAGGAACCTCCTAGGCGAGGACTTGGGC CCGCTGAGCACCAAGGAGCTGGAGCAGCTTGAGAAGCAGCTTGACGCTTCACTGAAGCAA ATAAGATCCACTAGGACACAGTACATGCTGGACCAACTTGCTGATCTGCAGAGGAGGGAA CAAATGCTTACTGAGGCCAACAAAACCCTTCGGAGAAGGTTAGAGGAGAGCAACCAGGCC ACAGCCCAGCAGCAGCAGGTGTGGGAGGCAGCTGCCAATGGCGGCAATGGGATGGACTAC GGACGCCAGCCCCCACAGGCCCAGGCCCAGCAGGCCTTCTTCCACCCCCTGGACTGCCAG CCCACCCTTCAGATTGGGTACCACCAGGACCAGATCTCACTGGCGGCGTCAGCTCCGAGT GTGACCACATACATGCCCGGGTGGCTTGCATAA >LsSEP3 MGRGRVELKRIENKINRQVTFAKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIIFSNRGKLYEFCSS PSMMRTLERYQKCSYSGPETNLQIRETQLMQSSHQEYLKLKARVEALQRSQRNLLGEDLG PLSTKELEQLEKQLDASLKQIRSTRTQYMLDQLADLQRREQMLTEANKTLRRRLEESNQA TAQQQQVWEAAANGGNGMDYGRQPPQAQAQQAFFHPLDCQPTLQIGYHQDQISLAASAPS VTTYMPGWLA* 89 (a) E.2. Secuencias de TbSEP3 >TbSEP3 ATGGGGAGGGGCAGGGTTGAGCTGAAGCGGATCGAGAACAAGATCAACCGGCAGGTCACC TTCGCCAAGCGACGGAACGGACTCCTCAAAAAGGCGTACGAGCTCTCCGTCCTCTGCGAC GCCGAGGTGGCGCTCATCATCTTCTCCAACCGGGGGAAGCTCTACGAATTCTGCTCCAGC CCCAGCATGATGAGAACCCTTGAGAGGTATCAGAAATGCAGCTACAGTGGACCCGAGACG AATTTACAGATAAGGGAGACACAGCTGATGCAAAGTAGCCACCAAGAGTACCTTAAACTC AAGGCGCGCGTTGAGGCTCTCCAGCGGTCACAGAGGAACCTCTTGGGCGAGGATCTGGGC CCGCTGAGCACCAAGGAGCTGGAGCAGTTGGAGAAGCAGCTTGATGCTTCACTGAAGCAA ATAAGATCCACTCGGACACAGTACATGCTGGACCAGCTTGCTGATCTTCAGAGGAGGGAA CAAATGCTTACTGAGGCAAACAAAACTCTTAGGAGAAGGTTAGAGGAGAGCAACCAAGCC ACAGCCCAGCAGCAGCAGGTGTGGGAGGTAGCTGCCAATGGCGGAAGTGGGATGGATTAT GGGCGCCAGCCCCCACAGGCCCAGCCCCAGCAGGCATTCTTCCACCCCCTTGAATGCCAG CCCACCCTTCAGATTGGGTATCACCAGGACCAGATTTCACTGGCGGCTTCGGCTCCGAGT GTGACCACATACATGCCCGGATGGCTCGCCTRR >TbSEP3 MGRGRVELKRIENKINRQVTFAKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIIFSNRGKLYEFCSS PSMMRTLERYQKCSYSGPETNLQIRETQLMQSSHQEYLKLKARVEALQRSQRNLLGEDLG PLSTKELEQLEKQLDASLKQIRSTRTQYMLDQLADLQRREQMLTEANKTLRRRLEESNQA TAQQQQVWEVAANGGSGMDYGRQPPQAQPQQAFFHPLECQPTLQIGYHQDQISLAASAPS TTYMPGWLA* 90 (b) Figura 4: Secuencias de LsSEP3 y TbSEP3 En (a) se muestra la secuencia de nucleótidos de LsSEP3 y su correspondiente secuencia de aminoácidos. En (b), se representan las secuencias de TbSEP3 21 E.3. Secuencias de LsAGL6 >LsAGL6 ATGGGAAGAGGAAGAGTGGAGCTCAAGAGGATCGAGAACAAGATCAACCGCCAAGTCACC TTCTCCAAACGCCGCAACGGCCTCCTCAAGAAAGCATACGAGCTCTCCGTCCTCTGCGAC GCCGAGGTTGCACTCATCATCTTCTCCAGCCGCGGCAAGCTCTACGAGTTCGGCAGCGCC GGCACCAACAAGACCCTTGAGCGATATCAACGCTGCTGCTACTCCTCTCAGGATCTTTCG GTCACTGATCGTGAAACACAGAACTGGTGTCAGGAAGTATCGAAACTAAAGGCGAAATTC GAGTCGTTGCAGCGTACACAGAGGCACCTTCTGGGAGAAGATCTTGGACCACTGAGTGTG AAGGAATTGCTGCAACTGGAGAGGCAACTTGAATTAGCTCTTTCACAAGCCAGGCAAAGG AAGACTCAAATGATGCTGGACCAGATGGAAGAACTCCGGAAGAAAGAACGCCAACTTGGG GACCTTAACAAGCAGCTTAAAGCCAAGCTGGAGGCTGAAGATAGCACTCTCCGCAGCATC CAAGGATCATGGGATTCCAATGGTGTGGTTGCAGGCAACTCATTCCCTTCGCAACCCTCC CATTCGGGTGCCATGGAAGTGGAACCCATATTACAAATTGGGTACCATCACAACTTTATTCACCCTGAAGGAGCCATTACAAGGAATTCTCCTGGGCAGAGCAATTTTGTGCATGGCTGG GTGCTGTGA >LsAGL6 MGRGRVELKRIENKINRQVTFSKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIIFSSRGKLYEFGSA GTNKTLERYQRCCYSSQDLSVTDRETQNWCQEVSKLKAKFESLQRTQRHLLGEDLGPLSV KELLQLERQLELALSQARQRKTQMMLDQMEELRKKERQLGDLNKQLKAKLEAEDSTLRSI QGSWDSNGVVAGNSFPSQPSHSGAMEVEPILQIGYHHNFIHPEGAITRNSPGQSNFVHGW VL* 91 (a) E.4. Secuencias de TbAGL6 >TbAGL6 ATGGGGAGGGGGAGGGTGGAGCTGAAGAGGATCGAGAACAAGATCAACCGGCAGGTGACC TTCTCGAAGCGCCGCAACGGGCTCCTCAAGAAAGCCTACGAGCTCTCCGTCCTCTGCGAC GCCGAGGTCGCACTCATCATCTTCTCCAGCCGAGGCAAGCTCTACGAGTTCGGCAGCGCC GGCACCAACAAGACGCTAGAGCGATATCAGCGTTGTTGCTACTCCTCTCAGGAGCTCACG GTCACCGATCATCATGAAACACAGAACTGGTGTCAAGAAGTATCGAAATTAAAGGCGAGG TTCGAGTCATTGCAGCGTACACAGAGGCACCTGTTGGGAGAAGATCTCGGACCACTGAGT GTGAAGGAATTGCTGCAGCTGGAGAGGCAACTTGAATTAGCTCTTTCCCAAGCCCGGCAA AGGAAGACTCAAATGATGCTGGACCAGATGGAAGAACTGCGGAAGAAAGAACGCCAACTT GGGGACCTTAACAAGCAGCTTAAAGCCAAGCTGGAGGCTGAAGATAGCACTCTCCGCAGC ATCCAAGGAACATGGGATTCCAATGGTGTGGTCTCAGGCAATTCATTCCCTTCTCAACCC TCCCACTCGGGTGCCATGGAAGTGGAACCCGTATTACAAATTGGGTACCATCACCACTTT GTTCATCATGATTCAGCCATTCCAAGGAATTCTCCTGGGCAGAGCAATTTTGTGCATGGC TGGGTGCTGTGA >TbAGL6 MGRGRVELKRIENKINRQVTFSKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIIFSSRGKLYEFGSA GTNKTLERYQRCCYSSQELTVTDHHETQNWCQEVSKLKARFESLQRTQRHLLGEDLGPLS VKELLQLERQLELALSQARQRKTQMMLDQMEELRKKERQLGDLNKQLKAKLEAEDSTLRS IQGTWDSNGVVSGNSFPSQPSHSGAMEVEPVLQIGYHHHFVHHDSAIPRNSPGQSNFVHG WVL* 92 (b) Figura 5: Secuencias de LsAGL6 y TbAGL6 En (a) se muestra la secuencia de nucleótidos de LsAGL6 y su correspondiente secuencia de aminoácidos. En (b), se representan las secuencias de TbAGL6 22 y no hacer una reconstrucción �logenética detallada, se utilizó deliberadamente un número reducido de secuencias para construir el alineamiento. Este alineamiento fue editado en el programa «Gblocks» para eliminar las regiones que no pudieron ser alineadas de forma precisa; se utilizó el programa «MEGA5» para determinar el modelo de sustituciones que mejor describe los datos de nuestro alineamiento. Se escogió el modelo Jones-Taylor-Thornton (Jones et al., 1992). Los árboles iniciales de la reconstrucción �logenética se obtuvieron automáticamente aplicando los algoritmos «Neighbor-Join» y «BioNJ» a una matriz de distancias calculada con el modelo JTT, de estos árboles se eligió aquel con el mayor valor del logaritmo natural de la función de verosimilitud (-3759.9335). Este árbol se ilustra en la �gura 6; el soporte estadístico de cada rama se calculó con 1000 repeticiones de «bootstrap». La topología del árbol recupera tres clados bien soportados que agrupan a las secuencias de genes SEP, AGL6 y AG, respectivamente. El clado que contiene a los ortólogos de SEP3 es mono�lético con un soporte estadístico del 64 %. En este clado se agrupan las secuencias de LsSEP3 y TbSEP3 que forman un sublaclado con otros gene SEP3 de monocotiledóneas. En este análisis �logenético se obtiene un clado LOFSEP poli�lético ya que las secuencias de A. thaliana SEP1, SEP2 y SEP4 se agrupan en un clado que incluye también al clado SEP3, mientras que el resto de las secuencias LOFSEP se agrupan en un clado hermano del anterior. Esta topología contrasta con algunos análisis �logenéticos publicados previamente (Malcomber y Kellogg, 2005; Yockteng et al., 2013) en donde el clado LOFSEP es mono�lético. Este resultado se podría explicar por el reducido número de secuencias utilizadas en nuestro análisis, además de la pérdida de información derivada de la edición del alineamiento. Las secuencias ortólogas de AGL6 se agrupan un clado mono�lético con un soporte del 44 %5. Es importante notar que este clado contiene secuencias tanto de angiospermas como de gimnospermas; cuando sólo se utilizaron las secuencias de angiospermas, el soporte estadístico del clado es de 91 %. Las secuencias de AGL6 de gimnospermas (PrMADS2 y GGM9) se agrupan en un clado (35 %) hermano de las secuencias de AGL6 de angiospermas. Los ortólogos de AGL6 de L. schismatica y T. brevistylis se agrupan en un clado que incluye otras secuencias de monocotiledóneas excepto aquellas de Oryza y Musa. El clado que forman los ortólogos de AGL6 de gimnospermas y angiospermas tiene un 5Al ser un valor inferior al 50 % no se indíca en el árbol �logenético. 23 Magnolia_AGL9 Persea_AGL9 Aquilegia_SEP3 Musa_MADS2 Oryza_OsMADS8 Oryza_OsMADS7 Lacandonia_LsSEP3 Triuris_TbSEP3 Petunia_FBP2 Arabidopsis_SEP3 SEP3 Arabidopsis_SEP1 Arabidopsis_SEP2 Arabidopsis_SEP4 Lilium_MADS3 Asparagus_MADS3 Elaeis_AGL2 Oryza_OsMADS5 Oryzas_LHS1 Pinus_PrMADS2 Gentum_GGM9 Lacandonia_LsAGL6 Triuris_TbAGL6 Crocus_AGL6 Lilium_AGL6 Oryza_OsMADS6 Musa_MADS4 Persea_AGL6 Amborella_AGL6 Magnolia_MgAGL6 Nufar_AGL6 Arabidopsis_AGL6 Arabidopsis_AGL13 AGL6 Gnetum_GGM3 Picea_DAL2 Amborella_AG Antihrrinum_PLE Nufar_AG Arabidopsis_AG Lacandonia_LsAG Triuris_TbAG Asparagus_AVAG1 Oryza_OsMADS3 AG 52 95 92 98 64 98 53 89 98 52 95 91 100 100 98 58 100 0.1 LOFSEP 0.1 Magnolia_AGL9 Persea_AGL9 Aquilegia_SEP3 Musa_MADS2 Oryza_OsMADS8 Oryza_OsMADS7 Lacandonia_LsSEP3 Triuris_TbSEP3 Petunia_FBP2 Arabidopsis_SEP3 SEP3 Arabidopsis_SEP1 Arabidopsis_SEP2 Arabidopsis_SEP4 Lilium_MADS3 Asparagus_MADS3 Elaeis_AGL2 Oryza_OsMADS5 Oryzas_LHS1 Pinus_PrMADS2 Gentum_GGM9 Lacandonia_LsAGL6 Triuris_TbAGL6 Crocus_AGL6 Lilium_AGL6 Oryza_OsMADS6 Musa_MADS4 Persea_AGL6 Amborella_AGL6 Magnolia_MgAGL6 Nufar_AGL6 Arabidopsis_AGL6 Arabidopsis_AGL13 AGL6 Gnetum_GGM3 Picea_DAL2 Amborella_AG Antihrrinum_PLE Nufar_AG Arabidopsis_AG Lacandonia_LsAG Triuris_TbAG Asparagus_AVAG1 Oryza_OsMADS3 AG 52 95 92 98 64 98 53 89 98 52 95 91 100 100 98 58 100 0.1 LOFSEP 0.1 Figura 6: Reconstrucción �logenética de genes MADS Las secuencias correspondientes a L. schisamtica se marcan con `y las correspondientes a T. brevistylis conV. El porcentaje de árboles en los que los taxa asociados se agrupan juntos se muestra en rama, los valores menores al 50 % fueron omitidos. La longitud de las ramas representa el número de sustituciones por sitio. El análisis �logenético se llevó a cabo en MEGA5 (Tamura et al., 2011). 24 soporte menor al 50 %, sin embargo, cuando se consideran solo las secuencias de angiospermas el soporte estadístico es del 91 %. El grupo externo está integrado por ortólogos de AG de angiospermas y gimnospermas. Tanto LsAGL6 como TbAGL6 se agrupan junto a otras secuencias ortólogos de AGL6 de monocotiledóneas (51 %). No obstante la poca resolución de algunos clados observada en del árbol obtenido a partir de nuestro análisis �logenético, podemos concluir que las secuencias denominadas LsSEP3 y TbSEP3 son ortólogos del gen SEP3 de A. thaliana; por su parte los genes LsAGL6 y TbAGL6 son genes ortólogos de AGL6. Sin embargo, con esta metodología no fuimos capaces de identi�car ninguna secuencia del grupo LOFSEP ni de L. schismatica ni de T. brevistylis. Puesto que la búsqueda de secuencias en los transcriptomas fue exhaustiva creemos que es posible que los genes LOFSEP en L. schiscmatica y T. brevistylis tengan niveles de expresión tan bajos que el método de secuenciación utilizado en la elaboración del transcriptoma haya sido incapaz de ampli�car tales secuencias. Por este motivo decidimos intentar ampli�carlos usando cebadores degenerados. Estos cebadores se diseñaron con base en una serie de alineamientos de genes LOFSEP de monoco- tiledóneas que se pueden consultar en la �gura 11 del apéndice D. Dado que la caja MADS esta ampliamente conservada, sólo se diseñaron cebadores antisentido en la región C, las secuencias de éstos se detallan en el cuadro 7 dentro del apéndice D ; como cebadores sentido se utilizaron TbSEP3F y AP3AGF diseñados para la ampli�cación de SEP3, AGL6, PI y AP3. En la mayoría de las reacciones de PCR llevadas a cabo con estos cebadores, no fue posible identi�car una banda clara en el gel de agarosa. En los casos en donde se observaba una banda clara con un tamaño acorde con la longitud promedio de los genes LOFSEP (aproximadamente 750 pb), la banda se puri�có y se mandó secuenciar. La secuenciaciónreveló que los fragmentos ampli�cados correspondían en su mayoría al gen SEP3 o a genes de otras familias. Creemos que la imposibilidad de ampli�car los genes LOFSEP se debe a tres factores: 1) a su bajo nivel de expresión, 2) a que el tejido vegetal del que disponíamos para extraer RNA fue escaso y, 3) a la baja e�ciencia de nuestros ceba- dores, dado que su secuencia es degenerada. Empero; también existe la posibilidad de que estos genes se hayan perdido en la evolución de las Triuridaceae. Dada la redundancia funcional de los genes SEP, es posible suponer que SEP3 sea capaz por si sólo de llevar a cabo las funciones de los genes LOFSEP. Esta hipótesis es poco 25 probable, ya que supondría diversos episodios de pérdida de genes en Triuridaceae, fenómeno inverso a lo observado en las demás angiospermas en donde la tendencia apunta hacia la diversi�cación de este clado (Malcomber y Kellogg, 2005). Se ha demostrado que la �logenia de los genes MIKC se correlaciona bien con la historia evolutiva de las diferentes especies de plantas (Theissen et al., 2000). Especí�camente, las secuencias clonadas tanto de Lacandonia (LsSEP3 y LsAGL6) como de Triuris (TbSEP3 y TbAGL6) se agrupan en el clado de las monocotiledó- neas y están más cercanas �logenéticamente entre sí que con las demás especies. Desafortunadamente no se cuenta con mas secuencias de ortólogos tanto de SEP3 como de AGL6 de otras especies de Pandanales, ya que esta información ayudaría a entender la evolución del desarrollo �oral en esta familia de plantas. 6.2. Caracterización molecular de LsSEP3 y TbSEP3 Las proteínas son secuencias de aminoácidos unidos covalentemente en una se- cuencia especí�ca. El alineamiento múltiple de las proteínas codi�cadas por los genes ortólogos de SEP3 y AGL6 permitió reconocer los dominios especí�cos de las diferentes proteínas; así como, identi�car tanto diferencias puntuales de ami- noácidos como inserciones o remociones de los mismos respecto a los ortólogos de las otras especies. Cada aminoácido tiene una estructura química que de�ne sus propiedades; hay aminoácidos polares y no polares, con carga positiva o negativa, aquellos que se solubilizan en agua y también se pueden clasi�car por su tamaño, volumen, punto isoeléctrico e hidrofobicidad. Estas características de los aminoácidos afectan la estructura tanto secundaria como terciaria, la estabilidad, las propiedades bioquímicas de las proteínas que los contienen y, por lo tanto, su función. En esta sección y la siguiente se analizarán las diferencias encontradas, a nivel de aminoácidos, entre las proteínas codi�cadas por los genes clonados. Se ubicarán las diferencias en cada uno de los dominios (MIKC) y se propondrá cuales de estas modi�caciones podrían estar afectando la estructura secundaria o terciaria de las proteínas y, por lo tanto, la función de las mismas. La región codi�cante de LsSEP3 y TbSEP3 tiene una longitud de 750 pares de bases que codi�can proteínas de 250 residuos de aminoácidos. Existe un 93 % de 26 similitud entre la secuencia de nucleótidos de ambos genes, sin embargo cuando se comparan las secuencias de aminoácidos, éstas sólo di�eren entre sí en tres residuos localizados en las posiciones 190, 196 y 209. El sitio 190 de LsSEP3 está ocupado por un residuo de alanina mientras que TbSEP3 presenta un residuo de valina. Los sitios 196 y 209 están ocupados por asparagina y alanina en LsSEP3 y por serina y prolina en TbSEP3. Tanto alaninia como valina y prolina son aminoácidos no polares o hidrofóbicos mientras que serina y asparagina son aminoácidos polares o hidrofílicos. Por lo tanto, podemos inferir que pese a las diferencias en la estructura primaria de LsSEP3 y TbSEP3, la estructura terciara de éstas es la misma. LsSEP3 y TbSEP3 presentan la estructura modular tipo MIKC característica de los MADS tipo II de plantas; en la �gura 7a se muestra un alineamiento múltiple de proteínas SEP3 de diversas monocotiledóneas entre las que se incluyen a LsSEP3 y TbSEP3. El porcentaje de identidad entre los diferentes sitios del alineamiento fue calculado con la matriz «blosum62» en el programa «Geneious Pro 5.0». En esta �gura se puede observar que, como en todos los genes MADS, las regiones mejor conservadas corresponden a las de los dominios MADS y K. A pesar de que la región C es altamente variable, es posible reconocer dominios característicos en esta región de ciertos clados como AG, PI, SEP3 o AGL6 (Ohmori et al., 2009; Vandenbussche et al., 2003; Zahn et al., 2005). LsSEP3 y TbSEP3 presentan dos motivos, llamados SEP I y SEP II que, de acuerdo con Zahn y colaboradores (2005), son característicos de este clado. El motivo SEP I está constituido por 16 aminoácidos aproximadamente mientras que al dominio SEP II lo componen 14 residuos de aminoácidos aproximadamente; ambos dominios están integrados principalmente por aminoácidos hidrofóbicos. Algunos experimentos han demostrado que la capacidad de transactivación de SEP3 reside en la región C y parte del domino K, ya que OsMADS34, un gen SEP de O. sativa carece de una parte de la región C y es incapaz de inducir la transcripción (Gao et al., 2010). Las proteínas SEP3 a las que se les ha removido la región C y una parte del dominio K tampoco son capaces de inducir la transactivación (Immink et al., 2009). A pesar de que se sabe que la región C de SEP3 es responsable de inducir la transactivación, la función de los dominios SEP I y SEP II aún no está bien establecida. Sin embargo, en AGL6 se ha demostrado que los motivos AGL6 I y AGL6 II, muy parecidos a los motivos SEP I y SEP II ( Figuras 8b y 7b), son capaces 27 de inducir la activación transcripcional de genes reporteros en levaduras (Ohmori et al., 2009). Por lo tanto, es muy probable que la capacidad de transactivación de los genes SEP también se debe en parte a los motivos SEP I y SEP II. En LsSEP3 y TbSEP3 estos motivos soy muy parecidos a los de otras monocotiledóneas y no presentan deleciones o inserciones que permitan suponer alteraciones funcionales. En proteínas que no tienen capacidad de transactivación, los dominios de la región C se han relacionado con la capacidad de modular la formación de tetrámeros proteicos (Lange et al., 2013). Además, se ha propuesto que la región C de los genes MADS puede haber contribuido con la diversi�cación funcional de éstos a lo largo de la evolución (Vandenbussche et al., 2003). Por todos estos motivos decidimos buscar evidencia de selección diversi�cadora tanto en los genes SEP3 como AGL6 de monocotiledóneas, haciendo énfasis en la región C. Para llevar acabo lo anterior, utilizamos un número reducido de secuencias ya que esto disminuye las ambigüedades al alinear regiones muy divergentes, tales como la región C de los genes MADS; además de que el uso de bases de datos pequeñas mejora la detección de sitios bajo selección positiva (Chen y Sun, 2011; Murrell et al., 2012). Decidimos utilizar el algoritmo MEME (Murrell et al., 2012) ya que a diferencia de otros métodos, éste permite que el radio (ω) entre mutaciones no sinónimas (β) y mutaciones sinónimas (α) varíe entre sitios y entre clados, lo que nos permite inferir sitios especí�cos que han estado bajo selección positiva de forma episódica. El algoritmo MEME identi�có 3 codones en donde la proporción de ramas con β>α es signi�cativamente mayor que 0 (p >0.5). Estos codones corresponden a los posiciones 73 (p >0.02), 164 (p >0.02) y 205 (p >0.01) del alineamiento mostrado en la �gura 7b. Los aminoácidos que codi�can estos codones se detallan en la �gura 7c. De estos tres sitios, el 164 es importante puesto que en la mayoría de las secuencias el aminoácido que lo ocupa es cisteína6 pero en L. schismatica y T. brevistylis está ocupado por un residuo de treonina. Los residuos de cisteína son importantes en la estructura terciaria de las proteínas gracias a su capacidad para formar puentes disulfuro con otros residuos de cisteína, por lo que la modi�cación de este aminoácido en Triuridaceae puede provocar alteraciones en la estructuraterciaria de la proteína. Además el residuo 164 se localiza en el domino K de la proteína, conocido por modular la formación de dímeros, indispensables para la 6El mismos sitio está ocupado por un residuo de serina en MADS7 de maíz. 28 función molecular de los genes MADS. Posteriormente, utilizamos el mismo alineamiento para identi�car cuáles pro- piedades de los aminoácidos estaban bajo algún tipo de selección. Para identi�car estos aminoácidos utilizamos el algoritmo PRIME, basado en «Fixed E�ects Like- lihood method» (FEL), pero que a diferencia de éste permite que β dependa no sólo del sitio en cuestión; también depende del residuo que ha reemplazado al anterior. PRIME toma en cuenta cinco propiedades químicas de los aminoácidos: composición química, polaridad, volumen, punto isoeléctrico e hidrofobicidad. Con este método pudimos identi�car que en los sitios 180, 241 y 248, el volumen del residuo de aminoácido está bajo selección negativa y que en los sitios 83 y 202, lo está el punto isoeléctrio. Todos estos sitios se localizan en la región C pero, de forma interesante, ninguno de ellos forma parte de alguno de los motivos característicos de esta región. Tanto el volumen como el punto isoeléctrico son importantes para el plegamiento correcto de las proteínas, por lo que es posible que estos sitios sean importantes para que que la región C adquiera su conformación nativa y lleve a cabo su función. Esta hipótesis se puede probar mediante mutaciones dirigidas a estos sitios y evaluando su efecto en la función de la proteína. Empero, a diferencia de MEME, PRIME no permite que ω varíe de una rama a otra por lo que es muy posible que los sitios bajo selección positiva queden enmascarados. 6.3. Caracterización molecular de LsAGL6 y TbAGL6 LsAGL6 tiene una longitud de 726 pb y codi�ca para una proteína de 242 residuos de aminoácidos, un residuo de histidina menos que TbAGL6. Además de esta diferencia en longitud, estos genes di�eren en la identidad de trece residuos de aminoácidos distribuidos entre las posiciones 78 y 230. En el cuadro 4 se muestran las diferencias entre las proteínas LsAGL6 y TbAGL6. La mayoría de las sustituciones entre LsAGL6 y TbAGL6 podrían no ser de importancia funcional entre las proteínas dado que los per�les de hidrofobicidad entre los residuos de aminoácidos se conservan. Sin embargo, encontramos una diferencia en el sitio 223 (240 en la �gura 8b) de una aminoácido hidrofóbico (prolina) en LsAGL6 por uno hidrofílico (histidina) 29 (a) (b) (c) Figura 7: Alineamiento múltiple de genes SEP3 (a) Alineamiento múltiple de diferentes proteínas SEP3, (b) Detalle de los dominios SEP I y SEP II para las mismas proteínas que en (a), (c) Sitios bajo selección diversi�cadora o en donde alguna característica química está bajo selección negativa. El porcentaje de identidad, calculado con la matriz Blosum62, se representa en escala de grises. Los números indican la posición de los residuos de aminoácidos. 30 en TbAGL6. En otras monocotiledóneas (Figura 8b), este sitio está ocupado por residuos hidrofóbicos o en su caso residuos polares sin carga. El sitio 233 se localiza entre los dominios AGL6 I y AGL6 II, que son dos regiones fundamentales, para que, en un sistema heterólogo, AGL6 pueda inducir la activación transcripcional (Ohmori et al., 2009). Por este motivo el sitio 223 de LsAGL6 es un buen blanco para llevar a cabo experimentos de mutagénesis dirigida. Al igual que con LsSEP3 y TbSEP3, analizamos las secuencias AGL6 en busca de sitios sometidos a selección diversi�cadora con el algoritmo MEME. Los sitios 184, 193, 251 y 257 están bajo selección diversi�cadora en parte debido a la diversi�cación de Poaceae, ya que las secuencias de maíz y arroz son las que acumulan un mayor número de mutaciones no sinónimas (β). Además, se identi�caron diversos sitios en donde el volumen, el punto isoeléctrico o la hidrofobicidad están bajo selección negativa. La lista de estos sitios se puede consultar en la �gura 8c en donde se puede ver que la mayoría de estas secuencias se localizan en la región C, a pesar de que es una región altamente variable. Resulta curioso que ninguno de estos sitios se localice en las zonas más conservadas de la región, los motivos AGL6 I y AGL6 II. En ninguno de los casos en donde se utilizó el algoritmo PRIME fue posible identi�car sitios bajo selección positiva, esto se puede deber en parte a que el algoritmo PRIME está basado en FEL que, como se dijo antes, no permite que el radio ω varíe de una secuencia a otra en un alineamiento dado. Ya que la mayoría de las sustituciones son sinónimas es muy posible que los eventos de selección positiva episódica se vean enmascarados. 31 Cuadro 4: Aminoácidos diferentes entre LsAGL6 y TbAGL6 Gen Posición 78 80 84 85 100 184 192 211 219 221 223 224 225 228 LsAGL6 D S R - K S A I N I P E G T TbAGL6 E T H H R T S V H V H* D S P Ácido aspártico (D), serina (S), arginina (R), lisina (K), alanina (a), isolecuina (I), asparagina (N), prolina (P), ácido glutámico (E), glicina (G), treonina (T), valina (V), histidina (H). El asterisco (*) indica un cambio importante en la hidrofobicidad del residuo. Los número indican la posición de los residuos en un alineamiento de sólo dos secuencias, por este motivo, los número marcados en esta tabla no coinciden con los alineamientos de la �gura 8 . 32 6.4. Ensayo de transactivación De acuerdo con el modelo del Cuarteto Floral, la proteína SEP3 es la encargada de dotar al complejo proteico de la capacidad de inducir la transcripción de los genes blanco. Mediante estudios de dos híbridos en levaduras se ha determinado que tanto SEP3 como los AGL6 de diversas especies, poseen la capacidad de inducir por sí solos la expresión de genes reporteros. Además, se ha identi�cado al domino C como el responsable de llevar a cabo la activación transcripcional (Ohmori et al., 2009). Por este motivo decidimos probar la capacidad de LsSEP3, TbSEP3, LsAGL6 y TbAGL6 para inducir la expresión transcripcional de un gen reportero en la cepa de levaduras Y187. En este caso la expresión del gen reportero permite que la levadura crezca en medio SD -Leu/-His. Como control positivo utilizamos una construcción del gen AGL6 en el vector pDEST32 proporcionada por Dr. Stefan de Folter, que ha probado tener capacidad de transactivación (de Folter et al., 2005). Para comprobar que las levaduras se habían transfectado de forma correcta se utilizó el medio SD/-Leu, que sólo permite el crecimiento de levaduras que contie- nen el vector pDEST32, ya que este plásmido incluye el gen LEU que permite el crecimiento de las levaduras en ausencia de leucina. Todas las levaduras crecieron en medio SD/-LEU, lo cual indíca que tienen el plásmido (datos no mostrados), pero sólo pudimos observar crecimiento en medio SD/-His en las células que expresaban AGL6, resultado que indica activación transcripcional (ver �gura 9). Esto sugiere que ninguna de las proteínas de L. schismatica y T. brevistylis puede activar la transcripción del gen reportero; lo cual contrasta con lo reportado en otras investi- gaciones mediante el uso de la misma técnica. Todas las secuencias probadas poseen un dominio C muy similar a otros genes SEP/AGL6 de monocotiledóneas (Figura 8b) , incluyendo los diferentes motivos localizados en el dominio, por lo que a nivel de estructura primaria de la proteína, no hay evidencia que nos permita suponer que éstas no tienen capacidad de transactivación. Por lo tanto, podemos interpretar este resultado como un posible falso negativo o habría que hacer diferentes experi- mentos para ver si éste es un resultado real. Uno de ellos podría ser el intercambio de dominios con genes en donde se haya visto la capacidad de transactivación para tratar de determinar si hay alguna región de la proteína que esté afectando esta capacidad de activación transcripcional. Finalmente, y de acuerdo con Anna 33 (a) (b) (c) Figura 8: Alineamiento múltiple de genes AGL6 (a) Alineamiento múltiple de proteínas AGL6, (b) Detallede los dominios AGL6 I y AGL6 II, (c) Sitios bajo selección diversi�cadora o en donde el volumen, punto isoeléctrico o hidrofobicidad se encuentran bajo selección negativa. El porcentaje de identidad, calculado con la matriz «Blosum62», se representa en escala de grises. Los números indican la posición de los residuos de aminoácidos. 34 Brückner y colaboradores (2009), existen diferentes causas que pueden explicar un falso negativo en este sistema, entre los cuales podemos mencionar la falta de modi�caciones postrancripcionales en las levaduras, necesarias para el correcto funcionamiento de la proteína, otra posibilidad es que al fusionar los MADS con el dominio de unión a ADN del factor de transcripción GAL4, presente en el vector pDEST32, éste impida el plegamiento nativo de las proteínas. AGL6 TbAGL6 LsAGL6 TbSEP3 LsSEP3 1 1:10 1:100 1:1000 1:10000 Figura 9: Ensayo de transactivación Levaduras después de 5 días de crecimiento en medio SD -His a 21 grados centigrados. Sólo se observa crecimiento de las colonias transfectadas con el gen AGL6 de A. thaliana. Los números indican diluciones consecutivas. 35 7. Conclusiones En L. schismatica se identi�có un ortólogo del gen SEP3 (LsSEP3) y un ortólogo del gen AGL6 (LsAGL6). De igual manera, en T. brevistylis se identi�có un ortólogo de SEP3 (TbSEP3) y uno de AGL6 (TbAGL6). No fue posible identi�car ortólogos de los genes LOFSEP en ninguna de las dos especies. Se clonaron las regiones codi�cantes completas de LsSEP3, TbSEP3, LsAGL6 y TbAGL6. Los genes LsSEP3 y TbSEP3 presentan los motivos SEP I y SEP II en su región C, estos motivos son característicos de los genes del clado SEP3. Tanto LsAGL6 como TbAGL6 presentan en su región C los motivos AGL6 I y AGL6 II, característicos de los genes del clado AGL6. Se identi�caron, tanto en AGL6 como en SEP3, diversos sitios sujetos a selección diversi�cadora a lo largo de la evolución de las monocotiledóneas. Las proteínas LsSEP3, TbSEP3, LsAGL6 y TbAGL6 no tienen capacidad de activar la transcripción, al menos en nuestro ensayo en levaduras. 36 8. Perspectivas Recientemente se ha logrado la cristalización del domino K de SEP3 (Acajjaoui y Zubieta, 2013) y se ha descrito de que manera se unen a sus respectivas cajas CArG los distintos genes SEP de A. thaliana (Jetha et al., 2014). Esta información ayudará a explicar cómo es que los distintos complejos proteicos modulan la expresión de sus genes blanco y en última instancia, controlan el desarrollo de los órganos de la �or. No obstante la gran cantidad de trabajos relacionados con el desarrollo de la �or en especies modelo, como Arabidopsis, arroz y maíz, la información disponible de organismos no modelo es muy limitada, di�cultando los estudios de biología comparada y evidenciando la importancia de la investigación en plantas como Lacandonia y Triuris. Además, con los resultados obtenidos en esta tesis no es posible aceptar, o en su caso rechazar, nuestra hipótesis; por este motivo hemos planteado una serie de objetivos a alcanzar en etapas posteriores de este trabajo: Identi�car y clonar los genes LOFSEP de L. schismatica y T. brevistylis o, en su caso, comprobar que éstos se han perdido durante la evolución de Triuridaceae. Realizar ensayos de complementación con LsSEP3/TbSEP3 y LsAGL6/TbAGL6 en líneas mutantes de sep3 y agl6 de Arabidopsis, para determinar si son funcionalmente equivalentes. Comprobar si los ortólogos de SEP3 y AGL6 de T. brevistylis y L. schismatica tienen o no la capacidad de activar la transcripción de sus genes blanco. Realizar ensayos de dos y tres híbridos en levaduras para describir los dife- rentes complejos proteicos que, de acuerdo con el modelo del Cuarteto Floral, 37 controlan el desarrollo de los órganos �orales. Hacer mutaciones dirigidas en los sitios en los que haya selección diversi�- cadora y determinar, mediante ensayos de dos y tres híbridos, si cambian las interacciones proteicas. 38 Literatura citada Acajjaoui, S. y Zubieta, C. (2013). Crystallization studies of the keratin-like domain from Arabidopsis thaliana SEPALLATA 3. Acta crystallographica. Section F, Structural biology and crystallization communications, 69(Pt 9), 997–1000. Álvarez-Buylla, E. 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