Caracterizacion-molecular-de-streptomyces-mobaraensis

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
 DE MÉXICO 
 FACULTAD DE CIENCIAS 
 
 
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE 
STREPTOMYCES MOBARAENSIS 
 
 
 
 
 
 
 
 T E S I S 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 BIÓLOGA 
 P R E S E N T A : 
 
SOFÍA NATALÍ MENDOZA CABRERA 
 
 
 
 
 
 
 
DIRECTOR DE TESIS: 
DOCTOR LORENZO PATRICK SEGOVIA 
FORCELLA 
Ciudad Universitaria, Ciudad de México, 2017 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
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CONTENIDO 
 
PORTADA…………………………………………………………………………………………..1 
CONTENIDO………………………………………………………………………………………..2 
AGRADECIMIENTOS……………………………………………………………………………..4 
RESUMEN…………………….……………………………………………………………………5 
ABSTRACT…………………….…………………………………………………………………..6 
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………..7 
16SrRNA: una herramienta muy útil para la clasificación bacteriana………………………..7 
Streptomycetes: bacterias de complejidad morfológica con gran potencial de producción 
de antibióticos ……………………………………………………………………..………………9 
Streptomyces mobaraensis y la producción del péptido antibiótico ciclotiazomicina……..10 
Genes bld y whi: implicaciones en el desarrollo de Streptomyces………………………….13 
Pregunta de Investigación……………………………………………………………………….15 
Hipótesis…………………………………………………………………………………………..15 
Objetivo general…………………………………………………………………………………..16 
Objetivos particulares…………………………………………………………………………….16 
MÉTODO…………………………………………………………………………………………..16 
Cultivo de S.mobaraensis ATCC29032 y B.cereus ATCC14579……………………………………16 
Extracción de ADN genómico de S. mobaraensis y Bacillus cereus ……………..……..…16 
Amplificación del gen 16S rRNA………………………………………………………………..17 
Diseño de oligonucleótidos para amplificar los genes marcadores: ciclotiazomicina, bldA, 
whig y whib………..……………………………….................................................................18 
Purificación y electroforesis de los productos de PCR……………………………………….19 
Secuenciación de los amplicones y análisis de las secuencias mediante BLAST: Basic 
Local Alignment Search Tool …………………………………………………………………...20 
RESULTADOS…….……………………………………………………………………………..22 
Extracción de ADN genómico de S.mobaraensis y de B.cereus ATCC1457………………22 
Coincidencias al buscar los genes marcadores en la base de datos de NCBI…………….23 
Amplificación del gen 16S rRNA……………………………………………….. .…………….25 
Amplificación del gen ciclotiazomicina………………………………………………………….27 
Amplificación del gen bldA.………………………………………………………………………28 
Amplificación de los genes whig y whib………………………………………………………..28 
Secuenciación de los genes marcadores………………………………………………………30 
Análisis de las secuencias mediante BLAST………………………………………………….32 
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Discusión…………………………………………………………………………………………..33 
Conclusiones..…………………………………………………………………………………….35 
BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………………..36 
ANEXOS…………………………………………………………………………………………..38 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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AGRADECIMIENTOS 
 
Le agradezco muchísimo al Doctor Lorenzo Segovia por haberme permitido ser parte de 
su laboratorio, por sus consejos, su contribución a mi aprendizaje, su paciencia y el gran 
apoyo que siempre me dio. 
A mis sinodales Rodrigo, Saúl, César y Vanessa les agradezco muchísimo toda su ayuda, 
su tiempo y sus correcciones en el escrito de la tesis. 
A la Doctora Claudia Martínez por sus opiniones en las exposiciones del proyecto y por 
sus consultas sobre la realización de los experimentos. 
Al Doctor José Luis Puente por su apoyo en todos los trámites necesarios para la titula-
ción y por sus enseñanzas. 
A la Maestra en Ciencias Blanca Ramos le doy las gracias por sus consejos, por su cono-
cimiento que me transmitió y por su gran ayuda en la realización de los experimentos de 
ésta tesis. A la M.C. Iris Bravo le agradezco sus enseñanzas y sus correcciones en la ela-
boración de ésta tesis. A ambas les agradezco el intercambio de ideas y sus discusiones 
enriquecedoras. 
A Karel Estrada Guerra le agradezco su apoyo en la parte de bioinformática y a la Dra. 
Mabel Rodríguez por sus consejos en la planeación de los experimentos. 
A todos los miembros del laboratorio gracias por su amistad, su ayuda y por tantos mo-
mentos cómicos que vivimos. 
A Grillo por su gran amistad, siempre estarás en mi corazón. 
A mi familia por su apoyo incondicional. 
Gracias a mis amigos de la Facultad de Ciencias, sobre todo a Esmeralda, Ángel y Edson 
que siempre han estado conmigo en las buenas y en las malas, en las locuras y en las 
prácticas de campo que eran toda un aventura. Y a Aarón, quien me abandonó en Cien-
cias para seguir otro destino pero al que también aprecio mucho y lo considero un gran 
amigo. Valoro mucho su amistad, le han dado a mi vida grandes momentos de felicidad, 
son personas increíbles. 
Y sobre todo quiero darle las gracias a mi mamá que siempre me ha apoyado en todas 
mis locuras y me ha dado la fortaleza para seguir adelante, te quiero mucho. 
 
 
 
 
 
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RESUMEN 
 
La secuenciación del gen 16S rRNA bacteriano resulta muy útil para llevar a cabo clasifi-
caciones taxonómicas, debido a su naturaleza conservativa y a su distribución universal. 
En este proyecto se realizó la identificación de la bacteria Streptomyces mobaraensis me-
diante el análisis de la secuencia del gen ribosomal 16S. 
S. mobaraensis pertenece al filo de las Actinobacterias. Se trata de una bacteria gram 
positiva miceliar aeróbica que habita en ambientes terrestres mesófilos. La importancia de 
ésta bacteria radica en su potencial de producción de un antibiótico llamado ciclotiazomi-
cina, el cual se ubica dentro de la familia de los péptidos antibióticos denominados tiopép-
tidos, una clase emergente de antibióticos que surgen a partir de cascadas de modifica-
ciones postraduccionales en péptidos sintetizados ribosomalmente. La ciclotiazomicina 
podría tener aplicaciones prometedoras al poseer actividad antifúngica e inhibitoria de la 
enzima renina que se encuentra asociada con hipertensión. Sin embargo, aún no ha sido 
llevado a pruebas clínicas debido a su baja solubilidad como es el caso de la mayoría de 
los tiopéptidos. 
El cultivo de S.mobaraensis resulta fundamental para el estudio de este péptido antibióti-
co. Sin embargo, se ha visto interferido por la contaminación con otras especies bacteria-
nas en el laboratorio. En el presente trabajo se hizo uso de la secuenciación del gen 16S 
rRNA, del gen ciclotiazomicina y de una serie de genes marcadores de Actinobacterias ( 
bldA, whig y whib), con el objetivo de desarrollar un método rápido de identificación de 
ésta especie en caso de contaminación. 
La secuenciación del gen 16S rRNA permitió llevar a cabo una eficaz identificación de 
S.mobaraensis. Sin embargo, no logró discernir a la cepa bacteriana que se utilizó en este 
proyecto, la cual resulta esencial identificar puesto que se trata de la cepa productora del 
antibiótico ciclotiazomicina. 
El gen ciclotiazomicina, constituye el único gen utilizado en este proyecto que nos permi-
te identificar la cepa al ser un gen verdaderamente exclusivo de S.mobaraensis 
ATCC29032. La amplificación de este gen abre paso a la realización de numerosasinves-
tigaciones en el laboratorio sobre este péptido antibiótico, en su mayoría estudios sobre 
relaciones estructura-función. 
 Asimismo, se vio que los genes característicos de Actinobacterias: bldA, whig, y whib 
podrían fungir como marcadores de S.mobaraensis, ya que aunque se encuentran am-
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pliamente distribuidos en varias especies de Streptomyces, la amplificación, secuencia-
ción y posterior análisis en la base de datos de BLAST de estos genes nos mostró que los 
alineamientos más significativos eran con S.mobaraensis y no con las otras especies, lo 
cual nos demuestra su utilidad para llevar a cabo la identificación de ésta bacteria en par-
ticular. 
ABSTRACT 
The sequencing of the bacterial 16S rRNA gene is very useful to carry out taxonomic clas-
sifications, due to its conservative nature and its universal distribution. In this project, the 
identification of the Streptomyces mobaraensis bacteria was carried out by analyzing the 
16S ribosomal gene sequence. 
S. mobaraensis belongs to the phylum Actinobacteria. It is an aerobic mycelial gram posi-
tive bacterium that lives in mesophilic terrestrial environments. The importance of this bac-
terium lies in its production potential of an antibiotic called cyclothiazomycin, which is lo-
cated within the family of antibiotic peptides called thipeptides, an emerging class of anti-
biotics that arise from cascades of post-translational modifications in peptides synthesized 
ribosomally. Cyclothiazomycin could have promising applications by having antifungal and 
inhibitory activity of the renin enzyme that is associated with hypertension. However, it has 
not yet been taken to clinical trials due to its low solubility as is the case with most of the 
thiopeptides. 
The culture of S.mobaraensis is fundamental for the study of this antibiotic peptide. How-
ever, it has been interfered by contamination with other bacterial species in the laboratory. 
Therefore, in the present work, sequencing of the 16S rRNA gene, the cyclothiazomycin 
gene and a series of Actinobacteria marker genes (bldA, whig and whib) was used, with 
the aim of developing a rapid identification method of this species in case of contamina-
tion. 
Sequencing of the 16S rRNA gene allowed to carry out an efficient identification of 
S.mobaraensis. However, it failed to discern the bacterial strain used in this project, which 
is essential to identify since it is the production strain of the antibiotic cyclothiazomycin. 
The cyclothiazomycin gene is the only gene used in this project that allows us to identify 
the strain since it is a truly exclusive gene of S.mobaraensis ATCC29032. The amplifica-
tion of this gene opens the way for numerous laboratory investigations on this antibiotic 
peptide, mostly studies on structure-function relationships. 
 Likewise, it was found that the characteristic genes of Actinobacteria: bldA, whig, and 
whib could act as markers of S.mobaraensis, since although they are widely distributed in 
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several Streptomyces species, the amplification, sequencing and subsequent analysis in 
the BLAST database of these genes showed us that the most significant alignments were 
with S.mobaraensis and not with the other species, which shows its usefulness to carry out 
the identification of this particular bacterium. 
 
INTRODUCCIÓN 
Secuenciación del gen 16S rRNA: una herramienta muy útil para la clasificación 
bacteriana 
En un principio, las clasificaciones bacterianas se realizaban basándose en similitudes 
morfológicas y en aspectos nutricionales. Sin embargo, la secuenciación del gen 16S 
rRNA, que proporciona análisis filogenéticos y taxonómicos detallados ha tenido un gran 
auge debido a su naturaleza conservativa y a su distribución universal (Lane et al.1985). 
La secuencia del gen 16S rRNA ribosomal tiene alrededor de 1,550 pares de bases y se 
compone de regiones variables y conservadas en todas las bacterias (Clarridge, 2004). 
Las regiones conservadas han sido alineadas y usadas para buscar oligonucleótidos uni-
versales 16S, los cuales sirven para amplificar el gen ribosomal 16S de todas las especies 
bacterianas (Baker et al., 2003; McCabe et al., 1999). En la Tabla 1 se muestran los oli-
gonucleótidos universales más empleados para amplificar el gen 16S rRNA. 
 
Tabla 1. Secuencias (5´-3´) de los oligonucleótidos universales forward y reverse 
más utilizados para amplificar el gen 16S rRNA. 
OLIGONUCLEÓTIDO SECUENCIA 5´-3´ REFERENCIA 
8Forward AGAGTTTGATCCTGGCTCAG Turner et al. 1999 
27Forward AGAGTTTGATCMTGGCTCAG Lane et al. 1991 
1391Reverse GACGGGCGGTGTGTRCA Turner et al. 1999 
1492Reverse GGTTACCTTCTTACGACTT Turner et al. 1999 
 
Las regiones hipervariables del gen 16S rRNA son las que nos permiten clasificar a las 
bacterias. Se han descrito 9 regiones hipervariables (V1-V9) que demuestran una consi-
derable diversidad en la secuencia entre diferentes bacterias (Chakravorty, et al. 2007). 
Las nueve regiones hipervariables abarcan los nucleótidos 69-99 (V1), 137-242 (V2), 433-
497 (V3), 576-682 (V4), 822-879 (V5), 986-1043 (V6), 1117-1173 (V7), 1243-1294 (V8) y 
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1435-1465 (V9) (numeración basada en el sistema de nomenclatura de E.coli) (Brosius et 
al., 1978) (Tabla 2). 
 
Tabla 2: Regiones hipervariables (V1-V9) del gen 16S rRNA de E.coli con su respec-
tiva posición nucleotídica y el número de pares de bases que abarca cada región 
hipervariable (Brosius et al., 1978). 
REGIÓN POSICIÓN # DE PARES DE BASES 
V1 69-99 30 
V2 137-242 105 
V3 338-533 195 
V4 576-682 106 
V5 822-879 57 
V6 967-1046 79 
V7 1117-1173 56 
V8 1243-1294 51 
V9 1435-1465 30 
 
 
El primer reporte sobre el uso potencial de la secuenciación del gen 16S rRNA en clasifi-
caciones taxonómicas y filogenéticas se remonta a las investigaciones llevadas a cabo 
por Dubnau et al. en 1965 sobre las relaciones de conservación de la secuencia del gen 
16S rRNA en diferentes especies de Bacillus. Sin embargo, el uso generalizado de este 
gen fue impulsado gracias a la labor pionera de Woese, quien hizo notar el papel de ésta 
secuencia génica como un cronómetro molecular (Clarridge, J. et al. 2004, Woese, 1987). 
La secuencia del gen 16S rRNA ha sido determinada para un largo número de cepas bac-
terianas y las secuencias nucleotídicas se encuentran anotadas en numerosas bases de 
datos como GenBank. Esto nos ha permitido tener a la disposición numerosas secuencias 
bacterianas del gen 16S rRNA contra las cuales se puede comparar la secuencia de una 
cepa desconocida para llevar a cabo identificaciones bacterianas (Clarridge, J. et al. 
2004). 
 
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Streptomycetes: bacterias de complejidad morfológica con gran potencial de pro-
ducción de antibióticos 
 
Los Streptomycetes son parte de las Actinobacterias, una clase de bacterias Gram positi-
vas con gran diversidad morfológica. Comparaciones de la secuencia del gen 16S rRNA 
muestran que el último ancestro en común de las Actinobacterias vivió hace 1.5-2 billones 
de años y se piensa que los Streptomycetes se originaron hace 440 millones de años, 
después de la invasión de la tierra por las plantas y el rápido incremento de oxígeno en la 
atmósfera (Embley & Stackebrandt, 1994). 
Los Streptomycetes se encuentran entre las bacterias más complejas morfológicamente 
hablando puesto que forman un micelio vegetativo y mediante el uso de varias enzimas 
hidrolíticas extracelulares extraen los nutrientes del suelo. Para la dispersión de Strepto-
myces, las esporas son formadas en estructuras reproductivas especializadas llamadas 
hifas aéreas, las cuales emergen desde la superficie de la colonia (Chater & Losick, 
1997), formando compartimientos de 100 mm de largo que contienen varias copias del 
genoma. Cuando esos compartimientos detienen su crecimiento, son sometidos a septa-
ciones múltiples para dar lugar a una cadena de compartimientos unigenómicos que acu-
mulan un pigmentoconforme se van convirtiendo en cadenas de esporas maduras 
(Chandra y Chater, 2014). 
Los Streptomycetes son conocidos por su habilidad de producir antibióticos clínicamente 
importantes y su complejidad morfológica está ligada a su extraordinaria habilidad para 
producir diversos metabolitos secundarios (Chater, 2011; Liu et al., 2013). 
Dentro de los Streptomycetes se encuentra una bacteria llamada Streptomyces mobara-
ensis. S. mobaraensis ATCC29032 es una bacteria Gram positiva miceliar aeróbica que 
habita en ambientes terrestres mesófilos cuyo genoma tiene una longitud total de 7.47 Mb 
y un alto contenido de GC: 73.3% (https://www.ncbi.nlm.nih.gov). La importancia del estu-
dio de ésta bacteria radica en la capacidad de ésta cepa bacteriana de producir un pépti-
do antibiótico denominado ciclotiazomicina, el cual constituye un gen marcador clave de 
S.mobaraensis. Con gen marcador me refiero a una secuencia de ADN específico cuya 
localización exacta ha sido identificada en el cromosoma y cuya herencia puede ser ras-
treada para separar células, individuos, poblaciones o especies (National Human Genome 
Research Institute: https://www.genome.gov). 
 
 
https://www.genome.gov/
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Streptomyces mobaraensis y la producción del péptido antibiótico ciclotiazomicina 
 
La ciclotiazomicina se agrupa dentro de la familia de péptidos antibióticos denominados 
tiopéptidos. Los tiopéptidos son una clase de antibióticos que surgen a partir de modifica-
ciones postraduccionales en péptidos sintetizados ribosomalmente (Walsh, et al. 2010). 
Se trata de antibióticos ricos en sulfuro altamente modificados que tienen arquitecturas 
muy particulares y modos de acción inusuales, cuya principal característica es un anillo 
central de piridina, tetrapiridina o dehidropiperidina que posee hasta 3 sustituyentes tiazo-
les (Wang et al. 2010; Barnizo et al. 2014). 
Son producidos por muchas bacterias Gram-positivas que habitan en el suelo, aunque 
recientemente en Japón se aisló un tiopéptido de una muestra de esponja marina produ-
cido por B.cereus QN03323 con potente actividad antibacteriana contra Staphylococcus 
aureus, bacteria patógena causante de infecciones cutáneas y de las mucosas (Baringo 
et al.2014; Nagai et al. 2003). 
Se ha visto que los tiopéptidos poseen una gran actividad contra varios patógenos resis-
tentes como son Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), Streptococcus 
pneumoniae resistente a penicilina (PRSP) y Enterococcus resistente a vancomicina 
(VRE) (Bagley et al., 2005). Representan una clase emergente de compuestos antimicro-
bianos prometedores. Sin embargo, debido a su baja solubilidad aún no han tenido la 
aplicación clínica deseada y hasta la fecha existen solamente 2 tiopétidos que se encuen-
tran en el mercado: tiostreptón y nosihéptido, los cuales se encuentran restringidos para 
uso veterinario como pomada para infecciones de la piel de perros y gatos y únicamente 
existe un tiopétido llamado GE2270 que se encuentra en pruebas clínicas para tratar el 
acné (Baringo et al., 2014). 
El modo de acción de los tiopéptidos radica en su unión a la subunidad 50S ribosomal 
que corresponde a la región de unión del factor de elongación Ef-G, lo cual no permite 
que ocurra la translocación del tRNA en el ribosoma. También se ha visto que se pueden 
unir directamente al factor de elongación Ef-Tu bloqueando su capacidad de chaperona 
de llevar los tRNAs al ribosoma (Walsh et al. 2010). 
 
Recientemente se ha encontrado que algunos tiopéptidos tienen actividad antiproliferativa 
en células cancerígenas humanas, como son tiostreptón y siomicina A ,los cuales tienen 
una actividad inhibitoria del proteosoma y del factor de transcripción FoxM1 (forkhead box 
M1), un activador transcripcional involucrado en la proliferación celular (Bhat et al. 2009). 
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Existen alrededor de 100 miembros de la familia de péptidos antibióticos tiazolil que se 
han aislado hasta la fecha (Bagley, 2005), siendo el primero de ellos la micrococcina, 
descubierta en 1948. De entre los antibióticos tiopéptidos más comunes se encuentran 
tiostrepton aislado de Streptomyces laurentii, tiocilina aislado de Bacillus cereus, nosihép-
tido aislado de S. actuosus, berninamicina aislado de S.bernensis, ciclotiazomicina 
aislado de S.hygrosopicus y GE2270A obtenido a partir de Planobispora rosea (Walsh, et 
al. 2010) (Figura 1). 
 
Figura 1. Estructuras moleculares de antibióticos tiopéptidos: A. tiocilina B. 
tiostreptón C. tiocilina D. nosihéptido E. bernamicina F. GE2270A G.ciclotiazomicina 
(Walsh, et al. 2010). 
 
El tiopéptido ciclotiazomicina producido por S.mobaraensis posee una estructura macrocí-
clica única derivada de un péptido estructural de 18 aminoácidos (Young et al. 2011; 
Zhang et al. 2014). 
El cluster de genes de 22.7 kb que codifica para la ciclotiazomicina ha sido ampliamente 
estudiando en S. Hygroscopicus. Se ha visto que existen 15 ORFs que cubren todos los 
genes funcionales requeridos para la producción del antibiótico. De entre ellos, existen 6 
genes: cltBCDEFG, que flanquean el gen estructural cltA y que codifican para las enzimas 
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requeridas para la modificación postraduccional del prepéptido y para la formación del 
antibiótico maduro (Wang et al. 2010). 
 
La estructura de este péptido antibiótico fue dilucidada mediante experimentos de degra-
dación y análisis espectroscópicos (Wang et al. 2010). Contiene una dehidroserina, 2 re-
siduos dehidrotreonina, tres tiazolinos, tres tiazoles y una piridina. Al comparar a la ciclo-
tiazomicina con lo tiopéptidos comunes, ésta posee características únicas ya que carece 
del característico sustituyente azol en el dominio central de piridina y en su lugar posee un 
residuo en el heterociclo derivado de alanina y 2 loops macrocíclicos (Figura 2) (Wang et 
al. 2010). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Estructura de ciclotiazomicina (Aoki et al. 1999) 
 
La importancia del antibiótico ciclotiazomicina radica en su función inhibitoria de la renina, 
la cual es una enzima asociada con la hipertensión, diabetes y alzheimer (Baringo et 
al.2014). Se trata de una enzima limitante en la cascada que comienza con el corte de la 
angiotensina y que termina con la formación de angiotensina II, siendo la angiotensina 
una hormona peptídica que causa vasoconstricción y un aumento en la presión arterial, 
por lo que la enzima renina es considerada uno de los blancos más efectivos para tratar la 
hipertensión (Baringo et al.2014). 
Hasta la fecha, se han aislado 2 análogos de la ciclotiazomicina: B1 y B2 (Figura 3). La 
ciclotiazomicina B1 es la que ha sido estudiada y se ha visto que posee actividad anti-
fúngica al unirse a la quitina causando la fragilidad de la pared celular (Baringo et 
al.2014). 
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Figura 3. Ciclotiazomicina y sus análogos: B1 y B2 (Baringo et al.2014). 
 
La producción de antibióticos como la ciclotiazomicina coincide con la formación de hifas 
aéreas de esporulación en Streptomyces debido a que estos antibióticos protegen a las 
hifas aéreas emergentes de otros microorganismos (Elliot et al., 2008). Se han identifica-
do una serie de genes denominados bld y whi que son esenciales para la formación de 
éstas hifas aéreas y para la esporulación, respectivamente (Hopwood et al.1976; Merrick, 
1976) Estos podrían servir como genes marcadores de S.mobaraensis, al igual que la ci-
clotiazomicina. 
 
Genes bld y whi: implicaciones en el desarrollo de Streptomyces 
 
Un gen relevante en el desarrollo de los Streptomycetes es bldA, el cual a diferencia de 
otros genes regulatorios en Streptomyces no codifica para un factor de transcripción, sino 
que codifica para el único tRNA que puede traducir eficientemente el codón de leucina 
UUA, un codón raramente usado en los genomas de los Streptomycetos debido a que 
estos poseen un alto contenido de GC en su DNA y usan preferencialmentelos codones 
ricos en GC (Chater y Chandra, 2008). 
Se ha estudiado que la abundancia del tRNA que produce bldA determina si un gen lla-
mado AdpA llega a niveles suficientes para activar el desarrollo de las hifas aéreas. El 
gen adpA actúa como un regulador maestro de 37 unidades transcripcionales en la vía de 
señalización de formación de éstas hifas, afectando cascadas de proteasas, péptidos 
morfogenéticos extracelulares y el metabolismo secundario (Hengst et al. 2010; Lawlor et 
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al. 1987; Leskiw et al. 1993; Takano et al., 2003). La presencia del codón TTA en el gen 
de desarrollo adpA de Streptomyces, hace que el tRNA de BldA sea esencial para la for-
mación del micelio aéreo y que las mutantes estén bloqueadas en la diferenciación 
fológica (Chater y Chandra, 2008). 
 
Los genes bld se activan en respuesta a un estrés nutricional y a diversas señales am-
bientales para formar éstas hifas aéreas con el objetivo de desarrollar largas cadenas de 
esporas que sean resistentes a condiciones adversas y que le permitan dispersarse a la 
bacteria (McCormick et al. 2012; Chater y Chandra, 2006). Una vez que son activados los 
genes bld, se activan otra serie de genes denominados whi, los cuales son fundamentales 
para formar las cadenas maduras de esporas y en su ausencia las hifas aparecen de co-
lor blanco cuando se crecen en medio sólido debido a que fallan en producir el pigmento 
policétido gris asociado con las esporas maduras, de ahí el término whi (white) (Flärdh y 
Buttner, 2009). 
 
Mediante estudios de la esporulación de S.coelicolor se han identificado 7 de los locus de 
whi (whiA,B,D,E,G,H,I) (Chater, 1972). Dentro de estos genes, WhiG es el que da inicio a 
toda la cascada de señalización para la formación de las esporas. Este gen codifica para 
un factor sigma involucrado en la decisión de esporulación de las hifas aéreas y en su 
ausencia las colonias desarrollan largas y delgadas hifas que fallan completamente al es-
porular (Chater, 1972). 
La RNA polimerasa que contiene este factor sigma Whig activa directamente 2 genes re-
gulatorios involucrados en etapas tardías de esporulación: whiH, el cual induce a un pro-
motor necesario para que se lleve a cabo la septación de las hifas aéreas (Ryding et al., 
1998); y whiI, el cual es un regulador de respuesta necesario para la septación (Ainsa et 
al., 1999). Ortólogos de whig están presentes en B.subtillis y en diversas Actinobacterias, 
aunque se encuentran ausentes en Actinomicetes cuya esporulación no involucra la for-
mación de cadenas de esporas de largas hifas aéreas (Chandra y Chater,2013). 
Otro gen whi importante es whib, el cual codifica para un factor de transcripción funda-
mental para la esporulación y constituye una de las proteínas características de Actino-
bacterias que forman hifas aéreas de esporulación Se trata de un gen que se agrupa 
dentro de la familia de pequeñas proteínas Wbl, las cuales se caracterizan por poseer un 
cluster sensitivo a oxígeno, capaz de sensar cambios REDOX (Chandra y Chater, 2013, 
Molle et al. 2000). Whib es necesaria para detener la extensión de las hifas aéreas y 
comenzar así la septación, se ha visto que su blanco es la proteína dpsA, la cual está 
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asociada al nucleoide formando largo complejos cristalinos nucleoproteicos con el ADN, 
protegiéndolo en situaciones de estrés para preservar así el genoma (Molle et al. 2000). 
 
Con base en estos antecedentes de genes característicos de Streptomycetes, me propu-
se desarrollar un método rápido de identificación de S.mobaraensis que consiste princi-
palmente en la amplificación y secuenciación de los genes whig, whib, bldA, ciclotiazomi-
cina y 16S rRNA. Este proyecto de identificación surge a partir del hecho de que han 
habido varios casos de contaminación con otras especies bacterianas en el laboratorio. 
Esto ha impedido que se lleve a cabo el cultivo de S.mobaraensis ATCC29032 , el cual es 
fundamental para estudiar la producción del péptido antibiótico ciclotiazomicina. 
El emplear la secuencia del gen 16S rRNA sobre los otros genes es de gran relevancia 
puesto que los genes marcadores whig, whib y bldA utilizados no son especie específicos 
y se encuentran ampliamente distribuidos en los Streptomycetes. De manera que el gen 
16S rRNA es aquel con mayor poder discriminatorio para llevar a cabo la identificación de 
S.mobaraensis. Asimismo, la secuenciación del gen que codifica para el antibiótico ciclo-
tiazomicina es de gran relevancia al ser el único gen que nos permitiría identificar la cepa 
bacteriana de S.mobaraensis. 
 
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 
 
¿Cómo identificar a S.mobaraensis de otras especies bacterianas en el laboratorio en ca-
so de contaminación? 
 
HIPÓTESIS 
Si se amplifican, secuencían y analizan en la bases de datos de BLAST los genes: 16S 
rRNA, whib, whig, bldA y ciclotiazomicina, entonces se podrá llevar a cabo una rápida y 
correcta identificación de ésta bacteria, caracterizándola molecularmente con base en es-
tos genes. 
 
 
 
 
 
 
 
 16 de 56 
OBJETIVO GENERAL 
 
* Desarrollar un método de identificación de S.mobaraensis mediante la amplificación y 
secuenciación del gen 16S rRNA y de los genes marcadores: whig, whib, bldA y ciclotia-
zomicina. 
 
OBJETIVOS PARTICULARES 
 
* Amplificar mediante PCR el gen ribosomal 16S de 2 especies bacterianas: B.cereus y 
S.mobaraensis. 
* Amplificar mediante PCR los genes marcadores de Streptomycetes: whig, whib y bldA, 
utilizando a B.cereus ATCC14579 como control negativo. 
* Secuenciar los amplicones y llevar a cabo un alineamiento de las secuencias mediante 
los programas FinchTv y Seaview. 
* Realizar un BLAST de las secuencias de los genes marcadores y de los genes riboso-
males 16S de B.cereus ATCC14579 y S.mobaraensis. 
 
MÉTODO 
 
Cultivo de S.mobaraensis ATCC29032 y B.cereus ATCC14579 
 
Se inocularon 50 μl de un glicerol de esporas de S.mobaraensis en un matraz bafleado de 
250 ml con 50 ml de medio SFM (20 g/L D-mannitol, 20 g/L de harina de soya marca 
Bob´s Red Mill). Se incubó el matraz a 30ºC, a 200 rpm, durante 36 horas de acuerdo al 
procedimiento descrito por Kiefer y colaboradores en el 2000. 
Para el cultivo de B.cereus, se emplearon 5 ml de medio LB líquido (10 g /L Bacto Tripto-
na, 5g/L extracto de levadura , 10g/L NaCl). Se dejó incubando a 30ºC, a 200 rpm, duran-
te 6 horas de acuerdo al procedimiento descrito por Moore y colaboradores en 2004. 
 
Extracción de ADN genómico de S.mobaraensis y Bacillus cereus 
 
Para extraer el ADN genómico de S.mobaraensis se realizó el procedimiento descrito por 
Kiefer y colaboradores en el 2000. Para consultar el protocolo revisar el ANEXO 1. 
 17 de 56 
Para extraer el ADN genómico de B.cereus ATCC14579 se empleó el protocolo descrito 
por Moore y colaboradores en 2004. Para la descripción del protocolo consultar ANEXO 
2. 
 
Amplificación del gen 16S rRNA 
 
Para la amplificación del gen 16S rRNA se utilizaron oligonucleótidos universales 16S 
previamente reportados en la literatura. El oligonucleótido forward denominado 27F se 
deriva de Lane et al. 1991 y corresponde a la secuencia nucleotídica: 
5´AGAGTTTGATCATGGCTCA3´. Por otro lado, el oligonucleótido reverse denominado 
1492 Rv se deriva de Turner et al. 1999 y corresponde a la secuencia: 
5´GGTTACCTTGTTACGACTT3´. 
El amplicón resultante fue de aproximadamente 1500 pb. y el programa de PCR para la 
amplificación del gen 16S rRNA se muestra en la Tabla 3. 
 
Tabla 3. Programa de PCR para la amplificación del gen 16s rRNA de S.mobaraensis 
y B.cereus ATCC14579. Para determinar la temperatura óptima de alineamiento, se 
realizó el siguiente gradiente de temperaturas: 50, 51 y 52 ºC. 
PROGRAMA PCR TEMPERATURA (ºC) TIEMPO # DE CICLOS 
desnaturalización 95 10 minutos 1X 
 95 30 segundos 25X 
alineamiento 50, 51, 52 45 segundos 25X 
extensión 72 2 minutos 25X 
 72 5 minutos 1X 
 
 
Para la reacciónde PCR se utilizaron las siguientes concentraciones finales de los reacti-
vos en un volumen final de 50 µl: 20 ng de ADN genómico de S.mobaraensis o de 
B.cereus ATCC14579, 2.5 mM de MgCl2 (Thermo Scientific, E.U.A, 25 mM LOT. 
00097122), Taq Buffer con KCl 1X (Thermo Scientific, E.U.A, 10X), 2 mM de dNTPs 
(Thermo Scientific , E.U.A, 20 mM #R1121), 1U de Taq DNA polimerasa recombinante 
(Thermo Scientific, E.U.A .1 U/µl, 500 U, #EP0404) y 20 pm de cada oligonucleótido for-
ward y reverse cuyo proveedor fue la Unidad de Secuenciación del Instituto de Biotecno-
logía de la UNAM, Cuernavaca Morelos, México. 
 18 de 56 
Para estimar el número de copias del gen 16S rRNA que poseen S.mobaraensis y 
B.cereus, se usó el programa rrnDB del Centro para Sistemas Microbianos de la Universi-
dad de Michigan que se encuentra disponible en la página web: 
https://rrndb.umms.med.umich.edu/estimate/run_classifier. 
 
Diseño de oligonucleótidos para amplificar los genes marcadores: ciclotiazomicina, 
bldA, whig y whib. 
 
Para obtener las secuencias nucleotídicas de los genes marcadores bldA, whib y whig de 
S.mobaraensis, se buscaron las proteínas WhiB y WhiG en la base de datos de NCBI pa-
ra verificar que éstas estuvieran anotadas en el genoma de la bacteria. 
WhiB se localizó como una familia de factores transcripcionales (#Acceso: 
WP_004955645.1, GI: 491094038) y WhiG como un factor sigma de la RNA polimerasa (# 
Acceso: WP_004944820.1 GI: 491083206). 
Habiendo identificado las secuencias de aminoácidos de estos genes se descargó el ge-
noma completo de S.mobaraensis de la página de NCBI en formato GenBank (RefSeq: 
NZ_AORZ00000000.1) y mediante el uso del software readseq versión 2.1.30 de la Uni-
versidad de Indiana, E.U.A, que se puede descragar en la página web: 
http://www.mybiosoftware.com/readseq-2-1-30-read-reformat-biosequences.html, se ob-
tuvieron las secuencias nucleotídicas de los dos genes whi, poniendo como formato de 
salida FASTA para que el programa nos diera la secuencia de los genes en este formato. 
Las secuencias aminoacídicas y nucleotídicas que se obtuvieron de whig y whib se pue-
den ver en el ANEXO 3. 
El gen bldA en S.mobaraensis no se había reportado, por lo que se buscó un ortólogo en 
otra especie de Streptomyces llamada S. fulvissimus. 
Se descargó la secuencia proteica del ortólogo Blda de S. fulvissimus y se buscó esa pro-
teína en el genoma de S. mobaraensis mediante el programa exonerate 2.2.0 con el fin de 
alinear la secuencia proteica del ortólogo en el genoma completo de S.mobaraensis y ob-
tener su secuencia nucleotídica. Este programa fue creado por el Instituto de Bioinformáti-
ca Europea (EMBL-EBI) y se puede descargar en la página web: 
https://www.ebi.ac.uk/about/vertebrate-genomics/software/. 
 
Una vez obtenidas las secuencias de los tres genes marcadores se prosiguió a diseñar 
los oligonucleótidos que amplificaran estos genes mediante el uso del programa Primer3 
versión 0.4.0 del Instituto Médico Howard Hughes, E.U.A. (http://bioinfo.ut.ee/primer3-
http://www.mybiosoftware.com/readseq-2-1-30-read-reformat-biosequences.html
http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/
 19 de 56 
0.4.0/primer3/). Se utilizó también el programa Oligo Analyzer de la compañía estadouni-
dense Integrated DNA Technologies (https://www.idtdna.com/calc/analyzer) para verificar 
que los oligonucleótidos elegidos no formaran dímeros y horquillas. Los amplicones resul-
tantes son los siguientes: whig (955 pb), whib (182 pb) y bldA (806 pb). 
Las secuencias nucleotídicas de los genes marcadores whig, whib y bldA que se utilizaron 
para el diseño de los oligonucleótidos se muestran en el ANEXO 6 y los oligonucleótidos 
usados se encuentran en la Tabla 4. 
 
Tabla 4. Oligonucleótidos forward (Fw) y reverse (Rv) usados para amplificar los 
genes marcadores: bldA, whig y whib con su respectiva secuencia nucleotídica, 
Tm, longitud, porcentaje de G-C y probabilidad de formación de dímeros y horqui-
llas. 
 
 SECUENCIA 
5´- 3´ 
 Tm Longitud % GC Formación de díme-
ros, horquillas 
whig-
Fw 
ACATCCGACAA
GGAGTGAGC 
 60ºC 20 nt 55% poco probable 
whig-
Rv 
TCAGTAGCCAC
CGACCTGAT 
 60ºC 20 nt 55% poco probable 
whib- 
Fw 
TCAGTAGCCAC
CGACCTGAT 
 60ºC 20 nt 55% poco probable 
whib-
Rv 
GACTCGGCGAA
GAAGACCTC 
 60ºC 20 nt 60% poco probable 
bldA-
Fw 
AGACCAACTACG
GCACCTTC 
 60ºC 20 nt 55% poco probable 
bldA-
Rv 
ACGGTGACATGA
AGGACCA 
 60ºC 19 nt 52.63% poco probable 
 
 
El programa de PCR fue el mismo que se utilizó para amplificar el gen 16S rRNA , aunque 
el gradiente de temperaturas empleado para hallar la temperatura óptima de alineamiento 
fue de: 59, 60, 61 y 62 ºC. 
 
Para obtener la secuencia nucleotídica del gen que codifica para el prepéptido ciclotiazo-
micina se utilizó el programa antiSMASH (antibiotics & Secondary Metabolite Analysis 
Shell) que se encuentra disponible en la página web 
http://antismash.secondarymetabolites.org/ y que proporciona un análisis detallado de los 
https://www.idtdna.com/calc/analyzer
 20 de 56 
antibióticos y metabolitos secundarios que produce S. mobaraensis ATCC29032. Se des-
cargó la secuencia del genoma completo de S.mobaraensis en formato FASTA a partir de 
la página de NCBI (RefSeq: NZ_AORZ00000000.1) y ésta secuencia se introdujo en el 
programa antiSMASH, encontrándose que el cluster 20 correspondía al gen de la ciclotia-
zomicina. Habiendo obtenido la secuencia nucleotídica mediante antiSMASH, se diseña-
ron los oligonucleótidos con los programas Primer3 versión 0.4.0 del Instituto Médico 
Howard Hughes, E.U.A. (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/) y Oligo Analyzer de la 
compañía estadounidense Integrated DNA Technologies 
(https://www.idtdna.com/calc/analyzer). Los oligonucleótidos usados para amplificar el 
gen ciclotiazomicina se encuentran en la Tabla 5. El amplicón resultante fue de 320 pb. 
. 
Tabla 5. Oligonucleótidos forward (Fw) y reverse (Rv) usados para amplificar el gen 
ciclotiazomicina con su respectiva secuencia, Tm, longitud y porcentaje de GC. 
 
Oligonucleótido Secuencia Tm Longitud % GC 
ciclotiazomicina 
Fw 
* CACCGAACGAGAG-
GAGGAC 
 * 59,60 y 
61ºC 
19 nt 63.16% 
ciclotiazomicina Rv * CTCGCTGGTGGTCG
TTCC 
 * 59,60 y 
61ºC 
18 nt 66.67% 
 
 
Las concentraciones finales de los reactivos de PCR y el programa para la amplificación 
del gen que codifica para el péptido ciclotiazomicina fue el mismo que se utilizó para am-
plificar los genes: bldA, whig, whib y 16S rRNA, aunque en este caso se realizó otro gra-
diente de temperaturas para el alineamiento, el cual fue de de 59, 60 y 61 ºC . 
 
Purificación y electroforesis de los productos de PCR 
 
Se utilizó el kit comercial: High Pure PCR Product Purification, (Roche®, Amsterdam) para 
la purificación por banda de los productos de PCR de los genes 16S rRNA, whib, whig, 
bldA y ciclotiazomicina. Se llevaron a cabo electroforesis en geles de agarosa al 1% teñi-
dos con bromuro de etidio y los geles fueron visualizados mediante el uso del equipo: 
GEL Doc EZ Imager, marca BIORAD. Se puede consultar el protocolo para la purificación 
de los amplicones en la página web: 
http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/
https://www.idtdna.com/calc/analyzer
 21 de 56 
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigmaaldrich/docs/Roche/General_Information/
1/high-pure-pcr-product-purification-kit.pdf. 
 
Secuenciación de los amplicones y análisis de las secuencias mediante BLAST: 
Basic Local Alignment Search Tool 
 
La secuenciación se realizó en la Unidad de Síntesis y Secuenciación (USSDNA) del Ins-
tituto de Biotecnología de la UNAM, Cuernavaca Morelos, México y el análisis de las se-
cuencias se llevó a cabo mediante los programas Finch Tv desarrollado por Geospiza, 
Inc, Seattle E.U.A, que se puede descargar en la página web 
https://digitalworldbiology.com/FinchTV, el programa Seaview desarrollado por Gouy y 
colaboradoresen 2010, el cual se puede descargar en la página: 
http://doua.prabi.fr/software/seaview y el programa BLAST de NCBI (Altschul et al. 
1997), el cual usa un rápido algoritmo de búsqueda para identificar regiones nucleotídicas 
de alta similitud con una secuencia blanco. Se utilizó la versión de BLAST del Centro Na-
cional de Información Biotecnológica (NCBI) que se encuentra en la página web 
(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Se realizó un BLAST de las secuencias de los ge-
nes 16S rRNA de B.cereus y S.mobaraensis para lograr discernir entre éstas dos espe-
cies bacterianas y también de cada una de las secuencias nucleotídicas de los genes 
marcadores (ciclotiazomicina, bldA, whig y whib) para ver si estos genes podían servir 
como marcadores de S.mobaraensis utilizando la base de datos de NCBI: 
refseq_genomic. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigmaaldrich/docs/Roche/General_Information/1/high-pure-pcr-product-purification-kit.pdf
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigmaaldrich/docs/Roche/General_Information/1/high-pure-pcr-product-purification-kit.pdf
 22 de 56 
RESULTADOS 
 
Extracción de ADN genómico de S.mobaraensis y B.cereus 
 
Se extrajo exitosamente el ADN genómico de S.mobaraensis, obteniéndose 60 ng/µl de 
ADN (Figura 4). 
 
Figura 4. Electroforesis en gel de agarosa al 1% y tinción con bromuro de etidio del 
ADN genómico de S.mobaraensis. Carril 1: marcador de peso molecular Gene Ruler 
DNA Ladder Mix Thermo Scientific, E.U.A. Carril 2: 5 µl de ADN genómico de 
S.mobaraensis. Carril 3: 3µl de ADN genómico de S.mobaraensis. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El ADN genómico de B.cereus ATCC14579 que sirvió como control negativo para la am-
plificación de los genes marcadores en este proyecto y para lograr discernir entre 
S.mobaraensis y B.cereus al utilizar el gen 16S rRNA, también fue extraído exitosamente 
(Figura 5). 
 
 
 
 
 
 23 de 56 
Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa al 1% y tinción con bromuro de etidio del 
ADN genómico de B.cereus ATCC14579. El carril 1 corresponde al marcador de pe-
so molecular Gene Ruler DNA Ladder Mix Thermo Scientific, E.U.A. Carril 2: 1 µl de 
ADN genómico de B. cereus ATCC14579. Carril 3: 2 µl de ADN genómico de B.ce 
reus ATCC14579. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Coincidencias al buscar en la base de datos de NCBI los genes marcadores 
 
Al buscar en la base de datos de proteínas de NCBI a WhiG y WhiB, se encontró que 
éstas ya estaban anotadas en el genoma de S. mobaraensis. 
Hubo 13 coincidencias al buscar en NCBI a WhiB de S.mobaraensis, identificándolo como 
una familia de factores transcripcionales, función que ya se había reportado previamente 
en la literatura (Chandra y Chater, 2008). Se puede acceder a la secuencia mediante la 
página web de NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov, usando como referencia el siguiente 
número de acceso: WP_004955645.1. 
 
En el caso de WhiG hubo 2 coincidencias al buscar en NCBI. Se identificó como un factor 
sigma de RNA polimerasa, tal y como se esperaba debido a que en la literatura ya estaba 
reportada su función (Chandra y Chater, 2008). Para mayor información, el número de 
acceso de NCBI de la secuencia es el siguiente: WP_004944820.1. 
 
La búsqueda en NCBI del gen bldA de S.mobaraensis no dio resultados puesto que este 
gen no se encontraba anotado en el genoma. Sin embargo, al buscar en NCBI el gen 
 
3000 pb 
 
 
1000 pb 
 
 
500 pb 
 1 2 3 
 24 de 56 
bldA, este se encontró en otra especie de Streptomyces llamada S. fulvissimus (Figura 6) 
y debido a que se trataba del mismo género: Streptomyces y a que era un RNA de trans-
ferencia al igual que el bldA que se buscaba en Streptomyces mobaraensis, se prosiguió 
a descargar la secuencia proteica del ortólogo S. fulvissimus (WP_015608996) y a buscar 
esa proteína en el genoma de S. mobaraensis. 
 
Figura 6. Coincidencia en NCBI al buscar el gen bldA. Corresponde a un RNA de 
transferencia en S. fulvissimus (# de referencia de la secuencia de NCBI: 
WP_015608996). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Al introducir en el programa la secuencia aminoacídica de bldA del ortólogo S. fulvissinus 
y la secuencia del genoma completo de S. mobaraensis, el programa exonerate encontró 
una coincidencia para bldA en el genoma de S.mobaraensis, originando un alineamiento 
que se encuentra en el ANEXO 4 
Habiendo realizado el alineamiento se obtuvo la secuencia nucleotídica del gen bldA me-
diante el programa exonerate-protein2genome y finalmente la secuencia nucleotídica ob-
tenida a partir de protein2genome se convirtió a secuencia de aminoácidos, a la cual se le 
realizó un BLAST para corroborar que se produjera un alineamiento con la secuencia pro-
teica de BldA de S.mobaraensis. Las secuencias aminoacídicas y nucleotídicas de bldA 
obtenidas a partir del programa exonerate se muestran en el ANEXO 5. 
 
Al realizar el BLAST de la secuencia proteica de BldA obtenida mediante el software pro-
tein2genome, hubo 100 secuencias que produjeron alineamientos significativos. La se-
cuencia de S.mobaraensis fue la que tuvo el mayor puntaje de alineamiento en la base de 
datos, lo cual fue satisfactorio debido a que este alineamiento nos corroboró que efecti-
vamente se trataba de la secuencia del gen bldA de S.mobaraensis, la cual aparecía co-
 25 de 56 
mo proteína hipotética en la base de datos de BLAST al no estar anotada en el genoma 
de la bacteria (Figura 7). 
 
Figura 7. Alineamiento más significativo de BLAST de la secuencia aminoacídica de 
bldA que corresponde a una proteína hipotética en S.mobaraensis. (ID. 
WP_004951203.1) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Amplificación del gen 16S rRNA 
 
Para la amplificación del gen 16S rRNA se realizó un gradiente de 3 temperaturas (50, 51 
y 52ºC . El gen fue amplificado en S.mobaraensis y B.cereus en todas las temperaturas a 
una concentración final de MgCl2 de 7.5mM y el tamaño del amplicón era de aprox.1500 
pb (Figura 8). 
 
Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa 1% y tinción con bromuro de etidio: PCR 
16S rRNA (1500 pb). 1-M= marcador de peso molecular Gene Ruler DNA Ladder Mix 
Thermo Scientific, E.U.A, 2- control (+) PCR: 700 pb, 3- PCR 16S rRNA B.cereus 
ATCC14579,Tm: 50ºC, 4-PCR 16S rRNA B.cereus ATCC14579, Tm: 51ºC, 5-PCR 16S 
rRNA B.cereus ATCC14579,Tm: 52ºC, 6- PCR 16S rRNA S.mobaraensis, Tm: 50ºC, 7- 
PCR 16S rRNA S.mobaraensis, Tm: 51ºC, 8- PCR 16S rRNA S.mobaraensis, Tm: 
52ºC, 9- control (-) sin ADN de S.mobaraensis en reacción de PCR, 10- control (-) sin 
ADN B.cereus ATCC14579. 
 
 26 de 56 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
La amplificación del gen 16S rRNA tanto en B.cereus como en S.mobaraensis fue exitosa 
bajo las condiciones mencionadas anteriormente con los oligonucleótidos universales 27F 
y 1492 R. Sin embargo se puede observar una mayor amplificación del gen ribosomal 16S 
de B.cereus que de S.mobaraensis. Farrelly Vincent et al. en 1995 reportan radios de 
productos de PCR del gen 16s rRNA de varias especies bacterianas que correlacionan 
con el número de copias del gen ribosomal 16S, el cual puede variar de 1 a 15 en las bac-
terias. Asimismo, May Ping Lee et al. en 2008 reporta la existencia de una base de datos 
llamada Ribosomal RNA Database (rrnDB), la cual contiene información del número de 
copias del gen 16S rRNA que poseen las bacterias. Al buscar en este programa el núme-
ro de copias del gen 16S rRNA de las bacterias empleadas en este proyecto, se encontró 
que B.cereus posee 14 copias mientras que S.mobarensis posee aproximadamente 6 co-
pias, lo cual nos sugiere que posiblemente hubo una mayor amplificación del gen 16S 
rRNA en B.cereus debido a que ésta posee un mayor número de copias. 
 
 
 
 
 
 
 27 de 56 
Amplificación del gen ciclotiazomicina 
 
El programa antiSMASH (http://antismash.secondarymetabolites.org) permitió obtener la 
secuencia nucleotídica del gen marcador ciclotiazomicina.Para su amplificación se realizó un gradiente de 3 temperaturas (59, 60, 61ºC). El gen era 
amplificado exitosamente en las 3 temperaturas anteriores y el amplicón resultante fue de 
320 pb. (Figura 9). Como se esperaba no hubo ampificación en B.cereus ATCC14579 
debido a que ésta bacteria no produce el péptido antibiótico ciclotiazomicina, sino que 
produce otro tiopéptido llamado tiocilina. 
 
Figura 9. Electroforesis en gel de agarosa 1% y tinción con bromuro de etidio: PCR 
ciclotiazomicina (320 pb). Carriles: 1-M= marcador de peso molecular Gene Ruler 
DNA Ladder Mix Thermo Scientific, E.U.A, 2- PCR ciclotiazomicina, Tm: 59ºC, 3- 
PCR ciclotiazomicina, Tm: 60ºC, 4-PCR ciclotiazomicina, Tm: 61ºC, 5- control (-) 
B.cereus ATCC14579, 6- control (+) PCR: 700 pb. 
 
 
 
 
 
 
http://antismash.secondarymetabolites.org/
 28 de 56 
Amplificación del gen bldA 
 
Para la amplificación del gen bldA se realizó un gradiente de 3 temperaturas (59, 60, 
61ºC). El amplicón resultante fue de 806 pb. y el gen bldA era amplificado exitosamente 
en las tres temperaturas (59, 60, 61ºC) (Figura 10) Cabe destacar que la concentración 
de MgCl2 en la reacción de PCR fue determinante para la amplificación, siendo la concen-
tración final óptima de MgCl2 de 2.5 mM. 
 
Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa 1% y tinción con bromuro de etidio: PCR 
bldA (806 pb). Carriles: 1- M= marcador de peso molecular, 2- PCR bldA 7.5 mM 
MgCl2 Tm: 59ºC, 3- PCR bldA 7.5 mM MgCl2 Tm: 60ºC, 4-PCR bldA 7.5mM MgCl2 
Tm: 61ºC, 5-PCR bldA 2.5 mM MgCl2 Tm: 59ºC, 6-PCR bldA 2.5 mM MgCl2 Tm: 60ºC, 
7-PCR bldA 2.5 mM MgCl2 Tm: 61ºC. 
 
Amplificación de los genes whig y whib 
 
Para la amplificación de whig se realizó un gradiente de 4 temperaturas (59, 60, 61, 62 
ºC). El gen era amplificado a éstas cuatro temperaturas de alineamiento y el total de la 
región amplificada corresponde a 955 pb. Como se esperaba, no hubo amplificación de 
whig en B.cereus ATCC14579 debido a que el gen es característico de Actinobacterias 
que forman hifas aéreas de esporulación (Figura 11). 
 
 
 29 de 56 
Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa al 1% y tinción con bromuro de etidio. 
Amplificación del gen whig (955 pb). El carril 1 corresponde al marcador de peso 
molecular, los carriles 2,3,4 y 5 corresponden a 5 μl del PCR de whig a 4 temperatu-
ras diferentes de alineamiento: 59, 60, 61 y 62 ºC respectivamente. El carril 6 es el 
PCR de whig en B.cereus ATCC14579 (control negativo). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para la amplificación de whib se realizó un gradiente de 3 temperaturas (59, 60, 61ºC). El 
gen whib era amplificado exitosamente en éstas temperaturas a una concentración final 
de magnesio de 7.5 mM. El amplicón resultante corresponde a 182 pb y tampoco hubo 
amplificación de whib en B.cereus ATCC14579, corroborando que es un gen exclusivo de 
Actinobacterias. (Figura 12). 
 
Figura 12. Electroforesis en gel de agarosa 1% y tinción con bromuro de etidio: PCR 
whib (182 pb). Carriles: 1- marcador de peso molecular, 2 y 3- carriles vacíos, 4- 
control (+) reacción PCR: 700 pb, 5- control (-) B.cereus ATCC14579, 6- PCR whib 
(182 pb) Tm: 59ºC,7.5 mM MgCl2, 20 ng ADN, 7- PCR whib (182 pb) Tm: 60ºC,7.5 mM 
MgCl2, 20 ng ADN, 8-PCR whib (182 pb) Tm: 59ºC, 2.5 mM MgCl2, 20 ng ADN, 9-PCR 
whib (182 pb) Tm: 60ºC, 2.5 mM MgCl2, 20 ng ADN, 10-PCR whib (201 pb) Tm: 61ºC, 
2.5 mM MgCl2, 20 ng ADN, 11-PCR whib (201 pb) Tm: 59ºC, 7.5 mM MgCl2 (25mM), 
50 ng ADN, 12-PCR whib (201 pb) Tm: 60ºC, 7.5 mM MgCl2, 50 ng DNA. 
 
 30 de 56 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
De ésta manera, para realizar la amplificación del gen whib (182 pb) se realizaron gra-
dientes de temperatura (59, 60, 61ºC), gradientes de MgCl2 (2.5 y 7.5 mM) y se probaron 
también 2 concentraciones diferentes de DNA genómico: 20 y 50 ng. El gen whib era am-
plificado tanto a 59 como a 60ºC utilizando una concentración de ADN genómico tanto de 
20 como de 50 ng a una concentración final de MgCl2 de 7.5 mM. 
 
Secuenciación de los genes marcadores 
 
La secuenciación de los amplicones del gen 16S rRNA y de los genes marcadores permi-
tió llevar a cabo los alineamientos de las secuencias producto de la secuenciación con las 
secuencias de los genes que se encuentran anotadas en las bases de datos. En todos los 
casos hubo un alineamiento perfecto, lo cual nos corroboró a nivel de secuencia nucleotí-
dica que efectivamente se trataba de los genes: 16S rRNA, ciclotiazomicina, bldA, whig y 
whib. Los cromatogramas correspondientes muestran picos claros de cada una de las 
bases nucleotídicas, lo cual demuestra que la secuenciación fue exitosa. En el ANEXO 7 
se encuentran los alineamientos y cromatogramas correspondientes del gen 16S rRNA y 
de cada uno de los genes marcadores, en donde cada base nucleotídica está representa-
da con un código de color: citosina-verde, guanina-amarillo, adenina-rojo y timina-azul . 
Las secuencias obtenidas a partir de la secuenciación del gen 16S rRNA de las dos espe-
cies bacterianas: S.mobaraensis y B.cereus ATCC14579 fueron comparadas mediante el 
programa Seaview. En el alineamiento que se muestra a continuación (Figura 13) se 
puede observar que las secuencias del gen 16S rRNA son muy diferentes en ciertas re-
giones. Sin embargo, se puede ver que existe un alineamiento perfecto entre ambas se-
cuencias en otras regiones que corresponden a las regiones conservadas del gen ribo-
 31 de 56 
somal 16S. Las variaciones en las secuencias nucleotídicas de los genes ribosomales 
16S de las 2 especies bacterianas corresponden a las regiones hipervariables, las cuales 
nos permitieron distinguir entre Bacillus cereus y Streptomyce mobaraensis. 
Figura 13: Alineamiento comparado de las secuencias obtenidas a partir de la se-
cuenciación del gen 16S rRNA de B.cereus ATCC14579 y S.mobaraensis con los 
oligonucleótidos universales 27F y 1492 R. Se pueden visualizar regiones conser-
vadas e hipervariables del gen ribosomal 16S. 
 32 de 56 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Análisis de las secuencias mediante BLAST 
 
La secuenciación de los genes marcadores permitió realizar un análisis en la base de da-
tos de BLAST. Esto con la finalidad de ver si estos genes realmente podrían servir como 
marcadores de S.mobaraensis. 
BLAST encontró regiones de similitud al comparar las secuencias nucleotídicas de los 
genes marcadores con las bases de datos. El programa nos proporcionó tablas de des-
cripciones que muestran las secuencias de la base de datos identificadas por BLAST que 
fueron similares a la secuencia blanco (query) y nos otorgó una serie de puntajes para 
evaluar el alineamiento: 
* el porcentaje que se cubrió de la secuencia blanco (query) por el alineamiento con la 
secuencia de la base de datos (Query cover). 
 33 de 56 
* el mejor valor esperado de todos los alineamientos de la base de datos (E value), el cual 
es un parámetro que describe el número de resultados que uno puede esperar al buscar 
en una base de datos de un tamaño particular. Entre más bajo o más cercano a 0 es el 
valor e, más significativo es el alineamiento. 
* el mayor porcentaje de identidad de todos los alineamientos con la secuencia blanco 
(Max ident). 
* el número de acceso de la secuencia (Accesion). 
En la Tabla 3 se muestran las secuencias que obtuvieron los mejores porcentajes de ali-
neamiento de BLAST. 
 
Tabla 3. Secuencias identificadas por BLAST que tuvieron el mayor porcentaje de 
similitud a las secuencias blanco (query) de los genes marcadores: 16S rRNA, ciclo-
tiazomicina, bldA, whig y whib. Se muestra el organismo, el número de acceso, el 
porcentaje de identidad, el porcentaje de cubrimiento de la secuencia blanco y el 
valor e esperado. 
GEN Organismo # ACCESO % IDENTIDAD %CUBRIMIENTO 
DE SECUENCIA 
VALOR e 
ESPERADO 
16S rRNA Bacillus cereus 
CC2H2L 
KP940382.1 99 97 0 
 Streptomyces 
mobaraensis 
NRRL B-3729 
NRL_043830
.1 
99 98 0 
Ciclotiazomicina S.hygroscopicuscepa 10-22 
FJ472825.1 90 88 8E-53 
bldA Streptomyces 
mobaraensis 
NBRC-13829 
NZ_AORZ01
000104 
99 98 0 
whig S.mobaraensis 
DSM40487 
NZ_AORZ01
000033.1 
99 98 0 
whib S.mobaraensis 
DSM40487 
NZ_AORZ01
000033.1 
98 96 3E-52 
 
El análisis del gen 16S rRNA en la bases de datos de BLAST produjo los alineamientos 
más significativos con las secuencias de los genes 16S rRNA de Bacillus cereus y de 
S.mobaraensis, lo cual nos corrobora la gran utilidad de este marcador molecular para 
llevar a cabo identificaciones bacterianas. 
La ciclotiazomicina obtuvo el mayor porcentaje de alineamiento con S.hygroscopicus y no 
con S.mobaraensis debido a que este gen no se encuentra anotado aún en el genoma de 
 34 de 56 
S.mobaraensis. El análisis de las secuencias de los genes bldA, whig y whib en BLAST, 
nos mostró que los alineamientos más significativos eran con S.mobaraensis y no con 
otras especies de Streptomycetes. 
 
DISCUSIÓN 
 
El uso del gen ribosomal 16S ha revolucionado nuestra clasificación del mundo bacteria-
no, permitiéndonos llevar a cabo identificaciones bacterianas precisas (Clarridge, J. et al. 
2004; Woese, 1987). Una rápida y confiable identificación permanece como una de las 
tareas más importantes en la taxonomía y en cualquier laboratorio. El que haya habido en 
el laboratorio casos de contaminación con otras especies bacterias, nos abrió paso a 
desarrollar un método rápido y eficaz para identificar a S.mobaraensis. 
 
En este proyecto se hizo uso de la secuencia del gen 16S rRNA para diferenciar entre dos 
especies bacterianas: Streptomyces mobaraensis y Bacilllus cereus ATCC14579. Ambas 
son muy parecidas debido a que se trata de bacterias Gram positivas, aerobias, formado-
ras de esporas y grandes productoras de péptidos antibióticos (ciclotiazomicina en el caso 
de S.mobaraensis y tiocilina en el caso de B.cereus) (Chandra y Chater, 2013; Walsh, 
2010). 
Aunque son muy similares, la secuenciación del gen 16S rRNA nos permitió discernir en-
tre éstas dos especies bacterianas gracias a su amplificación con oligonucleótidos univer-
sales, su posterior secuenciación y análisis en las bases de datos, lo cual nos permitió 
distinguir a nivel de especie y de género. Se encontró que aunque el gen es muy útil para 
llevar a cabo identificaciones bacterianas, no logra diferenciar a nivel de cepa. 
El identificar que se trata de la cepa ATCC29032 de S.mobaraensis resulta de gran impor-
tancia puesto que ésta cepa es la productora del péptido antibiótico ciclotiazomicina 
(https://antismash.secondarymetabolites.org). En el laboratorio solamente se han dado 
casos de contaminación con otras especies bacterianas, sin embargo en un escenario de 
contaminación con cepas de su misma especie, la secuenciación del gen ciclotiazomicina 
es la única que tendría suficiente poder discriminatorio para discernir entre la cepa bacte-
riana con la que se está trabajando, al ser un gen marcador exclusivo de S.mobaraensis 
ATCC29032. 
 
La ciclotiazomicina es un antibiótico que podría tener aplicaciones prometedoras al pose-
er actividad antifúngica e inhibitoria de la enzima renina que causa hipertensión (Baringo 
 35 de 56 
et al.2014). En este proyecto, la amplificación del gen que codifica para la ciclotiazomicina 
abre paso a futuras investigaciones en el laboratorio sobre relaciones estructura-función 
para lograr una mejor comprensión de este antibiótico, el cual no ha ido a pruebas clínicas 
debido a su baja solubilidad como es el caso de la mayoría de los tiopéptidos (Walsh et al. 
2010). 
 
Por otro lado, se encontró que los genes que se han reportado como marcadores de Acti-
nobacterias: los genes whig, whib y bldA (Flärdh and Buttner, 2009, Hopwood, 1967; 
Merrick, 1976; Chandra y Chater, 2008) podrían fungir como marcadores útiles de 
S.mobaraensis, puesto que aunque se encuentran ampliamente distribuidos en las Acti-
nobacterias, los alineamientos más significativos de BLAST se produjeron con ésta espe-
cie bacteriana y no con las otras especies de Streptomyces. 
 
De ésta manera, el uso del gen 16S rRNA, de genes marcadores del phylum Actinobacte-
ria al cual pertenece S.mobaraensis: whig, whib y bldA y de un gen exclusivo de ésta es-
pecie bacteriana: la ciclotiazomicina, nos permitieron llevar a cabo la identificación de 
S.mobaraensis y caracterizarla por la presencia de estos genes marcadores. El uso de las 
bases de datos fue fundamental y quisiera destacar su utilidad en almacenar todo el co-
nocimiento científico emergente. Estamos ante una era que ha tenido un desarrollo explo-
sivo en la aplicación de técnicas moleculares y en el uso de las bases de datos. El que 
una cantidad inmensa de organismos se encuentren secuenciados como fue el caso de 
S.mobaraensis, ha permitido el desarrollo de numerosas investigaciones y en este caso la 
secuenciación de los genes marcadores nos permitió identificar de manera precisa a una 
bacteria en particular. 
 
CONCLUSIONES 
La secuenciación del gen ribosomal 16S nos permitió distinguir a nivel de especie y géne-
ro entre Bacillus cereus y S.mobaraensis. Se encontró que no puede diferenciar mas allá 
de este nivel, puesto que no se logró distinguir la cepa bacteriana con la cual se trabajó 
en este proyecto. Para ello, el uso del gen que codifica para el péptido antibiótico com-
plementa el análisis al ser este un gen verdaderamente exclusivo de la cepa bacteriana 
utilizada en este proyecto: S.mobaraensis ATCC29032. 
 
 36 de 56 
Asimismo, se vio que los genes whig, whib y bldA podrían fungir como marcadores de S. 
mobaraensis puesto que los alineamientos más significativos se dieron con ésta especie y 
no con los otros Streptomycetes. La amplificación de estos genes en Bacillus cereus 
ATCC14579 sirvió como control negativo y nos demostró que estos eran característicos 
de Streptomycetes puesto que no había amplificación en B.cereus. 
La metodología empleada nos permite identificar rápida y eficazmente a S.mobaraensis, 
mediante el uso de marcadores moleculares, en donde el uso de bases de datos y de 
programas bioinformáticos resulta fundamental. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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ANEXOS 
 
ANEXO 1: PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO DE S.mobaraensis 
 
1- Inocular con 50 μl de un glicerol de esporas un matraz bafleado de 250 ml con 50 ml de 
medio SFM (20 g/L D-mannitol, 20 g/L de harina de soya marca Bob´s Red Mill). Incubar 
el matraz 30ºC, 200 rpm, durante 36 horas. 
2- Centrifugar el cultivo a 3000 rpm por 10 minutos. Lavar el pellet 2 veces con PBS y vol-
ver a centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos. 
3- Resuspender el pellet en 5 ml de buffer SET ( 75 mM NaCl, 25 mM EDTA pH.8, 20 mM 
Tris HCl pH.7.5). Adicionar 100 μl de solución de lisozima (50 mg/ml) y 50 U de Rnasa T1, 
incubar durante 60 minutos a 37ºC. 
4- Añadir 140 μl de solución de proteinasa K (20 mg/ml en agua), 600 μl de SDS al 10%, 
mezclar por inversión, incubar 2 horas a 55ºC e invertir ocasionalmente. 
 39 de 56 
5- Adicionar 2 ml de NaCl 5M, mezclar por inversión, dejar enfriar a 37ºC y añadir 5 ml de 
cloroformo. Mezclar por inversión 30 minutos a 20ºC. Centrifugar 20 minutos a 11000 g. 
4- Transferir sobrenadante a un tubo fresco y añadir 0.6 volúmenes de isopropanol, mez-
clar por inversión. Centrifugar a 13000 rpm por 3 minutos, descartar isopropanol y añadir 
5 ml de etanol al 70%, mezclar por inversión. Centrifugar a máxima velocidad por 1 minu-
to. Secar al vacío por 10 minutos para remover todo el etanol. 
5- Disolver el ADN en 2 ml de buffer TE (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA pH. 8) pre-
viamente calentado a 55ºC. 
 
ANEXO 2: PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO DE B.cereus 
ATCC14579 
 
1. Crecer un cultivo de B.cereus en 5 ml de medio LB líquido (10 g /L Bacto Triptona, 5g/L 
extracto de levadura , 10g/L NaCl) sin antibiótico durante 6 horas. Eliminar el medio por 
centrifugación a velocidad máxima (13000 rpm) durante 10 minutos hasta tener un pellet 
de aproximadamente 0.1 g. (40-200 mg de DNA). 
 
2. Resuspender el pellet en 564 µl de buffer TE (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA pH. 
8). Añadir 10 µg de lisozima (cristalina). Mezclar por inversión e incubar 60 minutos a 
37 ºC. 
3. Añadir 6 µl de proteinasa K (10 mg / ml) y 30 µl de SDS (20%). Mezclar por inversión e 
incubar a 37 ◦C hasta que la solución se vuelva clara y viscosa. 
4. Añadir 100 µl de NaCl (5 M) y mezclar por inversión. Incubar a 65ºC durante 2 
minutos. 
5. Añadir 80 µl de una solución CTAB/ NaCl (precalentada a 65ºC) y mezclar por inver-
sión. Incubar a 65ºC durante 10 minutos. Para preparar solución CTAB/NaCl: disolver 
4.1 g de NaCl en 80 ml de agua y agregar lentamente 10 g de CTAB (bromuro de 
hexadeciltrimetilamonio) mientras se calienta a 65°C en constante agitación. Ajustar el 
volumen a 100 ml con agua. 
6. Extraer el ADN con 800 µl de una solución cloroformo / alcohol isoamílico (24: 1). Cen-
trifugar a velocidad máxima 5 minutos. Pasar la fase superior (acuosa) que contiene el 
ADN a un tubo Eppendorf estéril. 
7. Extraer nuevamente con 800 µl de una solución de fenol / cloroformo / alcohol 
isoamílico (25: 24: 1). Centrifugar 5 minutos a velocidad máxima (13000 rpm). Pasar la 
fase superior (acuosa) a un tubo Eppendorfestéril. 
 40 de 56 
8. Extraer de nuevo con 800 µl de una solución cloroformo: alcohol isoamílico (24: 1). 
Centrifugar a velocidad máxima (13000 rpm) durante 5 minutos. Pasar la fase acuosa 
a un tubo Eppendorf limpio. 
7. Añadir 7 volúmenes de isopropanol para precipitar los ácidos nucleicos. Mezclar por 
inversión hasta que el ADN aparezca como un precipitado blanco, viscoso. Dejar reposar 
a temperatura ambiente de 5 minutos a 1 hora hasta que vaya al fondo del tubo. 
Centrifugar (13000 rpm. durante 30 minutos a temperatura ambiente) y remover el isopro-
panol cuidadosamente. 
8. Lavar el ADN con 500 µl de etanol al 70%. Mezclar por inversión y centrifugar a 13000 
rpm por 30 minutos. Eliminar el sobrenadante. 
9. Secar el pellet al vacío durante 5 minutos y resuspenderlo en 50 µl de buffer TE (10 
mM Tris-Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA pH. 8). 
 
 
 
 
 
 
 
ANEXO 3: Secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de whiG y whiB obtenidas a 
partir del software readseq: 
 
whib_CDS (secuencia nucleotídica) 
 
 
>NZ_AORZ01000001_38 
gtgcacatcaaggcacacaccccgtcagtagccaccgacctgatccccccgcccgtccccacggaggactccttgaccccc
ctcgctccgctcaccgcgctcaccgacctcgacgacgcgatcgagaacctcggcacccccgtgccgtgccgcacctacgac
cccgaggtcttcttcgccgagtccccggccgacgtcgagtacgccaagtcgctctgccagacctgcccgctgcgtgaggcctg
cctcgccggcgcgaaggaccgccgcgagccctggggcgtctggggcggagagctcttcgtccagggcgtcgtcgtggccc
gcaagcgtccccgtggtcgcccgcgcaagaacccggtcgccgcatga 
 
whib_aa (secuencia en aminoácidos) 
 
 
 41 de 56 
>NZ_AORZ01000001_38 0 
VHIKAHTPSVATDLIPPPVPTEDSLTPLAPLTALTDLDDAIENLGTPVPCRTYDPEVFFAES
PADVEYAKSLCQTCPLREACLAGAKDRREPWGVWGGELFVQGVVVARKRPRGRPRKN
PVAA* 
 
whig_CDS (secuencia nucleotídica) 
 
 
>NZ_AORZ01000033_2592 
atgctcagcgcgcacggtgtgacacatccgacaaggagtgagcaacatatggtgcgtatgacgcgaagacggttcacggc
ggtcggggcgggggcggtgacggccctgggcctgttcccgggcgcgggacgggcggcggacgccgggactcccacgga
gttccggggcgtatgggccgccaccgtcgccaacatcgactggccgtcccgcccggggctcggccgggaccggcagcgc
gaggaactcctcgccctcctggactccgccgtgaagcggcggctcaacgtcgtcctcctccagatccggccgaccgccgac
gcgttctggccgtcgcggtacgaaccgtggtccgagttcctgaccggcacgcaggggaaggacccgggctgggacccgct
ggacttcgccgtccgcgaggcgcaccggcggagcctgcaactgcacggctggttcaacccgtaccgcatcgccaaccaca
ccgaccccgggcggctcgtgccgtcccacccggcgcggaagcacccgggctgggcggtgccctacggcgggaagctcta
ctacaaccctggcctgcccgacgtccggcggttcgtccaggacgccatgctcgacgcggtgttccgctacgacctcgacggg
gtgcacttcgacgactacttctacccgtacccggtggcggggcaggagttcgacgacgcggcggcctaccggcggtacggc
gggaagttctccgaccggggcgcctggcggcgggacaacatcgaccggctggtgcgcgagacgggcgagcgcatcaag
cggcgcaagaaacacgtgcggttcggggtgagcccgttcgccgtgtggcgcaataaggcgacggactcccggggttcgga
cacccgggccggcgtgcagacgtacgacgacctgtacgcggacacccggaagtgggtgcgcgagggatggatcgactac
atcgtcccccaggtctactggcacatcggcaacgccgcggccgactacgcgacgctcgtaccgtggtgggcccggaccgtg
cgcggcacccgcgtcggcctgtacatcggcgaggcgctctaccggcagggcgacccgtcacagcccgccccctggcagg
acccggccgaactctcccgccacctcacgctttgccggcgccatcgcgaggtgggcgggaacgtctacttctccgcccggca
ggtgcgcgacgacccgatcggggcgatggcgcgcgtggtcggggaccactacccccgccgcgcgcgcccgccgcgctg
a 
 
whig_aa (secuencia en aminoácidos) 
 
>NZ_AORZ01000033_2592 0 
MLSAHGVTHPTRSEQHMVRMTRRRFTAVGAGAVTALGLFPGAGRAADAGTPTEFRGV
WAATVANIDWPSRPGLGRDRQREELLALLDSAVKRRLNVVLLQIRPTADAFWPSRYEPW
SEFLTGTQGKDPGWDPLDFAVREAHRRSLQLHGWFNPYRIANHTDPGRLVPSHPARKH
PGWAVPYGGKLYYNPGLPDVRRFVQDAMLDAVFRYDLDGVHFDDYFYPYPVAGQEFDD
AAAYRRYGGKFSDRGAWRRDNIDRLVRETGERIKRRKKHVRFGVSPFAVWRNKATDSR
 42 de 56 
GSDTRAGVQTYDDLYADTRKWVREGWIDYIVPQVYWHIGNAAADYATLVPWWARTVRG
TRVGLYIGEALYRQGDPSQPAPWQDPAELSRHLTLCRRHREVGGNVYFSARQVRDDPIG
AMARVVGDHYPRRARPPR* 
 
ANEXO 4: ALINEAMIENTO DEL GEN bldA OBTENIDO A PARTIR DE PROGRAMA 
EXONERATE VERSIÓN 2.2.0 
 
En el siguiente alineamiento, la secuencia de aminoácidos superior corresponde a la se-
cuencia del ortólogo de bldA en S.fulvissimus y la secuencia inferior corresponde a la se-
cuencia de S.mobaraensis. Las líneas representan que hubo un alineamiento entre las 
dos secuencias y los punto que no hubo un alineamiento en esa parte de la secuencia. 
Como se puede observar, existe una correlación al buscar el gen del ortólogo en el ge-
noma de S.mobaraensis a partir del programa exonerate. 
 
 
 
 
 
 
C4 Alignment: 
 
------------ 
 
 Query: gi505421894refWP_015608996.1 
 
 Target: NZ_AORZ01000104.1.0.11269-14133 
 
 Model: protein2genome:bestfit 
 
 Raw score: 749 
 
 Query range: 0 -> 294 
 
 Target range: 1000 -> 1891 
 
 43 de 56 
 
 
 1 : MetArgSerSerAsnProValPheSerArgArgGlyPheSerArgAspAsnGlyHisAlaGl : 21 
 
 |||||||||!!!|||||||||||||||||||||||||||!!!! !! ..!|||:!!|||.. 
 
 MetArgSerArgAsnProValPheSerArgArgGlyPheThrProGlyGlyGlyTyrAlaAs 
 
 1001 : 
ATGAGGAGCAGGAACCCGGTCTTCTCGCGACGGGGGTTCACTCCCGGAGGCGGCTA
CGCGAA : 1061 
 
 
 
 22 : yPheAsnAlaAlaProGlnAlaGlyAlaAlaAlaThr >>>> Target Intron 1 >> : 34 
 
 !|||||||||||||||! !:!!|||:!!|||.!! ! 33 bp 
 
 nPheAsnAlaAlaProProSerGlySerAlaThrGln+- 
 
 1062 : CTTCAACGCGGCACCGCCGTCCGGGTCCGCGACGCAGgg....................... : 
1102 
 
 
 
 35 : >> GlyAlaAsnProPheAlaGlnGlyThrAlaAlaAsnProTyrAlaThrAsnProTyrA : 53 
 
 !|||:!!|||!:!||| ..! !! !!.!.!.||| ! ! !! !! !! ! ! 
 
 ++ProAlaAspProTyrAlaGlyAsnProTyrGlyGlnProThrAsnProTyrAlaGlnG 
 
 1103 : 
..agCCGGCCGACCCGTACGCGGGCAACCCGTACGGCCAGCCCACCAACCCGTACGC
GCAGG : 1190 
 
 44 de 56 
 
 
 54 : laGlnGlnGlyThrGlnProGlyAlaPro<->AlaProAlaArgThrAspAlaMetThrIle : 72 
 
 .! ! ! ! !|||! !||| !||| |||||||||||| !!! !|||||||||!!: 
 
 lyAlaProAspLeuGlnGlnGlyMetProGlnAlaProAlaArgProGlyAlaMetThrMet 
 
 1191 : 
GCGCCCCCGATCTCCAGCAGGGGATGCCGCAGGCCCCGGCCCGCCCGGGCGCCAT
GACGATG : 1250 
 
 
 
 73 : AspAspValValThrArgThrAlaMetThrLeuGlyThrValValValAlaAlaAlaIleAl : 93 
 
 ||||||||||||!:!|||||||||!!:||||||||| !|||:!!|||||||||!.! || 
 
 AspAspValValSerArgThrAlaIleThrLeuGlyLeuValIleValAlaAlaGlyAlaAl 
 
 1251 : 
GACGACGTCGTCAGCCGCACCGCCATCACGCTGGGCCTGGTGATCGTCGCGGCCGG
CGCGGC : 1313 
 
 
 
 94 : aTrpTrpAlaLeuProValAspGlnAlaAsnLeuGlyThrAlaTyrGlyValAlaIleGlyA : 114 
 
 |||| ||| ! ! !! !|||:!!!.!.!!|||| 
 
 aTrp------------------------AlaLeuLysLeuProValGlyLeuGlyPheGlyA 
 
 1314 : GTGG------------------------GCGCTCAAGCTGCCGGTCGGCCTCGGCTTCGGTG : 
1352 
 
 45 de 56 
 
 
 115 : laAlaIleIleGlyPheValLeuSerLeuValAsnSerPheLysArgArgProSerProPro : 134 
 
 |||||:!:|||!.!.!.||||||.!!||||||.!.||||||||| !!:!||||||||| !! 
 
 laAlaValIleAlaMetValLeuGlyLeuValGlnSerPheLysAlaLysProSerProAla 
 
 1353 : 
CCGCGGTGATCGCGATGGTGCTGGGCCTCGTCCAGTCGTTCAAGGCCAAGCCGTCC
CCGGCG : 1412 
 
 
 
 135 : LeuIleLeuThrTyrAlaAlaPheGluGlyValPheLeuGlyValValSerAsnIleValSe : 155 
 
 |||||||||.!!||||||||||||||||||:!!||||||||||||:!!|||.!. !!: 
 
 LeuIleLeuAlaTyrAlaAlaPheGluGlyLeuPheLeuGlyValIleSerGlnAlaTyrAs 
 
 1413 : 
CTGATCCTCGCCTACGCGGCGTTCGAGGGCCTGTTCCTCGGTGTGATCAGCCAGGC
GTACAA : 1475 
 
 
 
 156 : rValTyrValAlaProGlyAlaAlaMetGlnAlaValLeuGlyThrMetAlaValPheAlaG : 176 
 
 ! ! |||||| !|||||| !!|||||||||||||||||||||:!!||||||||||||| 
 
 n---GluValAlaLysGlyAlaProMetGlnAlaValLeuGlyThrValAlaValPheAlaG 
 
 1476 : C---
GAGGTCGCCAAGGGCGCCCCGATGCAGGCGGTGCTGGGCACGGTGGCGGTCTTCG
CCG : 1535 
 46 de 56 
 
 
 
 177 : lyValLeuIleAlaTyrArgThrGlyLeuIleArgValThrArgArgPheTyrGlyPheVal : 196 
 
 ||||||||.!!|||||||||.!! !!:!!|||!.!|||!.!!.!||||||||| !!|||||| 
 
 lyValLeuPheAlaTyrArgAlaArgIleIleAsnValAsnAsnArgPheTyrArgPheVal 
 
 1536 : 
GTGTGCTCTTCGCGTACCGGGCCCGGATCATCAACGTGAACAACAGGTTCTACCGCT
TCGTG : 1595 
 
 
 
 197 : MetAlaAlaAlaIleGlyPheMetLeuLeuMetMetValAsnLeuLeuPheAlaValPheGl : 217 
 
 !.!|||||||||||||||:!!|||||| :!:||||||:!!|||||||||!.!||||| 
 
 AlaGlyAlaAlaIleGlyPheLeuLeuLeuGlyValValAsnMetLeuPheAlaAlaPheGl 
 
 1596 : 
GCCGGTGCCGCGATCGGCTTCCTGCTGCTGGGCGTCGTCAACATGCTGTTCGCCGC
CTTCGG : 1658 
 
 
 
 218 : yGlyGlyAspGlyLeuGlyPheArgSerGlyAlaLeuGlyValValPheGlyIleValAlaI : 238 
 
 |||||||:!!|||||||||||||||!!!|||