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1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS Caracterización morfológica y funcional de las células efectoras al estímulo proliferativo de la FSH y hCG en gónadas embrionarias de aves con 13 días de incubación. T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍ TULO DE: BIÓLOGO P R E S E N T A : GUILLERMO ESPINOSA VILLANUEVA DIRECTOR DE TESIS: DR. PEDRO NICOLÁS VELÁZQUEZ Ciudad Universitaria, Cd. Mx., 2016 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 Datos del alumno 1.Datos del alumno Hoja de Datos del Jurado. Apellido paterno Espinosa Apellido materno Villanueva Nombre(s) Guillermo Teléfono 5512911018 Universidad Nacional Autónoma de Universidad Nacional Autónoma de México México Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias Carrera Biología Número de cuenta 080528711 1. Datos del tutor 2. Datos del tutor Grado Dr. Nombre(s) Pedro Apellido paterno Nicolás Apellido materno Velázquez 2. Datos del sinodal 1 Datos del sinodal 1 Grado Dra. Nombre(s) Patricia Apellido paterno Rivas Apellido materno Manzano 3. Datos del tutor 2 2. Datos del tutor 2 Grado Dra. Nombre(s) Irma Apellido paterno Peralta Apellido materno Delgado 4. Datos del tutor 3 2. Datos del tutor 3 Grado Dr. Nombre(s) Pedro Apellido paterno Nicolás Apellido materno Velázquez 5. Datos del tutor 4 2. Datos del tutor 4 Grado Dr. Nombre(s) René de Jesús Apellido paterno Cárdenas Apellido materno Vázquez 6. Datos del tutor 5 2. Datos del tutor 5 Grado Dra. Nombre(s) Juana Alba Apellido paterno Luis Apellido materno Días 3 Caracterización morfológica y funcional de las células efectoras al estímulo proliferativo de la FSH y hCG en gónadas embrionarias de aves con 13 días de incubación. CONTENIDO Dedicatorias……………………………..….….………….4 Agradecimientos………………………..…..…..….…….. 5 RESUMEN……………………….………………………...…6 INTRODUCCIÓN………………….……………….….....….7 Desarrollo gonadal...............................................................8 Ovario…………………….…………………...……..…....11 Formación del folículo en aves…….………….……..........12 Hormonas testiculares…………………………………..…14 Hormonas que regulan la esteroidogénesis…………..…....17 Hormona gonadotrópica coriónica humana……………….18 Hormonas esteroides............................................................19 Inervación gonadal...............................................................20 JUSTIFICACIÓN.....................................................................25 HIPÓTESIS…………………………………………….…..…25 OBJETIVOS.…………………………….….………...…..….25 MATERIALES Y MÉTODOS…………………………….…26 RESULTADOS.………………………………………………28 Morfología gonadal….....................…..….......................…29 Concentración Estradiol y Testosterona.………..………....34 DISCUSIÓN………………………….……………...….....…37 CONCLUSIONES………………………………………....…39 REFERENCIAS.……….…………………………………......40 APÉNDICE.…………………………………………….….....46 4 DEDICATORIA Dedicado a todas las personas que me han acompañado en esta gran aventura, algunas ya se han convertido en estrellas, así continúan iluminando mi camino. Otras en el camino están. A mis padres Ernesto y Cristina. Y a mí demás gran familia. A mis amigos, a mis maestros y compañeros: Teresa Arenas, Carlos Mújica, Laura, José Trujillo, Ana Bel de la Rosa, Agustín Carmona, Ismael Herrera, entre otros. 5 AGRADECIMIENTOS Al Dr. Pedro Nicolás Velázquez y a la Dra. Irma Peralta Delgado, les agradezco los conocimientos, consejos que siempre me brindaron, el acicate que de mucho ha servido, y la oportunidad que me brindaron de poder realizar el presente estudio en el laboratorio de cultivo de tejidos en la facultad de medicina en la UNAM. Agradezco en forma muy especial a los sinodales, por su valiosa participación en la revisión del presente trabajo y por sus acertadas sugerencias que sin duda lo mejoraron. A las Doctoras, Juanita, Irma, Respetuosamente les agradezco su invaluable apoyo. 6 RESUMEN En la mayoría de las aves, como en gorriones y palomas, las hembras desarrollan bilateralmente ovarios y oviductos funcionales. Sin embargo, en algunas especies, tales como el gallus domesticus, aunque inicialmente se desarrollan los dos primordios gonadales, alrededor del día 10 del desarrollo embrionario el ovario derecho empieza a degenerar hasta convertirse en una estructura vestigial al nacimiento; mientras que en los machos los testículos se desarrollan bilateralmente. La función básica de las gónadas es proveer gametos viables para la reproducción y la producción de hormonas sexuales, cuya producción es regulada por las hormonas luteinizante (LH) y la hormona folículo estimulante (FSH), producidas en la adenohipófisis. La LH y FSH, actúan sobre sus células blanco en los ovarios y testículos. El objetivo del presente estudio fue determinar si las gónadas del embrión de pollo (Gallus domesticus), en el día 13 de la incubación, tienen respuesta esteroidogénica ante la estimulacióncon FSH y hCG, así como relacionar la respuesta esteroidogénica con el patrón de inervación en el desarrollo gonadal temprano de las aves. Se disecaron los ovarios y testículos derechos e izquierdos de embriones de pollo en el día 13 de la incubación y se procesaron histológicamente, con las técnicas de Bielschowski y en cortes semifinos con azul de toluidina. En un bioensayo se cuantifico la secreción de estradiol y testosterona en respuesta a la administración de FSH y hCG en los tejidos ovárico y testicular por Radioinmunoanálisis (RIA). En el día 13 de la incubación se puede diferenciar morfológicamente el ovario del testículo. El ovario izquierdo es de mayor tamaño que el derecho y tiene mayor organización histológica, en ambos ovarios se observaron más fibras nerviosas que en los testículos. Se observó que la administración de FSH y hCG incrementó la síntesis de estradiol y testosterona en todos los tejidos gonadales; el ovario izquierdo fue el que produjo significativamente más esteroides. Estos resultados mostraron que el tejido testicular y ovárico del embrión de pollo de 13 días de incubación tiene respuesta esteroidogénica a la FSH y hCG y esta respuesta puede estar asociada a una mayor 7 organización histológica. Los datos fueron analizados con las pruebas estadísticas de ANOVA y las pruebas de comparaciones múltiples de Duncan y Tukey INTRODUCCIÓN La determinación genética del sexo en las aves y en los mamíferos se da al momento de la fecundación. En las aves, los machos son homogaméticos, produciendo espermatozoides que portan el cromosoma Z, mientras que las hembras son heterogaméticas y producen óvulos con los cromosomas sexuales Z ó W, por lo que a diferencia de los mamíferos, la hembra es la que determina el sexo genético (Smith y Sinclair 2004; Smith 2010). La combinación cromosómica ZZ origina un macho, mientras que ZW una hembra. Durante el desarrollo embrionario las gónadas atraviesan por una etapa indiferenciada, en la que morfológicamente no es posible determinar primordios de ovario o testículo. Posteriormente, se presentan cambios morfológicos que permiten distinguir características propias de los ovarios o los testículos. En las aves el sexo morfológico puede distinguirse alrededor de los 6.5 días de incubación, por la diferenciación del epitelio germinativo y la presencia de las células Germinales Primordiales (CGP) (Villalpando y cols. 2000; Bruggerman y cols. 2002). En las aves y en los mamíferos después de la diferenciación del primordio gonadal en ovario o testículo, se inicia la síntesis de estradiol, testosterona y de hormona antiMülleriana, hormonas relacionadas con diferenciación sexual secundaria, En esta etapa ocurre la diferenciación morfológica de los conductos sexuales característicos del macho y la hembra. El papel de las hormonas sexuales durante la diferenciación de la gónada en las aves, se ha demostrado en los experimentos de masculinización cuando a embriones de hembras se les administra un inhibidor de la enzima P450 aromatasa, la cual convierte la testosterona en estrógenos, principalmente 17β-estradiol en los 5 a 7 días de la incubación (Elbrechet y Smith 1992). El gen para aromatasa en el pollo se expresa en ambas gónadas a los 5-6 días de incubación y después se encuentra únicamente en el ovario (Bruggerman y cols. 2002). Se demostró también que la administración de 8 estradiol en aves de 7 días de desarrollo indujo la formación de ovotestis en machos (Nakabayashi y cols. 1998; Smith 2010). Desarrollo gonadal Tanto en las aves, como en los mamíferos, en la etapa de gónada indiferenciada se observan principalmente tres tipos celulares: 1) células epiteliales de la cresta gonadal, 2) células del mesénquima y 3) células germinales primordiales. Estas últimas darán origen a ovogonias o espermatogonias según el sexo genético del embrión. En el pollo las células germinales primordiales se pueden distinguir antes de la gastrulación, en el día 1.5 de incubación. Agregados de células germinales primordiales se encuentran en la región anterior extraembrionaria en la porción central del área pelúcida, mientras que en humanos se localizan entre las células endoteliales de la pared del saco vitelino cerca de la alantoides (Sadler 2004). Morfológicamente las CGPs se pueden reconocer porque son de mayor tamaño que las células somáticas, tienen citoplasma claro, núcleo grande vesiculoso y redondo con nucléolos prominentes (Fig. 1). Con pruebas histoquímicas es posible detectar enzimas específicas y sustancias químicas como la fosfatasa alcalina (mamíferos), esterasas, abundante glucógeno (aves). Figura 1. A) Fotomicrografía electrónica de barrido de una célula germinal primordial de pollo en cultivo. (Tomada de Won y cols. 2010). B) Corte semifino de células embrionarias de ovario de pollo en cultivo, ovogonias (OV) (Cortesía Dra. Margarita González del Pliego). B 9 Las CGPs migran por movimientos ameboideos a lo largo del mesenterio dorsal del intestino posterior y llegan a las gónadas primitivas al comienzo de la quinta semana, en humanos. Estas células migran por dos tipos de movimientos, a) desplazamiento pasivo y b) desplazamiento ameboideo activo. En las aves, las CGPs son transportadas al interior del organismo por desplazamiento pasivo y atraviesan las paredes de los vasos sanguíneos por diapédesis (Ruiz-Durán 1988). En la gallina ambos ovarios inician su diferencia aproximadamente a las 72 horas de la incubación. Después del décimo día de la incubación el ovario derecho empieza a presentar regresión (Teng y Teng 1979; Morrish y Sinclair 2002). En el día 4 de incubación del epitelio celómico se forman los cordones epiteliales, llamados cordones sexuales primitivos o “cordones medulares primarios”. Las células de estas estructuras proliferan por mitosis y alrededor de ellos se establecerán células mesenquimatosas, algunas con características morfofisiológicas de células productoras de hormonas esteroides (Johnson 2014). Se ha detectado que a los 6.5 días del desarrollo presentan actividad 3-βhidroxiesteroidehidrogenasa, y 5-4 deshidrogenasas (3β-HSD). En el ovario de las aves, la secreción de 17-β estradiol, testosterona y progesterona ha sido detectada entre los 6-7 días de incubación (Gómez y Gómez 2011). Al avanzar el desarrollo gonadal, los cordones sexuales primitivos mostrarán cambios dependiendo de la gónada que se está diferenciando. En el caso del testículo entre los días 6 a 7.5 del desarrollo embrionario, estos cordones se establecerán en la región medular y darán origen a los cordones testiculares. En el caso del ovario, estas estructuras están presentes en la región medular, pero no se desarrollan como en el caso del testículo (Smith 2010) (Fig 2). 10 Figura 2. Diferenciación gonadal de pollo. Una vez establecidas las CGPs en las crestas urogenitales se inician cambios en la morfología gonadal. En embriones ZW las CGPs se establecen en la región de la corteza, mientras que en embriones ZZ la corteza se reduce y los cordones testiculares se establecen en la región medular con células germinales. El ovario izquierdo se desarrolla, mientras que el derecho degenera (Smith y Sinclair, 2004). Durante el desarrollo del ovario, aumenta el tejido epitelial, el estroma y los vasos sanguíneos; se establecen en este órgano dos regiones topográficas bien definidas, la corteza y la médula. Entre los días 8° y 11° del desarrollo se forma la corteza, en la cual se pueden observar acúmulos o cordones corticales desde el 10o día de desarrollo, dentro de estas estructuras se encuentran células germinales. En la región medular se desarrollan gran cantidad de acúmulos de células secretoras de hormonas esteroides(DeFalco y Capel 2009). Asimismo, se observa la presencia de conductos lacunares característicos de la gónada femenina (González del Pliego y cols. 1988). Las ovogonias se multiplican rápidamente hasta alcanzar su número máximo el día 17 de incubación y disminuye su número hasta el momento de la eclosión (Hughes 1963). Cordones Seminíferos Reducción de la Corteza Células germinales Medula Fragmentada Corteza Engrosada Células germinales meióticas 2.5 D. Gónada indiferenciada Medula Corteza Testículo 6-7.5 D. Ovario 10 D. Gónada D I mesonefros CGP 72hrs . 1.5 D. 4 D. 11 En el desarrollo, las células germinales que llegan a la zona cortical de los ovarios, se agrupan y mantienen en contacto entre ellas por uniones comunicantes, formando estructuras denominadas nidos de ovogonias, que se encuentran rodeados por células somáticas prefoliculares (fig. 3) (Peralta y Velázquez, 2013). Figura 3. Corte semifino de ovario embrionario de pollo de 18 días de incubación. A) Nidos de ovogonias en la región cortical (1), B) Cúmulos de células con inclusiones lipídicas productoras de hormonas esteroides en la médula ovárica (2), células pregranulosas (c) (Tomado de Peralta y Velázquez, 2013). Ovario El ovario de las aves se localiza en la parte superior de la cavidad abdominal por debajo de la aorta y de la vena cava posterior, este órgano se apoya sobre la parte apical lateral interna del riñón a un lado de la glándula adrenal, sobre el saco aéreo abdominal izquierdo (Fig. 4), se sujeta por el ligamento mesovárico del extremo cefálico del riñón izquierdo, recibe sangre de la arteria ovárica que usualmente proviene de la arteria renolumbar y de la rama directa de la aorta dorsal. Una característica del ovario de las aves, en comparación con el ovario de los mamíferos es el gran número de neuronas ganglionares y la distribución compleja de la inervación en el músculo liso, que 1 2 2 4 c 12 interviene en la contracción folicular. Las fibras nerviosas al parecer corren paralelas en la dirección de las fibras musculares (Callebaut 1979). El ovario de pollo es inervado por nervios simpáticos y parasimpáticos, con fibras adrenérgicas y colinérgicas (Gilbert 1969). Figura 4. Se muestra disección de pollo: el ovario derecho (Ov. D.) más pequeño que el ovario izquierdo (Ov. I.) en la parte dorsal de la cavidad abdominal cerca de la línea media hacia el borde apical del riñón (R) (extremo craneal). Formación del folículo en las aves Los folículos que son la unidad morfológica y funcional del ovario, están formados por las células de la granulosa y de la teca, que además de crear el microambiente del ovocito al rodearlo, son la principal fuente de hormonas esteroides. En las aves el folículo primordial se forma cuando se rompen los nidos de células germinales y empiezan a individualizarse al ser rodeadas por células de la pregranulosa. En el periodo en que las células germinales son rodeadas por estas células, se observa una gran disminución de células germinales, debido a que mueren por apoptosis. Las células de la pregranulosa Ov. D Ov. I R 13 que rodean al ovocito de las aves son aplanadas y durante el desarrollo se transforman en cúbicas. Entre las células de la granulosa y el ovocito se forma una envoltura perivitelina formada de glucoproteínas (Johnson 2014). En las aves a diferencia de los mamíferos, el ovocito está rodeado por una sola capa de células foliculares, para facilitar la vitelogénesis (Johnson 2014). En las aves, la producción de progesterona ha sido demostrada en las células de la granulosa, mientras que la secreción de 17β-estradiol, testosterona y androstenediona se ha demostrado en las células de la teca (Marrone y cols. 1985; Gómez y cols. 1998). Después de que se forma el folículo primario puede permanecer quiescente, en la corteza del ovario por meses o años. La transición de folículo primario a folículo en crecimiento es acompañada por la formación de las células de la teca, a partir de las células del mesénquima. La capa única de las células foliculares o de la granulosa no se estratifica, como ya se indicó. Este periodo se conoce como desarrollo lento, en esta etapa el folículo puede alcanzar un diámetro de aproximadamente de 0.05-1.0 mm. Se desconocen los factores intraováricos que regulan este periodo, aunque se ha establecido que el ovocito participa notoriamente en la regulación de esta fase. En la segunda etapa, la cual ocurre en la madures sexual, el folículo aumenta de tamaño rápidamente, debido a la acumulación de vitelo, cuya síntesis es regulada por las gonadotropinas y las hormonas esteroides, principalmente el estradiol. Los componentes del vitelo; las proteínas lipovitelina, fosfovitina, y lipoproteínas son sintetizados en el hígado y transportados al ovario por vía sanguínea. La mayor parte de lípidos y proteínas son depositados en el desarrollo lento, en una proporción similar, mientras que en la fase del desarrollo final, el cual es más rápido, son depositados más lípidos. El último periodo del desarrollo folicular abarca de los 7 a 11 días, antes de la ovulación; en esta fase la mayoría de los lípidos son depositados en la yema. En este paso final del desarrollo el folículo crece en un promedio de 8 a 37 mm en diámetro y de 0.08 a 15-18gr. de peso. La composición final del vitelo en el huevo de la gallina, consiste en un 33% de lípidos y un 16% de proteínas en peso húmedo. Se sugiere que la vitelogénesis termina 24 h antes de la ovulación. Con el aumento en la edad ocurre una disminución en el número de folículos que alcanzan la fase rápida del desarrollo (Johnson 1986). 14 La gónada en el adulto tiene el aspecto de un racimo de uvas debido a la presencia de 7 a 10 folículos portadores de vitelo, que se encuentran en fase de crecimiento rápido, junto a estos se observan folículos más pequeños y folículos atrésicos (McLelland 1992). Organización testicular En aves los cordones sexuales primitivos se diferencian del epitelio celómico a los 4 días de incubación, los cordones sexuales son arreglos epiteliales delimitados por una lámina basal y en su interior se localizan las células germinales. A partir del estroma testicular se diferenciarán varios tipos celulares, como las células de Leydig, células mioides (peritubulares), fibroblastos, células endoteliales (Fig. 5). Durante el desarrollo, los cordones sexuales se desplazan del epitelio celómico hacia la región medular por la invasión de vasos sanguíneos, fibronectina y colágeno. Estos cordones ahora llamados cordones testiculares, se encuentran rodeados por células peritubulares que delimitan y mantienen la morfología del cordón y células de Leydig productoras de testosterona que se localizan en la región intersticial. Dentro del cordón se encuentran células de Sertoli que tienen como función la nutrición y soporte de las células germinales (espermatogonias) y la producción de inhibina y la hormona antimülleriana, entre otras hormonas que regulan la aparición de los caracteres sexuales primarios y secundarios, así como el mantenimiento de la espermatogénesis. A medida que avanza el desarrollo embrionario, los cordones testiculares se separan del epitelio celómico por el aumento de una capa densa de tejido conjuntivo llamada túnica albugínea (Johnson 1986). Los conductos deferentes se diferencian en el día 18 de la incubación a partir de los conductos mesonéfricos o de Wolff. 15 Figura. 5. Corte histológico semifino de testículo de embrión de pollo de 18 días de incubación. Se observan cordones seminíferos (A), 1) delimitadopor lamina basal en su interior se observan células de Sertoli (2) y espermatogonias (3). En la región intersticial (B) se observan células de Leydig (4), células mioides o peritubulares (5), fibroblastos (6). (Tomado de Peralta y Velázquez, 2013). En aves adultas los testículos son órganos pares, de forma arriñonada, situados entre la base de los pulmones y el segmento intermedio de los riñones. Cada testículo está sujeto a la línea media de la pared corporal interna por el ligamento mesorquium y se encuentran desfasados en sentido céfalo-caudal uno del otro, aunque están próximos a los sacos aéreos, su temperatura es la misma que la temperatura corporal de 41-43 °C, por lo que la espermatogénesis en aves no se realiza a una temperatura inferior a la corporal como en el caso de los mamíferos (fig. 6). 2 3 4 5 A B 6 1 16 Figura. 6. Muestra que los testículos (T) de pollo son órganos pares internos desfasados en sentido céfalo-caudal uno del otro, situados entre la base de los pulmones y el segmento intermedio de los riñones (R) se encuentran en la parte dorsal de la cavidad abdominal cerca de la línea media, adherido cada uno a la pared corporal por el ligamento mesorquium. El testículo consiste de una serie de circunvoluciones de tubos seminíferos entre tejido conectivo, red arteriovenosa y linfática y una red nerviosa. El parénquima testicular, que no es tabicado a diferencia de algunos mamíferos, está compuesto por el compartimento tubular (aproximadamente el 85-95% del volumen testicular) y la región intersticial. En los túbulos seminíferos se localizan las células de Sertoli que secretan estrógenos (17estradiol, estrona) y las espermatogonias, mientras que en la región intersticial se encuentran células de Leydig, productoras de andrógenos. Alrededor de los túbulos seminíferos se localizan células peritubulares o mioides, que controlan la contracción de los túbulos (Skinner y Fritz 1986). Los túbulos seminíferos se anastomosan para formar la rete testis, que se comunica con los conductos eferentes que desembocan lateralmente en el canal del epidídimo, éste último se conecta con el conducto deferente, que es muy replegado. En el epidídimo maduran y se almacenan los espermatozoides. Los conductos deferentes desembocan a T R 17 través de la vesícula espermática en el urodeo. Cada una de las dos vesículas espermáticas termina en una papila eyaculadora. En varias especies de aves la circulación sanguínea del testículo es menos compleja, que la descrita en mamíferos, esto se debe en parte, a que en las aves los testículos no están escrotados y no existe el plexo panpiniforme. La sangre fluye a cada testículo desde la aorta abdominal, los vasos linfáticos del testículo de las aves no están bien caracterizados pero están presentes cerca de las células de Leydig; en aves no hay órganos comparables a la glándula prostática de mamíferos, glándula bulbouretral o vesícula seminal, el líquido seminal va desde los túbulos seminíferos a los vasos deferentes. (Skinner y Fritz 1986). Hormonas que regulan la esteroidogénesis En la naturaleza los organismos se ven afectados por factores externos como el ciclo luz- obscuridad, la temperatura, el sonido, entre otros. Aunque factores internos, como la nutrición y el estrés, también influyen en los seres vivos. Estos factores afectan la actividad reproductiva de los organismos al influir en la liberación de factores endócrinos a nivel del hipotálamo y la hipófisis anterior, que regulan las funciones endocrinas de las gónadas. La hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), secretada por el hipotálamo, es un decapéptido, que se ha conservado desde los peces hasta el hombre. Las neuronas que producen GnRH tienen su origen embrionario fuera del sistema nervioso central y derivan de la placoda olfatoria durante la gestación temprana, dichas neuronas migran hacia el hipotálamo, junto con o como parte del nervio terminal a través de la lámina cribiforme. La GnRH es liberada por el hipotálamo por pulsos generados que desencadenan los esteroides. La cantidad de GnRH que se produce es poca y su vida media es corta (10 minutos en humanos). Esta hormona pasa a la sangre del sistema portal hipotálamo-adenohipofisiario a la hipófisis anterior, conocida como adenohipófisis, en donde estimula la liberación de las hormonas gonadotropicas; la hormona estimulante del folículo (FSH) y la hormona luteinizante (LH) (Jean-Louis y cols. 1991). La LH actúa sobre las células de la teca interna estimulando la producción de andrógenos, a partir de colesterol, principalmente testosterona, y la secreción de http://es.wikipedia.org/wiki/Hormona_liberadora_de_gonadotropina http://es.wikipedia.org/wiki/Hip%C3%B3fisis_anterior http://es.wikipedia.org/wiki/Hormona_estimuladora_del_fol%C3%ADculo http://es.wikipedia.org/wiki/Hormona_luteinizante 18 progesterona. Los andrógenos producidos en las células de la teca interna difunden hacia las células de la granulosa, en donde son aromatizados a estrógenos. La LH regula la maduración folicular y junto con otros factores como las prostaglandinas, produce la liberación del ovocito al elevarse sus niveles previamente a la ovulación. Esta hormona también participa en el mantenimiento del cuerpo lúteo (Huang y Nalvandov 1979; Ritzhaupt y Bahr 1987). La FSH ejerce su acción sobre las células de la granulosa al interactuar con su receptor localizado en la membrana de estas células. Una vez unido a su receptor, la FSH activa varias vías de señalización intracelular en las que participan el AMPc, la proteína cinasa C y las tirosinas cinasas. Esta hormona estimula la expresión de la enzima P450 aromatasa, que transforma los andrógenos en estrógenos, principalmente 17β-estradiol. Esta hormona esteroide promueve el desarrollo folicular induciendo la proliferación de las células de la granulosa (Johnson 2003). En el testículo la LH actúa sobre las células de Leydig estimulando la producción de andrógenos, particularmente testosterona, a partir de colesterol. La testosterona es necesaria para la diferenciación gonadal y el mantenimiento de la espermatogénesis, entre otras funciones (Huang y Nalvandov 1979; Ritzhaupt y Bahr 1987). En el testículo la FSH se une a los receptores presentes en la membrana de las células de Sertoli, en estas células estimula la síntesis de la proteína ligadora de andrógenos (ABP), para que estas células capten testosterona, necesaria en la producción de espermatozoides y para la producción de la hormona antimulleriana, que durante el desarrollo fetal induce la degeneración de los conductos Müller, además de participar también en la regulación de la espermatogénesis. Hormona gonadotropina coriónica humana (hCG) Las células trofoblásticas de la placenta producen la hormona gonadotropina coriónica humana (hCG), la cual posee 2 subunidades, la subunidad α que es común a otras hormonas como la LH, FSH y la hormona estimuladora de tiroides (TSH), mientras que la subunidad β es similar en la hCG y LH. La hCG estimula la fusión de las células 19 citotrofoblásticas para formar el sincitiotrofoblasto, estimula la vascularización uterina para la implantación, protege al embrión del rechazo inmunológico de la madre y estimula la síntesis de progesterona en el cuerpo lúteo, entre otras funciones. Al igual que otras gonadotropinas, esta hormona se une a su receptor de membrana activando a las proteínas G y produciendo posteriormente la liberación de AMPc. Tanto la hCG como la LH comparten el mismo receptor (LH/hCG) sin embargo, la vida media de la LH en la circulación fetal es de aproximadamente 25-30 minutos, mientras que la hCG tiene una vida media de 37 horas (Schalch y cols. 1968; Faiman y cols. 1968; Velázquez y cols. 2013). Hormonas Esteroides Las hormonas esteroides sexuales son losestrógenos, andrógenos y progestágenos producidos por las gónadas. Estas hormonas son lípidos no saponificables, poco solubles en agua, solubles en disolventes orgánicos y con un núcleo común que es el ciclopentanoperhidrofenantreno, su estructura química básica es el colesterol, que es un hidrocarburo de 27 átomos de carbono (C-27) (Payne y Hales 2004). Los esteroides sexuales pueden ejercer efectos autocrinos, paracrinos y endocrinos en la regulación de la reproducción; por ejemplo, a nivel autocrino inducen mitosis en las células de la granulosa, célula en la cual se sintetizan. Tiene efectos paracrinos al inducir en las células de la teca, la expresión de receptores a LH. Los efectos endocrinos los ejerce a distancia por lo cual tienen que ser transportados a través de la circulación, en la cual se fijan a proteínas plasmáticas para desplazarse a las células del órgano que será el blanco, en donde ejercen un efecto específico. Su naturaleza lipídica les permite atravesar la bicapa de las membranas celulares para posteriormente unirse a sus receptores específicos que se localizan en el citosol o en el núcleo de las células diana. Uno de los efectos endocrinos más conocidos de los esteroides sexuales es la acción de la testosterona, producida en las células de Leydig, sobre los músculos y el hueso para estimular el aumento de la masa muscular y de la densidad ósea, respectivamente. http://es.wikipedia.org/wiki/AMPc http://es.wikipedia.org/wiki/Citosol http://es.wikipedia.org/wiki/N%C3%BAcleo_(c%C3%A9lula) 20 En las hembras el 17β-estradiol, ejerce efectos endocrinos en diversos órganos y tejidos, durante la madurez sexual, para la aparición de los caracteres sexuales secundarios femeninos (Eppig 2001). Inervación gonadal En general, el ovario es inervado por el nervio ovárico superior, y el nervio vago, la regulación de las funciones del ovario por signos neurales implican la liberación de neurotransmisores en una secuencia que depende del estado de madurez reproductiva. En las aves, en comparación con los mamíferos, varían algunas estructuras; por ejemplo en la gallina, los riñones están ubicados en las depresiones de la superficie ventral del sinsacro, el cual es una estructura ósea formada por la fusión de vertebras torácicas lumbares y coccígeas, en esta estructura se encuentran también los huesos pélvicos ilion, isquion y pubis. Entre la fosa renal de cada ilion y riñón, pasan grandes vasos sanguíneos y nervios, que forman el plexo nervioso sacro, el cual se encuentra en la zona ventral de la porción media del riñón, inmediatamente por delante de la arteria ciática (fig. 7). El ovario es inervado por el sistema nervioso simpático y parasimpático, con inervación eferente motora proveniente del sistema nervioso autónomo. Además, estos nervios poseen fibras aferentes (sensitiva visceral) que llevan la información al sistema nervioso central. Nervios que llegan al ovario por vía del nervio ovárico superior, viajan a lo largo del ligamento suspensorio junto con vasos, forman el plexo nervioso del ovario. Cuerpos neuronales posganglionares eferentes se localizan tanto en los ganglios prevertebrales y paravertebrales, y en el ganglio ovárico localizado en el origen del nervio del ovario (Klein y Carga 1988 b). Varios estudios indican que el nervio superior del ovario y el nervio vago están involucrados en el control de las funciones de ovario, incluyendo el inicio de la pubertad y la ovulación. Por otra parte, estudios recientes han aportado evidencias que sugieren la existencia de una vía neural directa, entre el ovario y el cerebro, independiente de la regulación del eje hipotálamo-hipófisis-gónada, que ejerce una acción neural reguladora en el ovario (To'th y col. 2007). 21 Las neuronas preganglionares simpáticas que inervan el ovario, se encuentra intermediolateralmente, en la médula espinal, entre los segmentos torácicos inferior y lumbar superior de la columna, mientras que el componente parasimpático de la inervación del ovario deriva del nervio vago. Los cuerpos neuronales de las fibras aferentes viscerales se encuentra en la raíz dorsal de los ganglios torácico y lumbar dorsal (dorsal inferior, superior lumbar) y el ganglio nodoso (el más grande) del nervio vago (Klein y Burden 1988; Nance y col. 1988). Entre los días 10 y 14 post eclosión, se ha demostrado la presencia de dopamina B- hidroxilasa y triptófano hidroxilasa, en la corteza y médula del ovario. En el ovario, el folículo recibe inervación de tipo adrenérgico (adrenalina) y colinérgico (acetilcolina). Asimismo, en la teca interna se han observado numerosas terminaciones nerviosas tanto colinérgicas como adrenérgicas, algunas de ellas están directamente asociadas con los vasos sanguíneos, pero muchas terminan libremente, aunque no se ha demostrado, si pudieran estar vinculadas con algún tipo de célula en particular (fig.8) (Unsicker y cols. 1983). También se ha observado inervación simpática en la glándula del cascarón (en el utero) proveniente del nervio hipogástrico (Johnson 1986). En el pollo la presencia de numerosas células de músculo liso en los conductos lacunares de los folículos sugiere contractibilidad o aumento intermitente en el tono. Estos músculos lisos son inervados por fibras nerviosas que corren paralelas en la dirección de las fibras musculares (Gilbert 1969). Se cree que la contracción del músculo liso en el folículo maduro, forma parte del mecanismo que participa en la ruptura del estigma antes de la ovulación (Guzsal. 1966). Una destacada característica del ovario de las aves, en comparación con los mamíferos, es el gran número de neuronas ganglionares y la complejidad de la distribución de los fascículos nerviosos finos (Gilbert 1969). Un sistema lacunar comparable al observado en el ovario de las aves, no parece existir en el de los mamíferos euterios (Callebaut, 1979). Esto podría indicar que en el ovario aviar además de controlar el flujo de sangre y la función secretora de la teca, la inervación también puede tener una influencia en la contracción coordinada del músculo liso de folículo (Dahl 1970). 22 La inervación en el testículo de las aves ha sido poco estudiada, aunque algunos indican que ésta es similar a la de los mamíferos. Las fibras eferentes que inervan el testículo se originan de neuronas simpáticas de los ganglios espermáticos y algunas fibras de los ganglios pre-aorticos contiguos que se conectan con el cordón espinal toracolumbar. El nervio espermático superior se encuentra yuxtapuesto a la arteria testicular, este nervio se considera la principal fuente de fibras eferentes que inervan el testículo. Fibras nerviosas adrenérgicas y colinérgicas inervan el testículo y otras partes del tracto reproductivo masculino, incluyendo, la arteria testicular, sus ramas superficiales, y la cápsula. Neurotransmisores peptidérgicos, tales como neuropéptido Y, péptido intestinal vasoactivo, la sustancia P y péptido relacionado con el gen de la calcitonina (Fig. 9), se han localizado dentro de los testículos por métodos inmunohistoquímicos (Rauchenwald, y col. 1995). En estudios morfológicos en testículos de algunas aves como el gallo doméstico, cisne y la codorniz japonesa, se han observado nervios no mielinizados entre los túbulos seminíferos y rodeando a células de Leydig (Baumgarten y Holstein, 1968). Esto mismo ha sido observado en la gónada indiferenciada de la tortuga golfina Lepidochelys olivácea, sugiriendo la participación del SNC como un termosensor que regula señales que determinan la diferenciación gonadal en esta especie de tortuga (Merchant, y cols. 1989). 23 Figura. 7. De acuerdo a lo descrito, se esquematiza la inervación del sistema nervioso Autónomo, simpático y parasimpático de gónadasde aves y una comparación relativa de la estructura pélvica de ave y mamífero (recuadros). 1) Raiz dorsal, 2) Raiz ventral, nervio esplacnico, 3) Ganglio espinal, 4) ramo comunicante blanco, 5) Ganglio paravertebral , 6) Ganglio preaórtico prevertebral, 7) Nervio esplácnico pélvico, 8) Nervio ovárico superior, 9) Plexo nervioso ovárico, 10) décimo par craneal (nervio vago) 11) plexo aórtico, 12) nervio hipogastrico, 13) hipotalamo, 14) hipófisis, 15) gónada. 4-T AVE 15-C Notarum 16-C, 3-T DIVISIÓN SIMPÁTICA Toracolumbar PARASIMPATICA Cráneosacro Eje Hipotálamo-Hipófisis-Gónada Sinsacro T, L, C Coxis 1 2 3 4 5 6 10 11 7 8 9- 15 13 14 MAMÍFERO Pelvis: Iliaco Sacro Coxis Pubis 12 24 Figura 8. De acuerdo con lo descrito, se esquematiza el folículo del ovario de ave; 1) oocito, 2) membrana plasmática, 3) capa perivetelina, 4) células de la granulosa, 5) lámina basal,6) células de la teca interna, 7) células de la teca externa, fibroblastos, fibrocitos, y fibras colágenas ,8) cápsula, y su posible relación con las hormonas gonadotropas, esteroides y neurotransmisores Figura 9. Se esquematiza el testículo de ave;1) células de Sertoli, 2) célula germinal,3) lámina basal, 4) células mioides o peritubulares, 5) células endoteliales, 6) fibroblastos, 7) células de Leydig, 8) túnica albugínea, y su posible relación con, hormonas gonadotropas, esteroides y neurosecreciones. FSH LH Adrenérgicos -catecolaminas .adrenalina .dopamina Colinérgicos -acetilcolina +polipéptidos Triptófano Estimula P450Aromatas Sintetiza 17-BE Andrógenos. T Progesterona FSH LH Inhibína. H. Anti M. Adrenérgicos Colinérgicos N.T. Peptidergicos NPY, PIV Sustancia P P. relación con calcitonina Progest. Inhibina activina Estrógenos Proteína- ligadora de Andrógenos Andrógenos. T. 1 2 4 3 5 6 7 8 1 2 7 3 4 8 5 6 25 JUSTIFICACIÓN En los mamíferos ha sido establecido que el sistema nervioso también participa en la regulación de la diferenciación, desarrollo y crecimiento de los folículos. Señales endocrinas del hipotálamo estimulan la liberación de FSH y LH, las cuales controlan la producción de hormonas esteroides en la gónada, que culminan con la ovulación y la formación de los espermatozoides en el ovario y el testículo, respectivamente. A la fecha se han realizado pocos estudios que relacionen la complejidad estructural de las gónadas, durante el desarrollo embrionario, incluyendo la inervación con la capacidad de sintetizar hormonas esteroides en las aves. Con la finalidad de aportar información sobre este aspecto del desarrollo, se realizó este estudio, utilizando como modelo al embrión de pollo. HIPÓTESIS. Se espera que la respuesta esteroidogénica a la administración de FSH y hCG esté asociada a la complejidad estructural, incluyendo la inervación. OBJETIVOS Objetivo general Determinar si la respuesta esteroidogénica de las gónadas del embrión de pollo (Gallus domesticus), sin o inducida por FSH y hCG, está relacionada con el patrón de inervación presente en el día 13 de incubación. Objetivos particulares Describir las características morfológicas de las gónadas del embrión de pollo (Gallus domesticus) en el día 13 de incubación. 26 Determinar el efecto esteroidogénico de FSH y hCG en las gónadas del embrión de pollo en el día 13 de la incubación. Relacionar la inervación gónadal con la actividad esteroidogénica inducida por FSH y hCG. MATERIALES Y MÉTODOS Material biológico: Los embriones de pollo utilizados en este estudio fueron de la línea Babcock B300, obtenidos de la granja avícola ALPES –II (Tehuacán, Puebla). Materiales químicos El medio mínimo esencial modificado por Dulbecco (DMEM), y la Tripsina (1:250) fueron obtenidas de Grand Island Biological Co. (Grand Island, N. Y.). El inhibidor de tripsina, la albúmina sérica bovina (BSA), el dodecil sulfato de sodio y la gonadotropina coriónica humana (hCG), se obtuvieron de Sigma Chemical CO. (St. Louis, Mo.). La hormona folículo estimulante humana (hFSH), obtenida de la orina de mujeres postmenopáusicas (Fertinorm HP) fue proporcionada por Serono de México (México, D. F.). La [methyl-3H] (2.0 Ci/mmol) y el líquido de centelleo (Aguasol II), se obtuvieron de NEM DU PONT (Boston, MA). Análisis morfológico Para obtener una estimación de peso húmedo y tamaño de las gónadas, se tomaron al azar diez testículos, diez ovarios derechos y diez ovarios izquierdos los cuales se fijaron con formol amortiguado (ver apéndice) durante 1 hora. Posteriormente se midió la longitud y ancho de cada gónada y se pesaron. Para el estudio histológico, las gónadas se colocaron en una solución fijadora de formol amortiguado, se lavaron, deshidrataron, aclararon, infiltraron e incluyeron en parafina. Los cortes de tejido fueron de 8 micrómetros y se montaron en portaobjetos, se desparafinaron, hidrataron y para determinar el patrón de inervación, algunos cortes 27 fueron procesados por la técnica de impregnación argéntica de Bielschowsky (ver apéndice). También se procesaron 10 muestras de ovario derecho, 10 de ovario izquierdo, 10 de testículo para realizar cortes semifinos y determinar las características ultraestructurales de las gónadas (ver apéndice). Procedimiento En condiciones estériles se obtuvieron las gónadas de los embriones de pollo, a los 13 días de incubación y se colocaron en una solución salina libre de Ca++ y Mg++ (SSB). Posteriormente, las gónadas se disociaron con tripsina al 0.25% en SSB, durante 20 minutos. La reacción enzimática se detuvo con inhibidor de tripsina al 0.50% en medio mínimo esencial modificado por Dulbecco (DMEM), más albúmina sérica bovina (BSA). Enseguida, la suspensión celular se centrifugó a 1000 rpm, durante 10 minutos, a 24 °C para eliminar las enzimas. Posteriormente, se realizaron dos lavados con DMEM + BSA. Al botón celular obtenido se le determinó la viabilidad celular con la técnica de azul tripano (Tennant 1964). Se sembraron 5x105 células/ml de cada gónada en cajas de cultivo, con 2 ml. de DMEM + BSA y se incubaron durante 3, 6, 12, 24, 48 y 60 horas, en una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO2 a 37°C. Los grupos experimentales fueron los siguientes: Grupo basal: DMEM + BSA Grupos tratados: DMEM + BSA + 1 UI/ml de hCG DMEM + BSA + 0.5 UI/ml de FSH Después de cada uno de los tiempos de incubación, se colectó el DMEM + BSA para cuantificar la concentración de testosterona y 17 - estradiol por RIA (ver apéndice). Análisis estadístico Los pesos del ovario izquierdo y derecho, así del testículo fueron procesados aplicando la prueba de Kruskal-Wallis. Las concentraciones de E2 y T de los ovarios izquierdo y derecho, así como testículo tratados con FSH y hCG fueron procesados estadísticamente por un análisis de varianza (ANDEVA) y las pruebas de comparaciones múltiples de Duncan y Tukey. 28 La significancia estadística fue establecida con una P < 0.05 en ambas pruebas. RESULTADOS Peso húmedo En la Tabla 1 se muestran el promedio del peso y el tamaño del ovario izquierdo, ovario derecho y testículo. El análisis estadístico mostró diferencias significativas entre el peso y el tamaño del ovario izquierdo, derecho y testículo (gl = 1, P < 0.05). El análisis múltiple de medias indicó que el ovario izquierdo tuvo un peso y una dimensión significativamente mayor que el ovario derecho y el testículo (Fig.10). Prueba de Kruskal-Wallis. Peso (miligramos) Dimensiones (milímetros) Ovario izquierdo 5.65 (38-82) largo 4.5 (3.3-4.7) ancho 5.65 (1.0-2.4) Ovario derecho 3.60 (17-42) largo 1.6(1.6-1.8) ancho 3.60 (0.8-1.4) Testículo 2.20 (20-49) largo 4.4 (4.4-4.5) ancho 2.20 (0.7-0.8) Tabla 1. Los datos son expresados en medianas y rangos de las dimensiones del ovario izquierdo, derecho y testículo. El análisis estadístico mostró diferencias significativas entre el peso y las dimensiones entre ovario izquierdo, derecho y testículo (gl = 1, P < 0.05). El análisis múltiple de medias indicó que el ovario izquierdo tuvo un peso y una dimensión significativamente mayor que el ovario derecho y el testículo (P < 0.05) 29 Figura 10. Se observan diferencias en forma y tamaño de, testículo (1), ovario izquierdo (2), ovario derecho (3), y su relación tan estrecha con tejido nefrótico (4) de embrión de pollo a los 13 días de incubación (1.6X 10X). Morfología Gonadal Ovario izquierdo El ovario izquierdo se observó de color blanco aperlado en el día 13 de la incubación, es de forma aplanada y alargada. Uno de sus extremos se encuentra en contacto con el mesonefros a través de un paquete de tejido conectivo vasos sanguíneos y fibras nerviosas (fig 10). A nivel histológico se distinguen dos regiones cubiertas por una cápsula formada por epitelio cúbico, por debajo de ésta se localizan acúmulos o nidos de células germinales. Rodeando a las células germinales se encuentran células con núcleo de cromatina condensada las células pregranulosas. En el límite entre las regiones cortical y medular se observan capilares y fibras de tejido conjuntivo. En la región medular se encuentran acúmulos de células con inclusiones lipídicas, células pretecales. Asimismo, se observan estructuras que forman conductos lacunares con forma irregular y diámetro variable, revestidos por un epitelio cúbico. Con frecuencia se observaron en los conductos 1 3 2 4 30 lacunares células germinales migrando. En la porción medular se observó un número considerable de capilares con elementos sanguíneos en su luz (Fig.11). Entre algunos conductos lacunares y capilares se observan abundantes paquetes y fibras nerviosas que disminuyen de tamaño y número conforme se aproximan a la corteza (Fig. 12). Figura 11. Corte semifino de ovario izquierdo de embrión de pollo con 13 días de incubación, se observa una cápsula. La corteza con células germinales (1) células pregranulosas (2) y capilares (3). En la región medular se observan capilares (3), células pretecales (4) y conductos lacunares (5). (Azul de toluidina), 40X. Corteza Médula 1 2 5 3 4 Cápsula 3 31 Figura 12. Ovario izquierdo con 13 días de incubación en el que se observa un paquete de fibras nerviosas (F.N.) entre los conductos lacunares (C.L.) (Bielschowsky), 100X. Ovario derecho Las características histológicas y el tamaño del ovario derecho son diferentes al ovario izquierdo (Fig. 10). En esta gónada no existe un límite definido entre corteza y médula, se observan capilares sanguíneos revestidos de epitelio plano. La cápsula ovárica está formada por epitelio cúbico y por debajo de esta se encuentra una zona formada de tejido conjuntivo laxo, en el cual se observan células germinales grandes con núcleos de cromatina poco condensada. En esta región también se encuentran acúmulos de células con inclusiones lipídicas características de células secretoras de hormonas esteroides. También se observan espacios grandes sinuosos recubiertos con epitelio cúbico, que forman los conductos lacunares de mayor tamaño, en los que se pueden observar células germinales, que probablemente los utilizan como vía de migración. A diferencia de la gónada izquierda, entre el tejido estromático del ovario derecho se encuentran algunas células que presentan núcleo de cromatina condensada de células en probable proceso de degeneración (Fig. 13), entre los conductos lacunares se observan fibras nerviosas, asociadas a un ganglio simpático (Fig. 14) C.L. F.N. 32 Figura 13. Muestra corte semifino de ovario derecho de embrión de pollo con 13 días de incubación se observa; la cápsula con células planas (1), célula germinal (2), células con presuntos lípidos (3), conducto lacunar (4), célula en degeneración (5), capilar (6). (Azul de toluidina), 40X. Figura 14. Muestra corte de ovario derecho con 13 días de incubación, nótese la presencia de un ganglio simpático (1) y fibras nerviosas (2) asociadas al mismo, 3) cápsula, 4) conducto lacunar. (Bielsch0wsky), 100X. 3 5 2 6 Mesonefros 1 2 1 4 5 3 4 33 Testículo A los 13 días de incubación los testículos de las aves son cilíndricos, alargados y están adheridos al mesonefros, por tejido conectivo muy vascularizado (Fig. 10). La cápsula del testículo está constituida por una transición de epitelio formado por una monocapa de células planas, por debajo de esta zona se observan fibras delgadas de tejido conjuntivo. En toda la gónada se distribuyen los cordones testiculares, formados por células germinales con un diámetro aproximado de 10-18 μm, con citoplasma claro y cromatina poco condensada, junto a estas células se observan células de Sertoli. En la periferia de los cordones se localizan acúmulos de células peritubulares o pericordonales. En el tejido intersticial se localizan células con inclusiones lipídicas y abundantes capilares con epitelio plano (Fig. 15). Entre el tejido conjuntivo se localizan fibras nerviosas cuya presencia fue demostrada a través de técnicas argénticas (Fig. 16). Figura 15. Muestra corte semifino de testículo de embrión de pollo con 13 días de incubación, se observa; Cápsula formada con células planas (1), Corteza de tejido conjuntivo (2 línea punteada), Medula (3 línea continua) con cordones testiculares (4), formado con células germinales (5), rodeadas por células pequeñas con lípidos en el citosol (pre-Sertoli) (6), células peritubulares (7), células con presuntos lípidos en el citoplasma (pre-Leydig) (8), y capilar (9). (Azul de toluidina), 100X. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 34 Figura 16. Muestra corte de testículo de 13 días de desarrollo, se observa, paquete de fibras nerviosas (1) entre cordones testiculares (2), capilar (3), células peritubulares (4), células germinales (5). (Bielschowsky), 100X Concentraciones de estradiol y testosterona Las concentraciones de E2 y T del ovario izquierdo, derecho y testículos tratados con FSH y hCG presentaron diferencias significativas en todos los tiempos de incubación (gl = 6, P < 0.05). Las pruebas de comparaciones múltiples indicaron que la secreción de E2 del ovario izquierdo fue significativamente más alta que la del ovario derecho, mientras que en el testículo la secreción de E2 fue menor que en los ovarios, en todos los tiempos de incubación con la administración de las dos hormonas (P < 0.05), (Figs. 17). 1 5 3 2 4 2 35 OVARIO DERECHO 17 B- Es tra dio l (p g/1 06 cé lul as ) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Basal FSH hCG 3 6 12 24 48 60 tiempo de incubación (horas) OVARIO IZQUIERDO 17 B-E str ad iol ( p g/1 06 cé lula s) 0 100 200 300 400 Basal FSH hCG Tiempo de incubación (horas) 3 6 12 24 48 60 TESTICULO 17 B- Es tra dio l (p g/1 06 cé lul as ) 0 1 2 3 4 5 6 Basal FSH hCG Figura. 17. La gráfica muestra el estímulo con FSH y hCG en la secreción de 17β estradiol en cultivos de células de ovario derecho, izquierdo y testículo de embriones de pollo a los 13 días de incubación, en diferentes tiempos de cultivo. P < (0.05) La secreción de T en ovario izquierdo fue significativamente mayor que el ovario derecho y el testículo. Mientras que ovario derecho tuvo una mayor secreción deT, que a a b c c d d e f f g h h i j 3 6 12 24 48 60 Tiempo de incubación hrs. j k a b c d d e f f a g b h c d h e f i g h i j j k l j m n ñ k o p q l a l b 36 el testículo, en todos los tiempos de cultivos tratados con FSH y hCG (P < 0.05) (Fig. 18). OVARIO DERECHO Te sto ste ron a ( pg /10 6 c élu las ) 0 5 10 15 20 25 30 Basal hCGFSH 3 6 12 24 48 60 OVARIO IZQUIERDO Te sto ste ron a (pg / 1 06 cé lul as ) 0 10 20 30 40 50 Basal FSH hCG 3 6 12 24 48 60 Tiempo de incubación (horas) TESTICULO 3 6 12 24 48 60 Te sto ste ron a ( pg /10 6 c élu las ) 0 5 10 15 20 25 Tiempo de incubación (horas) Basal FSH hCG NC Tiempo de incubación hrs. a b c d e e f g h a b b a c d i e f g h a i a j k j l m n ñ k b b c d e f j g h i j j l l m n n 37 Figura 18. En está gráfica se muestra el estímulo con FSH y hCG en la secreción de T en cultivos de células de ovario derecho, izquierdo y testículo de embriones de pollo, en el día 13 de la incubación, en diferentes tiempos de cultivo. P < (0.05) DISCUSIÓN Los resultados mostraron que la citoarquitectura del ovario izquierdo en el embrión de pollo en el día 13 de la incubación es diferente a la del ovario derecho; por ejemplo, en el ovario izquierdo se observa una separación definida entre corteza y médula, a diferencia del ovario derecho; en el ovario izquierdo los conductos lacunares se distribuyen en la médula mientras que en el ovario derecho están presentes en toda la gónada. En este periodo de incubación, en el ovario derecho se observaron células con núcleos picnóticos que indican degeneración celular. En el embrión de pollo se reporta que la degeneración del ovario derecho se inicia en el día 10 de la incubación (Brode 1928; Woods, 1987). Respecto a la inervación cualitativamente no se observaron diferencias, aunque en el ovario izquierdo debe haber más inervación, debido a que sus dimensiones y peso fueron significativamente mayores que el ovario derecho. En el día 13 de la incubación, en el testículo ya se han formado los cordones seminíferos, en esta etapa del desarrollo se observan las células de Sertoli y Leydig, aunque en estas últimas no están presentes las inclusiones lipídicas que caracterizan a las células secretoras de hormonas esteroides, como en las células precursoras de la teca y granulosa, en los ovarios. Cualitativamente la inervación en el testículo es menor que en ambos ovarios en esta etapa del desarrollo. En este periodo de incubación el ovario izquierdo, ovario derecho y testículo sintetizan estradiol y testosterona, esto fue demostrado utilizando la técnica de radioinmunoanálisis entre las 3 y 60 horas de incubación en los cultivos sin tratamiento hormonal. En el día 13 de la incubación, en el pollo no se ha establecido el eje hipotálamo-hipófisis-gónada por lo cual el sistema endócrino no participa en la síntesis de estas hormonas esteroides; Gilbert (1971) y Woods y Brazzill (1981) demostraron que en el pollo, el eje hipotálamo- hipófisis-gónada se establece alrededor de los 13.5 días de desarrollo. Entonces, se sugiere que la esteroidogénesis previa a esta edad puede depender en parte de la 38 estimulación del sistema nervioso (Baumgarten y Holstein 1968). Esto lo fundamentan nuestras observaciones de la presencia de fibras nerviosas en las gónadas a los 13 días de incubación y la de otros autores que han descrito inervación directa sobre las células esteroidogénicas (Baumgarten y Holstein 1968) y la presencia de 17-β estradiol, testosterona y progesterona desde los 6 y 7 días de incubación (Gómez y Gómez, 2011). Este trabajo también mostró que en el día 13 de incubación las células provenientes del ovario izquierdo, derecho y testículo del embrión de pollo, tienen la capacidad de responder al efecto esteroidogénico de FSH y hCG, aunque la respuesta varió significativamente. La respuesta esteroidogénica a FSH y hCG de las células provenientes de los ovarios y el testículo sugiere que en esta etapa de la diferenciación, hay células especializadas que responden a la estimulación de ambas hormonas, estos hallazgos se corresponden con la presencia de células con acúmulos lipídicos, observadas principalmente en los ovarios. De acuerdo con estos resultados, se ha reportado que células de gónadas de embriones de pollo de 7.5 a 18 días de incubación sintetizan 17 - estradiol en respuesta a LH (Weniger y Chouraqui 1988). Johnson (2014) observó a los 6.5 días del desarrollo la presencia de actividad de las enzimas 3- βhidroxiesteroidehidrogenasa y 5-4 deshidrogenasas (3β-HSD), que participan en la síntesis de esteroides. El ovario izquierdo sintetizó significativamente mayor cantidad de E2 y T que el ovario derecho, esto puede explicarse por la degeneración del ovario derecho y probablemente por la síntesis de ácido retinoico, que inhibe al factor esteroidogénico (SF1) relacionado con la regulación de genes que participan en la esteroidogénesis (Ishimaru y cols. 2008; Laserna 2009; Defalco y Capel 2009). En los ovarios la síntesis de E2 se mantiene más alta que la de T, mientras que en el testículo la secreción de T es más alta que la de E2, esto sugiere que cada gónada se está especializando para formarse como ovario o testículo. En los ovarios tratados con FSH y hCG se observa un aumento progresivo y rápido de testosterona a las 24 hrs., llegan a un máximo y se mantienen hasta las 60 hrs. Puede suceder que los receptores para FSH y hCG se saturan más rápido que en el caso de los controles en los que la producción de T es más lenta y no se logra ver su saturación. Asimismo, la síntesis de E2 continúa hasta las 60 horas, esto probablemente se deba a 39 que aún la aromatasa continúa transformando los andrógenos en estradiol, esto es acorde con lo observado en los cortes histológicos, en donde hay una presencia notoria de células con inclusiones lipídicas en su citoplasma. En testículo las concentraciones de E2 y T son muy bajos en comparación a las obtenidas en los ovarios. Esto puede deberse a que los testículos en este periodo de incubación, tienen una menor actividad esteroidogénica que los ovarios (como se observa en la prueba estadística de Kruskal-Wallis), lo cual podría implicar una menor cantidad de receptores a FSH y hCG y a una menor inervación, como se observó en los cortes histológicos. Finalmente, en la respuesta esteroidogénica de ovario de rata además de recibir inervación del plexo ovárico y del nervio vago, parece que recibe información nerviosa directa o indirecta de otras vías alternas (Domínguez-Casalá y cols. 1991; Gerendai y cols. 2005), lo cual puede suceder también en aves. CONCLUSIONES Podemos concluir de este trabajo que, a los 13 días de incubación del embrión de pollo (Gallus Domesticus). -El ovario y el testículo están diferenciados morfológicamente. -Se observa asimetría en el desarrollo entre ovario derecho e izquierdo, siendo esto evidente morfológicamente. -Las células esteroidogénicas de las gónadas responden al estímulo de la FSH y hCG exógenos, incrementando la síntesis de E2 y T. -La presencia de fibras nerviosas en los cortes histológicos sugiere la participación del sistema nervioso en la esteroidogénesis de las gónadas. 40 REFERENCIAS. Baumgarten H.G. y Holstein A. (1968). 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Agua bidestilada.................................................. 90.0 ml. NaCl.................................................................... 0.81 gr. Dipotassium Hydrogen Phosphate (H2HPO4).... 0.06 gr. Metil-OH benzoato.............................................. 0.05 gr. MEDIO DE CULTIVO. DMEM........................... 10.0 gr Albumina bovina............ 0.1 gr NaHCO3......................... 3.7 gr Agua bidestilada...............1000 ml SOLUCION SALINA BALANCEADA (SSB) LIBRE DE Ca2+ y Mg2+. Na Cl......................... 8.0 gr. KH2PO4................... 0.2 gr. KCl............................ 0.2 gr. Na2HPO4………….. 1.15 gr. Agua bidestilada….... 1000 ml. SOLUCIÓN DE TRIPSINA. 0.025 Gr. disuelto en 10 ml. de SSB libre de Ca2+ y Mg2+ SOLUCIÓN DE INHIBIDOR DE TRIPSINA. 0.050 gr. disuelto en 10 ml. de DMEM TÉCNICA DE RADIOINMUNOANÁLISIS. -Se descongelaron las muestras, para realizar la curva estándar se rotularon 7 tubos, agregando del tubo 2 al 7 un mililitro de buffer RIA isotónico, en el tubo 1 47 correspondiente a los 400 pg. se le agrego 0.1ml de solución de trabajo (testosterona o estradiol según el caso) + 4.9 ml 5 de buffer RIA isotónico, sé re suspendió. Se tomó un mililitro del tubo 1 y se vertió al tubo 2 correspondiente a 200 pg., se re suspendió, repitiéndose esta operación hasta el tubo 7 (6.25pg).Se enumeró tubos del 1....n, de los cuales el 1 y 2 corresponden a cuenta totales (100%), 3 y 4 corresponden a unión no específica (1 al 3%), 5 y 6 a la unión máxima (30- 50%) y a partir del tubo 7-8 hasta el 19-20 correspondió a la curva estándar. A partir de la pareja de tubos 7-8 hasta 19-20 se agregó 200l de cada concentración de la curva estándar de menor a mayor concentración (6.25pg –400pg) A todos los tubos se les agrego los reactivos en el siguiente orden: 1) Buffer RIA isotónico 2) muestra 3) marca 4) anticuerpo 5) carbón activado Después se adiciono el anticuerpo, incubo a 37° C durante una hora, detuvo la reacción con hielo durante una hora. Se agregó del tubo 3 al n, 500ml de carbón activado al 0.6%. Se centrifugo durante 10 minutos a 1500 r.p.m., se vertió el sobrenadante en un vial etiquetado. A cada vial se le agregaron 5 ml de líquido de centello, se tapó, se agito en un vortex durante 15 seg, se limpió con alcohol y se colocó en el contador de centelleo líquido LS 6000 para cuantificar la radioactividad. TÉCNICAS HISTOLÓGICAS. Formalina amortiguada, (formol al 10% buffer) Formaldehido 37%-40%………………….. 100 ml. Agua destilada…………………………….. 900 ml Fosfato de sodio monobásico……………… 4gr. Fosfato de sodio dibásico (anhidro)………. 6.5 gr IMPREGNACIÓN DE BIELSCHOWSKY (método para cilindro ejes y dendritas) 1.- desparafinar, hidratar hasta agua destilada 2.-impregnar en nitrato de plata al 20 %.durante 48 hrs. en obscuridad. 3.-enjuagar con agua tridestilada. 4.-plata amoniacal 10-20 minutos o hasta que los cortes tomen un color castaño. 5.-enjuague con agua destilada. 48 6.-reducción en formalina 20% durante 5 minutos los cortes viran a café obscuro 7.-lavar agua tridestilada. 8.- sumergir en cloruro de oro durante 1 hrs. O que viren a rojizo violeta 9.- enjuagar en agua destilada 10.- colocar en tiosulfato de sodio durante 1 minuto. 11.- lavar en agua corriente. 12.- Deshidratar, aclarar y montar. Resultados. Neurofibrillas en negro. Cilindro ejes, en negro. Dendritas, en negro. Fondo, púrpura. BUFFER DE CACODILATO 0.2 M a ph 7.4 Cacodilato de sodio pm 214………. 42.8gr Agua destilada…………………….. 1000ml Se ajusta el ph a 7.4 con Ácido clorhídrico al.2N………… HCl 1.98ml aforar a 100ml con agua destilada 100ml Fijador glutaraldehido al 2% en cacodilatos Glutaraldehido al 25%…………….… 8ml Cacodilato de sodio al .1m ph 7.4…… 92 ml RESINA EPÓXICA. (ARALDITA) Anidrido dodecenilsuccinico (DDSA)…………… 3.5cc Araldita 6005………………………………........... 5.0cc 2, 4, 6 –tris (dimetilaminometilfenol) (DMP30)… . .12cc Infiltrar el tejido en esta mezcla y se polimerizan a 60 °C. durante 24 hrs. CORTE SEMIFINO En el ultramicrotomo se cortar a un micrómetro se utiliza cuchilla de vidrio. 49 TINCIÓN CON AZUL DE TOLUIDINA. Cubrir el corte con el colorante, a una temperatura aproximada de 80 °C hasta que empiece a evaporar el colorante formando un halo brilloso en el borde del colorante, posteriormente se enfrían a temperatura ambiente, se lavan con agua de la llave y enjuagar con agua destilada. Contrastar con alcohol 96%, se deja secar y se monta con resina sintética (entellan). Portada Contenido Resumen Introducción Justificación Hipótesis Objetivos Materiales y Métodos Resultados Discusión Conclusiones Referencias Apéndice