Caracterizacion-termodinamica-y-cinetica-del-plegamiento-del-dominio-B-perteneciente-a-la-protena-periplasmica-de-union-a-lisina-arginina-y-ornitina-LAO-de-Salmonella-typhimurium

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
 DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE CIENCIAS 
Licenciatura en Biología 
 
 
Caracterización termodinámica y cinética del plegamiento del 
dominio B perteneciente a la proteína periplásmica de unión a lisina, 
arginina y ornitina (LAO) de Salmonella typhimurium. 
 
 
T E S I S 
 
 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 LICENCIADO EN BIOLOGÍA 
 P R E S E N T A : 
 Eva Isela Mejía Juárez 
 
Director de Tesis : 
Dr. Daniel Alejandro Fernández Velasco 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ciudad Universitaria. CD.MX. 2019 
 
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2 
NO ES NECESARIO 
 
La trompa del elefante 
es para recoger pistachos 
no es necesario doblarse 
 
El cuello de la jirafa 
es para alcanzar las estrellas 
no es necesario volar 
 
La piel del camaleón 
verde, azul, morada, blanca 
es para esconderse de los animales 
no es necesario huir 
 
El caparazón de la tortuga 
es para dormir en el interior, aun en invierno 
no es necesario una casa 
 
El poema del poeta es para decir todo esto 
y miles y miles de cosas mas 
no es necesario entender 
 
 
 
 Alain Bosquet 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
Gracias a la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) y 
a cada una de las personas, seres, procesos y circunstancias que 
tejieron este camino y lo hicieron posible. 
 
Con primordial amor y dedicación a mi madre… 
 
 
La humanidad… es más que un ente psicológico, biológico, social 
y cultural; es un ente cósmico…porque o bien es corresponsable, 
de todo el universo, de todas las formas de ser, y de todos los 
valores, o bien su responsabilidad no significa absolutamente 
nada…de ahí que plantee la hipótesis de que el cosmos en devenir 
sea la primera y última existencia y valor supremo 
 
 (Jacob Levi Moreno 1966) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
ÍNDICE 
 
RESUMEN……………………………………………………………………………………………………………………………6 
ABREVIATURAS…………………………………………………………………………………………………………………...8 
INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………………………………………………9 
Función y clasificación estructural de proteínas………………………………………………………9 
Plegamiento de proteínas………………………………………………………………………………………12 
Estudios de C.B Anfinsen y su hipótesis termodinámica de plegamiento………………14 
Paradoja de Levinthal……………………………………………………………………………………………16 
Mecanismos de plegamiento…………………………………………………………………………………17 
El paisaje de plegamiento y su representación en forma de embudo…………………….18 
Estudio del plegamiento de proteínas………………..………………………………………………….19 
Estudio termodinámico………………………………………………………………………………19 
Estudio cinético………………………………………………………………………………………….21 
Características de las proteínas como modelos de estudio para el plegamiento……22 
Proteínas periplásmicas de unión (PBP´s) y transportadores ABC…………………………..24 
Proteína periplásmica de unión a lisina, arginina y ornitina (LAO)…………..................26 
Función………………………………………………………………………………………………………26 
Estructura…………………………………………………………………………………………………..26 
Antecedentes termodinámicos y cinéticos del plegamiento de LAO…………..27 
Antecedentes termodinámicos y cinéticos del plegamiento del dominio A..29 
JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………………………………………………………..31 
HIPOTESIS………………………………………………………………………………………………………………………….31 
OBJETIVO GENERAL……………………………………………………………………………………………………………32 
OBJETIVOS PARTICULARES…………………………………………………………………………………………………32 
MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………………………………………………………..33 
 Purificación del dominio B………………………………………………………………………………………33 
Estudios termodinámicos……………………………………………………………………………………….34 
Desnaturalización térmica………………………………………………………………………….34 
 
5 
Desnaturalización química………………………………………………………………………….35 
Estudios cinéticos…………………………………………………………………………………………………..36 
Análisis de resultados…………………………………………………………………………………………….36 
 Estudios termodinámicos…………………………………………………………………………….36 
Desnaturalización térmica………………………………………………………………36 
Desnaturalización química………………………………………………………………38 
Estudios cinéticos……………………………………………………………………………………….39 
RESULTADOS……………………………………………………………………………………………………………………..40 
 Estudios termodinámicos………………………………………………………………………………………..40 
Desnaturalización térmica………………………………………………………………………….40 
Desnaturalización química………………………………………………………………………….44 
Estudios cinéticos…………………………………………………………………………………………………..49 
DISCUSIÓN…………………………………………………………………………………………………………………………51 
 Estudios termodinámicos………………………………………………………………………………………..51 
Desnaturalización térmica………………………………………………………………………….51 
Desnaturalización química………………………………………………………………………….54 
Estudios cinéticos…………………………………………………………………………………………………..56 
CONCLUSIONES………………………………………………………………………………………………………………….58 
PERSPECTIVAS……………………………………………………………………………………………………………………60 
REFERENCIAS……………………………………………………………………………………………………………………..61 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
RESUMEN 
 
El plegamiento es el proceso mediante el cual las proteínas obtienen su estructura terciaria 
a partir de la secuencia de aminoácidos. Sin embargo, continua sin ser posible determinar 
está estructura a partir de la secuencia de aminoácidos. El plegamiento se ha estudiado en 
proteínas pequeñas (<100 residuos) y formadas por un solo dominio; sin embargo 
aproximadamente el 75% del proteoma de los seres vivos está organizado por proteínas con 
más de 100 residuos y compuestas de manera multidominio. Un dominio se define como 
una identidad evolutiva independiente con plegamiento autónomo, el cual se puede 
organizar con otros dominios o presentarse de manera aislada. Los estudios de plegamiento 
se han realizado con dominios aislados, extrapolando los resultados del plegamiento a las 
proteínas multidominio. Se ha propuesto que la estabilidad y cinética de plegamiento están 
influenciadas por los dominios vecinos y por la intercara que los une. En nuestro laboratorio 
estudiamos a la proteína de unión a lisina, arginina y ornitina (LAO) una proteína periplásmica 
de unión formada por 238 residuos e integrada por dos dominios denominados lóbulo A y 
lóbulo B unidos por una región de bisagra. Ambos lóbulos comparten la misma estructura 
terciaria (4 hélices α y 5 hébras β); sin embargo el lóbulo A es discontinuo y está integrado 
por un mayor número de residuos en comparación con el lóbulo B, que es continuo en 
secuencia y de menor tamaño. Los resultados de desplegamiento para LAO revelaron que 
termodinámicamente el proceso es de dos estados (ΔG= 9.8 kcal mol-1 a pH 9). En contraste, 
en la cinética de plegamiento se reconoció la presencia de un intermediario. En relación al 
lóbulo A se sabe que la desnaturalización al equilibrio muestra un proceso de dos estados 
(ΔG=4.9 kcal mol-1 a pH 9), lo cual nuevamente es distinto para la cinética de 
desnaturalización pues por lo menos se reconoce la presencia de dos intermediarios. En esta 
tesis se realizaron los estudios termodinámicos y cinéticos de plegamiento del lóbulo B. La 
desnaturalización al equilibriose efectuó por temperatura y por urea. El lóbulo B presenta 
una estabilidad marginal a pH 9 (ΔG=0.8 kcal mol-1), la cual incrementa a pH 5 (ΔG=1.87 kcal 
mol-1); sin embargo continua siendo muy reducida. El valor de la energía libre para LAO y el 
lóbulo A está relacionada con su tamaño, no así para el lóbulo B. En síntesis, la comparación 
 
7 
de los parámetros termodinámicos en la desnaturalización térmica y por urea evidenciaron 
que el plegamiento de LAO surge de manera cooperativa entre los lóbulos; la presencia del 
lóbulo A, en contexto del lóbulo B, proporciona las interacciones que estabilizan a este 
lóbulo. Al adicionar al análisis los resultados cinéticos y comparar el gráfico de Chevron de 
cada proteína; se observa que los dominios aislados presentan una cinética de plegamiento 
más rápida y sin embargo un mecanismo más complejo; con un mayor número de 
intermediarios para llegar al estado nativo. Cuando los dominios forman parte de LAO, el 
plegamiento seguido cinéticamente ocurre a menor velocidad y con la formación de un 
menor número de estados. Los resultados termodinámicos y cinéticos de LAO en relación a 
los lóbulos A y B, revelan que las características de plegamiento son distintas; la estabilidad 
y cinética de plegamiento del lóbulo B depende del lóbulo A. Cuando ambos dominios 
integran a LAO emergen interacciones que influyen en el mecanismo de plegamiento. El 
plegamiento de LAO, una proteína multidominio y el de los lóbulos aislados, evidencian 
características de plegamiento no aditivas sino cooperativas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8 
 
ABREVIATURAS 
 
 Cambio de área expuesta al solvente (ΔASA) 
 Cambio de la capacidad calorífica a presión constante (ΔCp) 
 Cambio en la energía interna (ΔG) 
 Cambio en la entalpia de Van´t Hoff (ΔHVH) 
 Cambio en la entropía (ΔS) 
 Concentración media de desnaturalizante (Cm) 
 Dicroísmo circular (DC) 
 Estado desplegado (D) 
 Estado intermediario (I) 
 Estado nativo (N) 
 Estado de transición (‡TS) 
 Fracción de proteína desnaturalizada (Fd) 
 Intensidad de fluorescencia (IF) 
 Pendiente (m) 
 Proteína de unión a lisina, arginina y ornitina (LAO) 
 Proteínas periplásmica de unión (PBP) 
 Temperatura media de desnaturalización (Tm) 
 
 
 
 
9 
 
INTRODUCCIÓN 
Función y clasificación estructural de las proteínas 
Las proteínas son macromoléculas que se encuentran en los sistemas vivos y desempeñan 
una gran variedad de roles en cada uno de los procesos biológicos. Se puede reconocer a los 
transportadores o canales que permiten el intercambio de moléculas entre el espacio 
intracelular y extracelular. Los receptores traducen señales hacia el interior de la célula. Las 
hormonas son mensajes químicos o información que viaja de un conjunto de células hacía 
otro sitio. Los transportadores unen moléculas para trasladarlas de un sitio a otro. Los 
anticuerpos participan en la defensa de la célula contra agentes extraños. Así mismo, son 
estructurales al colaborar en la construcción de estructuras anatómicas. Uno de los roles con 
mayor relevancia es ser enzimas o catalizadores biológicos pues aceleran las reacciones 
químicas a velocidades biológicamente relevantes en todos los procesos bioquímicos 
(Lehninger, 2013). 
Las proteínas se integran a partir de unidades básicas nombradas aminoácidos, moléculas 
que presentan una estructura en común; un grupo amino (-NH2), un grupo carboxilo (-
COOH), un átomo de hidrógeno y una cadena lateral (-R). Son veinte los principales 
aminoácidos que integran a las proteínas y se diferencian entre sí por las propiedades de la 
cadena lateral; específicamente la polaridad o la tendencia a interactuar con el agua 
(Lehninger, 2013). Así, los aminoácidos se clasifican en no polares alifáticos (Glisina (Gly-G-), 
Alanina (Ala-A-) , Prolina (Pro-P-) , Valina (Val-V-), Leucina (Leu-L-), Isoleucina (Ile-I-) y Metionina (Met-M-)), 
no polares aromáticos (Fenilalanina (Fhe-F-), Tirosina (Tyr-Y-) y Triptófano (Trp-W-)), polares sin 
carga (Serina (Ser-S-), Treonina (Thr-T-), Cisteína (Cys-C-), Asparagina (Asn-N-) y Glutamina (Gln-Q-)), 
polares con carga positiva (lisina (Lys-K-), Histidina (His-H-) y Arginina (Arg-R-)) y polares con carga 
negativa (Aspartato (Asp-D-) y Glutamato (Glu-E-)) (fig.1).Los aminoácidos se unen entre sí por la 
formación de un enlace covalente denominado enlace peptídico, organizado por la unión del 
grupo carboxilo de un aminoácido con el grupo amino de otro aminoácido (CO-NH). La 
formación del enlace covalente libera e una molécula de agua. 
 
10 
 A M I N O A C I D O S 
NO POLARES 
Alifáticos Aromáticos 
 
 
 
 
POLARES 
Sin carga Con carga positiva 
 
 
Con carga negativa 
 
 
 
 
Figura 1. Clasificación, nombre, abreviación con una y tres letras de los 20 aminoácidos principales. 
Glicina (Gly-G) Alanina (Ala-A) Prolina (Pro-P) 
Valina (Val-V) Leucina (Leu-L) Isoleucina (Ile-I) 
Metionina (Met-M) 
Fenilananina (Phe-F) 
Tirosina (Tyr- Y) 
Triptófano (Trp-W) 
Serina (Ser-S) Treonina (Thr-T) Cisteína (Cys-C) 
Glutamina (Gln-Q) Asparagina (Asn-N) 
Ácido aspártico (Asp-D) Ácido glutámico (Glu-E) 
Lisina (Lys-K) Histidina (His-H) Arginina (Arg-R) 
 
11 
La estructura de las proteínas puede clasificarse en cuatro niveles jerárquicos: 1) la 
estructura primaria se refiere a la secuencia de aminoácidos que integran a la proteína, 2) la 
estructura secundaria se origina por la interacción que establecen los aminoácidos dando 
lugar a conformaciones repetitivas, principalmente hélices α, hebras β y asas, 3) la estructura 
terciaria es la organización espacial que surge de la interacción entre las distintas 
conformaciones de estructura secundaria y 4) la estructura cuaternaria surge por la 
interacción de diferentes cadenas polipeptídicas con estructura terciaria. Dicha interacción, 
entre distintas cadenas polipeptídicas origina proteínas nombradas como oligomeros (fig. 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A B1 
B2 
 
12 
 
 
 
 
 
 
Plegamiento de proteínas 
El proceso por el cual la estructura primaria obtiene la estructura terciaria se denomina 
plegamiento de proteínas. Ahora bien, otra manera de nombrar la estructura primaria, la 
cual corresponde a un estado des-estructurado o carente de estructura tridimensional es 
estado desplegado (D). Y otra forma de denominar la estructura terciaria es estado plegado 
o nativo (N); por lo tanto, el plegamiento de proteínas también puede definirse como el 
proceso mediante el cual el estado desplegado (D) adquiere el estado nativo (N), estructura 
esencial en la que estas macromoléculas realizan su función biológica (fig. 3A). A su vez, en 
el proceso de plegamiento, la cadena polipeptídica puede poblar conformaciones 
marginalmente estables con estructura parcialmente plegada, que no corresponde al estado 
nativo. Estos estados se denominan estados intermedios o estados intermediarios (I) (fig. 
3B). 
 
Figura 2.Clasificación estructural de las proteínas. (A) Estructura primaria, (B) estructura secundaria (B1- hélices 
alfa con asas y B2- hebras β con asas), (C) estructura terciaria y (D) estructura cuaternaria (hemoglobina 
formada por cuatro cadenas polipeptídicas, cada una representada por un color distinto) (PyMOLViewer). 
D C 
 
13 
 
 
 
Por otra parte, es importante señalar que la estructura tridimensional de las proteínas surge 
a partir de interacciones no covalentes entre los residuos de aminoácidos. Entre ellas se 
encuentran los puentes de hidrógeno, interaccioneselectrostáticas entre grupos cargados, 
fuerzas de Van der Waals e interacciones hidrofóbicas entre residuos no polares (Dill, 2012) 
(fig. 4). No obstante, la conformación nativa no es una estructura rígida, sino una población 
de moléculas en un estado dinámico con cambios conformacionales que permiten a las 
proteínas desempeñar su rol biológico. Se ha calculado que la conformación nativa presenta 
una estabilidad (∆G) muy pequeña, aproximadamente de -4 a -15 kcal mol-1 (-20 a -60 KJ mol-
1) a temperatura de 25°C y a pH fisiológico (7.4) (Pace, 2001). 
 
 
Figura 3. Proceso de plegamiento. (A) Proceso de plegamiento de dos estados y (B) proceso de plegamiento 
con la formación de un estado intermediario. 
A 
B 
 
14 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Estudios de Christian Boehmer Anfinsen y su hipótesis termodinámica de plegamiento 
En el año de 1961, Christian Boehmer Anfinsen expuso los primeros principios e 
interrogantes relacionados al plegamiento de proteínas. Él y sus colaboradores desarrollaron 
estudios con la proteína Ribonucleasa Pancreática Bovina, Ribonucleasa A (RNAasa A), 
enzima que hidroliza el RNA y está formada por 124 aminoácidos, dónde 8 de ellos 
corresponden a residuos de cisteína capaces de establecer entre sí, en el estado nativo, 4 
enlaces disulfuro. 
Los experimentos de Anfinsen consistieron en colocar a la RNAasa A en una solución de urea 
y β-mercaptoetanol. Por su parte, la urea puede romper las interacciones no covalentes, y el 
β-mercaptoetanol los puentes disulfuro. Es así que al comprobar la actividad catalítica de la 
RNAasa A en dicha solución, Anfinsen reconoció que ésta se había perdido. Resultado que 
 
Figura 4. Interacciones no covalentes que surgen en la estructura terciaria de las proteínas. (A) Puentes de 
hidrógeno, (B) interacciones hidrofóbicas e (C) interacciones electrostáticas. 
 
15 
indirectamente mostró; la pérdida tanto del estado nativo y de los 4 enlaces disulfuro. En 
pocas palabras, la proteína se encontraba en estado desplegado. Posteriormente, al remover 
la urea y la mayor parte del β-mercaptoetanol de la solución, la RNAasa A recobró su 
actividad enzimática, indicio de que la proteína recuperó su estructura nativa y por lo tanto 
los 4 enlaces disulfuro correspondientes a este estado. De modo que, los resultados de 
Anfinsen son sorprendentes, pues él comprobó que entre los 8 residuos de cisteína de la 
RNAasa A, existe la posibilidad de establecer 105 enlaces disulfuro; sin embargo se formaron 
los 4 enlaces que corresponden al estado nativo. En consecuencia a estos descubrimientos, 
Anfinsen concluyó que la secuencia de aminoácidos presenta el total de la información para 
establecer las interacciones necesarias que formarán el estado plegado de la proteína, en 
pocas palabras que la estructura terciaria o nativa de una proteína está determinada por la 
secuencia de aminoácidos (Morris, 2013). Finalmente, Anfinsen propuso una hipótesis en 
cuanto al plegamiento. Él menciono que las proteínas adquieren el estado conformacional 
de menor energía, dado que es la conformación más estable termodinámicamente. Como 
consecuencia la propuesta es nombrada hipótesis termodinámica de plegamiento (Buchner, 
2005). 
Es de importancia mencionar que las conclusiones de Anfinsen son verídicas, sin embargo, 
para la mayoría de proteínas se desconoce cómo ocurre este proceso; cómo la secuencia de 
aminoácidos establece el código para determinar la estructura nativa. A esta incógnita se 
nombra “problema de plegamiento de proteínas”; y plantea tres preguntas fundamentales: 
1) ¿Cómo las propiedades fisicoquímicas que mantienen la estructura nativa son codificadas 
en la secuencia de aminoácidos?, 2) ¿Por qué las proteínas se pliegan tan rápido? a pesar de 
existir un gran número de conformaciones posibles y 3) ¿Se puede predecir y diseñar la 
estructura de proteínas utilizando logaritmos de computadora? La respuesta a dicho 
problema parecería simple, sin embargo, las investigaciones han revelado que el 
plegamiento de proteínas es multivariable, pues el paisaje de plegamiento es específico para 
cada proteína, incluso cuando comparten el mismo tipo de estructura nativa (Wedemeyer, 
2001). 
 
 
16 
 
Paradoja de Levinthal 
Fue en 1969, cuándo Cyrus Levinthal propuso cuestionamientos relevantes que sin duda 
obligarían a incursionar más en este sorprendente y complejo proceso. Él se preguntó 
¿Cuánto tiempo tarda una proteína en adquirir su estructura nativa si realiza una búsqueda 
al azar en todo el espacio conformacional? El cálculo que Levinthal desarrolló, para contestar 
esta interrogante, fue el siguiente: si existe una proteína de 100 residuos de aminoácidos y 
cada residuo puede presentar dos conformaciones posibles, el número total de 
conformaciones qué podría visitar esta proteína sería 2100, lo que es igual a un número 
inmensamente grande. Si suponemos que el tiempo que la proteína tarda en adquirir cada 
conformación es de un picosegundo (1x10-12 segundos), entonces visitar todas las 
conformaciones hasta alcanzar el estado de mínima energía, sería mayor al tiempo estimado 
para la existencia del universo, ya que este razonamiento se opone a la lógica es nombrado 
“Paradoja de Levinthal” (Braselmann, 2013). 
Como solución a esta contradicción, Levinthal sugirió que las proteínas no visitan todas las 
conformaciones posibles, sino que existen vías de plegamiento que van del estado 
desplegado al nativo a través de estados intermedios. Él opino que la formación de estados 
intermedios o parcialmente plegados en el transcurso del plegamiento reducen el campo 
conformacional y aumentan la velocidad de plegamiento (Udgaonkar, 2008). Sin embargo, 
hoy en día permanece latente el papel de los intermediarios en las vías de plegamiento; la 
interrogante principal es si los intermediarios facilitan la búsqueda del estado nativo o si por 
el contrario, involucran interacciones no nativas que frustran el proceso y por lo tanto son 
considerados como trampas cinéticas (Morris, 2012) 
 
 
 
 
 
 
 
17 
Mecanismos de plegamiento 
Los mecanismos de plegamiento de las proteínas consisten en representaciones teóricas y 
experimentales que indican la velocidad y la serie de pasos que ocurren en el proceso, desde 
el estado desnaturalizado al estado nativo, con la posible formación de estados intermedios. 
En el transcurso de los años se ha propuestos diversos mecanismos generales de 
plegamiento, los cuales se muestran en la tabla 1. Los primeros tres, son mecanismos 
jerárquicos, pues sugieren un incremento secuencial y aditivo en la complejidad de la 
estructura. En contraste, los modelos de colapso hidrofóbico y nucleación condensación 
sugieren la formación de estructura secundaria y terciaria en paralelo (Morris, 2013). 
 
 
 
Tipo de mecanismo Autor Año Explicación 
 
Nucleación-
crecimiento 
 
Levinthal 
 
1973 
Un núcleo de estructura secundaria es formado 
lentamente, el cual causa un rápido crecimiento del 
resto de la proteína. 
 
Armazón 
(Framework) 
 
 Ptitsyn 
 
1973 
Primero se forma un intermediario que contiene 
gran extensión de estructura secundaria y estos 
elementos preformados se empaquetan juntos para 
desarrollar las interacciones terciarias. 
 
Difusión-colisión 
 
Karplus y 
Weaver 
 
1979 
Los elementos de estructura secundaria preformada 
difunden hasta que colisionan para formar la 
estructura nativa 
 
Colapso hidrofóbico 
 
Dill 
 
1985 
Es guiado por el colapso de regiones hidrofóbicas las 
cuáles siguen la compactación de la cadena 
polipeptídica, vía la formación de interacciones 
terciarias. 
 
Nucleación-
condensación 
 
Fersht 
 
1997 
El plegamiento origina un núcleo del cuál la 
estructura secundaria y terciaria se propaga en 
paralelo. 
Tabla 1. Nombre, Autor, año y explicación de los distintos mecanismos generales propuestospara el 
plegamiento de proteínas. 
 
18 
El paisaje de plegamiento y su representación en forma de embudo 
El paisaje energético de plegamiento representa todo el espacio conformacional y la energía 
asociada a cada conformación que la cadena polipeptídica puede visitar en el proceso de 
plegamiento hasta llegar al estado nativo. Con apoyo de estudios teóricos y experimentales 
se demostró que el paisaje energético de plegamiento tiene forma de embudo; 
representación que explica porque la velocidad de plegamiento ocurre en tiempos 
biológicamente relevantes (Morris, 2012). La altura del embudo representa el cambio en 
energía libre conformacional (ΔG) y el ancho del embudo simboliza el cambio en entropía 
conformacional (ΔS). De manera general hay dos maneras de representar el paisaje 
energético de plegamiento; a partir de un embudo liso y un embudo rugoso. El embudo liso 
es representado por la ausencia de barreras energéticas a excepción del estado de transición 
(‡TS); por lo tanto el proceso de plegamiento ocurre del estado desnaturalizado al estado 
nativo, pasando exclusivamente por el estado de transición. El embudo de plegamiento 
rugoso cuya rugosidad representa valles, pendientes y cimas energéticas, describe un 
proceso de plegamiento más complejo. Es así que el estado desnaturalizado está 
representado por un gran número de conformaciones (ΔS) de alta energía. Conforme la 
población de estado desnaturalizado avanza en el proceso de plegamiento, cuesta abajo en 
el embudo, la cadena polipeptídica transcurre por máximos energéticos a través de estados 
de alta energía, llamados estados de transición (‡TS). Así mismo, en el proceso de 
plegamiento, se puede visitar de manera azarosa conformaciones de menor energía que el 
estado desnaturalizado. Dichas conformaciones parcialmente plegadas son más parecidas al 
estado nativo, y representan los estados intermedios (I). Por consiguiente, una vez que 
ocurre la formación de estados intermedios, es más probable que la proteína visite estados 
de energía menor, llevando consigo una reducción del espacio conformacional, así como una 
disminución en el número de conformaciones posibles. En consecuencia, estos estados 
marginalmente estables y de energía cada vez menor, descienden en el embudo hasta 
alcanzar el estado de menor energía y termodinámicamente más estable, el estado nativo 
(fig. 5). 
 
19 
 
 
 
Estudio del plegamiento de proteínas 
El estudio experimental de las características del paisaje energético y de los mecanismos de 
plegamiento, se auxilia de disciplinas como la termodinámica y la cinética. A continuación se 
describe brevemente ambos acercamientos. 
 
Estudio termodinámico 
Los sistemas en equilibrio son aquellos que mantienen sus propiedades químicas, mecánicas 
y térmicas de manera constante en el tiempo. Es así que la termodinámica define y describe 
la transformación de la energía libre al transitar de un estado en equilibrio a otro. De ahí que 
la termodinámica de plegamiento brinda información del cambio de energía libre del proceso 
de plegamiento (ΔGf), así como la energía asociada a cada conformación visitada. Por otra 
parte, permite calcular los parámetros termodinámicos que contribuyen a comprender la 
energética del proceso, tales como la entalpía (ΔH), la entropía (ΔS) y la capacidad calorífica 
Figura 5. Embudo de plegamiento, con la ubicación espacial del estado desnaturalizado (D), el estado de 
transición (‡TS), estados intermedios (I) y el estado nativo (N). 
 
20 
(ΔCp). El ΔH describe el cambio en la energía interna del sistema, energía asociada a las 
interacciones que se pierden o se forman en el proceso de plegamiento. Por su parte el ΔS 
indica los cambios en grados de libertad o el número de conformaciones posibles que la 
cadena polipeptídica puede adoptar. Finalmente el ΔCp informa el cambio de área que la 
proteína expone al solvente (ΔASA) al aumentar la energía cinética de la cadena polipeptídica 
por un cambio en la temperatura (Braselmann, 2013), y desde el punto de vista energético 
el ΔCp hace referencia al cambio de ΔG con respecto a la temperatura. 
La desnaturalización de las proteínas se puede efectuar por la perturbación gradual de 
condiciones experimentales, tales como temperatura, presión, pH y concentración de 
desnaturalizante (Wedemeyer.2001). Específicamente, se monitorea el efecto de la 
desnaturalización sobre las poblaciones del estado nativo, el estado desnaturalizado y los 
posibles estados intermedios. 
La desnaturalización térmica es debida a los efectos de la temperatura en las moléculas de 
agua que rodean y solvatan a la proteína (Morris, 2012). Por su parte, la ecuación de Van´t 
Hoff permite obtener los parámetros termodinámicos anteriormente descritos y en adición 
el valor de la temperatura media de desnaturalización (Tm), temperatura dónde se presenta 
la mitad de la población en estado nativo y en estado desnaturalizado. 
Por su parte, la desnaturalización química puede ser efectuada por distintos agentes 
desnaturalizantes; tales como urea, cloruro de guanidinio o tiocinato de guanidinio. Los 
desnaturalizantes interactúan tanto con las regiones hidrofóbicas e hidrofílicas de la 
proteína, lo cual favorece el estado desnaturalizado (Morris, 2012). A partir de la ecuación 
de Santoro y Bolen, se obtienen los parámetros de la concentración media de 
desnaturalización (Cm), la pendiente (m) y el cambio en energía libre (ΔG). La concentración 
media de desnaturalización o Cm señala la concentración media de agente químico dónde 
se presenta la mitad de la población en estado nativo y en estado desnaturalizado. El valor 
de m indica el ΔASA al ocurrir la desnaturalización por un agente químico y el ΔG indica el 
cambio en energía de un estado a otro. 
El monitoreo del cambio en las poblaciones visitadas en el proceso de desnaturalización 
puede ser calculado por métodos espectroscópicos. De ahí que, los datos experimentales en 
 
21 
un rango de condiciones de desnaturalización se pueden ajustar a una curva de fracción de 
proteína desnaturalizada (Fd), a partir de la constante de equilibrio (Keq= Fd/ (1-Fd)) (fig.6). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Estudio cinético 
La cinética estudia la velocidad a la cual ocurren las reacciones químicas, por lo tanto, analiza 
la transformación de los sistemas a través del tiempo. En consecuencia, el estudio de la 
velocidad del proceso de plegamiento de una proteína corresponde a la cinética de 
plegamiento. Específicamente se reconoce el número de estados poblados en el tiempo, el 
mecanismo de plegamiento y las características del paisaje energético de plegamiento. 
La cinética de plegamiento puede ser seguida por técnicas espectroscópicas, el cambio en la 
señal a través del tiempo permite determinar el número de exponenciales que describen el 
cambio en la señal, de estos datos se puede calcular las constantes de velocidad 
microscópicas de plegamiento (kf) y desplegamiento (kD). A partir de graficar las constantes 
de velocidad con respecto a la concentración de desnaturalizante es posible construir el 
gráfico de chevron, el cual brinda información del mecanismo de plegamiento, los estados 
visitados y el tiempo en el cual ocurre el proceso. 
Figura 6. Curva de fracción de proteínas desnaturalizada obtenida a partir de la desnaturalización por 
temperatura. 
 
22 
Para un mecanismo de dos estados hay dos ramas lineales que en conjunto tienen forma de 
“V”, el Ink cambia de manera proporcional con respecto a la concentración (fig. 7). 
Así mismo, el ajuste se puede hacer con la presencia de un intermediario, ya sea porque hay 
más de dos exponenciales o porque se reconoce una fase burts. El intermediario puede estar 
dentro de la vía, se forma muy rápido antes de alcanzar el estado nativo, o por otro lado, se 
puede formar fuera de la vía, el estado nativo se forma directamente del estadodesnaturalizado, el estado intermedio es un estado alterno que requiere desplegarse 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Características de las proteínas como modelos de estudio en el plegamiento 
Generalmente las proteínas que se utilizan para comprender el proceso de plegamiento, son 
modelos de estudio que abarcan propiedades particulares y por lo tanto no representan la 
amplia variedad del proteoma. La mayor parte de los estudios se han realizado con proteínas 
in-vitro, pequeñas (≤100 aa), formadas por un solo dominio y monoméricas. De manera que, 
el plegamiento de aquellas proteínas de mayor tamaño (≥100 aa), con más de un dominio 
estructural y multimericas ha sido poco explorado, debido a que generalmente, son 
irreversibles y muestran una alta estabilidad cinética; con todo y que estas de proteínas 
Figura 7. Gráfico de Chevron para un mecanismo de dos estados. 
 
23 
representan la mayor parte de los sistemas biológicos (Braselmann, 2013). Por lo que se 
refiere a las proteínas multidominio que integran aproximadamente el 75% del proteoma de 
los seres vivos; es reconocido que se ha explorado menos del 5% de su plegamiento; datos 
que muestran nuestro escaso entendimiento del proceso. Evitar seleccionar proteínas con 
características poco estudiadas, a causa de las complicaciones de su estudio, obstaculiza 
nuestro entendimiento del plegamiento de proteínas (Han, 2007). 
Las proteínas multidominio son aquellas que han evolucionado a partir de la duplicación de 
genes, facilitando la generación de funciones novedosas. Se define como dominio a una 
unidad evolutiva independiente y autónoma de plegamiento que puede presentarse aislada 
o recombinarse con otras para formar parte de una proteína multidominio. Con base a la 
definición de dominio, podemos pensar que el estudio de dominios individuales o en 
aislamiento evidenciará todas las características de plegamiento de la proteína 
multidominio. Lo cual supone que el todo es la suma de las partes. Sin embargo, estudios 
previos han mostrado que las características de plegamiento de las proteínas multidominio 
difieren de aquellas con dominios aislados, por ejemplo, Han, J. y colaboradores en su trabajo 
“The folding and evolution of multidomain proteins” menciona que la intercara entre 
dominios, los dominios vecinos y las repeticiones en tándem son tres características que 
influyen en el plegamiento de una proteína multidominio (Han. 2007). En dicho trabajo 
propusieron que la intercara entre los dominios es una zona con una secuencia de 
aminoácidos y una geometría conservada que proporciona estabilidad e influye en la cinética 
de plegamiento. La intercara puede ser de dos tipos: aquellas dónde los dominios están 
unidos por regiones no estructuradas y por lo tanto existe una dificultad en identificar el 
inicio y el término de cada dominio y aquellas que son una región estructurada que permite 
delimitar cada dominio. Se ha observado que proteínas con el primer tipo de intercara 
presentan un plegamiento cooperativo en comparación con el segundo tipo de intercara, la 
cual es delimitada y por lo tanto el plegamiento es no cooperativo (Han. 2007). 
Por otra parte, la interacción de dominios vecinos proporciona tres estrategias que evitan el 
mal plegamiento: primero, el incremento en la velocidad de plegamiento evita la 
acumulación de los estados desplegados, segundo que la interacción dominio-dominio 
 
24 
incrementa la estabilidad de la proteína y por último se evita la agregación. Finalmente en 
las repeticiones en tándem, se ha observado que los dominios adyacentes no son dominios 
idénticos de manera que el plegamiento equivocado y la agregación son reducidos. 
Por todo lo anterior, la hipótesis que asume que el plegamiento de una proteína 
multidominio puede ser reducido al plegamiento de los dominios que la constituyen, es para 
muchos sistemas errónea. De modo que la posición de un dominio dentro de un contexto de 
una proteína multidominio puede alterar significativamente la energía del paisaje de 
plegamiento (Braselmann, 2013), pues hay características que emergen de la interacción 
entre dominios y como consecuencia afectan el plegamiento. Dicho lo anterior es necesario 
revaluar el plegamiento de proteínas multidominio, pues si el estudio del plegamiento de 
dominios aislados revela algunos principios, es importante preguntarse si éstos se extienden 
al plegamiento de los multidominios en conjunto (Han, J. 2007). 
 
 
Proteínas periplásmicas de unión (PBP´s) y transportadores ABC 
Un modelo de estudio óptimo para el plegamiento de proteínas multidominio es la familia 
de proteínas periplásmicas de unión (PBP´s), las cuales son parte de los sistemas de 
transporte periplasmáticos de bacterias Gram negativas. Dichos sistemas de transporte 
están constituidos por un complejo de membrana transportador ABC y una proteína PBP. Los 
complejos de membranas ABC se encargan de introducir o exportar sustancias y están 
constituidos por dos dominios transmembranales y dos dominios de unión a nucleótidos. Las 
PBP´s, por su parte, unen una gran diversidad de ligandos en el periplasma bacteriano; entre 
ellos iones, aminoácidos, péptidos, monosacáridos, vitaminas y oligosacáridos. A través de 
la asociación con el transportador ABC participan en el transporte del ligando desde el 
periplasma al interior de la célula (fig.8) (Bernstsson, 2010). 
Se ha propuesto que las PBP´s se han originado por duplicación génica, por lo cual presentan 
una estructura similar. Todas la PBP´s están constituidas por dos dominios estructurales 
unidos por una región de bisagra, cada dominio o lóbulo está integrado por 5 o 6 hebras β 
rodeadas por cuatro hélices alfa. El sitio de unión del sustrato se encuentra entre los dos 
 
25 
dominios. La proteína presenta un cambio conformacional cuando une el ligando, el cual se 
define como estilo “fly-trap”. 
Las PBP´s se clasifican en tres grupos de acuerdo al número y orden de las hebras β que 
conforman los dominios así como el número de segmentos polipeptídicos que se encuentran 
en la región de bisagra. Las PBP´s de tipo I presentan 6 hebras β y 3 segmento polipeptídicos 
mientras que las PBP´s de tipo II muestran 5 hebras β y 2 segmentos polipeptídicos. Las PBP´s 
de tipo III, por su parte, presentan una hélice α en la región de bisagra. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Complejo de membrana ABC. Se muestra el dominio transmembrana, el dominio de unión a 
nucleótido y la proteína periplásmica de unión (PBP). 
 
26 
 
Proteína periplásmica de unión a lisina, arginina y ornitina (LAO) 
 
Función 
La proteína de unión a lisina, arginina y ornitina (LAO) es una PBP que une los aminoácidos 
básicos arginina, lisina, ornitina e histidina. LAO se encuentra en el periplasma de Salmonella 
typhimurium y Escherichia coli, formando parte del sistema de transporte periplásmico, en 
el complejo de membrana HisJ. (Oh, 1993). 
 
Estructura 
LAO está constituida por 238 residuos y dos dominios o lóbulos estructurales (A y B) unidos 
por una región de bisagra. En relación a los tipos de clasificación mencionados, LAO es una 
PBP de tipo II ya que cada lóbulo está constituido por 5 hebras β, 4 paralelas y 1 antiparalela; 
y los lóbulos se interconectan a partir de dos regiones polipeptídicas. El lóbulo A es 
discontinuo en secuencia mientras que el lóbulo B es continúo, lo cual quiere decir que la 
secuencia de la cadena polipeptídica primero forma estructura correspondiente al lóbulo A, 
se interrumpe para formar completamente la estructura del lóbulo B y regresa para terminar 
de formar al lóbulo A. Específicamente, el lóbulo A está formado por los residuos 1 al 88 y 
del 195 al 238, mientras que el lóbulo B se compone de los residuos 93 al 185. La región de 
bisagra por su parte, está formada por los residuos 89 al 92 y 186 al 194. Una característica 
relevante para estudiar el plegamientopor métodos espectroscópicos, es la presencia de 
triptófanos (Trp), LAO cuenta con dos de ellos: el residuo 47 del lóbulo A y el 130 del lóbulo 
B (fig. 9). 
La mayor parte de las interacciones entre LAO y sus ligandos se establecen con el lóbulo A, a 
partir de los residuos Ser 70, Ser 72, Arg 77 y Thr 121. Por su parte el lóbulo B participa con 
los residuos Thr 121 y Asp 161. A su vez, se ha reportado que los residuos Tyr 14 y Phe 52 
interactúan con la cadena lateral de todos los ligandos y aunado a esto, los aminoácidos Asp 
30 y Ser 69 interactúan con el ligando a partir de moléculas de agua(Oh, 1993). 
 
 
27 
 
 
 
Antecedentes termodinámicos y cinéticos del plegamiento de LAO 
En 2011, Vergara, G. Jesús realizó estudios termodinámicos y cinéticos del plegamiento de 
la proteína LAO. El proceso fue seguido por IF y por DC. En dicho trabajo, se reportó un 
proceso de plegamiento de dos estados al equilibrio en desnaturalización térmica y por urea. 
(fig.10). Es importante mencionar que los experimentos de desnaturalización se efectuaron 
en un rango de pH de 8 a 9.5, pues fue señalado que a pH menores la proteína se agrega, 
siendo pH 9 las condiciones dónde la proteína presenta mayor reversibilidad. Los estudios 
cinéticos, a partir del gráfico de Chevron, mostraron la presencia de dos ramas a 
concentraciones de renaturalización. La rama a mayor velocidad hace referencia a la 
Figura 9. Estructura de la Proteína de unión a lisina-arginina-ornitina (LAO). El lóbulo A se muestra en color 
rosa ( ) y en color verde ( ), lo cual señala que este dominio es discontinuo. En azul ( ) se muestra el 
lóbulo B (dominio continuo) y en color olivo ( ) se muestra la región de bisagra. En el lóbulo A, se observa 
la cadena lateral del residuo 47 que corresponde al Triptofano (Trp-W). Así mismo, se observa el enlace 
disulfuro entre los dos residuos de Cisteina (Cys-C). En el lóbulo B, se distingue la cadena lateral del residuo 130 
que corresponde al Trp-W; así como la cadena lateral del residuo de Histinidina (His-H). 
 
28 
presencia de un intermediario. Por su parte, la rama con curvatura a menor velocidad 
corresponde a la isomerización de la prolina 17 (fig.11) (Vergara, 2011). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10. Curva de desnaturalizada de LAO. (A) Desnaturalización térmica a pH 9 y (B) desnaturalización por 
urea a pH 9. En círculos morados ( ) seguido por IF y en cuadros verdes ( ) seguido por Dicroísmo circular 
(Vergara.2011). 
A B 
Figura 11. Gráfico de chevron para LAO. Cada cuadro en morado ( ) representa la K obtenida a cada 
concentración de urea. A bajas concentraciones de urea se observan dos ramas. La rama a mayor velocidad 
representa la presencia de un intermediario y la rama a menor velocidad con curvatura se refiere a la 
isomerización de la prolina 17 (Vergara, 2011). 
 
 
 
 concentración de 
0 1 2 3 4 5
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
ln
 k
 (
s
-1
)
Urea [M]
40 45 50 55 60 65 70
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
40 45 50 55 60 65 70
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
 IF
F
d
 DC
Temperatura (°C)
0 1 2 3 4 5 6
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
 DC
 IF
F
d
Urea [M]
 
29 
 
Antecedentes termodinámicos y cinéticos del plegamiento del dominio A 
En 2018 Berrocal, G. Tania reportó los ensayos al equilibrio y cinéticos efectuados con el 
lóbulo A en aislamiento (fig.12). El plegamiento fue de dos estados al equilibrio, al efectuar 
la desnaturalización térmica y por agente desnaturalizante, urea. Los estudios se siguieron 
por IF y por DC (fig. 13). El gráfico de Chevron evidenció una cinética más compleja, pues 
muestra dos ramas en la renaturalización y dos ramas con curvatura en la desnaturalización. 
Estos resultados revelan un desplegamiento cinético con mayor número de pasos y número 
de estados, por lo menos dos estados intermedios (fig. 14) (Berrocal, 2018). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 13. Curva de desnaturalización del lóbulo A. (A) desnaturalización por temperatura y (B) 
desnaturalización por urea; ambos procesos en condiciones de pH 9. 
B 
Figura 12. Estructura del lóbulo A. Su estructura se representa en color rosa ( ) y en color verde ( ), 
mostrando que este dominio es discontinuo en secuencia. 
A 
20 30 40 50 60 70
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
F
d
Temperatura (°C)
0 1 2 3 4 5
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
F
d
Urea [M]
 
30 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
0 1 2 3 4 5
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
ln
 k
 (
s
-1
)
Urea [M]
Figura 14. Gráfico de chevron para el lóbulo A. Cada circulo en naranja ( ) representa la K obtenida a cada 
concentración de urea. A bajas concentraciones, se observan dos ramas de renaturalización; así como a altas 
concentraciones. Las ramas a mayor velocidad, tanto a bajas y altas concentraciones de urea, representan la 
presencia de un intermediario. 
 
 
 
 concentración de 
 
31 
 
JUSTIFICACIÓN 
Es claro que no podemos realizar una extrapolación del plegamiento de dominios 
individuales o aislados a todos los miembros del proteoma de tipo proteínas multidominio. 
Se ha demostrado que hay señales que emergen de la interacción entre dominios y que éstas 
influyen en el plegamiento de la proteína completa, y por lo tanto, la manifestación de dichas 
señales se pierde en dominios aislados. De ahí que es necesario experimentar con proteínas 
multidominio y sus dominios aislados a la vez, para reconocer cuáles son las consecuencias 
termodinámicas y cinéticas de la interacción entre dominios vecinos en el proceso de 
plegamiento. La relevancia de abarcar estos modelos de estudio que representan, en mayor 
medida, la diversidad de proteínas que conforman el proteoma de cualquier organismo, 
conducirá a una extrapolación integrativa y extensiva. De igual modo, contribuirá al 
ensamble de las piezas de este complejo rompecabezas que es el plegamiento de proteínas. 
 
 
 
 
HIPOTESIS 
Al ser LAO una proteína multidominio con una intercara delimitada, se espera que su 
plegamiento sea aditivo entre los dominios que la integran, lóbulo A y lóbulo B. A su vez, 
dado que el lóbulo A es un dominio discontinuo en secuencia y configurado por un número 
mayor de residuos, en relación con el lóbulo B que es continuo e integrado por 39 residuos 
menos, es de esperar que el primer dominio, lóbulo A, presente una estabilidad de 
plegamiento mayor en comparación con el segundo. Finalmente, se espera que la cinética 
de plegamiento de los lóbulos aislados ocurra por un menor número de pasos y una mayor 
velocidad de plegamiento en contraste con LAO que es la proteína multidominio. 
 
 
 
 
32 
 
OBJETIVO GENERAL 
Determinar y describir las propiedades termodinámicas y cinéticas de plegamiento del lóbulo 
B, perteneciente a la proteína periplásmica de unión a lisina, arginina y ornitina (LAO). En 
adición, a partir de los parámetros reportados para LAO y el dominio A, analizar si el 
plegamiento de LAO ocurre de manera aditiva entre cada uno de los dominios o por el 
contrario, el plegamiento de los dominios aislados revela que el plegamiento de LAO está 
afectado por las interacciones contextuales que emergen entre los lóbulos, originando un 
proceso de plegamiento cooperativo. 
 
 
 
 
OBJETIVOS PARTICULARES 
 Determinar las propiedades termodinámicas de desplegamiento térmico y por 
agente químico (urea) del lóbulo B utilizando técnicas espectroscópicas (intensidad 
de fluorescencia y dicroísmo circular). 
 
 Determinar las características cinéticas de desplegamiento del lóbulo B seguidas por 
dicroísmo circular. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
33 
 
MATERIALES Y MÉTODOS 
 
Purificación del lóbulo B 
Se mandó a sintetizar el gen que codifica al lóbulo B, constituido de los residuos 93 al 185 de 
la proteína silvestre. El gen se clonó enel vector pET28a, a partir de la técnica de clonación 
“Gibson assembly”. Esta técnica consiste en mezclar el fragmento de gen g-Blocks, el 
plásmido linearizado y el Mix Gibson Assembly. Posteriormente se incuba la mezcla a 50°C 
durante una hora, dando como resultado los vectores recombinantes para ser replicados. El 
plásmido se transformó por choque térmico en células de Escherichia coli de la cepa “DE3 
gold” para la expresión de la proteína. Las bacterias transformadas se sembraron en placas 
de medio con Kanamicina (60 µM) y se incubaron a 37°C toda la noche. Se tomaron colonias 
de estos medios y se inocularon en 4 tubos de 10 ml compuestos de medio LB (Luria-Bertani) 
y 10µl de Kanamicina a una concentración de 60 µM. Los inóculos se incubaron a 37°C en 
agitación toda la noche. Posteriormente, los cultivos se transfirieron a matraces con un 1L 
de medio LB y Kanamicina 60 µM. Se mantuvieron a 30°C en agitación constante. Al alcanzar 
una densidad óptica (DO) de 0.8 a 600nm, a cada cultivo se adicionó 0.20 g del inductor 
isoprpopil β-D-tiogalactopiranósidico (IPTG) a una concentración de 0.8 mM, compuesto que 
se une a la proteína represora por lo cual se induce la formación de la proteína. Los cultivos 
permanecieron en condiciones de agitación a 22°C durante toda la noche. Pasado el tiempo 
de incubación, los cultivos se centrifugaron a 5500 rpm durante 15 minutos con el rotor SLA-
1500, con el fin de recolectar las células. La pastilla celular se resuspendió con el siguiente 
amortiguador: NaH2PO4 20 mM, NaCl 500 mM e Imidazol 30 mM y 0.01 g de Floruro de 
fenilmetilsulfonilo (PMSF) (inhibidor que se une al residuo de Serina del sitio activo de las 
proteasas y por lo tanto evita la ruptura de las células) disuelto en 1ml dimetil 
sulfoxido(DMSO). La muestra resultante se colocó en un vaso de precipitado inmerso en hielo 
para efectuar el proceso de sonicación, a partir de 20 pulsos de 20 segundos con descansos 
de 20 segundos. Posteriormente la muestra se centrifugo a 19 000 rpm durante 25 minutos 
 
34 
con el rotor F215. Con el fin de separar las proteínas del lisado celular, el sobrenadante se 
filtró utilizando un filtro WHATMAN de 0.2 µm. 
La purificación del lóbulo B se realizó en el equipo HPLC por cromatografía de afinidad en 
una columna de níquel His Trap™ HP 5 ml, pues la población de proteínas presentaba 
etiquetas de histidinas. El amortiguador requerido para llevar a cabo la corrida fue NAH2PO4 
20 mM, NaCl 500 mM e Imidazol 30 mM a pH 7.4. El buffer de elusión para obtener la 
proteína fue NAH2PO4 20 mM, NaCl 500 mM e Imidazol 500 mM a pH 7.4, con un 42% de 
elusión. 
Con el fin de mantener las condiciones del amortiguador de trabajo, el cual presenta un 
rango amplio de amortiguamiento, se realizó un cambio de amortiguador a Bis-tris 50 mM a 
pH8 a partir de centrifugar a 4.4 rpm de dos a cuatro repeticiones durante intervalos de 20 
a 30 minutos. 
Finalmente con el fin de obtener el lóbulo B aislado, se realizó el corte de las etiquetas de 
histidina de la proteína transformada. Se colocó la muestra en una resina de agarosa, la cual 
tiene unida covalentemente la trombina; enzima encargada de realizar el corte entre la 
etiqueta de hitidinas y la proteína transformada, que presenta el sitio de reconocimiento a 
trombina. Así la escisión por acción de la trombina ocurre en los residuos de Gly y Arg. Por lo 
tanto, una vez que la proteína se colocó en la resina, se agregó el amortiguador de corte; 
Tris-HCl 500 mM, CaCl2 100 mM a pH 8.0. La solución se mezcló por cuatro horas a 25°C. 
Transcurrido el tiempo, se centrifugo a 2500 rpm por 5 minutos a 4°C. El sobrenadante 
recuperado se purifico a partir del equipo HPLC y una columna de níquel His Trap™ HP 5 ml. 
La muestra obtenida correspondió al lóbulo B aislado, debido a que las etiquetas de hitidinas 
permanecieron unidas a la columna. 
 
 
Estudios termodinámicos 
 
Desnaturalización térmica 
La desnaturalización por temperatura fue seguida por DC e IF. Los ensayos por DC, se 
realizaron en un espectropolarimetro JASCO-700 en una celda de 0.1 cm de paso de luz. Se 
 
35 
prepararon muestras con un volumen final de 400 µl a una concentración de proteína 0.2 
mg/ml en amortiguador Bis-tris-propano 10 mM, en un rango de pH entre 5 y 9. En cada 
condición de pH se obtuvieron tres espectros; a 25°C, a 80°C y un tercero al disminuir la 
temperatura de 80°C a 25°C. El primer espectro se realizó con el propósito de reconocer si 
la proteína presentaba estructura secundaria, el segundo demostraría si la estructura se 
perdía al aumentar la temperatura y el último evidenciaría si el plegamiento es un proceso 
reversible. Para todas las condiciones de pH se realizó la desnaturalización térmica de 20°C 
a 80°C, aumentando la temperatura a una velocidad de 0.5 grados por minuto, 
monitoreando la señal a 195, 210 y 222 nm. De cada condición de pH se realizaron 5 
repeticiones. 
Las pruebas de IF se efectuaron en un espectrofluorometro ISS PC1 con celdas de cuarzo de 
0.5 x 0.5 cm y rejillas de paso de luz de 1 mm. Se realizaron espectros en las mismas 
condiciones de pH y temperatura que en DC; sin embargo, el propósito de estos espectros 
fue reconocer la alteración de la estructura terciaria. Las rampas de temperatura ocurrieron 
en las mismas condiciones de pH, intervalo de temperatura y velocidad de calentamiento 
que en DC. Para cada pH se realizaron 6 repeticiones. Las muestras se excitaron a 295 nm, y 
la emisión fue seguida a 330 y 360 nm. 
 
 
Desnaturalización química 
La urea fue el agente caotrópico que se utilizó para efectuar la desnaturalización química. 
Los experimentos fueron seguidos por DC e IF en los instrumentos anteriormente 
reportados. Las muestras se prepararon a distintas concentraciones de urea, en un rango de 
0 a 6 M, en solución con proteína a una concentración de 0.2mg/ml, Bis-tris-propano 10 mM, 
en condiciones de pH 5 y 9 a 25°C. Para ambas pruebas espectroscópicas se efectuó la 
desnaturalización aumentando la concentración de urea, de 0 a 6 M, con un aumento de 0.5 
M entre cada unidad. Se realizaron 5 repeticiones por condición de pH. Los espectros 
obtenidos, permitieron corroborar la presencia de estructura secundaria y terciaria. Se tomó 
 
36 
las longitudes de 210 y 222 nm para DC y 330 y 360 nm para IF, con el fin de realizar el análisis 
de desnaturalización. 
 
Estudios cinéticos 
Los experimentos fueron seguidos por DC a 222 nm a partir de un instrumento de flujo 
detenido en el espectropolarimetro Chirascan de Applied, Photophysics. 
Se utilizó una muestra de proteína a una concentración final de 1mg/ml en solución con 
amortiguador Bis-tris-propano 10 mM así como una solución de urea a diferentes 
concentraciones en solución con amortiguador Bis-tris-propano 10 mM. Las condiciones de 
experimentación ocurrieron a pH 5, pues fue en este valor, dónde la proteína mostró mayor 
estabilidad. 
El flujo detenido consiste en mezclar a alta velocidad la muestra de proteína con el 
amortiguador o la solución de urea según sea el caso. Ambos reactivos se mezclan al llegar a 
la cámara de mezclado, momento en el que el flujo se detiene abruptamente por la jeringa 
de paro. La muestra que lee el instrumento es aquella que queda en la cámara de 
observación al detener el flujo. El tiempo que tarda en llegar la mezcla de la cámara de 
mezclado a la cámara de observación se le conoce como tiempo muerto. En este trabajo, se 
realizaron ensayos de flujo detenido a bajas y altas concentraciones de agente 
desnaturalizante, lo cual correspondió a cinéticas de renaturalización y desnaturalización 
respectivamente. Para las pruebas de renaturalización el rango de concentración final de 
urea fue entre 1.6 y 0.45 M. En los ensayos de desnaturalización las concentraciones finales 
abarcaron un rango de 1.8 a 3.6 M de urea. De cada concentración para ambos 
experimentos, se realizaron11 repeticiones. 
 
 
 
 
 
 
 
37 
Análisis de datos 
Estudios termodinámicos 
Desnaturalización térmica 
En las rampas de temperatura de DC e IF, la pretransición y la postransición se ajustaron a 
una línea recta: 
𝑌 = 𝑚𝑥 + 𝑏 
(ec.1) 
Dónde: 
 m=pendiente 
 x=temperatura 
 b=ordenada de origen 
 
El fin de este ajuste, fue conocer el valor del estado nativo y el estado desnaturalizado a 
cada temperatura; yN (señal de proteína nativa a cada concentración) y yD (señal de proteína 
desnaturalizada a cada concentración), respectivamente. El conjunto de los datos se 
normalizaron a fracción de proteína desnaturaliza (Fd), con la ecuación Fd (ec.2), basada en 
un modelo de dos estados. La normalización se realizó en un rango de 0 a 1; dónde 0 
corresponde al valor del estado nativo y 1 corresponde al valor del estado desnaturalizado. 
𝐹𝑑 =
(𝑦𝑜𝑏𝑠 − (𝑦𝑁 + 𝑚𝑁𝑇))
((𝑦𝐷 + 𝑚𝐷𝑇) − (𝑦𝑁 + 𝑚𝑁𝑇)
 
(ec.2) 
Donde: 
 Yobs= señal seguida por DC o IF 
 yN+mNT= ecuación de línea recta para el ajuste a pretransición 
 yD+mDT= ecuación de línea recta para el ajuste a la postransición 
 
 
38 
 
De dicha normalización se obtuvo la curva de desnaturalización y a partir del programa 
Origin Pro, se ajustó a la ecuación de Van´t Hoff: 
ln 𝐾𝑒𝑞 =
𝛥𝐻𝑣ℎ
𝑅𝑇
+
𝛥𝑆
𝑅
 
 
(ec.3) 
Dónde: 
 Keq= constante de equilibrio 
 ΔHvh= cambio de entalpía de Van´t Hoff 
 R= constante de los gases (0.001987 kcal mol-1 K-1) 
 T= temperatura 
 ΔS= cambio en la entropía 
 
Del gráfico de Van´t Hoff se obtuvieron los valores de ΔH (kcal mol-1) y Tm (°C). Finalmente, 
al graficar ΔH/Tm se estimó el valor de ΔCp (kcal mol-1 K-1). 
 
 
Desnaturalización química 
Con el fin de obtener la curva de desnaturalización Fd, tanto por DC a 210 y 222 nm como 
por IF a 330 y 360 nm en cada condición de pH (5 y 9), los resultados experimentales fueron 
evaluados del mimo modo que en la desnaturalización por temperatura (ec.2). 
La curva de desnaturalización para cada condición de pH y método espectroscopico, con el 
programa Origin Pro, se ajustó a la ecuación de Santoro y Bolen (ec.4), la cual supone un 
modelo de dos estados: 
𝑌𝑜𝑏𝑠 =
{ (𝑌𝑁 + 𝑚𝑁 [𝑢𝑟𝑒𝑎] ∗ 𝑒−(
𝛥𝐺𝐻2𝑂−𝑚𝑁 [𝑢𝑟𝑒𝑎]
𝑅𝑇
)
[1 + 𝑒−(
𝛥𝐺 𝐻2𝑂−𝑚𝑁𝐷[𝑢𝑟𝑒𝑎])
𝑅𝑇 ]
 
 (ec.4) 
 
39 
Dónde: 
 ΔGH2O= energía libre de desnaturalización en ausencia de urea 
 m= pendiente de la transición 
De dicho ajuste, se obtuvo el valor de ΔGH2O (kcal mol-1), m (kcal mol-1M-1) y Cm (M). 
 
Estudios cinéticos 
Las cinéticas de renaturalización y desnaturalización se ajustaron a una exponencial, a partir 
del programa Origin Pro. El ajuste se realizó al aplicar la ecuación 5. De este ajuste, se obtuvo 
el valor de las contantes de velocidad microscópicas para la renaturalización (kf) y 
desnaturalización (ku) en cada concentración de urea. 
 
𝑌 = 𝑌0 + 𝐴1𝑒
𝑥
𝑡1⁄ 
(ec.5) 
 
Dónde: 
 Y= señal 
 Y0= Y en el tiempo 0 
 A1= amplitud 
 x= tiempo (τ) 
 t1= constante de relajación 
 
De cada valor de τ, se obtuvo k. Finalmente se graficó In k contra la concentración de urea, 
construyendo así el gráfico de chevron. Con el programa Origin Pro, se ajustó el grafico de 
chevron a un modelo de dos estados (ec.6): 
 
ln (ko)= ln(knu*exp(mnu*x)+kun*exp(-mun*x)) 
(ec.6) 
 
40 
Así mismo, se ajustó a un modelo de tres estados, con formación de intermediario dentro 
de la vía (on-pahtway) (ec.7) y con intermediario fuera de la vía (off-pahtway) (ec.8): 
 
ln (ko)= ln(Kui*exp(-mui*x)/(1+ Kui*exp(-mui*x))*kin*exp(-min*x) + kni*exp(mni*x)) 
(ec.7) 
ln (ko)= ln(kun*exp(-mun*x)/(1+ Kui*exp(-mui*x)) + knu*exp(mnu*x)) 
(ec.8) 
RESULTADOS 
Estudios termodinámicos 
Desnaturalización térmica 
En la figura 15 se observan los espectros seguidos por DC a 25°C, a 80°C y espectro de 
renaturalización a 25°C (r25°C) en condiciones de pH 5 y pH 9. Los espectros presentan 
mínimos a 210 y 220 nm, correspondientes a hélices alfa y hojas beta. Al aumentar la 
temperatura a 80°C dichas características se pierden y se recuperan al disminuir la 
temperatura a 25°C en el espectro de renaturalización; evidenciando de tal manera la 
recuperación de la estructura secundaria. Por otro lado, al comparar los espectros en ambas 
condiciones de pH (5 y 9) es posible detectar una disminución de señal en el espectro de 
25°C a pH 9, resultado que demuestra perdida de estructura secundaria en estas condiciones 
de pH. 
 A 
190 200 210 220 230 240 250 260
-20
-10
0
10
20
30
 (nm)
 25°C
 80°C
 r25°C
D
C
 (
m
ili
d
e
g
)
190 200 210 220 230 240 250 260
-20
-10
0
10
20
30
 25°C
 80°C
 r25°C
D
C
 (
m
ili
d
e
g
)
 (nm)
B 
Figura 15. Espectros de lóbulo B en seguidos por DC. (A) Condiciones de pH5 y (B) condiciones de pH9. En 
rosa ( ) a 25°C, en amarillo ( ) a 80°C y en verde ( ) a r25°C. 
 
41 
 
La figura 16 muestra los espectros seguidos por IF. En condiciones de pH 5 a 25°C se observa 
un máximo a 330 nm. En el espectro a 80°C disminuye la intensidad y se corre la emisión a 
una longitud de 350 nm. Esto sucede porque al aumentar la temperatura, la proteína se 
desnaturaliza y el triptófano (Trp 47), residuo responsable de la emisión, se expone al medio 
haciendo que disminuya la intensidad de emisión, trayendo consigo un desplazamiento del 
espectro a longitudes de onda mayor. En el espectro r25°C, se observa la recuperación de la 
intensidad en más del 90%. Por lo que se refiere a condiciones de pH 9, los espectros 
muestran un comportamiento distinto en comparación con pH 5. El espectro a 25°C 
evidencia menor intensidad en comparación con el espectro de renaturalización (r25°C). 
 
 
 
 
 
 
 
Tanto los espectros seguidos por DC (fig. 15) e IF (fig.16) evidenciaron que el lóbulo B 
presenta estructura secundaria y terciaria, respectivamente. Fundamentalmente, los 
espectros demuestran la reversibilidad del proceso de desnaturalización. 
La figura 17 muestra las curvas de desnaturalización, obtenidas al normalizar los datos con 
la ecuación Fd (ec.2). Las curvas provienen de datos seguidos por DC a 222 en condiciones 
de pH entre 5 y 9. En cada gráfico, la línea continua se refiere al ajuste del mismo al aplicar 
B1 
300 320 340 360 380 400 420
0.030
0.035
0.040
0.045
0.050
0.055
0.060
0.065
0.070 25°C
 80°C
 r25°C
IF
 (
u
.a
.)
  (nm)
300 320 340 360 380 400 420
0.030
0.035
0.040
0.045
0.050
0.055
0.060
0.065
0.070
 (nm)
 25°C
 80°C
 r25°C
IF
 (
u
.a
)
B2 
Figura 16. Espectros de lóbulo B seguidos por IF. (A) Condiciones de pH5 y (B) condiciones de pH9. En rosa 
( ) a 25°C, en amarillo ( ) a 80°C y en verde ( ) a r25°C. 
 
42 
la ecuación de Van´t Hoff (ec.3). Cada curva presenta una forma sigmoidal. La pretransición 
corresponde al estado nativo; se encuentra entre 20°C y 35°C en pH 5 y 6, entre 20°C y 25°C 
en pH 8 y en pH 9 se observa una ausencia de la misma. De igual modo, en todas las curvas 
de desnaturalización, se presenta la postransición que corresponde al estado desplegado. En 
resumen, la forma sigmoidal de las curvas Fd y el ajuste a partir de la ecuación de Van´t Hoff 
evidencian un desplegamiento por temperatura de dos estados y una sola transición, un 
proceso en el cual; el estado nativo del lóbulo B pasa, sin poblar estados intermedios, 
directamente al estado desplegado. 
Por otra parte, al comparar las curvas de desnaturalización entre las distintas condiciones de 
pH, es perceptible que la fracción de la población de proteína nativa se va perdiendo 
conforme se aumenta el pH, específicamente a valores de pH 8 y 9. Estos resultados 
evidencian inestabilidad del lóbulo B en valores de pH básicos, condiciones que contrastan 
con lo reportado para LAO y el lóbulo A por Vergara en 2011 y Gama en 2018 
respectivamente. 
 
 
 
 
 
 
 
A B 
2030 40 50 60 70 80
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
F
d
Temperatura (°C)
20 30 40 50 60 70 80
-16
-15
-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8
D
C
 (
m
ili
d
e
g
)
Temperatura (°C)
20 30 40 50 60 70 80
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
F
d
Temperatura (°C)
20 30 40 50 60 70 80
-16
-15
-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8
D
C
 (
m
ili
d
e
g
)
Temperatura (°C)
 
43 
 
 
 
 
 
 
 
El ajuste de cada curva de desnaturalización, a partir de la ecuación de Van´t Hoff permitió 
calcular el valor de ΔH y Tm (tabla 2). Posteriormente se graficaron estos dos parámetros 
(ΔH / Tm) y se ajustaron a una línea recta. La pendiente de la recta, se refiere al valor de ΔCp 
0.9 kcal mol-1 (±0.4) (fig.18). 
 
Figura 17- Curvas de desnaturalización Fd del lóbulo B, por desnaturalizacion termica, seguido por DC a 222 
nm. En condiciones de pH (A) 5, (B) 6, (C) 8 y (D) 9. En circulos verde ( ) valores al aplicar la ecución Fd (ec.2) 
y en linea morada ( ) ajuste con la ecuación de Van´t Hoff. La inserción en cada curva se refiere a los datos 
crudos obtenidos en la experimentación. 
C D 
20 30 40 50 60 70 80
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
F
d
Temperatura (°C)
20 30 40 50 60 70 80
-16
-15
-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8
D
C
 (
m
ili
d
e
g
)
Temperatura (°C)
20 30 40 50 60 70 80
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
F
d
Temperatura(°C)
20 30 40 50 60 70 80
-16
-15
-14
-13
-12
-11
-10
-9
D
C
 (
m
ili
d
e
g
)
Temperatura (°C)
 
44 
Tabla 2. Valores de ΔH y Tm, en distintas condiciones de pH. Los valores fueron calculados a partir el ajuste 
con la ecuación de Van´t Hoff, seguido por DC a 222 nm. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 pH 
Parámetros 
 
5 
 
6 
 
8 
 
9 
 
ΔH 
(kcal mol-1) 
 
52.5 
±2.0 
 
51.0 
±2.5 
 
50.6 
±2.6 
 
35.5 
±1.7 
 
Tm 
(°C) 
 
47.2 
±0.2 
 
47.0 
±0.2 
 
37.8 
±0.2 
 
31.8 
±0.3 
m=0.9 kcal mol-1(±0.4) 
Figura 18. Gráfico de ΔH / Tm. La pendiente de la recta representa el valor aproximado de ΔCp. Los círculos 
morados ( ) corresponden a los valores experimentales y la línea verde ( ) es el ajuste a una línea recta. 
30 35 40 45 50
34
36
38
40
42
44
46
48
50
52
54

H
 (
k
c
a
l 
m
o
l-1
)
Tm (°C)
 
45 
Desnaturalización química 
La figura 19 muestra los espectros de DC a pH 5 y 9. El gráfico a pH 5 (fig.19 A) evidencia la 
presencia de estructura secundaria, con mínimos a 210 y 220 nm que corresponde a hélices 
α y hebras β. Así mismo, se visualiza la progresiva pérdida de la estructura al aumentar la 
concentración de urea. Al contrastar los espectros de pH 5 con pH 9 (fig. 19 B) se observa 
que a pH 9 la estructura secundaria se va perdiendo a partir de bajas concentraciones de 
urea, indicio que demuestra la inestabilidad del lóbulo B en valores de pH básicos. 
 
 
 
 
 
 
A B 
190 200 210 220 230 240 250 260
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
 0.0 M
 1.0 M
 2.0 M
 3.0 M
 4.0 M
 5.0 M
 6.0 M
D
C
 (
m
ili
d
e
g
)
 (nm)
190 200 210 220 230 240 250 260
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20 0.0 M
 1.0 M
 2.0 M
 3.0 M
 4.0 M
 5.0 M
 6.0 M
D
C
 (
m
ili
d
e
g
)
 (nm)
Figura 19. Espectros del lóbulo B seguidos por DC a distintas concentraciones de urea, de 0 a 6 M. A (A) pH 5 
y (B) pH (9). 
 
46 
 
Por otra parte, los espectros seguidos por IF (fig. 20) a pH 5 y 9 muestran un corrimiento de 
la longitud de onda al aumentar la concentración de urea, resultado esperado en un procesO 
de desnaturalización. Sin embargo, en condiciones de pH 5 se observa un comportamiento 
atípico, pues en las concentraciones de 0 a 1 M de urea, la intensidad sube y disminuye al 
pasar a 2 M, para volver a subir en las concentraciones restantes (3 a 6 M). Hasta ahora, con 
estos resultados, se puede inferir que existe la presencia de un intermediario en la 
desnaturalización por urea a pH 5. 
La figura 21 muestra los datos experimentales de la desnaturalización por urea seguidos por 
DC a 222 nm. Así mismo, se observan los datos de IF a 360 nm, en condiciones de pH 
5(fig.21A) y pH 9 (fig.21B), al aplicar el centro espectral de masas (CSM), esto a causa de que 
los datos experimentales presentaban un comportamiento errante. La figura 22 muestra las 
curvas de desnaturalización Fd obtenidas a partir de la ecuación 2 para las condiciones 
experimentales antes señaladas. 
A B 
Figura 20. Espectros del lóbulo B seguidos por IF a distintas concentraciones de urea, de 0 a 6 M. A (A) pH 5 y 
(B) pH 9. 
300 320 340 360 380 400 420
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000 0.0 M
 1.0 M
 2.0 M
 3.0 M
 4.0 M
 5.0 M
 6.0 M
IF
 (
u
.a
)
 (nm)
300 320 340 360 380 400 420
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000 0.0 M
 1.0 M
 2.0 M
 3.0 M
 4.0 M
 5.0 M
 6.0 M
IF
 (
u
.a
)
(nm)
 
47 
 
 
 
 
Las curvas de desnaturalización y su ajuste respectivo, a partir de la ecuación de Santoro y 
Bolen (ec.4), en condiciones de pH 5 (fig.22A) para DC e IF; muestran un desfase, 
comportamiento que sugiere la presencia de un intermediario en la desnaturalización por 
urea del lóbulo B. Esto quiere decir, que al aumentar la concentración de urea, la población 
del estado nativo transita a la formación de un estado intermedio, el cual pasará al estado 
desnaturalizado. En la curva de desnaturalización a pH 9, se observa que no ocurre de la 
misma manera (fig.22B). En primer lugar, los datos experimentales en pH 9 evidencian la 
A 
Figura 21. Datos experimentales en la desnaturalización por urea seguidos por DC y centro espectral de masas 
para datos de IF en condiciones de (A) pH 5 y (B) pH 9. 
B 
0 1 2 3 4 5 6
-12
-11
-10
-9
-8
-7
-6
-5
D
C
 (
m
ili
d
e
g
)
Urea [M]
0 1 2 3 4 5 6
-20
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
D
C
 (
m
ili
d
e
g
)
Urea [M]
0 1 2 3 4 5 6
340
342
344
346
348
350
352
354
356
358

m
a
x
 (
n
m
) 
Urea [M]
0 1 2 3 4 5 6
340
342
344
346
348
350
352
354
356
358

m
a
x
 (
n
m
) 
Urea [M]
 
48 
ausencia de la señal que corresponde a la pretransición, de ahí que para hacer la 
normalización y el ajuste se tomó los datos de la pretransición a pH 5, pues los datos crudos 
de la postransición para pH 5 y 9 corresponden al mismo valor, en otras palabras, se llega al 
mismo estado desnaturalizado. Es así que al realizar la normalización y el ajuste, el inicio de 
las curvas de desnaturalización está por arriba del valor asignado para la pretransición o el 
estado nativo (valor de 0 en el eje de Fd). Lo anterior indica que la desnaturalización del 
lóbulo B a pH 9 inicia de una población de proteína que no tiene el 100% del estado nativo. 
En estas condiciones de pH, el lóbulo B es inestable y pierde proporción de estructura 
secundaria y terciaria. 
Finalmente, la ecuación de Santoro y Bolen permitió obtener los valores de los parámetros 
de ΔG, m y Cm (tabla 3). 
 
 
 
 
 
 
 
 
0 1 2 3 4 5 6
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2 (IF)
F
d
Urea [M]
 (DC)
A 
 
49 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 3. Comparación de los valores de ΔG, m y Cm en condiciones de pH 5 y 9 seguidos por DC e IF. Valores 
obtenidos a partir del ajuste de la curva de desnaturalización Fd con la ecuación de Santoro y Bolen. 
 
 
 
Parámetros 
pH 
5 9 
DC IF DC IF 
ΔG 
(kcal mol
-1
) 
1.4 
±0.2 
1.8 
±0.1 
0.2 
±0.6 
0.0 
±0.2 
m 
(kcal mol
-1
M
-1
) 
0.8 
±0.0 
1.3 
±0.0 
1.2 
±0.3 
1.3 
±0.0 
Cm 
(M) 
1.8 1.4 0.5 0.6 
Temperatura 25°C 
B 
Figura 22. Curvas de desnaturalización Fd por desnaturalización con urea de 0 a 6 M, seguidas por DC a 222 nm 
e IF a 360. (A) pH 5 y (B) pH9. En cuadros grises ( ) valores por IF y en círculos verdes ( ) valores por DC. La 
línea azul ( ) y la línea morada () representan el ajuste a partir de la ecuación de Santoro y Bolen para 
ambos métodos espectroscópicos. 
0 1 2 3 4 5 6
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
F
d
 (DC)
Urea [M]
 (IF)
 
50 
Estudios cinéticos 
Las cinéticas de renaturalización y desnaturalización seguidas por DC a 222 nm, en 
condiciones de pH 5, se ajustaron a una exponencial (fig.23). 
 
 
El ajuste a una exponencial permitió obtener el valor de la constante de reacción (τ) a cada 
concentración de urea. De cada τ se obtuvo el inverso (1/τ= k). La figura 22 muestra el gráfico 
de chevron (InK / [urea]). Cada punto corresponde a los valores de k obtenidos a bajas y altas 
concentraciones de urea, renaturalización y desnaturalización respectivamente. El grafico de 
chevron se ajustó a tres mecanismos distintos; a un modelo de dos estados (fig. 24A), así 
como a un modelo de tres estados, específicamente con un intermediario dentro de la vía 
(on-pahtway) (fig. 24B) y con la formación de un intermediario fuera de la vía (off-pahtway) 
(fig.24C). 
 
 
 
 
 
0 2 4 6 8 10
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
D
C
Tiempo (s)
0 2 4 6 8 10
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
D
C
Tiempo (s)
1.6 M 
0.45 M 1.8 M 
3.6 M 
Figura 23. Cinéticas del Lóbulo B seguidas por DC a 222 nm en pH5. (A) Cinéticas de renaturalización a una 
concentración final de 1.6 M a 0.45 M de urea y (B) cinéticas de desnaturalización a una concentración final de 
1.8 M a 3.6 M. 
A B 
 
51 
 
 
 
 
 
Al comparar los distintos ajustes del gráfico de Chevron (fig.24) se advierte que el ajuste con 
un intermediario fuera de la vía (off-pahtway) es el óptimo de los tres, con un valor de R de 
0.9. El ajuste fuera de la vía toma en cuenta todos los valores del ajuste experimental; 
primordialmente aquellos que se encuentran en la rama de renaturalización a bajas 
concentraciones de urea. Particularmente a estas concentraciones, se observa la formación 
de una curvatura en el gráfico de Chevron (fig.25). La interpretación de la curvatura quiere 
decir que a bajas concentraciones de urea el intermediario es estable; y cuando ocurre su 
formación, en el proceso de plegamiento, la velocidad comienza a ser más lenta. A bajas 
concentraciones, en milisegundos el lóbulo B forma un intermediario que carece de las 
interacciones necesarias para formar el estado nativo; por lo tanto el intermediario, 
considerado como un intermediario no productivo, desintegra tales interacciones 
desplegándose; con una velocidad más lenta o también denominado paso limitante. Y así, a 
partir del estado desnaturalizado se forman nuevas interacciones que son óptimas y que 
conducen al estado nativo. 
 
 
Figura 24. Gráfico de chevron del lóbulo B. Cada punto representa el valor de In k=1/τ a cada concentración de 
urea. La línea continua indica tres distintos ajustes. (A) la línea morada ( ) indica el ajuste a un modelo de 
dos estados. (B) La línea naranja ( ) indica el ajuste a tres estados con la formación de un intermediario 
dentro de la vía y (C) en la línea verde ( ) representa el ajuste con la formación de un intermediario fuera 
de la vía. 
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
ln
 k
 (
s
-1
)
Urea [M]
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
ln
 k
 (
s
-1
)
Urea [M]
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
ln
 k
 (
s
-1
)
Urea [M]
A C B 
 
52 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DISCUSIÓN 
Estudios termodinámicos 
Desnaturalización térmica 
Las curvas de desnaturalización Fd del lóbulo B en desnaturalización por temperatura 
muestran un proceso de dos estados, resultados que coinciden con lo reportado para LAO y 
el lóbulo A. 
Por otra parte se observa una dependencia con el valor de pH. A valores de pH ácidos (5 y 
6), se observa mayor estabilidad en la estructura de la proteína que en valores de pH básicos 
(8 y 9), condiciones de pH dónde la población del estado nativo del lóbulo B ha perdido 
estructura. Esta característica es cualitativamente distinta en comparación con lo reportado 
para LAO (Vergara.2011) y para el lóbulo A (Gama.2018); pues fue señalado que ambas 
proteínas mantienen su estructura y su estabilidad en condiciones de pH básico, 
primordialmente a pH 9. Al contrastar con los resultados obtenidos para el lóbulo B, en 
condiciones de pH ácido (5 y 6) ambas proteínas disminuyen su estabilidad. Como 
consecuencia, los parámetros termodinámicos de LAO, lóbulo A y B, son señalados en 
condiciones de pH distintos. Para LAO y el lóbulo A los valores se obtuvieron en condiciones 
Figura 25. Gráfico de Chevron del lóbulo B. La línea continua ( ) indica el ajuste óptimo, con un intermediario 
fuera de la vía (off-pahtway). 
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
In
 k
o
b
s
Urea [M]
 
53 
de pH 8 y 9. Por su parte, para el lóbulo B se reportan en pH 5, 8 y 9 con el fin de evidenciar 
la inestabilidad de este dominio en condiciones de pH básico. 
La comparación de los valores de ΔH, Tm y ΔCp para LAO y ambos lóbulos (A y B) se muestra 
en la tabla 4. 
 
 Proteína 
 
Parámetros 
LAO Lóbulo A Lóbulo B 
pH 
8 9 8 9 5 8 9 
Tm 
(°C) 
57.0 53.9 56.0 53.8 47.2 
±0.2 
37.9 
±0.2 
31.8 
±0.3 
 ΔH 
(kcal mol-1) 
148.0 
±3.9 
141.0 
±4.3 
85.4 80.0 52.4 
±2.0 
50.6 
±2.6 
35.5 
±1.7 
ΔCp 
(kcal mol-1 K-1) 
2.4 
± 0.3 
2.0 
±0.2 
1.0 
±0.1 
Tabla 4. Comparación de los valores de ΔH, Tm y ΔCp de LAO, lóbulo A y B obtenidos a partir del ajuste de 
desnaturalización térmica. 
 
En relación al valor de Tm es observable que no existe diferencia ente LAO (53.9 °C) y lóbulo 
A (53.8°C) a pH 9. Sin embargo existe una diferencia significativa entre LAO y el lóbulo B 
(31.75°C) a pH 9, la cual se reduce a pH 5 (47.17°C). En consecuencia, la diferencia del valor 
de Tm se mantiene entre ambos lóbulos. Es así que, la diferencia entre los valores de Tm 
para los lóbulos aislados, nos diga que el plegamiento entre los dominios ocurre de manera 
cooperativa; pues sino no existiera cooperatividad, los resultados esperados mostrarían un 
solo valor de Tm para las tres proteínas, o por otro lado, en la curva de desnaturalización de 
LAO a pH9, se hubiera esperado visualizar dos transiciones; una a 53.8 °C que correspondería 
al lóbulo A y otra a 31.75°C para el lóbulo B. 
El valor de ΔH representa la energía asociada que se gana o se cede en la formación y ruptura 
de interacciones. En principio, era esperable que el valor de este parámetro disminuyera 
entre LAO y ambos lóbulos (A y B), pues cada uno de ellos está formado por un número 
 
54 
menor de residuos, específicamente hay una diferencia de 39 residuos entre el lóbulo A y el 
lóbulo B, sin embargo esta característica no es la única a tomar en cuenta, sino también la 
discontinuidad del lóbulo A y la continuidad del lóbulo B. En consecuencia, la diferencia en 
la ruptura de interacciones al aumentar la temperatura se verá afectada por ambas 
características. Por lo tanto, si enfocamos nuestra atención en el valor ΔH a pH 9, dónde LAO 
y lóbulo A son estables, se reconoce que la magnitud del valor de ΔH entre lóbulo A (80 kcal 
mol-1) y el lóbulo B (35.48 kcal mol-1) no es aditivo (115.48 kcal mol-1) en relación al valor de 
ΔH de LAO (141 kcal mol-1). Al contrastar estos valores, dónde el valor de ΔH del lóbulo A 
corresponden proporcionalmente en su tamaño con respecto a LAO; podemos inferir dos 
posibilidades: 1) qué el lóbulo A contribuye a la formación de interacciones en el lóbulo B y 
2) que el lóbulo A aumenta la fuerza de interacción. Al efectuar la desnaturalización por 
temperatura de LAO que es una proteína multidominio el valor de ΔH se verá afectado por 
los dominios que la integran, lóbulo A