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Aprendiendo Biologia

23/7/2022

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE
MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces
cerevisiae CAPAZ DE CO-FERMENTAR GLUCOSA Y
SACAROSA

TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
QUÍMICA DE ALIMENTOS

PRESENTA:
MARÍA FERNANDA ROJAS ARELLANO

MÉXICO, D.F. 2013

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
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JURADO ASIGNADO:

Presidente: JOSÉ PEDRAZA CHAVERRI
Vocal: FRANCISCO RUÍZ TERÁN
Secretario: MARICARMEN QUIRASCO BARUCH
1er Suplente: LAURA CARMONA SALAZAR
2do Suplente: HILDA ELIZABETH CALDERÓN VILLAGÓMEZ

Sitio donde se desarrolló el tema:
Laboratorio 321 del Departamento de Biotecnología y Alimentos
En el conjunto E de la Facultad de Química, UNAM.

ASESOR DEL TEMA:
Dr. Francisco Ruíz Terán ________________________
Firma

SUPERVISOR TÉCNICO:
Dra. Hilda Elizabeth Calderón Villagómez __________________________
Firma

SUSTENTANTE:
María Fernanda Rojas Arellano _________________________
Firma

iii

ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE DE FIGURAS Y ESQUEMAS…………………………………………….. v
ÍNDICE DE TABLAS…………………………………………………….………….. viii
RESUMEN......................................................................................................... 1
1. INTRODUCCIÓN…………...…………………………………………………….. 3
2. ANTECEDENTES…………………………………………………………..…..... 4
2.1 Aspectos generales de la levadura Saccharomyces cerevisiae…...… 4
2.2 Metabolismo de Saccharomyces cerevisiae……..………..…………… 6
2.3 Regulación por glucosa en Saccharomyces cerevisiae……….……… 12
3. Justificación……………………………………………………………………… 19
4. Objetivo……………………………………………………………….…………... 20
4.1 Objetivo General…………………………………………….…………….. 20
4.2 Objetivos Particulares…………………………………………………….. 20
5. Hipótesis………………………………………………………………………….. 20
6. Estrategia Experimental…………………………………………...…………… 21
7. Materiales y Métodos……………………………………………………...……. 22
7.1 Características de las Cepas de levaduras……………………..……… 22
7.2 Reactivación y Conservación de las cepas de levaduras…….………. 22
7.3 Preparación del inóculo…………………………………………………... 23
7.4 Estandarización del inóculo……………………………...………………. 23
7.5 Preparación de medios de cultivo………………….…………………... 24
7.6 Muestreo……………………………………………..…………………….. 24
7.7 Cuantificación del consumo de azúcares………………………………. 25
7.8 Cuantificación de etanol………………………………………………….. 25
7.9 Extracción de ADN………………………….…………………………….. 26
7.10 Amplificación de los genes MIG1 y MIG2 por medio de la PCR...…. 26
7.11 Trasformación de una cepa Industrial JC……………………….……. 28
8. Resultados y Discusión…………………………………………………….….. 32
8.1 Fermentaciones (WT, Mig1∆ geneticina y Mig2∆ geneticina)……….. 32
8.2 Amplificación de genes MIG1∆ GENETICINA y MIG2∆

GENETICINA empleando PCR……………………………………….……………. 47
8.3 Transformación de la cepa Industrial JC…………………….…………. 48
8.4 Fermentaciones JC y Tc2……………………………………..…………. 51
8.5 ANOVAS Multifactoriales de JC y Tc2………………………………….. 64
9. Conclusiones…………………………………………………………...………... 65
10. Perspectivas…………………………………………………………………….. 65
11. Bibliografía………………………………………….…………………………... 66

ÍNDICE DE FIGURAS Y ESQUEMAS
Fig. 1. Esquema de los organelos y compartimentos en la célula de levadura. 5
Fig. 2. Biotecnologías que involucran a la levadura………….……………..…… 7
Fig. 3. Metabolismo de la levadura bajo condiciones aeróbias y anaeróbias… 10
Fig. 4. Esquema de represión del gen MIG1 en presencia de glucosa…..…… 15
Fig. 5. Fosforilación de Mig1…………………………………………………….…. 16
Fig. 6. Principal vía de la represión por glucosa……………………………….… 18
Fig. 7. Esquema de la amplificación de la resistencia a geneticina………….… 27
Fig. 8. Método de transfección…………………………………………………...… 29
Fig. 9. Esquema del represor Mig1 y resistencia a geneticina…………….…… 30
Fig. 10. Conteo celular de S.cerevisiae…………………………………………… 33
Fig. 11. Consumo de glucosa en un cultivos por lote bajo condiciones
estáticas, a) glucosa inicial alrededor de 2% y b) glucosa inicial alrededor de
10% para las cepas, (♦) WT, (■) Mig1∆ geneticina y (▲) Mig2∆ geneticina,
representadas gráficamente en función del tiempo…………………………….

38
Fig. 12. Consumo de sacarosa en un cultivos por lote bajo condiciones
estáticas, a) sacarosa inicial alrededor de 2% y b) sacarosa inicial alrededor
de 10% para las cepas, (♦) WT, (■) Mig1∆ geneticina y (▲) Mig2∆ geneticina,
representadas gráficamente en función del tiempo………………………………

39
Fig. 13. Consumo de la mezcla equimolar sacarosa (♦)-glucosa (■) con una
concentración inicial alrededor de 2% de la mezcla equimolar, en cultivos
por lote bajo condiciones estáticas, a) WT, b) Mig1Δ geneticina y c) Mig2Δ
geneticina, representadas gráficamente en función del tiempo………..……….

43
Fig. 14. Consumo de la mezcla equimolar sacarosa (♦)-glucosa (■) con una
concentración inicial alrededor de 10% de la mezcla equimolar, en cultivos
por lote bajo condiciones estáticas, a) WT, b) Mig1Δ geneticina y c) Mig2Δ
geneticina, representadas gráficamente en función del tiempo…………………

44
Fig. 15. Producción de etanol en cultivos por lote bajo condiciones estáticas,
a) glucosa inicial alrededor de 2%, b) sacarosa inicial alrededor de 2% y c)
sacarosa-glucosa mezcla equimolar alrededor de 2% para las cepas WT,

Mig1∆ geneticina y Mig2∆ geneticina, representadas gráficamente…….…..… 45
Fig. 16. Producción de etanol en cultivos por lote bajo condiciones estáticas,
a) glucosa inicial alrededor de 10%, b) sacarosa inicial alrededor de 10% y c)
sacarosa-glucosa mezcla equimolar alrededor de 10% para las cepas WT,
Mig1∆ geneticina y Mig2∆ geneticina, representadas gráficamente……….…..

46
Fig. 17. Amplificación del gen Mig1∆ geneticina. Agarosa al 1%/ 0.5X buffer
TBE/100v, constantes por 30min……………………………………..……………

48
Fig. 18. Amplificación del gen Mig1∆ geneticina de 4 cepas trasformadas.
Agarosa al 1%/ 0.5X buffer TBE/100v, constantes por 30min………………….

49
Fig. 19. Observación al microscopio 100X de T1c cepa transformada………… 49
Fig. 20. Crecimiento de las cepas JC y Tc2 en medio YPDA a) 2x de
geneticina y b) 3x de geneticina………………………………………….………...

50
Fig. 21. Amplificación del gen Mig1∆ geneticina de la cepa Tc2 en 1) medio
YPDA 2x geneticina, 2) medio liquido YPD y 3) blanco positivo Mig1∆
geneticina de la cepa WT. Agarosa al 1%/ 0.5X buffer TBE/100v, constantes
por 30min……………………………………………………………….

50
Fig. 22. Consumo de glucosa en cultivos por lote bajo condiciones estáticas,
a) glucosa inicial
alrededor de 2% y b) glucosa inicial alrededor de 10% para
las cepas, (♦) JC y (■) Tc2, representadas gráficamente en función del
tiempo………………………………………………………………………………….

55
Fig. 23. Consumo de glucosa en cultivos por lote bajo condiciones estáticas,
a) sacarosa inicial alrededor de 2% y b) sacarosa inicial alrededor de 10%
para las cepas, (♦) JC y (■) Tc2, representadas gráficamente en función del
tiempo…………………………………………………………………………………

56
Fig. 24.Concentración de glucosa (■), sacarosa (♦) y fructosa (▲) en cultivos
por lote bajo condiciones estáticas y en mezcla equimolar glucosa-sacarosa
con una concentración alrededor del 2% para las cepas a) JC y b) Tc2,
representadas gráficamente en función del tiempo………………………………

57
Fig. 25.Concentración de glucosa (■), sacarosa (♦) y fructosa (▲) en cultivos
por lote bajo condiciones estáticas y en mezcla equimolar glucosa-sacarosa

vii

con una concentración alrededor del 10% para las cepas a) JC y b) Tc2,
representadas gráficamente en función del tiempo………………………………

58
Fig. 26. Producción de etanol en cultivos por lote bajo condiciones estáticas,
a) Glucosa inicial alrededor de 2%, b) Sacarosa inicial al rededor de 2% y c)
S-G mezcla equimolar alrededor de 2% para las cepas JC y Tc2,
representadas gráficamente………………………………………………………..

62
Fig. 27. Producción de etanol en cultivos por lote bajo condiciones estáticas,
a) Glucosa inicial alrededor de 10%, b) Sacarosa inicial al rededor de 10% y
c) SG mezcla equimolar alrededor de 10% para las cepas JC y Tc2,
representadas gráficamente en función del tiempo………………………………

viii

ÍNDICE DE TABLAS

Esquema de Bloques 1……………………………………………………...…….. 21
Tabla 1. Cepas de levaduras evaluadas en el consumo de azúcares y
producción de etanol, características iníciales………………………………….

22
Tabla 2.Concentración y tipo de azúcar en cada fermentación para las cepas
de estudio y cantidad de células inoculadas…………………………………..….

32
Tabla 3. Velocidades de consumo de azúcares para cada microorganismo
WT, Mig1∆ geneticina y Mig2∆ geneticina………………………………………...

37
Tabla 4.Rendimiento y productividad de etanol con respecto a la cantidad
inicial de azúcar………………………………………………………………...…….

47
Tabla 5. Concentración y tipo de azúcar en cada fermentación (250mL) para
las cepas de estudio y cantidad de células inoculadas…………………………..

51
Tabla 6. Velocidades de consumo para cada microorganismo JC y Tc2…...… 60
Tabla 7. Rendimiento y productividad de etanol con respecto a la cantidad
inicial de azúcar……………………………….……………………………………...

61
Tabla 8. Anovas multifactoriales para las fermentaciones JC y
Tc2………………………….................................................................................

DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

RESUMEN
La glucosa, fuente de carbono preferida por Saccharomyces cerevisiae
sobre otros azúcares (Kaniak et al., 2004), tiene efectos dramáticos en la
regulación del metabolismo de carbono y en muchas otras propiedades de la
levadura, cumpliendo dos funciones vitales: una es como molécula de señalización
y la otra como nutriente, ambas se entrelazan (Rolland et al., 2002).
La represión por glucosa en la levadura Saccharomyces cerevisiae se ha
desarrollado como un complejo sistema de regulación, el cual tiene un efecto en el
consumo de azúcares distintos a la glucosa como lo es la sacarosa.
En la industria Tequilera la utilización de sustratos está constituido en
ocasiones por mezclas de glucosa, fructosa y sacarosa, lo cual ocasiona que en
las fermentaciones Saccharomyces cerevisiae utilice estas fuentes de carbono en
un cierto orden con fases de retardo intermitente, ya que es necesario el
agotamiento de la glucosa para iniciar el consumo de sacarosa, debido a la
preferencia que tiene este microorganismo por glucosa sobre otros azúcares. Es
por ello que se buscan cepas que sean eficientes en el consumo de sacarosa en
presencia de glucosa.
En varios estudios se ha descrito que el principal gen implicado en la
represión por glucosa es MIG1, el cual en presencia de glucosa se une
directamente al ADN impidiendo la transcripción de SUC2, gen necesario para la
utilización de sacarosa. Sumado a este gen represor está el gen MIG2, un
homólogo de MIG1 en un 71%, que de acuerdo a informes tiene un papel
secundario en esta represión (Lutfiyya y Johnston, 1996; Klein et al., 1999).

Con el propósito de evaluar el efecto de estos genes en el consumo de sacarosa
en mezcla con glucosa, se evaluaron 3 cepas de S.cerevisiae, WT cepa silvestre
(BY4741), Mig1∆ geneticina cepa sin el gen MIG1, el cual se sustituyó con un gen
que codifica para resistencia a geneticina y Mig2∆ geneticina cepa sin el gen
http://ec.asm.org/search?author1=Aneta+Kaniak&sortspec=date&submit=Submit
DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

MIG2, el cual se sustituyó con un gen que codifica para resistencia a geneticina;
en cultivos por lote bajo condiciones estáticas, en un medio YP (extracto de
levadura 1% y peptona 1%) al cual se le varió la fuente de carbono en 2% y 10%
de glucosa, sacarosa y mezcla equimolar de glucosa y sacarosa. Se evaluó el
consumo de la fuente de carbono y rendimientos de etanol, lo que permitió ver el
impacto de la supresión de estos genes represores. Se observó que la supresión
de los genes referidos aumenta la eficiencia en el consumo de sacarosa en
mezcla equimolar con glucosa.

Este mismo estudio se realizó con una cepa S.cerevisiae industrial (JC),
utilizada en la producción de Tequila, a la cual se le realizó una trasformación
genética, con el fin de suprimir el gen MIG1, permitiendo así la evaluación de 2
cepas, JC cepa industrial y Tc2 cepa transformada sin el gen MIG1 con resistencia
a geneticina, las cuales fueron evaluadas en cultivos por lote bajo condiciones
estáticas, en medio YP con variación de la fuente de carbono a 2% y 10% de
glucosa, sacarosa y mezcla equimolar de glucosa y sacarosa. Donde de igual
forma se evaluó el consumo de la fuente de carbono y rendimientos de etanol. Se
encontró que la supresión del gen MIG1 permite un consumo de sacarosa sin
represión catabólica de glucosa, dando un consumo co-fermentativo de estos
azúcares.
Este estudio contribuye, por un lado, a entender el efecto de la supresión de
los genes MIG1 y MIG2 en la represión catabólica de una cepa de S. cerevisiae de
laboratorio y por el otro lado, comparar éste mismo efecto sobre una cepa
industrial, la cual generalmente está bajo condiciones de estrés en las
fermentaciones y tiene un fondo genético desconocido, con la cual nunca se han
realizado estudios de ésta naturaleza.

DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

1. INTRODUCCIÓN
Saccharomyces cerevisiae es el microorganismo eucariota investigado más
a fondo, lo que ha permitido la comprensión de la biología de la célula eucariota y,
por lo tanto, en última instancia, la biología humana. S. cerevisiae se ha empleado
en la producción de alimentos, productos fermentados (bebidas alcohólicas,
quesos, etc.), proteínas recombinantes, fármacos y vacunas; además de ser
utilizada para la biorremediación, producción de bioetanol, investigación de
enfermedades como el cáncer y el sida, entre muchas otras áreas. S. cerevisiae
es un organismo muy atractivo para trabajar ya que no es patógena, y debido a su
larga historia de aplicación en la producción de productos de consumo, ha sido
clasificado como un organismo GRAS (generalmente reconocido como seguro).
Debido a esto resulta ser un microorganismo atractivo
para varios fines
biotecnológicos debido a sus amplias aplicaciones y por la facilidad de
manipulación genética mediante tecnología de ADN recombinante, que ha sido
aún más facilitado por la disponibilidad de la secuencia completa del genoma,
publicado en 1996 (Feldmann, 2005; Vázquez y Dacosta, 2007).
El conocimiento de los mecanismos de regulación existentes no sólo es
valioso en la medida que se comprenden los principios generales de regulación,
sino también porque de esta forma es posible explotar nuevas capacidades
metabólicas de las levaduras para su uso industrial.
La glucosa tiene efectos dramáticos en la regulación del metabolismo de
carbono y en muchas otras propiedades de la levadura, cumple dos funciones
vitales: una es como molécula de señalización y la otra como nutriente, ambas se
entrelazan (Rolland et al., 2002).
Este estudio se enfoca en el mecanismo de regulación por glucosa (Mig1
represor protagonista de esta vía y su homólogo de menor impacto Mig2) es de
gran importancia no sólo para dilucidar mejor las vías de señalización y detección
de glucosa, sino que a nivel industrial generalmente los sustratos consisten en
mezclas de carbohidratos, que son absorbidos por las células en un cierto orden
DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

con fases de retardo intermitente (retardo que existe entre el agotamiento de la
glucosa y el consumo inicial de sacarosa o maltosa) debido a la preferencia por
glucosa sobre otros azúcares y a un conjunto de mecanismos controlados por la
glucosa. Lo que resulta a menudo en un menor rendimiento global y reducción de
la productividad volumétrica de etanol (cantidad de etanol producida por unidad de
tiempo) (Rin et al., 2012). Así, la presencia o la captación de glucosa tiene un
impacto negativo sobre el metabolismo de otros azúcares, ya que retrasa su
absorción y prolonga innecesariamente el proceso de producción (Klein et al.,
1999; Ostergaard et al., 2000). Por lo tanto, numerosos enfoques de ingeniería
metabólica han intentado construir microorganismos mejorados capaces de co-
fermentar azúcares mezclados simultáneamente. (Rin et al., 2012).
El presente trabajo consistió en evaluar el efecto que tiene la supresión de
dos genes por separado MIG1 y MIG2 involucrados en la trascripción de SUC2
(gen que codifica para la trascripción de invertasa-hidrólisis de sacarosa-) en el
consumo de azúcares y producción de etanol, así como en el desarrollo de una
cepa industrial (tequilera) sin el gen MIG1. La supresión de los genes
mencionados busca conseguir una mejor economía en el proceso, con base en los
antecedentes bibliográficos de los mecanismos de regulación por glucosa.
2. ANTECEDENTES
2.1 Aspectos generales de la levadura Saccharomyces cerevisiae
Las levaduras son hongos unicelulares, su estructura consta de pared
celular; periplasma, membrana plasmática, invaginación, cicatriz (ocasionada por
la división celular), citosol, núcleo, mitocondria, retículo endoplasmático (RE),
aparato de Golgi, vesículas secretoras, vacuolas, peroxisoma (Fig. 1). La mayoría
de esta estructura y funcionalidad se comparte con los eucariotas superiores, por
ello se toma como un modelo ideal para la biología de células eucariotas
(Feldmann, 2005). Estos microorganismos se localizan en la naturaleza (suelo,
superficie de frutas y ambientes acuáticos). Miden de 1-5 µm de ancho por 5-30
µm de largo, su forma típica es ovoide, la variación en el tamaño y forma
DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

dependen de la edad del cultivo y medio donde se encuentren. Su reproducción
puede ser asexual (gemación) ó sexual (García, 2005).
Entre estos microorganismos existe el género Saccharomyces que
corresponde a levaduras heterótrofas que requieren carbono orgánico para
producir energía y síntesis de componentes celulares (García, 2005), capaces de
llevar a cabo el proceso de fermentación (catálisis anaerobia de los azúcares) de
diversos productos orgánicos, como azúcares e hidratos de carbono. La catálisis
de azúcares por vía aerobia consiste en la utilización del oxígeno para oxidar a la
glucosa total o parcialmente, generando CO2 y agua, ácidos orgánicos y otros
productos intermediarios.

Fig. 1. Esquema de los organelos y compartimentos
en la célula de levadura (Feldmann, 2005).

En particular, la especie cerevisiae es un microorganismo anaerobio facultativo,
que puede llevar a cabo la fermentación alcohólica, proceso por el cual se
producen numerosos productos de interés industrial, como lo son la cerveza, el
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CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

vino y el pan. También es usada por su alto contenido de proteínas y vitaminas,
como suplemento en la alimentación humana y animal. De ella se pueden obtener
enzimas, glicerina y compuestos que dan sabores agradables a los alimentos.
Estas propiedades únicas de la levadura S. cerevisiae de entre unas 700 especies
de levadura y su enorme potencial no estudiado que ha sido explotado durante
muchos miles de años, la ha convertido en el organismo preferido también para la
mayoría de las aplicaciones industriales, médicas y para la investigación (Fig. 2).
Otro aspecto cada vez más importante es aprovechar la capacidad que tienen
para producir a partir de desechos industriales una gran cantidad de sustancias
útiles para la nutrición humana y animal. Por ejemplo, levaduras que pueden
producir vitaminas, grasas y proteínas a partir de residuos de las industrias del
petróleo y del papel, así como diversos subproductos de la industria de frutas y
vegetales (García, 2005).
2.2 METABOLISMO DE Saccharomyces cerevisiae
El metabolismo se refiere a la asimilación bioquímica (vías anabólicas) y
disimilación (vías catabólicas) de nutrientes por parte de una célula. Al igual que
en otros organismos, en la levadura estos procesos son mediados por las
reacciones enzimáticas, y regulación de las rutas subyacentes las cuales han sido
estudiados en gran detalle en la levadura. Las vías anabólicas incluyen procesos
reductores que conducen a la producción de material celular nuevo, mientras que
las vías catabólicas son procesos oxidativos que eliminan electrones de sustratos
o productos intermedios que se utilizan para generar energía. Preferiblemente,
estos procesos utilizan NADP+ o NAD+, respectivamente, como co-factores.
Aunque todas las levaduras son microorganismos que derivan su energía
química, a partir del ATP, por la descomposición de compuestos orgánicos, hay
una diversidad metabólica en cómo estos organismos generan y consumen
energía de esos sustratos.
La mayoría de las levaduras emplean azúcares como su principal fuente de
carbono y por lo tanto fuente de energía, pero hay levaduras específicas que
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CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

pueden utilizar fuentes no convencionales de carbono (ejemplo: hidrocarburos,
etanol, celulosa). En particular Saccharomyces cerevisiae prefiere la glucosa como
fuente de carbono, sobre otras fuentes de energía (Kaniak et al., 2004).

Fig. 2. Biotecnologías que involucran a la levadura (Feldmann, 2005).
La principal fuente para la producción de energía en la levadura
Saccharomyces cerevisiae, es la glucosa. La glucólisis es la vía general para la
conversión de glucosa a piruvato, mediante el cual la se produce energía en forma
de ATP, junto con la generación de productos intermediarios y poder reductor en
forma de NADH para vías de biosíntesis. Existen dos principales vías para la
utilización de piruvato durante la producción de energía: la respiración y la
fermentación (Fig. 3).
Biotecnología
de la
Levadura
Fermentación
Industrial
Elaboración de
cerveza, vino, otras
bebidas alcohólicas,
bioetanol, nuevos
procesos y productos
fermentativos
Investigación
Biomédica sobre:
Cáncer,
Sida,metabolismo de
las fármacos,
escaneo de toxicidad
génica y desórdenes
genéticos humanos
Tecnologías
Medioambientales
Biorremediación,
utilización de
desperdicios,
protección de
cultivos, biosorción
de metales
Industria de la
Salud
Producción de
Fármacos, vacunas,
probióticos,
hormonas,
factores sanguíneos
Investigación
Biológica
Biología celular,
genética,
biología molecular y
bioquímica
Tecnologías de
Alimentos y
Químicos
Saborizantes,
levadura de pan,
pigmentos, enzimas,
acidulantes de
alimentos y
reducciones químicas
http://ec.asm.org/search?author1=Aneta+Kaniak&sortspec=date&submit=Submit
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CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

En presencia de oxígeno y glucosa, el piruvato entra en la matriz
mitocondrial donde es descarboxilado oxidativamente a acetil coenzima A (ACoA)
por la piruvato deshidrogenasa (complejo multienzimático). Esta reacción enlaza la
glucólisis con el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo del TCA), donde el ACoA
se oxida completamente generando dos moléculas de dióxido de carbono (CO2)
equivalentes y poder reductivo en la forma de NADH y FADH2. Sin embargo, el
ciclo del TCA es una vía anfibólica, ya que combina ambas funciones, catabólicas
y anabólicas, en la que se generan productos intermediarios que son necesarios
para la síntesis de aminoácidos y nucleótidos. Otra de las vías presentes en S.
cerevisiae es el ciclo glioxilato, el que corresponde a una vía metabólica entre
compuestos del ciclo del TCA (Feldmann, 2005).
Durante la fermentación alcohólica de los azúcares, S. cerevisiae vuelve a
oxidar NADH a NAD+ en una reacción de dos pasos a partir del piruvato: primero
se descarboxila el piruvato por la enzima descarboxilasa piruvato, seguido por la
reducción de acetaldehído, catalizada por la alcohol deshidrogenasa. Al mismo
tiempo, se genera glicerol a partir de dihidroxiacetona fosfato (DHAP). Un modo
alternativo de oxidación de la glucosa es el ciclo de las pentosas fosfato (PPP por
sus siglas en inglés, Phosphate Penthose Pathway), que proporciona a la célula
pentosas y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH), necesarios para
las reacciones biosintéticas, como la reducción de ácidos grasos, aminoácidos y
alcoholes. En esta vía la glucosa-6-fosfato (G6P) es deshidrogenada y
posteriormente descarboxilada generando ribulosa-5-fosfato (R5P), y dos moles
de NADPH son generados. Por lo tanto, además de generar NADPH, la otra
función importante de esta vía es la producción de azúcares ribosa que sirven en
la biosíntesis de nucleótidos y coenzimas nucleotídicas. Los trasportadores redox,
NAD+ y FAD+, que se reducen durante la degradación de los azúcares a NADH y
FADH, respectivamente, se vuelven a oxidar en las vías respiratorias situadas en
la membrana mitocondrial interna (transporte de electrones) (Feldmann, 2005).
La energía liberada durante la transferencia de electrones está acoplada al
proceso de fosforilación oxidativa, efectuada por la ATP sintasa, un complejo de
DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

enzimas que también se encuentra en la membrana mitocondrial interna y su
función es sintetizar ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico (Feldmann, 2005).
Por otro lado, la gluconeogénesis es un proceso por el cual S. cerevisiae es capaz
de metabolizar etanol, lo que se ha utilizado en ciertas ocasiones para la
producción de biomasa de interés biotecnológico. Este proceso es posible gracias
a la enzima alcohol deshidrogenasa II que reduce el etanol a acetaldehído, al
mismo tiempo que oxida NADH a NAD+ (Feldmann, 2005).
Las rutas bioquímicas en las levaduras se regulan a varios niveles:
I. La síntesis de enzima: Inducción, represión y derepresión de la expresión
génica
II. La actividad enzimática: Activación alostérica, inhibición o interconversión
de las isoenzimas.
III. La compartimentalización celular: Localización de vías particulares en el
citosol, la mitocondria, los peroxisomas o la vacuola.
IV. Los mecanismos de transporte: La internalización, la secreción y el
movimiento de compuestos entre los distintos compartimentos celulares
(Feldmann, 2005).
La levadura, por ser un sistema versátil, ha contribuido significativamente a
descifrar una serie de importantes circuitos de regulación, que en muchos casos
han sido conservados entre todos los organismos eucariontes que han sido
estudiados hasta ahora (Feldmann, 2005).
Las levaduras del género Saccharomyces cerevisiae son fundamentalmente
fermentativas, obtienen energía a través de la fermentación de azúcares, utilizan
sobre todo monómeros como glucosa, fructosa, manosa o galactosa, pero también
son capaces de adaptarse al crecimiento en una amplia gama de fuentes de
carbono como di o trisacáridos, tales como sacarosa, rafinosa y trehalosa, que se
pueden convertir directamente en glucosa o fructosa, por lo tanto, no es
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CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

sorprendente que la glucosa sea una importante molécula mensajera primaria,
señalizando condiciones óptimas de crecimiento para la maquinaria celular.
De esta forma el crecimiento, metabolismo y la expresión génica están
altamente regulados en respuesta a la disponibilidad de la fuente de carbono que
en conjunto con las redes de señalización altamente interconectadas permiten
ajustar su metabolismo, perfil transcripcional y un programa de desarrollo para
adaptarse rápidamente y apropiadamente a los cambios de los estados
nutricionales para lograr respuestas óptimas a cualquier condición nutricional. La
glucosa también afecta otras características de las levaduras de importancia
comercial, tales como la tasa de crecimiento, capacidad de fermentación y la
resistencia al estrés (Benítez et al., 2013; Carlson, 1998; Zaman et al., 2008;
Rolland et al., 2002).

Fig. 3. Metabolismo de la levadura bajo condiciones aerobias y anaerobias (Feldmann,
2005).

DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

La represión catabólica se produce cuando la glucosa o un producto inicial del
metabolismo de la glucosa reprime la síntesis de diversas enzimas respiratorias y
gluconeogénicas. La inactivación catabólica resulta en la rápida desaparición de
dichas enzimas frente a la adición de glucosa, es decir ya no son sintetizadas
debido a la represión de genes por las señales derivadas de la glucosa u otros
azúcares. Sin embargo, la naturaleza de estas señales no se conoce con claridad
(Gancedo, 1998; Santangelo, 2006).

La represión por glucosa en S. cerevisiae corresponde a una adaptación
regulatoria a largo plazo para degradar la glucosa exclusivamente a etanol y CO2.
Por lo tanto, cuando se cultiva aeróbicamente con altas concentraciones de
glucosa, la fermentación representa la mayor parte del consumo de glucosa. En
cultivos por lote, cuando los niveles de glucosa disminuyen, las células se vuelven
progresivamente desreprimidas, resultando en la inducción de la síntesis de las
enzimas respiratorias. Esto, a su vez, se traduce en el consumo oxidativo del
etanol, cuando las células entran en una segunda fase de crecimiento conocida
como el cambio diáuxico (Feldmann, 2005).

El efecto Crabtree lleva este nombre por el bioquímico inglés Herbert Grace
Crabtree, y se entiende como el fenómeno de represión de una vía de producción
de energía por otra vía: la represión de la respiración por la fermentación (De
Deken, 1966).

Generalmente la levadura frente a altas concentraciones de glucosa y en
condiciones
aerobias, produce altas concentraciones de biomasa gracias al ciclo
del TCA. En cambio S. cerevisiae bajo estas mismas condiciones presenta el
efecto Crabtree, se reprime la síntesis y actividad de las enzimas respiratorias
generando etanol. Lo que sucede es que las altas concentraciones de glucosa
aceleran la glicólisis, lo que se refleja en una alta producción de ATP. Esto reduce
la necesidad de fosforilación oxidativa producida durante el ciclo del TCA,
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particularmente por la cadena de transporte de electrones, lo que finalmente
reduce el consumo de oxígeno (Thomson et al., 2005; García et al., 2004).

2.3 REGULACIÓN POR GLUCOSA EN Saccharomyces cerevisiae
La represión por glucosa en la levadura Saccharomyces cerevisiae se ha
desarrollado como un complejo sistema de regulación que implica varios caminos
diferentes.
Hay dos vías principales implicadas en la transducción de la señal. Una
tiene un papel en la detección de glucosa y la regulación del transporte de
glucosa, mientras que la otra en la represión de una amplia gama de genes que
codifican proteínas implicadas en la respiración (ciclo de Krebs y proteínas de
transporte de la cadena de electrones), la gluconeogénesis, el ciclo del glioxilato,
proteínas que están específicamente involucradas en los pasos de absorción y
metabolización de fuentes de carbono alternativas, tales como los genes GAL,
SUC y MAL y genes implicados en la utilización de etanol, lactato y glicerol. Varias
familias de genes implicados en el uso de otras fuentes de carbono están bajo el
control de familias específicas de inductores que permiten una regulación
coordinada de su expresión (Westergaard et al., 2007; Rolland et al., 2002).
Las células de levadura han evolucionado para el crecimiento en una
amplia gama de concentraciones de glucosa, y el genoma incluye 70 genes en la
familia de transportadores de hexosas (Hxt). Seis genes (HXT1-HXT4, HXT6,
HXT7) codifican las proteínas de los principales responsables del transporte de
glucosa que se produce por difusión facilitada, la expresión de un conjunto de
genes que codifican enzimas glicolíticas, transportadores de glucosa, proteínas
ribosomales, y otras proteínas se inducen. Estos transportadores presentan
diferentes afinidades por la glucosa, y los genes son inducidos y/o reprimidos por
los diferentes niveles de glucosa.
S. cerevisiae contiene toda una serie de transportadores de hexosas
homólogos, todos presentando diferentes afinidades al sustrato y patrones de
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expresión. Dependiendo de la cantidad de glucosa presente en el medio, se
expresan transportadores específicos. Los transportadores de alta afinidad como
Hxt6 y Hxt7 son altamente expresados en fuentes de carbono no fermentables y
reprimidos por altos niveles de glucosa (represión mediada por Mig1 y
directamente por Snf3), mientras que los transportadores con baja afinidad, tales
como Hxt1 y Hxt3, son inducidos por la presencia de una alta concentración de
glucosa. Los transportadores con afinidad intermedia para la glucosa como Hxt2 y
Hxt4, por otra parte, son inducidos por los niveles bajos de glucosa y reprimidos
por altos niveles de glucosa (represión mediada por Mig1).
La inducción por glucosa de los genes HXT está mediada por un
mecanismo de represión que implica una proteína de dedo de zinc Rgt1 que se
une al ADN; en ausencia de glucosa, Rgt1 se une a los promotores HXT y reprime
su expresión; la glucosa inactiva la función represora de Rgt1, conduciendo a la
desrepresión de la expresión de genes HXT. Esta inhibición de Rgt1 requiere la
presencia de la proteína Grr1 (parte de un complejo multiproteíco SCF que
contiene las proteínas Skp1, Cdc53 y Cdc34 y el F-box Grr1). Grr1 se requiere
tanto para la inducción de genes por baja glucosa como la inactivación de Rgt1
por concentraciones de glucosa altas. La función de Rgt1 depende de la presencia
de dos co-represores Mth1 y Std1, para reprimir la expresión génica HXT; se ha
demostrado que interactúan con las colas de los sensores de glucosa y el análisis
genético sugiere que están implicados en la transducción de la señal de la glucosa
para regular la invertasa y la expresión de genes trasportadores de hexosas. La
señal de la glucosa inhibe Rgt1, represión mediada por la estimulación de la
degradación de Std1 y Mth1 (señal generada por Snf3 y Rgt2) (Carlson, 1998;
Rolland et al., 2002; Zaman et al., 2008; Orzechowski et al., 2008).
Dos proteínas homólogas transportadoras que abarcan la membrana, Snf3
y Rgt2, son miembros inusuales de la familia de transportadores de hexosas. La
estructura molecular de Snf3 y Rgt2 es distinta de la de la mayoría de los otros
transportadores de glucosa, especialmente en el largo del carboxilo-terminal. Snf3
y Rgt2 se han propuesto para funcionar como sensores o receptores de glucosa
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extracelular generando una señal intracelular para la inducción de la expresión de
genes HXT. Snf3 tiene una alta afinidad por la glucosa, actúa como un sensor a
concentraciones bajas de glucosa, se requiere para la inducción de la
transcripción de los genes HXT2, HXT3 y HXT4; y Rgt2 tiene baja afinidad por la
glucosa y funciona principalmente como sensor en altas concentraciones de
glucosa se requiere para la inducción máxima de la expresión de Hxt1. Hasta la
fecha, se sabe poco acerca del mecanismo real de detección de glucosa por Snf3
y Rgt2 y la naturaleza de la señal que transmiten (Rolland et al., 2002; Özcan et
al., 1996).
La vía principal de la represión por glucosa tiene como efector principal a
Mig1, proteína con dos dedos de zinc (Cys 2 His2) que se une al ADN
específicamente a secuencias ricas en G-C, que corresponden a promotores de
muchos genes, reprimiendo así su transcripción (Fig. 4) (Orzechowski et al.,
2008). Mig1 recluta proteínas co-represoras Ssn6 y Tup1, para ejercer represión
en diversas familias de genes específicos. Para la función esencial de Mig1 en la
represión por glucosa es vital su localización subcelular (núcleo o citoplasma). En
la presencia de niveles elevados de glucosa, Mig1 se mueve rápidamente en el
núcleo, donde se une a los promotores de los genes reprimibles por glucosa (MAL,
GAL y SUC2). Cuando las células son privadas de glucosa, Mig1 es rápidamente
transportado al citoplasma, inhibiendo así su actividad represora.
La levadura tiene otra proteínas con dedos de zinc que está estrechamente
relacionada con Mig1: su homólogo en un 71% Mig2 (Lutfiyya y Johnston, 1996;
Klein et al., 1999). Mig2 parece ser un actor secundario reprimiendo la
transcripción de algunos genes como Mig1, por ejemplo SUC2.
El gen SUC2 de la levadura Saccharomyces cerevisiae codifica la enzima
invertasa, que hidroliza la sacarosa en glucosa y fructosa. La expresión del gen
SUC2 es reprimida alrededor de 200-veces por altos niveles de glucosa. En
ausencia del gen MIG1 (célula mutada), la expresión de SUC2 es todavía
aproximadamente 13-veces reprimida, ya que se ha identificado que Mig2 es
responsable de esta represión por la glucosa restante y por lo tanto de la
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expresión de SUC2 (Lutfiyya y Johnston, 1996). Varios genes (GRR1, REG1,
HXK2, GLC7, MIG1, SSN6, TUP1) son necesarios para la represión por glucosa
de la invertasa (Özcan et al., 1997).

Algunos genes reprimidos por glucosa, son reprimidos sinérgicamente por
Mig1 y Mig2 mientras que otros son reprimidos sólo por Mig1. No hay genes hasta
ahora que sean reprimidos sólo por Mig2. La localización
nuclear de Mig2 no está
controlada por la glucosa, y no hay evidencia de que Mig2 este regulada por Snf1
(no depende de la fosforilación para estar activa). (Orzechowski et al., 2008)
El sensor de esta vía principal de represión por glucosa no se conoce
todavía, pero se cree que implica la hexocinasa 2 (Hxk2), una enzima glicolítica
que cataliza la fosforilación de glucosa a glucosa-6-fosfato, posiblemente sensor
de glucosa, que reside en el núcleo de la célula. Esta localización es necesaria
para la señalización de la represión por glucosa, por lo tanto podría estar
implicada en la transducción de la señal de la glucosa interactuando directamente
con los factores de transcripción que controlan la expresión de genes reprimidos
por glucosa, puede comunicar la presencia de glucosa intracelular y estar
implicada en la inactivación del complejo Snf1.
Fig. 4. Esquema de represión del gen MIG1 en presencia de glucosa.
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La transcripción de los genes reprimibles por glucosa en condiciones
derepresibles depende del complejo quinasa Snf1, ya que cataliza la fosforilación
de los represores.
La red Snf1 es esencial para el crecimiento en fuentes de carbono
fermentables menos preferidos, tales como sacarosa, galactosa, maltosa y para el
crecimiento en fuentes de carbono no fermentables tales como glicerol y etanol. El
complejo Snf1 tiene una función general en la homeostasis de la energía, se activa
en condiciones de baja energía y restablece el nivel de energía por estimulación
de procesos que produzcan energía e inhibe procesos que consuman energía.
Snf1 se inhibe en presencia de glucosa, que puede ser considerado como una
condición de alta energía. (Orzechowski et al., 2008). De esta forma afecta a un
gran número de procesos celulares, incluyendo el envejecimiento, la meiosis, la
acumulación de glucógeno, el crecimiento en inositol, y el crecimiento pseudohifal.

BAJA [GLUCOSA]
Fig. 5. Fosforilación de Mig1. Snf1 proteína quinasa por medio de la vía represión por
glucosa se activa en ausencia o bajas cantidades de glucosa, trasfiriendo grupos
fosfato a Mig 1, fosforilándolo, lo cual impide la unión con sus co-represores (Ssn6-
Tup1) y de esta forma su localización en el promotor se anula y sale del núcleo hacia el
citoplasma en respuesta a la limitación de glucosa, permitiendo la trascripción de
genes como SUC2. El complejo de quinasa Snf1 es inactivo en glucosa alta. El
mecanismo exacto no se conoce; Snf1 está presente tanto en el núcleo como en el
citoplasma.

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La supresión de SNF1 resulta en incapacidad para crecer en fuentes de carbono
distintos de la glucosa, como sacarosa. Este complejo Snf1 se activa por el
crecimiento en ausencia de glucosa.
En ausencia o niveles bajos de glucosa se activa Snf1 a través de su fosforilación
y cambio conformacional (Snf1p) catalizando la fosforilación de Mig1 provocando
su translocación del núcleo al citoplasma, impidiendo la interacción con sus co-
represores Ssn6-Tup1, inhibiendo así la actividad represora de Mig1(Fig. 5)
(Orzechowski et al., 2008). La presencia de glucosa (> 20 mM) inactiva la
quinasa Snf1 por medio de su desfosforilación (esta inactivación es catalizada por
la proteína fosfatasa Glc7-Reg1) y Mig1 al no ser fosforilado permanece en el
núcleo, ubicándose en los promotores y reprimiendo la transcripción de genes
implicados en el metabolismo de otras fuentes de carbono distintas a la glucosa y
fructosa. (Zaman et al., 2008; Özcan et al., 1998; Westergaard et al., 2007;
Rolland et al., 2002; Klein et al., 1999). La represión por glucosa por lo tanto
implica tres pasos consecutivos negativos: glucosa inhibe Snf1, que inhibe Mig1,
que reprime los genes diana (SUC2) (Orzechowski et al., 2008; Klein et al.,
1998).
Los efectos dramáticos de la glucosa sobre el crecimiento y el metabolismo
apoyan claramente una función similar a las hormonas de este azúcar en
S.cerevisiae. Haciendo evidente que la detección y señalización de glucosa en
estos microorganismos es de vital importancia para el mantenimiento de la
homeostasis, permitiendo un uso óptimo de los nutrientes accesibles para
adaptarse a las deficiencias nutricionales de una manera que maximice su
supervivencia.
Los mecanismos de detección de glucosa en la levadura son por lo tanto un
excelente sistema modelo para el estudio de la transducción de señales en
general. Aunque todavía queda por dilucidar cuál es la señal real de glucosa que
desencadena la represión por glucosa (Rolland et al., 2002). Un esquema simple
con gran parte de los procesos descritos se presenta en la Figura 6.
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Fig. 6. Principal vía de la represión por glucosa, esquema que representa a los principales
mediadores y objetivos de la vía de la represión por glucosa; las líneas color rojo indican represión.
Snf3: sensor de glucosa de alta afinidad.
Rgt2: sensor de glucosa de baja afinidad.
Hxt: Trasportadores de hexosas.
Rgt1: proteína de dedos de zinc que se une al ADN en ausencia de glucosa, uniéndose a
promotores de HXT reprimiendo su expresión.
Mth1 y Std1: co-represores de Rgt1, necesarios para reprimir la expresión génica de genes HXT.
Grr1: co-represor para la inducción de genes por baja glucosa y para la inactivación de Rgt1 por
concentraciones altas de glucosa.
Hxk2: posible sensor de glucosa y enzima glicolítica que cataliza la fosforilación de glucosa a G6P.
Snf1: complejo esencial para el crecimiento en fuentes de carbono menos preferidas (sacarosa),
se inhibe en presencia de glucosa.
Reg1 y Glc7: co-represores necesarios para la represión por glucosa de invertasa.
Mig1: represor principal de la vía de la represión por glucosa, es una proteína de dedos de zinc
que se une al ADN en presencia de altos niveles de glucosa, uniéndose a los promotores de genes
reprimibles por glucosa (SUC, MAL, HXT6, etc.)
Ssn6 y Tup1: proteínas co-represoras de Mig1.
Mig2: proteína de dedos de zinc, homólogo de Mig1. Su localización celular no depende de Snf1.
HXT1: gen que transcribe para trasportador de glucosa de baja afinidad.
HXT2 y HXT4: genes que transcriben para transportadores de afinidad intermedia.
HXT6 y HXT7: genes que transcriben para transportadores de alta afinidad.

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3. JUSTIFICACIÓN
La levadura Saccharomyces cerevisiae ha sido un microorganismo de gran
estudio, representa muchos beneficios a nivel industrial y se ha logrado descifrar
gran parte del metabolismo por el cual se rige. Todos los estudios realizados han
empleado cepas de laboratorio, es decir que ya son muy conocidas en cuanto a
genoma, comportamiento, requerimientos nutrimentales (fuente de carbono
preferida, minerales, azufre, nitrógeno) y condiciones ambientales (temperatura,
pH, oxígeno), metabolismo, genoma, etc. Las levaduras naturalmente pueden
utilizar varias fuentes de carbono, pero de forma secuencial mediante un
crecimiento diauxico (utilizando primero glucosa y hasta su término comienza a
utilizar la otra fuente de carbono disponible). Esto ocasiona a nivel industrial en
menores rendimientos en el proceso. Debido a esto existen investigaciones que
intentan construir microorganismos mejorados capaces de co-fermentar mezclas
de azúcares.
Es por ello que el desarrollo de una cepa industrial capaz de co-fermentar glucosa
y sacarosa dará un acercamiento al comportamiento que tiene una cepa industrial
(elegidas por su gran capacidad fermentativa), las cuales no han sido estudiadas
como las de laboratorio, aportando importantes resultados
en cuanto a la
respuesta metabólica de consumo de azúcares y generación de etanol, para
posteriormente darle un uso para mejorar el proceso industrial.

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4. OBJETIVO
4.1 OBJETIVO GENERAL
Desarrollar una cepa de Saccharomyces cerevisiae de origen industrial, que sea
capaz de co-fermentar glucosa y sacarosa.
4.2 OBJETIVOS PARTICULARES

 Conocer el efecto que tiene la supresión del gen MIG1 en la represión
catabólica de sacarosa en presencia de glucosa en una cepa de laboratorio
Mig1∆ geneticina.
 Conocer el efecto que tiene la supresión del gen MIG2 en la represión
catabólica de sacarosa en presencia de glucosa en una cepa de laboratorio
Mig2 ∆ geneticina.
 Evaluar el efecto de la supresión de los genes MIG1 y MIG2 por separado
en la producción de etanol.
 Conocer el efecto que tiene la supresión del gen MIG1 en la represión
catabólica de sacarosa en presencia de glucosa en una cepa de
S.cerevisiae de uso Industrial (JC).

5. HIPÓTESIS
Si los genes involucrados en la represión de SUC2 no se expresan, entonces la
cepa que tiene eliminado el gen MIG1 podrá co-fermentar sacarosa y glucosa,
dando buenos rendimientos en cuanto al consumo de estos azúcares y tiempo de
generación de etanol. La supresión del gen MIG2 tendrá un efecto similar que
MIG1 pero con menos impacto en la co-fermentación de los azúcares sacarosa y
glucosa.

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6. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

Esquema de Bloques 1

FERMENTACIONES

TRANSFORMACIÓN

Preparación
del inóculo.
Preparación de los medios
YP + fuente de carbono a
distintas concentraciones*.
*2% G, 2% S, 2% SG
10% G, 10% S, 10% SG
Conteo celular
y lavado del
pellet.
Inoculación
Muestreo
cada 24 h.
Cuantificación de sacarosa, glucosa y
fructosa empleando HPLC.
Cuantificación de etanol empleando
Cromatógrafo de gases.
Reconstitución de la
cepa a transformar.
Extracción
de ADN. PCR
Transformación
Reactivación de
las cepas.
Conservación en glicerol
(0.7mL de inóculo▼ +0.3mL
de glicerol).
▼ Crecimiento en medio YPD
18h/T°ambiente/250rpm.
G: glucosa
S: sacarosa
SG: sacarosa y glucosa (mezcla
equimolar)
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7. MATERIALES Y MÉTODOS
7.1 CARACTERISTICAS DE LAS CEPAS DE LEVADURAS
Para la realización de este estudio se emplearon 4 cepas de levaduras
Saccharomyces cerevisiae obtenidas de fuentes de laboratorio e industrial. Las
características iniciales se presentan en la Tabla 1.
Tabla 1. Cepas de levaduras evaluadas en el consumo de azúcares y producción
de etanol, características iníciales.
CEPA CARACTERÍSTICAS ORIGEN
WT Silvestre
BY4741
Cepa de laboratorio cultivada
en medio YPD

Estas tres cepas fueron
aisladas y trasformadas en
el Instituto de Cardiología a
cargo del Dr. Héctor
Quezada Pablo

Mig 1∆ geneticina

BY4741
Cepa WT transformada, se le
sustituyó el gen MIG1 por uno
que codifica para resistencia
a geneticina.

Mig 2∆ geneticina

BY4741
Cepa WT transformada, se le
sustituyó el gen MIG2 por uno
que codifica para resistencia
a geneticina.
JC Cepa Industrial Empresa Tequilera

Tc2
Cepa Industrial transformada,
se sustituyo el gen MIG1 por
uno que codifica para
resistencia a geneticina.
Esta cepa fue desarrollada
en el Laboratorio 321 del
Departamento de
Biotecnología y Alimentos
en el conjunto E de la
Facultad de Química,
UNAM.

7.2 REACTIVACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LAS CEPAS DE LEVADURAS
Las cepas de levaduras WT, Mig1∆ geneticina y Mig2∆ geneticina, se recibieron
en conservación en cajas petri con agar YPD (1% extracto de levadura, 2%
peptona, 2% glucosa) con 1.5% de agar, mientras que las cepas mutadas Mig1∆
geneticina y Mig2∆ geneticina se mantenían en agar YPD adicionado con el
antibiótico geneticina 200 µg/mL, empleado como marcador de la mutación ya que
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estas cepas tienen sustituido el gen MIG1 y MIG2, respectivamente, por la
resistencia al antibiótico geneticina.
En el caso de la cepa de levadura industrial, se mantenía en forma de pellet
(liofilizada). Para la reactivación de esta cepa se tomaron 2 gramos del pellet
celular y se resuspendieron en agua estéril, posteriormente se sembraron
aproximadamente 1mL de la solución en agar YPD, las cajas fueron incubadas a
28°C durante 4 días.
Se tomó una colonia de cada cepa de levadura se cultivó en medio líquido YPD e
incubó a temperatura ambiente durante 24 h a una velocidad de agitación de 250
rpm. Las cepas de levaduras se conservaron en caldo YPD conteniendo 30% de
glicerol y se almacenaron a -80°C.
7.3 PREPARACIÓN DEL INÓCULO
Para la preparación del inóculo se tomó una colonia de levadura y se cultivó en un
matraz Erlenmeyer de 250 mL conteniendo 50 mL de medio liquido YPD y se
incubó durante toda la noche a temperatura ambiente con una velocidad de
agitación de 250 rpm. Posteriormente se tomaron 100 µL y se resembraron en otro
matraz con 50 mL YPD fresco, incubadas a temperatura ambiente durante toda la
noche a 250 rpm.
7.4 ESTANDARIZACIÓN DEL INÓCULO
Para garantizar que el inoculo se encontrara a la concentración requerida
(aproximadamente 106- 108 células) para cada fermentación, se emplearon cepas
con 18-24 h de crecimiento en medio de cultivo líquido YPD, de cada cultivo se
hicieron diluciones las cuales fueron leídas en un espectrofotómetro (Cintra double
beam UV-Visible) a una longitud de onda de 595 nm, y simultáneamente
cuantificadas por el conteo al microscopio (ZEISS) utilizando una cámara de
Neubauer. Las células se tiñeron con cristal violeta para facilitar la observación en
el microscopio, ya que sin este colorante las células son casi trasparentes.
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La cámara Neubauer se limpia y esteriliza. Posteriormente se coloca un
cubreobjetos (limpio y estéril) sobre la cámara donde se encuentra la cuadricula y
por capilaridad se introduce la muestra teñida. Se observó al microscopio a 40X.
Las células se contaron en 5 cuadrantes (esquinas y en medio).
La fórmula utilizada para calcular el # de células fue la siguiente:

1mm3 =1 µL
0.04= área de la cuadrícula
0.1= Profundidad de la cámara de Neubauer

7.5 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO CON DIFERENTES
CONCENTRACIONES Y MEZCLAS DE AZÚCARES.
Para cada microorganismo se prepararon tubos de 250 mL con medio YP (1%
extracto de levadura, 2% peptona) a distintas concentraciones de azúcar (marca
Bioxon): 2% glucosa (G), 2% sacarosa (S) y 2% sacarosa-glucosa (SG), para
realizar esta mezcla se realizó un cálculo equimolar, es decir basándose en la
relación molar se calculó el peso de cada azúcar en la mezcla y de 10% G, 10% S
y 10% SG (relación equimolar).
7.6 MUESTREO
Las muestras de cada fermentación fueron tomadas generalmente cada 24 horas
por un periodo máximo de 14 días, dependiendo el comportamiento de la
fermentación. El muestreo se realizó esterilizando previamente tubos eppendorf
(donde se deposita la muestra) y puntas de 1 mL. En zona aséptica se abre cada
tubo de fermentación y se agita un poco para homogenizar, de esta forma tomar
una muestra representativa con la micropipeta de 1 mL. Este proceso se realiza
por duplicado. Posteriormente las muestras se almacenaron a -20°C, hasta su uso
posterior para la cuantificación de azúcares y etanol.
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7.7 CUANTIFICACIÓN DEL CONSUMO DE AZÚCARES
La cuantificación de azúcares se llevó a cabo empleando un sistema HPLC marca
Waters, columna de exclusión iónica AMINEX HPX-87H 300 mm x 7.8 mm marca
Bio-Rad, detector IR Waters 2414, bomba binaria HPLC Waters 1525,
desgasificador en línea AF Waters, muestreador automático Waters 2707, las
condiciones utilizadas fueron temperatura 45°C, flujo 0.6 mL/min, fase móvil
H2SO4 (0.004M) y el tiempo de corrida para cada muestra fue de 12 min.
Cada muestra se centrifugó a 20160 x g / 20min/ 4°C (eppendorf Centrifuge
5417R), se filtró en un filtro con tamaño de poro de 0.45 µm millipore, se pasó a un
vial.
La cuantificación se basó en una curva patrón para los 3 azúcares (glucosa,
sacarosa y fructosa) a distintas concentraciones, graficando concentración
(g/100mL) en el eje “X” contra área (unidades de absorbancia AU) en el eje “Y”,
sacando regresión lineal, permitiendo así despejar por medio del resultado de
absorbancia las concentraciones de los azúcares de las muestras.
7.8 CUANTIFICACIÓN DE ETANOL
Para la cuantificación de etanol se empleo un Cromatógrafo de gases Agilent
6890N, con una columna capilar JW19091N-133 260°C / 30 m x 250 µm x 0.25
µm, gas acarreador H2 40°C 8.06 psi flujo 77.9 mL/min, detector de flama. La
corrida para cada muestra fue de 9 min, tiempo de la corrida a la cual se detectó el
etanol y se ajustó a las condiciones de temperatura requeridas por el
Cromatógrafo. Cada muestra se centrifugó a 20160 x g/ 20 min/ 4°C (eppendorf
Centrifuge 5417R), se filtró en un filtro con tamaño de poro de 0.45 µm millipore,
se pasó a un vial.
La cuantificación se basó en una curva patrón para etanol a distintas
concentraciones (de 0 a 10% v/v), graficando la concentración (g/100 mL) en el eje
“X” contra área (unidades de absorbancia AU) en el eje “Y”, sacando regresión
lineal, permitiendo así despejar por medio del resultado de absorbancia las
concentraciones de etanol de las muestras.
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7.9 EXTRACCIÓN DE ADN
Se tomó parte de una colonia sólida de levadura y se colocó dentro de un tubo
PCR, dispersándola de manera homogénea en las paredes del tubo,
embarrándola de manera homogénea. Posteriormente se ingresa al microondas
(marca Daewoo) por 20 segundos, colocando el tubo con la tapa abierta, junto con
un vaso de precipitados con agua, esto se realiza para evitar que el ambiente este
muy seco y se degraden más las células hasta la destrucción total, lo que
impediría una buena amplificación, ya que el ADN se encontraría destruido.
7.10 AMPLIFICACIÓN DE LOS GENES MIG1∆ GENETICINA Y MIG2∆
GENETICINA POR MEDIO DE LA PCR
Para la amplificación de los genes Mig1∆ geneticina (Fig. 7) y Mig2 ∆ geneticina,
se empleó un Termociclador Thermo scientific PIKO 24, empleando los siguientes
primers (cebadores) y condiciones:
Cebadores 1.5 µM siempre se usó 20 µL de cada uno.
Cebadores de MIG1 y MIG2 del cromosoma 7 de Saccharomyces cerevisiae
(genbank, número de acceso YGL035C).

Mig1 Fo Bis 5´- CACCCCAGTACTCATTAACGAAGAC. Correspondiente a
la posición de los nucleótidos 860 a 885, 25b.
Mig1 Re Bis 5´- ATCTCTGCGGAAGACTAAGACAATC. Correspondiente a
la posición de los nucleótidos 2705 a 2730, 25b.
Mig2 FoBis 5´- TGCCTGTCAAATTGTGTGCTTGTCC. Correspondiente a la
posición de los nucleótidos 870 a 895, 25b.
Mig2 ReBis 5´- CATGACGATGCTAGTTAGTGATATGC. Correspondiente a
la posición de los nucleótidos 2254 a 2280, 26b.

DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

Para la reacción de PCR
Condiciones del Termociclador, programa de temperaturas utilizado fue el
siguiente:
3 min /95°C, 30 seg /95°C, 1 min /59°C, 2 min/62°C, 35 ciclos, 5 min /62°C,
mantener a 4°C
ADN genómico de la levadura -extracción (una colonia)-, dNTPs [10 µM], Taq
polimerasa recombinante [1U], Buffer [1X] para PCR, Mg [1.5 mM]. El volumen
final de la reacción fue de 241.86 µL.
El producto de amplificación se separó por electroforesis en gel de agarosa al 1%
con buffer TBE 0.5X Tris-Borato-EDTA a 100V constantes durante 30 min,
utilizando un marcador de peso molecular de 1 Kb ó 100 pb, esperando un
amplicón de aproximadamente 2000pb. El gel se observó en un trasiluminador
Flour´s y la imagen se analizó utilizando un programa Kodak Molecular Imaging
Software Versión 5.0.

Fig. 7. Esquema de la amplificación de la resistencia a geneticina.
DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

7.11 TRANSFORMACIÓN DE UNA CEPA INDUSTRIAL

La transfección (trasformación) o introducción de material genético exógeno
a células en cultivo es una herramienta eficaz en los estudios de biología
molecular y celular. La posibilidad de introducir ADN exógeno alterando de forma
estable el genoma de una célula, ha permitido estudiar más profundamente las
funciones y el control de la expresión de los genes, así como la generación de
microorganismos mejorados. Esto es posible mediante las diferentes técnicas de
transfección (Ovidio F. y Portelles Y., 1997).

Existen diferentes métodos para la introducción de ADN exógeno en células, para
este estudio se utilizó el método LiAc/SS-Carrier DNA/PEG, donde principalmente
la función del acetato de litio es debilitar la pared celular y permitir el ingreso del
material genético que en este caso es el gen de resistencia a geneticina, el cual se
diseño de tal forma que tiene en sus extremos una sección del gen MIG1, de esta
forma la célula puede ser engañada y utilizar este gen como si fuera propio e
ingresarlo en lugar de MIG1. Los principales objetivos de esta modificación son: 1)
usar la resistencia a geneticina como marcador de la transfección y 2) quitar el gen
MIG1 (Fig. 9)

El ingreso de este material genético se logra con el esperma de salmón (vector), el
cual funciona como acarreador, ya que la cabeza del esperma posee sitios de
unión que atraen moléculas cargadas negativamente como el ADN o en este caso
la sección de resistencia Mig1∆ geneticina (Fig. 8) (Gandolfi F., 1999).

DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

Fig. 8. Método de transfección en células de levadura JC, LiAc/SS-Carrier DNA/PEG.
1
2
3
DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

Fig. 9. Esquema del represor Mig1 y de la resistencia a geneticina.

Para realizar la transformación genética de la cepa industrial en un matraz
Erlenmeyer de 250 mL con 50 mL de medio YPD se cultivó la cepa industrial JC
(agregando una asada de una colonia del crecimiento en cajas con medio YPD),
incubándola durante toda la noche a 30°C con agitación 250 rpm. Tomar densidad
óptica a 600 nm entre 0.2 a 0.25 nm, empleando un Espectrofotómetro UV-visible
de doble haz (Cintra, Australia).
Posteriormente en 2 tubos Falcon con 25mL de YPD nuevo se inocularon e
incubaron a 30°C, con agitación a 250 rpm, aproximadamente durante tres horas.
Se centrifugaron estos tubos a 926 x g/ 5 minutos/ temperatura ambiente para
colectar las células.
Se puso a hervir el DNA de esperma de salmón. Se resuspendió en 20 mL de
agua estéril para cada tubo y se centrifugó nuevamente a 926 x g /5 minutos, a
temperatura ambiente. Se resuspendió en 5 mL de TEL (acetato de litio 1200 µL,
Tris HCl 1M, pH 7.5 120 µL, EDTA 0.5M, pH 8 24 µL, agua 10.65 mL) p/cada tubo
y centrifugó a 926 x g /5 minutos. El pellet de cada tubo se resuspendió en 0.5 mL
DESARROLLO DE UNA CEPA DE
Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

de TEL y se juntó en un tubo eppendorf de 1.5 mL y se centrifugó a 20160 x g /30
segundos.
Se resuspendieron las células en 200 µL de TEL. En tres tubos de 1.5 mL se
colocaron 50 µL de la suspensión de células en cada uno y se agregó:
a. 10 µL de DNA acarreador (DNA de esperma de salmón hervido por 5
minutos y después en baño de hielo por otros 5 minutos).
b. 1 µg de producto de PCR.
Se mezcló suavemente con pipeta. Se adicionaron 300 µL de PLATE al 45% (2.25
mL PEG al 45%, acetato de litio 250 µL, Tris HCl 1M, pH 7.5 25 µL, EDTA 0.5 M,
pH 8 5 µL) recién preparado.
Se incubó a 30°C con agitación de 250 rpm durante 30 minutos, se puso un baño
de agua a 42°C. Se sometió a un choque térmico por 15 minutos a 42°C,
invirtiendo los tubos cada 3 minutos. Se centrifugaron las células a 20160 x g/ 30
segundos y se eliminó el sobrenadante. Después de centrifugar y eliminar el
sobrenadante se resuspendió en 200 µL de YPD para plaquear en las cajas de
YPD. Se plaqueó en medio YPD con antibiótico 200 µg/mL. Se incubó a 30°C por
6 días.
Los reactivos TEL y PLATE se prepararon el mismo día de la transformación y se
esterilizaron por filtración en un filtro de poro 0.22 µm millipore, almacenando en
tubos Falcon estériles (Gietz D.R. and Woods A.R., 2002).

DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
8.1 FERMENTACIONES (WT, Mig1∆ geneticina Y Mig2∆ geneticina).
Las tres fermentaciones consistieron en las siguientes concentraciones y
combinaciones de azúcares para cada microorganismo en estudio (Tabla 2).
Tabla 2. Concentración y tipo de azúcar en cada fermentación para las cepas de estudio y
cantidad de células inoculadas.

Azúcar
[azúcar]
g/100
mL
Fermentación 1*
[Microorganismo]
células/250 mL
Fermentación 2*
[Microorganismo]
células/250 mL
Fermentación 3*
[Microorganismo]
células/250 mL

Glucosa
2 WT Mig1∆ geneticina Mig2 ∆geneticina
104células 3.4 X105 células 4.1 X106 células
10 WT Mig1∆ geneticina Mig 2 ∆geneticina
104células 3.4 X105 células 4.1 X106 células

Sacarosa
2 Mig1∆ geneticina Mig2∆ geneticina WT
104 células 2.7 X105 células 4.1 X106 células
10 Mig1∆ geneticina Mig2∆ geneticina WT
104células 2.7 X105 células 4.1 X106 células

Sacarosa-
Glucosa
2 Mig2∆Geneticina WT Mig1∆ geneticina
104celulas 3.8X105 células 4.1 X106 células
10 Mig2∆Geneticina WT Mig1∆ geneticina
104células 3.8X105 células 4.1 X106 células
*Cada fermentación se realizó en una sola replica.
Para la inoculación se realizó un conteo y se observaron células puras,
permitiendo así continuar con la preparación del inóculo (Fig. 10)

DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

CONSUMO DE AZÚCARES
Los resultados para consumo de azúcares para las cepas de estudio WT, Mig1∆
geneticina y Mig2∆ geneticina las cuales fueron cultivadas por lote de forma
aerobia, a concentraciones de 2% G, 2% S y 2% S/G y 10% G, 10% S y 10% S/G
como se presenta en la Tabla 2, son los siguientes:
Fermentación a 2% Glucosa y 10% Glucosa
El comportamiento de estos microorganismos (WT, Mig1∆ geneticina y Mig2∆
geneticina) respectivamente fue de manera similar en cuanto al consumo de este
monosacárido (glucosa), se observa un descenso casi paralelo entre las 3 cepas,
solo varían en la concentración inicial de glucosa (Fig. 11a.). Se observaron
variaciones en cuanto a tiempos por la cantidad de inóculo añadido en la
fermentación 2 (3.4 X105 células) y 3(4.1 X106 células), donde fue mayor con
respecto a la fermentación 1(104células) (ver Tabla 2), teniendo así más células
para consumir sustrato. Mig1∆ geneticina y Mig2∆ geneticina consumieron el
sustrato al día 3 con una velocidad de consumo inicial (primeros 3 días) de 0.79
g/100 mL * día y 1.03 g/100 mL * día (Tabla 3), respectivamente. En contraste con
WT la cual se prolonga hasta el día 14 con una velocidad inicial de 0.81 g/100 mL
* día, velocidad que disminuye después del día 4 (Fig. 11a), posiblemente esta
prolongación se debe a que esta fermentación con WT tenía mayor cantidad de
sustrato inicial y menor cantidad de células en la inoculación (ya que únicamente
se deseaba observar el consumo general de estos azúcares).
Fig. 10. Conteo celular de S.
cerevisiae, en una cámara de
Neubauer, observadas a través
del objetivo 100X de un
microscopio Carl Zeiss y teñidas
con cristal violeta.
en la cámara de Neubauer (100X)

DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

En el caso del tubo de fermentación al 10% G se observa que la cepa de levadura
WT y Mig1∆ geneticina tienen un descenso muy similar, prolongando el termino de
consumo de sustrato hasta el día 13-14, con una velocidad de consumo de 1.08
g/100 mL * día y 2.02 g/100 mL * día respectivamente (Tabla 3), mientras que la
cepa de levadura Mig2∆ geneticina resulta terminar en el día 4 (Fig. 11b) con una
velocidad de consumo de 3.38 g/100 mL * día, este comportamiento puede
deberse a que, como se mencionó anteriormente, la concentración inicial de
sustrato y de inóculo varia un poco entre las 3 fermentaciones, ya que lo que se
busca es ver el comportamiento de consumo de azúcares de estas levaduras bajo
estas condiciones. Posibilitando observar un evidente descenso para Mig2∆
geneticina y sumado a lo anterior se puede hipotéticamente decir que a 10% G
además de activarse distintos genes para la detección y el trasporte de este
azúcar, la ausencia de MIG2 pudo haber repercutido en algún gen involucrado
directamente en el consumo de este monosacárido (hasta la fecha no existen
estudios que indiquen en qué otros genes repercute su ausencia y de qué forma) ,
lo cual ayuda a que en menor tiempo se lleve a cabo su metabolización. Esta
fermentación permitió observar el comportamiento control de las cepas WT, Mig1∆
geneticina y Mig2∆ geneticina.
Fermentación a 2% Sacarosa y 10% Sacarosa
Para el caso de la fermentación con sacarosa se observó un comportamiento casi
paralelo donde WT y Mig1∆ geneticina terminan de fermentar en el día 3
aproximadamente a una velocidad de consumo inicial de 1.07 g/100 mL * día y
0.72 g/100 mL * día respectivamente , mientras que Mig2∆ geneticina prolonga su
fermentación hasta el día 7 (Fig. 12a) a 0.58 g/100 mL * día , esto para 2% y en el
caso de 10% ocurre de manera similar en WT y Mig1∆ geneticina terminan la
fermentación al día 4 con velocidades de consumo de 5.06 g/100 mL * día y 2.78
g/100 mL * día respectivamente (Tabla 3) . Mientras que Mig2∆ geneticina termina
el consumo de este disacárido al día 9 aproximadamente (Fig. 12b) con velocidad
inicial de consumo de 1.58 g/100 mL * día. Las variaciones en cuanto a tiempos se
pueden deber a lo mencionado anteriormente (concentración de sacarosa inicial
DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

y/o concentración de inóculo inicial), también es importante mencionar que
únicamente se tuvo control de la temperatura de la fermentación (28°C), mientras
que el pH, aireación, agitación no existe un control, lo cual puede afectar en
cuanto al consumo de azúcar y ruta metabólica (formación de biomasa o etanol).
En general se puede observar que las cepas WT y Mig1∆ geneticina tiene un
consumo similar de este azúcar (sacarosa), lo anterior se debe a que la ausencia
del gen MIG1 no tiene un impacto notorio en el consumo, ya que se encuentra en
una sola fuente de carbono y WT se adapta a este sustrato activando genes que le
permitan consumirla como principal fuente de carbono, sin ningún tipo de
represión por presencia
de glucosa, debido a esto se puede observar un
comportamiento muy similar. Se observa que Mig2∆ geneticina en ambas
concentraciones de azúcar (sacarosa) tarda más que WT y Mig1∆ geneticina, se
puede pensar que al no tener el gen MIG2 este pudiera estar afectando algún
sistema de regulación lo que retrasa el consumo de este azúcar, esta es
únicamente una posible explicación pero hace falta tener más información para
afirmarlo, ya que hasta el momento la investigación sobre este gen MIG2 es poca.
En esta fuente de carbono la cepa con mejores velocidades de consumo resulta
ser WT, comportamiento posiblemente debido a que su sistema de regulación en
el consumo de azúcares se adapta muy bien a la fuente de carbono del medio, en
este caso sacarosa, que a pesar de no ser un azúcar preferido por este
microorganismo se ve obligado a consumirlo, mostrando una buena eficiencia de
consumo. Mig1∆ geneticina mostró una velocidad intermedia (2.78 g/100 mL * día)
entre WT y Mig2∆ geneticina, resultado posiblemente debido a que la mutación
pudiera repercutir en alguna función de regulación para lo cual hacen falta
estudios que confirmen que la mutación puede repercutir en otros genes.
Fermentación a 2% Sacarosa-Glucosa y 10% Sacarosa-Glucosa
Para la mezcla glucosa-sacarosa se observó que en 2%, la cepa WT tardó
alrededor de 7 días en hidrolizar y consumir la sacarosa del medio (Fig.13a) a una
velocidad de consumo de 0.29 g de sacarosa/100 mL * día y 0.26 g de
glucosa/100 mL * día, se observa que la cepa sin el gen MIG1, Mig1∆ geneticina
DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

desde el día 1 tiene un descenso considerable en el consumo de sacarosa (Fig.
13b), reflejado en la velocidad de consumo de este disacárido y monosacárido con
1.28 g de sacarosa/100 mL * día y 0.47 g de glucosa/100 mL * día, la cual fue la
mayor en ambos casos para sacarosa y glucosa con respecto a los otros 2
microorganismos. Mig2∆ geneticina también tiene un descenso considerable (Fig.
13c), con una velocidad intermedia de 0.43 g de sacarosa/100 mL * día, con
respecto a Mig1∆ geneticina y WT. El consumo de este disacárido para Mig2∆
geneticina no es tanto como en Mig1∆ geneticina pero si mayor con respecto a
WT, esto debido a que en estudios se ha observado que el gen MIG2 no tiene
tanta influencia en la represión de SUC como MIG1 (Klein et al., 1999).

DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

Tabla 3. Velocidades de consumo de azúcares para cada microorganismo WT, Mig1∆
geneticina y Mig2∆ geneticina.

Azúcar

Microorganismo
Velocidad de
consumo
(g/100 mL * día)

2% Glucosa
WT 0.81
Mig1∆ geneticina 0.79
Mig2∆ geneticina 1.03

10% Glucosa
WT 1.08
Mig1∆ geneticina 2.02
Mig2∆ geneticina 3.28

2% Sacarosa
WT 1.70
Mig1∆ geneticina 0.72
Mig2∆ geneticina 0.58

10% Sacarosa
WT 5.06
Mig1∆ geneticina 2.78
Mig2∆ geneticina 1.58

2% SG

WT
Sacarosa Glucosa
0.29 0.26

Mig1∆ geneticina
Sacarosa Glucosa
1.28 0.47

Mig2∆ geneticina
Sacarosa Glucosa
0.43 0.22

10% SG

WT
Sacarosa Glucosa
0.24 2.55

Mig1∆ geneticina
Sacarosa Glucosa
2.55 0.50

Mig2∆ geneticina
Sacarosa Glucosa
1.15 0.73

DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

Fig. 11. Consumo de glucosa en cultivos por lote bajo condiciones estáticas, a) glucosa
inicial alrededor de 2% y b) glucosa inicial alrededor de 10% para las cepas, (♦) WT, (■)
Mig1∆ geneticina y (▲) Mig2∆ geneticina, representadas gráficamente en función del
tiempo.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
0 2 4 6 8 10 12 14
%
G
lu
c
o
s
a
(
g
/1
0
0
m
L
)
Tiempo (días)
a)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2 4 6 8 10 12 14
%
G
lu
c
o
s
a
(
g
/1
0
0
m
L
)
Tiempo (días)
b)
DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

Fig. 12. Consumo de sacarosa en cultivos por lote bajo condiciones estáticas, a) sacarosa
inicial alrededor de 2% y b) sacarosa inicial alrededor de 10% para las cepas, (♦) WT, (■)
Mig1∆ geneticina y (▲) Mig2∆ geneticina, representadas gráficamente en función del
tiempo.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 2 4 6 8 10 12 14
%
S
a
c
a
ro
s
a
(
g
/1
0
0
m
L
)
Tiempo (días)
a)
0
2
4
6
8
10
12
14
0 2 4 6 8 10 12 14
%
S
a
c
a
ro
s
a
(
g
/1
0
0
m
L
)
Tiempo (días)
b)
DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

A una concentración de 2% p/v de la mezcla S-G no se pudo cuantificar fructosa,
ya que no hubo un incremento de fructosa que fuera detectable por el quipo HPLC
(Fig. 13), este comportamiento probablemente es debido a la hidrólisis de
sacarosa, esto es porque al momento de hidrolizarla y tener glucosa y fructosa en
el medio, esta es consumida al mismo tiempo que es hidrolizada, lo que no da
lugar a observar un incremento de glucosa y fructosa, comportamiento muy similar
a los experimentos de Klein et al., 1999. Se puede apreciar que el consumo de
este par de azúcares es casi paralelo en la cepa WT y su consumo casi total de
sacarosa es en el día 9. En el caso de Mig1∆ geneticina el descenso más evidente
de consumo es de sacarosa, disminuyendo su concentración a menos de 0.2 %
(g/100 mL) en el día 2, este comportamiento se puede atribuir a que en ausencia
del gen MIG1 se esta sintetizando invertasa que permite el consumo de sacarosas
no solo a la par de glucosa sino que en mayor proporción. Para la cepa Mig2∆
geneticina se observa un descenso casi paralelo como en el caso de WT en los
primeros tiempos, hasta el día 3 comienza un descenso mayor casi
empalmándose las líneas de consumo de ambos azúcares y en el día 4 termina el
consumo de ambos azúcares, este comportamiento es muy similar para la cepa
con ausencia de MIG1, mayor para Mig1∆ geneticina, aún así refleja la homología
que tienen entre si.
Para la concentración de 10% sacarosa-glucosa (S-G) en relación equimolar
ocurre un comportamiento similar al mencionado para 2% sacarosa-glucosa, solo
difiere en que para Mig1∆ geneticina se observa un incremento de glucosa (Fig.
14), ya que a estas concentraciones la célula no es capaz de metabolizar tanta
glucosa producto de la hidrólisis, se observa un aumento de este azúcar a lo largo
de la fermentación (Klein et al. 1999), al día 2 la concentración de sacarosa
disminuye al 1% aproximadamente a una velocidad del 2.55 g de sacarosa/100
mL * día la cual resultó ser la mayor de las velocidades con respecto a los otros
microorganismos (Tabla 3); al día 4 la consume casi en su totalidad la sacarosa, lo
que refleja esa eficiencia en el consumo de este disacárido a pesar de la
presencia de glucosa. La cepa de levadura Mig2∆ geneticina no refleja este
incremento de glucosa por la hidrólisis, debido a que la ausencia del gen MIG2 no
DESARROLLO DE UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae CAPAZ DE
CO-FERMENTAR GLUCOSA Y SACAROSA

tiene tanto impacto como MIG1, su comportamiento es casi paralelo en el
consumo de ambos azúcares (Fig. 14) con velocidades de consumo en los
primeros días de 1.15 g de sacarosa/100 mL * día y 0.73 g de glucosa/100 mL *
día, lo que refleja un consumo co-fermentativo, consumiendo en su totalidad
ambos azúcares en el día 9 aproximadamente. La cepa control WT se comporta
de forma más adaptativa, es decir el consumo de glucosa es evidente en los
primeros tiempos con una velocidad de consumo de 2.55 g de glucosa/100 mL *
día, siendo la velocidad más alta de consumo de glucosa con respecto a los otros
2 microorganismos; el descenso de sacarosa es casi

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