Despliegue-en-fagos-de-variantes-del-amino-terminal-de-la-toxina-CSS2

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas 
 
 
 
“Despliegue en fagos de variantes del amino terminal de la toxina Css2” 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
Maestro en Ciencias 
 
 
Presenta: 
Q.F.B. Mónica García Montelongo 
 
 
Tutor: Dr. Ernesto Ortiz Suri 
(Instituto de Biotecnología, UNAM) 
 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR 
Dr. Gerardo Corzo Burguette (Instituto de Biotecnología, UNAM) 
Dra. Claudia Lydia Treviño Santa Cruz (Instituto de Biotecnología, UNAM) 
 
TUTOR INVITADO: 
Dra. Lidia Riaño Umbarila (Instituto de Biotecnología, UNAM) 
 
 
Cuernavaca, Morelos. Junio, 2015 
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UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Este trabajo se realizó bajo la dirección del Dr. Ernesto Ortiz Suri, en el laboratorio 
del Dr. Baltazar Becerril Luján dentro del Departamento de Medicina Molecular y 
Bioprocesos del Instituto de Biotecnología, UNAM. 
Durante la realización de este trabajo se contó con la beca de maestría otorgada 
por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) No. De apoyo 355983 
 
AGRADECIMIENTOS 
Al Dr. Baltazar Becerril, por permitirme formar parte de su grupo y apoyarme con 
sus valiosos consejos. 
Al Dr. Gerardo Corzo, por apoyarme durante la realización de este proyecto. La 
palabra “gracias” se queda corta para expresar mi gratitud para terminar mi 
posgrado. Gracias por sus valiosos aportes a este proyecto. 
A la Dra. Lidia Riaño, por sus valiosos consejos y gran paciencia, por sus 
conocimientos sobre despliegue en fagos. Por su gran comprensión y por escuchar 
mis problemas ayudándome a buscar siempre una solución, mil gracias. 
Al Dr. Lourival Possani, por ser un gran ejemplo a seguir. 
Gracias a mi comité tutoral, Dr. Gerardo Corzo B., Dra. Claudia L. Treviño, Dra. Lidia 
Riaño U., por las valiosas aportaciones a este trabajo. 
Agradezco a mi jurado de tesis, Dra. María Martha Pedraza E., Dr. Ignacio López 
G., Dra. Vera L. Petricevi L., Dra. Lidia González M., Dra. Yvonne J. Rosenstein A., 
por los comentarios y consejos oportunos. 
A la Dra. Rita Restano Cassulini, por realizar los experimentos de electrofisiología 
mostrados en este trabajo, así como también brindarme su apoyo y comprensión, 
además de su valioso tiempo. 
A la Dra. María J. Jiménez, por aportar su conocimiento, tiempo y dedicación a la 
elaboración de este proyecto. Muchas gracias Mari, eres una gran persona, te 
aprecio bastante, y admiro tu fortaleza ante todo, nunca cambies. 
Gracias a los integrantes Possani/Becerril/Corzo, quienes me acompañaron en esta 
aventura: Nachito, Rosby, Tere, Leo, Jimena, Guille, Rodrigo, Ilse, Ever, Timo, 
Chano, Oscar, Miriam L., Carmen, Linda, Polo, Vero, Fredy, Gina E, Gerardo, 
Fernando, Rosalba, Jonathan, Ivette… Gracias a todos ustedes por este tiempo 
compartido. 
 
Agradecimientos técnicos 
Bioterio: MVZ Graciela Cabeza Parez y al Sr. Sergio González T. 
Unidad de Síntesis: Q.I. Santiago Becerra Ramírez 
Unidad de secuenciación: M.B. Timoteo Olamendi Portugal 
MS: Dr. Fernando Zamudio 
 
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AGRADECIMIENTOS 
A mis padres: Mamá, tú quien con enorme paciencia me enseñaste a amar, 
comprender, perdonar, a ser valiente y muchas cosas más. Tu que con tu ejemplo 
me muestras que si se puede, y nunca hay que rendirse. A ti quien has dedicado tu 
vida a criarnos a mí y a mis hermanos, que a pesar de todos nuestros errores nos 
amas como nadie en el mundo. Por tus regaños que enderezaron mi camino y 
gracias a ella estoy aquí... Mil gracias mamá. 
Papá, la persona más trabajadora que conozco, que me demuestras que siempre 
se puede hacer más. Porque al igual que mi madre has sacrificado muchas cosas 
para darnos los mejor, porque a pesar de estar cansado, logras sacar fuerzas para 
mantener a toda nuestra familia. Tú, quien me enseñas todos los días a aspirar por 
algo mejor, y nunca conformarme, gracias por inspirarme a ser mejor cada día… 
Gracias a ustedes he logrado tantas cosas, y siempre luchare para que se sientan 
orgullosos de mí. Los amo… 
A mis hermanos, mis amigos de toda la vida, quienes me acompañan siempre y a 
quienes adoro con todo mí ser. Ana, mi hermana hermosa, que sabe hacerme reír, 
que compartimos tanto y quien me entiende mejor que nadie, porque ella es mi 
amiga y siempre estaré a su lado. Chuy, mi compañero de peleas infantiles, porque 
gracias a él aprendí a ser paciente, a gritar, a llorar, pero también a no tener miedo 
a tantas cosas. Y finalmente David, mi pequeño, quien amo con todo mi corazón y 
siempre será mi hermanito, a quien siempre le daré apoyo y comprensión sin 
importar lo que pase. 
A toda mi hermosa familia, en especial a quien siempre tengo presente además de 
mis padres y hermanos: Abuelita, Tía Ana, saben ambas que las quiero con todo mi 
corazón. 
Gracias Sebastián, por soportar este tiempo de transición, por aprender a mi lado 
nuevas cosas, por ser mi apoyo en momentos difíciles, por la paciencia infinita, por 
eso y mil cosas más, un gracias no será suficiente… 
Al Dr. Ernesto Ortiz, mi asesor, que a pesar de todo llegamos hasta el final. Gracias 
Erne, por enseñarme tantas cosas nuevas y prepararme para enfrentar nuevos 
retos, por enseñarme que cuando la gratitud no es expresada con hechos y actitud, 
no sirve a nadie. Actitud ante todo… 
A mis amigos tanto nuevos como viejos, quienes escucharon mis problemas y me 
brindaron su apoyo ante todo: Guty, Raúl, Nachito, Lucerito, Kike, Víctor, Rigo, 
Jesús, Tere, Rosby, Jime, Juan, Guille, Helena, Leo. Gracias por todo. 
A mi amiga de toda la vida, Alicia… gracias por tu apoyo, locuras, por la simpleza 
con que vez las cosas, por enseñarme a no temer a lo nuevo, por demostrarme que 
sin importar que digan los demás siempre debes creer en ti mismo. Gracias 
hermana… 
 
 
 
ÍNDICE 
1.- INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1 
1.1.- Canales de sodio dependientes de voltaje .................................................. 3 
1.2.- Generalidades de las toxinas de sodio de alacrán ....................................... 4 
1.3.- Toxina 2 de Centruroides suffusus (Css2) ................................................... 5 
1.4.- Tecnología de despliegue en fagos ............................................................. 7 
2.- ANTECEDENTES ............................................................................................ 10 
3.- OBJETIVOS ..................................................................................................... 12 
4.- HIPÓTESIS ...................................................................................................... 13 
5.- MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 14 
5.1.- Soluciones y medios de cultivo .................................................................. 14 
5.2.- Cepas y vectores ....................................................................................... 15 
E. coli XL1-Blue ..............................................................................................15 
E. coli DH5α .................................................................................................... 15 
pBluescript II KS+ ........................................................................................... 17 
pSyn2.............................................................................................................. 18 
pET -22 b ........................................................................................................ 19 
5.3.- Preparación de células electrocompetentes protocolo BIORAD ................ 20 
5.4.- Obtención del gen de la toxina nativa en el vector pSyn2 ......................... 21 
5.5.- Construcción del banco de variantes de Css2 para despliegue en fagos .. 23 
5.6.- Preparación de fago ayudante ................................................................... 24 
5.7.- Estrategia para el tamizado de fagos ......................................................... 24 
5.8.- Recuperación del banco de fago-toxinas/anticuerpos ............................... 25 
5.9.- Tamizado en células HEK293 que expresan el canal de sodio hNav 1.6 .. 27 
5.10.- Diluciones para el título de fagos de salida del tamizado ........................ 29 
5.11.- Selección de clonas ................................................................................. 30 
5.12.- Expresión y purificación de las variantes y la rCss2 (Toxina Css2 
recombinante) .................................................................................................... 31 
5.12.1.- Expresión de la toxina Css2 en Escherichia coli cepa BL21 (DE3) ... 31 
5.12.2.- Protocolo de HPLC ............................................................................ 33 
5.13.- Ensayo de reconocimiento por ELISA ..................................................... 34 
 
5.14.- Electrofisiología ........................................................................................ 35 
5.14.1.- Cultivo celular .................................................................................... 35 
5.14.2.- Soluciones ......................................................................................... 35 
5.14.3.- Whole-Cell Patch Clamp .................................................................... 35 
6.- RESULTADOS ................................................................................................. 37 
6.1.- Preparación de células electrocompetentes BIORAD ................................ 37 
6.2.- Amplificación del gen de la toxina Css2 ..................................................... 38 
6.3.- Clonación de la toxina Css2 nativa en el vector pBluescript II KS(+) ......... 39 
6.4.- Secuenciación del DNA plasmídico ........................................................... 40 
6.5.- Subclonación de la toxina Css2 nativa en el vector de para despliegue en 
fagos pSyn2 ....................................................................................................... 42 
6.6.- Mutagénesis de la toxina Css2 nativa ........................................................ 43 
6.7.- Título de fago ayudante, fago-anticuerpo, fago-toxina nativa y fago-toxina 
mutante .............................................................................................................. 45 
6.8.- Estandarización del tamizado de fago-toxinas ........................................... 46 
6.9.- Tamizado de las variantes de la toxina Css2 ............................................. 47 
6.10.- Secuenciación de las variantes obtenidas en los tamizados ................... 48 
6.11.- Expresión de la toxina Css2 nativa recombinante (rCss2) ....................... 50 
6.11.1.- Ligación del péptido rCss2 al vector de expresión pET-22b(+) ......... 50 
6.11.2.- Prueba de inducción con diferentes medios de cultivo ...................... 51 
6.11.3.- Expresión de la rCss2 en dos medios de cultivo distintos: YT2X y TB
 ........................................................................................................................ 52 
6.11.4.- Pruebas biológicas de toxicidad de la toxina rCss2 ........................... 55 
6.11.5.- Ensayo de reconocimiento por ELISA ............................................... 56 
6.11.6.- Estudios de electrofisiología de la toxina rCss2................................. 57 
6.12.- Variantes NHM y DHV ............................................................................. 58 
6.12.1.- Estudios de electrofisiología de las variantes NHM y DHV ................ 62 
7.- DISCUSIÓN ..................................................................................................... 65 
8.- CONCLUSIONES ............................................................................................ 70 
9.- PERSPECTIVAS .............................................................................................. 72 
BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................... 73 
 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
Figura 1. Distribución de especies de importancia médica del género 
Centruroides. ........................................................................................................... 2 
Figura 2. Representación esquemática de las subunidades de los canales de 
sodio. ....................................................................................................................... 4 
Figura 3. Toxina Css2, estructura tridimensional. ............................................. 5 
Figura 4. Alineamientos entre las secuencias de Cn2 y Css2. Clustal X .......... 6 
Figura 5. Esquema del despliegue de bancos de péptidos en fagos. ............... 8 
Figura 6. Vector de clonación pBluescript KS+ ............................................... 17 
Figura 7. Vector de despliegue en fagos pSyn2 ............................................. 18 
Figura 8. Vector de expresión pET -22B(+) .................................................... 19 
Figura 9. Protocolo de despliegue en fagos.................................................... 28 
Figura 10. Esquema de diluciones para la titulación de los fagos de salida del 
tamizado de fagos en células completas. .............................................................. 29 
Figura 11. Construcción de la toxina recombinante Css2. .............................. 31 
Figura 12. Gel de electroforesis del producto de PCR de la toxina nativa. .... 38 
Figura 13. Gel de agarosa al 1% con el producto de PCR de colonia usando los 
oligos T7-like y T3-like. .......................................................................................... 39 
Figura 14. Secuencias del inserto de la clona tres: Css2 nativa-pBluescript II 
KS(+). .................................................................................................................... 40 
Figura 15. Secuencia del inserto de la clona cuatro: Css2 nativa-pBluescript II 
KS(+). .................................................................................................................... 41 
Figura 16. Inserto del gen de la toxina en el vector pSyn2. ............................ 42 
Figura 17. PCR mutagénico, usando el oligo Pv_Css2. ................................. 43 
Figura 18. Comparación de la secuencia nativa de Css2 con las clonas 
mutagénicas .......................................................................................................... 44 
Figura 19. Inserto PelB/SfiI/Css2/NotI/6XHis .................................................. 50 
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file:///C:/Users/mOniiCa/Dropbox/TESIS/Tesis%20Monica%20JUNIO.docx%23_Toc421823821
file:///C:/Users/mOniiCa/Dropbox/TESIS/Tesis%20Monica%20JUNIO.docx%23_Toc421823825
file:///C:/Users/mOniiCa/Dropbox/TESIS/Tesis%20Monica%20JUNIO.docx%23_Toc421823825
file:///C:/Users/mOniiCa/Dropbox/TESIS/Tesis%20Monica%20JUNIO.docx%23_Toc421823827file:///C:/Users/mOniiCa/Dropbox/TESIS/Tesis%20Monica%20JUNIO.docx%23_Toc421823828
file:///C:/Users/mOniiCa/Dropbox/TESIS/Tesis%20Monica%20JUNIO.docx%23_Toc421823830
 
Figura 20. Prueba de inducción a diferentes temperaturas. ........................... 51 
Figura 21. Expresión y purificación de la proteína de fusión........................... 52 
Figura 22. Purificación del péptido rCss2. Medio TB. ..................................... 53 
Figura 23. Purificación del péptido rCss2. Medio YT2X. ................................. 53 
Figura 24. Purificación del péptido rCss2 por HPLC. ...................................... 54 
Figura 25. Ensayo de reconocimiento por ELISA de la rCss2, NHM y VDH ... 56 
Figura 26. La adición de las fracciones 11.98 y 13.3 de la toxina rCss2 reducen 
la amplitud de la corriente de sodio y recorren el umbral de activación de la curva 
corriente voltaje del canal hNav1.6 expresado en las células HEK293. ................ 57 
Figura 27. Expresión y purificación de las proteínas de fusión, del banco de 
variantes de la toxina Css2. .................................................................................. 58 
Figura 28. Purificación de los péptidos NHM y DHV ....................................... 59 
Figura 29. Cromatogramas clonas NHM y DHV ............................................. 60 
Figura 30.Prueba de la actividad de la variante NHM a una concentración de 1 
µM ......................................................................................................................... 62 
Figura 31.La variante DHV no presentó actividad sobre el canal de sodio hNav 
1.6 a una concentración de 1 µM. Gráfica I/V. ...................................................... 63 
Figura 32. Ensayo de competencia usando DHV y rCss2, comparación entre 
ambas toxinas a una concentración de 5 µM y 1 µM, respectivamente. Gráfica I/V.
 .............................................................................................................................. 63 
Figura 33. La variante DHV a una concentración de 5 µM mostró actividad sobre 
el canal de sodio hNav 1.6. Gráfica I/V ................................................................. 64 
 
 
file:///C:/Users/mOniiCa/Dropbox/TESIS/Tesis%20Monica%20JUNIO.docx%23_Toc421823831
 
SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS 
°C Grados centígrados 
µg Microgramos 
µL Microlitros 
µM Micromolar 
Amp Ampicilina 
BSA Albumina de suero bovino (Bovine serum albumin) 
Ca2+ Calcio 
CaCl2 Cloruro de calcio 
Cl- Cloro 
Cm Centímetros 
CsCl Cloruro de Cesio 
CsF Fluoruro de Cesio 
CsOH Hidróxido de Cesio 
Da Daltones 
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium 
DNA Acido desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic acid) 
dNTP’s Desoxinucleótido trifosfato 
DO Densidad óptica 
E. coli Escherichia coli 
EDTA Ácido etildiaminotetraacético 
EGTA Ácido etilenglicol-bis (2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetraacético 
Fw Iniciador hacia adelante (Forward) 
g Gramos 
HCl Ácido clorhídrico 
HEK Human Embryo Kidney cells 
HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico 
HPLC Cromatografía líquida de alta eficacia, en ingles High Performance Liquid 
Chromatography 
IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido 
K+ Potasio 
K2HPO4 Fosfato de potasio dibásico 
Kan Kanamicina 
KCl Cloruro de potasio 
kDa Kilodaltones 
KH2PO4 Fosfato de potasio monobásico 
L Litros 
 
LB Caldo Luria (Luria Broth) 
M Molar 
MgCl2 Cloruro de magnesio 
mL Mililitros 
mM milímetros 
mM Milimolar 
MΩ Megaohmio 
Na+ Catión sodio 
NaCl Cloruro de sodio 
NaOH Hidróxido de sodio 
Nav Voltage-gated Sodium Channels 
Nm Nanómetros 
pb Pares de bases 
PBS Tampón fosfato salino 
PCR Reacción en cadena de la polimerasa 
PEG Polietilenglicol 
pH Potencial de Hidrogeno 
PPB Tampón de extracción periplásmica (Periplasmic extraction buffer) 
rpm Revoluciones por minuto 
Rv Iniciador reverso (Reverse) 
SDS Dodecilsulfato sódico 
SOB Super Optimal Broth 
SOC SOB suplementado con glucosa (Super Optimal broth with Catabolite repression) 
TBST Tampón salino Tris-Tween 20 (Tris-Buffered Saline and Tween 20) 
X-gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido 
 
 
http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3031-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-protocol
http://en.wikipedia.org/wiki/Catabolite_repression
 
RESUMEN 
Centruroides suffusus es una de las pocas especies de escorpiones mexicanos 
peligrosos para el ser humano. Css2 es la neurotoxina más toxica del veneno de C. 
suffusus, la cual es específica para el canal de sodio dependiente de voltaje Nav 
1.6. Otras toxinas de escorpiones del mismo género comparten un alto grado de 
similitud con la toxina Css2. A pesar de que comparten el mismo andamiaje 
estructural y tienen secuencias altamente homólogas, difieren en su especificidad y 
afinidad hacia los diferentes canales de sodio de mamíferos. En un alineamiento de 
secuencias de estas toxinas, se observan dos regiones variables: el carboxilo 
terminal y una región de 3 aminoácidos cerca del amino terminal. El carboxilo 
terminal ya ha sido estudiado, y con unos cuantos cambios se modificó parcialmente 
la actividad de está toxina sobre el canal de sodio Nav 1.6, mejorando la afinidad de 
está por el canal (1). El efecto de los cambios en el amino terminal permanece 
inexplorado y ese fue el objetivo de este proyecto. Se propuso una metodología 
para evaluar el efecto de la variabilidad en los 3 aminoácidos del amino terminal, 
buscando así dos tipos de toxinas. Aquellas que presenten mejor afinidad y mejor 
actividad sobre el canal de sodio blanco (Nav 1.6) y que puedan servir como 
herramientas electrofisiológicas, y algunas que tengan alta afinidad pero no 
actividad biológica (anatoxinas) sobre el canal Nav 1.6, que pudieran funcionar 
como inmunógenos para producir antivenenos. Por esta razón se construyó una 
genoteca de fago-toxinas de variantes de la toxina Css2, las cuales cubren todas 
las mutaciones posibles en esas 3 posiciones. De esta manera, se obtuvieron 
variantes de la toxina Css2, mediante la selección de la genoteca de fagos 
(despliegue en fagos) contra células HEK que expresan el canal de sodio Nav 1.6. 
Por esta metodología se consiguieron dos variantes de la toxina, NHM y DHV, las 
cuales se caracterizaron y se observó que ambas presentaron actividad sobre el 
canal de sodio Nav 1.6. A pesar que no se obtuvieron las variantes deseadas, las 
encontradas eran funcionales, por lo que se demostró, que es posible seleccionar 
de manera rápida toxinas activas, usando el despliegue de fagos en células 
completas. 
 
1 
 
1.- INTRODUCCIÓN 
Los alacranes son miembros de uno de los grupos de animales más antiguos en la 
tierra (más de 400 millones de años de evolución), representados ahora por 
aproximadamente 1,500 especies diferentes, las cuales han conservado su 
morfología casi inalterada. Estos pertenecen a la clase Arachnida, Orden 
Scorpionida. Los alacranes peligrosos para los humanos pertenecen a la familia 
Buthidae, que comprende alrededor de 500 especies. Dentro de éstas, los géneros 
Androctonus, Leiurus, Buthus, Buthotus y Heterometrus están localizados en el viejo 
mundo, mayormente en África del Norte, en el Medio Oriente e India. El género 
Parabuthus se ha reportado en el Sur de África, el género Centruroides está 
distribuido en la parte sur de EEUU, México y América Central, y el género Tityus 
en Trinidad y Tobago y Sudamérica, mayoritariamente en Brasil, Venezuela, 
Colombia y Argentina (2). El género Centruroides (Marx, 1930) está representado 
en el territorio mexicano por 33 especies (3), entre las que se encuentran los 
alacranes de mayor toxicidad de Norteamérica, por lo que la amplia distribución 
geográfica y las altas densidades poblacionales de algunas de estas especies las 
convierten en un serio problema médico-sanitario (4). 
México es uno de los países con mayores problemasde salud pública relacionados 
a las picaduras de alacrán (fenómeno denominado “alacranismo”) (5). En los últimos 
años, en México se han reportado más de 250,000 accidentes anuales por picadura 
de alacrán. Por su alta incidencia y morbilidad, el alacranismo constituye un 
problema de salud pública en México (6). Como se puede observar en la Figura 1, 
entre los estados más afectados están Jalisco, Morelos, Guerrero, Nayarit, 
Guanajuato, Michoacán, Puebla, Oaxaca, el Estado de México y Durango (7). En 
Durango y Sinaloa se encuentra una de las especies de alacrán más venenosa de 
México, Centruroides suffusus. Esta es una especie generalista, es decir, se le 
puede encontrar debajo de cualquier superficie que le brinde refugio, se puede 
alimentar de una amplia variedad de presas y tolera una amplia gama de 
condiciones climáticas, motivo por el cual se puede encontrar en asentamientos 
humanos. 
 
2 
 
 
Figura 1. Distribución de especies de importancia médica del género Centruroides. 
(Adaptado de Alagón, 2003) 
 
El interés hacia estos alacranes radica en su importancia médica y en la presencia 
de compuestos biológicos activos en sus glándulas venenosas: enzimas, péptidos, 
nucleótidos, lípidos, mucoproteínas, aminas y otras sustancias (desconocidas). De 
estos compuestos, los mayormente estudiados son los péptidos cuyo blanco son 
los canales iónicos y los receptores de membrana excitables, y que por 
consecuencia son dañinos para diferentes organismos, incluyendo el hombre. Se 
han descrito cuatro familias diferentes de toxinas, las cuales específicamente 
interactúan con canales iónicos: de Na+, de K+, de Cl- y de Ca2+ (2). 
Las toxinas medicamente relevantes de C. suffusus, afectan la permeabilidad de 
iones en las células excitables de mamíferos, en donde su blanco principal son los 
canales de sodio dependientes de voltaje (Nav) (6). 
 
3 
 
De ahí la relevancia de la caracterización bioquímica y biológica de estas toxinas. A 
la fecha, su aislamiento y caracterización se ha reportado por varios grupos, incluido 
el nuestro (8). 
1.1.- Canales de sodio dependientes de voltaje 
Los canales de sodio dependientes de voltaje constituyen una familia de nueve 
canales (Nav 1.1 al Nav 1.9), los cuales se abren por los cambios en la diferencia 
de potencial de la membrana plasmática producidos por estímulos a través de 
neurotransmisores. Estos canales constituyen un complejo formado por una 
subunidad α de alrededor de 260 kDa en asociación con una o más subunidades β 
auxiliares (β1, β2, β3 y/o β4) de 33-36 kDa (Figura 2). El poro acuoso conductor de 
iones está contenido dentro de la subunidad α, al igual que los elementos esenciales 
de la función del canal de sodio (la apertura del canal, la selectividad de iones y la 
rápida inactivación). La subunidad β se requiere para modificar la cinética y la 
dependencia de voltaje de la compuerta (es decir, apertura y cierre) del canal (9). 
La secuencia primaria predice que la subunidad α de los canales de sodio se pliega 
en cuatro dominios (I-IV), que son similares entre sí y contienen seis segmentos α 
hélices transmembranales (S1-S6). En cada uno de los dominios, el sensor de 
voltaje se encuentra en el segmento S4, el cual contiene residuos de aminoácidos 
con carga positiva (lisina y arginina) en una de cada tres posiciones. Un bucle 
reentrante entre las hélices S5 y S6 está incrustado en la región transmembranal 
del canal para formar el filtro selectivo de iones, en el extremo extramembranal del 
poro (9). Se sabe que las β toxinas interactúan con los canales de sodio en el 
dominio II, al final de la hélice formada entre los segmentos S3-S4 (10). 
 
4 
 
 
Figura 2. Representación esquemática de las subunidades de los canales de sodio. 
Los dominios extracelulares de las subunidades β se muestran como pliegues tipo inmunoglobulina, 
que interactúan con los bucles en las subunidades α como se muestra en la figura. Los números 
romanos indican los dominios de la subunidad α; los segmentos 5 y 6 son los segmentos de 
revestimiento del poro y las hélices S4 constituyen los sensores de voltaje. P sitios de fosforilación; 
Ψ, probable sitio N-ligado a glicosilación. (9). 
 
1.2.- Generalidades de las toxinas de sodio de alacrán 
Las toxinas de sodio de alacrán (NaScTx) constituyen una familia de péptidos de 
alrededor de 60-70 residuos de aminoácidos, cuya estructura primaria es 
conservada. La estructura está constituida por un motivo estructural / estabilizado 
por cisteínas (CS-α/β) que consiste en una o dos -hélices cortas unidas por tres o 
cuatro puentes disulfuro a una hoja- plegada de dos o tres hebras (6). 
Las NaScTx alteran el funcionamiento normal de los canales de sodio dependientes 
de voltaje de los músculos y nervios. Entre estas toxinas se han descrito dos grupos 
de acuerdo a las diferencias en sus propiedades farmacológicas y de unión al blanco 
de acción. El primer grupo de las α-toxinas se compone principalmente de toxinas 
que fueron aisladas de alacranes del viejo mundo, estas se unen al dominio 3 de 
 
5 
 
los canales de sodio, retrasando la inactivación del canal. Las otras toxinas que 
corresponden al segundo grupo son las β-toxinas, que se obtuvieron a partir del 
veneno de alacranes del nuevo mundo, éstas modifican el proceso de activación del 
canal de sodio uniéndose al dominio 4 del mismo. Más adelante se describe la 
composición de los canales de sodio dependientes de voltaje (11). 
1.3.- Toxina 2 de Centruroides suffusus (Css2) 
Dentro de las toxinas de importancia médica se encuentra la Css2 (Figura 3), 
aislada de entre otras toxinas del alacrán Centruroides suffusus, que es específica 
para el canal de sodio dependiente de voltaje Nav1.6. Css2 es una neurotoxina tipo 
β, esta toxina se une al sitio 4 del receptor, cuyo efecto al igual que otras β-ScTxs 
del nuevo mundo, es hacer que el canal de sodio dependiente de voltaje se abra a 
potenciales de membrana más negativos, a diferencia de las α-ScTxs del viejo 
mundo, que prolongan el potencial de acción manteniendo los canales abiertos por 
un largo tiempo (2). 
 
Figura 3. Toxina Css2, estructura tridimensional. 
Se observa la hoja formada por tres hebras β, una α 
hélice, y los cuatro puentes disulfuro. (2JLM- Protein Data 
Bank). 
 
Existen otras toxinas específicas para canales de sodio aisladas de venenos de 
otras especies de Centruroides que son de importancia médica, como por ejemplo 
 
6 
 
la Cn2, encontrada en C. noxius Hoffman, Cll2 de C. limpidus, Cii1 de C. infamatus, 
entre otras. Aunque estas toxinas comparten el mismo andamiaje estructural, sus 
secuencias, presentan diferencias en distintas regiones (8). Estos cambios en unas 
pocas posiciones de aminoácidos, consiguen modificar tanto la especificidad como 
la afinidad de cada toxina. Como se observa en la Figura 4, si comparamos la Css2 
con otras toxinas provenientes de alacranes del genero Centruroides, podemos ver 
que existen pocas diferencias entre ellas, a pesar de lo cual, el o los canales de 
sodio dependientes de voltaje blanco sean distintos para cada toxina. Schiavon 
(2012), propuso que los residuos 5, 7, 8 y 9 de las β toxinas, son los principales 
sitios necesarios para asegurar las interacciones óptimas de las toxinas con los 
canales de sodio y de esta manera conseguir desencadenar la respuesta biológica. 
Hay dos regiones de estas toxinas donde se concentra la mayor diferencia de 
secuencia: en el extremo carboxilo terminal y en la región próxima al amino terminal. 
Se han realizado estudios anteriormente para conocer la influencia de mutaciones 
en el carboxilo terminal de la Css2, encontrándose que con unos cuantos cambios 
en esta región se podía cambiar la afinidad de la toxina por el canal (1), pero el 
efecto de mutaciones en la región del amino terminal aún no se ha estudiado y 
constituye el objetivo de este proyecto.Nos centraremos en la mutagénesis de tres 
residuos cercanos al extremo amino terminal en la posición 7,8 y 9. 
 
 
 
Figura 4. Alineamientos entre las secuencias de Cn2 y Css2. Clustal X 
Css2 KEGYLVSKSTGCKYECLKLGDNDYCLRECKQQYGKSSGGYCYAFACWCTHLYEQAVVWPLPNKTCN 
Cn2 KEGYLVDKNTGCKYECLKLGDNDYCLRECKQQYGKGAGGYCYAFACWCTHLYEQAIVWPLPNKRCS 
Css4 KEGYLVNSYTGCKFECFKLGDNDYCLRECRQQYGKGSGGYCYAFGCWCTHLYEQAVVWPLPNKTCN 
Cll2 KEGYLVNHSTGCKYECFKLGDNDYCLRECKQQYGKGAGGYCYAFGCWCNHLYEQAVVWPLPKKTCN 
 ******. ****:**:************:*****.:*******.***.******:*****:* *. 
Nav 1.6 
Nav 1.6 
Nav 1.1, 1.2 
Nav 1.1, 1.2, 1.4 
 
7 
 
1.4.- Tecnología de despliegue en fagos 
En este proyecto se pretende establecer una metodología para el despliegue de 
toxinas en fagos filamentosos. El despliegue en fagos es una herramienta de estudio 
sencilla y versátil en la biología molecular, que permite el estudio de las 
interacciones moleculares entre una proteína y su blanco. Smith (1985) demostró 
que fragmentos de DNA foráneo pueden insertarse en el gen de la proteína III del 
fago filamentoso para crear una proteína de fusión con esta secuencia. La proteína 
de fusión se incorpora dentro del virión, el cual conserva su infectividad y despliega 
los aminoácidos de la secuencia foránea en forma inmunológicamente accesible 
(12). En este caso las variantes de la proteína de interés se expresan 
individualmente como parte de los componentes de la cápside de un fago 
filamentoso mientras que su material genético codificante se encuentra empacado 
dentro del mismo fago. De esta forma hay una liga entre el “fenotipo” del fago y su 
“genotipo”. Mediante procesos de tamizado in vitro se seleccionan los fagos cuyas 
proteínas expresadas cumplan con las restricciones que imponga el sistema de 
tamizado elegido. Un sistema de tamizado común consiste en inmovilizar en la 
pared de inmunotubos al blanco de interacción y ponerlo en contacto con el banco 
desplegado en fagos (despliega las proteínas de interés). Después del período de 
incubación, los fagos que no interaccionan con el ligando se lavan, quedando los 
fagos cuyas proteínas desplegadas mantienen la unión con el ligando. Esos fagos 
son rescatados y se utilizan para infectar nuevas bacterias, de manera tal que el 
grupo saliente de fagos se va enriqueciendo de aquellos que desplieguen las 
proteínas con las propiedades de interacción de interés (Figura 5). 
 
8 
 
 
Figura 5. Esquema del despliegue de bancos de péptidos en fagos. 
 (Modificado de www.springerimages.com) 
Es importante señalar que las condiciones de tamizado se pueden variar para 
conseguir el objetivo deseado. Por ejemplo, si se buscan proteínas que tengan una 
alta afinidad por el blanco se puede reducir la concentración de antígeno en los 
inmunotubos, si se desean interacciones termodinámicamente estables, se puede 
añadir un agente desnaturalizante como el cloruro de guanidinio o subir la 
temperatura. Para blancos complejos, como proteínas expresadas en la membrana 
de células, el tamizado se puede hacer directamente sobre las células (13). El 
despliegue en fagos ha sido una herramienta exitosa para seleccionar anticuerpos 
contra diferentes antígenos [incluyendo toxinas, en nuestro grupo (14)], así como 
péptidos con una determinada especificidad, conformación o función. 
Muy pocos trabajos hablan con éxito acerca de la selección específica de fagos 
sobre la superficie de una célula viva, lo cual propone un reto importante en este 
proyecto, ya que el blanco no se encuentra puro, es decir, la célula HEK, la cual 
además de expresar heterólogamente el canal Nav1.6, tiene en su superficie una 
gran cantidad de otros receptores y proteínas de membrana (15), lo cual dificulta la 
interacción específica de los fagos de interés con el canal. Es por ello, que se 
propuso un método que logrará disminuir la cantidad de fagos inespecíficos, en base 
 
9 
 
al conocimiento que se tiene de los sitios de interacción de las toxinas con los 
canales de sodio (16). 
 
 
10 
 
2.- ANTECEDENTES 
La generación de variantes de toxinas con diferentes especificidades y afinidades 
por los receptores, así como con diferente toxicidad es de interés para nuestro 
grupo, ya que estas variantes pueden constituir herramientas biofísicas para el 
estudio de los canales iónicos y también pueden tener aplicación práctica en la 
producción de antivenenos. 
En el caso de la Css2, la NaScTx más tóxica del alacrán C. suffusus, un trabajo 
previo realizado en nuestro laboratorio (1) permitió conocer la contribución parcial 
de algunas posiciones del carboxilo terminal de esta toxina con respecto a su 
toxicidad. Algunas variantes del carboxilo terminal mejoraron su interacción con el 
canal blanco, pero ninguna llegó a alcanzar valores de afinidad que pudieran 
acercarse a los valores de toxicidad característicos de Cn2. Esto significa que otras 
diferencias en la composición de aminoácidos pudieran ser las responsables de 
estas diferencias entre ambas toxinas. Sobre el amino terminal de la Css2 aún no 
se han realizado estudios y en esta región hay tres aminoácidos diferentes con 
respecto a la Cn2, que podrían explicar la diferencia de toxicidad que existe entre 
estas toxinas. 
Se demostró que mutando la posición E15R (el cual es un cambio único en la 
secuencia de la Css2), se logra obtener como molécula resultante una anatoxina. 
La cual a pesar de lograr unirse al canal blanco, no le otorga actividad biológica. El 
hecho de que anticuerpos policlonales producidos en conejo contra esta variante 
sean capaces de neutralizar a la toxina original (17), convierte a este tipo de 
variantes en potenciales inmunógenos que, al no ser tóxicos, permitirían inyectar 
dosis mayores en los caballos, sin que éstos se vean afectados, facilitando así la 
generación de sueros antialacránicos. 
En el laboratorio, se cuenta con la experiencia para el manejo de bancos de 
proteínas desplegados en fagos. Con esta técnica se ha generado una serie de 
anticuerpos de cadena sencilla capaces de interactuar con Cn2 y Css2 y de 
neutralizarlas (14). Contamos, además, con las herramientas necesarias para hacer 
 
11 
 
electrofisiología sobre células humanas (HEK, human embryonic kidney) que 
expresan de forma heteróloga al canal blanco de Css2, el hNav1.6, para comparar 
la especificidad de las variantes generadas. Estos experimentos nos permitirían 
caracterizar biológicamente a las variantes de Css2. 
 
 
 
12 
 
3.- OBJETIVOS 
Objetivo general 
El objetivo general de este proyecto es la construcción de un banco de variantes del 
amino terminal de la toxina Css2 por despliegue en fagos. 
Objetivos particulares 
Hacer una exploración masiva de todas las variantes posibles en las tres posiciones 
proximales al amino terminal de la Css2 donde radican diferencias con respecto a 
otras toxinas de alacranes del género Centruroides, buscando encontrar algunas 
que: a) tengan mejor afinidad y mejor actividad sobre el canal de sodio blanco 
(Nav1.6) y que puedan servir como herramientas electrofisiológicas, y b) algunas 
que tengan alta afinidad pero no actividad biológica (anatoxinas) sobre el canal 
Nav1.6, que pudieran funcionar como inmunógenos para producir antivenenos. 
Debido a que, el número de variantes que sería necesario analizar es de 203=8x104, 
el cual es inmanejable por las técnicas tradicionales de selección, secuenciación, 
expresión y electrofisiología, proponemos emplear la técnica del despliegue en 
fagos (selección directa en células HEK que expresan el canal de sodio hNav1.6), 
la cual puede manejar y seleccionar clonas relevantes entre miles de millones de 
otras clonas que no son de interés. 
 
 
 
13 
 
4.- HIPÓTESIS 
La secuencia amino-terminal de la toxina Css2 es importante para su función, 
afinidad y/o especificidad. 
Podremos usar la tecnología del despliegue en fagos para seleccionarvariantes de 
Css2 con propiedades bioquímicas de interés. 
 
 
 
 
14 
 
5.- MATERIALES Y MÉTODOS 
5.1.- Soluciones y medios de cultivo 
 
YT2x (Para un litro) 
16 g bacto-triptona, 10 g de extracto de 
levadura, 5 g NaCl, Aforar a un litro y 
ajustar el pH a 7.0 con NaOH 5N. 
Autoclave. 
TB (Para un litro) 
12 g bacto-triptona, 24 g extracto de 
levadura, 4 mL de glicerol, Aforar a 900 
mL. Autoclave. Añadir 100 mL de 
solución estéril de sales de fosfato (23.1 
g KH2PO4, 125.4 g K2HPO4). 
LB (Para un litro) 
10 g bacto-triptona, 5 g extracto de 
levadura, 5 g NaCl, aforar a un litro y 
ajustar el pH a 7.0 con NaOH 5N. 
Autoclave. 
SOC (Para 10.2 mL) 
Nota: Este medio se prepara al 
momento de usarse. 
10 mL de SOB, 2 mL de glucosa 2 M, 
0.1 mL MgCl2 1M. Esterilizar por 
filtración. 
 
SOB (Para un litro) 
5 g bacto-triptona, 20 g de extracto de 
levadura, 0.125 g NaCl, 2.5 mL. Aforar 
a un litro y ajustar el pH a 7.0 con NaOH 
5N. Autoclave. Después añadir 10 mL 
de una solución filtrada de KCL 0.25 M. 
TBE 10X (Para un litro) 
Disolver en 800 mL de agua destilada: 
108 g de Tris-Base y 55 g de Ácido 
bórico. Añadir 40 mL de 0.5 M Na2EDTA 
(pH 8.0), Aforar a un litro con agua 
destilada. Almacenar a temperatura 
ambiente. 
Lisis alcalina 
Solución I (100 mL): 0.9 g dextrosa, 2 mL EDTA 0.5 M pH 8, 1.25 mL Tris 2M pH 
8. Aforar a 100 mL con agua destilada. 
Solución II (10 mL, preparar al momento de usarse): 1 mL SDS 10%, 0.2 mL NaOH 
10 N, aforar a 10 mL con agua destilada. 
Solución III (100 mL): 60 mL de CH3CO2K 5M, 40 mL de ácido acético. 
 
 
15 
 
5.2.- Cepas y vectores 
E. coli XL1-Blue 
 
XL1-Blue Genotipo: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F ́ proAB 
lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)]. 
Esta es una cepa de despliegue ya que puede ser infectada por fagos filamentosos 
y producirlos. Los fagos filamentosos utilizan una estructura bacteriana conocida 
como pilus F para infectar a una bacteria. Cuando la proteína pIII del fago entra en 
contacto con la proteína TolA en los pili bacterianos, el genoma del fago se transfiere 
al citoplasma de la célula bacteriana donde las proteínas residentes convierten el 
genoma de DNA de cadena sencilla a una forma replicativa de doble cadena. Este 
DNA luego sirve como una plantilla para la expresión de los genes del fago. 
E. coli XL1-Blue es una excelente cepa huésped para aplicaciones de clonación de 
rutina utilizando plásmidos. Las células XL1-Blue son deficientes para 
endonucleasa A (endA), lo que mejora en gran medida la calidad del DNA de 
minipreparaciones, y son deficientes en recombinación (recA), lo cual mejora la 
estabilidad de la inserción. 
E. coli DH5α 
Genotipo: F- 80dlacZ∆M15 (lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rK-, mK+) 
phoA supE44 - thi-1 gyrA96 relA1 
E. coli DH5α permite la detección de los plásmidos recombinantes a través de un 
color blanco-azul, esta selección se basa en la actividad de la enzima β-
galactosidasa (lacZ) de E. coli y en la regulación del operón lactosa. La enzima β-
galactosidasa está formada por dos dominios, uno N-terminal pequeño (péptido 
alfa) y otro C-terminal (fragmento omega). Estos dos dominios por separado no 
presentan actividad enzimática, pero al unirse incluso de manera no covalente, se 
reestablece la actividad enzimática, este fenómeno se denomina α-
complementación. Usando vectores que portan el DNA que codifica para la 
 
16 
 
subunidad α de la β-galactosidasa se puede restablecer esta actividad enzimática. 
Cuando células de E. coli que portan la enzima mutada en la subunidad α (lacZ) son 
transformadas con estos plásmidos se restablece la actividad β-galactosidasa y ésta 
puede detectarse usando el sustrato cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-
galactósido (X-gal) que toma una coloración azul intensa cuando es procesado por 
la enzima. Al insertarse un gen de interés en los plásmidos que portan la subunidad 
α, esta secuencia se interrumpe y este fragmento no se expresa más, por tanto las 
colonias transformadas con los plásmidos recombinantes (que portan el gen de 
interés) son de coloración blanca cuando se crecen en medio sólido que contiene 
X-gal e IPTG. Mientras que aquellas clonas no recombinantes serán azules en este 
mismo medio. El isopropiltiogalactósido (IPTG) es una molécula sintética análoga a 
la alolactosa que se une eficientemente al represor del operón lactosa, 
convirtiéndola en un inductor gratuito (que no es degradado por la β-galactosidasa) 
del sistema. 
El gen lacIqZΔM15 en el episoma F' permite la detección blanquiazul para el 
plásmido recombinante. 
 
 
 
17 
 
pBluescript II KS+ 
Este es un fagémido comercial que contiene varias secuencias útiles para su uso 
en clonación. Las secuencias incluyen un sitio múltiple de clonación (MCS, por sus 
siglas en inglés), una secuencia de resistencia a ampicilina y orígenes de replicación 
de E. coli y el fago f1. La secuencia del sitio múltiple de clonación se localiza dentro 
del el gen LacZ (Figura 6). 
 
Figura 6. Vector de clonación pBluescript KS+ 
(Stratagene, 2008) 
 
 
 
18 
 
pSyn2 
Este es un vector de despliegue en fagos el cual contiene el gen de resistencia a 
Kanamicina, un péptido señal de exportación a periplasma pelB, los sitios de 
restricción para las enzimas NotI y SfiI, una cola de histidinas y una bandera (tag) 
Cmyc. 
 
Figura 7. Vector de despliegue en fagos pSyn2 
 
 
19 
 
pET -22 b 
El vector pET-22b (+) lleva una secuencia N-terminal del péptido señal pelB para la 
exportación potencial a periplasma. Cuenta con sitios de restricción los cuales se 
muestran en el mapa circular. 
 
Figura 8. Vector de expresión pET -22B(+) 
(Addgene, 2002) 
 
20 
 
5.3.- Preparación de células electrocompetentes protocolo BIORAD 
De acuerdo a Ausubel et al. (1987) y Miller y Nickoloff (1995), se inocularon 500 
mL de caldo L (L-broth) con un volumen 1/100 de un cultivo fresco de E. coli 
(preinoculo de toda la noche). Posteriormente, se procedió a crecer las células a 
37° C en agitación a 300 rpm hasta una DO600 de aproximadamente 0.5-0.7. Las 
células se enfriaron en hielo por ~20 minutos. Para cosechar, las células se 
transfirieron a una botella de centrífuga fría y se centrifugaron a 3000 x g por 15 
minutos a 4°C. Cuidadosamente se vertió y descartó el sobrenadante. Se 
resuspendió la pastilla en 500 mL de glicerol frío al 10% para posteriormente 
centrifugar a 7000 x g por 15 minutos a 4°C, de nuevo se decantó el sobrenadante. 
La pastilla se resuspendió en 250 mL de glicerol frío al 10% para después 
centrifugar a 7000 x g por 15 minutos a 4°C, y de nuevo cuidadosamente decantar 
el sobrenadante. Como siguiente paso de lavado se resuspendió la pastilla en ~20 
mL de glicerol frío al 10%. Esto se transfirió a un tubo de 30 mL Oakridge y centrifugó 
a 7000 x g por 15 minutos a 4°C, se decantó el sobrenadante. Se resuspendió la 
pastilla en un volumen final de 1 a 2 mL de glicerol frío al 10%. 
Para medir la eficiencia de las células se procedió a hacer la correspondiente 
electroporación usando un vector de referencia y haciendo diluciones apropiadas 
para después sembrar en medio de cultivo selectivo. 
5.3.1.- Electroporación 
Las células preparadas por el método de BIORAD se descongelaron en hielo. Se 
colocaron en hielo un tubo de microcentrifuga de 1.5 mL y una celda de 
electroporación de 0.1 ó 0.2 cm. Se mezclaron 50 µL de la suspensión de células 
con 2 µL de DNA en un tubo de microcentrifuga de 1.5 mL, y esta mezcla se incubó 
en hielo por ~1 minuto. En el MicroPulser (Equibio Easyjet T Prima; Peqlab) 
previamente ajustado a “Ec 1” del E. coli celda de 0.1 cm. La mezcla de células y 
DNA se transfirió a una celda de electroporación fría y una vez hecho esto se dio un 
pequeño golpe para asegurar que la suspensión estuviera en la parte inferior. Ya 
colocada la celda en la cámara se pulso una vezhasta que se escuchó un tono que 
 
21 
 
indicaba una electroporación adecuada, lo que quiere decir que si la fuerza del 
campo eléctrico aplicado o la duración de la exposición al mismo se eligieron 
apropiadamente, los poros formados por el pulsó eléctrico se sellaran tras un corto 
período, durante el cual los compuestos extracelulares tienen la oportunidad de 
entrar a la célula. Después se removió la celda de la cámara e inmediatamente se 
adicionó 1 mL de medio SOC, las células se resuspendieron con una pipeta Pasteur, 
se transfirieron a un tubo de propileno de 17 x 100 mm y se incubaron a 37°C por 1 
hora, en agitación a 225 rpm Finalmente se sembraron en medio selectivo. 
 
5.4.- Obtención del gen de la toxina nativa en el vector pSyn2 
La secuencia de la toxina nativa se amplificó utilizando dos oligos, uno directo y otro 
reverso los cuales contienen los sitios de restricción SfiI y NotI para su clonación (se 
indican subrayados): 
SfiI_Css2.Fw: 
5’-GAG GCC CAG CCG GCC ATG GCC AAA GAG GGC TAT CTG GTA-3’ 
NotI_Css2.Rv: 
5’-GAG CGG CCG CGT TGC ATG TTT TAT TAG GAA GGG-3’ 
 
Las condiciones para la PCR fueron las siguientes (reacción de 100 µL): 
 
 
Templado (Css2 dd SfiI/NotI) 2 µL 
Tampón 10x/MgCl2 10 µL 
dNTP's 10 mM 2 µL 
SfiI_Css2 2 µL 
NotI_Css2 2 µL 
Vent Pol 2 µL 
Agua tetradestilada 80 µL 
 
22 
 
Una vez amplificado el gen de la toxina nativa usando los oligos anteriores, se 
procedió a ligar a un vector de clonación pBluescript II KS(+), para posteriormente 
electroporar en células DH5α. Estas células se sembraron en placas con medio 
selectivo para después identificar una colonia transfectada correctamente por PCR, 
usando como oligos aquellos propios del vector de clonación que hibridan en 
regiones que flanquean el MCS, T7-like y T3-like: 
T7-like: 
5’-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TA-3’ 
 
T3-like: 
5’-CTC ACT AAA GGG AAC AAA AGC-3’ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Una vez realizado el PCR se verificó por electroforesis que el tamaño de cada uno 
de los productos fuese el esperado, con un tamaño estimado de ~453 pb. De estas 
colonias se prepararon las correspondientes purificaciones del plásmido para 
posteriormente secuenciar. 
Con la construcción correcta, es decir la secuencia de Css2 nativa en pBluescript II 
KS(+), se tomaron dos rutas. En la primera, la secuencia se usó para las pruebas 
de pegado inespecífico con la toxina nativa (ver más adelante). En la segunda 
estrategia, se utilizó la secuencia como templado para la mutagenésis sitio dirigida 
y de esta manera se obtuvieron las variantes que se describirán en pasos próximos. 
Templado 5 µL 
Tampón 10x/KCl 1 µL 
25 mM MgCl2 0.4 µL 
dNTP's 5 mM 0.8 µL 
T3-like 0.4 µL 
T7-like 0.4 µL 
Taq Pol 0.2 µL 
Agua tetradestilada 1.8 µL 
 
23 
 
Para la subclonación de la secuencia silvestre, partimos de la secuencia Css2 nativa 
contenida en el vector de despliegue en fagos pBluescript II KS+ y se digirió 
mediante las enzimas de restricción SfiI y NotI. Posteriormente, procedimos a hacer 
la ligación de esta secuencia en el vector pSyn2 (subclonación de Css2 en pSyn2), 
y nuevamente se verificó que la secuencia del gen de Css2 nativa en este vector 
era la correcta. 
5.5.- Construcción del banco de variantes de Css2 para despliegue en fagos 
Para generar las distintas variantes de Css2, utilizamos como templado la secuencia 
que codifica para la toxina Css2 nativa. Esta secuencia se reamplificó utilizando un 
primer directo degenerado llamado Pv_Css2, el cual contiene los codones más 
usados en E. coli para todas las variantes posibles en las tres posiciones de interés 
del amino-terminal de la Css2. Además usamos los oligos que corresponden a los 
sitios de clonación SfiI y NotI. Las “X” marcan los sitios donde se llevó a cabo la 
mutagénesis. 
Pv_Css2: 
5’-GA AGG AAA GAG GGC TAT CTG GTA XXX XXX XXX ACA-3’ 
El producto de PCR se purificó y digirió en sus extremos con las enzimas SfiI y NotI. 
El producto de la digestión, una vez purificado, se ligó al vector de despliegue en 
fagos pSyn2, el cual se usó para expresar las variantes como péptidos de fusión 
con la proteína PIII del fago filamentoso. Para transformar el banco se usaron 
células electrocompetentes de E. coli XL1-Blue de alta eficiencia. El título del banco 
se determinó por dilución y su diversidad se evaluó por secuenciación. 
 
 
24 
 
5.6.- Preparación de fago ayudante 
Para cumplir con este objetivo, se inocularon 10 ml de medio YT2x con 100 µl de 
un cultivo previo XL1-Blue en medio YT2x (el cual se incubó toda la noche) y se dejó 
crecer hasta una densidad óptica de 0.7-1.0 a 600 nm para posteriormente infectar 
con 50 µl del fago ayudante (fago M13 proporcionado por la Dra. Lidia Riaño). Este 
cultivo final se incubó a 37°C por 30 minutos sin agitación y 30 más con agitación, 
(para comprobar la infección se plateó 1 µl en YT2x sólido + kanamicina). 
El cultivo se transfirió a 500 mL de medio YT2X + kanamicina (km) 50 µg/mL, en un 
matraz de 2.5 litros, y se incubó toda la noche a 37°C en agitación. Al día siguiente 
se centrifugó el cultivo a 3500 rpm por 20 minutos a 4°C. El sobrenadante obtenido 
se transfirió a una botella estéril y se adicionó el 15% del volumen del cultivo de una 
mezcla de PEG 8000 al 20% y NaCl 2.5 M, es decir 75 mL de la mezcla por cada 
500 mL de cultivo original. Se mezcló muy bien con una pipeta estéril. 
Inmediatamente se incubó en hielo durante 1 hora (para facilitar la precipitación). 
Se centrifugó a 8000 rpm por 40 minutos a 4°C, se tiró el sobrenadante y la pastilla 
se resuspendió en 150 mL de PBS 1x estéril (30% de los 500 mL). Se adicionó 22.5 
mL de la mezcla de PEG + NaCl. Inmediatamente se incubó en hielo durante 1 hora 
(para facilitar la precipitación). Se centrifugó a 8000 rpm por 40 minutos a 4°C, se 
tiró el sobrenadante y se resuspendió la pastilla en PBS 1X estéril (22.5 mL). Se 
incubó a 70°C por 20 minutos, se centrifugó a 3500 rpm x 15 minutos a 4°C. 
Finalmente se filtró el sobrenadante por membrana de 0.45 µm y se guardó el 
sobrenadante que contiene los fagos a 4°C. 
5.7.- Estrategia para el tamizado de fagos 
Teóricamente, el pegado de los fagos durante la selección puede ser específico 
(debido al reconocimiento del blanco por parte de la proteína de interés desplegada) 
o inespecífico (si el pegado ocurre a través de las proteínas propias del fago). Por 
esta razón son cruciales los procedimientos de tamizaje que permitan la 
identificación de ligandos específicos. 
 
25 
 
Uno de los problemas a los que se puede enfrentar el proceso de selección por 
despliegue en fagos, es el pegado inespecífico de éstos, siendo necesario optimizar 
la técnica y asegurarse de que la selección va a ser regida por la proteína 
desplegada por el fago y no que esa capacidad de adhesión sea propia del fago. 
Esto se puede solucionar de diversas maneras, ya sea aumentando la astringencia 
de los pasos de lavado durante el proceso de selección, o utilizando bloqueadores 
de sitios inespecíficos como suero fetal bovino. En este caso las fago-toxinas se 
seleccionan directamente contra el canal blanco hNav 1.6 expresado de células 
HEK. Como control, para asegurar que durante el proceso de selección, las clonas 
obtenidas sean aquellas que tengan la secuencia deseada, se probó el despliegue 
de la toxina nativa rCss2, demostrando que el proceso de selección es específico. 
Esto antes de probar las variantes mutantes de la rCss2. 
Para afinar la selección de la toxina Css2 contra el canal hNav 1.6 se realizó una 
prueba donde se puso a competir la unión de la fago-toxina nativa al canal, contra 
un fago que no tuviera afinidad alguna por el canal. Para ello se utilizó un fago-
anticuerpo (producido en las mismas condiciones que la fago-toxina) que no fuera 
afín al canal hNav 1.6. Si las condiciones del tamizado permiten la selección de 
interacciones específicas,se debería obtener como fagos de salida aquellos que 
expresan a la Css2 nativa fusionada a la PIII. 
5.8.- Recuperación del banco de fago-toxinas/anticuerpos 
Se colocaron en tubos Falcon 15 mL de medio YT2X, ampicilina y glucosa al 2% y 
se inoculó con el banco (300 µL). Se incubó hasta una DO de 0.7 a 1 y se adicionó 
el fago ayudante en una relación de 20 fagos por bacteria. Se incubó por 30 minutos 
a 37°C sin agitación, después se cambió a 37°C con agitación por 30 minutos, 
después se centrifugó el cultivo a 4000 rpm por 15 minutos a 4°C. Se tiró el 
sobrenadante y se resuspendió en YT2X/Kan/Amp sin glucosa (volumen final 50 
mL), para después pasarlo a un matraz de 250 mL, dejando en agitación 30 minutos 
a 37°C y a continuación se bajó la temperatura a 30°C con agitación por toda la 
noche. Los cultivos se dividieron en dos tubos Falcon (25 mL), se centrifugaron a 
 
26 
 
4000 rpm por 20 minutos a 4°C. Se pasaron los sobrenadantes a tubos Falcon, y 
para precipitar los fagos se agregó 5 mL de PEG 8000 al 20% y NaCl 2.5 M, dejando 
reposar en hielo 15 minutos. Posteriormente se centrifugó a 5500 rpm por 20 
minutos a 4°C. El precipitado se recuperó en 20 mL finales de PBS y se adicionó 4 
mL de PEG NaCl (en la concentración anterior), se dejó reposando en hielo por 15 
minutos. Se centrifugó a 4000 rpm a 4°C por 20 minutos. El pellet se resuspendió 
en 2.5 mL (o 5mL) de PBS 1x. Se centrifugó en tubos de 1 mL a 14000 rpm por 15 
min. Finalmente se filtró el sobrenadante por una membrana de 0.45 µm y se 
almacenó a 4°C. 
 
 
27 
 
5.9.- Tamizado en células HEK293 que expresan el canal de sodio hNav 1.6 
Como se habló anteriormente, el principal problema que existe en el despliegue de 
fagos en células completas, es la cantidad de receptores presentes en estas, los 
cuales pueden propiciar interacciones inespecíficas. Se ha visto que para disminuir 
estas interacciones desfavorables, se debe centrifugar el cultivo de células HEK 
fresco, a bajas velocidades, y este debe ser usado inmediatamente, ya que la 
prolongación en los tiempos de centrifugación favorece el lisado de las células, 
contribuyendo de esta manera al pegado inespecífico de fagos (18). Una ventaja 
del uso de las células completas, es que estás favorecen la conformación nativa de 
los receptores, asegurando de esta manera que la selección se llevará a cabo 
respecto a las propiedades nativas del receptor (19). 
En base a lo anteriormente descrito, las células HEK que expresan el canal hNav 
1.6 se trataron con tripsina durante 1 minuto para despegarlas de la placa de cultivo, 
después ésta se inactivó con DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino 
y antibiótico G418 (disulfato de geneticina). Las células se pasaron a un tubo Falcon 
para realizar los lavados necesarios con PBS 1x para retirar el medio DMEM. 
Después se hizo un conteo para colocar las células en una relación 1x106 células 
por 1x1011 fagos/mL, esto en un tubo Falcon (previamente bloqueado con BSA al 
5% durante 20 minutos), los fagos y las células se incubaron una hora a 37°C 
agitando suavemente cada 20 minutos. A continuación se realizaron 10 lavados con 
TBST 1x (solución Tris-tampón/Tween), después de los lavados se rompió la 
interacción célula/fago-péptido con un tampón de 0.2M de glicina-HCl pH 2.2 y se 
neutralizó con 1M Tris-HCl pH 9.1. Se recuperó de 1 a 10 µL de sobrenadante para 
titular los fagos, el resto se almacenó a 4°C para la siguiente ronda de infección 
(Figura 9). Se hicieron un total de tres rondas de tamizado. 
 
28 
 
 
Figura 9. Protocolo de despliegue en fagos 
 
 
29 
 
5.10.- Diluciones para el título de fagos de salida del tamizado 
 
Las diluciones para establecer el título de fagos de salida del experimento de 
tamizado de fagos en células completas se realizaron como se describe a 
continuación. A partir de los fagos neutralizados con Tris-HCl pH 9.1 al 1M se realizó 
la titulación, infectando E. coli XL1-Blue en medio YT2x. Un inóculo de la cepa de 
E. coli XL1-Blue se dejó toda la noche incubando en 1 mL de medio YT2x. Se 
inocularon 15 mL de medio YT2x con 100 µL del cultivo de la noche anterior, se 
incubó hasta lograr una densidad óptica de 0.7 a 1 leyendo a 600 nm. El fago se 
diluyó como muestra la Figura 10. Las colonias se cuantificaron al día siguiente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 
Medio YT2X (180 µl por cada tubo) 
20 µl 
Fagos de salida 
XL1Blue E. coli (180 µl por cada tubo) 
20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 
100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 
Medio YT2X sólido 
Figura 10. Esquema de diluciones para la titulación de los fagos de 
salida del tamizado de fagos en células completas. 
 
 
30 
 
5.11.- Selección de clonas 
La selección de los fagos obtenidos después de haber realizado las rondas de 
tamizado, se realizó a partir de las placas hechas para obtener el título de los 
tamizados, haciendo PCR de colonia. Una vez que se verificó el tamaño del inserto 
(~253 pb), se evaluaron al azar variantes, secuenciándolas y haciendo un 
alineamiento usando como comparativo la secuencia de la Css2 nativa, tratando de 
encontrar residuos similares en los aminoácidos mutagenizados (7, 8 y 9) o 
secuencias repetidas. Por otro lado, se hizo una comparación con otras toxinas 
reportadas en otros alacranes, considerando los cambios realizados con la 
mutagénesis; finalmente estas se seleccionaron para su posterior expresión y 
purificación, para finalmente ser evaluadas por electrofisiología. 
 
 
 
31 
 
5.12.- Expresión y purificación de las variantes y la rCss2 (Toxina Css2 
recombinante) 
 
5.12.1.- Expresión de la toxina Css2 en Escherichia coli cepa BL21 (DE3) 
 
Ligación al vector de expresión pET-22b (+) 
El gen que codifica para la Css2 (digerido en sus extremos con las enzimas de 
restricción SfiI y NotI) fue ligado al vector de expresión pET-22b (+), quedando de 
la siguiente manera (Figura 11): 
 
 
Figura 11. Construcción de la toxina recombinante Css2. 
Pel B: péptido señal de exportación a periplasma. Toxina: Css2. 
AAALE: Cinco aminoácidos propios del vector pET-22b (+). HHHHHH: 
Cola de histidinas. 
 
Posteriormente este vector con la construcción como se señala en la Figura 11, se 
electroporó a la cepa BL21 (DE3) de E. coli. 
Preparación de los cultivos de bacterias 
Los cultivos para la expresión de cada una de las proteínas de fusión que contienen 
a las toxinas se prepararon en dos días de la siguiente manera: 
 
32 
 
En el día 1 se preparó el pre-inóculo, se tomó una colonia fresca de BL21 (DE3) 
conteniendo el vector de expresión con la toxina, en 50 mL de medio LB + 25 µL 
ampicilina (200 µg/mL); después se incubó a 37°C con agitación (250 rpm) durante 
toda la noche. En el día 2, un matraz Fernbach con 500 mL de medio LB + 250 µL 
ampicilina, se inoculó con el cultivo nocturno, hasta obtener una densidad óptica a 
600 nm de 0.05-0.1 (aprox. 10 mL). Posteriormente se incubó a 37°C, con agitación 
de 180 rpm durante 4 horas o hasta tener una densidad óptica superior a 2 (λ 600 
nm). 
Inducción de los cultivos 
Para la producción de las proteínas de fusión recombinantes fue necesario utilizar 
IPTG (Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido), cuya acción resulta en la producción de 
T7 RNA polimerasa (20) (que se encuentra bajo el promotor Lac), la cual 
subsecuentemente actúa sobre el promotor T7 del vector de expresión pET22B-
Thio-Toxina, promoviendo así la producción de las proteínas recombinantes. Por lo 
tanto, cuando el cultivo llegó a la densidad óptica deseada se realizó la inducción 
con IPTG a una concentración final de 1 mM. Posteriormente se incubó a 30°C, 
agitando a 120 rpm durante 6 horas. La disminución de la temperatura de 37°C a 
30°C es con el objetivo de favorecer la formación de los puentes disulfuro que 
forman parte de la estructura secundaria de las toxinas. 
Purificación delas proteínas de fusión del periplasma de E. coli BL21 (DE3) 
Las células del cultivo inducido se colectaron en botellas de plástico de 500 mL y se 
centrifugaron a 6000 rpm por 10 minutos a 4°C. Las células se resuspendieron en 
15 mL de tampón PPB (200 mg/mL de sacarosa, 20 mM Tris-HCl pH 8.0). La 
muestra se pasó a tubos de centrífuga para rotor JA20 (tubos de aproximadamente 
40 mL) y se incubó en hielo por 20 minutos. Posteriormente se centrifugó a 6000 
rpm por 30 minutos y posteriormente se colectó el sobrenadante en otro tubo 
(continuando con la incubación en hielo). El tubo que se quedó con el precipitado 
celular se resuspendió con 15 mL de agua y se incubó en hielo por 20 minutos. Al 
término de la incubación en hielo se centrifugaron ambas muestras (el tubo donde 
 
33 
 
se colectó el primer sobrenadante de PPB y el tubo con el segundo sobrenadante 
de agua), a 10000 rpm por 30 minutos a 4°C. Finalmente se colectaron ambos 
sobrenadantes, para pasarlos posteriormente por la columna de afinidad. 
Para la purificación de las proteínas recombinantes se siguió el protocolo de afinidad 
a Níquel (QIAexpress® System, QIAGEN). La proteína de fusión contiene en el 
extremo C-terminal una cola de histidinas, las cuales son afines al níquel y permiten 
separar la proteína de interés de otras proteínas de E. coli. La metodología fue la 
siguiente: 
Se preparó una mini columna conteniendo 1 mL de resina de Níquel-NTA 
(QIAGEN). Se equilibró cada columna con 10 volúmenes del tampón de carga (20 
mM de imidazol en PBS 1X). Se cargaron las muestras con los extractos dentro de 
las columnas y se dejó fluir por gravedad hasta pasar el total de la muestra (repetirlo 
tres veces). Se lavó con 10 volúmenes del tampón de lavado (30 mM imidazol en 
PBS 1X), para eliminar las proteínas no deseadas. Como último paso, se eluyó la 
proteína recombinante con el tampón de elución (300 mM imidazol en PBS 1X). 
 
5.12.2.- Protocolo de HPLC 
Para separar los componentes obtenidos por la columna de afinidad de Níquel se 
utilizó una columna analítica C18 (Vydac®). Para hacer el gradiente de separación 
en fase reversa se utilizaron dos tampones, A y B. El tampón A es hidrofílico, 
contiene agua tetradestilada con 0.12% de ácido trifluoroacético (TFA). El tampón 
B es hidrofóbico y está constituido por acetonitrilo con 0.1% de TFA. La purificación 
de los péptidos recombinantes se realizó empleando un gradiente lineal de 20 a 
40% de B en 20 minutos, es decir por cada minuto que pasa hay un aumento del 
1% de la fase B, aproximadamente al minuto 16 se obtenían las variantes. Antes de 
cada protocolo de purificación la columna se equilibró con 20% de tampón B durante 
20 minutos y una vez que se eluyó la muestra de la columna, alrededor de los 16 
minutos, se lavó la columna con 100% de la fase B por 5 minutos. 
 
34 
 
5.13.- Ensayo de reconocimiento por ELISA 
Para comprobar que tanto la rCss2 como las variantes obtenidas tenían el 
plegamiento correcto, se hizo un ensayo de ELISA utilizando dos anticuerpos 
producidos en el laboratorio a través de ingeniería proteómica y evolución dirigida: 
el primero de ellos denominado LR, reconoce a la toxina Css2 con una afinidad del 
orden picomolar (21) y del que se sabe reconoce una región importante de la 
interacción toxina-canal (22). El segundo anticuerpo, IG (patente pendiente), 
proviene de una familia que reconoce una región diferente del LR. Estos dos 
fragmentos de anticuerpos reconocen epítopes estructurados, es decir reconocen 
superficies tridimensionales de un antígeno. 
Para este ensayo, se colocaron 100 µL de la solución de toxina (3 µg/mL de toxina 
en un tampón de carbonatos) por pozo y se incubo dos horas a 37°C, después se 
lavó con un tampón de lavado (PBS 1x-Tween 0.1%) y se procedió a bloquear la 
placa incubando toda la noche a 4°C, utilizando BSA al 0.5% disuelto en el tampón 
de lavado. A continuación se lavó con el tampón de lavado tres veces. Posterior a 
este paso, se añadieron 100 µL de la solución de anticuerpo primario (10 µg/mL) a 
cada pozo, incubando a 37°C por una hora. Después de incubar se lavó de nuevo 
la placa con el tampón de lavado y se adicionó un anticuerpo secundario de ratón 
anti c-Myc (Santa Cruz Biotechnology) y se incubó por una hora a 37°C. Se volvió 
a lavar con el tampón de lavado para posteriormente añadir un anticuerpo terciario 
de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa (GeneTex), el cual se incubó una 
hora a 37°C protegido de luz, y finalmente, se adicionó 100 µL por pozo de la 
solución reveladora (4.4 µL H2O2 30%, tampón de fosfatos 0.1 M pH 5, 4.4 mg 
ortofenilendiamina) esperando cinco minutos para después neutralizar la reacción 
con 100 µL de HCl 6N. La placa se leyó en un lector iMark™ microplate absorbance 
reader de BIORAD a  490 nm. Se hicieron pozos triplicados para cada toxina. 
 
35 
 
5.14.- Electrofisiología 
5.14.1.- Cultivo celular 
Se utilizó la línea celular HEK293 la cual expresa heterólogamente el canal humano 
de sodio (hNav 1.6). Lás células se cultivaron en medio DMEM (Dulbecco’s Modified 
Eagle Medium) suplementado con 10% de suero fetal bovino y antibiótico G418 
(disulfato de geneticina) y se mantuvieron a 37°C/5% de CO2. 
5.14.2.- Soluciones 
Solución de registro extracelular (pH 7.3): NaCl 130 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, 
MgCl2 2 mM, HEPES–NaOH 10 mM, D-glucosa 5 mM. 
Solución intracelular (pH 7.3 con CsOH): CsF 105 mM, CsCl 27 mM, NaCl 5 mM, 
MgCl2 2 mM, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM. 
5.14.3.- Whole-Cell Patch Clamp 
El procedimiento utilizado para este trabajo es similar al usado en otros trabajos 
previos del laboratorio (23). Para lograr registrar las corrientes de sodio se utilizó la 
técnica de fijación de voltaje en una célula completa (“Whole-Cell Patch Clamp” por 
su nombre en inglés). Esta estrategia experimental consiste en mantener fija la 
diferencia de voltaje de la membrana (diferencia de potencial), por lo cual se utiliza 
una pipeta de vidrio en comunicación con un electrodo que a su vez está conectado 
a un amplificador, un convertidor analógico-digital y finalmente una computadora. 
Para formar el sello de alta resistencia entre la membrana y la punta de la pipeta, 
se usó una presión negativa de tal manera que con una pequeña succión, la 
membrana se invagino, a continuación se aplicó una succión extra para romper esta 
invaginación, formando una comunicación entre la pipeta y el medio intracelular, 
teniendo de esta manera la configuración de “whole-cell” lo cual permitió fijar el 
potencial de membrana y llevar a cabo el registro de la actividad de todos los 
canales iónicos presentes en la membrana celular. 
 
36 
 
Todas las variantes de la Css2 probadas, así como la rCss2, fueron resuspendidas 
en solución estándar extracelular (detallada anteriormente). Las corrientes se 
registraron a temperatura ambiente utilizando el amplificador MultiClamp 700Aª y la 
digidata 1440 (Molecular Devices, USA). Las células fueron estimuladas mediante 
el protocolo de voltaje descrito en la Figura 25 y se llevó a cabo el registro de las 
corrientes correspondientes en condiciones de control (solución fisiológica) y en 
presencia de las toxinas. 
La resistencia de la micropipeta fue de 1.5-2.2 MΩ. Antes de cada protocolo de 
fijación de voltaje se realizó una compensación de las espigas de la capacitancia 
celular y resistencia en serie, con el fin de disminuir los errores de voltaje a menos 
del 5%. Los datos se analizaron usando el programa pClamp (versión 10.0, 
Molecular Devices, USA) y Origin 7. 
 
 
37 
 
6.- RESULTADOS 
6.1.- Preparación de células electrocompetentes BIORAD 
La preparación de células competentes se llevó a cabo por el método reportado en 
el manual de BIORAD, obteniendo una eficiencia de 7.8x108 ufc/µg de plásmido 
pUC19. En la Tabla 1 y el gráfico 1 se muestra el crecimiento seguido por la 
medición de la densidadóptica de la cepa XL1-Blue utilizada en la preparación de 
células electrocompetentes. Estas células se utilizaron en los procesos de tamizado. 
Tabla 1. Crecimiento de E. coli XL1 Blue durante la preparación de células 
electrocompetentes. 
Hora Abs 600 nm (DO) 
1 0.07 
2 0.135 
3 0.33 
3.5 0.437 
3.75 0.53 
4 0.613 
4.25 0.728 
 
Gráfico 1. Curva de crecimiento de E. coli XL1 Blue, Absorbancia a 600 nm. 
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
1 2 3 3.5 3.75 4 4.25
D
O
6
00
Tiempo en horas
 
38 
 
200 pb 
253 pb 
6.2.- Amplificación del gen de la toxina Css2 
La amplificación del gen de la toxina se realizó con los oligos que contenían los 
sitios de clonación SfiI y NotI, obteniendo un producto que poseía el tamaño 
esperado, que es de 253 pb (Figura 12). 
Como parte de los controles fue necesario obtener la variante nativa, la cual sirvió 
tanto como control positivo para los tamizados (recordando que la Css2 nativa tiene 
especificidad y afinidad conocidas para el canal Nav 1.6), como para los registros 
electrofisiológicos realizados sobre la corriente de sodio generada por el canal hNav 
1.6. 
. 
 
Figura 12. Gel de electroforesis del producto de PCR de la toxina nativa. 
Gel de agarosa al 1%. En el carril uno se observa el marcador de peso molecular de 100 
pb (New England Biolabs, NEB). En el carril dos se encuentra el producto de PCR 
amplificado con los oligos SfiI_Css2.Fw y NotI_Css2.Rv, la flecha roja señala la posición 
de la banda del producto de PCR en relación al marcador de peso molecular, teniendo un 
aproximado de 253 pb, que es el tamaño esperado después de la amplificación. 
 
 
39 
 
400 pb 
6.3.- Clonación de la toxina Css2 nativa en el vector pBluescript II KS(+) 
Como paso siguiente, procedimos a ligar el gen que codifica para la toxina Css2 
nativa al vector de clonación pBluescript II KS(+). Esta construcción se electroporó 
en E. coli DH5α, para posteriormente por PCR de colonia, usando oligos propios del 
vector (T3 y T7) identificar a la colonia transfectada con la secuencia deseada. En 
este caso el tamaño esperado para el inserto era de alrededor de 453 pb. Se 
evaluaron 5 colonias al azar. Como control negativo de la transfección se utilizó una 
colonia sin el inserto de la toxina Css2 (colonia azul) (Figura 13). 
 
Figura 13. Gel de agarosa al 1% con el producto de PCR de colonia 
usando los oligos T7-like y T3-like. 
Carriles, 1: Marcador 100 pb; 2: Colonia azul; 3: Colonia 1; 4: Colonia 2; 5: Colonia 
3; 6: Colonia 4; 7: Colonia 5. La flecha señala el tamaño aproximado para esta 
amplificación, siendo de ~453 pb. Las colonia 3, 5 y 6 contenían a la toxina Css2. 
 
 
1 2 3 4 5 6 7 
 
40 
 
6.4.- Secuenciación del DNA plasmídico 
El inserto obtenido en el paso anterior, se secuencio, utilizando los oligos que 
flanquean el gen de la toxina Css2 (SfiI y NotI). De las secuencias obtenidas se 
encontraron dos correctas, es decir ambas poseían la construcción completa de la 
Css2 con los sitios SfiI y NotI (Figuras 14 y 15). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El alineamiento mostrado en la Figura 14 se hizo utilizando como secuencia de comparación el 
gen de la toxina nativa Css2, el cual en sus extremos tiene los sitios de clonación SfiI y NotI, la 
comparación se hizo para el inserto de la clona tres. Ambas secuencias tienen una identidad 
del 100%. Alineamiento hecho en ApE-A plasmid Editor v2.0.47. 
 
Figura 14. Secuencias del inserto de la clona tres: Css2 nativa-pBluescript II KS(+). 
 
41 
 
 
Figura 15. Secuencia del inserto de la clona cuatro: Css2 nativa-pBluescript II KS(+). 
El alineamiento mostrado en la Figura 15 se hizo utilizando como secuencia de comparación el gen 
de la toxina nativa Css2, el cual en sus extremos tiene los sitios de clonación SfiI y NotI. Ambas 
secuencias tienen una identidad del 100%. Alineamiento hecho en ApE-A plasmid Editor v2.0.47. 
 
 
 
42 
 
6.5.- Subclonación de la toxina Css2 nativa en el vector de para despliegue 
en fagos pSyn2 
Una vez confirmada la correcta clonación de la toxina Css2 nativa en el vector 
pBluescript II KS(+), procedimos a subclonarla en el vector para despliegue en fagos 
pSyn2. Para esto, digerimos al vector de clonación pBluescript II KS(+) usando las 
enzimas de restricción SfiI y NotI. El inserto de la toxina Css2 obtenido previamente 
se ligó al vector pSyn2 (vector de despliegue en fagos). La nueva construcción 
pSyn2-Css2 nativa se electroporó en células electrocompetentes XL1Blue y 
nuevamente se hizo PCR de colonia para identificar a las colonias positivas, 
obteniendo que tanto la clona 3 como la 4 contenían al inserto esperado, de 253 pb 
(Figura 16). Estas clonas se secuenciaron, y se confirmó que ambas poseían la 
secuencia de Css2 nativa. De esta manera se obtuvo a la Css2 nativa para 
despliegue en fagos, la cual se usó como control positivo en los tamizados y en los 
estudios de electrofisiología. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Gel de agarosa 1%. Carril 1: Marcador 100 pb, Carriles 2 al 7 colonias 
de la clona 3, Carril 8 vacío, carriles 9 al 12 colonias de la clona 4. En 
el cuadro naranja se señala el tamaño obtenido de los insertos. 
 
 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 
~253 
pb 
 
3 4 
Figura 16. Inserto del gen de la toxina en el vector pSyn2. 
 
 
43 
 
6.6.- Mutagénesis de la toxina Css2 nativa 
En la sección 5.5 se describió la estrategia para obtener todas las posibles variantes 
con los tres cambios en el amino-terminal de la Css2 (posiciones 7,8,9), para lo cual 
la secuencia de la toxina Css2 nativa, se amplificó utilizando el oligo Pv_Css2 que 
es un oligo degenerado, el cual, como se explicó anteriormente, contiene los 
codones para todas las variantes posibles en las tres posiciones de interés del 
amino-terminal de la Css2. Además del oligo anterior, usamos los oligos 
correspondiente SfiI y NotI para la amplificación de la secuencia por PCR (Figura 
17). Una vez realizada la mutagénesis se procedió a hacer la digestión con las 
enzimas de restricción SfiI y NotI, para posteriormente ligar el plásmido al vector de 
despliegue en fagos, pSyn2. Este construcción (pSyn2-Css2 mutante) se 
electróporo en E. coli XL1Blue. 
 
Gel de agarosa 1%. Carril 1: Marcador 100 pb, 2: Css2 digerida con 
SfiI y NotI, 3: Mutagénesis. 
El banco obtenido se evaluó por secuenciación de DNA plasmídico, para lo cual se 
seleccionaron 10 clonas al azar, encontrando que cuatro correspondían a la 
secuencia de la toxina Css2 nativa, mientras que el resto poseían cambios en las 
tres posiciones seleccionadas (7, 8 y 9, Ser-Lys-Ser, respectivamente), lo que 
quiere decir que hay un 60% de mutación. Al momento de secuenciar, podemos 
encontrar la secuencia nativa dentro del banco de variantes mutagénicas, lo cual se 
1 2 3 
Figura 17. PCR mutagénico, usando el oligo Pv_Css2. 
 
 
44 
 
debe a que el templado utilizado proviene precisamente del gen de la Css2 nativa 
que tiene el mismo tamaño que el producto mutagenizado, y por lo tanto es 
copurificado del gel (Figura 18). 
 
Figura 18. Comparación de la secuencia nativa de Css2 con las clonas mutagénicas 
Alineamiento realizado en Jalview® versión 2.8.2, se comprobó que la mutagénesis se hubiese 
llevado a cabo correctamente, observando que de 10 secuencias analizadas, cuatro pertenecían a 
la Css2 nativa, lo cual porcentualmente indica que el 60% de las secuencias pertenecían a mutantes. 
Una vez que se obtuvieron tanto la Css2 nativa como las variantes, se procedió a 
producir las fago-toxinas, además de los otros controles: Los fago-anticuerpos y el 
fago ayudante. 
 
 
 
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6.7.- Título de fago ayudante, fago-anticuerpo, fago-toxina nativa y fago-toxina 
mutante 
Se produjeron los fagos correspondientes (fagos ayudantes (φ-Help), fago-
anticuerpos (φ-Ab), fago-toxinas (φ-Css2) y fago-toxinas mutantes