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Aprendiendo Biologia

23/7/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE
MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES
IZTACALA

Determinación de las propiedades fotoprotectoras de Jacaranda
mimosifolia D. Don, usando como modelo biológico a la
levadura Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E. C. Hansen
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
Licenciado en Biología
PRESENTA
MIGUEL ANGEL ROMERO ESPINOSA

DIRECTOR DE TESIS
Dr. José Guillermo Avila Acevedo

Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla, Estado de México, 2016

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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Dedicatoria
Al Sol, que da vida, energía e ilusiones…
A la Esfera Azul, único hogar conocido y poco entendido…
A mi familia… En especial a mi Madre y mi tía Ana que dan todo sin pedir nada a cambio.
A Cris, Mari y Ger primos que me han alentado y orientado como hermanos.
A mis amigos, del barrio, de la secu, de la prepa, de la universidad, de la vida y de la lucha, que son
la familia escogida.
A Ceci, que me acompaña en el amor, amortiguando y rememorando éste esfuerzo.
Al Dr. Memo y a la Dra. Anita guías académicos y al Dr. Campos, a la Dra. Montse, a la Maestra
Marisol y al Maestro Andrés, que con su inspiración y conocimiento esto fue posible.
Al Mundo, practiquen y promuevan la cercanía…la amistad duplica nuestras alegrías y divide
nuestra tristeza.
A lo Divino que es infinito, abstracto y concreto, que es todo y nada, que es mi principio y mi fin…
Gracias al Universo, al Cosmos, a la vida y a todos los que lectores de estas páginas.
Tabla de contenido
1 Resumen ............................................................................................................................................................................................1
2 Introducción .................................................................................................................................................................................. 2
3 Marco teórico ............................................................................................................................................................................... 5
3.1. Fotoprotectores solares ..................................................................................................................................................... 5
3.2. Antecedentes ........................................................................................................................................................................... 5
3.3. Género: Jacaranda ................................................................................................................................................................ 6
3.4. Especie de estudio: Jacaranda mimosifolia .................................................................................................................7
3.4.1. Usos en medicina tradicional ................................................................................................................................... 9
3.4.2. Usos comprobados científicamente ....................................................................................................................... 9
3.5. Extracto metanólico ............................................................................................................................................................. 12
3.6. Modelo biológico de estudio: Saccharomyces cerevisiae .................................................................................... 12
4 Justificación ................................................................................................................................................................................ 16
5 Hipótesis ........................................................................................................................................................................................ 16
6 Objetivos ........................................................................................................................................................................................ 17
6.1. Objetivo general .................................................................................................................................................................... 17
6.2. Objetos particulares ............................................................................................................................................................ 17
7 Estrategia experimental .................................................................................................................................................... 188
Etapa 1 .............................................................................................................................................................................................. 19
7.1.1. Obtención del material vergetal………………………………………………………………………………………………………19
7.1.2. Obtención del extracto metanólico de flores ..................................................................................................... 19
7.1.3. Espectro de absorción del extracto metanólico ............................................................................................... 19
7.1.4. Obtención del cultivo axénico.................................................................................................................................... 19
7.1.5. Cinética de crecimiento en medio líquido ...........................................................................................................20
7.1.6. Cinética de crecimiento en medio sólido ............................................................................................................. 21
7.1.6.1. Preparación del inóculo en medio sólido………………………………………………………………………………......21
7.1.6.2. Crecimiento…………………………………………………………………………………………………………………………………..21

Etapa 2. S. cerevisiae expuesta a UV-B ....................................................................................................................... 23
7.2.1. Experimentos de desafío .......................................................................................................................................... 23
7.2.2. Experimento de irradiación por UV-B sin protección .................................................................................. 25
7.2.3. Protección física .......................................................................................................................................................... 27
7.2.4. Protección a nivel metabólico ................................................................................................................................ 27
7.2.4.1. Adaptación de S. cerevisiae al extracto de J. mimosifolia………………………………………………….....27
7.2.4.2. S. cerevisiae cultivada en extracto y expuesta a RUV-B………………………………………………………..27
7.2.5. Protección a nivel físico-metabólico ..................................................................................................................28
7.2.6. Análisis estadístico y recuperaciónde material biológico irradiado. ..................................................28
Etapa 3. Análisis de proteínas .......................................................................................................................................... 29
7.1. Extracción de proteínas ............................................................................................................................................. 30
7.2. Electroforesis….…………………………………………………………………………………………………………………………….….30
7.3. Análisis de expresión de proteínas…………………………………………………………………………………………………..31
8 Resultados y discusión ......................................................................................................................................................... 32
Etapa 1 ................................................................................................................................................................................................ 32
8.1.1. Rendimiento del extracto ......................................................................................................................................... 32
8.1.2. Espectro de absorción del extracto metanólico de flor de J. mimosifolia .......................................... 32
8.1.3. Cultivo axénico de S. cerevisiae .......................................................................................................................... 33
8.1.4. Crecimiento de S. cerevisiae ............................................................................................................................... 33
8.1.5. Conteo de placa ........................................................................................................................................................... 34
Etapa 2 .................................................................................................................................................................................................. 35
8.2.1. Experimentos de desafío con y sin protección a la RUV-B ....................................................................... 35
8.2.2. Cinética de muerte de S. cerevisiae por exposición a UV-B sin protección ..................................... 36
8.2.3. Experimento con protección física .................................................................................................................... 38
8.2.4. Experimento con protección a nivel metabólico............................................................................................ 40
8.2.5. Experimento con protección a nivel físico-metabólico .............................................................................. 45
8.2.6. Comparación de los datos de sobrevivencia de los desafíos de irradiación .................................... 46

8.2.6.1. Tasas de mortalidad………………………………………………………………………………………………………………..46
8.2.6.2. Población de levaduras al inicio de cada experimento…………………………………………………………48
8.2.6.3. Tiempo de mortalidad de la población de levaduras expuesta a RUV-B…………………………….…49
Etapa 3 ............................................................................................................................................................................................... 52
8.3.1. Extracción de proteínas de células de S. cerevisiae ...................................................................................... 52
8.3.2. Consideraciones finales………………………………………………………………………………………………………………….58
9 Conclusiones .............................................................................................................................................................................. 59
10 Anexos…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………60
Anexo 1: Técnicas de extracción de proteínas de levaduras expuestas a RUV-B para comparación del
……..efecto fotoprotector anivelmolecular……………………………………………………………………………………………………….60
A. Kit de extracción de ADN UltraClean All Prep para células vegetales………………………………….…………………….60
B. A. Kit de extracción de ADN UltraClean All Prep para células animales……………………………………………………..62
C. C. Reactivo TRIzol® de Invitrogen………………………………………………………………………………………………………………..64
D. D. Hidróxido de sodio (NaOH)………………………………………………………………………………………………………………………..66
E. Rompimiento celular por choque térmico…………………………………………………………………………………………………….67
Anexo 2: Determinación taxonómica y registro en Herbario……………………………………………………………………68
11 Referencias…………………………………………………………………………………………………………………………………………………70

Índice de Figuras
Figura 1. RUV-B en el espectro electromágnetico .................................................................................................................. 3
Figura 2. Jacaranda mimosifolia. Sus diferentes estructuras vegetativas y reproductivas. ............................... 8
Figura 3. Metabolitos secundarios identificados en el género Jacaranda. ................................................................... 11
Figura 4. Ciclo celular de Saccharomyces cerevisiae .......................................................................................................... 13
Figura 5. Ciclo biológico de Saccharomyces cerevisiae ...................................................................................................... 14
Figura 6. Estrategia experimental ................................................................................................................................................. 18
Figura 7. Esquema de la obtención de S. cerevisiae en cultivo axénico en PDA y su observación al
………………microscopio óptico .........................................................................................................................................................20
Figura 8. Crecimiento de S. cerevisiae en medio sólido y técnica de dilución........................................................... 22
Figura 9. Esquemas de experimentos de desafío: 1. Cinética de muerte de S. cerevisiae por irradiación
……………….UV-B; 2. Experimento con barrera física; 3. Experimento con protección a nivel metabólico;
……………….4. Experimento con barrera física y metabólica ................................................................................................ 24
Figura 10. Diagrama de cinética de muerte de S. cerevisiae por irradiación UV-B ................................................. 26
Figura 11. Diagrama de cámara de electroforesis. ................................................................................................................. 31
Figura 12. Curvas de supervivencia de microorganismos irradiados con luz UV-B……………………………………….37
Figura 13. Electroforesis de Gel de poliacrilamida 1 .............................................................................................................. 54
Figura 14. Electroforesis de Gel de poliacrilamida 2 .............................................................................................................55
Figura 15. Fotografía del ejemplar herborizado: Jacaranda mimosifolia………………………………………………….......69

Índice de Tablas
Tabla 1. Clasificación de la radiación ultravioleta. ................................................................................................................... 2
Tabla 2. Preparación de reactivo de Bradford. ...................................................................................................................... 30
Tabla 3. Constantes de mortalidad .............................................................................................................................................. 47
Tabla 4. Comparaciónde los distintos experimentos de desafío. ................................................................................... 48
Tabla 5. Concentración de proteínas según el reactivo de Bradford. .......................................................................... 53
Tabla 6. Pesos moleculares de las bandas reveladas en electroforesis .................................................................... 56
Tabla 7. Comparación: Concentración de proteínas y valor relativo ............................................................................. 57

Índice de Gráficas
Gráfica 1. Espectro de absorción del extracto metanólico de flor de J. mimosifolia. ............................................. 32
Gráfica 2. Crecimiento de S. cerevisiae .................................................................................................................................... 34
Gráfica 3. Fase exponencial de S. cerevisiae ......................................................................................................................... 35
Gráfica 4. Cinética de muerte de S. ceresivisiae por exposición a RUV-B continúa sin protección ................ 36
Gráfica 5. Experimento con protección física. ....................................................................................................................... 38
Gráfica 6. Experimento con protección a nivel metabólico. ............................................................................................... 41
Gráfica 7. Experimento con protección a nivel físico-metabólico ................................................................................... 45
Gráfica 8. Cinética de muerte de S. cerevisiae por exposición a la RUV-B sin protección (dispersión). ....... 46
Gráfica 9. Experimentos con protección a la RUV-B (dispersión). ................................................................................. 47
Gráfica 10. Densitometría: Gel de poliacrilamida 1................................................................................................................ 54
Gráfica 11. Densitometría: Gel de poliacrilamida 2 .................................................................................................................55

“Determinación de las propiedades fotoprotectoras de Jacaranda mimosifolia, usando como modelo
biológico a la levadura Saccharomyces cerevisiae” M.A.R.E.
Laboratorio de Fitoquímica. UBIPRO. FES-I, UNAM, 2016
Resumen
La Radiación Ultravioleta B (RUV-B) causa severos daños en los organismos, además el deterioro
de la capa de ozono permite mayor penetración de los RUV-B a la corteza terrestre, provocando que
las lesiones en la piel humana sean cada vez más severas, por lo tanto, es necesario atenuar los
daños producidos por la RUV-B. Todos los seres vivos son capaces de producir metabolitos
secundarios, algunos poseen propiedades fotoquimioprotectoras, en este caso se evaluó el extracto
metanólico de flor de Jacaranda mimosifolia.
Lo costoso de los modelos biológicos para estudiar la protección contra ésta radiación, motiva a la
búsqueda de otras alternativas. En este trabajo se plantea utilizar como modelo biológico para
evaluar sustancias fotoquimioprotectoras a la levadura Saccharomyces cerevisiae. Se evaluaron las
cinéticas de crecimiento de S. cerevisiae, y su muerte en experimentos de desafío con y sin
protección ante la RUV-B. Los resultados indicaron que la levadura presenta un crecimiento
exponencial normal a partir de las 16 horas. Se determinó que con la irradiación de UV-B la muerte
de una población de las levaduras sin protección ocurre a los 3.5 minutos, mientras que al usar el
extracto de J. mimosifolia como barrera física sobreviven 3 horas. Además, se preparó un medio de
cultivo cuya única fuente de carbono fue el extracto de J. mimosifolia, resultando un medio
adecuado para su crecimiento, las levaduras creciendo en medio con extracto de J. mimosifolia
(experimento: metabólico) sobreviven a la exposición de 15 minutos de RUV-B. Por otra parte, se
obtuvo el valor cuantitativo de la protección que el extracto le confiere a las levaduras en contra de
la RUV-B. El extracto metanólico utilizado como barrera física protege 46 veces más que el control
sin protección, mientras que cuando dicho extracto es usado como medio de cultivo, su protección
es de 4.06 veces mayor, por otra parte, cuando el extracto es utilizado como barrera física y
metabólica su protección es de 30.36 veces.
En todos los experimentos se recuperaron células de S. cerevisiae y se les extrajeron las proteínas
para comparar el daño a nivel molecular mediante la identificación de cambios en la expresión de
estas moléculas. La cuantificación proteínica se realizó por el método de Bradford. Además, se
realizó electroforesis en gel de poliacrilamida para determinar si existía un patrón diferencial entre
los diferentes tratamientos, no se encontró expresión diferencial de proteínas. Se concluye que el
extracto de flores de J. mimosifolia es una sustancia fotoquimiprotectora y la levadura puede ser un
modelo biológico adecuado para evaluar estas sustancias. Palabras clave: metabolitos
secundarios, fotoprotección, proteínas, Saccharomyces cerevisiae, radiación ultravioleta,
Jacaranda mimosifolia.
“Determinación de las propiedades fotoprotectoras de Jacaranda mimosifolia, usando como modelo
biológico a la levadura Saccharomyces cerevisiae” M.A.R.E.
Laboratorio de Fitoquímica. UBIPRO. FES-I, UNAM, 2016
Introducción
Entre el Sol y la Tierra existe una distancia de 149.600.000 Km; sin embargo, la radiación
electromagnética producida por el Sol es emitida en todas direcciones y solo una pequeña parte de
esa radiación llega a la superficie terrestre, gracias a la protección de la atmósfera y a la capa de
ozono. La radiación solar está formada por pequeñas partículas de energía, llamadas fotones, se
propagan a una velocidad constante de 300.000 Km/s y se clasifica en tres categorías: las
radiaciones ionizantes, ondas hertzianas (radiaciones no ionizantes) y la radiación óptica (figura 1).
Esta última categoría comprende la luz visible al ojo humano y la radiación ultravioleta (RUV), no
visible para el ojo humano y que a su vez se clasifica en cuatro zonas: UV-A, UV-B, UV-C, y UV-
Vacío (tabla 1) (Avril et al., 2002).

Los fotones en función de su longitud de onda son absorbidos por ciertas moléculas denominadas
cromóforos (Vollhardt y Schore, 2002). El cromóforo “excitado” puede modificar su estructura,
establecer enlaces con las moléculas que lo rodean, puede transmitir la energía absorbida a
moléculas vecinas y en algunos casos formar especies reactivas conocidas como radicales libres.
Algunos radicales libres formados por la luz UV-B y en algunos procesos celulares son conocidos
como especies reactivas de oxígeno (ERO), que se caracterizan por ser biomoléculas con
capacidad de oxidar numerosas biomoléculas clave, provocando un desbalance y modificación de
las funciones biológicas en las que se encuentran implicadas dichas biomoléculas (March,1992).
Tipo de radiación UV Longitud de onda (nm)
UV-A 320 – 400
UV-B 280 – 320
UV-C 280 – 200
UV-Vacío 0.1 – 200
Tabla 1. Clasificación de la Radiación Ultravioleta.
“Determinación de las propiedades fotoprotectoras de Jacaranda mimosifolia, usando como modelo biológico a la levadura Saccharomyces cerevisiae”
M.A.R.E.
Laboratorio de Fitoquímica. UBIPRO. FES-I, UNAM, 2016
Figura 1. Tipos de radiación en el espectro electromagnético. Resaltado con un rectángulo rojo, la radiación ultravioleta B.
UV UV
EXTREMO LEJANO LUZ VISIBLE
10 95
Rayos Rayos
Gamma X
If----'-----.-""""" Radio
10 180
Radiaciones lonizantes Radiaciones Ópticas
“Determinación de las propiedades fotoprotectoras de Jacaranda mimosifolia, usando como modelo
biológico a la levaduraSaccharomyces cerevisiae” M.A.R.E.
Laboratorio de Fitoquímica. UBIPRO. FES-I, UNAM, 2016

Las ERO producen severas alteraciones celulares como: el rompimiento de las cadenas de ADN, la
modificación de la expresión del material genético, la desnaturalización de proteínas y la oxidación
de lípidos insaturados de las membranas celulares.
Las RUV son responsables de efectos celulares deletéreos y producen dos tipos de daños: 1. Efecto
directo (UV-B), fotorreacción en el DNA nuclear provocando la formación de dímeros de pirimidina
en los ácidos nucleicos; 2. Efecto indirecto, formación de especies reactivas de oxígeno,
responsables de la citotoxicidad, del efecto mutagénico y oxidación de bases nitrogenadas (Bjorn et
al., 2002; Diffey y Kochevar, 2007).
Los efectos biológicos de las RUV sobre la piel se manifiestan en todos los individuos, siempre y
cuando las dosis de irradiación (intensidad y duración) hayan sido suficientes. Sin embargo, las
consecuencias moleculares intracelulares pueden ser importantes y algunas lesiones en tejidos
como la piel, pueden ser clínicamente imperceptibles. En la piel, estas agresiones que pueden ser o
no producto de radicales libres, se van a acumular poco a poco alterando las células epidérmicas y
las dérmicas causando el envejecimiento celular y/o el cáncer (Konigsberg Fainstein et al., 2008).
La exposición de la piel a la RUV, particularmente de la radiación UV-B, puede causar eritema,
edema, hiperplasia, hiperpigmentación, quemaduras solares, inmunosupresión, fotoenvejecimiento y
cáncer de piel (Afaq y Mukhtar, 2001). Según la Organización Mundial de la Salud 65,161 personas
mueren al año a causa del cáncer de piel y se estima que 130,000 casos nuevos de melanoma se
producen cada año. El melanoma es la forma más mortífera de cáncer de piel, causando
aproximadamente 48,000 muertes al año. Además, se ha diagnosticado que 2-3 millones de los
casos de cáncer de piel no melanómicos se deben a la exposición a la luz solar (OMS, 2009). De
acuerdo a la Sociedad Mexicana de Oncología a nivel nacional ocurren alrededor de 1,000 casos de
cáncer de piel anualmente (Martínez, 2012).
Sin embargo, existen defensas para atenuar o remediar los daños causados por la RUV-B, se sabe
que cualquier organismo vivo expuesto a la radiación UV, reacciona de diferentes maneras, por
ejemplo la fototaxia, es una habilidad que poseen muchas células para dirigirse hacia la luz. El
efecto contrario, huir de la luz, se denomina fotoshock o fototaxia negativa (Lancha et al., 1988).
Otro ejemplo es la producción natural de compuestos fotoprotectores que sirven como pantalla
contra la RUV, como la melanina sintetizada en células de la piel de animales. De este modo, la
RUV puede inducir daños celulares, pero también puede inducir la producción de metabolitos
secundarios que les brinden un efecto fotoprotector (Alonso-Lebrero et al., 2003).

http://www.ecured.cu/C%C3%A9lulas
“Determinación de las propiedades fotoprotectoras de Jacaranda mimosifolia, usando como modelo
biológico a la levadura Saccharomyces cerevisiae” M.A.R.E.
Laboratorio de Fitoquímica. UBIPRO. FES-I, UNAM, 2016

Los fotoprotectores solares son productos químicos que proporcionan defensa contra los efectos
adversos de la radiación solar y en particular, la radiación UV-B. Los modelos biológicos utilizando
ratones y diferentes líneas celulares han mostrado que una variedad de filtros solares pueden
reducir los efectos cancerígenos e inmunosupresores de la luz solar (Kerr, 1998). Las sustancias
naturales extraídas de plantas se han considerado como una fuente potencial de recursos de
protección solar debido a que algunas de ellas tienen la capacidad de absorber radiación ultravioleta
además de sus propiedades antioxidantes (Adhami et al., 2001; Wright et al., 2006).
Marco teórico

3.1. Fotoprotectores solares.
Los fotoprotectores solares tienen la capcidad de proteger a la piel filtrando la luz y atenuando la
dosis de radiación ultravioleta que penetra en el tegumento. Estos productos multiplican el tiempo de
fotoprotección natural. Un protector solar es un preparado al que se asocia diferentes principios
activos, que pueden ser filtros orgánicos y/o pigmentos minerales, que han sido solubilizados o
dispersados en un excipiente; son moléculas que aseguran una protección fotoquímica al absorber
la energía de algunas radiaciones solares (Camacho, 2001).

3.2. Fotoprotectores a partir de plantas.
Los compuestos fitoquímicos que han demostrado poseer propiedades fotoprotectoras pertenecen a
varias clases como: flavonoides, isoflavonoides, fitoalexinas, fenoles, antocianos y carotenoides.
Éstos compuestos pueden actuar de distintas maneras: como cromóforos, estimulando la respuesta
inmune, suprimiendo la inducción de genes, mediante el bloqueo de daño oxidativo al ADN, por
desintoxicación de carcinógenos y al modificar algunas vías de señalización. Cada vez es más claro
que muchos de estos compuestos fitoquímicos desempeñan múltiples funciones actuando en contra
de algún proceso de fotocarcinogénesis (Adhami et al, 2001).
Los metabolitos secundarios extraídos de plantas han atraído considerable atención debido a sus
efectos fotoprotectores en la piel, esto ha generado un gran interés en el uso de antioxidantes y
filtros solares naturales para la prevención de la fotocarcinogénesis y el fotoenvejecimiento
(Camacho, 2001).
“Determinación de las propiedades fotoprotectoras de Jacaranda mimosifolia, usando como modelo
biológico a la levadura Saccharomyces cerevisiae” M.A.R.E.
Laboratorio de Fitoquímica. UBIPRO. FES-I, UNAM, 2016

Los polifenoles aislados de un extracto metanólico de corteza de Yucca periculosa mostraron una
actividad fotoprotectora en tejidos irradiados con UV-B, además se evaluaron dichos compuestos
aislados contra la mortalidad de Escherichia coli irradiadas con UV-B reduciendo la tasa de
mortalidad celular (García-Bores et al., 2010). Se aisló y se evaluó el fenilpropanoide glicosilado
conocido como verbascósido, extraído de una fracción de extracto metanólico de Buddleja cordata,
en ratones SKH-1 irradiados con UV-B reduciendo el daño celular, al tener menor incidencia y
multiplicidad de tumores (Martínez Bailón, 2012). Las epigalocatequinas (EGCG) de Camelia
sinensis o té verde (Ahmad y Mukhtar, 1999); la silimarina obtenida de Silybum marianum o cardo
mariano (Katiyar et.,1997); la genisteína de la soya (Wei et al., 2002), polifenoles como el resveratrol
de varios frutos rojos (Dong, 2003), son ejemplos de sustancias que poseen propiedades de
protección solar.

3.3. Género Jacaranda.
La familia Bignoniaceae perteneciente al orden Lamiales, comprende unos 120 géneros y 800
especies, creciendo principalmente en África y en la parte central y sur de América, se le conoce
como la familia de las vides trompeta (Spichiger et al., 2004). Las especies de esta familia se utilizan
para muchos fines como: la horticultura, plantas ornamentales, productos maderables, alimenticia,
para fabricar artesanías y colorantes y como medicinal (Gentry, 1992). Un ejemplo reconocido del
uso de algunas especies de esta familia, es el medicinal que se le atribuye a la corteza interior de
diversas especies de Tabebuia, principalmente T. impetigosa, llamado pau d'arco en Brasil, como un
analgésico, anti-inflamatorio, antineoplásico y diurético (de Miranda, et al., 2001).
Dentro de esta familia se encuentra el género Jacaranda, que su principal forma de vida es arbórea,
se utilizan como plantas ornamentales en todo el mundo debido a sus flores. Estudios fitoquímicos
previos indican que el género es una fuente de varios metabolitos secundarios, tales como:
glucósidos feniletanoides, flavonoides, quinonas, fitoesteroles y antocianinas (Fernández, 1968; Blatt
et al., 1998;).
En la medicina tradicional al género Jacaranda se le atribuyen varias actividadesen la prevención y
tratamiento de enfermedades. En Brasil, las hojas de J. caroba se consumen en forma de infusión
para el tratamiento de las enfermedades venéreas, como depurativo (Di Stati et al., 2002; Gachet y
Schühly, 2009; Brandão et al., 2012) y en baños para tratar infecciones generales (Di Stati et al.,
2002). Se ha reportado actividad diurética y astringente (Gavilanes y Brandão, 1992), antiulcerosa y
antisifilítica (Hirschmann y Arias, 1990). Además, el extracto de etanol se utiliza para la cicatrización
“Determinación de las propiedades fotoprotectoras de Jacaranda mimosifolia, usando como modelo
biológico a la levadura Saccharomyces cerevisiae” M.A.R.E.
Laboratorio de Fitoquímica. UBIPRO. FES-I, UNAM, 2016

de úlceras (Brandão et al., 2008; Gachet y Schühly, 2009) y el extracto hidroetanólico es un
componente fitosanitario, que es indicado para el tratamiento de la dispepsia (Botion et al., 2005).
Además, fueron evaluadas las actividades antirradical y anticolinesterolítica in vitro en diferentes
líneas celulares. En el extracto de diclorometano se han identificado los ácidos oleanólico y ursólico
(Endringer et al., 2010). Estudios recientes indican que esta especie es una fuente rica de ácidos
bioactivos y algunos derivados de flavonoides, con fuerte actividad antioxidante y anti-monoamino
oxidasas (MAO) (Ferreres et al., 2013), inhibiendo la reacción enzimática de las MAO que catalizan
la oxidación de monoaminas y la degradación de neurotransmisores y aminas, por ejemplo, la
serotonina y la noradrenalina (Evans y Hofmann, 1979). En Yanesha, Perú J. copaia es utilizada
para tratar la malaria. Se prepara un té de sus hojas, funciona como preventivo y con fines curativos,
además se puede aplicar como cataplasma ó en un baño de vapor para tratar heridas cutáneas. Ha
demostrado tener algunas propiedades leishmanicidas basándose en derivados de quinonas,
jacaranona y triterpenos (Chan-Bacab y Peña-Rodríguez, 2001).
En J. caucana se han identificado en un extracto metanólico de tallo feniletanoides, glicósidos y
neolignanos con actividad antioxidante (Martin et al., 2009). J. decurrens posee actividad
antioxidante, las propiedades fueron evaluadas gracias a la obtención de un extracto hidroalcohólico
de hojas, obteniendo los compuestos: ácido ursólico, ácido oleanólico, además una de las fracciones
resultó ser rica en glicósidos flavonoides (Carvalho et al., 2009)

3.4. Especie de estudio: Jacaranda mimosifolia.
Jacaranda en guaraní significa madera dura, mimosifolia se refiere a la similitud de sus hojas con
cierto tipo de leguminosas (Mimosa), en Argentina se le conoce como tarco, en Colombia como
guayacán o palo de boba y en Ecuador como arabisco (Gachet, 2008). Es un árbol sudamericano
que alcanza hasta los 20 metros de altura. Se le puede encontrar distribuida en toda Latinoamérica.
Incluso en la ciudad de México es utilizada con fines ornamentales, donde alcanza de 8 a 10 metros
de altura (Niembro A., 1990; CONABIO, 2012).
El tronco de J. mimosifolia es desnudo, (figura 2) recto y cilíndrico, a veces ligeramente inclinado, su
corteza es fracturada, de follaje semipersistente, hojas opuestas de color verde-medio en el haz y
más claro en el envés. De flores hermafroditas de 4‐5 cm de largo, de color azul-violáceo y cáliz
pequeño, tubulosas, ligeramente curvas, acampanadas, pubescentes, dispuestas en amplias
panojas terminales, erguidas de 24-30 cm de largo.

https://es.wikipedia.org/wiki/Monoamina
“Determinación de las propiedades fotoprotectoras de Jacaranda mimosifolia, usando como modelo
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La floración se produce de noviembre a diciembre, antes de la foliación y a veces tiene una segunda
floración, más escasa, hacia febrero en Sudamérica, mientras que la floración en Norteamérica es
en marzo. El fruto leñoso de J. mimosifolia es dehiscente, plano, en forma de castañuela, es
una cápsula loculicida de unos 6 cm de diámetro, orbicular y comprimida, de color verde que se
torna pardo oscuro cuando madura, con semillas aladas, que en guaraní se llama: ka-í jepopeté que
significa: aplauso de mono, en México se le conoce como: cachetada, los frutos aparecen a finales
de otoño y permanecen todo el año. La polinización es entomófila (Friesen, 2004).

Figura 2. Jacaranda mimosifolia. Sus diferentes estructuras vegetativas y reproductivas.
Fuente: sección Vecinos verdes: Árboles comunes de las ciudades, del sitio: Biodiversidad Mexicana de la Comisión
Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad.
http://www.biodiversidad.gob.mx/Difusion/cienciaCiudadana/aurbanos/ficha.php?item=Jacaranda%20mimosifolia
http://es.wikipedia.org/wiki/Fruto
http://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A1psula
http://es.wikipedia.org/wiki/Dehiscencia
http://es.wikipedia.org/wiki/Semilla
http://es.wikipedia.org/wiki/Idioma_guaran%C3%AD
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biológico a la levadura Saccharomyces cerevisiae” M.A.R.E.
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3.4.1. Usos tradicionales.

La decocción de la raíz de J. mimosifolia se emplea como diaforético. El jarabe de la raíz o la
infusión de hojas se utilizan especialmente contra las enfermedades venéreas y la forunculosis;
además, se usa contra las afecciones del hígado, las hemorroides, las várices, los eczemas e
impurezas de la sangre. La decocción de la corteza o de las raíces se utiliza en lavados para
cicatrizar úlceras, artritis, várices, varicela, llagas heridas y escrófulas (Muñoz, 1987; Cáceres,
1996). Por vía oral se usa para curar el paludismo, la sífilis, blenorragia, diarrea, dolor en los huesos,
reumatismo y artritis; en forma de gargarismos, para sanar las afecciones de la garganta, úlceras de
la boca, neuralgias, soriasis, sífilis, chancros y contra los helmintos (IARNA, 2011). Para regular el
ciclo menstrual, como diurético, antianémico y dolores de hueso. La decocción de las hojas o de la
corteza se utiliza contra úlceras y externamente se usa en lavados vaginales.
El polvo de las hojas secas, espolvoreando sobre las úlceras, se emplea como desinfectante de
heridas abiertas, llagas, para sanar afecciones de los riñones (Bogino y Gómez, 2006).
La infusión y tintura de flores, hojas y corteza se usa por vía oral para el tratamiento de disentería
amebiana y otras afecciones gastrointestinales agudas (Cáceres, 1996; Nicolas, 1999).

3.4.2. Usos evaluados científicamente.

El extracto de las hojas de J. mimosifolia resultó ser un potente antiséptico in vitro contra
Staphylococcus aureus y Neisseria gonorrheae. En casos de impétigo infantil, con el uso del
extracto en forma de ungüento, se observa la resolución total de la lesión en un lapso de 48 hrs. La
loción de jacaranda presenta actividad sobre el acné y se comporta como agente antitumoral
(Piñeros, 1988). Se le atribuye propiedad antiséptica, antiamebiana, antitumoral y espasmolítica
(Villareal et al., 1992).
Algunos de los compuestos que han sido reportados para esta Bignoniaceae son capaces de frenar
diversas afecciones de entre las cuales podemos mencionar forunculosis, afecciones del hígado,
várices, eczemas, cicatrización de heridas, enfermedades cutáneas, antiséptico, inhibiendo el
crecimiento de Staphylcoccus aureus (Acosta, 1992; Cáceres, 1996). El extracto de jacaranda se
usa también para afecciones de la piel tan severas como el acné (Cevallos, 2013). Además, a la
jacaranda se le atribuye propiedades antisépticas, antiamebianas, antitumorales y espasmolíticas
(Ramiro et al., 2007).
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Entre los compuestos que han sido identificados están (figura 3): Ácido jacarándico, jacaronona (1-
hidroxi-4-oxo-2,5-ciclohexandienil acetato de metilo), ácido jacoumárico, ácidoursólico y otras
sustancias flavonoides, grandes cantidades de taninos y un compuesto que le da la coloración a las
flores llamado: jacarandina (Lema, 2013).
Las flores contienen flavonoides: neohesperidósidos y glucósidos de apigenina, rutinósidos de
cianidina y glucósidos de delfinidina (Subramanian et al., 1972; Mahran et al., 1991). Las hojas y
ramas contienen fenoles, antocianinas, glucósidos de apigenina y escutelareina, quinoides, lignanos
y esteroides (espinasterona) (Scogin ,1980: Mahran et al., 1991). El estudio de los componentes
polares de las hojas condujo al aislamiento de una ciclohexanona (jacaranona), un glucósido
fenilpropanoide, verbascósido (acetósido) y un éster de glucosa: la jacaranosa (Cometa et al., 1993).
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Figura 3. Metabolitos secundarios identificados en el género Jacaranda. A. Jacaranona; B. Metil
jacarona; C. Hidroquinona; D. Ácido jacoumárico, E. Lupenona; F. β-Sitosterol; G. Ácido ursólico;
H. Ácido oleanólico. En rojo los compuestos que se ha reportado con actividad antioxidante.
O
HO
O
O-CH
R2
~
H
~
-
-
o
(
CH3
Y'
~
HO
H
. ~ OH
I
~
HO
H3C
• ~ ( O HO CH3 CH3
O
", OH
'::::: O
"'" CH
3
H3C
H3C
9H3
-
CH3
H
"
H3
CH3
OOH
H , .. '
H3C CH 3
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3.5. Extracto metanólico.
En el extracto metanólico de flor de J. mimosifolia es posible encontrar: fenoles, taninos, flavonoides
y glucósidos de antocianinas, que son grupos de metabolitos secundarios capaces de absorber la
luz UV y/o ser antioxidantes (Mahran et al., 1991)., sin embargo, muchos de ellos poseen
propiedades biológicas aún no estudiadas.
Los compuestos fenólicos, en particular, han demostrado prevenir el estrés oxidativo, y patologías
crónicas como el cáncer, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson (Asadi et al.,
2010; Sun et al., 2011). Los compuestos fenólicos también pueden modular las actividades de
enzimas y receptores, siendo considerados como drogas multi-objetivo (Zhang et al., 2006; Yi et al.,
2010). Además, los inhibidores de MAO, se utilizan para tratar la depresión, y a superar la
disminución de monoaminas como la serotonina, la noradrenalina y adrenalina (Youdim et al., 2006;
Shih et al., 2009).

3.6. Modelo biológico de estudio: Saccharomyces cerevisiae.
Para evaluar sustancias fotoprotectoras se han utilizado diferentes modelos biológicos, sin embargo,
algunos de ellos son costosos (cepas de ratones: Koshiishi y colaboradores 2000; Hollands-Barca y
colaboradores en 2003; Konger y colaboradores en 2016), en otros modelos se necesitan periodos
largos de observación (cultivos con diferentes líneas celulares: fibroblastos HSG8 de piel humana
por Park y Bae en 2013; queratinocitos por Schütz y colaboradores en 2013), y algunos
microrganismos usados son patógenos para el ser humano (en E. coli, Prada-Medina y
colaboradores en 2016). Por esta situación dentro del estudio de sustancias fotoprotectoras, ante los
pocos y caros modelos de protección contra la RUV, es necesario estudiar alternativas
económicamente atractivas para evaluar sustancias fotoprotectoras.
Las levaduras son células esféricas u ovales unicelulares (figuras 4), con un diámetro de 3 a 5 μm
aproximadamente. Son organismos eucariontes, la estructura principal macromolecular de la pared
celular es la quitina, constituida por moléculas de N-acetil-glucosamina unidas entre sí como las de
glucosa en la celulosa, por enlaces β-1,4 glucosídicos (Davis et al., 1984). El crecimiento de las
levaduras se produce por un proceso de gemación, en el que la célula hija se separa de la célula
madre tan pronto como ha madurado (haploide), sin embargo, también posee reproducción sexual
(diploide), (figura 5). En cuanto a la alimentación de S. cerervisiae, los requerimientos nutritivos son
simples y pueden prepararse fácilmente los medios de cultivo adecuados (Brock, 1978).

S. cerevisiae, es una levadura capaz de crecer en medios definidos simples, lo que permite el
completo control de su fisiología. Las características de su ciclo celular vegetativo, como es la
coexistencia de los estados haploides y diploides, así como la existencia de dos tipos sexuales de
células haploides: a y α, facilitan los estudios genéticos, y permiten determinar el efecto de la ploidía
y del tipo celular en la acción génica. Además, el desarrollo de herramientas genéticas muy
eficientes, que permiten que cualquier gen sea reemplazado por un alelo mutante o sea
completamente escindido del genoma con gran exactitud (Rothstein, 1983; Guldener et al., 1996),
facilita los estudios genéticos en este organismo eucariótico.

Figura 4. Fotografía del ciclo celular de Saccharomyces cerevisiae, microscopia de barrido.
Tomado de: Eye of Science / Science Photo Library.
http://www.microbiologyonline.org.uk/about-microbiology/introducing-microbes/fungi

Reproducción
asexual
Reproducción
asexual
Haploide
Diploide
Haploide
Germinación
Fusión celular
Fusión celular
Apareamiento de
tipos opuestos
Ascósporas
Asca
Meiosis
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biológico a la levadura Saccharomyces cerevisiae” M.A.R.E.
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S. cerevisiae ha sido ampliamente utilizado por los seres humanos desde hace miles de años y es
posiblemente una de las especies microbianas más importantes en la historia de la humanidad
(Chambers et al. 2010). Esta relación se debe a un solo rasgo: su capacidad para producir alcohol a
partir del azúcar. También es útil para aumentar el volumen del pan, la producción de combustible y
de proteína. La demanda de bebidas alcohólicas motivó a Pasteur en 1897, y la investigación de los
Laboratorios Carlsberg (Hansen, 1896) al estudio científico de la levadura. Desde entonces S.
cerevisiae ha logrado una segunda distinción: es el organismo que se usa como modelo genético
mejor entendido (Chambers et al., 2010).
S. cerevisiae fue el primer eucariota en tener su genoma completamente secuenciado, y por lo tanto
es el modelo biológico más estudiado, más manejable a manipulaciones y análisis genéticos
(Cherry, 2011). Diversos proyectos han determinado las funciones biológicas y las interacciones
genéticas de todas las partes del genoma de S. cerevisiae (Kelly et al., 2001; Boone, 2014). S.
cerevisiae ha sido clave para numerosos avances importantes en la genética, la bioquímica y la
biología celular (Chambers et al., 2010).
Debido a lo anterior, en este trabajo se propone a la levadura S. cerevisiae como nuevo modelo
biológico para evaluar compuestos con una posible actividad fotoquimioprotectora, tiene la ventaja
de que se pueden obtener varias generaciones en relativamente poco tiempo, además es posible
estudiaren esta levadura las alteraciones a nivel genético causado por la radiación ultravioleta, es
un modelo económicamente barato y no es patógeno para el ser humano.

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biológico a la levadura Saccharomyces cerevisiae” M.A.R.E.
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Justificación
La radiación solar es esencial para el hombre, sin embargo, la exposición prolongada a la RUV-B
produce efectos adversos en cualquier organismo. En la piel humana causa inflamación, eritema,
inmunosupresión, fotoenvejecimiento y cáncer de piel. Actualmente se tiene conocimiento sobre
estos padecimientos y por lo tanto de la importancia de la fotoprotección. Un gran número de
personas continúan exponiéndose excesivamente a estas radiaciones sin protección alguna; aunado
a ésto, la disminución de la capa de ozono estratosférico provoca una mayor incidencia de radiación
sobre la Tierra, lo que puede representar un riesgo para la salud. En los próximos años se espera
que el cáncer de piel se incremente de manera significativa, por tal motivo existe la necesidad de
encontrar sustancias que contenga compuestos químicos capaces de disminuir los efectos adversos
de la RUV-B. En ese sentido, el extracto metanólico de flor de J. mimosifolia puede contener
compuestos químicos que en su estructura molecular posean zonas cromóforas a la luz UV-B y con
posible actividad antioxidante.
Es posible que la levadura sea capaz de crecer en un medio de cultivo cuya única fuente de carbono
sea el extracto metanólico de flor de J. mimosifolia. Los compuestos que se encuentran en el
extracto probablemente están constituidos de anillos aromáticos (Subramanian et al., 1972), como:
fenoles simples, flavonoides (Scogin ,1980), glucósidos aromáticos, antocianinas, quinoides y
esteroides (Mahran et al., 1991), y la jacaranona, que es un éster de glucosídico de p-hidroxiquinona
(Cometa et al., 1993).
Por lo tanto, nuestras preguntas científicas son: ¿Jacaranda mimosifolia posee propiedades
fotoprotectoras? y ¿Éstas se pueden determinar usando S. cerevisiae como modelo biológico?

Hipótesis
El extracto metanólico de flor de Jacaranda mimosifolia posee sustancias fotoquimioprotectoras que
se pueden evaluar en el modelo biológico de la levadura Saccharomyces cerevisiae.
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biológico a la levadura Saccharomyces cerevisiae” M.A.R.E.
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Objetivos
6.1. Objetivo general.
Evaluar las propiedades fotoprotectoras del extracto metánolico de la flor de Jacaranda mimosifolia
usando a Saccharomyces cerevisiae, como modelo biológico.

6.2. Objetivos particulares.
A. Obtener el extracto metanólico de la flor de J. mimosifolia.
B. Obtener las cinéticas de crecimiento de S. cerevisiae en diferentes medios de cultivo para
ser usados en pruebas de desafío.
C. Determinar si S. cerevisiae es capaz de crecer en un medio de cultivo cuya única fuente de
carbono es el extracto metanólico de J. mimosifolia.
D. Evaluar el efecto fotoprotecor del extracto de J. mimosifolia en S. cerevisiae expuesta a
RUV-B.

E. Determinar el efecto fotoprotecor del extracto de J. mimosifolia por medio de la expresión
diferencial de proteínas, entre los diferentes experimentos de exposición a la RUV-B.
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Estrategia experimental
Figura 6. Diagrama metodológico

Figura 8. GreenBeats.org
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Etapa 1

7.1.1. Obtención del material vegetal.
Las flores se recolectaron en el mes de febrero, en las instalaciones de la Facultad de Estudios
Superiores Iztacala de la Universidad Nacional Autónoma de México. Un ejemplar con hojas, flores y
frutos se recolectó para su identificación en el herbario de la FES-I, UNAM, al cual se le asignó el
número de registro: 2484 IZTA.

7.1.2. Obtención del extracto metanólico de flor.
Las flores (1 Kg) fueron recolectadas se limpiaron y se maceraron en metanol (CH₃OH). La solución
se filtró y posteriormente se destiló a presión reducida, en un rotavapor Heidolph a una temperatura
de 60°C y a una velocidad de 60 rpm, se recuperó el destilado para después calcular el rendimiento
del extracto.

7.1.3. Espectro de absorción del extracto metanólico.
Para obtener el espectro de absorción en la región del ultravioleta, se tomaron 50 μg de extracto
metanólico de flor que fue disuelto en 1 mL de CH₃OH, el barrido se realizó a partir de 190 a 350 nm
en un espectrómetro PerkinElmer Lambda 25 UV/VIS, a una longitud de onda de 190 a 350 nm.

7.1.4. Obtención del cultivo axénico.
El inóculo inicial de S. cerevisiae fue aislado a partir de levadura usada para la producción de pan
por el Maestro en Microbiología Andrés Martínez Cortés del laboratorio de Fitoquímica de la FES-
Iztacala. La resiembra fue realizada de acuerdo a la técnica de estría cruzada (figura 7), en agar de
dextrosa y papa (PDA). Ya reactivado el cultivo, se hizo crecer en medio líquido Sabouraud. Se
prepararon muestras para realizar una observación al microscopio óptico y comprobar la pureza del
cultivo (figura 7).
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7.1.5. Cinética de crecimiento en medio líquido.

Una vez asegurada la pureza del cultivo de S. cerevisiae se procedió a la evaluación del
crecimiento. Para obtener la cinética de crecimiento de la población de levaduras, el cultivo de S.
cerevisiae se mantuvo dentro de una incubadora en medio líquido Sabouraud a 30°C durante 20
horas. Las mediciones se realizaron a las 0, 4, 8, 12, 14, 16, 18 y 20 horas de crecimiento, utilizando
un tubo estéril con medio líquido Sabouraud como tubo blanco. A partir de las 10 horas de haber
realizado la siembra, se comprobó el crecimiento mediante turbidimetría usando un
espectrofotómetro Coleman a una longitud de onda de 600 nm.
Figura 7. Esquema de la obtención de S. cerevisiae en cultivo axénico
en PDA y su observación al microscopio óptico.
Inóculo inicial
segundo grupo
de estrías
cuarto grupo de
estrías
tercer grupo de
estrías
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7.1.6. Cinética de crecimiento en medio sólido.

7.1.6.1. Preparación del inóculo.
Para determinar la cinética de crecimiento de la levadura, se utilizó la técnica de dilución (Toro C.,
2005., Davis, 1984). El inóculo inicial se preparó haciendo crecer la levadura en medio líduido
durante 16 horas, el cultivo se centrifugó a 3500 rpm durante 3 minutos, se eliminó el sobrenadante
y la pastilla se suspendió en 10 ml de solución salina fisiológica (SSF). Se cuantificaron los
sobrevivientes realizando 3 diluciones: con tubos tipo falcon para centrifuga de 15 ml donde se
resuspendieron las pastillas, se aseguró la perfecta homogeneización con SSF, se tomó 100 µl y se
vertieron en otro tubo tipo falcon con 10 ml de SSF estéril (1ra. dilución), y de esté se tomaron otros
100 µl (2da. dilución) para otro tubo tipo falcon con 10 ml de SSF estéril y de éste último se tomaron
100µl (3ra. dilución) para realizar la resiembra en PDA. (figura 8), que se incubaron a 30°C durante
16 y posteriormente contar las Unidades Formadoras de Colonia (UFC).
7.1.6.2. Cinética de crecimiento.
Las diluciones de S. cerevisiae se realizaron hasta las 20 horas de crecimiento en intervalos de 2
horas (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20 horas). Se resembraron 100 μl con asas de siembra de
vidrio esterilizadas con un mechero, para homogeneizar cada una de las cajas petri con PDA, tres
cajas por tiempo de crecimiento. Las cajas se mantuvieron en incubación a 30°C durante 24hrs.
Después se realizaron el conteo de las placas y las gráficas del crecimiento.
En muchos casos se cuentan las células vivas y esto suele hacerse mediante el recuento de células
viables. Una célula se define como viable cuando colocada en un medio adecuado, es capaz de
dividirse y dar descendencia. El método habitual de lograr esto es sembrar pequeñas alícuotas de
diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio sólido. Cada célula
viable dará origen a una colonia visible después del tiempo adecuado de incubación. Contando las
colonias visibles y teniendo en cuenta la dilución de la que proceden, así como el volumen de
alícuota utilizado, es fácil deducir el número de células viables en la suspensión original. El recuento
se refiere no a número de células viables reales sino a unidades formadoras de colonia (UFC). Por
lo tanto, una UFC corresponde, como mínimo, a una levadura, pero sobre todo una levadura con
agrupaciones, la medida por siembra en placa infravalora el número real de individuos, porque cada
UFC puede corresponder a dos o más individuos que estaban juntos al ser sembrados en la placa.

Figura 8. Crecimiento de S. cerevisiae en medio sólido, mostrando la técnica de dilución.
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Etapa 2
S. cerevisiae expuesta a UV-B.

7.2.1. Experimentos de desafío.
Una vez establecido el tiempo de incubación necesario para que la población de levaduras
alcanzará la fase exponencial, se procedió a planear los experimentos para la evaluación de las
propiedades fotoprotectoras del extracto metanólico de flor de J. mimosifolia. Esta etapa del
proyecto consta de 4 experimentos de desafío (figura 10).
A. El primer experimento fue exponer a S. cerevisiae a RUV-B sin protección.
B. El segundo experimento fue irradiar a la levadura con una protección física, utilizando el
extracto de J. mimosifolia como barrera.
C. Para el tercer experimento se preparó un medio de cultivo utilizando el extracto metanólico
como fuente de carbono para el cultivo de S. cerevisiae, para que la levadura pueda crecer
en éste, determinando si los metabolitos presentes en el extracto pudieran proteger a nivel
metabólico contra el daño por RUV-B.
D. Y por último, se hizo un experimento para determinar la protección combinada, tanto a nivel
físico como a nivel metabólico, en este caso el extracto se utilizó como barrera física y como
medio de cultivo.

Figura 9. Esquemas de experimentos de desafío: 1. Experimento sin protección a irradiación UV-B; 2. Experimento
con barrera física. 3. Experimento con barrera metabólica; 4. Experimento con barrera física y metabólica.
1. Exposición a RUV-B sin
protección.

3. Exposición a RUV-B con
protección metabólica.

2. Exposición a RUV-B
con protección física.

7.2.2. Experimento de irradiación con UV-B sin protección.
El inóculo de la población de levaduras en fase exponencial se centrifugó a 3500 rpm durante 3
minutos, se eliminó el sobrenadante y la pastilla se resuspendió con SSF. Los tiempos de irradiación
fueron: 30, 60, 90, 120, 150, 180 y 210 segundos. En cada tiempo de irradiación se colocaron cada
una de las unidades experimentales, constituidas por 2 cubetas de cuarzo una con CH₃OH y otra
con las células de levadura en 2 ml de SSF, ambas cubetas se fijaron para evitar algún movimiento,
primero se colocó la cubeta que contenía CH₃OH de cara a lámpara de UV-B y detrás de ésta, la
cubeta con levaduras (figura 9.1). Las cubetas se irradiaron a una distancia de 15 cm de la lámpara
de luz UV-B, la dosis utilizada fue de 0.88 J/cm², la cual se determinó con un radiómetro Spectroline
DM-300HA (figura 10).
En cada tiempo de irradiación se cuantificaron los sobrevivientes realizando 3 diluciones en SSF,
(de manera similar a la manera mencionada en el apartado 1.F). Después se realizó el conteo de
placa para obtener el número de sobrevivientes y con estos datos construir las gráficas del
experimento, para obtener las constantes de mortalidad (K) de S. cerevisiae expuesta a RUV-B.

Figura 10. Diagrama ejemplificando el experimento de la cinética de muerte de S. cerevisiae
por exposición a la RUV-B.
Cultivo
axénico de
s. cerevisiae
Cultivo en
matraz estéril
30° C
x16 hrs
Incubar a 30°C
x 24hrs
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7.2.3. Protección física.
En el primer experimento de protección se utilizó el extracto metanólico de J. mimosifolia como
barrera física en contra de la irradiación por UV-B. Con el inóculo de 16 horas se procedió a
centrifugar a 3500 rpm durante 3 minutos, se eliminó el sobrenadante y la pastilla se resuspendió
con SSF.
El experimento de protección física consta de 8 tiempos de irradiación: 15, 30, 60, 90, 120, 210
segundos, 90 y 180 minutos. El extracto de J. mimosifolia se disolvió 2 mg/mL en metanol para
obtener la solución fotoprotectora. Primero se colocó la cubeta que contenía la solución
fotoprotectora de cara a lámpara de UV-B y detrás de esta, la cubeta con SSF con levaduras en
crecimiento exponencial (Figura 9. 2.) Cuantificando sobrevivientes y obteniendo las K.

7.2.4. Protección a nivel metabólico.

7.2.4.1 Adaptación de S. cerevisiae al extracto de J. mimosifolia.
Para que S. cerevisiae pueda crecer en un medio de cultivo cuya única fuente de carbono sea el
extracto metanólico de J. mimosifolia, se realizaron distintas resiembras de la levadura en
diferentes medios con el propósito de activar metabólicamente a la levadura y conseguir su
adaptación al extracto de J. mimosifolia. A partir de una población de S. cerevisiae en fase
exponencial en medio solido:
 Se resembró en cajas con agar bacteriológico y extracto de J. mimosifolia (39 g/L) como
fuente de carbono, dejando incubar a 30°C durante 16 horas.
 Resiembra de colonias aisladas e inoculación en extracto de J. mimosifolia a una
concentración de 1 g/L disuelto con SSF,dejando incubar a 30°C durante 32 horas.
7.2.4.2. S. cerevisiae cultivada en extracto y expuesta a RUV-B.
Cuando la población de levaduras que creció en contacto con el extracto alcanzó la fase
exponencial, se centrifugó a 3500 rpm durante 3 minutos, el sobrenadante constituido por extracto
de J. mimosifolia y amortiguador se decantó, la pastilla se resuspendió con SSF, procediendo a
irradiar con UV-B la levadura adaptada metabólicamente al extracto metanólico de J. mimosifolia.

Éste experimento constó de 8 tiempos de irradiación: 1.5, 3, 4.5, 7.5, 12, 15, 24 y 30 minutos.
Colocando dos cubetas por tiempo de exposición a la RUV-B. La primera cubeta contenía CH₃OH y
detrás de esta la cubeta con las levaduras (figura 9.3). Repitiendo el proceso de los anteriores
experimentos: conteo de placa, obtención del logaritmo de sobrevivientes y la gráfica del
experimento.
7.2.5. Protección a nivel físico-metabólico.

Se realizó un cuarto experimento donde S. cerevisiae se irradió con protección contra la RUV-B. Las
levaduras fueron cultivadas en un medio cuya única fuente de carbono fue el extracto de flor de J.
mimosifolia, además de utilizar el extracto como barrera física durante la exposición a la RUV-B
(figura 9.4). Las condiciones de cultivo de la levadura en el extracto son similares a las del apartado
anterior 2. D. La solución fotoprotectora se elaboró de acuerdo al apartado 2. C. Se llevó a cabo el
conteo de placa correspondiente, de acuerdo a lo realizado a los tres anteriores experimentos de
desafío.
7.2.6. Análisis y recuperación de material biológico irradiado.
Después de cada uno de los experimentos de desafío se realizó el conteo de placa y se
construyeron las gráficas de cada uno de los experimentos, obteniendo las líneas de tendencia y los
logaritmos de UFC (Unidades Formadoras de Colonia) que indicán un número aproximado del
número de sobrevivientes para cada uno de los experimentos en cada tiempo de irradiación.
Además, se realizaron gráficas de dispersión con los datos de todos los experimentos de desafío
omitiendo aquellos tiempos de exposición a la RUVB en que la levadura no sobrevive a la
exposición, para obtener las constantes de mortalidad de cada uno de los desafíos.
Utilizando como criterio de elección el número de UFC que sobrevivieron a la irradiación en cada
tiempo, se establecieron los tiempos adecuados para recuperar suficiente material celular y obtener
las proteínas de levaduras irradiadas.
Del experimento con protección física se recuperaron las células irradiadas a los 90, 210 segundos,
180 y 210 minutos, mientras que del experimento sin protección se recuperaron a los 90, 180 y 210
segundos. Una vez establecidos los tiempos adecuados de irradiación se procedió a recuperar el
material biológico para comparar los distintos experimentos. Para el control negativo, se utilizaron
resiembras de S. cerevisiae con crecimiento exponencial en medio sólido PDA. En este grupo
experimental la levadura no está expuesta a la RUV-B y crece en condiciones ideales.
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Etapa 3
Para todas las pruebas de desafío incluyendo controles negativos, se recuperaron las células para
su posterior análisis con diferentes técnicas de extracción de proteínas y así evaluar una posible
expresión diferencial de éstas proteínas por exposición a la RUV-B.
Concluyendo el experimento de irradiación, se procedió a recuperar el material expuesto a RUV-B
de las cubetas de cada uno de los tiempos de irradiación en un tubo tipo falcón de 15 mL estéril,
después se centrifugó y se decantó el sobrenadante, una vez obtenida la pastilla está se recuperó
en tubos Eppendorf de 1.5 mL estériles con micropipeta y puntas estériles. Cada tubo se sumergió
en una cuba con nitrógeno líquido, durante 30 segundos, repitiendo el proceso 2 veces. Se
almacenó inmediatamente en un congelador REV-CO a -74°C para su posterior uso en la extracción
de proteínas.
Para la extracción de proteínas se utilizó el buffer RIPA, la mezcla de reactivos tiene un
amortiguador que permite la lisis celular y la solubilización de proteínas eficientemente, evitando su
degradación y la interferencia con la inmunorreactividad de las proteínas y actividad biológica. La
fórmula del buffer RIPA es: 10 mM Tris-Cl (pH 8-0), 1mM EDTA, 0.1% SDS, 140 mM NaCl, 1 mM
fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) según Sigma-Aldrich Co. LLC en 2015.
Características del buffer RIPA:
 Práctico: listo para usar la solución; no hay necesidad de montar y preparar
componentes.
 Flexible: compatible con muchas aplicaciones, incluyendo ensayos de proteína,
inmunoensayos y purificación de proteínas.
 Versátil: permite la extracción de citoplasmática, membrana y proteínas nucleares.
 Se describe la formulación proporcionando a los usuarios un control completo y el
conocimiento de los posibles problemas de compatibilidad.

7.3.1. Extracción de proteínas.
La extracción de proteínas se realizó siguiendo los siguientes pasos: a cada uno de los tubos
Eppendorf de 1.5 mL con células de S. cerevisiae, se le agregó amortiguador RIPA a una proporción
de 1:5 p/v de acuerdo al contenido de cada uno de los tubos. Se procesaron las muestras de
irradiación con protección física, irradiación sin protección y 2 controles negativos en donde la
levadura creció en condiciones ideales y sin exposición a RUV-B. Después de agregar RIPA a cada
uno de los tubos Eppendorf, se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 20 min y después
se centrifugaron a 10 000 rpm por 20 min, se recuperó el sobrenadante en tubos Eppedorf de 1.5
mL estériles.
Se llevó a cabo una cuantificación de proteínas por el método de Bradford, la curva patrón se
construyó de acuerdo a la siguiente tabla (tabla 2), se medió ABS con un espectrofotómetro Perkin
Elmer Lambda 1.1 a 595 nm.

7.3.2. Electroforesis.
Para realizar una comparación de posibles expresiones diferenciales de proteínas se realizó una
electroforesis con gel de poliacrilamida al 12% en una caja de electroforesis Mini Protean Bio-Rad,
con una fuente de poder Bio-Rad Power Pac 300 a 120 V, 40 mA durante 3 horas, en cada uno de
los pocillos destinados a cada uno de las muestras, se cargaron un total de 20 µL de muestra en
cada pozo, 5 µL son amortiguador de carga, el Marcador de Peso Molecular (MPM) fue de la marca
BenchMark™ elaborado por Thermo Fisher Scientific Inc en 2014, los geles fueron tenidos con
tinción de azul de coomassie.

TUBO
Reactivo (mL) 1 2 3 4 5 6 7
Bradford 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
BSA (100 µg/mL) 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0
Agua destilada 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.5
Muestra problema 0 0 0 0 0 0 0.01
Tabla 2. Preparación de la curva patrón para la cuantificación de proteínas.
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7.3.2.1 Análisis de expresión diferencial de proteínas.
Terminada la separación de proteínas en la electroforesis, se tomaron fotografías y realizó la
preservación de los geles en papel celofán dulce, para su posterior digitalización. Se hizo la
estimación de los pesos molecularesen kiloDaltones (kDa) de las bandas de interés. Para esto se
revelarón y se representaron las bandas por la movilidad (distancia avanzada o, mejor, cociente
entre ésta y el avance del frente de electroforesis) frente al logaritmo del tamaño (kDa), sobre la
recta ajustada se interpolan las distancias de avance de las muestras problema, calculando así su
tamaño en kDa (G-Biosciences, 2014).
Para determinar posibles proteínas presentes y/o ausentes, se realizó un análisis comparativo de
cada uno de los experimentos, así como de los valores de intensidad, realizando comparación entre
ellos con ayuda del software ImageJ. Es un programa Java de procesamiento de imágenes de
dominio público inspirado por el NIH Image para Macintosh. Puede mostrar, editar, analizar,
procesar, guardar e imprimir 8 bits, imágenes de 16 bits y 32 bits. Puede leer muchos formatos de
imagen, incluyendo TIFF, GIF, JPEG, BMP, DICOM, FITS y "crudo". Calcula el área y el valor de
píxel estadísticas de selecciones definidas por el usuario. Puede medir distancias y ángulos. Se
puede crear histogramas de densidad y perfil de línea. Es compatible con las funciones estándar de
procesamiento de imágenes como la manipulación de contraste, nitidez, suavizado, detección de
bordes y el filtrado de la mediana, hace transformaciones geométricas como escalado, rotación y
volteretas. La imagen puede ser ampliada hasta 32:1 y hasta 1:32.
Figura 11. Diagrama de cámara de electroforesis. Posición de cargas eléctricas
(cátodo - y ánodo +). Aplicación y desplazamiento de muestras en los pocillos.
Carga de las muestras en los
pocillos empleando micropipeta. Cátodo
Pocillos donde se aplican las muestras.
Ánodo

Cátodo
Ánodo
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Resultados y discusión
Etapa 1
8.1.1. Rendimiento del extracto.
Se recolectaron 1 Kg de flores de J. mimosifolia. El rendimiento del extracto fue de 10 % de sólidos,
esto para un extracto metanólico es un rendimiento alto. Este resultado es similar para extractos de
otras flores, que por lo general son ricos en glicósidos y antocianinas (Subramanian et al., 1972;
Camacho, 2001).
8.1.2. Espectro de absorción en la región UV-B del extracto metanólico de flor de J.
mimosifolia.
El extracto metanólico de flor de J. mimosifolia mostró una absorción continúa desde 210 nm hasta
350 nm en el barrido realizado en el espectrómetro (gráfica 1). De acuerdo a esta medición, el
extracto mostró una absorción de luz que abarca la zona de UV-A, UV-B y UV-C los máximos de
absorción están localizados a los 233, 270 y 330 nm.

Gráfica 1: Espectro de absorción del extracto metanólico de flor de J. mimosifolia.

La lámpara que se utiliza para los experimentos de desafío irradia con una longitud de onda principal
de 312 nm, ésta longitud de onda se encuentra en la región B del ultravioleta, dos de los picos
máximos de absorción (270 y 330 nm) están cerca de la longitud de esta región. Debido a ello, se
considera que el extracto metanólico tiene absorción en la zona de la RUV-B y puede evaluarse la
actividad fotoprotectora.

8.1.3. Cultivo axénico de S. cerevisiae.
La observación e identificación de un cultivo puro de S. cerevisiae fue realizada satisfactoriamente.
Para asegurar las condiciones de pureza del cultivo de S. cerevisiae se hicieron varias resiembras
por estría cruzada en cajas con medio PDA y en medio líquido Sabouraud. Los cultivos celulares de
S. cerevisiae en PDA, se observaron al microscopio óptico.

8.1.4. Crecimiento de S. cerevisiae.
La población de levaduras a las 16 horas de haber realizado la siembra en medio líquido Sabouraud
y con una incubación 30°C se encuentra en fase exponencial. Se realizó una comprobación por
turbidimetría óptica, obteniendo 0.3 de absorbancia (gráfica 2). La base de estos métodos, consiste
en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo microbiano. Las
suspensiones microbianas dispersan la luz, al igual que cualquier partícula pequeña suspendida en
agua (efecto Tyndall). La dispersión de la luz es proporcional a la masa del cultivo (Davis, 1984).
Para los experimentos de fotoprotección, se requiere que la población de S. cerevisiae se encuentre
en fase exponencial tanto para alcanzar un volumen celular adecuado como para asegurar que la
levadura esta metabólicamente activa. Esto puede determinarse mejor gráficamente, obteniendo la
certeza de que a través de un número de generaciones se produce una línea recta cuando el
logaritmo de la masa celular se representa gráficamente en función del tiempo (Davis, 1984).

8.1.5. Conteo de placa.
A las 16 horas de crecimiento, la población de levadura se encuentra en fase exponencial (gráfica
3). El crecimiento poblacional muestra un aumento significativo de UFC, pero a las 18 horas la
población de las levaduras deja de crecer.
En la cinética de crecimiento el logaritmo de las UFC decayó casi 3 órdenes de magnitud a las 18
horas de incubación, estableciendo este tiempo como en el que la levadura entra en fase
estacionaria (gráfica 3). Este experimento confirmó la primera cinética, el cual fue medido a través
de espectrofotometría (gráfica 2). En ambas cinéticas, la levadura se encuentra en fase exponencial
a las 16 horas.
En un recipiente de cultivo cerrado una población no puede crecer indefinidamente a ritmo
exponencial. La limitación de la reproducción se produce porque se agota el suministro de un
nutriente esencial o porque se acumula algún producto metabólico tóxico. El periodo durante el cual
cesa el crecimiento de una población se denomina fase estacionaria (Davis, 1984).

Gráfica 2: Cinética de crecimiento: muestra el crecimiento de S. cerevisiae de acuerdo a las
mediciones hechas con un espectrofotómetro Coleman a 600 nm.
Tiempo de crecimiento (horas)
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Etapa 2
8.2.1. Experimentos de desafío con y sin protección a la RUV-B.
Para llevar a cabo este proyecto se planificaron y estandarizaron 4 experimentos de desafío con
exposición a la RUV-B. Cada uno de ellos se realizó con repeticiones (de 3 a 5) para asegurar la
reproducibilidad y la significancia, así como para reducir la variabilidad de los resultados. Además de
tener el suficiente material biológico irradiado para el análisis y comparación del efecto fotoprotector
a nivel molecular en las proteínas de las levaduras de cada uno de los experimentos de desafío.

0.5
1.2
3.6
5.98
7.8
8.8
9.53
10.14
10.94
7.65
7.04
0
2
4
6
8
10
12
14
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
L
o
g
d
e
U
F
C
/m
l
Tiempo de crecimiento (horas)
Gráfica 3: Cinética de crecimiento: número de organismos en fase exponencial
de S. cerevisiae en conteo de UFC.
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Laboratorio