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Aprendiendo Biologia

23/7/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA
CAMPUS II

TESIS

DETERMINAR EL EFECTO BACTERICIDA DE UNA SOLUCIÓN DE
NANOPARTÍCULAS DE PLATA

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

P R E S E N T AN
REMEDIOS ANA LILIA ANTÓN MANDUJANO
OSCAR JAVIER RAMIREZ RUIZ

ASESORES:
DIRECTORA: Q.F.B. ESPERANZA JIMÉNEZ CASTAÑEDA
ASESORA: MTRA. MARÍA DEL ROSARIO BENÍTEZ VELÁZQUEZ

Ciudad de México a 14 de Marzo del 2016

http://www.google.com.mx/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjIxc2Pvp_JAhXBPz4KHUWGBuAQjRwIBw&url=http://www.ingenieria.unam.mx/paginas/galeriaEscudos.htm&psig=AFQjCNEM2GqXX9PVnIxRfFXcw8yCcdQtIA&ust=1448125467024685

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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

A mis Padres Yolanda Y Alejandro.
Por creer en mí y darme la oportunidad de
realizar este sueño, no importándoles
desvelos, y siempre estar a mi lado.
Ahora se que con dedicación y esmero se
logra una meta tan soñada para ellos y mía,
ver a sus hijos crecer y cumplir sus metas.
Para ellos toda mi admiración y respeto
porque no les importo nada, solo apoyarnos
y nunca hubo imposibles para ellos.
Dejándonos un gran legado siempre seguir
adelante nunca te detengas, todo lo puedes
lograr.
Doy gracias a Dios por darme estos padres.
Los quiero mucho y este triunfo es de
ustedes
.
Para mis hermanos Claudia, Gris, Alex,
Armando
Gracias por estar siempre a mi lado en las
buenas y malas siempre unidos, procurando
ayudarnos y no soltarnos de la mano.
Hoy logramos unidos una meta mas, gracias
por se parte de este hermoso sueño por
estar siempre dispuestos apoyando.
Los quiero mucho.
A mis sobrinos Carlos, Omar Dany, Beto,
Eve, Mia, Naty, Miguel, Isa, Eithan (mi
gran guerrero gracias por enseñarme a
luchar), la güerita y los que me faltan. a
todos ellos gracias por estar compartiendo
este triunfo y apoyo.
Cada uno tiene una historia y se que al igual
que yo ellos también llegaran a la meta.

A mis cuñadas (os) y esposas de mis
sobrinos
Gracias por estar compartiendo este logro,
que también es de ustedes por pertenecer a
esta gran familia que formamos todos y por
darme la dicha tan grande de ser tía y
amiga de sus hijos.

A mis asesores Q.F.B. Esperanza y Mtra.
Maria del Rosario
Por confiar en nosotros y darnos la
oportunidad de realizar este sueño y por su
apoyo

A mis profesores en especial Magdalena
Ordoñez, Mauro Arrieta, prefiero no
seguirlos nombrando para no omitir algún
nombre ya que todos para mi tienen un
valor incalculable gracias por el apoyo
brindado, confianza y conocimientos, mi
admiración y respeto para cada uno, gracias
por no ser solo mi profesor sino unos
grandes “AMIGOS”, Siempre dando lo
mejor de ustedes sin recibir nada a
cambio.
A mis sinodales Mtra. Dora Alicia Pérez
Gonzalez, M en C. Maria Teresa Griselda
y Q.F.B. José Oscar Gonzalez Moreno.
Por apoyarme revisando este trabajo y
enriquecerlo con sus conocimientos que
fueron de gran ayuda.

A mis amigos, compañeros.
Gracias mi mas profundo agradecimiento
para cada uno de ustedes, nunca me
dejaron sola siempre tendiéndome la mano
y estando a mi lado para no desistir, a todos
ustedes muchas gracias perdón por omitir
los nombres.

A todos las personas que no nombre.
Gracias a todas ellas por haber colaborado
en la elaboración de nuestro proyecto,
quedo inmensamente agradecida por su
apoyo, dedicación y conocimientos
compartidos, durante el proceso de la
misma, a todos ustedes muchas gracias.

A mis Padres Margarita y Gustavo que
en paz descanse.
Por darme todo lo que se le puede dar a un
hijo sin ustedes yo no sería la persona que
soy en este momento, gracias por cuidar de
mí y confiar en mí nunca podre dejar de
agradecerles todo, a ti madre que me
acompañas en las buenas y en las malas
apoyándome y a ti padre que
lamentablemente ya no te encuentras con
nosotros les dedico esta pequeña parte de
mi vida.

A mi hermana
Que siempre me apoya aunque no me lo
diga directamente, siempre me ayuda en lo
que puede y que tengo la bendición de
haber compartido gran parte de mi vida con
ella.
A mi esposa
Que siempre está conmigo en las buenas y
en las malas que me consuela cuando las
cosas fallan y me da su cariño incondicional

A mis asesores Q.F.B. Esperanza y Mtra.
Maria del Rosario
Por confiar en nosotros y darnos la
oportunidad de realizar este sueño y por su
apoyo
A mis sinodales Mtra. Dora Alicia Pérez
Gonzalez, M en C. Maria Teresa Griselda
y Q.F.B. José Oscar Gonzalez Moreno.
Por ayudarnos y orientándonos en la
realización de este trabajo revisándolo y
enriqueciéndolo.

A mis profesores en especial Angelita,
Gina y Mauro Arrieta, y todos los
profesores que tuve durante mi formación
académica les agradezco su tiempo su
apoyo y todos los conocimientos brindados
mi admiración y respeto para todos y cada
uno de ustedes
A mis amigos compañeros y demás
personas

Que gracias a su apoyo se logró este sueño
y se hizo posible la realización de este
ayudando de alguna forma o apoyando
gracias a todos y cada uno de ustedes les
doy las gracias.

RESUMEN

En el presente trabajo se sintetizaron dos soluciones de nanopartículas de
plata utilizando borohidruro y como agente estabilizante PVP, y Tween 20,
resultando una solución de color amarillo claro tanto la de PVP y la de
Tween 20, donde se tuvo que controlar la agitación y el calentamiento para
obtener nanopartículas pequeñas y estables.
Para la caracterización se evaluó la estabilidad por medio de microscopía
electrónica de transmitancia, espectro de infrarrojo y UV-Vis.
En el microscopio electrónico de transmitancia se observó que las
nanopartículas de plata se encuentran estables después de tres meses con
un tamaño de 10 y 50 nanómetros.
En el espectrofotómetro de UV-Vis se realizaron lecturas cada mes para
corroborar su estabilidad, durante este tiempo se obtuvieron lecturas de
aproximadamente 400 nm, indicando la estabilidad de las mismas.
Para la prueba de toxicidad se utilizaron nauplios de Artemia sp, los cuales
fueron incubados 24 h a 26–28 °C con solución salina en una cámara
obscura con aeración y luz, después de su eclosión se realizó la prueba de
toxicidad utilizando concentraciones de 41.11, 123.35, 205.58, 287.81,
370.053 g/mL, no presentando tasa de mortalidad, ya que ningún nauplio
murió a las concentraciones utilizadas.
En sensibilidad microbiana se utilizaron las soluciones de nanopartículas de
plata a concentraciones de 411.17, 287.81, 82.23, 205.58 g, observando
halos de inhibición en cultivos al 0.5 del nefelómetro de Mac Farland, de
Staphylococcus aureus ATCC 25923,Escherichia coli ATCC 11229,
Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis,

inoculados en agar soya tripticaseína, y para el estudio de sensidiscos se
utilizó el medio de Muller Hinton, comprobando conello el mecanismos de
acción de las nanopartículas de plata en las bacterias, observándose mejor
efecto bactericida de las nanopartículas estabilizadas con Tween 20.

ÍNDICE
Pág.
RESUMEN 1
I. INTRODUCCIÓN 5
1.1Conceptos básicos 5
1.1.1 Agentes antimicrobianos 5
1.1.2 Bactericida 5
1.1.3 Bacteriostático 5
1.1.4 Antiséptico 5
1.2 Clasificación de las bacterias 6
1.2.1 Distinción macroscópica y microscópica 6
1.2.2 Clasificación de las bacterias Gram positivas y negativas 7
1.2.3 Diferencia metabólica antigénica y genética 9
1.2.4 Características de las bacterias Gram positivas y Gram
negativas
10
1.2.5 Material biológico a utilizar ( bacterias) 12
1.3 Medios de cultivo 15
1.3.1 Requerimiento para el crecimiento 15
1.3.2 Temperatura 16
1.3.3 Requerimientos químicos 17
1.3.3.1 Carbono 17
1.3.3.2 Nitrógeno, azufre y fósforo 18
1.3.3.3 Oligoelementos 19
1.3.3.4 Oxígeno 19
1.3.4 Factores de crecimiento orgánico 21
1.3.5 Definición Medios de cultivo 21
1.3.6 Medios de cultivo químicamente definidos 21
1.3.7 Medios complejos 22
1.3.8 Medios selectivos y diferenciales 22
1.4 Generalidades de las nanopartículas de plata 23
1.5 Historia y mecanismo de acción de las nanopartículas de plata 25
1.6 Preparación de nanopartículas de plata 28
1.7 Preparación de nanopartículas de plata por reducción termal
y por reducción con boro hidruro de sodio
32
1.7.1 Síntesis de nanopartículas de plata por reducción térmica 32
1.8 Que es un plasmón?, y su relación con la absorción UV- Visible de las
nanopartículas metálicas
33
1.9 Estabilización de nanopartículas metálicas 34
1.10 Absorción de especies inorgánicas espectrofotometría UV-Visible 36
1.11 Microscopio electrónica de transmitancia 37
1.12 Espectroscopia de infrarrojo cercano y medio 39
1.13 Escalas o patrones de Mc Farland 41
1.14 Carácterísticas de las Artemias sp 42
1.14.1 Toxicidad en Artemias sp 42

II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 44
III. OBJETIVOS 45
3.1 Objetivos generales 45
3.2 Objetivos particulares 45
IV. HIPÓTESIS 46
V. DISEÑO EXPERIMENTAL 47
5.1 Población de estudio 47
5.2 Criterios de inclusión 47
5.3 Criterios de exclusión 47
5.4 Criterios de eliminación 48
5.5 Variables 48
VI. MATERIAL Y MÉTODO 48
6.1 Material 48
6.1.1 Material y equipo para la síntesis de nanopartículas de plata 48
6.1.2 Reactivos para la preparación de nanopartículas de plata 49
6.1.3 Material y equipo para la lectura UV-Vis para las
nanopartículas de plata
50
6.1.4 Reactivos UV-Vis 50
6.1.5 Material y equipo para realizar la prueba de sensibilidad
microbiana
50
6.2 Metodología 51
6.2.1 Valoración de las soluciones de AgNO3 0.1 M 51
6.2.2 Preparación de la solución de nano partículas con Tween20 52
6.2.3 Preparación de la solución de nano partículas con PVP 52
6.2.4 Metodología para evaluar la toxicidad 53
6.2.4.1 Metodología para la preparación de huevecillos de
Artemias sp.
53
6.2.4.2 Metodología para la realización del bioensayo 54
6.2.5 Metodología de sensibilidad microbiana 55
VII. DIAGRAMA DE FLUJO 58
VIII. RESULTADOS 59
8.1 caracterización por espectrofotómetro infrarrojo 59
8.2 Microscopia Electrónica de Transmitancia 61
8.3 Caracterización por espectro UV-VIS para Tween 20 62
8.4 prueba de toxicidad en Artemias sp 63
8.5 sensibilidad microbiana 64
IX. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 67
X. CONCLUSIONES 69
XI. REFERENCIAS 70
Índice de Abreviaturas 73
Índice de figuras 73
Índice de tablas 74

I. INTRODUCCIÓN
1.1 CONCEPTOS BÁSICOS
1.1.1 Agentes antimicrobianos
Son los que interfieren en el crecimiento y actividad de los microbios. En el
lenguaje corriente, el término antimicrobiano denota inhibición del desarrollo
y si se refiere a grupos denominados de organismos que emplean los
términos de antibacterianos o anti fúngicos. Los agentes antimicrobianos
que se utilizan en el tratamiento de las infecciones se denominan agentes
terapéuticos. (1)

1.1.2 Bactericida
Agente que mata bacterias. De manera similar, los términos fungicida,
virucida, y esporicida se refieren a agentes que matan respectivamente
hongos, virus y esporas. (1)

1.1.3 Bacteriostático
Es la supresión del desarrollo de bacterias (agentes bacteriostático). De la
misma manera, los fungistáticos se refieren a los hongos. Los agentes que
tienen en común la capacidad de inhibir el desarrollo de microorganismos
que se designan colectivamente microbiostáticos. (1)

1.1.4 Antiséptico
Toda sustancia que se opone a la “sepsis” o impide el desarrollo o acción de
los organismos, ya sea por destruir o inhibir su crecimiento y actividad.
Generalmente se refiere a sustancias aplicadas al cuerpo (1)

1.2 Clasificación de las bacterias
Las bacterias se pueden clasificar según su aspecto macroscópico y
microscópico, por el crecimiento y las propiedades metabólicas
características, por su antigenicidad y, por último, por su genotipo. (2)

1.2.1 Distinción macroscópica y microscópica
La distinción inicial entre las bacterias se puede realizar en función de las
características de crecimiento en distintos nutrientes y medios de cultivo
selectivos. Las bacterias crecen en colonias y cada una de ellas equivaldría
a una ciudad con un millón o más de microorganismos. La suma de sus
características condiciona los rasgos que definen a una colonia, como su
color, tamaño, forma u olor. La capacidad de resistir frente a determinados
antibióticos, de fermentar azúcares específicos(por ejemplo la lactosa que
permite distinguir Escherichiacoli de Salmonella), de lisar los eritrocitos
(capacidad hemolítica) o de hidrolizar los lípidos (por ejemplo la lipasa de los
Clostridium) se puede determinar también mediante el uso de los medios de
cultivo adecuados.(2)
El aspecto microscópico, incluido el tamaño, la forma y la configuración de
los gérmenes (cocos, bacilos, curvos, espirales), y la capacidad de captar el
colorante Gram (Gram positivos o Gram negativos) son el principal modo de
distinguir las bacterias. Una bacteria esférica, como Staphylococcus, es un
coco mientras que una bacteria en forma de bastón, como Escherichiacoli,
es un bacilo; el treponema que adopta una forma serpenteante es un
espirilo. Además, Nocardia y Actinomyces tienen un aspecto filamentoso

ramificado similar a estos hongos. Algunas bacterias forman agregados,
como en las especies de Neisseria o Streptococcus.(2)
La mayoría de las bacterias conocidas presentan forma de coco o de bacilo.
los cocos son células casi esféricas pueden existir como células individuales
pero se asocian también en agrupaciones características que son útiles
frecuentemente para identificar a las bacterias los diplococos se forman
cuando los cocos se dividen y permanecen juntos para constituir pares. Las
bacterias del género Staphylococcusse dividen en planos aleatorios para
generar racimos irregulares similares a los de las uvas. Los miembros del
género Micrococcus se dividen a menudo en dos planos para formar
paquetescuadrados de cuatro células llamadas tétradas. El género Sarcina
los cocos se dividen en tres planos, formando paquetes cúbicos de ocho
células. La otra forma común de bacteria es el de bastón denominado bacilo,
los bacilos varían considerablemente en la proporción entre su longitud y su
diámetro siendo los cocobacilos tan cortos y anchos que parecen cocos. Los
vibrios son curvados con forma de coma o de espiral incompleta. Pueden
permanecer juntos formando cadenas o parejas como el Bacillus
megaterium que forma largas cadenas. Muchas bacterias poseen una forma
semejante a bacilos largos retorcidos como espirales o hélices, se
denominan espirilos si son rígidos y espiroquetas cuando son flexibles.(3)

1.2.2 Clasificación de las bacterias en Gram positivas y Gram negativas
La tinción de Gram es una prueba rápida, potente y sencilla que permite al
clínico distinguir entre estas dos clases fundamentales de bacterias
basándose en las diferencias inherentes entre las bacterias se fijan con calor

o se dejan secar sobre el portaobjetos, se tiñen con cristal violeta, que es un
colorante que se precipita con yodo, y después se elimina el exceso de
colorante y el no ligando lavando el porta con un decolorante cuya base es la
acetona y con agua. Se añade después un contraste. La safranina, para teñir
las células decoloradas. Este proceso se realiza en menos de 10 minutos.
Las bacterias Grampositivas se tiñen de morado porque el colorante queda
atrapado en una gruesa capa de péptidoglucanos a modo de malla
entrelazada, que rodea a la célula, las bacterias Gramnegativas tiene una
capa de péptidoglucanos más delgada, que no retiene el cristal violeta, de
forma que las células se tiñen con la safranina empleada como contraste y
se ven rojas (2) (Figura 1)(4).
Fig. 1 Diferencias en la pared celular entre células Gram negativa y Gram positiva
(4)
.

Dada la degradación de los péptidoglucanos, la tinción de Gram no se
considera fiable para bacterias que están sin nutrientes (es decir, cultivos
antiguos o en fase estacionaria) o que han sido tratadas con antibióticos. Las
bacterias que no se pueden clasificar en función del resultado con el Gram
incluyen las micobacterias, que tienen una cubierta externa de tipo céreo y

que se distinguen bien con la tinción ácido alcohólica, y los micoplasmas,
que no tienen péptidoglucanos.(2)

1.2.3 Diferencia metabólica, antigénica y genética
El siguiente nivel de la clasificación depende de las características
metabólicas de las bacterias, incluida la necesidad de un entorno aerobio o
anaerobio, la exigencia de nutrientes específicos (por ejemplo la capacidad
de fermentar hidratos de carbono específicos o emplear distintos
compuestos como fuentes de carbono para el crecimiento) y la producción
de productos metabólicos característicos (ácidos, alcoholes) y enzimas
especificas (por ejemplo catalasas de los Staphylococcus). Se han
desarrollado técnicas automatizadas para distinguir entre las bacterias
entéricas y de otro tipo, que analizan el crecimiento en distintos medios de
cultivo y sus productos microbianos y adjudican un biotipo numérico a cada
bacteria.
Una cepa concreta de bacterias se puede distinguir mediante el uso de
anticuerpos que detectan antígenos característicos en la misma (serotipado).
Estas pruebas serológicas se pueden emplear también para identificar
organismos difíciles (Treponema pallidum, el germen responsable de la
sífilis) o demasiado peligrosos para cultivarlos en el laboratorio, que se
asocian con un síndrome patológico específico (por ejemplo el serotipo O157
de Escherichia coli responsable de la colitis hemorrágica) o que se deben
identificar con gran rapidez (por ejemplo Streptococcus pyogenes
responsable de la faringitis estreptocócica) el serotipado se emplea también

para subdividir a las bacterias por debajo del nivel de la especie con fines
epidemiológicos.(2)
El método más exacto para clasificar las bacterias es el análisis de su
material genético. Los nuevos métodos distinguen las bacterias mediante la
detección de secuencias del ADN características específicas. Entre estas
técnicas se incluyen la hibridación del ADN, la amplificación mediante
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y otras técnicas relacionadas.
Estas técnicas genéticas no necesitan gérmenes vivos o en crecimiento y se
pueden emplear para la detección e identificación rápida de gérmenes de
crecimiento lento como micobacterias y hongos o para el análisis de
muestras patológicas, incluso de cepas muy virulentas. Ahora se dispone de
esta tecnología para el análisis rápido de las secuencias de ácidos nucleicos
de segmentos específicos dentro de todo el cromosoma de la bacteria. La
aplicación más frecuente de esta técnica es el análisis de secuencias de
ADN ribosómico para detectar las secuencias muy conservadas que
distinguen a una familia o género y las secuencias altamente variables que
caracterizan a la especie o sub especie. Se han usado diversos métodos
adicionales sobre todo para clasificar subespecies de microorganismos para
la investigación epidemiológica, como el análisis de plásmidos, el ribotipado
y el análisis de los fragmentos de ADN cromosómico. (2)

1.2.4 Características de las bacterias Gram positivas y Gram
negativas
Entre las principales características de las bacterias figuran su tamaño, su
forma, su estructura y su tipo de agrupación. Estas características

constituyen la morfología de la célula. No obstante sus dimensiones
microscópicas. Según su especie son esféricas, en forma de bastón o de
espiral. En algunas especies, las bacterias se organizan en grupos, siendo
los más comunes de ellos pares, racimos, cadenas y filamentos. Conviene
conocer estas formas de agrupación porque con frecuencia son
características de un grupo taxonómico, por ejemplo, un género.
Durante años se han expuesto numerosas teorías al mecanismo de la
reacción de Gram. Las explicaciones más plausibles de este fenómeno son
las que se refieren a la estructura y composición de la pared celular. (5)
Las bacterias Gramnegativas contienen un porcentaje más alto de lípidos
que las bacterias Grampositivas. Las paredes celulares de las bacterias
Gramnegativas son también más delgadas que las de las Grampositivas.
Hay pruebas experimentales en el sentido de que el tratamiento con alcohol
extrae lípidos con lo cual se aumenta la porosidad o permeabilidad de la
pared celular Gramnegativa. Así el complejo cristal violeta-yodo (CV-I),
puede extraerse en los organismos Gramnegativos y de esta manera se
destiñen. Las paredes celulares de las bacterias Grampositivas, por su
composición diferente (bajo contenido lípidico), se deshidratan durante el
tratamiento con alcohol, los poros disminuyen, la permeabilidad se reduce y
no se logra extraer el complejo CV-I.
(5)
Otra explicación se basa en la diferencia de la permeabilidad entre los dos
grupos de bacterias. En las bacterias Grampositivas, el complejo CV-I queda
retenido en la pared después del tratamiento con etanol, lo cual según se
supone causa una disminución en el diámetro de los poros del glucopéptidos
o péptidoglucano de la pared celular. Las paredes de las bacterias

Grampositivas tienen una cantidad menor de péptidoglucano con ligaduras
cruzadas menos extensas que en las paredes de las bacterias
Grampositivas. Los poros en los péptidoglucanos de las bacterias
Gramnegativas después del tratamiento con etanol quedan lo
suficientemente grandes para permitir que se extraiga el complejo CV-I.
Estas dos explicaciones no se excluyen mutuamente y es probable que
ambas contribuyan a explicar el mecanismo de la coloración de Gram. (5)

1.2.5 Material biológico a utilizar (bacterias).Gram positivas

Gram negativas

Staphylococcusaureus ATCC 259923
TAXONOMÍA
Reino: Bacteria
Filo: Firmicutes
Clase: Bacilli
Orden: Bacillales
Familia: Staphylococcaceae
Género: Staphylococcus
Especie: Staphylococcusaureus

Fig. 2 Staphylococcus aureus
(6)
.

Escherichiacoli ATCC 11229
TAXONOMÍA
Dominio: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Enterobacteriales
Familia: Enterobacteriaceae
Género: Escherichia
Especie: Escherichiacoli

Fig.3 Escherichia coli(6).

Gram positivas

Gram negativas

Enterococcusfaecalis
TAXONOMÍA
Reino: Bacteria
Filo: Firmicutes
Clase: Bacilli
Orden: Lactobacillales
Familia: Enterococcaceae
Género: Enterococcus
Especie: Enterococcusfaecalis

Fig. 4 Enterococcusfaecalis
(7
.
)

Pseudomonasaeruginosa

TAXONOMÍA
Dominio: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Clase: Gamma Proteobacteria
Orden: Pseudomonadales
Familia: Pseudomonadaceae
Género: Pseudomonas
Especie: Pseudomonasaeruginosa

Fig. 5 Pseudomonasaeruginosa
(8)
.

Esporulados
Gram positivos

Bacillus subtilis
TAXONOMÍA
Domain: Bacteria
Phylum: Firmicutes
Class: Bacilli
Orden: Bacillales
Familia: Bacillaceae
Genero: Bacillus
Especie:Bacillussubtilis

Fig. 6 Bacillussubtilis
(6)
.

1.3 Medios de cultivo
Cuando hablamos de crecimiento microbiano en realidad nos referimos al
número de células, no al tamaño de las células. Los microbios que están en
la etapa de crecimiento aumentan en cantidad y se agrupan en colonias o
grupos de células lo suficientemente grandes como para ser observados sin
el microscopio de cientos de miles de células, o poblaciones de miles de
millones de células. Si bien el tamaño de las células individuales casi se
duplican durante la vida de la célula, este cambio no es muy significativo si
se le compara con los aumentos de tamaño observados durante la vida de
las plantas y los animales. (9)
Las poblaciones microbianas pueden tornarse increíblemente grandes en un
tiempo muy corto. Si se conocen las condiciones necesarias para el
crecimiento microbiano se puede determinar la forma de control del
crecimiento de los microbios que causan enfermedades y deterioro de los
alimentos. También se puede aprender el modo de estimular el crecimiento
de los microbios útiles y de aquellos que se desea estudiar. (9)

1.3.1 Requerimientos para el crecimiento
Los requerimientos para el crecimiento microbiano pueden dividirse en dos
categorías principales: físicos y químicos. Los aspectos físicos comprenden
la temperatura, el pH y la presión osmótica los requerimientos químicos
incluyen las fuentes de carbono, nitrógeno, azufre, fosforo, oligoelementos,
oxígeno y factores de crecimiento orgánicos.(9)

1.3.2 Temperatura
La mayor parte de los microorganismos crecen bien a las temperaturas
preferidas por los seres humanos. Sin embargo, ciertas bacterias pueden
desarrollarse en temperaturas extremas que por cierto impedirían la
supervivencia de casi todos los organismos eucariontes. Los
microorganismos se clasifican en tres grupos principales sobre la base de
sus límites de temperatura preferidos. Los psicrófilos (microorganismos con
afinidad por el frío), los mesófilos (microbios con afinidad por la temperatura
moderada), y termófilos (microbios con afinidad por el calor) la mayor parte
de las bacterias crecen solo dentro de un espectro limitado de temperaturas
y las temperaturas de crecimiento máxima y mínima solo están separadas
por 30°C. Su crecimiento es deficiente a las temperaturas altas y baja
extremas, dentro de su espectro. (9)
Cada especie bacteriana crece en temperatura mínima óptima y máxima
particulares. La temperatura mínima de crecimiento es la temperatura más
baja a la cual crecerá la especie. La temperatura óptima de crecimiento es la
temperatura a la cual la especie crece mejor. La temperatura máxima de
crecimiento es la temperatura más elevada a la cual es posible el
crecimiento. Al graficar la respuesta del crecimiento a diversas temperaturas
se puede observar que la temperatura óptima de crecimiento suele estar
cerca de la parte más elevada del espectro, por encima de esa temperatura
la velocidad de crecimiento disminuye con rapidez. Es probable que esto se
deba a que la temperatura elevada inactiva los sistemas enzimáticos de la
célula.(9)

La mayoría de las bacterias crecen mejor en un rango de pH estrecho
cercano a la neutralidad entre 6.5 a 7.5 y muy pocas bacterias crecen a pH
ácido por debajo de 4.0 esto explica porque ciertos alimentos como el
chucrut, los pickeles y muchos otros quesos, son preservados del deterioro
por los ácidos producidos por la fermentación bacteriana. No obstante
algunas bacterias denominadas ácidofilas, toleran notoriamente bien la
acidez. Un tipo de bacterias químico autótrofas, que se encuentran en el
agua del desagüe de las minas de carbón y oxidan el azufre para formar
ácido sulfúrico pueden sobrevivir a un pH de 1.0. (9)
Las bacterias que se cultivan en el laboratorio a menudo producen ácidos
que al final interfieren sobre su propio crecimiento. Para neutralizar los
ácidos y mantener un pH adecuado se agregan al medio de cultivo
sustancias químicas que actúan como tampones o buffers. En algunos
medios las peptonas y los aminoácidos actúan como tampones y muchos
medios también contienen sales de fosfato, estas últimas tienen la ventaja
de mostrar su efecto buffer en los límites de pH del crecimiento de la
mayoría de las bacterias y no son tóxicas. (9)

1.3.3 REQUERIMIENTOS QUÍMICOS
1.3.3.1Carbono
Además del agua uno de los requerimientos más importantes para el
crecimiento microbiano es el carbono. Este elemento constituye la estructura
básica de la materia viva, es necesario para todos los compuestos orgánicos
que forman una célula viva. La mitad del peso seco de una célula bacteriana
típica es carbono. Los quimioheterótrofos obtienen la mayor parte de su

carbono de la fuente de su energía materiales orgánicos como proteínas,
hidratos de carbono y lípidos. Los quimioautótrofos y los fotoautótrofos
obtienen su carbono del dióxido de carbono. (9)

1.3.3.2 Nitrógeno, Azufre y Fósforo
Además del carbono los microorganismos necesitan otros elementos para la
síntesis del material celular. Por ejemplo, la síntesis de proteínas requiere
cantidades considerables de nitrógeno así como algo de azufre. La síntesis
de DNA y RNA también requiere nitrógeno y algo de fósforo, lo mismo que
la síntesis de ATP, la molécula tan importante para el almacenamiento y la
transferencia de energía química dentro de la célula. El nitrógeno constituye
cerca del 14% del peso seco de una célula bacteriana y el azufre y el fósforo
constituyen cerca del 4%.
Los microorganismos utilizan el nitrógeno sobre todo para formar el grupo
amino de los aminoácidos de las proteínas. Muchas bacterias cubren este
requerimiento mediante la descomposición de materia que contenga
proteínas y reincorporan los aminoácidos en proteínas recién sintetizadas y
otros compuestos que contienen nitrógeno. Otras bacterias utilizan nitrógeno
proveniente de los iones de amonio que ya están en la forma reducida y
suelen encontrarse en la materia celular orgánica. Otras bacterias pueden
obtener el nitrógeno a partir de los nitratos (compuestos que se disocian
para dar el ion nitrato en solución). (9)
Algunas bacterias importantes incluidas muchas de las cianobacterias foto
sintetizadoras utilizan el nitrógeno gaseoso directamente de la atmósfera.
Este proceso se denomina fijación del nitrógeno. Algunos organismosque

pueden utilizar este método viven libremente. La mayoría en el suelo pero
otros viven en forma cooperativa en simbiosis con las raíces de las
legumbres como el trébol, la soya, la alfalfa, los frijoles y los guisantes. El
nitrógeno fijado en la simbiosis es utilizado tanto por la planta como por las
bacterias. El azufre se utiliza para sintetizar aminoácidos que contienen
azufre y vitaminas como la biotina. (9)

1.3.3.3 Oligoelementos
Los microbios requieren cantidades muy pequeñas de otros elementos
minerales, como hierro, cobre, molibdeno y zinc que se les denomina
oligoelementos. Casi todos son esenciales para las funciones de ciertas
enzimas, por lo general como cofactores. Aunque en ocasiones estos
elementos se agregan al medio de cultivo, en general se supone que están
presentes naturalmente en el agua del grifo y otros componentes del medio.
Incluso la mayoría de las aguas destiladas contienen cantidades
adecuadas.(9)

1.3.3.4 Oxígeno
Los microbios que utilizan oxígeno molecular (aerobios) producen más
energía a partir de los nutrientes que los que no utilizan oxígeno
(anaerobios) los organismos que requieren oxígeno para vivir se denominan
aerobios estrictos.
Los aerobios estrictos están en desventaja porque el oxígeno es poco
soluble en el agua de su ambiente. Por ende muchas de las bacterias
aerobias han desarrollado o conservado la capacidad de continuar creciendo

en ausencia de oxígeno. Estos organismos se denominan anaerobios
facultativos. En otras palabras los anaerobios facultativos pueden utilizar
oxígeno cuando están presentes pero pueden continuar creciendo mediante
la fermentación o la respiración anaeróbica cuando no hay oxígeno
disponible. Sin embargo su eficiencia en la producción de energía disminuye
en ausencia de oxígeno son ejemplos de microorganismos anaerobios
facultativos la familia Escherichia coli que se encuentra en el intestino de los
humanos y muchas levaduras. (9)
Los anaerobios estrictos. Son microorganismos que no pueden utilizar el
oxígeno molecular en las reacciones que producen energía. De hecho, la
mayoría de ellos son perjudicados por su presencia. Un ejemplo de estos es
el género Clostridium. Que comprende las especies causantes del tétanos y
del botulismo. (9)
Los anaerobios aerotolerantes no pueden utilizar oxígeno para su
crecimiento pero lo toleran bastante bien. Sobre la superficie de un medio
sólido crecen sin el empleo de las técnicas especiales requeridas para los
anaerobios estrictos. Una característica de muchas bacterias aéreo-
tolerantes es que fermentan los hidratos de carbono para formar ácido
láctico, que cuando se acumula inhibe el crecimiento de los competidores
aerobios y establece un nicho ecológico. En el laboratorio se les manipula y
cultiva como a cualquier otra bacteria pero no usa el oxígeno del aire. Estas
bacterias pueden tolerar el oxígeno porque poseen súper óxido dismutasa
(SOD) o un sistema equivalente que neutraliza las formas tóxicas del
oxígeno.(9)

1.3.4 Factores de crecimiento orgánicos
Son compuestos orgánicos que un organismo no puede sintetizar como las
vitaminas y actúan como coenzimas en los seres humanos. Muchas
bacterias pueden sintetizar la totalidad de sus vitaminas y no dependen de
fuentes externas. En cambio, algunas carecen de enzimas necesarias para
la síntesis de ciertas vitaminas y para ellas estas vitaminas constituyen
factores de crecimiento orgánicos. Otros factores de crecimiento para
algunas bacterias son los aminoácidos, las purinas y las pirimidinas.(9)

1.3.5 Definición de medio de cultivo
Es un material nutritivo preparado para el crecimiento de microorganismo en
un laboratorio. Algunas bacterias pueden crecer bien en casi cualquier medio
de cultivo y otras requieren medios especiales y otros no pueden crecer en
ninguno de los medios inertes existentes hasta ahora. El medio de cultivo
debe contener los nutrientes adecuados para el microorganismo específico
que se desea desarrollar. También debe contener humedad suficiente, un
pH ajustado de manera apropiada y una concentración conveniente de
oxígeno, tal vez ausente por completo. El medio que se va a inocular debe
ser estéril. Y por último el medio de cultivo inoculado debe incubarse a la
temperatura correcta. (9)

1.3.6 Medios de cultivo químicamente definidos
Es un medio del que se conoce su composición químicamente exacta. En el
caso de un organismo quimioheterótrofo, el medio químicamente definido
debe contener factores de crecimiento orgánicos que actúen como fuentes

de carbono y energía. Por ejemplo si incluye glucosa en el medio para
favorecer el crecimiento de la bacteria quimioheterótrofo de Escherichiacoli.
Los microorganismos que requieren varios factores de crecimiento se
describen como microorganismos con requerimientos especiales de
crecimiento.(9)

1.3.7 Medios complejos
Estos están compuestos por nutrientes como extractos de levaduras, carne o
plantas o digeridos de proteínas de estas y otras fuentes. Entre los
diferentes lotes del medio puede haber leves variaciones de la composición
química. En los medios complejos los requerimientos de energía carbono,
nitrógeno y azufre son aportados sobre todo por proteínas. Las proteínas
son moléculas grandes y relativamente insolubles que la minoría de los
microorganismos puede utilizar en forma directa, si bien una digestión parcial
por ácidos o enzimas las reducen a cadenas más cortas de aminoácidos
determinadas peptonas. La mayoría de las bacterias pueden digerir estos
fragmentos pequeños y solubles.
Los extractos de carne o de levadura le proporcionan al medio las vitaminas
y otros factores de crecimiento orgánicos. Estos también proporcionan
nitrógenos orgánicos y compuestos de carbono. (9)

1.3.8 Medios selectivos y diferenciales
En los procedimientos de microbiología clínica y de salud pública con
frecuencia es necesario detectar la presencia de microorganismos
específicos asociados con enfermedad o malas condiciones higiénicas. Para

esta tarea se utilizan medios selectivos y diferenciales. Los medios
selectivos están diseñados para suprimir el crecimiento de bacterias no
deseadas y favorecer el crecimiento de las deseadas. Por ejemplo el agar
sulfito de bismuto se utiliza para aislar la bacteria Gram negativa que
produce la fiebre tifoidea: Salmonella typhi, de las heces. El sulfito de
bismuto inhibe a las bacterias Grampositivas y también a la mayor parte de
las bacterias intestinales Gram negativas. El agar dextrosado de Sabouraud,
con un pH de 5.6, se utiliza para aislar hongos que se desarrollan mejor que
la mayor parte de las bacterias a este pH.
Los medios diferenciales permiten distinguir con mayor facilidad las colonias
del microorganismo deseado de otras colonias que crecen en la misma
placa.(9)

1.4 Generalidades de las nanopartículas de plata
Las nanopartículas de plata que están en el rango de 1 y 100 nm de tamaño.
Tienen propiedades únicas que ayudan en el diagnóstico molecular, en
terapias, así como en dispositivos que se utilizan en varios procedimientos
médicos. Los principales métodos utilizados para su síntesis son los
métodos físicos y químicos. El problema con los métodos químicos y físicos
es que “la síntesis es cara” y también puede tener sustancias tóxicas
absorbidas en ellos. Para superar esto, el método biológico ofrece una
alternativa viable. Los principales sistemas biológicos implicados en este son
bacterias, hongos, y extractos de plantas. Las principales aplicaciones en el
campo de la medicina incluyen aplicaciones de diagnóstico y aplicaciones
terapéuticas. En la mayoría de las aplicaciones terapéuticas, es la propiedad

antimicrobiana la que se estáexplorando, aunque la propiedad anti-
inflamatoria tiene su parte justa de las aplicaciones. Se utilizan en muchos
procedimientos y dispositivos médicos, así como en varios campos
biológicos, que tienen sus inconvenientes debido a la nanotoxicidad.(9)
Uno de los objetivos centrales de la nanociencia es construir pequeñas
estructuras para el diseño de materiales avanzados, nanodispositivos de alto
rendimiento, y miniaturización de dispositivos electrónicos. Las
nanopartículas inorgánicas son particularmente atractivas como piezas de
construcción para tales propósitos, debido a sus propiedades ópticas,
electrónicas, magnéticas y catalíticas únicas, muchas de las cuales pueden
ser moduladas cambiando su tamaño, la forma o la funcionalización de la
superficie de la nanopartículas, sin cambiar la composición del material.(10)
Debido a sus propiedades físicas y químicas únicas, las nanopartículas son
con frecuencia descritas como átomos artificiales. Los avances en los
procesos de síntesis han permitido el control preciso sobre los parámetros
estructurales que gobiernan la formación de las nanopartículas lo que ha
permitido adaptar las propiedades de estos átomos artificiales de acuerdo
con su uso específico.
La síntesis y el ensamblado modular de nanopartículas permiten explotar
sus propiedades únicas, lo que puede llevar a nuevas aplicaciones en
catálisis, electrónica, fotónica, magnetismo así como químicas y
biológicas.(10)

1.5 Historia y mecanismo de acción de las nanopartículas de plata.
Las propiedades antibacterianas de la plata están documentadas desde
hace 1000 A.C. cuando se utilizaron recipientes de plata para preservar el
agua los primeros trabajos científicos que describen el uso médico de la
plata informan sobre la prevención de la infección delos ojos en los recién
nacidos en 1881 y antisepsia interna en 1901. Después de esto, el nitrato de
plata y la sulfadiazina de plata han sido ampliamente utilizados para el
tratamiento de quemaduras dérmicas superficiales y profundas de las
heridas y para la eliminación de las verrugas. El modo de acción de la plata
se presume que es dependiente de los iones Ag+ que inhiben fuertemente el
crecimiento de las bacterias a través de la supresión de las enzimas
respiratorias y componentes de transporte de electrones y a través de la
interferencia con las funciones del ADN.La plata en una escala
nanométrica(menos de 100nm), tiene diferentes propiedades catalíticas en
comparación con los atribuidos a la forma a granel del metal noble, como
resonancia del plasmón superficial, y la fuerte toxicidad a un amplia gama de
microorganismos. (11)
Diferentes estudios han establecido el efecto bactericida de la nanoplata en
bacterias Gram positivas y negativas, pero el mecanismo bactericida de este
compuesto no ha sido claramente dilucidado. La actividad antibacteriana de
las nanopartículas de plata en cuatro tipos de bacterias Gram negativas:
Escherichia coli, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa y Salmonella
typhi sugieren que las nanopartículas de plata se unen a la superficie de la
membrana celular y perturban su función, penetran las bacterias, y liberan
iones plata. Otros grupos determinan una actividad antibacteriana similar en

bacterias Gram positivas. Como Bacillussubtilis, Staphylococcusaureus y
Enterococcusfaecalis. Las nanopartículas de plata también ejercen actividad
antibacteriana frente a algunas bacterias resistentes a los medicamentos. (11)
Las nanopartículas de plata tienen la capacidad de anclaje a la pared celular
bacteriana y posteriormente penetran en ella, provocando de este modo
cambios estructurales en la membrana celular como la permeabilidad de la
membrana celular y la muerte de la célula. Hay formación de 'hoyos ' en la
superficie celular, y no hay acumulación de las nanopartículas en la
superficie celular. (11)
La formación de radicales libres por las nanopartículas de plata puede ser
considerado como otro mecanismo por el cual las células mueren. Se han
realizado estudios de espectroscopia de resonancia de espín de electrones
que sugerían que existe formación de radicales libres por las nanopartículas
de plata cuando está en contacto con las bacterias, y estos radicales libres
tienen la capacidad de dañar la membrana de la célula y hacerla porosa que
en última instancia puede conducir a la muerte de la célula (12).
También se ha propuesto que puede haber liberación de iones de plata por
las nanopartículas, y estos iones pueden interactuar con los grupos tiol de
muchas enzimas vitales e inactivar estos. Las células bacterianas en
contacto con la plata toman iones de plata que inhiben varias funciones en
la célula y dañan las células. La plata es un ácido débil, y hay una tendencia
natural de un ácido para reaccionar con una base, en este caso, un ácido
débil para reaccionar con una base débil. Las células mayormente se
componen de azufre y fósforo que son bases débiles. La acción de estas
nanopartículas en la célula puede causar que la reacción tenga lugar y

posteriormente conducir a la muerte celular. Otro hecho es que el ADN tiene
azufre y fósforo como sus componentes principales; las nanopartículas
pueden actuar sobre estas bases débiles y destruir el ADN que sin duda
conducen a la muerte celular (9). La interacción de las nanopartículas de plata
con el azufre y el fósforo del ADN puede conducir a problemas en la
replicación del ADN de las bacterias y por lo tanto matar a los microbios. (12)
Es un hecho bien establecido que la fosforilación de sustratos de proteína en
bacterias influencia la transducción de señal bacteriana. La desfosforilación
se observó sólo en los residuos de tirosina de las bacterias Gram negativas.
El perfil de fosfotirosina de péptidos bacterianos se altera por las nano
partículas. Se encontró que las nanopartículas desfosforilan los sustratos
peptídicos en los residuos de tirosina, que conduce a la inhibición de la
transducción de señal y por lo tanto la detención del crecimiento.(12)
Además de la capacidad antiviral de las nanopartículas de plata contra el
virus de la inmunodeficiencia humana y el virus de la hepatitis B se han
establecido, las aplicaciones actuales de las nanopartículas de plata incluye
vendas antimicrobianas para las quemaduras, filtros de agua y otros. La
toxicidad de las nanopartículas de plata se ha estudiado en diferentes
sistemas de células de mamíferos. Incluyendo células de hígado de rata, los
queratinocitos humanos y cultivos de fibroblastos. In vitro una dosis elevada
de nano plata induce el estrés oxidativo (liberación de especies reactivas de
oxígeno) como un mecanismo de citotoxicidad. En un inocuo rango de
concentración, las nanopartículas de plata se han descrito que ejercen
efectos antiinflamatorios como: la aceleración de la cicatrización de heridas,
la modulación de la producción de citosinas y la inducción de la proliferación

de células mononucleares de sangre periférica, la inhibición de la dermatitis
alérgica de contacto en ratones, la supresión de la expresión de TNF-α y IL-
12, y la inducción de la apoptosis de las células inflamadas. (11)

1.6 Preparación de nanopartículas de plata
Recientemente la preparación de nanopartículas metálicas ha despertado
gran interés en la comunidad científica debido a las propiedades catalíticas ,
ópticas, electrónicas, magnéticas y bactericidas que presentan estos
sistemas, lo que significa que son de gran utilidad tecnológica, siendo de
especial atención los materiales que contienen nanopartículas de metales
nobles, tales como oro plata, platino y paladio.(13)
Las nanopartículas metálicas se pueden definir como agregados aislados de
tamaños entre 1 y 50 nm, los cuales son un conjunto de átomos rodeados deuna cápsula protectora o estabilizadora que evita la aglomeración. Existen
varios métodos para la preparación de nanopartículas; en el caso de los
nanoclúster o nanoagregados de los metales de transición se pueden citar la
reducción química de una sal metálica, descomposición térmica, fotoquímica
o sonoquimica, reducción del ligando y desplazamiento del ligando en
compuestos órgano metálicos deposición del metal en fase vapor y síntesis
electroquímica.(13)
Uno de los métodos más comunes para la preparación de las nanopartículas
es la reducción química de las sales de metales de transición en presencia
de agentes estabilizadores. El mecanismo de formación de nanopartículas
se basa primordialmente, en la reducción de la sal metálica al átomo
cerovalente y seguidamente estos átomos actúan como centros de

nucleación dando lugar a la formación de clúster cuyo crecimiento continuará
a medida que se sigan agregando los átomos, formándose así, partículas de
mayor tamaño y formas poliédricas más complejas. No obstante, es
necesario estabilizar las partículas. Mediante la envoltura de moléculas o
agentes estabilizadores (polímeros generalmente) que se absorben en su
superficie, inhibiendo de esta manera el proceso de aglomeración o
sinterización.(13)
La principal ventaja del método de reducción química es su reproducibilidad
y la posibilidad de obtener coloides mono dispersos con una distribución
estrecha en el tamaño de partícula, razón por la cual se preparan
frecuentemente nanopartículas metálicas siguiendo esta metodología.
Empleando como agentes reductores especies químicas tales como: ácidos
orgánicos, alcoholes, polioles, aldehídos y azucares. (13)
Entre ellas están también aquellas basadas en la reducción de nitrato de
plata por boro hidruro de sodio o citrato de sodio. Otros métodos incluyen el
uso de microondas, electrolisis de sales de plata, micro emulsión y foto
reducción de iones Ag+. (14)
En los últimos años el proceso de calentamiento asistido por microondas, se
ha utilizado como una alternativa para la síntesis de materiales a escala
nanométrica dado que es un método rápido, uniforme y efectivo, que permite
incrementar las cinéticas de reacción en uno o dos órdenes de magnitud.
Las nanopartículas coloidales de Pt, Ru, Ag, y Pd estabilizados por
polímeros, han sido preparadas por calentamiento con microondas, a partir
de las sales precursoras del metal disueltas en soluciones de etilenglicol.
Por otra parte el calentamiento por microondas de las muestras líquidas

permite la disminución de las fluctuaciones de temperatura en el medio de
reacción, proporcionando así, un entorno más homogéneo para la
nucleación y el crecimiento de las partículas metálicas. (13)
La formación de nanopartículas de plata por el método poliol en presencia de
NaOH ha sido investigada y se ha concluido que bajo estas condiciones se
puede aumentar la velocidad de reducción de los iones del metal y
estabilizar el coloide resultante. En este sentido, se ha sugerido como medio
de síntesis el etilenglicol, debido a su alta constante dieléctrica (41.4 a 298K)
y perdida dieléctrica, por lo que puede ser calentado rápidamente por la
radiación de microondas, logrando acelerar la velocidad de reducción de los
iones metálicos y favoreciendo la formación de los núcleos metálicos. El
etilenglicol se descompone, generando especies tales como (CH3CHO) que
pueden reducir los iones metálicos a átomos. Los cuales se aglomeran y
forman partículas al emplear el etilenglicol se producen reacciones químicas
en el medio de síntesis tales como las siguientes (13)
CH2OH-CH2OH NaOH CH3CHO +H2O (1)
Δ
2CH3 CHO + 2 Ag
+ 2 Ago+ 2H+ + CH3COCOCH3(2)
En los últimos años el proceso poliol ha sido desarrollado para preparar
polvos finos de metales diversos: cobalto, níquel, plomo, oro, cobre, paladio
y algunas aleaciones de estos metales. El método de síntesis es el siguiente:
un compuesto metálico inorgánico o sal es dispersado en un líquido poliol.
Principalmente se usa etilenglicol. La suspensión luego es agitada y
calentada a una temperatura dada, hasta la completa reducción del
compuesto. El metal es recogido como un polvo fino por centrifugación o
filtración. Las partículas obtenidas son monodispersadas, no aglomeradas,

en el rango coloidal o micrónico. En estos procesos se considera un polvo
monodisperso cuando el coeficiente de variación de la distribución del
tamaño de la partícula no excede el 20 % es esencial la estabilización de las
nanopartículas en el medio dispersante para prevenir la aglomeración. Esto
puede ser logrado por estabilización electrostática o estérica. Varios agentes
estabilizadores tales como agar, ciclo dextrina, poli-vinil-alcohol (PVA),
polivinilpirrolidona (PVP) y acetato de celulosa se han probado con éxito. (14)
El mecanismo general de reducción del etilenglicol puede ser representado
por las reacciones siguientes:
CH2OH-CH2OH CH3CHO +H2O (1)
2CH3 CHO + 2 Ag
+ 2 Ago+ 2H+ + CH3COCOCH3(2)
Por otro lado, el PVP juega un rol fundamental en la estabilización de las
nanopartículas evitando la aglomeración de estas. (14)
Agm
+PVP
Donde m es el número de iones plata anclados a la molécula de PVP. Este
caso ocurre en la reducción química de los iones plata en presencia de PVP.
Como los átomos de nitrógeno y oxígeno de la pirrolidona en el PVP
contribuyen a aumentar la densidad electrónica en el orbital de los iones
plata comparado con el átomo de oxígeno del agua, permitiría que el
complejo de los iones plata con el PVP pueda obtener electrones más
fácilmente que el sistema de iones plata con agua. De acuerdo a esto la
presencia de PVP asegura la reducción de los iones plata en el complejo. (14)

1.7 Preparación de nanopartículas de plata por reducción termal y por
reducción con borohidruro de sodio
El método más común para sintetizar las nanopartículas de plata de manera
estable es la reducción química de iones plata con diferentes estabilizadores
como son polímeros y surfactantes. Algunos de estos son
Pirrovinilpirrolidona (PVP) y polyvinyl alcohol (PVA), ya que atraen
considerablemente la atención por sus excelentes propiedades físicas y
químicas que haciéndolo buen material para recubrimiento o como un aditivo
a materiales diferentes. El PVP actúa no únicamente como agente
estabilizador sino también impacta en el control de la velocidad de reacción
de los iones plata y el proceso de agregación de los átomos de plata. (15)

1.7.1 Síntesis de nano partículas de plata por reducción térmica
5 g de PVP se disuelven en 250 mL de agua desionizada bajo agitación a
temperatura ambiente. Diferentes cantidades de nitrato de plata se utilizan
(0.025,0.05 y 0.1 g) se disolvieron en 0.5 mL de agua se adicionan gota a
gota bajo agitación a 25 mL de PVP al 2 % consiguiendo una concentración
final de nitrato de plata en la solución igual a 0.98, 1.96 y 3.92 mg/ mL. La
solución preparada se calienta por 1 h a 100 °C en la obscuridad. El color de
la solución depende de la concentración de Ag y varía de negra a amarilla a
marrón. La solución PVP/AgNPS obtenida es estable por un mes.(15)

1.8 ¿Qué es un plasmón?, y su relación con la absorción UV-Visible de
las nanopartículas metálicas.
Cuando un gas está fuertemente ionizado, en estado de plasma, los
portadores de carga libres pueden interaccionar fácilmente con la radiación
electromagnética de baja frecuencia oscilando en resonancia con ésta,
produciéndose así un fenómeno vibratorio típico de los plasmas, conocido
como plasmón.(16)
Debido a la naturaleza característica de los metales, el interior de estos
(bulk)viene a ser en muchos casos y con gran aproximación, un “plasma
sólido” en el que los átomos pueden ser considerados como puntos masivos
fijos con carga positiva neta mientras una “sopa de electrones libres” lo baña
todo, estrictamente hablando los plasmones bulk (o masivos) son ondas
cuantizadas de una colección de electrones móviles que son producidas
cuando una gran cantidad de estos son perturbados respecto de sus
posiciones de equilibrio y vibran a una frecuencia característica dada.(16)
Se conocen como plasmones de superficie localizados a las oscilaciones
colectivas de electrones restringidos en pequeños volúmenes metálicos.
Para que este fenómeno ocurra, la partícula tiene que ser mucho menor que
la longitud de onda de la luz incidente. El campo eléctrico oscilante de la luz
incidente induce un dipolo eléctrico en la partícula desplazando a una parte
de los electrones móviles deslocalizados en una dirección lejos del resto de
la partícula metálica, generando así una carga neta negativa en un lado de la
partícula. Como el resto de los núcleos y sus electrones internos no se han
desplazado, constituyen una carga opuesta positiva (red catiónica). Esta
separación de cargas actuará como una fuerza restauradora del equilibrio.

En partículas pequeñas se produce un dipolo, pero en partículas grandes (a
partir de 30 nm) se produce un cuádruplo y en general multipolos, lo que
determina una situación bastante compleja. (16)

1.9 Estabilización de nanopartículas metálicas
Antes de comenzar con la descripción de los métodos de síntesis un aspecto
general y crucial se podría considerar a la medida por la cual las partículas
metálicas son estabilizadas en un medio de dispersión, como las partículas
de metal pequeñas son inestables con respecto a la aglomeración del
granel. Por una distancia interpartícula corta una partícula puede ser atraída
por otra fuerza de Van der Waals y en la ausencia de una fuerza de
repulsión que contrarreste esta atracción, un sol no protegido puede
coagular. Esta interacción contraria puede ser lograda por dos métodos,
nombrados estabilización electrostática y estabilización estérica. En una
solución clásica de oro se rodea por una doble capa eléctrica formada por el
citrato absorbido, iones cloruro y cationes que son atraídos por las
partículas. Esto da como resultado una repulsión Coulombica entre las
partículas. (17)
Una mínima energía potencial a una distancia moderada define una
disposición estable de partículas la cual es fácilmente interrumpido por
efectos del medio y a temperaturas normales, por el movimiento térmico de
las partículas, por lo tanto si el potencial eléctrico asociado con la doble capa
es suficientemente alta la repulsión electromagnética puede prevenir la
aglomeración de partículas, sin embargo un sol estabilizado

electrostáticamente puede coagular si la fuerza iónica del medio de
dispersión se incrementa lo suficiente.(17)
Si la fuente de carga es reducida por el desplazamiento de los aniones
absorbidos por una fuerte banda de absorción neutra. Las partículas pueden
colisionar y aglomerarse por la influencia de las fuerzas de atracción de Van
der Waals. Este fenómeno puede demostrarse fácilmente por la adición de
piridina a un sol de oro del tipo antes mencionado. (17)
Regularmente en medio orgánico en el cual el efecto electrostático puede no
ser normalmente considerado importante, el desarrollo de carga puede ser
demostrado en fuentes inorgánicas, incluyendo metales, en contacto con
fases orgánicas como son solventes. Por ejemplo la adquisición de carga por
partículas de oro en líquidos orgánicos pueden ser demostrados, la señal y
magnitud de la carga encuentra una variante como una función de las
propiedades donadoras de el líquido por eso regularmente para metales
coloidales en suspensión de líquidos relativamente no polares la posibilidad
puede no ser excluida de que la estabilización electrostática contribuya a la
estabilidad del sol no obstante la estabilización electrostática de las nano
partículas metálicas es bastante débil y nunca permite el aislamiento de
estas nanopartículas como sólidos sin agregación extendida y regular la
formación del metal compuesto. (17)
Una segunda y mucho mejor medida para prevenir la agregación de las
nanopartículas se basa en el efecto estérico. Y ocurre por la adición de
polímeros y surfactantes en la superficie de las partículas. Los polímeros son
ampliamente utilizados y está claro que el protector con el fin de funcionar
efectivamente, no solo deben coordinar a la superficie de la partícula, sino

también deben ser adecuadamente solvatados por el fluido dispersante
como polímeros con terminación (amfifilicos). (17)
La elección de los polímeros se determina por la consideración de la
solubilidad del metal precursor, la elección del solvente, y la habilidad del
polímero para estabilizar las nanopartículas metálicas. Antes de la llegada
de la química de los polímeros sintéticos, los polímeros naturales como son
gelatina y agar se usaban. Estabilizadores relacionados como acetato de
celulosa, nitrato de celulosa y ciclo dextrina son usados más recientemente.
Otros estudios se han realizado sobre la capacidad relativa de los polímeros
para actuar como estabilizantes estéricos. Parece que entre los polímeros
sintéticos considerados por este efecto están el polivinilpirrolidona (PVP) y
polivinil alcohol (PVA) que son especialmente útiles a este respecto. (17)

1.10 Absorción de especies inorgánicas espectrofotometría UV- visible.
Algunos aniones inorgánicos presentan bandas de absorción ultravioleta que
son resultado de electrones no enlazantes que se excitan. Entre los
ejemplos están los iones nitrato (313 nm), carbonato (217nm) nitrito (360 nm
y 280 nm), azida (230 nm) y tritiocarbonato (500nm). (18)
En general, los iones y complejos de elementos en las dos primeras series
de transición absorben bandas anchas de radiación visible en por lo menos
uno de sus estados de oxidación y, como resultado, son de colores, en este
caso, la absorción involucra transiciones entre orbitales “d” llenos y no llenos
con energías que dependen de los ligandos enlazados a los iones metálicos.
Las diferencias de energías entre estos orbitales “d” y, por tanto, la posición
del máximo de absorción correspondiente, dependen de la posición del

elemento en la tabla periódica, de su estado de oxidación y de la naturaleza
del ligando unido a el. (18)
Los espectros de absorción de iones de las series de transición de los
lantánidos y actínidos difieren de manera notable de los que se muestran en
los de los elementos de transición. Los electrones que se ocupan de la
absorción en estos elementos (4f y 5f, respectivamente) están protegidos
contra influencias externas por medio de electrones que ocupan orbitales
con números cuánticos principales más grandes. Entonces, las bandas
tienden a ser angostas y relativamente no se ven afectadas por la especie
unida mediante los electrones externos. (18)

1.11 Microscopia electrónica de transmitancia
Para la caracterización del analito se utilizó microscopia electrónica de
transmitancia (MET por sus siglas en ingles) el desarrollo de la microscopía
óptica o de luz fue evolucionando de manera importante desde su aparición.
Fue hasta el año 1931 cuando se alcanzó a obtener, con la ayuda de otra
generación de microscopios, una resolución 1000 veces mayor que la de un
microscopio óptico; a ésta generación se le conoce como microscopía
electrónica y fueron los físicos Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania.
Quienes dieron a conocer el MET, posteriormente, en el año 1938, Manfred
von Ardenne construyó el primer microscopio electrónico de Barrido (SEM,
por sus siglas en inglés). (19)
El desarrollode la microscopía electrónica permitió, entre otras cosas,
alcanzar el nivel de resolución espacial que muchos investigadores de
diversas disciplinas demandaba, y fundar una rama de investigación que a

pesar de ser relativamente joven, ha avanzado de una manera vertiginosa
en la ciencia contemporánea, esta técnica se ha convertido en una fuente
inagotable de información y desarrollo, no solo por la resolución alcanzada,
sino también por las capacidades de análisis de las técnicas asociadas a un
microscopio electrónico moderno, como son la espectroscopia por dispersión
de energía de rayos X(EDS de sus siglas en inglés) por su capacidad de
proporcionar información morfológica, topográfica, química, cristalina,
eléctrica y magnética de los materiales, la han convertido en herramientas
indispensables en el dominio de la física del estado sólido, ciencia de
materiales, electrónica, polímeros, metales, textiles, biología, medicina, etc.
El futuro de esta técnica es muy prometedor debido a su desarrollo
tecnológico en la última década del siglo XX, alcanzando un poder de
resolución de hasta 0.1 mm en un MET y 1.5 mm en un SEM, este último
con la posibilidad de trabajar con la presión controlada, útil en la observación
de muestras húmedas. (19)
La diferencia principal entre microscopia electrónica y óptica es el uso de un
“Haz” de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra, consiguiendo
aumentos de hasta dos millones de veces. Su diseño se basa en dos
principios físicos, uno es el de dualidad onda-partícula predicha por Louis de
Broglie en 1924, quien dedujo una ecuación (ʎ= h/p; h es la constante de
Planck) que permite calcular la longitud de onda (ʎ) esperada para una
partícula de masa m con momentum p (p=mv). En microscopía electrónica m
representa la masa de un electrón y ʎ adquiere valores en el intervalo 0.388-
0.00193nm, dependiendo del voltaje de aceleración de los electrones. (15)

El otro principio físico en el que se basa el diseño de un microscopio
electrónico es la ley de Lorentz (F=e(VXB), lo cual indica para este caso, que
un electrón viajando con velocidad “V” dentro de un campo magnético “B”,
experimenta una fuerza que hace que el electrón describa una trayectoria
helicoidal alrededor de las líneas del “B”. De esta manera un microscopio
electrónico está constituido por lentes electrostáticas y electromagnéticas
que desempeñan el mismo papel que una lente de vidrio para el caso de un
microscopio de luz. (19)

1.12 Espectroscopia de infrarrojo cercano y medio
Para la caracterización se leyeron las muestras al IR obteniéndose así los
espectros de la muestra y el blanco de la solución.
La región del infrarrojo (IR), desde el punto de vista analítico, reagrupa una
variedad de métodos no destructivos de identificación y determinación
basados en la absorción o la reflexión, por parte de la muestra, de
radiaciones electromagnéticas comprendidas entre 1-50 µm. esta banda
espectral se divide en IR cercano (1-2.5 µm) e IR medio (2.5-5.0 µm). El IR
medio es más rico en información acerca de la estructura de los compuestos
examinados. De hecho, se utiliza para la identificación de moléculas
orgánicas, ya que permite registrar una especie de huella digital. Para
realizar estos tipos de análisis se dispone de una variedad de instrumentos,
desde espectrofotómetros de transformada de Fourier hasta distintos
analizadores industriales de tipo dispersivo o no dispersivo, especializados
en la determinación de compuestos específicos (por ejemplo, análisis de
gas), o que permiten realizar las medidas en continuo con sondas de

inmersión en las unidades de producción. La espectrometría infrarroja es por
transformada de Fourier, que reemplaza al método dispersivo inicial, ofrece
numerosas posibilidades en el tratamiento de espectros y permite
aplicaciones en el análisis de estructuras en micromuestras (microanálisis
infrarrojo). (20)
En el IR cercano y medio, la absorción de la radiación por la materia tiene su
origen en la interacción entre las radiaciones de la fuente luminosa y los
enlaces químicos. Más concretamente, los átomos situados en dos extremos
de un enlace están afectados por un movimiento de vibración, uno en
relación al otro, y que si son diferentes forman un dipolo eléctrico que oscila
a esta misma frecuencia. Si se irradia un determinado enlace no simétrico
con una fuente luminosa monocromática, cuya frecuencia sea la misma que
la frecuencia de vibración, se producirá una interacción con el dipolo
eléctrico del enlace. (20)
Dicho de otro modo, el componente eléctrico de la onda podrá transmitir su
energía al enlace a condición de que exista concordancia entre su frecuencia
mecánica de vibración y la frecuencia electromagnética de la radiación. Esta
aproximación simplificada explica el hecho de que en ausencia del dipolo
permanente de enlaces no polares, como es el caso de moléculas como O2,
N2, Cl2, no exista acoplamiento con la onda electromagnética y que no se
produzca ninguna absorción de energía. A estos tipos de enlace se les
denomina transparentes en el IR medio. (20)
Los instrumentos se clasifican en dos categorías los espectrómetros de
transformada de Fourier, que realizan un análisis simultáneo de toda la
banda espectral a partir de medidas interferométricas y los numerosos

analizadores especializados .en el IR cercano puede usarse igualmente
algunos espectrómetros de tipo dispersivo. (20)

1.13 Escalas o patrones Mc Farland
Técnica basada en turbidimetria, la escala se basa en la capacidad de
precipitación del Cloruro de Bario en presencia de ácido sulfúrico y su
utilidad, es la de poder elaborar suspensiones bacterianas ajustadas a un
patrón y valorando su concentración, para esto se toma una alícuota de la
muestra de bacterias y se inocula en un tubo conteniendo solución salina
fisiológica (0.85%) el objetivo es lograr ajustar una concentración de
bacterias a uno de los patrones preparados al 0.5% de la escala de Mc
Farland se elaboran 10 estándares, y por espectrofotometría se crea una
recta patrón con la cual se va a poder determinar la concentración de las
diluciones bacterianas elaboradas. La información arrojada es aproximada
ya que la lectura depende de factores como el tamaño de la bacteria y la
formación de agrupaciones. En este estudio se preparó una curva y se tomó
el estándar al 0.5% de la escala de Mc Farland para ajustar la turbidez de
cada bacteria a este estándar antes de inocular las cajas con Muller Hinton
para tener una concentración aproximadamente igual en turbidez al estándar
en cada muestra de bacterias en cada caja. (21)

1.14 Características de las Artemias sp
El género Artemia sp comprende una serie de especies que se encuentran
distribuidas ampliamente en el mundo, es un organismo único que tiene la
capacidad de adaptarse a condiciones cambiantes del medio con respecto a
la salinidad la cual puede ir desde concentraciones menores de 10 UPS
hasta 340 UPS, este camarón de salmuera como es conocido se ve
favorecido a estas condiciones debido a la ausencia de depredadores y
competidores de alimento permitiendo con ello que su desarrollo (nauplio
adulto) sea exitoso bajo estas condiciones extremas de salinidad y en
algunos casos con densidades altas debido a la presencia de una halo
bacteria y micro algas que resisten estas condiciones adversas. (22)

1.14.1 Toxicidad en Artemias sp
El bioensayo en Artemias sp (Fig.10)se realiza para evaluar diferentes
actividades, en compuestos bioactivos a dosis más bajas, que la toxicología,
mientras que la letalidad de un organismo simplemente puede ser utilizada
para detectar y guiar el fraccionamiento de los extractos, considerando
valores menores de1.000 ppm como bioactivos.

Fig.7Nauplio deArtemiasp
(23)
.

Es la primera prueba realizada desde 1982, y se ha utilizado para el
aislamiento in vivo, la inhibición de los huevos también se ha estudiado.
Por medio de esta técnica podemos determinar la concentración letal media
(CL50), en ppm de extractos en un medio salino, se han utilizado en ensayos
o análisis de residuos de pesticidas, micotoxinas, anestésicos, toxinas
dinoflagelares, toxinas en ambiente marino, compuestos químicos en
muestras ambientales, toxinas naturales presentes en alimentos, productos
farmacéuticos y toxicidad dispersa del aceite, debido a que la larva de este
crustáceo es altamente sensible a una gran variedad de sustancias químicas
y extractos de plantas.

II. PLANTEMIENTO DEL PROBLEMA

Uno de los principales problemas con el tratamiento de antimicrobianos es
que las bacterias presentan resistencia, y estos pierden su eficiencia por lo
que es importante evaluar la efectividad bactericida de las nanopartículas
como una alternativa a este problema.

III.OBJETIVOS

3.1 Objetivos generales

 Evaluar el efecto bactericida de una solución de nanopartículas
estabilizadas, en bacterias Gram positivas y Gram negativas.

3.2 Objetivos particulares

 Sintetizar soluciones de nanopartículas de plata estables, y verificar
su estabilidad mediante; Infrarrojo, MET, UV-Vis.
 Determinar si las nanopartículas de plata tienen efecto bactericida en
las bacterias elegidas como material biológico
 Demostrar que no hay efecto tóxico en las concentraciones utilizadas
en el modelo de Artemias sp.

IV. HIPÓTESIS

Las nanopartículas de plata son agentes antimicrobianos de amplio
espectro que impiden el crecimiento bacteriano al interactuar con el
metabolismo de las bacterias aumentando la inhibición, por lo que a las
concentraciones de nanopartículas de plata utilizadas en el experimento se
espera no presenten toxicidad a las concentraciones utilizadas en el modelo
de Artemiassp.

V. DISEÑO EXPERIMENTAL

PROSPECTIVO TRANSVERSAL

5.1 Población de estudio
Material biológico bacterias
Que fueron proporcionadas por los laboratorios de Microbiología
Farmacéutica, y de producción de la FES Zaragoza de la UNAM, y elIMSS
HGZ No. 47“Vicente Guerrero”.
Gram positivas Gram negativas
Staphylococcusaureus ATCC 25923 Escherichia coli ATCC11229

Enterococcusfaecalis

Pseudomonasaeruginosa

Bacillussubtilis

5.2 Criterios de inclusión
Gram positivas: Staphylococcus aureus ATCC 25923
Bacillussubtilis
Enterococcusfaecalis
Gram negativas: Escherichiacoli ATCC11229
Pseudomonasaeruginosa
5.3 Criterios de exclusión
Bacterias anaerobias
Medios de cultivo contaminados

5.4 Criterios de eliminación
Bacterias con crecimiento microbiano no inoculadas.
Cajas contaminadas después de realizar la prueba de esterilidad.
Cajas con crecimiento bacteriano diferentes géneros.
5.5 Variables
Cepa bacteriana.
Concentración de nanopartículas.
Tipo de medio de cultivo.
Tipo de solución de nanopartículas.

VI. MATERIAL Y MÉTODO
6.1 MATERIAL
6.1.1 Material y equipo para la síntesis de nanopartículas de plata
- Pipetas volumétricas 2 mL.
- Pipetas volumétricas 5 mL.
- Matraz aforado 25 mL.
- Matraz aforado 200 mL.
- Matraz aforado 500 mL.
- Matraz aforado 1000 mL.
- Matraz balón 200 mL.
- Matraz balón 1000 mL.
- Bureta de 50 mL.
- Pesa filtros.
- Desecador.
- Embudo de tallo largo.

- Probeta de 50 mL.
- Probeta de 100 mL.
- Vasos de precipitados 100 mL.
- Estufa.
- Soporte universal.
- Pinzas de 3 dedos con nuez.
- Pinzas para crisol.
- Pinzas dobles de presión.
- Termómetro -10 a 150 °C.
- Espátula.
- Guantes.
- Agitador magnético.
- Frascos ámbar.
- Balanza analítica.
- Parrilla agitación y calentamiento.

6.1.2 Reactivos para la preparación de nanopartículas de plata
- Solución de AgNO3 al 0.1 M.
- NaCl.
- Metanol.
- NaBH4.
- PVP.
- Tween 20.
- Agua destilada.

6.1.3 Material y equipo para la lectura en UV-VIS para las nanopartículas
de plata
- Vasos de precipitados.
- Piseta.
- Espectro UV-Vis Perkin- Elmer lambda 2.
- Celdas de cuarzo.

6.1.4 Reactivos UV-VIS
-Solución de AgNO3 al 0.1 M.
- Agua destilada.
- Blanco solución de PVP, Tween 20.

6.1.5 Material y equipo para realizar la prueba de sensibilidad
microbiana
- Cajas Petri.
- Tubos 16 X 125 mm ó 18 x 150 mm.
- Tubos con tapa de rosca.
- Matraces Erlenmeyer .
- Mechero Fisher.
- Tripie.
- Algodón.
- Gasas.
- Asa bacteriológica.
- Autoclave u olla de presión.
- Incubadora .

- Termómetro -10 a150 °C.
- Medios de cultivo.
- Hisopos.
- Pinzas.
- Material biológico :
Gram positivas Gram negativas
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Escherichia coli ATCC11229

Enterococcusfaecalis

Pseudomonasaeruginosa

Bacillussubtilis

Reactivos
- BaCl2.
- H2SO4.

6.2 Metodología

6.2.1 Valoración de las soluciones de AgNO3 0.1 M
1. Pesar 2.5 g de NaCl grado reactivo.
2. Secar por 2 h en un pesa filtró a 110°C.
3. Colocar el pesa filtros en desecador.
4. Pesar 0.01 g de NaCl.
5. Colocar en un matraz Erlenmeyer.
6. Disolver con 5 mL de agua destilada.
7. Adicionar 5 mL de ácido acético.
8. Adicionar 50 mL de metanol.

9. Colocar 0.5 mL de SI. de eosina.
10. Titular con solución de Ag NO3 al 0.1M.
11. Agitar fuertemente con magneto.
12. Esperar el vire a rosa.
Se realizaron dos soluciones de nanopartículas de plata (PVP, Tween 20).

6.2.2 Preparación de la solución de nanopartículas con Tween 20
1. Medir 100 mL de agua destilada.
2. Adicionar 10 mL Tween 20.
3. Adicionar 5 mL de Ag NO3 al 0.1 M.
4. Calentar a evaporación.
5. Adicionar 25 mL de NaBH4 al 0.66 M lentamente.
6. Agitar vigorosamente (con magneto).
7. Calentar hasta que la solución se torne a un color amarillo.
8. Retirar de la parrilla.
9. Aforar a 200 mL.
10. Llevar a un frasco ámbar con tapa de baquelita y colocar en un lugar
obscuro.
11. Rotular (día-mes-año).

6.2.3. Preparación de la solución de nanopartículas con PVP
1. Pesar 2 g de PVP.
2. Adicionar a un matraz de 50 mL.
3. Aforar con agua destilada.
4. Pesar 0.3783 g NaBH4 (0.2M).

5. Adicionar en un matraz de 50 mL.
6. Aforar con agua destilada.
7. En un matraz balón (provisto de placa de agitación y conteniendo
agitador magnético).
8. Se adicionan 20 mL de PVP al 4%.
9. Agitar vigorosamente.
10. Agregar 100 mL de AgNO3 al 0.1M gota a gota.
11. Agregar lentamente 38mL NaBH4 (0.2M).
12. Agitar vigorosamente por una h.
13. Aforar a 500 mL.
14. Guardar en un frasco ámbar con tapa de baquelita, en un lugar
obscuro.

6.2.4 METODOLOGÍA PARA EVALUAR LA TOXICIDAD

6.2.4.1 Metodología para la preparación de huevecillos de
Artemia sp
1. Armar el dispositivo de incubación (contiene una cámara obscura,
dispuesta de una bomba de aire para pecera, y un foco sumergible),como se
muestra en la (Fig. 17).
2. reparar 400 mL de agua de mar artificial.
3. Pesar 12.2 g de sal de mar.
4. Disolver con agua corriente.
5. Adicionar 2 gotas de anticloro.
6. Reposar 5 min.

7. Colocar la solución anterior en la pecera de incubación (obscura).
8. Colocar una cantidad de agua corriente en la pecera mayor.
9. Temperatura 26 – 28 °C.
10. Dejar que se equilibre