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Aprendiendo Biologia

23/7/2022

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Biología

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“DIAGNÓSTICO GENÉTICO EN PACIENTES
46,XY CON HIPOSPADIAS MEDIANTE
ANÁLISIS DEL GEN AKR1C4.”

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

P R E S E N T A:
DIRECTOR DE TESIS:

FRIDA MARIELA SÁNCHEZ LÓPEZ
Dr. Luis Ramos Tavera
B I Ó L O G A
LOS REYES IZTACALA, EDO. DE MÉX. 2019

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA
T E S I S

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

El presente trabajo se desarrolló en el Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición
Salvador Zubirán, en el departamento de Biología de la Reproducción, laboratorio de
Bioquímica Hormonal.

DEDICATORIA

A mis padres José Manuel y Guadalupe. Por ser tan inefables seres humanos y por uno
de los más primorosos obsequios otorgados: su confianza y esperanzas en mi persona,
la motivación que precisaba cada día y todo el amor, respeto y admiración que me han
brindado a lo largo de mi carrera y vida. No dejaré de sentirme agradecida con ustedes
por tan destacado aprendizaje que me concedieron desde siempre, a pesar de todo lo
que se ha interpuesto, su ejemplo y palabra me ha formado como una mujer con una
percepción distinta, pero maravillosa de lo que es la vida. El esfuerzo que me supuso
llegar a esta meta no tiene comparación alguna con el que ustedes hacen cada día por
mi bienestar, por ello quiero hacerlos parte de este logro, decirles que son mi mayor
fuente de inspiración y tranquilidad. Los amo infinitamente.

3
AGRADECIMIENTOS
A mi querido hermano Manuel. A ti que me apoyaste en mi elección de esta carrera
desde el momento en que te lo mencioné, por todos los diálogos que intercambiamos
constantemente, los cuales han contribuido a formar la persona que hoy represento, por
ser el mejor ejemplo a seguir, por ser tan brillante y ayudarme con cada cuestionamiento.
Te amo.

A mis hermanas Elizabeth y Diana. Hermanas, gracias por el esfuerzo que me
otorgaron sin demandar algo a cambio, por darme el mayor signo de empatía, por
esforzarse junto a mí para sacarme adelante y ser de las primeras en ayudarme
emocional y económicamente cuando lo necesitaba, quiero que sepan que esto es una
parte del resultado de todo lo que me dieron. Las admiro y amo.

A mi hermana Gloria. Gracias por tanto cariño y apoyo, por atender mis anécdotas y
creer en mí, por el tiempo que has invertido y por todo lo que me has dado, eres de las
escasas personas que me han visto crecer, quiero que sea de tu entendimiento que no
he de olvidarlo y siempre atesoraré en mi pensar todo lo que has compartido a mi lado,
gracias por la mayor enseñanza de valentía y constancia. Te amo.

A mi prima Cinthia. Por tu inmenso apoyo y tan franco cariño, eres como una hermana
para mí, gracias por tantos momentos y estar siempre ahí cuando me sentía sola.

A mis abuelos Clementina y Vicente. Por su cariño y sincera demostración de amor,
por aceptarme en su casa y cuidarme todo el tiempo desde que tengo memoria. Por
darme un lugar seguro, son una maravilla y tan bellas personas, los amo con todo mi
corazón.

A mi director de tesis y amigo, el Dr. Luis Ramos. A su loable mentalidad es a quien
debo la mayor parte de mi experiencia profesional y conocimiento. Infinitas gracias por la
paciencia que me tuvo este tiempo, por guiarme, creer en mí y motivarme cada día para
seguir creciendo y consiguiendo oportunidades, siempre mostrando profesionalismo para
con sus estudiantes. Por la continuidad y tiempo que le ha dedicado a mi trabajo, en un
ambiente agradable. Así mismo, gracias por escucharme y aconsejarme oportunamente
en diversos aspectos.

A mis sinodales: el Dr. Martín Martínez, la Dra. Juana Alba Luis, el Dr. Luis Arturo
Baiza y el M. en C. Mario Cárdenas. Por dedicarle tiempo a mi trabajo y por los
comentarios que ayudaron a la realización de este mismo.

4
A mis mentores, la M. en C. Lizzette Mares y el Biólogo Armando Martínez. Por todo
el conocimiento que me otorgaron, por su confianza en mi persona, por darme la
seguridad que necesitaba cada día para lograr muchas cosas. Por darme un gran
ejemplo de sabiduría y constancia, pero sobre todo por su amistad.

A mis compañeros de laboratorio: Fernanda, Melina, Octavio, Jordan y Arturo. Por
hacer de mi estancia en el laboratorio una de las experiencias más gratas, representan
una familia para mi persona, agradezco su apoyo constante, así como las enseñanzas
que me dieron pacientemente y por lograr que cada mañana fuera un poco menos
pesada. Los admiro y aprecio en demasía.

A Isaac. Por el constante apoyo que me concediste el tiempo que estuve en el
laboratorio, en el aspecto técnico, administrativo, y profesional. Además de tu gran
muestra de amistad e inmenso apoyo moral, también eres parte de esto, infinitas gracias.
A mi mejor amigo Edwin. Sabiendo que tenerme como amiga conlleva una gran
responsabilidad y paciencia infinita, quiero hacerte parte de mis logros, porque eres la
primera persona que no me ha abandonado y que puedo asegurar se enorgullece de mí,
gracias por todo tu apoyo incondicional a lo largo de este tiempo, gracias por
escucharme cada noche que quería darme por vencida y me levantaste para continuar
trabajando. Te quiero.
A mis compañeros de la carrera: Octavio Trejo, Enrique Suarez y José Agustín. A
ustedes que me dieron el verdadero significado de la amistad, que me escucharon y
regalaron consejo, sabiduría y momentos divertidos durante toda la carrera, no quiero
que olviden lo que representan en mi vida. Los quiero.
A mis amigos, compañeros y familia: Christian, Mariana, Oscar, Karina y Lomelí.
Por adoptarme en su equipo y regalarme los momentos más divertidos que pude tener
en tan solo unos meses, por confiar ciegamente en mí, una completa desconocida para
algunos. Porque me tomaron en cuenta en sus planes, gracias por rescatarme de los
momentos difíciles, extenderme su mano en tantas ocasiones, les aprecio como no
tienen idea. Siempre me encontraré orgullosa de cada uno de ustedes, porque sé que
van a ser los mejores en lo que se propongan.
A mis viejos y grandes amigos: Emilio, Coco, Jacqueline, Atzin y Perla. No hay más
que decir, ustedes saben de sobra cuanto significa su compañía para mí, por tantos años
de amistad y apoyo, cada uno me ha enseñado muchísimas cosas, da gusto ser amiga
de profesionistas tan exitosos como ustedes.

5
INDICE
RESUMEN ..................................................................................................................... 6
1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 7
1.1 Determinación y diferenciación sexual .............................................................. 7
1.2 Efecto genómico de los andrógenos ............................................................... 11
1.3 Esteroidogénesis............................................................................................. 15
1.4 AKR1C4 ..........................................................................................................18
1.5 Desorden de desarrollo sexual ....................................................................... 21
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................. 24
Hipótesis ................................................................................................................... 25
Objetivo general ........................................................................................................ 26
Objetivos particulares ............................................................................................... 27
3. MATERIALES Y METODOS ................................................................................. 28
Extracción de DNA genómico ................................................................................... 28
Reacción en la cadena de la polimerasa PCR .......................................................... 29
Polimorfismo conformacional de cadena sencilla (SSCP) ........................................ 30
Purificación de DNA .................................................................................................. 31
Secuenciación........................................................................................................... 32
Análisis in sillico ........................................................................................................ 33
4. RESULTADOS ...................................................................................................... 34
5. DISCUSIÓN ........................................................................................................... 45
6. CONCLUSIÓN ...................................................................................................... 49
7. PERSPECTIVAS ................................................................................................... 50
8. REFERENCIAS ..................................................................................................... 51

6
RESUMEN

Durante la diferenciación sexual la dihidrotestosterona (DHT) es esencial para la
formación de la uretra masculina. Este andrógeno es sintetizado por la vía clásica de
esteroidogénesis. Mutaciones en las enzimas de esta vía son causantes de desórdenes
en el desarrollo sexual (Disorders of Sex Development; DSD) 46,XY; sin embargo estas
malformaciones congénitas no siempre pueden ser asociadas a la vía clásica.
Recientemente, se ha reportado una vía alterna o “Backdoor” la cual se ha sugerido
como participante para la síntesis de DHT y podría ser también causante de DSD-46,XY.
En el presente estudio se realizó un análisis mutacional del gen AKR1C4 en pacientes
46,XY con malformación uretral (hipospadias) mediante el análisis de PCR-SSCP y
secuenciación a partir de DNA genómico (gDNA). Los ensayos mediante SSCP indicaron
dos variantes en la movilidad electroforética en los exones 4 y 9 tanto en pacientes como
en individuos normales. La secuenciación de DNA indicó dos substituciones
nucleotídicas en la región codante c.434C>G y c.931C>G lo que originó un cambio de
serina a cisteína en la posición 145 y un cambio de leucina a serina en la posición 311,
respectivamente. Los análisis in sillico determinaron polimorfismos y excluyeron
patogenicidad génica. Los análisis del genotipo y haplotipo mostraron ausencia de
diferencias significativas. Los datos sugieren que las mutaciones inactivantes en el gen
AKR1C4 son una causa infrecuente de hipospadias, lo que debilita la contribución de la
vía “Backdoor” en la masculinización embrionaria de la uretra y una baja asociación en la
formación de DHT por esta vía durante el desarrollo sexual, específicamente en la
diferenciación de los genitales externos.

Palabras clave: AKR1C4; hipospadias; DHT; andrógenos; vía “Backdoor”.

7
1. INTRODUCCIÓN

1.1 Determinación y diferenciación sexual

La determinación del sexo embrionario es definida desde el momento de la
fecundación y es establecida a partir de la quinta semana, anterior a este último periodo
de tiempo es imposible distinguir el sexo del embrión, etapa denominada periodo de
indiferenciación. A partir de la sexta y séptima semana del desarrollo se iniciará la
formación hacia ovario o testículo y mediante la biosíntesis de hormonas en la octava
semana se llevará a cabo la diferenciación sexual masculina (Hughes, 2001; Rey, 2001;
Baetens et al, 2017).

La determinación sexual es un proceso biológico fundamental en el cual
numerosos genes se encuentran involucrados. Esta etapa queda definida en el momento
de la unión del ovocito (que aporta un cromosoma X) con el espermatozoide (que puede
aportar un cromosoma X o un Y). En este sentido, el cromosoma Y desencadena la
diferenciación de los testículos a partir de una gónada indiferenciada. Este mecanismo
es regulado a través del gen SRY (Swain y Lovell-Badge, 1999; Hughes, 2001). El gen
SRY localizado en el brazo p del cromosoma Y codifica para un factor de transcripción;
en gónadas indiferenciadas es el principal iniciador de la cascada de interacciones
génicas que determina el desarrollo de los testículos. El SRY conjuntamente con los
factores transcripcionales SF1 y SOX9 inician la diferenciación de las células pre-Sertoli
a células de Sertoli (Hughes, 2001; Rey, 2001; Swain y Lovell-Badge, 1999).

En el desarrollo sexual femenino, SOX9 es reprimido transcripcionalmente y por
lo tanto no se formarán gónadas masculinas. Sin embargo existen algunos genes
candidatos que son parte de este mecanismo de diferenciación sexual femenina, siendo
el más aceptado el DAX1 del cual existen pruebas genéticas que lo mencionan como
parte de la determinación sexual y diferencia gonadal (Ludbrook y Harley, 2004). El gen
DAX1 es expresado en la cresta genital de ambos sexos. En testículo el gen es inhibido,
mientras que en el ovario permanece activo. A pesar de los estudios que sugieren que el

8
factor DAX1 previene la transcripción de los genes SOX9 y SF1, se ha reportado la
participación de otros genes como WNT4, WNT7, FOXL2 y RSPO1, los cuales actúan
específicamente en la gónada femenina. Estos genes se encuentran altamente
expresados en los ductos de Müller y desempeñan un papel importante para el
desarrollo ovárico (Yu et al, 1998; Swain y Lovell-Badge, 1999; Hiort y Holterhus, 2000;
Jordan et al, 2001; Chassol et al, 2008).

La etapa de indiferenciación tendrá lugar en el mesonefros, estructura que se
desarrollará a ambos lados de la línea media, en el que se diferenciarán las llamadas
crestas genitales hacia un engrosamiento del epitelio celómico. Existen otros factores
implicados en la determinación sexual para la formación y estabilización de la cresta
genital, estos son WT1, SF1, LIM1 y EMX2. Las crestas genitales son bipotenciales y se
diferencian gonadalmente dependiendo de su determinación genética (XX o XY). Por
otro lado, dentro del saco vitelino se encuentran las células germinales primordiales, las
cuales no influyen en la determinación sexual, sin embargo, si desarrollarán los futuros
gametos masculinos o femeninos y alrededor de la semana 6-7 llegarán a colonizar las
crestas genitales (Hughes, 2001).

En el mesonefros se presenta una estructura tubular localizada en sentido
longitudinal al eje principal del gononefrotomo y es denomina conducto de Wolff.
Asimismo, como invaginación del epitelio celómico se han reportado estructuras
tubulares llamadas conductos de Müller; las cuales son unipotenciales y constituirán los
genitales internos dependiendo la carga genética. Mientras que los genitales externos
serán originados de la membrana cloacal y su diferenciación dependerá de la presencia
o ausencia de hormonas testiculares (Hughes, 2001; Rey, 2001; Voutilainen, 1992; Rey y
Josso, 1997).

Bajo la acción de los andrógenos los conductos mesonéfricos de Wolff danorigen a las estructuras internas masculinas: epidídimos, conductos deferentes, y
vesículas seminales, mientras que los conductos de Müller formarán las estructuras
internas femeninas: trompas de Falopio, útero y el tercio superior de la vagina. Como se

9
ha mencionado previamente, SOX9 y SRY son genes necesarios para la determinación
sexual de la gónada indiferenciada, su expresión en células precursoras de Sertoli
desencadena eventos que contribuirán a la formación de los túbulos seminíferos. Este
mecanismo es precedido por la diferenciación estructural de las células de Sertoli. Las
células de Sertoli junto con las células germinales se unirán para envolver los cordones
seminíferos que secretan una lámina basal y que separará las células germinales
primordiales del cordón testicular. Los vasos sanguíneos se desplazan por debajo del
epitelio celómico y se localizan a lo largo del testículo en la región opuesta al
mesonefros, marcando la diferencia morfológica del testículo (Díaz-Hernández y
Merchant-Larios, 2017).

El dogma del desarrollo sexual de los mamíferos aún carece de reportes que
asocien a genes específicos en la determinación ovárica y desarrollo de otros genitales
internos femeninos; mientras que la diferenciación masculina puede ocurrir cuando el
testículo fetal secreta dos tipos de hormonas en un periodo crítico durante la gestación
temprana (Hughes, 2001).

La siguiente fase denominada diferenciación sexual será exclusivamente
dependiente de hormonas testiculares. El contenido hormonal en testículos fetales se
encuentra elevado alrededor de la semana 12-14 de la gestación, en esta etapa las
células de Sertoli producirán la hormona anti-Mülleriana (AMH) que cumple con la
función de regresión de los ductos de Müller al unirse a un receptor transmembranal
localizado en las células mesenquimales; este mecanismo induce la apoptosis de las
células epiteliales. La secreción de la hormona luteinizante (LH) y la gonadotropina
coriónica humana (hCG) en las células de Leydig estimularán la esteroidogénesis
testicular fetal, vía anabólica importante para la formación de los andrógenos e
indispensables para el desarrollo masculino normal (Fig. 1). Múltiples reportes han
determinado que la diferenciación masculina es crucialmente dependiente de la
biosíntesis y acción de andrógenos (Swain y Lovell-Badge, 1999; Voutilainen, 1992;
Misrahi et al, 1998).

Fig. 1. Genes involucrados en la determinación y diferenciación sexual. La expresión de los
factores WT1, Lim1 y Emx2 es importante para desarrollar la gónada bipotencial a partir de la
cresta genital. Factores transcripcionales como SRY y DAX1 serán importantes para la
diferenciación gonadal expresándose uno en ausencia del otro dependiendo de la gónada.

11
1.2 Efecto genómico de los andrógenos

Los andrógenos son hormonas esteroides involucradas principalmente en la
diferenciación sexual del fenotípico masculino durante la embriogénesis y desarrollo de
caracteres sexuales secundarios en la pubertad. Los principales andrógenos
testosterona (T) y dihidrotestosterona (DHT) ejercen su acción genómica clásica
basándose en el control transcripcional mediado por el receptor de andrógenos (AR,
NR3C4), una proteína de la superfamilia de receptores nucleares (Patrao, 2009).

La síntesis de andrógenos es regulada por el eje hipotálamo-hipófisis-gónada. En
el hipotálamo será sintetizada la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH).
Esta hormona ejercerá su acción en la adenohipófisis e inducirá transcripcionalmente la
síntesis de LH, que será la encargada de estimular la síntesis de T en las células de
Leydig. Liberada la T se encontrará en concentraciones elevadas en sangre y estará
unida a proteínas séricas transportadoras como la albúmina o la globulina fijadora de
hormonas sexuales (SHBG) para llegar a sus células blanco. Una vez que la T ingresa a
la célula blanco por difusión pasiva puede asociarse directamente con el AR o ser
metabolizada por la enzima 5α-reductasa a DHT, un ligando de alta afinidad al AR
(Hiipakka y Liao, 1998; Hiort et al, 1998; Rojas et al, 2011).

El AR es un miembro de la superfamilia de receptores nucleares en donde se
encuentran otros receptores como el de glucocorticoides, mineralocorticoides,
progesteronas y estrógenos. El gen que codifica para el AR se encuentra localizado en el
cromosoma X, ubicado en la posición Xq11-q12 y presenta un peso molecular
aproximado de 98 kb. Estructuralmente está constituido por ocho exones que codifican
para una proteína de 919 aminoácidos. La proteína se encuentra dividida en tres
dominios funcionales: 1) Un dominio N-terminal el cual contiene 537 amino ácidos que
representa más de la mitad de la proteína del AR y es codificado únicamente por el exón
1, contiene un dominio de transactivación independiente del ligando (AF1) y un dominio
que regula la actividad constitutiva localizado entre el aminoácido 141 y 338. Otra de las
características llamativas de este dominio es la presencia de múltiples repeticiones de

12
amino ácidos, en particular de poliglutamina (codificado por los trinucleótidos CAG/CAA)
y poliglicina (por los trinucleótidos GGC/GGT), de las cuales no se conoce un papel
fisiológico exacto, pero pueden ser importantes en la regulación transcripcional vía
interacciones proteína-proteína con otros factores de transcripción incluidos SRC-3,
CBP, TAFII130 y Sp1. 2) Un dominio de unión al DNA (DBD) que contiene 89 amino
ácidos y presenta una región central rica en cisteínas. El DBD es codificado por los
exones 2 y 3, este dominio está formado estructuralmente por dos dedos de zinc. El
primero se encarga de regular las interacciones específicas receptor-DNA, en la base de
este dedo aparecen particularmente tres aminoácidos los cuales interactúan con las
secuencias de nucleótidos potenciadoras de la transcripción llamadas elementos de
respuesta a hormonas (HRE). Los HREs están presentes en genes andrógeno-
dependientes usualmente localizados en su región 5’, mientras que el segundo dedo
está predominantemente involucrado en la dimerización del receptor y estabilización de
la interacción por unión a la columna de fosfatos. 3) Una región bisagra codificada por la
porción 5’ del exón 4 y que se encarga de regular la transferencia del AR del citoplasma
a su sitio de acción nuclear y finalmente 4) un dominio de unión al ligando (LBD) que
contiene alrededor de 290 amino ácidos, codificado por la parte 3’ del exón 4 y de los
exones 5-8. Las funciones principales de este dominio son la unión a andrógenos y su
participación en la activación transcripcional dependiente del ligando (AF2), dimerización
del receptor; así como la interacción con proteínas de choque térmico (Fig. 2) (Hiort et al,
1998; Heinlein y Chang, 2002; Levalle y Lalosa, 2015; Quigley et al, 1995).

13
Fig. 2. Organización génica y funcional del AR o NR3C4. A) Se muestra la región q11-12 del
cromosoma X en la cual se localiza el gen del AR. B) El gen se compone de 8 exones separados
por unas regiones intrónicas (1-7). C) En el cDNA se observan los tamaños del exón por pares
de bases siendo el exón 1 el más grande. D) La proteína del AR contiene tres dominios
funcionales; N-terminal, dominio de unión al DNA, región bisagra y un dominio de unión al
ligando.

Una vez que la T entra por difusión pasiva al citoplasma celular puede ser 5α-
reducida en DHT y unirse al AR, el cual se encuentra inactivado por proteínas de choque
térmico (HSP) o chaperonas, como HSP90 y HSP70. Las HSP se liberarán del AR una
vez que el ligando se ancla en el sitio de unión. La unión T-AR provoca la fosforilación de
regiones específicas del factor transcripcional y la consecuente translocación al núcleo
en donde puede ocurrir la dimerización para unirse a secuencias específicasdel DNA
que son conocidas como ERA. Unido a estas secuencias el AR requiere de factores
transcripcionales (TFII A, TFII B, TFIID, TFIIE, TFII F y TFIIH) como de la RNA
polimerasa II para realizar la transcripción, las cuales tienen unión en las regiones AF1 y
A
B
C
D

14
AF2 de los dominios del receptor. Concluida la transcripción el mRNA (Fig. 3) saldrá al
citoplasma para unirse a ribosomas y conformar la proteína (Gobinet et al, 2002; Lee y
Chang, 2003; Mongan et al, 2015).

Fig. 3. Mecanismo de acción de los andrógenos en la célula blanco. La T ingresa por difusión
pasiva a la célula, se 5α-reduce en DHT y así se puede unir al AR liberándose de las HSP que lo
mantienen inactivo. EL AR es activado mediante fosforilaciones, se dimeriza para translocarse al
interior del núcleo en donde se une a los ERA localizados en el DNA. EL AR conjuntamente con
los correguladores y la RNA Polimerasa II controlan la expresión de genes andrógeno-
dependientes.

DHT

15
1.3 Esteroidogénesis

Las hormonas esteroides han sido clasificadas en cinco grupos de acuerdo a su
función; mineralocorticoides, glucocorticoides, estrógenos, progestinas y andrógenos.
Todas ellas son estructuralmente similares y son sintetizadas a partir del colesterol. La
esteroidogénesis requiere de múltiples enzimas que están involucradas en la conversión
del colesterol a esteroides activos. Estas enzimas consisten específicamente de
citocromos P450 (CYPs), hidroxiesteroide deshidrogenasas (HSDs) y esteroide
reductasas. Principalmente existen tres órganos endocrinos especializados en la síntesis
de novo de hormonas esteroides; las glándulas suprarrenales, testículos y ovarios, no
obstante en el sistema nervioso central y transitoriamente en la placenta pueden
sintetizarse esteroides (Miller, 1988; Sanderson, 2006).

Los tejidos esteroidogénicos pueden sintetizar colesterol de novo a partir de
acetato pero las células humanas obtienen colesterol generalmente de lipoproteínas de
baja densidad del plasma (LDL). Los ésteres de colesterol son absorbidos por
endocitosis mediada por receptores. Los ésteres LDL de colesterol pueden ser
encontrados directamente o pueden ser convertidos a colesterol libre y usado para la
síntesis de hormonas esteroides en gónadas y corteza suprarrenal debido a su
transporte hacia la mitocondria. El mecanismo regulador de transporte hacia el interior
mitocondrial es controlado por la proteína reguladora de la esteroidogénesis aguda o
StAR (Gómez-Chang et al, 2012; Miller, 1988).

La conversión de colesterol a pregnenolona en mitocondria es el primer paso en la
síntesis de todas las hormonas esteroides, donde el citocromo (CYP11A) P450scc (side-
chain cleavage) es la enzima responsable (Fig. 4). El citocromo es expresado en las tres
zonas de la corteza suprarrenal, en células de Leydig y en la teca interna del ovario. Una
vez que la pregnenolona es sintetizada puede ser 17α-hidroxilada para formar 17α-
hidroxipregnenolona y dehidroepiandrosterona (DHEA) mediante el CYP17A1. La 3β-
HSD tipo II (HSD3B2) puede utilizar como substrato DHEA y pregnenolona para formar

16
Δ4-androstendiona y progesterona, respectivamente (Hanukoglu, 1992; Miller, 1988;
Payne y Hales, 2004).

La biosíntesis de andrógenos se lleva a cabo en células de Leydig en caso del
testículo y en la zona reticular en la glándula suprarrenal. En vertebrados, la síntesis de
T ocurre mediante dos vías conocidas como Δ4 y Δ5. En humanos, la vía predominante
es la Δ5 contrariamente a roedores (Schiffer, 2018).

En la vía Δ5 la androstendiona es reducida a T mediante la aldo ceto reductasa
familia 1 miembro C3 (AKR1C3) o la 17β-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 3 (17β-
HSD tipo 3 o HSD17B3) y puede ser reducida a 5α-androstandiona mediante la 5α-
reductasa tipo 2. La mayoría de las conversiones de T a DHT se llevan a cabo mediante
la 5α-reductasa tipo 2; mientras que la formación de DHT a partir de 5α-androstandiona
requiere de AKR1C3 (Hanukoglu, 1992; Miller, 1988).

En la vía alterna o “backdoor” la progesterona es el sustrato primordial y por
acción de la 5α-reductasa tipo 1 forma 5α-pregnan-3,20-diona, que una vez sintetizado
será reducida por la actividad de AKR1C2/4 para la formación de 3α-hidroxi-5α-pregnan-
20-one (alopregnenolona) y mediante el CYP17A1 la alopregnenolona será transformada
a androsterona, que será reducida a 5α-androstano-3α, 17β-diol (androstandiol)
mediante la enzima AKR1C3. Para la formación de la DHT el androstandiol requiere de
la AKRC2/4 o HSD17B6 (Luu-The, 2013; Uribe, 2016; Schiffer et al, 2018).

Fig. 4. Esquema representativo de las vías de síntesis de andrógenos con las enzimas
necesarias (flechas), en morado la ruta clásica Δ5 que utiliza T para sintetizar a DHT. En verde la
ruta alterna, la cual no requiere de T y necesita de la 5α reducción de androstendiona a 5α-
androstandiona para la síntesis de DHT. En azul se muestra la vía “backdoor”, la cual no utiliza
T, androstendiona ni DHEA para la síntesis de DHT pero requiere de la familia de androstandiol y
de las AKR1C.

Androstendiona

18
1.4 AKR1C4

La AKR1C4 [también denominada dihidrodiol deshidrogenasa (DD4), clordecona
reductasa (CDR), aldo-ceto reductasa, 3α-hidroxiesteroide deshidrogenasa (3α-HSD)].
Pertenece a la familia de las aldo ceto reductasas, isoenzimas que se caracterizan por la
conversión de aldehídos y cetonas a sus respectivos alcoholes utilizando como cofactor
NADH o NADPH. Su localización es principalmente identificada en el citoplasma celular.
Se encuentra específicamente en hígado y es responsable de la inactivación de
hormonas esteroides manteniendo el balance homeostático en circulación. Estudios
sugieren que esta enzima se encuentra presente en humanos y tiene la capacidad de
reducir y deshidrogenar compuestos como la conversión de 5α-dihidrotestosterona a 5α-
androstano-3α,17β-diol (androstandiol) empleando NADPH como cofactor de la 3α-
deshidrogenación de androsterona. Asimismo la enzima cataliza eficazmente la
reducción de 5α-pregnane-3,20-diona (dihidroprogesterona) para producir 3α-hidroxi-5α-
pregnan-20-ona (alopregnenolona) que es el precursor de androsterona (Khanna et al,
1995; Stayrook et al, 2007; Zeng et al, 2017).

El gen AKR1C4 tiene una longitud de 20 kilobases y una región codificante de 969
nucleótidos dividida en 9 exones y 8 intrones. Se localiza en el cromosoma 10p14-15 y
codifica para una proteína de 323 aminoácidos. Los intrones varían de tamaño desde
375 pares de bases hasta aproximadamente 6 kilobases (Fig. 5) (Qin et al1993; Khanna
et al, 1994; 1995).

Fig. 5. Organización génica de AKR1C4 donde se observan los 9 exones y 8 intrones.

La secuencia de aminoácidos de la AKR1C4 es muy similar a la de AKR1C2 y la
mayoría de los residuos catalíticamente importantes (Asp50, Tir55, Lis84 e His117) son
encontrados en posiciones similares en el exón 2 de ambas enzimas. La unión de
NADPH y sustratos esteroideos requiere flexibilidad significativa en la estructura de la
AKR1C4. En AKR1C4, Leu54 está potencialmente involucrado en la determinación de la
especificidad del sustrato, mientras que Asp50 y Lis84 equilibran la fuerza de disociación
del sitio activo, lo que es necesario para que los electrones del anillo de NADPH se
transfieran al sustrato esteroide (Flück et al, 2011).

AKR1C4 es predominantemente una 3-ceto esteroide reductasa con eficiencia
catalítica en 3α-HSD y actúa como subsidiaria en 3β-HSD, un paso catabólico importante
en la transformación de hormonas esteroides. Basados en sus eficiencias catalíticas, los
trabajos han propuesto que esta es una isoforma del hígado que trabaja en conjunto con
la 5β-reductasa en el catabolismo o inactivación de hormonas esteroides, asimismo se
ha demostradosu relación en la biosíntesis intermediaria de los ácidos biliares. Uno de

20
los principales ejemplos de la actividad de las HSDs es la reducción del andrógeno DHT
a androstandiol en el C-6 y androstandiona (Fig. 6). La formación de androstandiol por la
HSD17B6 es irreversible, mientras que la DHT puede ser formada a través de la
actividad de la AKR1C4. Asimismo, el androstandiol puede ser oxidado a androsterona
en C-7 por la AKR1C4 (Penning et al, 2003; Steckelbroeck et al, 2004).

Fig. 6. Papel bioquímico de la AKR1C4 en el metabolismo de andrógenos. La isoenzima cataliza
in vitro la interconversión bidireccional de 3-cetosteroides con 3-hidroxiesteroides, así como 17-
cetosteroides con 17-hidroxiesteroides.

21
1.5 Desorden de desarrollo sexual

El término desorden de desarrollo sexual (DSD) es definido como aquellas
condiciones congénitas en las cuales el desarrollo cromosómico, gonadal o anatómico
del sexo es atípico. Esta terminología se ha propuesto ya que anteriormente para
referirse a pacientes con estos padecimientos se utilizaban diversos términos confusos y
que a su vez no eran del tanto específicos para definir el desorden sexual, ya que se
necesitaba una especificidad clínica para aportar una nomenclatura adecuada a los
pacientes y familiares (Lee et al., 2006). Estudios han sugerido clasificaciones que
abarcan los tipos de desórdenes de desarrollo sexual como son:

DSD en cromosomas sexuales; 45, X (síndrome de Turner), 47, XXY (síndrome
de Klinefelter y variantes, 45, X/46XY (MGD, ovotesticular DSD) y 46, XX/46, XY
(quimera, ovotesticular DSD) (Lee et al., 2006; Cools et al., 2018).

DSD 46,XY; desordenes del desarrollo gonadal (testicular), disgenesia gonadal
completa (síndrome de Swyer), disgenesia gonadal parcial, DSD con regresión gonadal y
ovotesticular. Desordenes en la síntesis (por ejemplo; deficiencias en 17β-
hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 3 y deficiencia de 5α-reductasa tipo 2, mutaciones
en StAR) o acción de andrógenos (CAIS, PAIS), defectos en el receptor de la hormona
luteinizante (hipoplasia y aplasia en células de Leydig) y desordenes en el receptor de la
AMH (Cools et al., 2018).

DSD 46, XX; desordenes del desarrollo gonadal (ovario) como DSD ovotesticular,
DSD testicular (ejemplo, SRY o SOX9 duplicado) y disgenesia gonadal. Exceso de
andrógenos fetales (deficiencia de 21-hidroxilasa), fetoplacental (deficiencia de
aromatasa, p450 oxidoreductasa) y maternal (luteoma) (Lee et al., 2006).

Existen criterios que sugieren que los DSD incluyen manifiesto de genitales
ambiguos (por ejemplo extrofia cloacal), genitales aparentemente femeninos (con
alargamiento de clítoris, posterior fusión labial o una masa inguinal), genitales

22
aparentemente masculinos con testículos no descendidos, micropene, hipospadias
(defecto congenito de la uretra) perineales aisladas o hipospadias ligeras con testículos
no descendidos, una historia familiar de DSD como CAIS y una discordancia entre
apariencia genital y un cariotipo prenatal (Alhomaidah et al., 2017).

Muchos de los casos de DSD son reconocidos en el periodo neonatal, en jóvenes
o adultos y en estos casos se pueden presentar hernias inguinales, pubertad incompleta,
virilización en mujeres y ocasionales ciclos de hematuria en hombres. A pesar de los
diversos métodos de diagnóstico en estos pacientes, gracias a la accesibilidad o
problemas una diagnosis molecular especifica es identificada en solo aproximadamente
20% de los casos con DSD y solo el 50% de niños 46,XY con DSD reciben un
diagnóstico definitivo (Alhomaidah et al., 2017).

Una de las problemáticas en estos pacientes es la asignación del género para lo
cual se toman en cuenta factores como el cariotipo o la apariencia genital. Más del 90%
de pacientes con 46,XX con hiperplasia congénita y todos los pacientes con 46,XY CAIS
son asignados con sexo femenino, por otro lado aproximadamente 60% de pacientes
con deficiencias en 5α reductasa son asignados masculinos. En pacientes con síndrome
de insensibilidad a andrógenos parcial (PAIS), con defectos en la biosíntesis de
andrógenos y disgenesia gonadal incompleta hay inconformidad en el sexo asignado en
el 25% de pacientes sea masculino o femenino (Alhomaidah et al., 2017).

Los estudios han recopilado mejor la información acerca de los DSD y los genes
involucrados en estos padecimientos, como se describe a continuación:

46,XY DSD, desordenes del desarrollo gonadal testicular: WT1, SF1, SRY, SOX9,
DHH, ATRX, ARX. Desordenes del desarrollo gonadal testicular (cambios cromosómicos
involucrados en genes): DMRT1, DAX1 y WNT4. Desordenes en la síntesis o acción de
hormonas: LHGCR, DHCR7, StAR, CYP11A1, HSD3B2, CYP17, POR, HSD17B3,
SRD5A2, AMH, AR. 46,XX DSD, desordenes del desarrollo gonadal ovárico: SRY,

23
SOX9, HSD3B2, CYP21A2, CYP11B1, POR, CYP19, receptor de glucocorticoides
(Mouriquand et al., 2016).

Las hipospadias comprenden una malformación al nacimiento en varones 46,XY y
se definen clínicamente como una malformación congénita en la que existe una apertura
anormal de la uretra. La anormalidad uretral puede localizarse en el falo, escroto o
perineo. Los agentes etiológicos que se han propuesto para el desarrollo de hipospadias
son factores endocrinológicos, genéticos, maternos y en raras ocasiones ambientales.
Las causas fundamentales para la formación de hipospadias pueden ser debidas a
defectos en la estimulación androgénica de la uretra o la deficiencia de 5α-reductasa tipo
2 (Pacheco-Mendoza y Rendón-Macías, 2016).

24
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Evidencias recientes han mostrado que la vía “backdoor” en la biosíntesis de
andrógenos podría ser importante o estar implicada en la diferenciación sexual
masculina de individuos 46,XY, esto indica una posible participación de la vía “backdoor”
en la formación de DHT. Por lo tanto, en esta investigación se realizarán ensayos
moleculares para determinar mutaciones en el gen AKR1C4 en pacientes de origen
mexicano con cariotipo 46,XY y fenotipificados clínicamente y únicamente con
hipospadias aisladas.

Hipótesis

Si la vía “backdoor” es una de las principales fuentes de esteroides C19-5α-
reducidos durante la embriogénesis, las deficiencias de la actividad enzimática de la 3α-
HSD (oxidativa-reductiva) podría ser una causa de DSD 46,XY debido a la incapacidad
de formar 3α-diol o convertir 3α-diol a DHT. En consecuencia, estos individuos tendrían
un cuadro clínico similar al de los sujetos con síndrome de insensibilidad a andrógenos
parcial (PAIS) o deficiencia de 5α-reductasa tipo 2.

Objetivo general

Determinar la contribución del gen AKR1C4 como causa molecular de DSD 46,XY
asociado a hipospadias.

Objetivos particulares

1. Identificar mutaciones en el gen AKR1C4 mediante PCR-SSCP en individuos
46,XY con DSD-hipospadias.

2. Analizar mediante secuenciación la región codante del gen AKR1C4 en
individuos 46,XY con DSD-hipospadias.

3. Realizar un análisis in silico mediante el uso de programas para predecir la
patogenicidad de las variantes génicas identificadas.

28
3. MATERIALES Y METODOS

Sujetos
Se utilizó DNA genómico de 25 pacientes 46,XY de origen mexicano
diagnosticados al nacimiento única y exclusivamente con hipospadias aisladas. Como
estudios iniciales se incluyeron los genes NR3C4, SRD5A2, AKR1C2, AKR1C3,
HSD17B6 y HSD17B3 como causa de hipospadias aisladas en estos pacientes. Para el
grupo controlse incluyeron 100 individuos masculinos sanos (sin presencia de DSD ni
afectación en el aparato urogenital) de origen mexicano.

Extracción de DNA genómico

Se tomaron 10 mL de sangre periférica de pacientes (25) y controles (100) los
cuales fueron colocados en tubos cónicos con 200 μL de EDTA 0.5 M pH 8 y mezclados
por inversión. Las muestras se colocaron en hielo y se llevaron a 35 mL con sacarosa
Tritón 2X (sacarosa 0.64 M, Tris-base 0.02 M, MgCl2 0.01 M, Tritón X100 2%), la mezcla
se llevó a 50 mL con agua estéril, desionizada-destilada y se mezcló por inversión. Las
muestras se dejaron en hielo por 10 minutos con agitación suave. Para obtener el
precipitado celular se centrifugó a 1000 x g a 4°C por 15 minutos decantando el
sobrenadante para lavar el precipitado con 5 mL de solución sacarosa Tritón 1X con
posterior centrifugación a 1000 xg por 15 minutos a 4°C. El precipitado se resuspendió
en 3 mL de Solución de Lisis Nuclear (Tris-base 10 mM, NaCl 400 mM y Na2EDTA 2
mM), 108 μL de Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) al 20% y 100 μL de Proteinasa K (5
mg/ml). La muestra fue incubada con agitación a 50°C durante un mínimo de 2 horas. El
contenido fue transferido a tubos cónicos estériles de 15 mL, se agregó 1 mL de NaCl
saturado y se agitó vigorosamente 15 segundos. Se centrifugó a 1000 xg durante 15
minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se recuperó, se agregaron 2
volúmenes de etanol absoluto frío y se mezcló por inversión hasta que el DNA precipitó.
El DNA fue extraído con una pipeta Pasteur sellada y se lavó con etanol al 70% por 30
segundos. Se dejó secar durante 30 segundos y el DNA fue colocado en tubos para
microcentrífuga de 500 μL que contenían 400 μL de Tris-EDTA (TE, 1 ml de Tris 1 M,

29
0.02 ml de EDTA 0.5 M). Se dejó disolver a 37°C durante 24 horas. El DNA se cuantificó
en un espectrofotómetro “Beckman DU 650”.

Reacción en la cadena de la polimerasa PCR

Se amplificaron los 9 exones del gen AKR1C4 de manera individual mediante
PCR usando oligonucleótidos sintetizados como indicadores para la síntesis de DNA en
la región intrónica adyacente a la zona de corte y empalme diseñados de acuerdo a las
secuencias nucleotídicas ya reportadas en el GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) utilizando el programa PrimerQuest
(http://www.idtdna.com/primerquest/Home/Index). Para el PCR punto final se realizó la
reacción colocando 4 μL de solución amortiguadora 5X, 0.5 μL de dNTP’s (20 μM), 0.5
μL Oligo 5’ (20 μM), 0.5 μL de Oligo 3’ (20 μM), 5 μCi de dCTP marcado en α con 32P,
GoTaq Polimerasa (1 u/μL), 2 μL de MgCl2 25 mM, DMSO (1%), 10 ng de gDNA y se
llevó a un volumen final de 20 μL con H2O. Las reacciones fueron colocadas en un
termociclador Veriti 96 well thermal cycler por 1 ciclo a 94°C 3 min, 30 ciclos a 94°C por
30 seg, 60°C por 30 seg, 72°C por 30 seg y 1 ciclo a 72°C por 3 min.

Los productos amplificados mediante PCR fueron analizados en geles de agarosa
al 1% [pesar 1 g de agarosa en 100 mL de TBE 0.5X (TBE 5X, 27.5 g de ácido bórico, 54
g de Tris base y 20 mL de EDTA 0.5 M)] y teñidos con Midori Green. Los productos (5
μL) fueron depositados en geles de agarosa utilizando 3 μL solución de carga para DNA
(azul de bromofenol 0.25% p/v, cianol xileno 0.25% p/v, ficoll 400 5% p/v) y comparados
con un marcador de peso molecular (MPM) de 100 pares de bases. La electroforesis se
dejó correr a 100 volts y se observó en un transiluminador.

http://www.idtdna.com/primerquest/Home/Index

30
Polimorfismo conformacional de cadena sencilla (SSCP)

Los ensayos mediante la técnica de SSCP se realizaron posterior a la
amplificación de los nueve exones, de los cuales se tomaron 2 μL de la muestra los
cuales fueron mezclados con 13 μL de solución de carga para SSCP [formamida 95%,
EDTA 20 mM y azul de bromo fenol (0.05%)], los amplicones se desnaturalizaron por 5
minutos a 94°C y fueron colocados en geles de poliacrilamida de 30x40 cm a diferentes
concentraciones de acrilamida (5.4% y 8% con y sin glicerol) (Tabla 1) los cuales se
sometieron a electroforesis con solución de corrida TBE 0.5X a 200-250 volts por un
periodo de 18 horas.

Terminada la electroforesis, los geles se desmontaron y se transfirieron a papel
Whatman 3MM y fueron secados (Slab Gel Dryer, Savant) durante una hora a 70°C,
pasado este proceso se expuso en una pantalla “Molecular Imager FX, Imaging screen-
K, BioRad” en un cartucho con pantallas intensificadoras durante 3 horas, la cual
finalmente fue analizada en un escáner PMI con el programa QuantityOne.

Tabla 1. Reactivos necesarios para geles de poliacrilamida de 70 mL.

Reactivo Gel de Poliacrilamida al 8% Gel de Poliacrilamida al 5.4%
Con glicerol Sin glicerol Con glicerol Sin glicerol
H2O 29.85 mL 36.89 mL 35.91 mL 42.91 mL
Glicerol 7.0 mL -------- 7.0 mL --------
TBE 5X 14.0 mL 14.0 mL 14.0 mL 14.0 mL
Ac/Bis (29:1) 18.66 mL 18.66 mL 12.6 mL 12.6 mL
PSA 10% 0.49 mL 0.49 mL 0.49 mL 0.49 mL
Temed 25 µL 25 µL 24.5 µL 24.5 µL

31
Purificación de DNA

Los exones identificados con alteraciones mediante SSCP se amplificaron
nuevamente en las mismas condiciones pero con la ausencia de dCTP-32P. Se
agregaron 20 μL de solución de carga para DNA, estos fueron colocados en geles de
agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio para ser purificados, el gel se dejó correr a
100 volts por aproximadamente 45 minutos para posteriormente cortar el sitio donde se
encontraba la muestra. Los fragmentos fueron colocados en membranas de diálisis (las
cuales fueron previamente lavadas con agua estéril, desionizada y destilada y colocadas
en TBE 0.5X) y se les agregó 300 μL de TBE 0.5X para después realizar la
electroelución a 100 volts durante 15 minutos, pasado el periodo de tiempo, la muestra
se transfirió a columnas Amicon Ultra-4, 30 K con 1.5 mL aproximadamente de agua
estéril, desionizada y destilada. Las columnas fueron centrifugadas a 1500 x g durante
20 minutos, finalmente se colectó el DNA purificado y se colocó en tubos Eppendorf de
0.5 μL del amplicón obtenido, se observaron en geles de agarosa al 1% para verificar su
concentración/pureza y posteriormente se cuantificó espectrofotométricamente para
secuenciación.

32
Secuenciación

Las muestras que fueron purificadas se prepararon para secuenciar utilizando el
estuche BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Austin, TX).
Las reacciones se realizaron de la siguiente manera: 2 μL de la mezcla de reacción, 1 μL
de solución amortiguadora, 5 μL de H2O, 2 pmol de oligonucleótido y 10 ng del DNA. Las
muestras se colocaron en un termociclador Veriti “96 well thermal cycler” durante un
tiempo de corrida de aproximadamente tres horas. Las condiciones de secuenciación
fueron las siguientes: un ciclo a 96°C por 1 minuto, treinta y cinco ciclos a 95°C por 10
segundos, 50°C por 5 segundos y 60°C por 4 minutos, con una extensión final a 4°C.

Terminada la reacción se purificaron las muestras utilizando 45 μL de solución
SAM y 10 μL de solución XTerminator. Las muestras se colocaron en agitación durante
30 minutos y se centrifugaron durante 2 minutos a 500 xg. El sobrenadante se colectó en
tubos estériles. Finalmente las muestras se colocaron en un equipo “ABI PRISM 310
Genetic Analyzer” para la secuenciación en ambos sentidos. Los experimentos fueron
realizados en 3 ensayos independientes.

33
Análisis in sillico

Se realizó un análisis de las variaciones encontradas en las secuencias realizadas
y fueron comparadas en bases de datos MutationTaster2
(http://www.mutationtaster.org/), PolyPhen 2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/),
Provean (http://provean.jcvi.org/seq_submit.php) y SIFT (https://sift.bii.a-star.edu.sg/)
para predecir la patogenicidad de lassubstituciones identificadas.

http://www.mutationtaster.org/
http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/
http://provean.jcvi.org/seq_submit.php

34
4. RESULTADOS

Como paso inicial se amplificaron mediante PCR los 9 exones (del exón 1 al 9) del
gen AKR1C4 en individuos 46,XY-DSD. Los amplicones fueron colocados en geles de
agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio y sometidos a electroforesis con un
marcador de peso molecular (MPM). Los resultados mostraron que los exones si habían
amplificado y presentaban el tamaño esperado de 100 a 250 pares de bases (pb) similar
al de los sujetos sanos control (Fig. 7). Asimismo, presentaban patrones de bandeo
único lo cual índica la especificidad de la reacción de PCR.

Fig. 7. Imagen representativa de un gel de agarosa observado bajo luz UV. En este caso se
muestra únicamente el exón 7 del gen AKR1C4. En la figura se muestran los controles (C) y los
pacientes (1-12) comparados con el MPM de 100 pb.

Una vez comprobado que los exones fueron amplificados correctamente se realizó
el estudio de cada uno de los exones mediante SSCP en geles de poliacrilamida de
35x43 cm a diferentes concentraciones de acrilamida [(5.4% y 8% con glicerol (c/g) y
5.4% y 8% sin glicerol (s/g)]. Un total de 36 sistemas para el gen AKR1C4 fueron
realizados. Los geles fueron secados utilizando un desecador (Slab Gel Dyer) y
expuestos en una pantalla sensible a radiactividad (Molecular Imager FX Imaging scree-
k). Los resultados mostraron variaciones en el exón 4 y en el exón 9 observando tres
distintos tipos de patrón de migración (Fig. 8 y 9). Los exones 1, 2, 3, 5, 6, 7 y 8 del gen
AKR1C4 no presentaron variaciones o cambios en su secuencia nucleotídica (Fig. 10).

Fig. 8. Ensayos de SSCP al 8% s/g del exón 4 del gen AKR1C4. Los grupos controles (C) se
encuentran en los extremos y se muestran los 25 pacientes estudiados, con flechas se señalan
los patrones de migración electroforética diferentes.

C
C
Se
r

C
is

Se
r/
C
is

Fig. 9. Ensayos de SSCP al 8% c/g del exón 9 del gen AKR1C4. Los grupos controles se
localizan en los extremos y se muestran en comparación los 25 pacientes. Las flechas señalan
las variaciones que se presentan.

Le
u
/V
al

V
al

C C
Le
u

Fig. 10. Ensayos de SSCP del exón 8 como imagen representativa en la que se muestra que el
patrón de migración electroforética es similar en todas las muestras de individuos control y
pacientes con hipospadias.

C
C

38
Identificadas las substituciones o alteraciones moleculares del gen AKR1C4 a
partir de pacientes 46,XY-hipospadias, se procedió a secuenciar los exones 4 y 9 que
presentaban alteraciones en la movilidad electroforética (Tabla 2).

Los resultados detectaron una variante polimórfica en el nucleótido 434 de la
región codante del exón 4 y que consistió en la identificación en diferentes pacientes de
un alelo homocigoto para citosina (C), un alelo homocigoto para guanina (G) y un alelo
heterocigoto para C/G (Tabla 2). La variante puntual originó en el codón 145 (Fig. 11) la
localización de una serina (TCT; p.S145), una cisteína (TGT; p.C145) y un heterocigoto
para serina y cisteína (p.S145/ p.C145).

Tabla 2. Alelos identificados en el exón 4 del gen AKR1C4 asociados a pacientes
con DSD 46,XY-hipospadias.

Paciente Exon 4
P1 TGT
P2 TGT
P3 TCT/TGT
P4 TCT/TGT
P5 TCT/TGT
P6 TCT/TGT
P7 TCT
P8 TCT/TGT
P9 TCT
P10 TCT
P11 TGT
P12 TCT
P13 TCT
P14 TCT
P15 TCT/TGT
P16 TCT/TGT
P17 TCT/TGT
P18 TCT/TGT
P19 TCT
P20 TCT/TGT
P21 TCT
P22 TCT/TGT
P23 TCT/TGT
P24 TCT/TGT
P25 TCT

Fig. 11. Secuencia parcial del exón 4 del gen AKR1C4. La secuencia muestra las variantes
alélicas identificadas en la posición 434 (c.434C>G).
p.Ser145Cys
GTG GAT CTC TCT GCC ACA TGG
TGT
Exón 4

40
Los resultados obtenidos mediante secuenciación del exón 9 del gen AKR1C4
identificaron una variante polimórfica en el nucleótido 931. La variante fue localizada en
el codón 311 y mostró como resultado un alelo homocigoto para C, un alelo homocigoto
para G y un alelo heterocigoto para C/G (Tabla 3). La variante nucleotídica del alelo 311
(Fig. 12) codifica para una leucina (CTT; p.L311), una valina (GTT; p.V311) y un
heterocigoto para L y V (p.L311; p.V311).

Tabla 3. Alelos identificados en el exón 9 del gen AKR1C4 asociados a pacientes
con DSD 46,XY-hipospadias.

Paciente Exon 9
P1 CTT
P2 CTT
P3 CTT/GTT
P4 CTT/GTT
P5 CTT/GTT
P6 CTT/GTT
P7 GTT
P8 CTT/GTT
P9 GTT
P10 GTT
P11 CTT
P12 GTT
P13 GTT
P14 GTT
P15 CTT/GTT
P16 CTT/GTT
P17 CTT/GTT
P18 CTT/GTT
P19 GTT
P20 CTT/GTT
P21 GTT
P22 CTT/GTT
P23 CTT/GTT
P24 CTT/GTT
P25 GTT

Fig. 12. Secuencia parcial del exón 9 del gen AKR1C4. La secuencia muestra las variantes
alélicas identificadas en la posición 931 (c.931C>G).

ctt ttc agt CTT ATG GAC CAT
GTT
p.Leu311Val
Exón 9

42
A partir de los resultados obtenidos mediante PCR-SSCP y secuenciación para
los pacientes 46,XY con DSD se procedió a analizar mediante PCR-SSCP las variantes
polimórficas del codón 145 (exón 4, c.434C>G) y 311 (exón 9, c.931C>G) del gen AKR1C4
en 100 individuos controles sanos (Tabla 4).

Tabla 4. Alelos identificados en el exón 4 y 9 del gen AKR1C4 en 100 individuos
controles sanos.

Gen Variante nucleotídica Alelo Número de individuos
AKR1C4 c.434C>G C/C 74
G/G 2
C/G 24
c.931C>G G/G 74
C/C 2
C/G 24

43
Se realizó un análisis de equilibrio Hardy-Weinberg para determinar si los
genotipos encontrados se encuentran en equilibrio utilizando las frecuencias genotípicas
y alélicas (Tabla 5) y por medio de la prueba Chi-cuadrada (X2) con 1 grado de libertad
(gl). Los resultados indicaron que no existe diferencia significativa (NS) y podemos
sugerir que la población se encuentra en equilibrio (Tabla 6 y 7). Las frecuencias se
presentaron en igual proporción en ambos exones, mostrándose los homocigotos G/G en
el exón 4 y C/C en el exón 9 los de menor frecuencia y los homocigotos C/C para el exón
4 y G/G en el exón 9 los de mayor frecuencia para el caso de los controles. Por el lado
de los pacientes en el exón 4 y 9 los de menor frecuencia fueron el homocigoto G/G y el
C/C respectivamente, así como los heterocigotos C/G los de mayor frecuencia.
Tabla 5. Frecuencias genotípicas y alélicas de las variaciones encontradas para
los exones 4 y 9 del gen AKR1C4.

Gen AKR1C4 Frecuencias
genotípicas
Frecuencias alélicas

Controles
Exón 4
c.434C>G
G/G
C/C
C/G
0.02
0.74
0.24

p= 0.17
q= 0.83

Pacientes
Exón 4
c.434C>G
G/G
C/C
C/G
0.12
0.36
0.52

p= 0.38
q= 0.62

Controles
Exón 9
c.931C>G
C/C
G/G
C/G
0.02
0.74
0.24

p= 0.17
q= 0.83

Pacientes
Exón 9
c.931C>G
C/C
G/G
C/G
0.12
0.36
0.52

p= 0.38
q= 0.62

44
Tabla 6. Probabilidad determinada para el exón 4 (c.434C>G) y la significancia
según los grados de libertad de acuerdo a Hardy-Weinberg.

Población Muestras gl X2 Probabilidad Significancia
Controles 100 1 1.28 0.72 NS
Pacientes 25 1 0.2673 0.34 NS

Tabla 7. Probabilidad determinada para el exón 9 (c.931C>G) y la significancia
según los grados de libertad de acuerdo a Hardy-Weinberg.

Población Muestras gl X2 Probabilidad SignificanciaControles 100 1 1.28 0.72 NS
Pacientes 25 1 0.2673 0.34 NS

Ambas substituciones fueron analizadas in sillico mediante los programas
previamente mencionados en la metodología para la predicción de variantes
patogénicas. Las predicciones encontradas señalan que se trata de una variación
benigna o polimorfismo por lo cual no son las causantes de la patogenicidad en los
individuos en el caso de ambos exones (Tabla 8).

Tabla 8. Predicciones de ambas variaciones en el gen AKR1C4 según diferentes
bases de datos.

Variantes Provean Polyphen-2 MutationTaster SIFT
p.Ser145Cys Neutral Benigna Polimorfismo Tolerada
p.Leu311Val Neutral Benigna Polimorfismo Tolerada

45
5. DISCUSIÓN

Los andrógenos son esteroides sexuales considerados como responsables de la
diferenciación sexual masculina y del mantenimiento de los caracteres sexuales
secundarios. La acción de los andrógenos es regulada mediante la unión a su receptor
nuclear denominado AR. Los principales andrógenos T y DHT son sintetizados mediante
la vía clásica Δ5 o Δ4 a partir del colesterol; en esta ruta metabólica intervienen enzimas
específicas que incluyen citocromos P450 (CYP450), hidroxiesteroide deshidrogenasas
(HSDs) y esteroide reductasas. En estas vías metabólicas, la DHT es obtenida mediante
la 5α-reducción de T en tejidos periféricos; sin embargo se ha reportado la existencia de
otras vías para la síntesis de DHT y son llamadas vía “alterna” (donde DHT es
sintetizada a partir de 5α-androstandiona por acción de la AKR1C3) y vía “backdoor” (la
cual no requiere de T, DHE ni androstandiona para sintetizar DHT y en la que intervienen
las enzimas AKR1C2-4).

Asimismo, múltiples investigaciones han reportado que individuos 46,XY con
deficiencias o alteraciones en la esteroidogénesis pueden presentan DSD, una
malformación congénita caracterizada por presentar ambigüedad de genitales y en
algunas ocasiones hipospadias (anormalidades en el desarrollo de la uretra masculina).
A pesar de toda la información reportada a la fecha, no todas las alteraciones en el
desarrollo masculino han sido explicadas totalmente por lo cual se sugiere que existen
otros factores génicos aún no identificados (Zachmann et al, 1972; Miller, 1988; Vilchis.,
et al 2003; Sanderson, 2006; Vilchis et al., 2008; 2010; Chávez et al., 2014; Ramos et al.,
2018; Schiffer et al, 2018).

Al respecto, un único estudio de Flück et al en 2011 sugiere que la vía “backdoor”
podría estar involucrada en el desarrollo masculino en humanos y han asociado sus
alteraciones como posibles causantes de DSD en pacientes donde se han descartado
mutaciones en enzimas de la vía clásica. El objetivo de este proyecto se enfocó en
realizar ensayos de tamizaje molecular y secuenciación en el gen AKR1C4 y que codifica
para una enzima que actúa en la vía “backdoor”, esto con el propósito de corroborar si

46
las alteraciones génicas son causantes de la ambigüedad genital en pacientes con DSD
46,XY-asociados a hipospadias.

La amplificación mediante PCR de los 9 exones del gen AKR1C4 excluyó la
presencia de inserciones o deleciones de un número amplio de pares de bases. Esto se
pudo observar debido a que todos los exones amplificados presentaban el tamaño
esperado (aproximadamente 200 pares de bases) y presentaban una talla similar a la de
los controles sanos. Posterior a la amplificación por PCR, los resultados mediante SSCP
indicaron tres variaciones en la migración electroforética en dos de los exones
analizados individualmente (exones 4 y 9).

Los primeros resultados que se obtuvieron en la secuenciación del exón 4
mostraron una variación polimórfica en el nucleótido 434 donde se presentó un
homocigoto para C, uno para G y un heterocigoto para C/G, los cuales codifican para
una serina o una cisteína en el codón 145, estos fueron comparados con los grupos
control los cuales presentaban la misma variación. En las bases de datos, los resultados
de predicción de patogenicidad concluyeron que esta variación es benigna, tolerada,
neutral o se trata de un polimorfismo. Esta variación coincide con la reportada por
Söderhäll et al en 2015, la cual es mencionada como un polimorfismo y que no es la
causante de los DSD; por lo que de esta manera, no se puede asociar esta variación
nucleotídica como la causante de las hipospadias en los individuos. Trabajos como el de
Johansson et al en 2011 y 2012 han asociado este polimorfismo con la baja
concentración de progesterona en hombres y un riesgo de manía, hipomanía e
irritabilidad; además de que esta variación sin sentido reduce el riesgo de ideas de
paranoia en un 60%.

Para el exón 4 se logra apreciar una menor frecuencia en el alelo homocigoto G/G
entre pacientes y grupos controles, así como una mayor frecuencia en el homocigoto
C/C en los individuos control y el heterocigoto en los pacientes. A pesar de que se
observa un cambio entre las frecuencias genotípicas y fenotípicas, las proporciones
alélicas, así como el análisis de Hardy-Weinberg, muestran que la población está en

47
equilibrio, es decir, los alelos mantienen su frecuencia en la población y no existe
selección entre estas variantes polimórficas.

A pesar que los estudios de Flück et al en 2011 realizaron amplificación y
secuenciación del gen AKR1C4, ellos no encuentran en la parte codificante mutaciones y
se enfocan en una mutación intrónica que eliminaba por completo el exón dos el cual
representa el sitio activo. En este trabajo no se presenta algún resultado considerable o
similar a los reportados por este autor ya que las variaciones encontradas se limitan al
exón 4 y al 9.

De acuerdo con el estudio de Söderhäll et al realizado en 2015, ellos proponen
como candidatos de hipospadias a AKR1C2-4 y señalan en AKR1C4 dos variaciones
genéticas en la secuenciación del exón 4, los autores reportan como polimorfismo una
variante encontrada en el codón 145 que origina el cambio de una serina por una
cisteína, así mismo como una mutación en el nucleótido 447 en la región intrónica 4.
Para analizar los resultados en este trabajo, las diferentes migraciones fueron sometidas
a secuenciación para identificar el tipo de mutación.

Los resultados para el exón 9 mostraron una variación polimórfica en el nucleótido
931 con un homocigoto para C, uno para G y un heterocigoto para C/G que codifican
para una leucina o una valina en el codón 311. De igual manera que en el exón 4, estas
variaciones se tratan de polimorfismos y no se pueden asociar como substituciones o
mutaciones causantes de hipospadias en los pacientes, no se encuentran trabajos que la
mencione o asocie con DSD. Sin embargo estudios como el de Lord et al en 2005
reportan que este polimorfismo se involucra en el metabolismo de estrógenos en mujeres
con post menopausia que se someten a terapias de estrógenos. Tunali y Tiryakioglu en
2011 mencionan que este polimorfismo encontrado en la C terminal, afecta la unión de
especificidad al sustrato en tejidos.

En el exón 9 se aprecia un resultado similar a lo observado en el exón 4, una
diferencia de frecuencias genotípicas en las cuales el alelo homocigoto C/C se presenta

48
en menor frecuencia en pacientes y grupos controles, los de mayor frecuencia para el
homocigoto G/G en controles y el heterocigoto en pacientes, al igual no se presenta una
desviación entre las frecuencias de estos alelos por lo que la población se encuentra en
equilibrio en ambos casos, los factores que determinan esta variación son externos a la
reproducción.

Parte de los resultados muestran que los diferentes patrones de migración
electroforética mediante SSCP y secuenciación en el exón 4 y el exón 9 se tratan de
variaciones de un solo nucleótido, las cuales se presentan en igual proporción en ambos
exones, como se aprecia en la tabla 5 los mismos pacientes que presentan lavariación
homocigota para CTT en el exón 4, la presentan para TGT en el exón 9, de igual manera
el mismo número de individuos que presentan la variación GTT la presentan en TCT y el
mismo caso para el número de individuos con la variación del heterocigoto TCT/TGT,
GTT/CTT para ambos exones respectivamente. Estos SNPs (polimorfismos de
nucleótido simple) se han transmitido juntos y puede que se encuentren asociados por lo
cual se puede tratar de un haplotipo, sin embargo este patrón difícilmente se puede
relacionar con la causa de las hipospadias en los pacientes por lo cual se sugeriría un
estudio para determinar la correlación que existe entre estas dos variaciones
polimórficas en estos exones.

49
6. CONCLUSIÓN

Se localizaron tres variaciones en el patrón de migración electroforética del gen
AKR1C4 en cada uno de los exones 4 y 9. La secuenciación de la parte codificante
mostró un cambio nucleotídico en el codón 145 del exón 4 (p.S145C) y 311 del exón 9
(p.L311V) en los pacientes.

Se observan las mismas variaciones en cuanto al patrón de migración y la
secuencia en los individuos control y los pacientes. El análisis poblacional no muestra
una diferencia significativa en el comportamiento de estos alelos.

El análisis in silico realizado mostró que estos cambios han sido reportados
previamente como polimorfismos, por lo cual no se trata de mutaciones o variaciones
patógenas que puedan ser las causantes de un desorden en el desarrollo.

Las variantes localizadas en el gen que codifica a la enzima AKR1C4
perteneciente a la vía “backdoor” no presentan una participación considerable en la
diferenciación sexual por lo tanto no puede ser asociado como la causa de hipospadias
en los 25 pacientes estudiados.

50
7. PERSPECTIVAS

Los resultados obtenidos en este trabajo descartan la participación de mutaciones
del gen AKR1C4 asociadas a DSD-hipospadias de los sujetos 46,XY estudiados, sin
embargo se sugiere un análisis mutacional de otros genes que pudieran estar asociados
con este padecimiento y que estén involucrados en la diferenciación sexual masculina
como es el caso del gen MAFB.

Recientemente se ha demostrado que la expresión sexualmente dimórfica de
MAFB podría regular la masculinización de la formación uretral embrionaria en ratones
(Suzuki et al., 2014). El factor de transcripción MAFB (V-maf musculoaponeurotic
fibrosarcoma oncogene homolog B) es una proteína caracterizada estructuralmente por
presentar una región denominada zipper de leucinas localizada en el extremo carboxilo
terminal y que afecta positiva o negativamente la transcripción, dependiendo de su(s)
proteína(s) asociada(s) y la estructura del promotor génico. Estudios iniciales han
mostrado que el MAFB es un regulador transcripcional de la neurogénesis y la
hematopoyesis. En etapas tempranas del desarrollo, los genes Hox controlan la
regionalización durante la segmentación del rombencéfalo en las rombomeras;
sugiriendo que MAFB activa directamente la expresión de los genes HOXB3 y HOXA3,
asociando al MAFB al proceso de regulación segmentaria.

Durante muchos años, las investigaciones se han centrado en la identificación de
genes masculinizantes bajo el control de las acciones androgénicas. Sin embargo, tales
genes no han sido identificados. Por lo tanto, todavía no está claro completamente cómo
estos procesos morfogenéticos están regulados por andrógenos.

51
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Portada
Índice
Resumen
1. Introducción
2. Planteamiento del Problema
3. Materiales y Métodos
4. Resultados
5. Discusión
6. Conclusión
7. Perspectivas
Referencias