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Aprendiendo Biologia

23/7/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONÓMA DE MÉXICO
Facultad de Estudios Superiores Zaragoza
Química Farmacéutico Biológica
Hospital Infantil de México Federico Gómez

Tesis experimental:
“Discrepancia de resultados en dos pruebas de tamizaje para sífilis
en Banco de Sangre.”

Presentado por:
Dulíz Delgado Jesús Eduardo
Para obtener el título de Químico Farmacéutico Biólogo

Número de cuenta:
303077565

Director de Tesis:
Dr. Vicencio Juárez Barreto

Presentada en el Campus II de la FES Zaragoza
6-Junio-2016

Orientación:
Bioquímica Clínica

Margarita
Texto escrito a máquina
Cd. Mx. 2016

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS
PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN
BANCO DE SANGRE.

Eduardo Dulíz
Tesis realizada para
obtener el título de
Químico Farmacéutico
Biólogo

DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

Agradecimientos y dedicatoria.
Doy gracias a algunos amigos entrañables, personas que en mayor o menor medida
contribuyeron para finalizar este proceso en mi vida. Dos grandes amigas de la Facultad,
Paola y Alma, con quienes compartí grandes experiencias en la licenciatura y a la familia
Camacho García por no dejar que me perdiera en el camino cuando aún no definía el rumbo
en mi vida.
Sé que no me hubiesen perdonado sino les menciono en esta parte y la verdad, pensaba
hacerlo. “Gracias totales” a todo el personal del Banco de Sangre del Hospital Infantil de
México por transmitir sus experiencias y el amplio conocimiento sobre medicina
transfusional
En definitiva, debo agradecer de manera muy especial el apoyo y la confianza que el Doctor
Juárez me ha brindado todo este tiempo, ya que de no ser por él este trabajo y la experiencia
profesional que he adquirido hasta el momento, no los tendría. Aprovecho para agradecer
también a los profesores Pablo Juárez y Patricia Vidal por compartir conmigo sus
conocimientos y consejos, pero sobre todo, de ser partícipes y principales responsables de
mi gran pasión por la Hematología (siempre estaré en deuda con ellos).
Haciendo una pequeña escala en estos párrafos, es importante para mi dar crédito (y mi más
sincero agradecimiento) a empresas que apoyan a estudiantes para la realización de nuevos
proyectos, y esta tesis no se podría haber realizado sin los recursos necesarios
proporcionados por una gran empresa hoy en día; Abalat.
Entre las muchas personas que intervinieron en este largo camino, están grandes seres
humanos, que fueron quienes con gran esfuerzo y sacrificio sustentaron mis estudios en
todo momento; MI FAMILIA. Agradezco a mis abuelos quienes nunca dejaron de creer en
mí, a mis tíos por tantos consejos y recuerdos inolvidables, primos por tantos momentos
llenos de felicidad y principalmente a aquellos a quien dedico este y todos los logros en mi
vida…
A mis padres y hermanas,
gracias por su infinito amor apoyo y paciencia.
A Karen,
por su gran cariño y por darme lo mejor de mi vida, Santiago.

DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

Contenido
1. RESUMEN. .............................................................................................................. 6
2. MARCO TEÓRICO .................................................................................................... 8
I. El estudio serológico en los Bancos de Sangre................................................................. 8
i. Reseña Histórica................................................................................................................................ 8
ii. Evolución de las pruebas para el diagnóstico de la Sífilis ............................................................... 12
II. Infecciones transmisibles por transfusión (ITT). ............................................................ 19
III. Sífilis........................................................................................................................ 24
i. Clasificación taxonómica ................................................................................................................. 25
ii. Fisiología y estructura. .................................................................................................................... 27
iii. Cultivo. ............................................................................................................................................ 28
iv. Características de crecimiento. ....................................................................................................... 29
v. Genoma ........................................................................................................................................... 29
vi. Estructura antigénica. ..................................................................................................................... 30
IV. Manifestaciones clínicas de la enfermedad. .............................................................. 31
i. Periodo de incubación. ................................................................................................................... 32
ii. Sífilis primaria o precoz. .................................................................................................................. 32
iii. Sífilis secundaria. ............................................................................................................................. 32
iv. Sífilis latente. ................................................................................................................................... 34
v. Sífilis tardía. ..................................................................................................................................... 34
V. Clasificación de las pruebas para el diagnóstico de sífilis. .............................................. 34
i. Pruebas directas.............................................................................................................................. 36
ii. Pruebas serológicas inespecíficas para la sífilis. ............................................................................. 39
iii. Pruebas específicas o confirmatorias para la Sífilis. ....................................................................... 59
VI. Reacciones de aglutinación. ..................................................................................... 78
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ......................................................................... 80
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

4. OBJETIVO ............................................................................................................. 80
5. DISEÑO EXPERIMENTAL ........................................................................................ 81
I. Tipo de estudio y población de estudio. ....................................................................... 81
II. Criterios de inclusión. ..................................................................................................81
III. Criterios de exclusión. .............................................................................................. 81
IV. Criterios de eliminación. .......................................................................................... 81
V. Variables. .................................................................................................................... 82
VI. Método. .................................................................................................................. 83
VII. Diagrama de flujo. ................................................................................................... 85
VIII. Diseño estadístico. ................................................................................................... 86
6. RESULTADOS ........................................................................................................ 87
7. ANÁLISIS DE RESULTADOS ..................................................................................... 90
8. CONCLUSIONES ..................................................................................................... 93
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 94
I. Apéndice A ................................................................................................................ 101
Nuevos algoritmos para el estudio de la sífilis. .................................................................................... 101

DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

1. RESUMEN
El tamizaje de donadores en los Bancos de Sangre ha sufrido cambios importantes
desde los inicios de las prácticas transfusionales, situación que se debe en gran
medida a los avances en las pruebas empleadas para el diagnóstico de las
enfermedades transmitidas por este medio. Por otra parte, el descubrimiento de los
agentes etiológicos de las diferentes infecciones transmisibles por transfusión (ITT)
ha dado lugar a implementar diferentes técnicas en el estudio de donadores. Hoy en
día la NORMA Oficial Mexicana NOM 253-SSA1-2012 Para la disposición de sangre
humana y sus componentes con fines terapéuticos, establece las diferentes pruebas
a utilizar para cada marcador serológico, donde, para la detección del Treponema
pallidum se establecen como opciones para la detección de reaginas, el uso de
pruebas como Venereal Disease Research Laboratory (VDRL) y Rapid Plasmatic
Reagin (RPR), o pruebas para la detección de anticuerpos específicos como lo son la
inmunocromatografía y los ensayos inmunoenzimáticos. A pesar de que la sangre
no se considera un como un vehículo importante para la trasmisión del Treponema
pallidum, es importante conocer la sensibilidad y especificidad de la gama de
pruebas disponibles y con esto poder elegir la más adecuada para el tamizaje.
Aunado a ello, se sabe que las pruebas no treponémicas presentan un fenómeno de
prozona, que aumenta el riesgo de transfundir componentes sanguíneos
contaminados, principalmente en aquellos que no se someten a refrigeración o
congelación, como los concentrados plaquetarios. El presente estudio realizó el
tamizaje a 1711 donadores de sangre con la técnica de Quimioluminiscencia (CMIA
por sus siglas en inglés) y la técnica de RPR. Se empleó también como prueba
suplementaria Ensayo de Hemaglutinación de Treponema pallidum (TPHA) y como
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

prueba confirmatoria Western Blot (WB); obteniendo los siguientes resultados en los
donadores: 15 (0.88%) presentaron un resultado positivo en Quimioluminiscencia y
solo 10 (0.58%) fueron confirmados por WB. Para la prueba de RPR 21 (1.23%)
resultaron positivos y 7 (0.41%) confirmados por WB. El 80% de los resultados entre
la prueba suplementaria y confirmatoria fueron concordantes. Dentro de las
muestras estudiadas se obtuvieron tres resultados falsos negativos con RPR, donde,
dos de ellos resultaron con un valor medio de 6 S/CO para CMIA, negativos por TPHA
y positivos por WB IgG. El otro tuvo un valor de 20.38 S/Co por CMIA y resultó
positivo para TPHA y WB IgG.

DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

2. MARCO TEÓRICO

i. Reseña Histórica
La historia de la sangre es sumamente amplia y se remonta a épocas muy antiguas,
pero no fue hasta tiempos en los que Harvey descubrió la dirección de la sangre en
su recorrido por el cuerpo, que ya se comenzaba a pensar en aplicar medicamentos
directamente en la sangre y en la práctica de transfusiones sanguíneas. Muy
probablemente la historia de la Medicina Transfusional, aunque muy rudimentaria y
peligrosa, comienza con Richard Lower (1631-1691), quien con un grupo de
científicos comenzaron a practicar las transfusiones de arteria a vena en animales;
desangraban a un perro casi hasta la muerte y posteriormente lo reanimaban con
exanguinotransfusión con la sangre de dos perros, ocasionando el deceso de los
donadores.
Jean Baptiste Denis en 1667 médico de Luis XIV, llevo a la práctica transfusiones con
sangre de animales a personas que presentaban algún trastorno mental, sin tener
algún éxito apreciable. Lo anterior dio motivos suficientes para que la corte francesa,
seguida por los gobiernos de Inglaterra y Roma, así también por la Iglesia, decretaran
prohibido el procedimiento transfusional. La prohibición definitiva se da hasta 1675.
Fue hasta 1818 que se volvió a llevar a cabo una transfusión, pero esta vez de sangre
humana, por el médico, fisiólogo y tocólogo James Blundell, quien, tras experimentar
con animales, pudo llegar a dos conclusiones: solo se debe transfundir sangre
humana y las transfusiones no tendrían que servir para curar la locura o modificar el
carácter; sino solo para sustituir la sangre perdida.
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

Pero el riesgo de transmitir infecciones por transfusión no se consideró sino hasta
1943, cuando Paul Besson reportó que por medio de las transfusiones se transmitía
hepatitis, aumentando el problema de ictericia durante la época de la Segunda
Guerra Mundial. El descubrimiento del antígeno Australia de la hepatitis B en 1965,
de la hepatitis A y la No A y No B (NANB) que en 1988 se definiría como hepatitis C,
se vieron opacados con el brote del virus de la inmunodefiencia humana (VIH)
debido a las transfusiones en 1980. Sin embargo, fue hasta 1990 y 1992, que los
Bancos de Sangre de Estados Unidos, introdujeron análisis minuciosos para
portadores de hepatitis C, disminuyendo el número de casos de infección por las
transfusiones.
Se tiene claro que la historia de las transfusiones ha sido extensa; pues en nuestro
país no lo fue menos. México fue de los primeros países en América que aportó y
participó con sus trabajos de experimentación y comprobación, mucho antes de
otros países pensaran si quiera en intentarlo. Tan es así, que la primera transfusión
realizada en el Continente Americano, se realizó en 1845 en la Ciudad de México por
el médico Guanajuatense Matías D. Beistigui, ayudado por el Dr. Francisco Javier
Vértiz. La aparición de los Bancos de Sangre en México se dio en los años 30 del
siglo pasado, siendo los primeros, el del Hospital General y el del Hospital Español,
siguiéndole el Hospital Juárez en 1942.
En el año de 1982, por fin se crea en México el Centro Nacional de la Transfusión
Sanguínea, para la vigilancia sanitaria técnica de los servicios de transfusión en el
país. Pero no fue hasta 1987 que se emite una norma para prohibir la donación
remunerada y la comercialización de sangre, debido a los casos del “Síndrome de
Inmunodeficiencia Adquirida” que se asociaron a las transfusiones.Finalmente, en
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

1993 se crea la Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993, Para la disposición de
sangre humana y sus componentes con fines terapéuticos, cuya Norma tuvo su
primera actualización en el año 2012.1,2
Retomando la historia sobre el estudio serológico de los donadores; se conoce que
la primera prueba implementada en los Estados Unidos de América para el estudio
de donadores fue la prueba de sífilis, en la década de los 40´s y obligatoria en los 50.
Hasta la década de los 60´s pudo comprobarse que la Hepatitis post-transfusional
(HPT) se presentaba en más del 30% de los pacientes transfundidos y una vez que
se identificó el antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B (HBsAg), se
demostró que éste era responsable del 25% de los casos de HPT. Estos estudios
dieron lugar a otro hallazgo; la mayoría de las infecciones postransfusionales por
VHB y por hepatitis No A, No B (NANB) eran más frecuentes cuando los
componentes provenían de donadores remunerados que cuando se obtenían los
componentes de donadores voluntarios. Para la década de los 70, ya se comenzaba
a implementar pruebas con una sensibilidad probada para el tamizaje de donadores
y el cambio universal en el tipo de donación hacia la “voluntaria”, contribuyendo en
gran medida para disminuir los casos de HPT. Sin embargo, la ausencia de una
prueba específica para la hepatitis NANB permitió que la enfermedad persistiera
entre un 6 y un 10% de los pacientes politransfundidos.
Con lo anterior ya se había considerado utilizar pruebas alternativas, pero esto fue
evaluado conscientemente hasta que surgieron algunas inquietudes sobre la
transmisión del Sindrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) por transfusión.
Para esto, ya existían reportes entre los años 1982 a 1984 señalando una mayor
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

probabilidad de transmitir el SIDA por transfusión, aunque se sabía que la
prevalencia en los donantes era baja.
Tras un grandioso esfuerzo para aislar el virus del SIDA e identificarlo como el agente
causal, se desarrollaron pruebas para detectar el anticuerpo contra este agente y se
implementaron de manera inmediata a los Bancos de Sangre en 1985. Una vez que
se dispuso de una prueba para el estudio de Virus de Inmunodeficiencia Humana
(VIH) en donadores y en los receptores de transfusiones, se supo que la transmisión
del virus por transfusión se había subestimado; esto permitió dilucidar que una
persona podía estar en el estadio de portador asintomático por varios años sin ser
reconocido. Después de este descubrimiento el enfoque de tamizaje se extendió
mucho más allá de la detección de agentes que ya eran conocidos.
No fue hasta ese momento que se implementó un cuestionario como sistema
adicional a la búsqueda y exclusión de donantes con un riesgo aumentado de
exposición a patógenos en sangre o a presentar infecciones de transmisión sexual.
Todo esto con la única intención de detectar aquellos microorganismos
potencialmente transmisibles por transfusión que aún no eran considerados.
De esta manera el Center for Disease Control and Prevention (CDC) identificó algunas
conductas asociadas con un riesgo aumentado de infección. A partir de ese
momento, el CDC y diversos estudios han demostrado que la presencia de úlceras
anales, vaginales, orales o en el pene facilita la infección por el VIH aumentando la
probabilidad de contagio de 2 a 5 veces más.33, 45
Posteriormente la Food and Drugs Administration (FDA) en 1990, propuso una serie
de recomendaciones a los Bancos de Sangre, que en resumen consistían en
proporcionar al donante material informativo enumerando las actividades de riesgo
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

para contraer alguna enfermedad de transmisión sexual y haciendo énfasis en que
las personas no donaran si estaban comprendidas en dichas actividades.
Durante un largo tiempo el tamizaje se enfatizó en la detección de agentes virales
como los virus de la hepatitis y desde su descubrimiento en 1984 el Virus de la
Inmunodeficiencia Humana ha sido el principal motor para realizar un mejor estudio
en los donadores, pero esto trajo consigo darle la misma importancia a otros
microorganismos como las bacterias.
La contaminación de los hemocomponentes (siendo un caso muy especial las
plaquetas) es una de las causas más importantes de muerte relacionadas con la
trasfusión, seguida en orden de frecuencia por problemas pulmonares agudos
relacionados con la transfusión y las reacciones hemolíticas. Aunque el riesgo de
contaminación por bacterias en los componentes sanguíneos no ha podido ser
eliminada, desde el 2010 al 2014 no se tuvo un caso confirmado de Infección
Transmitida por Transfusión (TTI por sus siglas en inglés) en el Reino Unido. Sin
embargo, este continúa siendo el principal motivo de sospecha de contaminación,
sobre todo en concentrados plaquetarios obtenidos por aféresis.
ii. Evolución de las pruebas para el diagnóstico de la Sífilis
La sífilis es una enfermedad causada por una bacteria llamada Treponema pallidum,
que ha adquirido su nombre en función de sus características morfológicas y de
coloración (lo cual se explicará con más detalle en el punto 2.3). El tamizaje en
donadores de sangre para la sífilis se ha realizado por más de 60 años y en el siglo
XX se consideró como el mayor problema de salud que aquejaba a la sociedad.54
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

En 1905 Schaudinn y Goffman realizan una modificación a la tinción de Giemsa, que
aplican a la muestra de una lesión de una persona con sífilis y en base al resultado
obtenido es que logran establecer la relación de la enfermedad con la espiroqueta.
Un año después un Bacteriólogo alemán discípulo de Robert Koch desarrollo una
prueba para la detección de sífilis, conocida como la reacción de Wasserman. En
realidad, dicha prueba era una variación a la prueba de fijación del complemento
implementada por Bordet y Gengou en 1901. Algunos años después Landsteiner
emplea extractos diferentes al de hígado que utilizó Wasserman, demostrando que
se podía reemplazar sin perder la eficacia hacia el antígeno; propone un extracto
alcohólico del corazón de la res. En base a diferentes estudios posteriores es que se
añaden colesterol y lecitina para incrementar la sensibilidad de la prueba, pero el
realizar el ensayo representaba aún algunos problemas importantes, como el empleo
de diversos reactivos, del complemento y un tiempo promedio para su realización.
Para el año de 1917 Michaelis y Meinike realizaron una modificación más a la técnica,
cambiando la forma de extracción mediante agua y cloruro de sodio, logrando el
primer ensayo por precipitación que no necesitaba complemento. En 1922 Kahn
introduce las pruebas de floculación cuya ventaja era que podían ser leídas en pocas
horas. Si hasta ese momento las pruebas ya habían pasado por varias modificaciones,
en los siguientes 18 años la técnica de Kahn tendría otras “mil variaciones más”, sin
embargo, todas ellas seguían padeciendo el mismo problema, la falta de
estandarización, factor que afectaba significativamente la sensibilidad y especificidad
del ensayo.
Unos años adelante, en 1941 los estudios realizados por Pangborn marcaron un giro
interesante en el estudio serológico de la sífilis; logró aislar y purificar un compuesto
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

no nitrogenado responsable de la reactividad en los extractos alcohólicos del
corazón de la res, al que le dio el nombre de cardiolipina. Mezclando éstecompuesto
con lecitina purificada, se prepararon antígenos que podían ser utilizados en las
pruebas por fijación de complemento y en las de floculación (Ilustración 1). 1, 2, 6
Ilustración 1 Publicación presentada en el V Congreso de Venerología en el año de
1954, donde se mencionan los avances que se obtuvieron en los estudios realizados
por diversos investigadores (entre ellos Kanh y Pangborn), para el diagnóstico de la
Sífilis.
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

La combinación de la cardiolipina purificada con la lecitina y el colesterol le darían a
la prueba una mayor sensibilidad y especificidad, además de la posibilidad de
estandarizarse. De esta manera surgen las pruebas de floculación que actualmente
se conocen, como el VDRL (Venereal Disease Research Laboratory), al cual se le
añadieron algunas otras sustancias como EDTA y cloruro de colina para estabilizar el
antígeno y que le permitía también amplificar la reactividad y por ende la
sensibilidad. Pese al avance que ya se tenía en ese momento, las técnicas aun
presentaban cierta complejidad, ya que requerían un calentamiento previo del suero
para inactivar el complemento, lo que llevó a crear el USR (unheated serum reagin)
técnica que no necesitaba el calentamiento para realizarse. Esto a su vez dio lugar a
la creación de otra prueba revolucionaria y que permitiría trabajar grandes lotes de
muestras, el RPR (rapid plasma reagin), pero que en su primera versión no era muy
confiable ya que no se conocía su especificidad y el volumen de muestra para
realizarla no estaba bien definido. Pero no tardaría mucho tiempo en tener algunos
cambios como mejoras a la prueba. De manera casi inmediata se desarrolla un
sistema de tarjeta más la adición de partículas de carbón que le dan una mayor
estabilidad, tiempo después a las tarjetas se les coloca una cubierta plástica. En el
año de 1960, se logra automatizar la prueba en tarjeta de RPR y se lanza al mercado,
siendo los Bancos de Sangre y las zonas de admisión de Hospitales los primeros
lugares en adquirirla e implementarla.
En la década de los 70´s, la incidencia de esta patología cae abruptamente, lo cual
origina que en diversas zonas de nuestro país se deje de exigir el RPR. En la siguiente
década (1982) se presenta un Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA
por sus siglas en inglés) que emplea el antígeno del VDRL.
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

Hasta ese momento los avances habían sido considerables, pero no del todo
satisfactorios. Las pruebas con las que ya se contaban tenían un gran número de
resultados falsos positivos, obligando a los investigadores a buscar alternativas para
disminuir esta problemática. En 1949 Nelson y Mayer, desarrollan la primera prueba
treponémica; el TPI (T. pallidum inmobilization) pero que resultaría en una prueba
difícil de realizar, que era tardada y que requería de personal altamente calificado.
En 1953 D´Allesandro y Dardanoni realizan un intento para mejorar y agilizar el
ensayo, utilizando un antígeno de T. phagedenis conocido como antígeno de Reitter,
logrando optimizar el tiempo, pero sin disminuir el número de falsos positivos.
Cuatro años después se desarrolla la técnica basada en fluorescencia, llamada FTA
(Fluorescent Treponemal Antibody), la cual consiste en probar el suero diluido del
paciente ante treponemas muertos y utilizando un anticuerpo marcado.
Desafortunadamente la dilución inicial que se manejó (1:5) daba varios falsos
positivos, pero su primera modificación le dio el nombre de FTA-200 porque se
necesitaba diluir la muestra del paciente en una relación 1:200, dando origen a una
prueba altamente específica pero poco sensible. Con la finalidad de aumentar la
especificidad del test Deacon y Hunter extraen el antígeno mediante absorción, de
un cultivo de la cepa de Reitter, creando la prueba que por mucho tiempo se ha
considerado como el “gold standard” para el diagnóstico de la Sífilis, el FTA-ABS o
“FTA Absortion”. Hasta el año de 1965 Rathlev difunde información sobre el primer
ensayo basado en técnicas de hemaglutinación, que, en resumen, consistían en tratar
eritrocitos con ácido tánico para posteriormente sensibilizarlos con antígenos de T.
pallidum, pasando desde su realización en tubos, placas y hoy en día tarjetas de gel.
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

En México se han comercializado tanto ensayos treponémicos como los no
treponémicos que mantenían como problema latente el gran número de falsos
positivos. En algunos lugares contaban con la prueba de FTA-ABS, pero como ya se
ha mencionado, requería equipo, personal especializado y con experiencia para la
realización del ensayo. Como una respuesta a esta situación se introdujeron en el
mercado pruebas más sencillas de realizar y que no necesitaban equipo especial,
pero que eran igualmente específicas como lo son las pruebas de hemaglutinación
y aglutinación pasiva.

DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

Ilustración 2 Resumen histórico de los avances en las pruebas para el
diagnóstico de la Sífilis.
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

El Annual SHOT (Serious Hazards of Trasnsfusion) Report define como Infección
Transmisible por Transfusión (TTI por sus siglas en inglés) cuando posterior a la
investigación se encuentra lo siguiente:
 El receptor o paciente tenía evidencia de infección después de la transfusión
de un componente sanguíneo y no había evidencia de infección antes de la
transfusión o de alguna fuente alternativa.
 Cuando al menos un componente sanguíneo obtenido del donador tiene
evidencia de la misma infección transmisible.
 Cuando al menos un componente sanguíneo del receptor infectado fue
mostrado con evidencia del mismo agente infeccioso
Es una obligación de los Bancos de Sangre y servicios de transfusión realizar el
tamizaje para detectar agentes infecciosos en las personas que asisten a donar, ya
que la sangre sigue siendo un recurso donde el ser humano es la única fuente de
obtención. Esto adquiere tal importancia que los hemocomponentes obtenidos
(eritrocitos, plasma, plaquetas, crioprecipitados, granulocitos, etcétera) no son
esterilizados, ni reciben algún tratamiento para inactivar agentes infecciosos y son
administrados vía intravenosa, permitiendo a todo aquel microorganismo que no
sea detectado en los donadores un acceso directo al torrente sanguíneo del receptor.
Prevenir la transmisión de agentes infecciosos es uno de los principales objetivos de
la medicina transfusional y tras el desarrollo de los ensayos antes mencionados, la
principal preocupación y trabajo de los Químicos analistas ha sido buscar la
estandarización y evaluación de las reformas considerando siempre la sensibilidad,
la especificidad y la reproducibilidad de los ensayos.
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

Como parte de los estudios pretransfusionales se encuentran las pruebas de tamizaje
para ciertos marcadores; los cuales están determinados por la NOM-253-SSA1-2012
Para la disposición de sangre humana y sus componentes con fines terapéuticos. En
el aparatado 9 de esta Norma se menciona todo lo relacionado a las determinaciones
analíticas para la detección de agentes infecciosos transmisibles y las pruebas de
inmunohematología que se deben realizar a los donadores de sangre o cualquiera
de sus componentes.
A partir del punto 9.4 se hace énfasis sobre las pruebas que se deben de realizar
invariablemente a todos los donadores para la detección deagentes transmisibles
por transfusión, antes de poner a disposición los componentes sanguíneos,
observando lo siguiente:
9.4.2 Las pruebas para la detección de los agentes infecciosos transmisibles por
transfusión deberán incluir obligatoriamente la detección de los siguientes:
a) Treponema pallidum
b) Virus B de la hepatitis
c) Virus C de la hepatitis
d) Virus de la inmunodeficiencia humana tipos 1 y 2, y
e) Trypanosoma cruzi
9.4.3 Cuando por la situación epidemiológica de la región geográfica donde se
encuentra el establecimiento o de la de procedencia del donante, sus antecedentes
personales o sus factores de riesgo para adquirir infecciones, o bien, por las
características de los futuros receptores y su susceptibilidad a adquirir o desarrollar
enfermedad, el banco de sangre deberá efectuar y documentar pruebas adicionales
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

para la detección de los agentes infecciosos transmisibles por transfusión. Las
pruebas adicionales podrán incluir la detección de los agentes siguientes:
a) Brucella;
b) Plasmodium;
c) Citomegalovirus;
d) Toxoplasma;
e) Retrovirus HTLV tipos I y II, y
f) Otros agentes.
En los siguientes dos puntos de la norma se especifica que el Banco de Sangre podrá
autorizar el uso terapéutico de las unidades de sangre y cualquiera de sus
componentes, al contar con los resultados inequívocamente negativos en las
pruebas de tamizaje y que los procedimientos del laboratorio son correctamente
efectuados, además de demostrar que los resultados son confiables mediante el
control de calidad.
La forma en la que el personal responsable de realizar las pruebas de tamizaje deberá
proceder como se muestra en la siguiente figura de la Norma (Ilustración 3):

DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

Ilustración 3 Algoritmo para realizar las pruebas de tamizaje en Bancos de Sangre,
establecido en la Norma NOM- 253-SSA1-2012
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

De manera particular la Norma enfatiza en el punto 9.4.9 todo lo referente a la
detección de Treponema pallidum, haciendo mención de lo siguiente:
9.4.9.1 Tamizaje: Se deberá realizar mediante cualquiera de las pruebas siguientes:
a) Identificación de reaginas mediante una prueba de aglutinación de partículas,
entre las siguientes:
 VDRL, o
 RPR
b) Identificación de anticuerpos específicos mediante pruebas treponémicas con
especificidad ≥ 98.50 %, tales como:
 Inmunocromatografía;
 Ensayo inmunoenzimático, u
 Otras con sensibilidad y especificidad igual o mayor.
El control de calidad de la prueba de tamizaje efectuado en cada corrida, se
demuestra cuando la prueba tiene una sensibilidad suficiente para detectar un
control positivo débil.
9.4.9.2 Confirmatoria. Se deberán emplear pruebas treponémicas que tengan
especificidad 99 %, entre otras, cualquiera de las siguientes:
a) Hemaglutinación contra Treponema;
b) Anticuerpos fluorescentes contra el Treponema;
c) Inmunofluorescencia indirecta;
d) Inmovilización del treponema, u
e) Otras con especificidad igual o mayor.
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El padecimiento fue descrito por primera vez en 1525 por el renombrado médico
italiano Girolamo Fracastorius (Ilustración 4), en un pastor llamado Sífilio y el agente
etiológico de esta enfermedad, el Treponema pallidum, fue descubierto por Fritz
Schaudinn y Erich Hoffman en 1905, en la secreción de las lesiones de sus pacientes.
En 1906 el bacteriólogo alemán Paul Von Wassermann con la colaboración de
Neisser y Bruck describieron una reacción que pretendía demostrar la presencia de
anticuerpos séricos en el líquido cefalorraquídeo en personas con tabes dorsal o
parálisis general, la cual presentó positividad en la mayoría de los casos, pero que
después se darían cuenta de que era una prueba un tanto inespecífica. Esta prueba
recibió el nombre de “reacción de fijación del complemento” o “reacción de
Wassermann-Neisser-Bruck”.1, 2

Ilustración 4 Girolamo Fracastorus (Getty images)
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A pesar del tiempo que ha transcurrido desde que se identificó el agente causal de
esta enfermedad no se ha logrado definir cuál fue su origen. Se propone que la sífilis
evolucionó a partir de una enfermedad clínica más leve en los aborígenes
americanos. Por consiguiente, se cree que los marineros que acompañaron a Colón
llevaron la enfermedad a su regreso del Nuevo Mundo. Historiadores de la época
denominaron al T. pallidum como la causa del great pox (“mal francés”, antiguo
nombre de la sífilis). Existen abundantes datos de cambios óseos y lesiones similares
en esqueletos precolombinos del Viejo Mundo, aunque esto no ha permitido
esclarecer del todo su origen, debido a que las lesiones de la sífilis venérea y no
venérea son difíciles de diferenciar. Independientemente del origen, los países
europeos decidieron atribuir o asociar el origen de la enfermedad a su país vecino,
esto es, los ingleses la consideraban como la “enfermedad francesa” y los franceses
le decían la “varicela italiana”. Parecía que ningún país pretendía hacerse responsable
del azote que causó la enfermedad en el Viejo Continente.3
En algunas décadas del siglo pasado la sífilis tuvo algunas fluctuaciones en cuanto a
su incidencia y en tiempos remotos fue un gran azote para la humanidad hasta el
empleo de la penicilina, donde casi fue erradicada. Hoy en día, la sífilis es considerada
una enfermedad ubicua con altas y bajas en su incidencia pero que mantiene una
tasa estable.1, 3
i. Clasificación taxonómica
Este grupo de bacterias se ha clasificado taxonómicamente en el orden
Spirochaetales, el cual se agrupó en base a sus propiedades morfológicas comunes.
Es un grupo muy grande y diverso, además de heterogéneo en lo que respecta a sus
necesidades, es decir, algunas bacterias son microaerófilicas o incluso algunos
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autores las clasifican como anaerobias estrictas, unas especies tienen relaciones
ecológicas muy complejas y en donde los seres humanos son huéspedes
accidentales. Otras espiroquetas solo son patógenas del ser humano y no han
podido ser cultivadas in vitro, solo in vivo o en cultivos especiales.3, 4,5
La orden en que se encuentran tiene dos familias: Leptospiraceae, con el género
Leptospira y Spirochaetaceae con los géneros Treponema y Borrelia. El género
Treponema, a su vez, tiene dos especies Treponema carateum y Treponema pallidum
con tres subespecies: pallidum (que para fines prácticos en adelante solo se
mencionara sólo como T. pallidum), endemicum y pertenue (Tabla 1).1
Tabla 1 Clasificación de las espiroquetas.
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ii. Fisiología y estructura.
Los treponemas relacionados con esta especie (T. pallidum) y con el género, son
espiroquetas muy finas enroscadas que miden 0.1 a 0.2 µm de ancho por 5 a 20 µm
de largo, aproximadamente. Sus extremos son rectos y puntiagudos. Las espiras
están espaciadas regularmente a una distancia de 1 µm entre sí y son tan finas que
no se les identifica con facilidad, una tinción inmunofluorescente o la microscopía
de campo oscuro facilitan su observación (Ilustración 6). No se les fija de manera
adecuada con colorantes convencionales como la anilina, pero si se impregnan con
preparaciones argénticas se aprecian claramente en tejidos.1, 3, 4, 5
Tiene un filamentoaxial integrado por tres miofibrillas que se insertan en cada uno
de los extremos afilados. Los flagelos que poseen estas bacterias están incluidos
dentro de la membrana externa multicapa, llamada vaina externa. Sin embargo, el
género Spirillum sp. tiene flagelos externos. Por consiguiente, son bacterias muy
móviles y a diferencia de otras se auto propulsan por rotación a través del medio
líquido que las rodea, inclusive pueden mantener su motilidad en líquidos con alta
viscosidad.3, 4, 5
No es una bacteria que forme esporas ni cápsula, pero forma una película delgada
que envuelve el cuerpo de la bacteria (exclusiva de cepas virulentas), constituida –
por lo menos en gran parte– por componentes del propio hospedero (Ilustración 5).
Las cepas patógenas producen hialuronidasa y una adhesina que se une a la
fibronectina, además de la envoltura externa.1
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iii. Cultivo.
Un dato importante es que no se ha logrado cultivar in vitro en medios artificiales,
pero actualmente se ha logrado desarrollar cepas virulentas en cultivos de células
epiteliales de conejo con una baja tensión de oxígeno y solo pueden mantener unas
cuantas generaciones. También ha sido posible cultivar en medios anaerobios
treponemas no patógenos como lo es la subespecie de Reiter, que son saprófitos
que mantienen una vinculación antigénica con el T. pallidum.5
Ilustración 5 Treponema pallidum (Getty images)
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Su tiempo de generación se ha calculado en 30 horas y su forma de reproducción es
por fisión transversa.4, 5
iv. Características de crecimiento.
T. pallidum es una bacteria tanto anaerobias como aerobias ya que son capaces de
metabolizar la glucosa en presencia de oxígeno, pero también puede incorporar
aminoácidos a proteínas en ausencia del mismo; aunque se ha visto que sobrevive
mejor en un medio con 1 a 4 % de oxígeno. Algunas subespecies de Reiter proliferan
en medios con nutrientes específicos y definidos como sales, minerales, vitaminas,
aminoácidos y albumina sérica. 2, 5
Los treponemas en suspensiones apropiadas y en presencia de sustancias reductoras
pueden conservar su movilidad de 3 a 6 días a 25 °C y mantener su viabilidad en
glicerol a -70 °C. En sangre completa o plasma almacenado a 4 °C los
microorganismos siguen siendo viables hasta las 72 horas como máximo.1, 5
Es una bacteria muy sensible a las condiciones ambientales, la sequedad y el
aumento de temperatura a 42 °C mata rápidamente a las bacterias.5
v. Genoma
El genoma completo del T. pallidum se secuenció en 1998 y se encontró que tenía
una homología genética del “100 %” con T. pallidum subespecie pertenue que es
responsable de una enfermedad cutánea no venérea que se distingue en varios
aspectos de la sífilis. Un grupo de investigadores secuenciaron el genoma completo
de una cepa de referencia de cada microorganismo, encontrando diferencia de un
solo nucleótido en un gen que codifica para una proteína de 19 kD, pero la
inmunogenicidad de ésta era la misma para ambas subespecies.3 En particular, el
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genoma del T. pallidum es un cromosoma circular que en promedio tiene 1 138 000
pares de bases, una poca cantidad para una bacteria con una virulencia significativa.
Un aspecto importante, es que muchas bacterias tienen elementos transponibles
dentro de su genoma, pero T. pallidum no los tiene, esto sugiere que conserva
firmemente el genoma, lo cual puede ser una explicación a que siga siendo
susceptible a un antibiótico como la penicilina. Hoy en día no hay casos reportados
de resistencia a dicho antibiótico por parte del T. pallidum.3, 5
Por otra parte, son pocos los genes que intervienen en la producción de energía y
síntesis de nutrientes, lo cual hace evidente que el microorganismo obtiene la
mayoría de ellos del hospedero. Su secuencia genómica completa ha demostrado
que los treponemas carecen de genes que codifican para superóxido dismutasa o
catalasa.4, 5
vi. Estructura antigénica.
Debido a que no se ha logrado cultivar el T. pallidum in vitro, no por lo menos en
medios acelulares, ha limitado su estudio en diferentes aspectos; uno de estos ha
sido la identificación de sus antígenos. Aunado a esto, la membrana externa que
rodea el espacio periplásmico y el complejo de peptidoglucanos-membrana-
citoplasma vuelven casi inaccesibles los antígenos a los anticuerpos, ya que los
lípidos que la conforman se encargan de fijar las proteínas a la membrana
citoplásmica o a la externa. Los endoflagelos (que se sitúan en el espacio
periplásmico) están conformados por tres proteínas que tienen similitud con otras
proteínas de los flagelos bacterianos y una proteína más de recubrimiento que no
presenta relación alguna. Se ha logrado identificar más de 100 antígenos proteicos
y la cardiolipina es una componente importante de estos.
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La sífilis es una enfermedad cosmopolita que surge en el siglo XX y que actualmente
presenta altas y bajas en la incidencia, pero mantiene una tasa estable. Es exclusiva
del ser humano, la transmisión de ésta puede ser mediante el contacto sexual,
transfusión y perinatal.4, 5, 6
La sífilis es una enfermedad con una presentación clínica muy variada y un poco
compleja, debido a una superposición de las etapas en que se divide, de ahí el que
sea considerado por algunos autores como “la gran imitadora”. 7, 8
La enfermedad se ha dividido en una serie de etapas en base a su evolución y cuando
la persona no ha recibido tratamiento, las cuales se describen a continuación:
Ilustración 6 Morfología y estructura del Treponema pallidum (iStock)
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i. Periodo de incubación.
Los treponemas tienen la capacidad de penetrar las mucosas sanas o introducirse a
través de una abrasión en la piel. Algunos estudios han denotado el contagio por
medio de objetos contaminados o por el contacto con las úlceras, sin que sea
necesariamente sexual y se estima que el 50 % de estos pueden o no desarrollar la
enfermedad. La realización de estudios experimentales ha permitido calcular la dosis
infectiva media (DI50) que es de sólo 57 microorganismos. El periodo de incubación
dura de 3 a 90 días, con una media de 3 semanas.7, 9
ii. Sífilis primaria o precoz.
Se manifiesta por la presencia de la lesión localizada de una sola úlcera que
generalmente aparece en el lugar por donde entró la bacteria al organismo. En
personas inmunosuprimidas, asociadas a VIH, es posible que aparezcan múltiples
úlceras. La lesión es firme, de bordes elevados, redonda y no causa dolor, aunque
ligeramente sensible a la palpación; debido a esto puede pasar desapercibida. Hay
poco exudado de la lesión (denominada también “chancro”), en el que pueden
observarse las espiroquetas por medio de microscopía de campo oscuro o
inmunofluorescencia directa. Las pruebas no treponémicas son negativas en un 10 a
30 % de las personas con sífilis primaria.
iii. Sífilis secundaria.
Ésta es la etapa más manifiesta de la enfermedad y en la cual el número de
microorganismos aumenta invariablemente. Hay erupciones en las membranas
mucosas (boca, vagina, ano y en la piel) que caracterizan esta etapa de la
enfermedad. Las lesiones en la piel se aprecian como puntos duros, de color rojizo
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o marrón, pueden aparecer una vez que ya curola úlcera primaria, sin que haya
sanado o varios días después, por lo que no están bien demarcadas las fases de la
enfermedad. No produce picazón o molestias en general y se localizan en la palma
de las manos y en la planta de los pies (Ilustración 7).
Algunos otros síntomas de la enfermedad en esta etapa son fiebre, inflamación de
los ganglios linfáticos, dolor de garganta, pérdida parcial de cabello, mialgias,
pérdida de peso, cefalea y astenia. La serología es el mejor método para el
diagnóstico y si la persona continua sin recibir tratamiento, la enfermedad
progresará a una fase latente y posiblemente a estados más graves.

Ilustración 7 Personas con Sífilis secundaria (Getty images).
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iv. Sífilis latente.
Comprende un periodo inicial de cuatro años denominado fase latente temprana y
periodo tardío posterior, comienza con la desaparición de los síntomas de las etapas
anteriores. La diferencia radica en que en la latencia temprana pueden existir
recidivas y la persona puede transmitir la infección. El periodo latente tardío puede
abarcar un tiempo indefinido y su detección es por marcadores serológicos.
v. Sífilis tardía.
Existen complicaciones en el sistema nervioso central, anomalías cardiovasculares,
tumores llamados “gomas” y puede estar comprometido casi cualquier órgano. Los
síntomas que presentan las personas que llegan a etapas avanzadas o tardías de la
sífilis incluyen dificultad para coordinar los movimientos musculares, parálisis,
entumecimiento, ceguera gradual y demencia.7, 8, 9

El diagnóstico de la enfermedad se puede hacer de forma muy sencilla siempre y
cuando el paciente presente los signos y síntomas que hagan pensar al médico en
la sífilis. Desafortunadamente la enfermedad puede o no pasar por ciertas etapas de
“curación espontánea” que pueden complicar el diagnóstico y en donde la única
forma de llegar a él es mediante el estudio serológico.
Las pruebas para el diagnóstico de la sífilis se clasifican en dos grandes grupos; el
diagnóstico Directo, donde se examina los exudados de las lesiones en los pacientes
en busca del agente causal y el Indirecto, donde analizan muestras de líquido
cefalorraquídeo y de sangre para la detección de anticuerpos (Ilustración 8).

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A su vez el diagnóstico indirecto se sub clasifica en dos grupos más; las pruebas
treponémicas y las no treponémicas, que difieren, en el tipo de antígeno que
utilizan y el tipo de anticuerpo a detectar.

Diagnóstico directo.
• Examen del agente causal directamente
Diagnóstico indirecto.
• Detección de Ac y/o titulación
D
ia
gn
ó
st
ic
o
In
d
ir
ec
to
No treponémicas
Utilizan particulas recubiertas
de lípidos.
Detecta Ac reaginicos
Treponémicas
Utiliza Ag especificos Tp 15, Tp
17 y Tp 47
Detecta Ac de las clases IgG e
IgM
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i. Pruebas directas.
a) Examen microscópico en campo oscuro.
Muestras:
Exudado del chancro con pocas células sanguíneas o punción ganglionar.
Técnica:
1. Limpiar la lesión con gasa y agua estéril para retirar secreciones secas o
costras; secar y frotar con gasa hasta que comience a sangrar, absorber y
esperar que exude una serosidad amarilla poco o nada sanguinolenta.

Ilustración 8 Esquema de las pruebas que se realizan para el serodiagnóstico de Sífilis y
su clasificación en Treponémicas y No Treponémicas.
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2. Tomar la gota apoyando sobre ella un portaobjeto limpio o utilizar un asa
estéril para transferirla al portaobjeto y cubrir con un cubreobjeto. Observar
inmediatamente al microscopio óptico con condensador de campo oscuro y
aumento de 400 X. Si la observación al microscopio se viera retrasada, se
deberá utilizar una cámara húmeda para colocar los preparados a fin de evitar
la desecación.

3. El T. pallidum presenta 8 a 14 espiras indeformables, es de movilidad lenta, se
identifica como un espiral delgado, rígido y con 3 tipos de movimientos:
rotación sobre su eje (como un tirabuzón), flexión en el centro y traslación. En
los chancros recientes suelen verse numerosos treponemas en el preparado,
estos disminuyen o desaparecen al envejecer la lesión.

4. Si el primer portaobjeto fuera negativo, insistir con 2 tomas más.

Interpretación
La demostración de treponemas con morfología y motilidad características del T.
pallidum constituye un diagnóstico positivo de sífilis en cualesquiera de sus fases,
independientemente del resultado de la reacción serológica.
La imposibilidad de encontrar la bacteria no excluye un diagnóstico de sífilis.

Criterio de informe
Observación en campo oscuro: negativa o positiva.
b) Prueba directa con anticuerpos fluorescentes para T. pallidum.
Es una reacción de fluorescencia directa que se aplica sobre la exudación del chancro.
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Se utiliza una inmunoglobulina anti-Treponema marcada con isotiocianato de
fluoresceína (FITC) que ha sido absorbida con Treponema phagedensis, treponema
Reiter, o un anticuerpo monoclonal anti-T. pallidum marcado con FITC. La
inmunoglobulina marcada reacciona con el antígeno T. pallidum, subespecie
pallidum en el material de la prueba.
Es obviamente más costosa que el Campo Oscuro (CO) y requiere un microscopio
de fluorescencia, así como experiencia en la observación. El material es fijado con
acetona antes de la coloración, por lo tanto, solo se verán formas espiraladas
fluorescentes, pero no la típica movilidad; presenta la ventaja de permitir el envío a
distancia del portaobjeto fijado.
Técnica para la obtención de la muestra
1. Colocar la muestra en un portaobjeto formando un círculo de 1 cm de ancho,
aproximadamente 10 μl del material y secar al aire. Si es posible preparar 4
portaobjetos de cada espécimen.

2. Fijar los extendidos en acetona por 10 min. o con metanol 100 % por 10
segundos o con calor suave.

3. Cubrir cada extendido con conjugado diluido (aprox. 30 μl), y colocar en
cámara húmeda a 35-37 ºC por 30 min. Nota: con el anticuerpo monoclonal,
adicionar azul de Evans que puede prepararse como una solución al 0.05 %
en PBS.

4. Lavar los extendidos con PBS, y cubrir con PBS por 10 min. Hacer un lavado
final con agua destilada.

5. Secar con papel de filtro, colocar una gota de líquido de montaje y colocar un
cubreobjeto. Colocar los portaobjetos en una cámara oscura y leer entre las 4
horas.
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6. Examinar en microscopio de fluorescencia con objetivo de 40X y con un
objetivo de 100X para confirmación.

Criterio de informe:
Se observaron por inmunofluorescencia directa, treponemas inmunológicamente
específicos para T. pallidum.

ii. Pruebas serológicas inespecíficas para la sífilis.
a) Venereal Disease Research Laboratory (VDRL).
Es una reacción de floculación, donde el antígeno utilizado está compuesto por
colesterol, lecitina y cardiolipina.
Esta prueba no treponémica mide anticuerpos antilipídicos de tipo IgG e IgM, los
cuales son formados por el huésped en respuesta al material lipídico liberado de las
células huésped dañadas en la infección por TP y material lipídico de la superficie
celular treponémica.
A causa del antígeno utilizado, esta prueba reacciona frente a otras patologías:
colagenopatías, parasitosis, drogadicción o en determinadas condiciones fisiológicas
comoembarazo, vejez, etc. Tiene una alta sensibilidad y baja especificidad.
Reactivos:
1. Antígeno de VDRL:
Es una solución alcohólica de 0.03 % de cardiolipina, 0.9 % de colesterol y 0.21 %,
0.01 % de lecitina.
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2. Buffer salino VDRL, pH 6.0 y 0.1 (1.0 % NaCl).
3. Sueros controles:
Siempre se debe incluir en la realización de la reacción de VDRL controles para
verificar la reactividad de la suspensión de antígeno sensibilizado. Registrar los
resultados de los controles como:
Control reactivo (R): Flóculos definidos de cualquier grado
No reactivo (N): Sin flóculos o ligera rugosidad.
No utilizar el antígeno sensibilizado sino cumple con estos criterios de reactividad.
Para la realización de las pruebas cuantitativas el suero control debe tener un título
de al menos 4 diluciones.
4. Solución Salina 0.9 %: Agregar a cada 100 ml de agua destilada 0.9 gr de NaCl.
5. Solución Salina 10.0 %: Agregar a cada 100 ml de agua destilada 10 gr de
NaCl.
Equipamiento:
1. Placas de vidrio de 2 x 3 pulgadas (50 X 76 mm aproximadamente) con 12
círculos planos (no cóncavos) de 14 mm de diámetro. El perímetro de cada
círculo debe tener un espesor tal que evite el traspaso del suero de un anillo
a otro.
2. Rotador mecánico ajustable a 180 ± 2 r.p.m. que circunscriba un círculo de 19
mm de diámetro sobre el plano horizontal.
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3. Agujas no descartables calibradas. Para dispensar el antígeno sobre el suero:
calibre 18. Si no se disponen de agujas, se pueden utilizar pipetas automáticas
considerando que se hallen bien calibradas.
4. Un frasco de vidrio para la preparación del antígeno de VDRL, de 30 ml de
capacidad de 35 mm de diámetro con tapa de vidrio base plana. Nota: Como
este tipo de frasco resulta difícil de conseguir en el comercio se recomienda
un Erlenmeyer de vidrio de 25 ml con tapa de vidrio
5. Microscopio con ocular de 10X y objetivo 10X
6. Micropipeta de volumen variable (recomendable 10 a 200 µL)
Conservación del suero:
Conservar el suero, separado del coágulo, en refrigeración (2 - 8 ºC) o congelado (-
20 ºC) si la determinación demorará más de 5 días. Evitar el congelamiento y
descongelamiento de los especímenes.
Las muestras con contaminación bacteriana o hemólisis excesiva son insatisfactorias
para el ensayo.
Preparación del suero:
Calentar a 56 ºC en baño María durante 30 minutos, si la técnica así lo requiere.
Los sueros que se analicen después de 4 horas del primer período de calentamiento,
deben volver a calentarse a 56 ºC durante 10 minutos.
NOTA: Las pruebas de floculación para la sífilis son afectadas por la temperatura
ambiente (Ta). Para obtener resultados confiables y reproducibles, las muestras de
suero control, el antígeno y los sueros a testear deben estar a una Ta de 23 a 29 ºC
en el momento de la determinación.
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

REACCION DE VDRL CUALITATIVA, EN SUERO
Preparación de la Suspensión del Antígeno VDRL:
1. Al momento de preparar la suspensión todos los reactivos deben estar entre
23 °C y 29 °C.
2. Pipetear 0.4 ml de Buffer salino VDRL y agregarlo al fondo del frasco de 30 ml
o del Erlenmeyer de 25 ml.
3. Agregar 0.5 ml de suspensión de antígeno (de la mitad inferior de una pipeta
1 ml graduada hasta la punta) directamente sobre la solución salina mientras
se hace girar el frasco suave pero continuamente sobre una superficie plana.
NOTA: El antígeno se añade gota a gota, de modo que se permita unos seis
segundos para los 0.5 ml de antígeno. La punta de la pipeta debe quedar en el tercio
superior del frasco y la rotación no debe ser tan vigorosa que salpique la pipeta con
la solución salina. Se obtendrá la velocidad de rotación adecuada cuando el centro
del frasco describa un círculo de 5 cm de diámetro, unas tres veces por segundo.
4. Desechar la última gota de antígeno de la pipeta sin que esta toque la
solución salina.
5. Proseguir con la rotación del frasco durante 10 segundos.
6. Con una pipeta de 5 ml añadir 4.1 ml de buffer.
7. Tapar el frasco y agitar de abajo hacia arriba y viceversa unas 30 veces en 10
segundos.
8. La suspensión de antígeno está lista y puede ser utilizada durante un día (8
horas).
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

9. Cada vez que se utilice la suspensión agitarla suavemente. No debe mezclarse
haciéndola pasar a la fuerza de un lado a otro de la jeringa y la aguja, puesto
que podría ocasionar la ruptura de partículas y la pérdida de reactividad.
Procedimiento:
1. En un anillo de 14 mm de la placa, depositar con pipeta 50 µl de suero
calentado.
2. Añadir 1 gota (1/60 de ml) de suspensión de antígeno (previamente
resuspendida) sobre cada suero, con una aguja no descartable calibrada sin
bisel de calibre 18.
3. Rotar las placas durante 4 minutos a 180 ± 2 rpm sobre un rotador
mecánico.
4. Leer la reacción al microscopio con ocular de 10X y objetivo de 10X.
5. Informar el resultado como:
REACTIVO: formación de flóculos medianos o grandes.
DÉBIL REACTIVO: pequeños flóculos.
NO REACTIVO: ausencia de floculación o ligeramente rugoso.
REACCION DE VDRL CUANTITATIVA, EN SUERO
Todos los sueros que produzcan resultado reactivo, débil reactivo o no reactivo
ligeramente rugoso en la reacción de VDRL en placa, deben analizarse de nuevo
cuantitativamente hasta un título en dilución final.
Las diluciones de suero que deben analizarse son: sin diluir (1:1), 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16.
En casos especiales continuar hasta 1:256.
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

1. Para cada muestra a ensayar colocar 50 µL de NaCl al 0.9 % en los círculos 2-
5.
2. Colocar 50 µL del suero a testar en los círculos 1 y 2.
3. Mezclar la solución salina y el suero en el círculo 2 utilizando la pipeta
automática, por aspiración y eliminación, 8 veces. Evitar la formación de
burbujas.
4. Transferir 50 µL del círculo 2 (1:2) al círculo 3 (1:4), mezclar como en el paso.
5. Transferir 50 µL del círculo 3 (1:4) al círculo 4 (1:8), mezclar como en el paso.
6. Transferir 50 µL del círculo 4 (1:8) al círculo 5 (1:16), mezclar como en el paso
3 y descartar 50 µL.
7. Resuspender suavemente la suspensión antigénica. Sosteniendo el frasco del
antígeno en posición vertical, dispensar 1 ó 2 gotas a fin de liberar el pico
vertedor de aire, y luego colocar exactamente una gota (1/60 ml) de la
suspensión antigénica dentro de cada círculo de prueba con una aguja no
descartable sin bisel de calibre 18.
8. Rotar 4 minutos a 180 ± 2 rpm y leer los resultados al microscopio con ocular
y objetivo de 10X.
9. Anotar los resultados en términos de la mayor dilución de suero que produzca
un resultado Reactivo.
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

10. Si la más alta dilución probada (1:16) es reactiva, proceder como sigue:
a) Preparar una dilución 1:16 de la muestra por adición de 100 μl del suero a
1,5 ml de NaCl al 0.9 %. Mezclar.
b) Colocar 50 μl de la solución de NaCl 0.9 % en los círculos 2, 3, 4 y 5 de la
placa.
c) Colocar 50 μl de la dilución 1:16 en los círculos 1 y 2.
d) Con la misma pipeta, realizar diluciones seriadas dobles a partir del círculo
2 y completar la prueba como se describió antes en los pasos 3 a 6.
e) Leer los resultados como se describió previamente.
b) Reacción en suero NO calentado, USR (Unheated Serum Reagin).
La USR es una prueba microscópica, no-treponémica y de floculación en placa. El
antígeno de USR detectara anticuerpos(reaginas) antilipoidales en muestras de
suero de personas con otras condiciones agudas y crónicas.
DISCREPANCIA DE RESULTADOS EN DOS PRUEBAS DE TAMIZAJE PARA SÍFILIS EN BANCO DE SANGRE.

La prueba de microfloculación USR usa una suspensión de antígeno de VDRL
modificado que contiene cloruro de colina, la cual incrementa la reactividad del
anticuerpo en suero no calentado. Semejante a la VDRL, la prueba se lee
microscópicamente y es rápido y fácil de hacer. Sin embargo, a diferencia de la VDRL,
la suspensión antigénica de la USR no debe ser preparada o descartada diariamente.
Muestra
1. Evitar infecciones accidentales por pinchaduras o cortes cuando se colecta y
procesa la muestra, observando las normas de bioseguridad
correspondientes.
2. El suero es la única muestra apropiada para la USR.
3. Una muestra de suero aceptable no debería contener partículas que pudieran
interferir con la lectura de los resultados. Las muestras de suero que
estuvieran excesivamente hemolizadas, visiblemente contaminadas con
bacterias, quilosas o extremadamente turbias, son insatisfactorias. Una
muestra está muy hemolizada cuando un impreso no puede ser leído a través
de ella.
Nota: La hemólisis puede ser causada por transportar la muestra en un clima
extremadamente frío o caliente, sin el aislamiento apropiado.
4. No todas las muestras inadecuadas deberían ser descartadas o no analizadas.
Cuando una muestra no satisfactoria es recibida en el laboratorio, avisar al
médico solicitante y discutir si la muestra debería ser analizada. Si el resultado
de la prueba es aun requerido por el médico, la condición de la muestra debe
ser indicada en el informe.
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Procesamiento
1. Dejar el tubo a temperatura ambiente el tiempo suficiente (aproximadamente
20 minutos) para que se forme el coagulo en la muestra.
2. Centrifugar la muestra a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos,
entre 1000 a 1200 x g a fin de sedimentar los elementos celulares.
3. Dejar la muestra de suero en el tubo de recolección original o transferirlo a
un tubo limpio si el análisis va a demorarse más de 4 horas. o el suero va a
ser calentado. Aunque la inactivación por calentamiento no es necesaria, el
suero puede ser calentado a 56 °C por 30 minutos para reducir el virus del
VIH tipo 1, sin afectar la prueba en curso.
4. Si la muestra de suero va a ser derivada a otro sitio para la agitación, se deben
utilizar los contenedores apropiados.
5. Si la prueba va a ser demorada, guardar el suero en el refrigerador (2 a 8 °C).
Si la prueba no va a ser procesada en más de 5 días, congelarla a –20 °C o
menos. Evitar repetidos congelamientos y descongelamientos de la muestra.
6. Las muestras deberán ser llevadas a temperatura ambiente (23 a 29 °C) antes
de realizar la prueba.
MATERIALES
Reactivos
Adquiridos
1. Suspensión antigénica USR. Una combinación estabilizada de cardiolipina,
colesterol y lecitina en una solución resuspendida de EDTA, cloruro de colina,
fosfato y timerosal. La suspensión antigénica se guarda a 2 – 8 °C.
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Suspensiones no abiertas son estables al menos por 1 año desde la fecha de
manufactura o hasta la fecha de expiración.
2. Alcohol, Etanol 95%
3. Acetona
Preparados
1. Muestras de suero control. Reactivo (R), débil reactivo (D) y no reactivo (NR).
2. Solución salina 0.9 %. Agregar 0.9 g de cloruro de sodio seco (ACS) a 100 ml
de agua destilada.
Equipamiento
1. Aguja no descartable calibrada, calibre 18 sin bisel.
2. Jeringa de vidrio (2 a 5 ml)
3. Pipeta automática de 50 µL.
4. Portaobjetos, 2 x 3 pulgadas con 12 anillos parafinados o cerámicos de
aproximadamente 14 mm de diámetro.
5. Rotador mecánico ajustable a 180 ± 2 rpm, circunscribiendo un círculo de 19
mm de diámetro sobre un plano horizontal.
6. Microscopio con oculares de 10X y un objetivo de 10X.
7. Centrífuga.
8. Refrigerador de 2 a 8 °C.
9. Trapo o tela húmeda (opcional).
10. Guantes de látex desechables, anteojos de seguridad y ropa protectora.
11. Contenedores para desechar y desinfectantes.
Procedimientos
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Prueba Cualitativa
1. Las pruebas de floculación en placa para sífilis, son afectadas por la
temperatura. Para obtener resultados confiables y reproducibles, la
suspensión antigénica de USR, los controles y la muestra a analizar deben
estar a temperatura ambiente (23 a 29 °C) cuando se realiza la prueba.
2. Colocar con una pipeta automática 50 µL de suero no calentado en un anillo
de parafina o cerámica de la placa. No usar placas de vidrio con concavidades,
pocillos o anillos de vidrio.
3. Resuspender suavemente la suspensión de antígeno de USR.
4. Sostener la aguja dispensadora de la suspensión antigénica y la jeringa en
posición vertical, dispensar varias gotas para eliminar el aire de la aguja; luego
agregar exactamente 1 gota (22 µL) de suspensión antigénica a cada círculo
conteniendo suero.
5. Colocar la placa sobre el rotador mecánico. Rotar la placa por 4 minutos a 180
± 2 rpm. Cuando se realiza la prueba en un clima seco, cubrir las placas con
un trapo húmedo durante la rotación para prevenir la evaporación excesiva.
6. Inmediatamente después de la rotación, sacar la placa del rotador y leer los
resultados.
7. Realizar la prueba cuantitativa en todas las muestras de suero que produzcan
un resultado reactivo, débil reactivo o no reactivo rugoso en la prueba
cualitativa.

Lectura e informe de los resultados cualitativos
I. Leer las reacciones usando un microscopio equipado con ocular de 10X y
objetivo de 10X.
II. Informar los resultados de la siguiente manera:

Lectura Informe
Grumos grandes o medianos Reactivo
Grumos pequeños Débil reactivo (D)
Sin grumos o muy ligera
rugosidad
No reactivo (NR)
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Prueba Cuantitativa
1. Diluir hasta un título de punto final todas las muestras que produzcan
resultado reactivo, débil reactivo o no reactivo rugoso en la prueba cualitativa.
Analizar la muestra de suero no diluida y diluida 1:2, 1:4 y 1:8. Se pueden realizar en
una sola placa las pruebas cuantitativas hasta diluciones 1:8 de tres muestras de
suero, según se muestra en la figura siguiente.

2. Colocar 50 µL de solución salina al 0.9 % en los círculos 2 a 4. No derramar la
solución salina.
3. Con una pipeta automática, colocar 50 µL del suero en el círculo 1 y 50 µL en
el círculo 2.
4. Mezclar la solución salina y el suero en el círculo 2 utilizando la pipeta
automática, por aspiración y eliminación, 8 veces. Evitar la formación de
burbujas.
5. Transferir 50 µL del círculo 2 (1:2) al círculo 3 (1:4), mezclar como en el paso
3.
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Transferir 50 µL del círculo 3 (1:4) al círculo 4 (1:8), mezclar como en el paso 3
y descartar los últimos 50 µL.
6. Resuspender suavemente la suspensión antigénica. Sosteniendo el frasco del
antígeno en posición vertical, dispensar 1 o 2 gotas a fin de liberar el pico
vertedor de aire y luego colocar exactamente una gota (22 µL) de la
suspensión antigénica dentro de cada círculo.
7. Colocar la placa sobre el rotador mecánico. Rotar 4 minutos a 180 ± 2 rpm.
Cuando la prueba es realizada en un clima muy seco, colocar la placa bajo un
trapo húmedo durante la rotación para preservar la evaporación.
8. Inmediatamente después de la rotación, leer los resultados al microscopio con
ocular y objetivo de 10X.
9. Anotar los resultados en términosde la mayor dilución de suero que produzca
un resultado Reactivo (NO débil reactivo).

10. Si la dilución más alta probada (1:8) es reactiva, continuar de la siguiente
manera:
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a) Preparar en un tubo una dilución 1:8 de la muestra de suero. Agregar 0.1
ml (100 μl) de suero a 0.7 ml de solución salina 0.9 %. Mezclar
adecuadamente.
b) Colocar 50 μl de solución salina 0.9 % en los círculos 2, 3 y 4 de la placa.
Preparar diluciones seriadas adicionales para muestras fuertemente
reactivas.
c) Agregar 50 μl de la dilución 1:8 preparada anteriormente a los anillos 1 y
2.
d) Realizar diluciones seriadas al medio, comenzando con el anillo 2 y
descartar los últimos 50 μl. Completar la prueba como se describió en los
pasos 6 a 9.
11. Una vez finalizadas las pruebas del día, tapar el antígeno remanente. En el
caso de utilizar una aguja y jeringa dispensadora o un dispositivo dispensador
separado, limpiarlos enjuagando con agua, alcohol y acetona. Sacar la aguja
de la jeringa después de limpiarlos.

Interpretación de la prueba
La prueba de USR es una gran ayuda en el diagnóstico de sífilis. Para arribar al
diagnóstico definitivo de sífilis, el profesional combina los resultados de la USR con
otras pruebas serológicas, exámenes de campo oscuro, signos y síntomas clínicos y
factores de riesgo. Sin algún otro soporte para el diagnóstico de sífilis, un resultado
de USR reactivo, puede deberse a causas que no correspondan con una infección
por treponema patógeno. El valor predictivo de una USR en el diagnóstico de sífilis
se incrementa cuando se combina con una prueba treponémica reactiva.
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La prueba reactiva puede sugerir infección pasada o presente con Treponema
patógeno, aunque también podría ser una reacción falso positiva.
Las reacciones falso positivas pueden deberse a un error de laboratorio como así
también a anticuerpos séricos que no están relacionados con Treponemas
patógenos. Los errores técnicos son detectados por la prueba USR no reactiva sobre
una segunda muestra sérica. Un resultado reactivo de USR debido a infección no
relacionada u otros factores, es identificada por los resultados de una prueba
treponémica no reactiva simultánea.
La prueba USR no reactiva sin evidencia clínica de sífilis, puede sugerir una infección
sifilítica pasada, infección con tratamiento efectivo u ocasionalmente, una infección
de larga evolución. Una prueba no reactiva USR con evidencia clínica de sífilis puede
deberse a sífilis primaria temprana; sífilis secundaria, como resultado de una reacción
de prozona; y a algunos casos de sífilis tardía. Si se sospecha reacción de prozona,
debería repetirse la prueba con diluciones del suero del paciente 1:16 antes de
determinar que la muestra de suero es no reactiva. Una prueba USR no reactiva no
excluye una sífilis en período de incubación.

c) Rapid Plasmatic Reagin (RPR).
La prueba de RPR es una prueba de floculación no treponémica macroscópica,
utilizada para detectar y cuantificar reaginas, un anticuerpo anti-lipoideo encontrado
en el suero o plasma de personas con sífilis y ocasionalmente en personas con
infecciones agudas o crónicas en otras condiciones aparte de la sífilis.
El antígeno que se utiliza en esta prueba es una modificación del antígeno de VDRL,
que contiene micro partículas de carbón para resaltar la diferencia entre un resultado
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positivo y negativo. Si la muestra tiene reaginas, ocurre la floculación con las
partículas de carbón contenidas en la suspensión del antígeno, dando como
resultado un acumulo de color negro, mientras que las muestras no reactivas dan
como resultado un ligero color gris.
Muestras:
Las muestras pueden ser sueros o plasmas activados o inactivados, incluso plasmas
colectados con EDTA como anticoagulante, siempre evitando la hemolisis. La lipemia
no interfiere con la suspensión del antígeno, sin embargo, si la muestra está muy
lipémica e interfiere en la apreciación de las partículas de carbón no debe utilizarse.
Contenido:

Procedimiento:
Prueba cualitativa.
1. Lleve a temperatura ambiente la suspensión del antígeno de RPR, los
controles y las muestras. NOTA: los controles positivos y negativos del kit
deben probarse con cada lote de prueba.
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2. Tome la pipeta/agitador del extremo sellado. Al tiempo que oprime y
mantiene presionado dicho extremo, coloque la pipeta dentro de la muestra.
Suelte para permitir que la pipeta aspire un poco de muestra.
3. Sostenga en posición vertical la pipeta/agitador directamente sobre un círculo
de la tarjeta de prueba y coloque una gota de muestra sobre esta área.
4. Utilizando el extremo plano de la pipeta/agitador, extienda la muestra para
cubrir el total de la superficie del círculo. Deseche la pipeta/agitador. Repita
el mismo procedimiento para cada muestra.
5. Agite el frasco dispensador de la suspensión del antígeno antes de utilizarlo.
Sosténgalo en posición vertical y dispense varias gotas en la tapa del frasco
dispensador para asegurarse de que el paso por la aguja es correcto. No
limpie la aguja. Coloque una gota de la suspensión del antígeno sobre cada
muestra. No extienda.
6. Agite por 8 minutos a 100 rpm en un rotador mecánico.
7. Transcurrido este tiempo retire la tarjeta del rotador, agite breve y
suavemente la tarjeta.
8. Lea macroscópicamente bajo una lámpara de luz intensa.
Interpretación de resultados:
Reactivo: Flóculos grandes o pequeños en el centro o la periferia del circulo de
prueba.
Poco reactivo: Presencia de flóculos pequeños pero definidos.
No reactivo: Apariencia lisa, uniforme, pero sin flóculos visibles.
Procedimiento Cuantitativo.
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1. Lleve a temperatura ambiente la suspensión del antígeno de RPR, los
controles y las muestras.
2. Para cada muestra a probar, coloque 50 µL (0.05 mL) de salina al 0.9% dentro
de los círculos de prueba, numerados del 2 al 5. Se puede utilizar un capilar
calibrado o una pipeta serológica de 1 mL o menos. No extienda la salina.
3. Coloque 50 µL (0.05 mL) de muestra en el círculo No. 1.
4. Coloque 50 µL (0.05 mL) de muestra en el círculo No. 2 mezcle de 6 a 8 veces,
después transfiera 50 µL al círculo 3, mezcle y continúe preparando diluciones
al doble hasta el círculo 5. Deseche los últimos 50 µL.
5. Utilizando una pipeta/agitador nuevo (extremo plano) para cada muestra,
comenzando con la dilución más alta de suero (círculo 5), extienda el suero
sobre el total del área del círculo de prueba. Proceda de la misma forma para
los círculos 4, 3, 2 y 1.
6. Agite el frasco dispensador de la suspensión del antígeno antes de utilizarlo.
Sosténgalo en posición vertical y dispense varias gotas en la tapa del frasco
dispensador para asegurarse de que el paso por la aguja es correcto. No
limpie la aguja. Coloque una gota de la suspensión del antígeno sobre cada
muestra.
7. Agite por 8 minutos a 100 rpm en un rotador mecánico.
8. Transcurrido este tiempo retire la tarjeta del rotador, agite breve y
suavemente la tarjeta.
9. Lea macroscópicamente bajo una lámpara de luz intensa.

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Resultados Cuantitativos
La última dilución que contenga agregados macroscópicos indica el título de la
muestra.
Si la última dilución (círculo 5) es reactiva, las diluciones seriadas