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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS Distribución de SYCP1, SYCP3 y gamma-H2AX en espermatocitos primarios de ratas prepúberes. T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGA P R E S E N T A : YUNUEN MIRIELA VALENZUELA RIVAS DIRECTOR DE TESIS: DOCTORA OLGA MARGARITA ECHEVERRÍA MARTÍNEZ 2017 Margarita Texto escrito a máquina CIUDAD DE MÉXICO Margarita Texto escrito a máquina UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 1 Agradecimientos. A la UNAM, por otorgarme la oportunidad de formarme como profesional. Al taller de Biología Celular y Molecular de la reproducción sexual por permitirme iniciar mi trabajo de tesis de licenciatura. Al laboratorio de Microscopía electrónica de la Facultad de Ciencias UNAM por otorgarme un lugar para iniciarme en el quehacer científico. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo económico otorgado durante mis tres años como ayudante de investigador. A DGAPA-UNAM por el apoyo económico otorgado al proyecto INPAPIIT IN225917 CTCF como regulador de múltiples mecanismos estructurales y moleculares durante la espermiogénesis. A la Dra. Olga Margarita Echeverría Martínez, coordinadora del laboratorio de Microscopía electrónica y la directora de mi tesis por su contribución a mi formación académica. Al Dr. Gerardo Hebert Vázquez Nin fundador de esta línea de investigación en el país, por sus aportaciones y por su amplia experiencia en el campo de la meiosis. A los doctores: Dra. Maricela Villagrán, Dra. Sandra Gómez, Dra. Teresa Fortoul, Dr. Abrahan Hernández Hernández y Dra. Olga Echeverría Martínez por dedicarle el tiempo a la revisión de mi trabajo de tesis, por sus observaciones, comentarios y sugerencias a la misma y por brindarme su apoyo durante dicha revisión. A la Dra. Rosario Ortíz Hernández por su asistencia técnica durante el proceso de la realización de los experimentos dentro de este trabajo de investigación. A la Dra. Luisa Escobar por sus sugerencias para mejorar el texto. A la Maestra en Ciencias Ernestina Ubaldo por su apoyo técnico en la experimentación. 2 A la Maestra en Ciencias Silvia Juárez Chavero por su asistencia técnica en mis inicios dentro del laboratorio de Microscopía electrónica. 3 Agradecimientos a título personal. A mi tutora la Dra. Olga Echeverría Martínez, por todo lo que he aprendido gracias a sus enseñanzas. A la Dra. Rosario Ortiz Hernández, por su apoyo durante la elaboración de mi trabajo de tesis, por sus enseñanzas y sobre todo por su paciencia y su amistad. A la Dra. Luisa, por animarme a ir siempre hacia adelante. A los Meiocitos y Apoptocitos, por aceptarme como una de los suyos, por su amistad y compañerismo. A mi madre, por estar siempre al pendiente de mí y animarme a ser mejor cada día. A mi padre, por tanto apoyo y cariño. A mis hermanos, por todo el cariño, apoyo y sobre todo por estar siempre a mi lado. A mis amigos, todos, porque no habría sido lo mismo sin ustedes, por su amistad, apoyo, consejos y cariño. A mis sinodales la Dra. Sandra Gómez Arroyo, la Dra. Teresa Imelda Fortoul Vander Goes, la Dra. Maricela Villagrán Santa Cruz y en especial al Dr. Abrahan Hernández Hernández por su apoyo incondicional durante la revisión de mi trabajo de tesis. A todos los que hicieron que este camino fuera más llevadero. 4 Dedicatoria A mi familia, por todo su apoyo y paciencia, especialmente a mis padres porque siempre han creído en mí y me han brindado su apoyo incondicional, a mi madre porque han vivido lo mejor y lo peor de este camino a mi lado y a mis hermanos Edgar, Polandre, Berenice y Artemisa, por estar siempre presentes, especialmente en los momentos más difíciles. A mamá Eve, porque sembró en mí las ganas de crecer y ser profesional, por su cariño. A mi tía Bertha, por sus consejos, su apoyo y cariño. A Isra por su amor incondicional y por ser tan paciente conmigo, por no dejar que me dé por vencida. A mis sobrinos Ángel, Iker, Cecilia y Renata, porque de ustedes también he aprendido. 5 Distribución de SYCP1, SYCP3 y gamma-H2AX en espermatocitos primarios de ratas prepúberes. Alumna: Yunuen Miriela Valenzuela Rivas Director de Tesis: Dra. Olga Margarita Echeverría Martínez Índice. I. Abreviaturas ................................................................................................................ pág. 8 II. Resumen .................................................................................................................... pág. 9 III. Introducción ............................................................................................................... pág. 15 III.1 Reproducción sexual y pubertad ................................................................. pág. 15 III.2 Testículo ...................................................................................................... pág. 15 III.3 Espermatogénesis ....................................................................................... pág. 17 III.4 Ciclo del epitelio seminífero y onda espermatogénica .................................. pág. 18 III.4.1 Ciclo del epitelio seminífero ................................................................. pág. 18 III.4.2 Onda espermatogénica ....................................................................... pág. 18 III.5 Meiosis ......................................................................................................... pág. 18 III.5.1 Complejo sinaptonémico ..................................................................... pág. 19 III.5.2 Profase meiótica I ................................................................................ pág. 19 III.5.2.1 Leptoteno ................................................................................. pág. 19 III.5.2.2 Cigoteno .................................................................................. pág. 20 III.5.2.3 Paquiteno ................................................................................ pág. 20 III.5.2.4 Diploteno ................................................................................. pág. 21 III.5.2.5 Diacinesis ................................................................................ pág. 21 IV. Justificación .............................................................................................................. pág. 21 V .Hipótesis .................................................................................................................... pág. 21 VI. Objetivos .................................................................................................................. pág. 22 VI.1. Objetivo general ..........................................................................................pág. 22 VI.2 Objetivos particulares .................................................................................. pág. 22 VII. Material y método ..................................................................................................... pág. 22 VII.1 Procesamiento histológico del material Biológico ........................................ pág. 22 VII.1.1 Extracción de tejido ............................................................................ pág. 22 VII.1.2 Fijación .............................................................................................. pág. 23 VII.1.3 Deshidratación ................................................................................... pág. 23 6 VII.1.4 Aclaramiento ...................................................................................... pág. 23 VII.1.5 Preinclusión ....................................................................................... pág. 23 VII.1.6 Inclusión ............................................................................................. pág. 23 VII.2 Corte del material biológico......................................................................... pág. 24 VII.2.1 Desparafinación e hidratación ............................................................ pág. 24 VII.2.2 Tinción Hematoxilina y Eosina ........................................................... pág. 24 VII.3 Inmunolocalizaciones.................................................................................. pág. 24 VII.3.1 Inmunolocalización para SYCP3 ........................................................ pág. 24 VII.3.2 Doble inmunolocalización para SYCP3 y SYCP1 ............................... pág. 25 VII.3.3 Doble inmunolocalización para SYCP3 y γH2AX ............................... pág. 25 VII.3.4 Obtención de imágenes y cuantificación ............................................ pág. 26 VIII. Resultados .............................................................................................................. pág. 28 VIII.1 Observaciones en los túbulos seminíferos de ratas adultas ....................... pág. 29 VIII.1.1 Morfología del túbulo seminífero de organismos adultos ................... pág. 29 VIII.1.2 Distribución de SYCP3 y SYCP1 durante la profase meiótica I en ratas adultas.................................................................................................. pág. 29 VIII.1.2.1 Leptoteno .............................................................................. pág. 29 VIII.1.2.2 Cigoteno ................................................................................ pág. 29 VIII.1.2.3 Paquiteno .............................................................................. pág. 29 VIII.1.3 Distribución de γH2AX durante la profase meiótica I en organismos adultos ....................................................................................... pág. 33 VIII.1.3.1 Leptoteno .............................................................................. pág. 33 VIII.I.3.2 Cigoteno ................................................................................. pág. 33 VIII.I.3.3 Paquiteno ............................................................................... pág. 33 VIII.2 Observaciones en los túbulos seminíferos de ratas prepúberes ................ pág. 37 VIII.2.1 13 días de edad ................................................................................ pág. 37 VIII.2.1.1 Morfología del túbulo seminífero de ratas de 13 días de edad ............................................................................... pág. 37 VIII.2.1.2 Distribución de SYCP3 y SYCP1 durante la etapa de leptoteno en ratas de 13 días de edad .................................................. pág. 37 VIII.2.1.2.1 Leptoteno ............................................................. pág. 37 VIII.2.1.3 Distribución de γH2AX durante la etapa de leptoteno en ratas de 13 días de edad ................................... pág. 37 VIII.2.2 16 días de edad ................................................................................ pág. 40 7 VIII.2.2.1 Morfología del túbulo seminífero de ratas de 16 días de edad .................................................................................... pág. 40 VIII.2.2.2 Distribución de SYCP3 y SYCP1 durante la etapa de cigoteno en ratas de 16 días de edad .................................... pág. 40 VIII.2.2.2.1 Cigoteno .............................................................. pág. 40 VIII.2.2.3 Distribución de γH2AX durante la etapa de cigoteno en ratas de 16 días de edad .............................................. pág. 40 VIII.2.3 27 días de edad ................................................................................ pág. 44 VIII.2.3.1 Morfología del túbulo seminífero de ratas de 27 días de edad .................................................................................... pág. 44 VIII.2.3.2 Distribución de SYCP3 y SYCP1 durante la etapa de paquiteno en ratas de 27 días de edad ................................................. pág. 44 VIII.2.3.2.1 Paquiteno ............................................................. pág. 44 VIII.2.3.3 Distribución de γH2AX durante la etapa de paquiteno en ratas de 27 días de edad ................................................. pág. 44 VIII.2.4 38 días de edad ................................................................................ pág. 44 VIII.2.4.1 Morfología del túbulo seminífero de ratas de 38 días de edad .................................................................................... pág. 48 VIII.2.4.2 Distribución de SYCP3 y SYCP1 durante la etapa de paquiteno en ratas de 38 días de edad .............................. pág. 48 VIII.2.4.3 Distribución de γH2AX durante la etapa de paquiteno en ratas de 38 días de edad ................................................. pág. 48 IX. Discusión .................................................................................................................. pág. 52 X. Conclusiones .............................................................................................................. pág. 55 8 I. Abreviaturas. CPN-SYCP3 Cúmulos Perinucleares de SYCP3 CS Complejo Sinaptonémico RC Región Central ELs Elementos Laterales EC Elemento Central FTs Filamentos Transversos SYCP3 Synaptonemal Complex Protein 3 SYCP1 Synaptonemal Complex Protein 1 SYCP2 Synaptonemal Complex Protein 2 H2AX Histona H2A variante X γH2AX Forma fosforilada de la histona H2AX en la posición gama en la serina 139 LH Hormona Luteinizante FSH Hormona Folículo Estimulante ABP Proteína fijadora de andrógenos DNA Ácido Desoxirribonucleico 1a Primera onda espermatogénica PBS Phosphate Buffered Saline H y E Hematoxilina y Eosina TBST Tris Borato Sulfato Tween FITC Fitocromo C 9 II. Resumen. Durante la primera onda espermatogénica de la rata, se lleva a cabo la formación del complejo sinaptonémico, esto puede ser evidenciado por la inmunodetección de las proteínas que lo constituyen, entre ellas SYCP3 y SYCP1, siendo muy específico el patrón de detección dependiendo la etapa en la que se encuentren las células marcadas, pudiendo diferenciar las distintas etapas de la profase meiótica I. En este trabajo se evaluó la presencia de estas proteínas durante la primera onda espermatogénica en ratas prepúberes a diversas edades (13, 16, 27 y 38 días de edad), así como en ratas adultas, encontrando que una de las proteínas analizadas, SYCP3, presentó una distribución distinta a lo observado en organismos adultos, a este patrón de distribución se le denominó Cúmulos Perinuclaeares de SYCP3 (CPN- SYCP3), además se evaluó o se estimó el proceso de recombinación meiótica pormedio de la inmunodetección de la variante de histona H2AX (γH2AX), sugiriendo que este proceso se lleva a cabo de manera adecuada, aún con la presencia de estos Cúmulos Perinucleares de SYCP3. 10 III. Introducción. III.1 Reproducción sexual y pubertad. La reproducción sexual es una característica única de organismos pertenecientes al dominio Eukarya. Éstos producen células sexuales o gametos en órganos especializados (gónadas) mediante un proceso especializado de división celular o meiosis. Los gametos son haploides, es decir contienen la mitad de la carga genética de sus células progenitoras. La unión de dos gametos, provenientes de organismos de diferente género, produce la formación de un nuevo individuo, en el cual se restablece la ploidía del nuevo organismo (Alberts et al., 2015). En algunos organismos como los mamíferos, la maduración sexual se lleva a cabo después del inicio de la etapa de pubertad, definiéndose ésta como la etapa en la vida de un individuo, durante la cual se desarrollará física y psicosomáticamente, obteniendo al final de este proceso la capacidad de reproducirse. El periodo prepúber se puede estudiar desde distintos puntos de vista, uno de ellos es evaluando los cambios que ocurren en los testículos y la forma en la que se lleva a cabo la formación y desarrollo de las células germinales. Es durante la etapa de pubertad que se da inicio a la formación y diferenciación de las células germinales, implicando procesos como el inicio de la primera onda espermatogénica, y por tanto, incluyendo dentro de ésta, los procesos meiótico y espermatogénico. Es importante tomar en cuenta las condiciones en las que se encuentran las células germinales, ya que al tratarse de organismos jóvenes, las características sexuales no están bien establecidas, por ejemplo: la barrera hematotesticular en la rata, comienza constituirse desde los 15 a 16 días postnatales y termina de formarse de los 18 a 21 días posnatales, coincidiendo con el tiempo en que las células de Sertoli cesan de dividirse. Esta barrera es constituida casi exclusivamente por uniones especializadas entre las células de Sertoli adyacentes, necesitando de esta manera de la membrana basal para formarse. Una vez formada, las espermatogonias y las células en etapa de preleptoteno se mantienen fuera de la barrera hematotesticular, sin embargo una vez que transitan hacia la etapa de cigoteno, paquiteno y diploteno pasan al interior de la barrera hematotesticular, continuando con la meiosis I y posteriormente con la meiosis II (Cheng y Mruk, 2012).. III.2 Testículo. El testículo en mamíferos es un órgano par que se encuentra normalmente recubierto por una cápsula fibrosa denominada túnica albugínea (Gartner y Hiatt, 2001); a partir de ésta capa, el testículo es dividido en 250 compartimentos aproximadamente, llamados septos; en el caso del ser humano éstos compartimentos son incompletos y se les 11 conoce como lóbulos testiculares, dentro de los cuales se encuentran los túbulos seminíferos (Xia, et al., 2005). Histológicamente el testículo puede dividirse en dos componentes principales: un espacio intersticial y el compartimiento compuesto por los túbulos seminíferos. A su vez, los túbulos seminíferos están formados por una membrana basal que da soporte estructural al epitelio seminífero. En el ser humano, se estima que un túbulo seminífero tiene una extensión de entre 30 a 70 cm de largo y un diámetro de aproximadamente 150 a 250mm (Gartner y Hiatt, 2001). Cada túbulo se encuentra enrollado y sus dos extremos finales se conectan con el inicio de la red testicular (rete testis) (Russell et al., 1990). Durante la etapa reproductiva del organismo, hay una gran demanda celular para la formación de espermatozoides, mismos que serán necesarios para la reproducción sexual (Russell et al., 1990). La formación de espermatozoides se lleva a cabo en la unidad funcional de los testículos, los túbulos seminíferos (Hermo et al., 2010). Los túbulos seminíferos están compuestos por un epitelio que se encuentra al interior de cada túbulo, este epitelio consta de varias capas de células, la más externa contiene a las células de Sertoli (también llamadas células nodriza) y a las espermatogonias (Gartner y Hiatt, 2001). Las células de Sertoli forman uniones entre ellas conformando la barrera hematotesticular, constituyendo de esta manera una barrera física que impide el paso de substancias de peso molecular muy pequeño. Esta barrera separa el epitelio seminífero en un compartimento basal y un adluminal, de esta manera se protege a los espermatozoides de una respuesta autoinmune, ya que debido a la ploidía que presentan podrían resultar extraños para el organismo (Russell et al., 1990). El tejido conectivo que rodea a los túbulos seminíferos contiene a las células de Leydig (Gartner y Hiatt, 2001), éstas células son estimuladas por la hormona luteinizante (LH por sus siglas en inglés) para la producción de testosterona, la cual se difunde dentro del túbulo a través del espacio linfático, donde las células de Sertoli la asimilan (Russell et al., 1990). El mantenimiento del epitelio seminífero depende de altas concentraciones esta hormona para que las células germinales sean capaces de proliferar y diferenciarse. Otra hormona importante para la espermatogénesis es la hormona folículo estimulante (FSH por sus siglas en inglés), activa directamente a los túbulos seminíferos, promoviendo la formación de la proteína fijadora de andrógenos (ABP por sus siglas en inglés), misma que es producida por las células de Sertoli (Bloom y Fawcett, 1975); la ABP se une a la testosterona impidiendo su salida del túbulo seminífero y de esta manera aumenta la concentración de la hormona a nivel local, lo suficiente para mantener el proceso de espermatogénesis en curso. 12 III.3 Espermatogénesis. La espermatogénesis es el proceso por medio del cual se lleva a cabo la formación y diferenciación de los espermatozoides (Ross y Pawlina, 2007), este proceso se inicia durante el periodo prepúber y continúa a lo largo de la vida adulta (Xia, et al., 2005). Conforme el organismo incrementa su talla y edad, el epitelio seminífero comienza a presentar diferentes tipos celulares, entre ellos células de Sertoli y distintos tipos de espermatogonias, en este punto ya es posible observar células que por su forma y tamaño han sido denominadas espermatocitos primarios, mismos que transitan de manera sucesiva por la profase meiótica I (Bellve et al., 1977). Diversos estudios dejan claro que no todos los espermatocitos terminarán el proceso meiótico, siendo eliminados durante el proceso espermatogénico, mediante procesos de muerte celular programada (Jahnukainen et al., 2004; Hermo et al., 2010). Normalmente la espermatogénesis es dividida en tres fases: la fase de proliferación, la fase de meiosis y la espermiogénesis o diferenciación de los espermatozoides (Gartner y Hiatt, 2001). La primera etapa se dará principalmente en las espermatogonias, por medio de una serie de divisiones mitóticas, dando como resultado una gran población celular. De acuerdo a su morfología, en la rata, se han descrito seis diferentes tipos de espermatogonias y se les han denominado por tipos: tipo A1, A2, A3, A4, Intermedias y B (Hermo et al., 2010). Todas las espermatogonias se encuentran en el compartimento basal y constan de una carga genética diploide, sin embargo, cuando una espermatogonia tipo B se divide vía mitosis puede dar origen a otra espermatogonia tipo B, para mantener el estrato de células, o bien puede convertirse en un espermatocito primario y entonces migrar hacia el compartimento adluminal (Adler, 1996). La segunda etapa, la meiótica, iniciacon los espermatocitos primarios, dando como resultado a dos espermatocitos secundarios de corta duración (Gartner y Hiatt, 2001), que de inmediato llevan a cabo una segunda división meiótica. La profase de la primera división meiótica es de larga duración y para su estudio ha sido dividida en cinco etapas: leptoteno, cigoteno, paquiteno, diploteno y diacinesis. Por último se da la etapa de espermiogénesis, la cual se define como el proceso de diferenciación de las espermátidas a espermatozoides (Ross y Pawlina, 2007). Durante ésta etapa las células han terminado el proceso meiótico y comienzan a sufrir una serie de cambios morfológicos, entre los cuales se encuentran, la pérdida de gran parte de su citoplasma (el cual es fagocitado y reciclado por las células de Sertoli), la formación de un acrosoma granular y el establecimiento del flagelo (Gartner y Hiatt, 2001). Esta serie de transformaciones, dentro del proceso de espermiogénesis, comprenden las siguientes cuatro fases: la de Golgi, de cubierta, de acrosoma y de maduración. Estas células son conocidas como espermátidas y cuando han terminado su proceso de diferenciación se las llama espermatozoides (Gilbert, 2010). 13 III.4 Ciclo del epitelio seminífero y onda espermatogénica. III.4.1 Ciclo del epitelio seminífero. El término "ciclo del epitelio seminífero”, puede ser usado para describir la serie completa de las diferentes asociaciones de las células germinales en distintas etapas del proceso espermatogénico. El ciclo es definido como la serie de cambios que ocurren entre dos sucesivas apariciones de la misma asociación celular, en un área determinada del túbulo seminífero (Leblond y Clermont, 1952). Estudios realizados principalmente por Leblond y Clermont en 1952, permitieron definir estos arreglos celulares, al analizar cortes transversales contiguos es posible observar que se repiten los distintos arreglos de manera cíclica. En el caso de la rata se han descrito 14 diferentes arreglos celulares (también llamados estadíos) (Hermo et al., 2010; Leblond y Clermont, 1952). En el ratón se han referido 12 estadios, mientras que en el ser humano sólo seis; la duración del ciclo del epitelio seminífero no es constante en cada especie, teniendo una duración de aproximadamente 13 días para la rata, 8.65 días para el ratón, entre 10 y 11 días para los primates y alrededor de 16 días para los seres humanos (Hermo et al., 2010). III.4.2 Onda espermatogénica. Cuando se habla de la onda espermatogénica, se refiere a un concepto temporal, que hace referencia a la ocurrencia en el tiempo de todas las etapas del epitelio seminífero. En la rata se ha descrito que la primera onda espermatogénica tiene una duración de 50 a 60 días aproximadamente (Russell et. al., 1990; Adler, 1996). III.5 Meiosis. La meiosis es un proceso de división celular especializada que produce células haploides, llevando una sola copia de cada cromosoma. La primera división meiótica es la más estudiada debido a que tiene una profase I que dura varios días. Ésta se ha subdividido en cinco etapas: leptoteno, cigoteno, paquiteno, diploteno y diacinesis. Durante estas etapas la cromatina sufre una serie de cambios conformacionales, mismos que son muy importantes para un correcto alineamiento e intercambio del material genético entre los cromosomas homólogos (Hernández-Hernández et al., 2009; Zickler y Kleckner, 1998; Russell et. al., 1990). Muchos organismos que llevan a cabo reproducción sexual, forman una estructura DNA- proteica conocida como Complejo Sinaptonémico (CS), dicha estructura asegura el correcto alineamiento de los cromosomas homólogos y el proceso de recombinación (Kouznetsova et al., 2011), que contribuye a la diversidad genética (Schramm et al., 2011). 14 III.5.I Complejo Sinaptonémico. El Complejo Sinaptonémico (CS) fue descrito por primera vez por Moses (1956) y Fawcet (1956) como una estructura tripartita que se ensambla entre los cromosomas homólogos durante la profase de la primera división meiótica (Heyting, 1996). El complejo está constituido por dos elementos laterales (ELs), los cuales a su vez están formados por las proteínas del Complejo Sinaptonémico 2 y 3 (SYCP2 y SYCP3 por sus siglas en inglés, respectivamente) (Schücker et al., 2015). De forma paralela a los ELs se encuentra a la región central (RC), que está formada principalmente por la proteína del Complejo Sinaptonémico 1 (SYCP1 por sus siglas en inglés), constituyendo los filamentos transversos y uniéndose a SYCP3 por su dominio carboxilo terminal, mientras que su región amino terminal queda hacia la región central del CS (Schücker et al., 2015; Hernández-Hernández et al., 2009); otras proteínas que se conocen hasta el momento que constituyen al elemento central son: SYCE1, SYCE2, SYCE3, TEX12 y C14ORF39/SIX6OS1 (Fraune et al., 2012; Gómez- H et al., 2016). El CS al ser una estructura de ensamble para los cromosomas homólogos, se va configurando de manera paralela a los ejes cromosómicos, esto sucede de acuerdo a la etapa de la profase meiótica en la que se encuentren los espermatocitos, pudiéndose distinguir cada una de las etapas dentro de la profase meiótica, tomando en cuenta el grado de formación del complejo sinaptonémico (Hermo et al., 2010). Esto da la pauta para utilizar como marcadores a las proteínas del CS, con el fin de conocer específicamente en qué etapa de la profase meiótica I se encuentran las células germinales (Vallente et al., 2006). III.5.2 Profase meiótica I. A continuación se describe lo que ocurre en cada etapa de la profase meiótica I, haciendo especial énfasis en proteínas de interés para este trabajo de investigación. III.5.2.1 Leptoteno. En la etapa de leptoteno se inicia el ensamble del Complejo Sinaptonémico con la formación de los elementos axiales, que se convertirán posteriormente en elementos laterales. Durante este proceso se incorpora la proteína de Complejo Sinaptonémico 3 (SYCP3) a los ejes cromosómicos establecidos por componentes cohesinicos y de esta forma, los ejes de los cromosomas son individualizados como estructuras delgadas filamentosas (Zickler y Kleckner, 1998). En una inmunodetección de SYCP3 llevada a cabo en una célula en etapa de leptoteno, se puede observar a SYCP3 como segmentos lineales cortos, distribuidos en todo el 15 volumen nuclear del espermatocito, alineándose a lo largo del eje cromosómico de cada homólogo (Vallente et al., 2006) En leptoteno medio, la topoisomerasa Spo11 efectúa los dobles rompimientos de cadena, desencadenando el reclutamiento de diferentes proteínas para la reparación de dichos rompimientos (Longhese et al., 2009; Keeney et al., 1997), esto trae como consecuencia la fosforilación de la histona γH2AX, convirtiéndose en una variante de histona llamada γH2AX (Podhorecka et al., 2011). En una inmunodetección la histona modificada γH2AX se observa a manera de puntos en todo el volumen nuclear, se sabe que esta modificación en la histona sirve como marcaje o señal para las proteínas reparadoras y de recombinación meiótica (Fernandez-Capetillo et al., 2004). III.5.2.2 Cigoteno. Durante la etapa de cigoteno los elementos axiales del Complejo Sinaptonémico toman una apariencia de filamentos más gruesos, convirtiéndose en elementos laterales (EL) que se mantienen unidos mediante los filamentos transversos (FTs) formando la región central (RC). Los FTs son formados por la proteína SYCP1, en una inmunodetección de SYCP1 se observan una serie de filamentos que colocalizan con la proteína SYCP3, esto indica el inicio del apareamiento y sinapsis de los cromosomas homólogos (Yuan et al., 2000; Vallente et al., 2006). También es durante la etapa de cigoteno que los cromosomas se agrupan en un arreglo especial llamado Bouquet (Harper et al.,2004; Baarends y Grootegoed, 2003), en dicho arreglo los telómeros de los cromosomas se unen a la placa de adhesión (Zickler y Kleckner, 1998b), se ha propuesto que este arreglo sirve para que los cromosomas se encuentren más cercanos entre sí y de esa forma se aumenta la probabilidad de que cada cromosoma se encuentre con su homólogo (Harper et al., 2004). Por otro lado, en cigoteno tardío γH2AX llega a su máxima expresión marcando los dobles rompimientos de cadena (Vallente et al., 2006). En este punto la marca de γH2AX (que se ve en forma de puntos) se va restringiendo cada vez más a una región perinuclear (Baarends y Grootegoed, 2003). III.5.2.3 Paquiteno. En paquiteno el CS se ha terminado de ensamblar, por lo que SYCP3 junto con SYCP2, SYCP1 y las otras proteínas de la RC (mencionadas anteriormente) constituyen una estructura tripartita característica, en forma de cierre o escalera. En la inmunodetección de SYCP3, ésta se observa en forma de filamentos gruesos en todo el volumen nuclear, mientras que SYCP1 se muestra también como filamentos gruesos que colocalizan con la marca de SYCP3. La sinapsis se ve completada y la expresión de algunas proteínas disminuye, una de ellas es γH2AX (Vallente et al., 16 2006), misma que en su inmunodetección se ve restringida a los cromosomas sexuales, en lo que se ha denominado cuerpo XY (Baarends y Grootegoed, 2003; Blanco-Rodríguez, 2012). III.5.2.4 Diploteno. Los cromosomas homólogos continúan con una condensación gradual, misma que inició en la etapa de paquiteno (Hernández-Hernández et al., 2009). Es durante esta etapa que se comienza a desensamblar el CS, los cromosomas homólogos se separan, a excepción de los lugares en donde se encuentran los quiasmas (aquellos sitios en donde se llevó a cabo recombinación genética entre las cromátidas no hermanas (Alberts et al., 2015; Page y Hawley, 2004). En el caso de las hembras, durante esta etapa ocurre una detención del ciclo celular, denominada arresto o estado dictiado y puede durar unos cuantos meses o incluso años, esto depende del organismo en cuestión (Handel y Schimenti, 2010). III.5.2.5 Diacinesis. La diacinesis marca la última etapa de la profase meiótica I y también es la última etapa en la cual los cromosomas se descondensan, ya que al final de ésta la envoltura nuclear se disociará e iniciará la metafase meiótica I (Harper et al., 2004). IV. Justificación. La primera onda espermatogénica comienza en el momento en que los organismos nacen, sin embargo se sabe que en atapas juveniles de mamíferos las funciones sexuales aún no se encuentran bien establecidas, por ejemplo: la barrera hematotesticular en la rata, comienza a establecerse desde los 15 a 16 días postnatales y termina de formarse de los 18 a 21 días posnatales, coincidiendo con el tiempo en que las células de Sertoli cesan de dividirse. Por lo tanto, éste trabajo se enfoca en describir la dinámica de la profase meiótica I, con especial atención a algunos de los procesos más relevantes, como lo son la formación del complejo sinaptonémico, el cuerpo XY y la recombinación meiótica, durante la primera onda espermatogénica de ratas prepúberes. Dichos procesos son monitoreados por medio de inmunodetección fluorescente de las proteínas SYCP3, SYCP1 y γH2AX y así con datos moleculares aportar al conocimiento de la fisiología de las células meióticas. V. Hipótesis. La dinámica de las proteínas SYCP3, SYCP1 y γH2AX es similar en la profase meiótica I de la primera onda espermatogénica de ratas prepúberes que en su contraparte en ratas adultas. Cualquier alteración en su dinámica podría reflejar anomalías en los procesos de formación del Complejo Sinaptonémico, el cuerpo XY y la recombinación meiótica. 17 VI. Objetivos. VI.1 Objetivo general. Describir la distribución de las proteínas específicas del proceso meiótico, SYCP1, SYCP3 y γH2AX en espermatocitos primarios durante la primera onda espermatogénica en cordones seminíferos de ratas prepúberes y compararlas con su distribución en la onda espermatogénica de ratas adultas. VI.2 Objetivos particulares. Caracterizar el patrón de distribución de SYCP3, SYCP1 y γH2AX durante la profase meiótica I de la primera onda espermatogénica a los 13, 16, 27 y 38 días de edad. Comparar los patrones de distribución de SYCP3, SYCP1 y γH2AX durante la profase meiótica I de la primera onda espermatogénica de ratas prepúberes con su contraparte en ratas adultas. VII. Material y método. VII.1 Procesamiento histológico del material biológico. Se utilizaron tres ratas Wistar macho por cada una de las siguientes edades: 13, 16, 27 y 38 días de edad y tres ratas adultas como testigo; estas ratas fueron proporcionadas por el bioterio de la Facultad de Ciencias de la UNAM. Estas edades fueros escogidas de acuerdo de acuerdo a reportes donde se detalla la aparición de las células de la primera onda espermatogénica en rata (Adler, 1996). De esta forma en cada edad se detectará progresivamente las diferentes células de la profase meiótica de la primera onda espermatogénica bajo el siguiente esquema: 13 días: Leptotenos 16 días: Cigotenos 27 días: Paquitenos medios 38 días: Ya no hay células correspondientes a la primera onda espermatgénica Adultos: Profase meiótica I completa de “n” de ondas espermatogénicas. VII.1.1 Extracción de tejido. Para obtener los testículos de las ratas se procedió a anestesiar a los animales con éter en una cámara de gases, una vez anestesiadas se disecaron los testículos y se procedió a sacrificar al animal siguiendo los lineamientos éticos recomendados en la 18 guía para el cuidado y manejo de los animales de laboratorio (Guide Line for the Care and Use of Laboratory Animals, 1996). VII.1.2 Fijación. Las muestras de testículo se seccionaron en dos y se colocaron en una solución de paraformaldehído al 4% a 4°C o en fijador Histochoice (AMRESCO) a temperatura ambiente por 24 horas. VII.1.3 Deshidratación. Se deshidrataron las muestras de acuerdo al siguiente protocolo: Lavados en PBS durante 30 minutos realizando tres cambios de la solución cada 10 minutos, posteriormente se deshidrataron en alcoholes graduales, iniciando en alcohol al 30%, seguido de alcohol al 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y etanol absoluto, en este último se realizaron dos cambios. El tiempo que permanecieron en cada uno de ellos fue de 30 a 60 min. VII.1.4 Aclaramiento. El aclaramiento del material biológico se realizó empleando una solución de etanol absoluto-xilol 1:1 durante 60 min, después las muestras fueron transferidas a una mezcla de aceite de cedro-xilol 1:1 durante 60 min o hasta que la muestra estuviera completamente aclarada con una apariencia acaramelada. Por último se sumergieron en xilol durante cinco minutos con el propósito de eliminar los restos de aceite de cedro que puedan interferir con el proceso de infiltración del medio de inclusión. VII.1.5 Preinclusión. La infiltración de las muestras de testículo se realizó en una mezcla de parafina-xilol 1:1 durante una hora y en dos cambios de parafina pura durante una hora cada uno a 56ºC. VII.1.6 Inclusión. Una vez infiltradas las muestras se procedió a su inclusión en cubos de plástico a los cuales se les colocó la muestra biológica con la cara del corte hacia la base del cubo, la muestra previamente se pasó por la llama para derretir la parafina que pudiera quedar solidificada, posteriormente se le agregó al cubo de plástico parafina líquida, finalmente se esperó a que la parafina solidificara. 19 VII.2 Corte del material biológico. Se realizaron cortes histológicos de un espesor de 5μm aproximadamente, esto con ayuda de un microtomo de rotación marca Leica. Los cortes obtenidosfueron colocados en un baño de flotación que se mantuvo a 42°C, posteriormente fueron montados en portaobjetos cubiertos con el compuesto químico polianiónico Poli L- lisina, que por medio de cargas eléctricas entre la Poli-L-lisina (+) y el material biológico con carga negativa (-) ayuda a mantener adheridos los cortes al portaobjetos, para que en manipulaciones posteriores, tales como tinciones o inmunolocalizaciones, éstos no se desprendieran del portaobjetos. VII.2.1 Desparafinación e hidratación. Para poder realizar las tinciones generales o las inmunolocalizaciones, fue necesario retirar la parafina al material biológico y posteriormente se hidrató. Para ello, los portaobjetos con los cortes se colocaron 10 min en una estufa a 60ºC, después se sumergieron durante 10 min por los siguientes líquidos: xilol puro, etanol absoluto, etanol al 90%, etanol al 70%, etanol al 50%, etanol al 30% y finalmente agua bidestilada. VII.2.2 Tinción Hematoxilina y Eosina (H y E). Con el objetivo de evaluar la calidad del tejido obtenido, se realizaron tinciones generales con hematoxilina y eosina, este material de igual manera sirvió para ilustrar los diferentes estadios de la onda espermatogénica en los cuales se encontró marca. Una vez hidratado el tejido, se tiñó con hematoxilina de Harris 10 min, se lavó 10 min en agua corriente y se enjuagó con agua bidestilada. Después se deshidrató con etanol al 30% 3 min, seguido de etanol al 50% 3 min, etanol al 70% 3 min, eosina alcohólica 3 min. Posteriormente, se sumergieron momentáneamente en etanol al 80%, etanol 90% y etanol absoluto. Se continuó la deshidratación con xilol-etanol absoluto 1:1 durante 5 min, xilol 10 min y finalmente se montó con la ayuda de resina sintética y un cubreobjetos. VII.3 Inmunolocalizaciones. VII.3.1 Inmunolocalización para SYCP3. Para realizar la inmunolocalización, primero se desparafinaron e hidrataron los cortes, luego, se colocaron en amortiguador PBS (por sus siglas en inglés: Phosphate Buffered Saline) durante cinco minutos, pasado este tiempo se realizó la recuperación antigénica con amortiguador de citratos marca BioGenex (N° de catálogo HK080-9K) y con ayuda de un horno de microondas (Marca: Panasonic Modelo: System inside the genius 1300W) (tres minutos en potencia diez y seis minutos en potencia tres, en baño 20 de agua), se dejó enfriar por treinta minutos. Pasado este tiempo se procedió a realizar un bloqueo de las cargas electrostáticas producidas por los aldehídos del fijador, con glicina a una concentración de 0.1 M diluida en PBS a temperatura ambiente por una hora, esta manipulación se realizó con el propósito de reducir el ruido de fondo. Terminado el bloqueo, se procedió a colocar el anticuerpo primario anti SYCP3 de la marca Affinity BioReagents (anticuerpo policlonal hecho en cabra, N° de catálogo PA1-16766), el cual se diluyó en el amortiguador PBS a una concentración de 1/100 y se dejó incubar por una hora a temperatura ambiente en cámara húmeda. Una vez transcurrido el tiempo de incubación del anticuerpo primario, se lavaron las preparaciones con TBST (Tris-Borato-Sulfato-Tween) por cinco minutos y después con amortiguador PBS también por cinco minutos. Realizados los lavados, se procedió a colocar el anticuerpo secundario acoplado a FITC (Fitocormo C) marca Alexa Fluor (anticuerpo policlonal hecho en cabra, N° de catálogo F-2765) a una concentración de 1/200 diluido en PBS, se dejó incubar por dos horas a temperatura ambiente en cámara húmeda y protegido de la luz; posteriormente se colocaron durante cinco minutos en TBST y en PBS también por cinco minutos. Después de los lavados, se procedió a teñir las preparaciones con DAPI, lo que permite la observación del DNA; se incubó por un minuto. Finalmente, se lavó el material con PBS por cinco minutos y se montó la preparación con medio para preservar la fluorescencia de la marca VectaShield. VIII.3.2 Doble inmunolocalización para SYCP3 y SYCP1. Para realizar la inmunolocalización, se realizaron los mismos pasos que se llevaron a cabo en la inmunolocalización de SYCP3, sólo cambian los anticuerpos primarios y secundarios, en este caso se utilizaron: uno anti SYCP3 de la marca Abcam (anticuerpo policlonal hecho en cabra, N° de catálogo PA1-161766) y a la misma alícuota se le agregó el segundo anticuerpo primario anti SYCP1 de la marca Affinity BioReagents (anticuerpo policlonal hecho en conejo, N° de catálogo PA1-46254), la alícuolta se diluyó en el amortiguador PBS a una concentración de 1/100 y los anticuerpos secundarios que se usaron fueron: el primero acoplado a FITC de la marca Alexa Fluor (goat anti mouse, N° de catálogo A-11029) y el anticuerpo secundario acoplado a Rojo Texas de la marca Alexa Fluor (goat anti rabbit N° de catálogo 111-095-045) ambos anticuerpos diluidos en la misma alícuota a una concentración de 1/200 en PBS. VII.3.3 Doble inmunolocalización para SYCP3 y γH2AX. En esta inmunolocalización se siguieron los mismos pasos de la inmunolocalización anteriormente citada usando los siguientes anticuerpos: anticuerpos primarios, uno anti SYCP3 de la marca Pierce (anticuerpo policlonal hecho en conejo, N° de catálogo PA1-16766) y a la misma alícuota se le agregó el segundo anticuerpo primario anti γH2AX de la marca Millipore (anticuerpo monoclonal hecho en ratón, N° de catálogo 21 05-636), la alícuota se diluyó en el amortiguador PBS a una concentración de 1/200 y los anticuerpos secundarios, el primero acoplado a FITC de la marca Alexa Fluor hecho en conejo, N° de catálogo F-2765) y el anticuerpo secundario acoplado a Rojo Texas de la marca Alexa Fluor (hecho en cabra, N° de catálogo A11032) ambos anticuerpos diluidos en la misma alícuota a una concentración de 1/200 en PBS. VII.3.4 Obtención de imágenes y cuantificación. La observación de las inmunofluorescencias se llevó a cabo en un microscopio de epifluorescencia Nikon. La obtención de las imágenes se realizó con ayuda de la cámara Nikon Digital Camera DXM1200F con software Nikon ACT-1 y la edición de las imágenes se realizó con el software Adobe Photoshop CS5, con el cual se realizaron sobreposiciones de las diferentes imágenes obtenidas. Para realizar el conteo de células, con ayuda del microscopio de epifluorescencia se tomaron fotografías panorámicas en todo el corte con el objetivo de tener una guía de los túbulos contados y evitar contar el mismo túbulo dos veces, de manera que cada túbulo a contar se enumeró. Los túbulos a contar debían tener dos características: 1) tener marca para la proteína SYCP3 y 2) ser túbulos cortados de manera transversal, resultando en túbulos redondos. Una vez enumerados los túbulos se tomaron fotografías a túbulos seminíferos individuales. Una vez obtenidas las fotografías de los túbulos seminíferos, se procedió a realizar el conteo de células positivas con la ayuda del programa informático manejador de imágenes Image J. Los espermatocitos positivos a SYCP3 se dividieron en dos grupos únicamente, el primer conjunto con la marca tipo 1, en este conjunto se agruparon aquellos espermatocitos con el patrón de distribución de SYCP3 en forma de Cúmulo Perinuclear de SYCP3 (CPN-SYCP3), mientras que el segundo conjunto, con la marca tipo 2, se compone de los espermatocitos que presentaron una distribución de SYCP3 igual a lo que se ha reportado en individuos adultos. Se contaron 40 túbulos de cada rata y tres ratas por edad muestreada, dando un total de 120 túbulos por edad (ver tabla 1). Tabla 1. Número de túbulos muestreados por edad y por rata. Rata 13 días 16 días 27 días 38 días Adultos 1 40 40 40 40 40 2 40 40 40 40 40 3 40 40 40 40 40 Total 120 120 120 120 120 Posteriormente, con base en el conteo anterior se realizó una tabla obteniendo el porcentaje de túbulos yde meiocitos dentro de estos túbulos con cada una de las distribuciones de SYCP3 (en forma de filamentos y en forma de CPN-SYCP3) de acuerdo a la edad del individuo (ver tabla 2). Estos porcentajes se obtuvieron sumando el número de túbulos o meiocitos marcados (dependiendo el caso), 22 dividiendo este número entre el total de túbulos o meiocitos con señal de SYCP3 en forma de CPN-SYCP3 y el resultado se multiplicó por cien (ver fórmulas 1: porcentaje de túbulos y 2: porcentaje de meiocitos) Formulas: 1) Obtención de porcentaje de túbulos con los distintos patrones de SYCP3 (con el patrón normal y con el patrón en forma de CPN y 2) Obtención del porcentaje de meiocitos con los distintos patrones de distribución de SYCP3. ( ) ( ) Tabla 2. Porcentaje de túbulos con marca de ambos patrones de distribución de SYCP3 de acuerdo a la edad del individuo. Edad en días Porcentaje de túbulos con SYCP3 normal durante la 1ª onda espermatogénica Porcentaje de túbulos con SYCP3 en forma de CPN durante la 1ª onda espermatogénica Rango de meiocitos I en la primera onda con SYCP3 en forma de CPN Porcentaje de meiocitos de la primera onda espermatogénica con SYCP3 en forma de CPN Adulto 100 0 0 0 13 84 16 3-35 Leptoteno 4.67 16 18 82 63-93 Cigoteno 20.67 27 70 30 3-78 Paquiteno 9.73 38 66 34 30-35 Paquiteno 2.40 Por último se graficó el porcentaje de túbulos y meiocitos con la distribución en forma de CPN-SYCP3, de acuerdo a la etapa de la profase meiótica I en la que se encontraban (ver Gráfica 1). 23 Gráfica 1: Gráfica del porcentaje de túbulos con SYCP3 en forma de CPN y el número de meiocitos con SYCP3 en forma de CPN de acuerdo a la etapa de la profase meiótica en la que se encuentran. VIII. Resultados. El estudio de cuarenta túbulos o cordones seminíferos, según el caso, de cada rata (tres por edad) (ver tabla 1), se realizó para morfología con Hematoxilina y Eosina (H y E) y las inmunolocalizaciones para SYCP3, SYCP1 y γH2AX. Con H y E se identificaron las células en las distintas etapas de la profase meiótica I en todas las edades y se compararon con los adultos (ver figuras: 1, 8, 11, 15 y 19), sirviéndonos de base para la correcta localización de los distintos tipos celulares. En las observaciones de las inmunolocalizaciones de SYCP1 el patrón de marca es similar en todos los casos de organismos prepúberes y en los adultos (ver figuras: 3, 4, 13, 17 y 21). La marca de γH2AX presenta un patrón sin diferencia entre las células provenientes de organismos prepúberes y los adultos (ver figuras: 5, 6, 7, 10, 14, 18 y 22). En cuanto a SYCP3, se encontraron marcas peculiares en todas las edades estudiadas, mismas que se denominaron Cúmulos Perinucleares de SYCP3 (CPN-SYCP3), en todos los espermatocitos de las distintas etapas de la profase meiótica I, siendo en cigoteno más frecuentes y menos frecuentes en etapa de leptoteno (ver Tabla 2). Dichos cúmulos no se observaron en las células correspondientes en organismos adultos (ver figuras: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 20, 21 y 22). Las dobles inmunolocalizaciones se realizaron con el fin de asegurar la etapa en la que se encontraba el espermatocito, dado que algunas células solo presentaban Cúmulos Perinucleares y se dificultaba la identificación celular, además la inmunolocalización de γH2AX nos permite evaluar indirectamente el proceso de recombinación. 0 15 30 45 60 75 90 P o rc e n ta je d e t ú b u lo s y m e io ci to s e n fo rm a d e C P N -S Y C P 3 Etapa de la profase meiótica I Distribución en forma de CPN-SYCP3 durante la profase meiótica I. Porcentaje de meiocitos con SYCP3 en forma de CPN durante la 1ª onda espermatogénica Porcentaje de túbulos con SYCP3 en forma de CPN durante la 1ª onda espermatogénica 24 Se muestran los resultados de los organismos adultos, con el objeto de que éstos sean tomados como referencia de la distribución normal de las diferentes proteínas inmunodetectadas y posteriormente, hacer una comparación entre el organismo adulto y los individuos prepúberes. VIII.1 Observaciones en los túbulos seminíferos de ratas adultas. VIII.1.1 Morfología del túbulo seminífero de organismos adultos. El epitelio seminífero de los túbulos muestra características típicas de un organismo adulto, se pueden observar los distintos estratos celulares, desde la membrana basal, la cual está integrada principalmente por células de Sertoli y espermatogonias, un estrato con espermatocitos primarios y por último, más hacia la luz del túbulo seminífero, espermátidas elongadas (ver Figura 1). VIII.1.2 Distribución de SYCP3 y SYCP1 durante la profase meiótica I en ratas adultas. VIII.1.2.1 Leptoteno. Durante la etapa de leptoteno la proteína SYCP3 se observa esbozando filamentos finos en todo el área del núcleo, mientras que la proteína SYCP1 aún no se expresa en esta etapa de la profase meiótica I (ver Figura 2). VIII.1.2.2 Cigoteno. En la etapa de cigoteno SYCP3 se observa como filamentos delgados, marcando los ejes cromosómicos, por otro lado la marca de SYCP1 colocaliza con algunos de los filamentos de SYCP3, lo cual indica el inicio de la sinapsis entre los cromosomas homólogos (ver Figura 3). VIII.1.2.3 Paquiteno. En células en etapa de paquiteno los filamentos delgados que SYCP3 mostraba durante cigoteno se engrosan y el tamaño del espermatocito aumenta (comparar Figura 3 con Figura 4), en esta etapa SYCP1 colocaliza en toda la extensión del eje cromosómico con la señal de SYCP3 (ver Figura 4), indicando una sinapsis completa de los cromosomas homólogos. 25 Figura 1. Tinción de Hematoxilina y Eosina en un corte de testículo de rata adulta, se observa la luz del túbulo seminífero (L), espermátidas elongadas (Ee), espermatogonias (Eg), células de Sertoli (S) y células peritubulares (Pe). La barra representa 10µm. Figura 2. Inmunodetección de SYCP3 (en verde) en cortes de testículo de rata adulta. A. SYCP3 marca espermatocitos en etapa de leptoteno (L) y de paquiteno (P). B. Sobreposición de la imagen A con tinción con DAPI, en donde se muestran espermatocitos en etapa de leptoteno (L) y de paquiteno (P) además del núcleo de células peritubulares (Pe) y espermátidas elongadas (Ee). La barra representa 10µm. 26 Figura 3. Inmunodetección doble de SYCP3 (en verde) con SYCP1 (en rojo) en cortes de testículo de rata adulta. A. Inmunodetección de SYCP3 evidenciando la presencia de espermatocitos en etapa de cigoteno (C) B. Inmunodetección de SYCP1 donde se observan los mismos espermatocitos en cigoteno (C) marcando SYCP1 en rojo en pequeños segmentos. C. Sobreposición de SYCP3 (verde) y SYCP1 (en rojo) se observa la colocalización de ambas proteínas en los espermatocitos, marcando esta colocalización en tonos amarillos. D. Sobreposición de una imagen de tinción con DAPI con las imágenes de SYCP3 y de SYCP1, en donde se muestra el núcleo de todas las célula presentes, entre ellas células de Sertoli (S), células peritubulares (Pe) y los mismos espermatocitos en etapa de cigoteno (C). La barra representa 10µm. 27 Figura 4. Inmunodetección doble de SYCP3 (en verde) con SYCP1 (en rojo) en cortes de testículo de rata adulta. A. SYCP3 muestra la presencia de espermatocitos en etapa de paquiteno (P), B. SYCP1 marcandolos mismos espermatocitos en la figura A, en etapa de paquiteno (P), C. Se ve la colocalización de ambas proteínas (SYCP3 y SYCP1) en color amarillo en donde se localizan los ejes cromosómicos, marcando espermatocitos en etapa de paquiteno (P), D. Sobreposición de la imagen C con tinción con DAPI, que además de los espermatocitos en paquiteno (P) ya mencionados, también muestra el núcleo de todas las células, entre ellas células peritubulares y espermátidas elongadas (Ee). La barra representa 10µm. VIII.1.3 Distribución de γH2AX durante la profase meiótica I en organismos adultos. VIII.1.3.1 Leptoteno. Durante la etapa de leptoteno γH2AX se observa a manera de puntos en toda el área del núcleo, como típicamente se describe en el adulto (Lagarrigue et al., 2011; Leblond y Clermont, 1952). Esta distribución es característica e indica el inicio de los rompimientos programados de la doble cadena de DNA (Fernandez-Capetillo et al., 2004) (ver Figura 5). IX.1.3.2 Cigoteno. En el estadío de cigoteno la señal de γH2AX disminuye y se presenta a manera de puntos, indicando la reparación de los rompimientos de la doble cadena de DNA. Al mismo tiempo una señal focalizada de γH2AX se empieza a apreciar hacia una región perinuclear, lo cual representa el inicio de la formación del cuerpo XY (ver Figura 6). IX.1.3.3 Paquiteno. En esta etapa, la señal de γH2AX desaparece del volumen nuclear y se restringe a una región bien definida del núcleo. En esta etapa los rompimientos de doble cadena del DNA han sido reparados en su totalidad, por lo que la señal de γH2AX es observable sólo en una región perinuclear que está marcando el cuerpo de heterocromatina, correspondiente al cuerpo XY (ver Figura 7). 29 Figura 5. Inmunodetección doble de SYCP3 (en rojo) con γH2AX (en verde) en cortes de testículo de rata adulta. A. SYCP3 muestra la presencia de espermatocitos en etapa de leptoteno (L) y paquiteno (P), B. γH2AX marcando los mismos espermatocitos que en la figura A, en etapa de leptoteno (L) y paquiteno (P), con la diferencia que esta marca evidencia los rompimientos de doble cadena en forma de puntos y en los espermatocitos en etapa de paquiteno (P) se observa el cuerpo XY (cabezas de flecha), C. Se ve la localización de ambas proteínas (SYCP3 y γH2AX) en donde se observan los espermatocitos en etapa de leptoteno (L) y paquiteno (P), en estos últimos se puede observar la presencia del cuerpo XY (cabezas de flecha), D. Sobreposición de la imagen C con tinción con DAPI, que además de los espermatocitos en leptoteno (L) y paquiteno (P) ya mencionados, muestra el núcleo de todas las células, entre ellas las espermátidas elongadas (Ee). La barra representa 10µm. 30 Figura 6. Inmunodetección doble de SYCP3 (en rojo) con γH2AX (en verde) en cortes de testículo de rata adulta. A. SYCP3 muestra la presencia de espermatocitos en etapa de cigoteno (C), B. γH2AX marcando los mismos espermatocitos que en la figura A, en etapa de cigoteno (C), con la diferencia que esta marca evidencia los rompimientos de doble cadena en forma de puntos, nótese que estos puntos se van restringiendo hacia una región del núcleo, C. Se ve la localización de ambas proteínas (SYCP3 y γH2AX) en donde se observa en los espermatocitos en cigoteno (C), D. Sobreposición de la imagen C con tinción con DAPI, que además de los espermatocitos en etapa de cigoteno (C) mencionados anteriormente, también muestra el núcleo de todas las demás células. La barra representa 10µm. 31 Figura 7. Inmunodetección doble de SYCP3 (en verde) con γH2AX (en rojo) en cortes de testículo de rata adulta. A. SYCP3 muestra la presencia de espermatocitos en etapa de paquiteno (P), B. γH2AX marcando los mismos espermatocitos que en la figura A, en etapa de paquiteno (P), con la diferencia que esta marca evidencia el cuerpo XY en una región del núcleo (cabezas de flecha), C. Sobreposición de la imagen B con la C, en donde se observa la localización de ambas proteínas (SYCP3 y γH2AX) en los espermatocitos en etapa de paquiteno (P) y la localización del cuerpo XY (cabezas de flecha), D. Sobreposición de la imagen C con tinción con DAPI, que además de los espermatocitos en etapa de paquiteno (P) mencionados anteriormente, también muestra el núcleo de todas las demás células, entre ellas células peritubulares (Pe) y células de Sertoli (S). La barra representa 10µm. 32 VIII.2 Observaciones en los túbulos seminíferos de ratas prepúberes. VIII.2.1 13 días de edad. VIII.2.1 .1 Morfología del túbulo seminífero de ratas de 13 días de edad. Se pueden observar diferencias en el epitelio seminífero de los organismos prepúberes de acuerdo a su edad, ya que van apareciendo distintos tipos celulares y sumándose estratos al epitelio del túbulo seminífero dependiendo de la edad del organismo en cuestión. En este caso, a los trece días de edad, los túbulos seminíferos tienen una luz muy reducida, el epitelio germinativo consta únicamente de tres estratos y está constituido principalmente por células de Sertoli, espermatogonias y posiblemente espermatocitos primarios (ver Figura 8). VIII.2.1.2 Distribución de SYCP3 y SYCP1 durante la etapa de leptoteno en ratas de 13 días de edad. Mediante el patrón de distribución de la inmunodetección de SYCP3, a esta edad solamente se detectó la presencia de espermatocitos primarios en etapa de leptoteno (ver Figura 9). VIII.2.1.2.1 Leptoteno. Los espermatocitos en etapa de leptoteno que se presentan en esta edad, muestran una marca para SYCP3 que comienza a esbozar ejes (ver Figura 9). Adicionalmente encontramos un patrón de distribución de SYCP3 en forma de Cúmulo Perinuclear en el 16% de los túbulos seminíferos analizados (ver Tabla 2), misma que no es típica en esta etapa en organismos adultos (cabezas de flecha y aumentos en figura 9 y cabezas de flecha en figura 10, y Tabla 2). Dentro de los túbulos afectados el 4.67% de los leptotenos presentan esta marca atípica de SYCP3. Mientras que en los organismos adultos no encontramos ningún túbulo seminífero que contenga leptotenos con este tipo de distribución de SYCP3 en forma de Cúmulo Perinuclear (ver Figuras 9 y 10 y Tabla 2). VIII.2.1.3 Distribución de γH2AX en ratas de 13 días de edad. La señal de γH2AX se presenta de manera habitual en células en etapas de leptoteno, marcando los rompimientos de doble cadena de ADN. No se observa una alteración de la distribución de este marcador en células ya sea con marca normal de SYCP3 o con marca en forma de CPN-SYCP3 (ver Figura 10). 33 Figura 8. Tinción de Hematoxilina y Eosina a un corte de túbulo seminífero de una rata de 13 días de edad, en la que se observa un epitelio conformado por tres estratos, con presencia de espermatogonias (Eg) y células de Sertoli (S), principalmente rodeado por células peritubulares (Pe) con forma alargada y una luz muy estrecha al centro del túbulo seminífero (L). La barra representa 10μm. Figura 9. Inmunodetección de SYCP3 (en verde) en cortes de testículo de rata de 13 días de edad, A. Muestra con una marca de filamentos delgados en espermatocitos en etapa de leptoteno (L); . B. Sobreposición de la imagen A con DAPI (en azul) que además de mostrar los espermatocitos en leptoteno (L), se observan los núcleos de células de Sertoli (S) y de células peritubulares (Pe). Adicionalmente en la parte inferior derecha de cada imagen se encuentra un aumento de los espermatocitos con marca en forma de CPN-SYCP3, evidenciando esta marca. La barra representa 10μm. 34 Figura 10. Inmunodetección doblede SYCP3 (en verde) y γH2AX (en rojo) en cortes de testículo de rata de 13 días de edad. A. Se observa SYCP3 en forma de CPN-SYCP3 en los espermatocitos (cabezas de flecha). B. γH2AX en forma de puntos en todo el núcleo de los espermatocitos (cabezas de flecha). C. Empalme de las imágenes A y B, en donde se puede observar la colocalización dentro del núcleo de ambas proteínas (SYCP3 y γH2AX). D. Sobreposición de las imágenes A y B con la imagen de tinción con DAPI que muestra la localización de los núcleos de los espermatocitos y células peritubulares (Pe). La barra representa 10μm. 35 VIII.2.2 16 días de edad. VIII.2.2.1 Morfología del túbulo seminífero de ratas de 16 días de edad. El epitelio de los túbulos seminíferos y la luz de los mismos incrementó notablemente su tamaño en comparación con el epitelio de los túbulos de 13 días de edad (comparar figura 8 con figura 11), se observan espermatocitos primarios, los cuales se pueden reconocer por sus características morfológicas (tamaño y arreglo de la cromatina) y a esta edad se encuentran espermatocitos en etapa de cigoteno (ver Figura 12). VIII.2.2.2 Distribución de SYCP3 y SYCP1 durante la etapa de cigoteno en ratas de 16 días de edad. A esta edad ha avanzado el proceso meiótico siguiendo la cinética de la primera onda espermatogénica (Rusell et al., 1990), por lo que se observan espermatocitos primarios en etapa de cigoteno (ver Figura 12). Se puede notar un incremento en el número de espermatocitos primarios marcados con SYCP3 (ver Tabla 2), en los cuales SYCP1 se aprecia por primera vez corroborando la presencia de células en estadío de cigoteno (ver Figura 13). VIII.2.2.2.1 Cigoteno. Además de la distribución clásica de SYCP3 en cigotenos, se observa en forma de CPN- SYCP3 en el 82% de los túbulos seminíferos analizados en esta edad (cabezas de flecha en Figura 13 y Tabla 2). Dentro de los túbulos afectados se encuentran hasta un 20.67% de cigotenos con esta marca atípica de SYCP3. Mientras que en organismos adultos no se evidencia ningún túbulo seminífero con cigotenos con este tipo de distribución en forma de CPN-SYCP3 (ver Tabla 2). Por el contrario, la inmunodetección de SYCP1 es similar a la que se observa en un organismo adulto (comparar figura 13 con figura 9). VIII.2.2.3 Distribución de γH2AX durante la etapa de cigoteno en ratas de 16 días de edad. Durante la etapa de cigoteno γH2AX se va restringiendo cada vez más hacia el cuerpo XY, observándose en forma de puntos que asemejan cada vez más un cúmulo, aunque SYCP3 se presenta en forma de Cúmulo Perinuclear (CPN-SYCP3), γH2AX se distribuye de manera similar a la que se presenta en los organismos adultos (comparar figura 6 con figura 14). 36 Figura 11. Tinción de Hematoxilina y Eosina de un túbulo de testículo de rata de 16 días de edad, en donde se observa un epitelio estratificado conformado por tres a cuatro capas de células, en la capa basal se presentan células de Sertoli (S) y avanzando en las capas superiores se encuentran espermatogonias tipo A y tipo B, además de espermatocitos en diferentes etapas de la profase meiótica I. También se muestran células en mitosis (M), células peritubulares rodeando el túbulo seminífero (P) y la luz del túbulo al centro (L). La barra representa 10µm. Figura 12. Inmunodetección de SYCP3 en cortes de testículo de rata de 16 días de edad. A. Inmunodetección de SYCP3 (en verde) en la que se observan espermatocitos en etapa de preleptoteno (PL) y cigoteno (C), también es posible observar la marca hacia la periferia del núcleo en forma de media luna (cabezas de flecha) B. Sobreposición de una imagen de la inmunodetección de SYCP3 (en verde) y tinción con DAPI (en azul), en donde se observan espermatocitos en etapa de preleptoteno (PL) y cigoteno (C), como en la imagen A, también se presentan espermatocitos con una marca hacia la periferia de su núcleo en forma de CPN- SYCP3 (cabezas de flecha). Hacia la periferia del túbulo seminífero, se muestran los núcleos de algunas células de Sertoli (S), así como los núcleos de células peritubulares (Pe). La barra representa 10µm. 37 Figura 13. Inmunodetección doble de SYCP3 (en verde) y SYCP1 (en rojo) en cortes de testículo de rata de 16 días de edad. A. Se observa SYCP3 en forma de CPN-SYCP3 (cabezas de flecha) en espermatocitos que se encuentran la etapa de cigoteno (C) además de los espermatocitos que presentan a SYCP3 en forma de puntos en todo el núcleo. B. SYCP1 en forma de puntos en todo el núcleo de los espermatocitos en cigoteno (C). C. Sobreposición de las imágenes A y B, en donde se puede observar la colocalización dentro del núcleo de ambas proteínas (SYCP3 y SYCP1). D. Empalme de las imágenes A y B con la imagen de tinción con DAPI que muestra la localización de los núcleos de los espermatocitos y de todas las demás células, entre ellas las células peritubulares (Pe). La barra representa 10μm. 38 Figura 14. Inmunolocalización doble de SYCP3 (en verde) y γH2AX (en rojo) en cortes de testículo de rata de 16 días de edad. A. Muestra la marca en forma de CPN-SYCP3 en los espermatocitos (cabezas de flecha). B. γH2AX marcando los rompimientos de doble cadena de DNA dentro del núcleo de los espermatocitos, se observan a manera de puntos en todo el volumen nuclear y se restringen hacia la zona del cuerpo XY (flecha). C. Empalme de las imágenes A y B en donde se observa la colocalización de SYCP3 y γH2AX, mostrando que a pesar de la presencia de SYCP3 en forma de CPN (cabezas de flecha), γH2AX marca los rompimientos de DNA al igual que en los organismos adultos, restringiéndose al cuerpo XY (flecha). D. Sobreposición de la imagen C con la tinción con DAPI que además de lo ya mencionado, muestra la localización de los núcleos de células peritubulares (Pe) y de las células de Sertoli. La barra representa 10µm. 39 VIII.2.3 27 días de edad. VIII.2.3 .1 Morfología del túbulo seminífero en ratas de 27 días de edad. Se observa un incremento notable en el número de células que forman parte de los estratos del epitelio germinativo (Figura 15), se nota por primera vez la presencia de espermatocitos en etapa de paquiteno (Figuras 15 y 16). VIII.2.3.2 Distribución de SYCP3 y SYCP1 durante la etapa de paquiteno en ratas de 27 días de edad. A esta edad continúa observándose la presencia de células con el patrón en forma de CPN-SYCP3 evidenciado en las edades anteriores (ver Figuras 16 y 17) en espermatocitos primarios además presentan una distribución a manera de puntos de SYCP3 en todo el núcleo, los cuales colocalizan con puntos que marca SYCP1 en espermatocitos primarios (ver Figura 17). También se detecta el patrón de distribución clásica de SYCP3 evidenciando células en paquiteno. VIII.2.3.2.1 Paquiteno. Es evidente por la marca de SYCP3, que a esta edad existen espermatocitos primarios en etapa de paquiteno ya que SYCP3 se presenta en forma de filamentos colocalizando con la marca de SYCP1 (ver Figura 16 y Figura 17). También se encontró que un 30% de los túbulos seminíferos presentan la distribución en forma de CPN-SYCP3. Dentro de estos túbulos el 9.73% de los paquitenos de la primera onda espermatogénica contienen a SYCP3 y SYCP1 colocalizando en forma de filamentos (como en paquitenos de adulto) más la distribución en forma de CPN-SYCP3 en el mismo núcleo (ver Figura 17). VIII.2.3.3 Distribución de γH2AX durante la etapa paquiteno en ratas de 27 días de edad. A los 27 días de edad γH2AX se muestra una distribución como la encontrada en organismos adultos, marcando el cuerpo XY en espermatocitos en etapa de paquiteno (ver Figura 18). 40Figura 15. Tinción de Hematoxilina y Eosina cortes de testículo de rata de 27 días de edad que muestra la presencia de espermatocitos en etapa de paquiteno (P) así como espermatogonias (G), así como núcleos de células de Sertoli (S) y de células peritubulares (Pe). La barra representa 10µm. Figura 16 A. Inmunodetección de SYCP3 en cortes de testículo de rata de 27 días de edad. A. Se muestra una distribución en forma de CPN-SYCP3 en los espermatocitos (cabezas de flecha) y espermatocitos en etapa de paquiteno (P). B. Sobreposición de la imagen A y la tinción con DAPI, la cual además muestra núcleos de células de Sertoli (S) y de células peritubulares (Pe). La barra representa 10µm. 41 Figura 17. Inmunodetección doble de SYCP3 (en verde) con SYCP1 (en rojo) en cortes de testículo de rata de 27 días de edad. A. Se muestra una distribución en forma de CPN-SYCP3 en el núcleo de algunos espermatocitos (cabezas de flecha), además de presentar un patrón punteado en todo el núcleo marcando espermatocitos en etapa de leptoteno (L). B. Imagen de la inmunodetección de SYCP1 mostrando una señal a manera de puntos en todo el núcleo marcando espermatocitos en etapa de leptoteno (L), C. Empalme de las imágenes A y B en donde se puede observar los puntos en donde ambas proteínas colocalizan, marcándose con un color amarillo, mostrando así la presencia de espermatocitos en estado de leptoteno (L), es notorio que aquellos espermatocitos con la marca en forma de CPN-SYCP3 y puntos marcando todo el volumen nuclear, también muestran la presencia de la proteína SYCP1 (amarillo), D. Sobreposición de una imagen de la colocalización de SYCP3 (en verde) y SYCP1 (en rojo) junto con la tinción con DAPI (en azul), la cual además de lo descrito arriba muestra la ubicación del núcleo de cada célula, entre ellas los núcleos de células peritubulares (Pe) y de células de Sertoli. La barra representa 10µm. 42 Figura 18. Inmunodetección doble de SYCP3 (en verde) con γH2AX (en rojo) en cortes de testículo de rata de 27 días de edad A. Se muestra una distribución en forma de CPN-SYCP3 (en verde) (cabezas de flecha), así como filamentos en todo el volumen nuclear. B. γH2AX marcando los rompimientos de doble cadena de DNA, marcando el cuerpo XY (flechas), C. Sobreposición de una imagen de SYCP3 y γH2AX, en donde se puede observar la localización de ambas proteínas. D. Sobreposición de la imagen C con una imagen de la tinción con DAPI (en azul), la cual además de lo descrito arriba muestra la ubicación del núcleo de cada célula, entre ellas los núcleos de las células de Sertoli (S). La barra representa 10µm. 43 VIII.2.4 38 días de edad. VIII.2.4.1 Morfología del túbulo seminífero de ratas de 38 días de edad. A los 38 días de edad se muestran espermatocitos primarios y se observan espermátidas elongadas hacia el centro del túbulo seminífero. Se puede decir que a esta edad el epitelio seminífero se asemeja mucho al epitelio seminífero presentado por un organismo adulto (ver Figura 19). Es importante señalar que todos los espermatocitos primarios presentes en esta edad ya no corresponden a la primera onda espermatogénica. VIII.2.4.2 Distribución de SYCP3 y SYCP1 durante la etapa de paquiteno en ratas de 38 días de edad. A pesar de que los espermatocitos primarios observados en esta edad ya no corresponden a células de la primera onda espermatogénica, aún se observa a SYCP3 con distribución de CPN-SYCP3 (ver Figura 21). Se nota que el 34% de los túbulos contienen espermatocitos con este patrón. Sorpresivamente el 2.4 % de los paquitenos contienen esta distribución de SYCP3, aun cuando SYCP1 se encuentra presente en el núcleo de espermatocitos en etapa paquiteno (ver Figura 21). Sin embargo, estos porcentajes de paquitenos (con SYCP3 en forma CPN) son mucho menores que los porcentajes de paquitenos de la primera onda espermatogénica con esta distribución (2.4% versus 9.73% respectivamente, ver Tabla 2). VIII.2.4.3 Distribución de γH2AX durante la etapa de paquiteno en ratas de 38 días de edad. En la inmunodetección doble de SYCP3 con γH2AX se observa a SYCP3 en forma de CPN, sin embargo γH2AX se presenta de manera similar a la que se presenta en los organismos adultos, en este caso la encontramos en espermatocitos en etapa de paquiteno marcando el cuerpo XY (ver Figura 22). 44 Figura 19. Tinción de hematoxilina y eosina en un corte de testículo de rata de 38 días de edad, se puede observar la luz del túbulo seminífero (L) y se muestran espermátidas elongadas (Ee) además de células peritubulares (Pe) y núcleos de células de Sertoli. La barra representa 10µm. Figura 20. Inmunodetección de SYCP3 (en verde) en cortes de testículo de rata de 38 días de edad, A. Se observan espermatocitos en etapa de cigoteno (C) B. Sobreposición de la imagen A con la de tinción con DAPI, en donde se muestra el núcleo de espermatocitos en etapa de cigoteno (C) y núcleos de células peritubulares (Pe) y de células de Sertoli. La barra representa 10µm. 45 Figura 21. Inmunodetección doble de SYCP3 (en verde) con SYCP3 (en rojo) en cortes de testículo de rata de 38 días de edad, A. SYCP3 se presenta en forma de filamentos marcando espermatocitos en etapa de paquiteno (P), también muestra espermatocitos en etapa de leptoteno que además de presentar la marca punteada característica de esta etapa, expresan una distribución en forma de CPN (cabezas de flecha). B. SYCP1 se presenta en forma de filamentos marcando espermatocitos en etapa de paquiteno (P) y en forma de puntos en los espermatocitos en etapa de leptoteno, C. Sobreposición de las imágenes A y B mostrando la colocalización de ambas proteínas (en amarillo), nótese que los espermatocitos con la marca en forma de CPN-SYCP3 (cabezas de flecha) y en forma de puntos, también presentan una distribución en forma de puntos de SYCP1, D. Sobreposición de la imagen C con una tinción con DAPI mostrando los núcleos de todas las células, entre ellas las células peritubulares (Pe) y los espermatocitos en etapa de paquiteno (P). La barra representa 10µm. 46 Figura 22. Inmunodetección doble de SYCP3 (en rojo) con γH2AX (en verde) en cortes de testículo de rata de 38 días de edad. A. SYCP3 presenta dos patrones de distribució, uno en el que se observa en una forma punteada dentro del núcleo de los espermatocitos y la segunda a manera de CPN (cabezas de flecha), B. γH2AX marcando los rompimientos de doble cadena localizados en el cuerpo XY (flechas) marcando espermatocitos en etapa de paquiteno. C. Sobreposición de las imágenes A y B en donde se observa cómo en aquellos espermatocitos con SYCP3 a en forma de CPN (cabezas de flecha), muestran también a γH2AX marcando el cuerpo XY (flechas), D. Se observa de manera conjunta lo observado en las imágenes A, B y C, con la tinción de DAPI, que permite evidenciar la cromatina de las células, además de la presencia de espermátidas elongadas (Ee) y de células peritubulares. La barra representa 10µm. 47 IX. Discusión. Se ha descrito que SYCP3 aparece por primera vez en etapa de leptoteno formando parte de los elementos axiales (AE) del CS y mostrándose a manera de filamentos delgados (Yuan et al., 2000; Schramm et al., 2011). Es también durante esta etapa que se producen los rompimientos de doble cadena de la molécula del DNA y en respuesta la variante de histona H2AX es fosforilada (γH2AX); esta modificación se mantiene desde leptoteno hasta cigoteno en los cromosomas autosómicos, mientras que en la etapa