Efecto-de-la-administracion-del-acido-3-nitropropionico-sobre-la-activacion-de-cascadas-de-muerte-neuronal-apoptotica-via-estres-de-retculo-endoplasmico-en-cuerpo-estriado-de-ratas

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN DEL 
ÁCIDO 3-NITROPROPIÓNICO SOBRE LA 
ACTIVACIÓN DE CASCADAS DE MUERTE 
NEURONAL APOPTÓTICA, VIA ESTRÉS 
DE RETÍCULO ENDOPLÁSMICO, EN 
CUERPO ESTRIADO DE RATAS. 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA 
P R E S E N T A 
ANDREA VITE GARCÍA 
MÉXICO, D.F. 2011 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesor: PERLA CAROLINA CASTAÑEDA LÓPEZ 
VOCAL: Profesor: EUCLIDES AVILA CHÁVEZ 
SECRETARIO: Profesor: ANA ERIKA RODRÍGUEZ MARTÍNEZ 
1er. SUPLENTE: Profesor: MARIA ELENA BRAVO GÓMEZ 
2do. SUPLENTE: Profesor: PERLA DEYANIRA MALDONADO JIMÉNEZ 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: LABORATORIO DE ESTRÉS 
OXIDATIVO Y PLASTICIDAD CEREBRAL, DEPTO. DE FISIOLOGÍA 
FACULTAD DE MEDICINA, UNAM 
 
 
ASESOR DEL TEMA: DRA. ANA ERIKA RODRÍGUEZ MARTÍNEZ 
 
 
 
SUSTENTANTE: ANDREA VITE GARCÍA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A mi mamá, tu esfuerzo, tu amor y tu apoyo 
es lo que me ha llevado tan lejos. 
No pude haber tenido una 
bendición más grande 
que el ser tu hija. 
 
 
A mi hermana Claudia, porque al final del 
día la única persona que realmente 
me puede entender eres tú. 
 Te amo tanto. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS: 
A mi alma máter la Facultad de Química y a la Universidad Nacional por haberme 
brindado una excelente educación, prometo hacer honor a su nombre. 
 
A la Dra. Erika Rodríguez, sin cuyo esfuerzo y trabajo este proyecto jamás se 
hubiera visto finalizado. Gracias por todo tu apoyo y tu amistad. 
 
A la Dra. Selva Rivas, César, Gabino y Alfredo gracias por su ayuda en la 
elaboración de este proyecto. 
 
A la Dra. Perla Castañeda y el Dr. Euclides Ávila por su ayuda en la revisión del 
trabajo escrito así como por sus consejos y recomendaciones para hacerlo un 
trabajo de mejor calidad. 
 
A la DGAPA IN219511-3 S-R. A. por su apoyo para la elaboración de este 
proyecto. 
 
A mis amigos de la Facultad, Lulú, Diana, Iván, Emmanuel, José Luis, Alfredo, 
Paola y Pablo. Fuimos un equipo increíble, compartimos logros, fracasos, alegrías, 
enojos y tristezas y sé que lo seguiremos haciendo. Gracias por todo su apoyo a lo 
largo de este trayecto, los quiero mucho. 
 
A mis amigos de la prepa, Xiadani, Lore, Chole y Kane, no imagino mi vida sin 
ustedes, pero no lo tengo que hacer porque son los mejores amigos que alguien 
podría tener y sé que siempre van a estar ahí para mí, como lo han estado hasta 
ahora. 
 
 
 
 
 
ABREVIATURAS 
 
ROS Especies reactivas del oxígeno 
RE Retículo endoplásmico 
3-NP Ácido 3-nitropropiónico 
ATP Trifosfato de adenosina 
MPTP 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina 
NMDA N-metil D-aspartato 
SDH Succinato deshidrogenasa 
FAD Dinucleótido de flavina 
ATC Ciclo de los ácidos tricarboxílicos 
NOS Sintasa de óxido nítrico 
DA Dopamina 
MAO-A Monoamino oxidasa A 
BiP /GRP78 Proteína de unión a inmunoglobulina/ Proteína de 
respuesta a glucosa 78 
ATF6 Factor de activación de transcripción 6 
PERK Proteína cinasa R 
Ire1a Enzima 1a dependiente de inositol 
XBP1 Caja X de unión a proteína 1 
CHOP Proteína homóloga a C/EBP 
S1P Proteasa sitio 1 
S2P Proteasa sitio 2 
CRE Elemento de respuesta a ATF/cAMP 
ERSE Elemento de respuesta a estrés de retículo endoplásmico 
eIF2 Factor de iniciación 2 
GLS Secuencia de localización de golgi 
MOMP Permeabilización de la membrana mitocondrial externa 
TM Proteína transmembranal 
Apaf-1 Factor apoptótico activador de caspasa 
CARD Dominio de reclutamiento de caspasa N-terminal 
NOD Dominio de unión a nucleótido y oligomerización 
IAP’s Proteínas inhibidoras de apoptosis 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE 
 
RESUMEN 1 
ANTECEDENTES 2 
 ÁCIDO 3-NITROPROPIÓNICO COMO MODELO DE ESTRÉS 2
 
 ESTRÉS DE RETÍCULO ENDOPLÁSMICO 9
 
 APOPTOSIS 14 
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 22 
OBJETIVOS 23 
HIPÓTESIS 24 
MATERIALES Y MÉTODOS 25 
RESULTADOS 30 
DISCUSIÓN 36 
CONCLUSIONES 39 
ANEXO 1 40 
ANEXO 2 CONGRESO 42 
REFERENCIAS 44 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMEN 
Una sobreproducción de especies reactivas de oxígeno (ROS) suele 
producirse en un estado celular de estrés oxidante. Dependiendo de si los 
mecanismos celulares utilizados para contrarrestar este estado de estrés en la 
célula son suficientes o no, está puede regresar a la homeostasis o morir vía 
apoptosis. La apoptosis es una forma programada de muerte celular. La apoptosis 
puede desencadenarse a través de diferentes vías, una de ellas es vía estrés de 
retículo endoplásmico (RE). En esta vía el mal funcionamiento en el mecanismo 
de plegado de proteínas y la acumulación de estas induce a la célula a un estado 
apoptótico. El estrés oxidante puede ser inducido por diferentes toxinas, una de 
ellas es el ácido 3-nitropropiónico (3-NP). El 3-NP produce muerte celular a través 
de la inhibición de complejo II mitocondrial de la cadena respiratoria. El 
mecanismo molecular a través del cual se produce la muerte neuronal aún no es 
del todo claro. En este trabajo se administró vía intraperitoneal el 3-NP a ratas de 
aproximadamente 300 gr para evaluar si la toxina producía estrés de retículo 
endoplásmico y posteriormente muerte apoptótica. Utilizando técnicas de 
inmunohistoquímica y Western Blot se midieron marcadores para estrés de RE: 
ATF6 y BiP/GRP78 y marcadores de apoptosis: caspasa 12 y caspasa 3. Se 
observó que la administración de la toxina produce un aumento en la expresión, 
así como en el número de células marcadas para los marcadores de estrés de RE 
y los marcadores de apoptosis. El análisis de los resultados nos permite concluir 
que tras la administración del ácido 3-nitropropiónico se produce apoptosis celular 
vía estrés de retículo endoplásmico. 
 
 
 
 
 
 
 
ANTECEDENTES 
Ácido 3-nitropropiónico como modelo de estrés. 
El oxígeno es una molécula indispensable para la vida, sin embargo como 
producto de su metabolismo se producen especies reactivas de oxígeno (ROS), 
las cuales son altamente tóxicas para las células. Las ROS están compuestas 
tanto por radicales libres (superóxido, radical hidroxilo, peroxilo, alcohoxilo, 
hidroperoxilo) así como por otras especies moleculares (peróxido de hidrógeno, 
peroxinitrito, oxígeno singulete, ozono, ácido hipocloroso) (Andersen, 2004). Los 
radicales libres son especies químicas que tienen uno o más electrones 
desapareados en un orbital atómico o molecular, los cuales le confieren un gran 
nivel de reactividad al radical libre, pues trata de completar sus electrones 
tomándolos de moléculas estables (Valko et al., 2007). 
Las ROS pueden tener efectos benéficos o dañinos en la célula 
dependiendo de la concentración a la que se encuentren (Valko et al., 2006). A 
bajas concentraciones están involucradas en diferentes sistemas de señalización 
celular. El efecto dañino de los ROS se denominaestado de estrés oxidante. Esto 
ocurre cuando hay una sobreproducción de ROS y una deficiencia en los 
sistemas de defensa antioxidantes (endógenos y exógenos) capaz de 
contrarrestarlos. El exceso de ROS puede causar daño en lípidos celulares, 
proteínas o ADN, alterando su función normal. Por esto mismo el estrés oxidante 
está relacionado con diversas enfermedades degenerativas así como con el 
proceso de envejecimiento (Kovacic et al., 2001; Ridnour et al., 2005; Valko et al., 
2001). 
La mitocondria es una fuente importante de ROS en las células de 
mamíferos. La cadena mitocondrial de transporte de electrones es la mayor fuente 
de producción de trifosfato de adenosina (ATP); durante la producción de ATP un 
cierto número de electrones se convierten en oxígeno prematuramente formando 
radicales libres. Cuando existe una actividad mitocondrial aumentada o una 
inhibición de la cadena respiratoria la producción de radicales libres aumenta; este 
 
 
incremento en la producción de radicales libres se ve directamente relacionado 
con el daño producido a la célula (Murphy, 2009). 
Debido a su gran actividad metabólica, un alto consumo de oxígeno y una 
capacidad relativamente reducida para la regeneración celular (bajos niveles de 
enzimas antioxidantes) el cerebro es un tejido particularmente susceptible al daño 
provocado por el estrés oxidante (Andersen, 2004). Actualmente existen varios 
modelos toxicológicos para estudiar el estrés oxidante algunos de ellos son el uso 
de ácido quinolínico, ozono, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) o el 
ácido 3-nitropropiónico. 
El ácido 3-nitropropiónico o 3-NP (Figura 1) fue identificado por primera vez 
como un producto del metabolismo del 3-nitropropanol, responsable de la 
intoxicación de ganado en los años 50s en Estados Unidos el cual manifestó 
varias anormalidades motoras. Tiempo después en 1991 el 3-NP fue identificado 
como el causante de varias muertes por encefalopatía aguda de niños en China 
por intoxicación por consumo de caña de azúcar contaminada con el hongo 
Arthrinium spp (productor de 3-NP). Los pacientes presentaron problemas 
motores, pérdida de consciencia, convulsiones así como la presencia de 
movimientos coreiformes; todos estos eran síntomas consistentes con el cuadro 
clínico de la enfermedad de Huntington. Estudios neurológicos demostraron 
lesiones de tipo hipóxicas principalmente en los ganglios basales así como en las 
neuronas del estriado (Ludolph et al., 1991). Es por eso que se ha utilizado como 
modelo de estudio de dicha enfermedad. 
 
Figura 1. Estructura química del 3-NP 
 
 
 El 3-NP es un inhibidor irreversible de la enzima succinato deshidrogenasa 
(SDH), presente en el ciclo de Krebs así como en el complejo II mitocondrial de la 
cadena de transporte de electrones (Herrera-Mundo et al. 2010). Estudios in vitro 
han demostrado que también inhibe reversiblemente a la fumarasa y la aspartasa, 
sin embargo la toxicidad que ejerce el 3-NP parece ser limitada a la inhibición que 
ejerce sobre la succinato deshidrogenasa (Porter et al., 1980). 
 La constante de equilibrio para la inhibición es de Ki=2 x10-4 M lo que 
sugeriría que el 3-NP es un inhibidor competitivo débil, sin embargo dado que la 
inhibición real es irreversible se cree que el mecanismo de inactivación de la 
enzima se produce en más de un paso. El mecanismo de la inactivación de la 
SDH por el 3-NP no es del todo claro aún, sin embargo estudios anteriores 
sugieren que se requiere que el 3-NP se encuentre en su forma de carbanión, en 
el citosol se da el pH propicio para la formación de esta especie. El carbanión del 
3-NP se une en el sitio de sustrato de la SDH para ser posteriormente oxidado a 
3-nitroacrilato por la flavina (FAD) de la enzima, el cual es capaz de reaccionar 
con el grupo tiol presente en el sitio para formar la unión covalente e irreversible 
(Alston et al., 1977; Coles et al., 1979) (Figura 2). 
Una vez que se inhibe la actividad de la SDH hay una disminución en la 
producción de ATP lo que ocasiona un bloqueo en la ATPasa de Na+/K+ por 
ausencia de ATP y consecuentemente una despolarización en la membrana 
celular. Esta despolarización libera el Mg2+ que bloquea a los receptores N-metil 
D-aspartato (NMDA) causando una activación excesiva de estos por el glutamato 
presente en la célula. La estimulación continua de los receptores resulta en una 
entrada masiva de Ca2+ y de Na+ a la célula produciendo la excitotoxicidad 
neuronal. Inicialmente el Ca2+ será tomado por la mitocondria y el retículo 
endoplásmico produciendo un aumento en las ROS, hasta que eventualmente el 
Ca2+ no pueda ser almacenado por ninguno de estos organelos y active enzimas 
como caspasas, cinasas, endonucleasas y fosfolipasas que a su vez activarán 
vías metabólicas dependientes de calcio. Todos estos eventos llevarán a la muerte 
celular por diferentes vías (Liot et al., 2009; Brouilliet et al., 1999) (Figura 3). 
 
 
 
Figura 2.- Mecanismo de inactivación de la SDH por el 3-NP (Modificado de 
Brouillet et al., 1999). (A) La estructura química del 3-NP es muy similar a la de 
ácido succínico, lo que explica que el 3-NP ocupe el sitio catalítico de la enzima. 
(B) Representación de la inactivación irreversible de la SDH por el 3-NP. La forma 
de dianión del 3-NP se une a la SDH llevando a la formación de nitroacrilato. El 
nitroacrilato reacciona con el grupo tiol de la SDH haciendo un enlace covalente 
con la enzima. (C) La SDH participa en la fosforilación oxidativa y el ciclo de los 
ácidos tricarboxílicos (ATC), el 3-NP inactiva a la SDH impidiendo así la entrada a 
la cadena de transporte de electrones de equivalentes reducidos generados por la 
oxidación del succinato y a su vez disminuyendo la habilidad del ciclo ATC para 
producir NADH disponible para el complejo I. 
 
 
 
 
Figura 3.- Cascada de excitotoxicidad generada por el 3-NP (Modificado de 
Brouillet et al., 1999). La inhibición de la SDH disminuye la cantidad de ATP 
disponible, lo que reduce el potencial de membrana, liberando el Mg2+ que 
bloquea los receptores NMDA, los cuales se activan por el glutamato presente 
produciendo una entrada masiva de Ca2+. El Ca2+ es tomado tanto por la 
mitocondria como por el retículo endoplásmico (RE), lo que ocasiona un aumento 
en la producción de radicales libres y disfunción en la cadena respiratoria. El Ca2+ 
que no puede ser amortiguado por los organelos activa diferentes vías 
dependientes de Ca2+ como proteasas, cinasas, fosfolipasas y endonucleasas. 
Estos eventos llevan a la muerte celular por diferentes vías, ya sea por necrosis o 
apoptosis. 
 
 
 
Otra de las consecuencias reportadas debido a la cascada de 
excitotoxicidad generada por el 3-NP es la fragmentación mitocondrial (Liot et al., 
2009). En neuronas saludables la mitocondria se encuentra en forma filamentosa 
lo que se relaciona con una alta biofuncionalidad energética. La fisión mitocondrial 
causa enfermedades neurodegenerativas en humanos (Knott et al., 2008). 
Experimentos demuestran que posterior a la administración de 3-NP se observa 
una disminución en el ATP así como un leve aumento en la cantidad de ROS, pero 
la morfología mitocondrial permanece inalterada. Horas después de la 
administración ocurre un severo aumento en la cantidad de ROS y con este 
aumento una fisión mitocondrial caracterizada por el cambio de mitocondrias 
filamentosas a puntuales y posteriormente se presenta la muerte celular (Liot et 
al., 2009) (Figura 4). 
 
Figura 4.- Modelo de fragmentación mitocondrial inducida por 3-NP (Modificado de Liot et 
al., 2009). La inhibición del complejo II mitocondrial ocasiona una disminución de ATP y 
un aumento de ROS. La entrada de Ca2+ por la activación de los receptores NMDA activa 
la sintasa de óxido nítrico (NOS) generando óxido nítrico (NO). NO se puede combinar 
con O2 para formar ONOO
-. Este aumento en radicales libresresulta en fragmentación 
mitocondrial que eventualmente ocasiona la muerte celular. 
 
 
Es bien sabido que el 3-NP causa un daño selectivo a las neuronas del 
estriado (Akopian et al., 2008). Una característica distintiva del estriado es que 
concentra la mayor cantidad del neurotransmisor 3,4-dihidroxifeniletilamina o 
dopamina (DA) en el cerebro. Se han hecho estudios que demuestran que al 
disminuir la cantidad de DA en el estriado la lesión inducida por administración del 
3-NP se reduce (Maragos et al., 1998). Esto sugiere que el metabolismo de la DA 
está involucrado en la vulnerabilidad del estriado hacia el 3-NP. El mecanismo que 
se sugiere es que el 3-NP inhibe la degradación de la DA al inhibir indirectamente 
la actividad de la monoamino oxidasa A (MAO-A) presente en las terminaciones 
nerviosas de la vía dopaminérgica nigro-estriatal. El aumento de ROS producido 
por la administración de 3-NP oxida a la DA produciendo DA-quinonas que a su 
vez también inhiben la cadena respiratoria (Herrera-Mundo et al., 2010). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Estrés del retículo endoplásmico 
El retículo endoplásmico (RE) es un organelo que está implicado en 
distintas funciones celulares. El RE tiene muchas enzimas que están involucradas 
en el control de calidad de la síntesis de proteínas así como la modificación pos-
traduccional, incluido el plegamiento de proteínas (Anelli et al., 2008; Ellgaard et 
al., 2003). El RE también juega un papel muy importante en la homeostasis 
intracelular del calcio (Paschen et al., 1998), esto involucra el almacenamiento de 
grandes cantidades de calcio así como el proporcionarlo para la señalización 
intracelular (Krebs et al., 2011). El calcio es un portador de señales dentro y fuera 
de la célula, como ligando puede regular varias aspectos de la actividad celular, 
incluida la muerte celular programada. En el lumen del RE se encuentran varias 
proteínas que son capaces de influenciar en procesos dependientes de calcio, 
muchas de estas proteínas están involucradas en el plegamiento de proteínas y se 
conocen como chaperonas moleculares (Corbett et al., 2000; Molinari et al., 2000). 
El RE es sensible al estrés celular. En respuesta al estrés celular, como 
disminución de calcio, exposición a radicales libres o disminución de glucosa, 
proteínas mal plegadas se acumulan en el RE y varias vías de señalización 
conocidas como respuesta a proteínas mal plegadas se activan para corregir este 
problema (Pashen et al., 1998; Ma et al., 2004) (Figura 5). Si estos mecanismos 
fallan en recuperar la homeostasis se activa la muerte celular vía apoptosis 
dependiente de estrés de retículo endoplásmico (Ferri et al., 2001; Kim et al., 
2008). La interrupción de la homeostasis del calcio es el efecto más inmediato y 
adverso causado por el estrés de retículo endoplásmico producido por la 
acumulación crónica de proteínas mal plegadas (Hetz et al., 2006). Comparado 
con otro tipo de células este efecto es aun más dañino en neuronas debido al 
importante papel del calcio en las ondas de actividad neuronal. El estrés de 
retículo endoplásmico es característico de la muerte celular involucrada en 
muchas enfermedades neurodegenerativas (Higo et al., 2010). 
 
 
 
 
 
Figura 5.-Respuestas activadas por estrés de RE (Modificado de Hoyer-Hanseen 
et al., 2007). El estrés de RE es provocado cuando proteínas no plegadas se 
acumulan en el RE ya sea por un aumento en la cantidad de proteínas o por una 
capacidad disminuida del RE para plegar las proteínas (esto debido a cambios de 
calcio, oxígeno o glucosa). El estrés de RE también se induce cuando proteínas 
mal plegadas se acumulan en el citoplasma. El estrés de RE lleva a la inducción 
de la respuesta a proteínas mal plegadas, degradación de proteínas y señalización 
de calcio. Estas respuestas reducen la cantidad de proteínas no plegadas en el 
RE al reducir la síntesis global de proteínas, aumentar la capacidad de plegado del 
RE y remover las proteínas mal plegadas del RE al traslocarlas para ser 
degradadas por el proteosoma. Si el estrés es extremo o se mantiene constante, 
estas vias de señalización pueden llevar a la apoptosis celular. 
 
 
 
Las vías de señalización que controlan la respuesta a proteínas mal 
plegadas y la muerte celular durante el estrés de RE están reguladas por la 
chaperona de RE BiP/GRP78 (Proteína de unión a inmunoglobulina/ Proteína de 
respuesta a glucosa 78), la cual se encuentra unida a tres proteínas 
transmembranales del RE: ATF6 (Factor de activación de transcripción 6), Ire 1a 
(enzima 1a dependiente de inositol) y PERK (Proteína cinasa R) (Kincaid et al., 
2007). La unión de BiP/GRP78 con estas proteínas se da en altas 
concentraciones de calcio, y cuando hay disminución de este BiP/GRP78 se 
disocia de las proteínas llevando a cabo una respuesta que resulta en una 
activación de factores transcripcionales que aumentan la síntesis de la proteína 
(Krebs et al., 2011). Estas tres proteínas transmembranales regulan la muerte 
celular en respuesta a un estrés de retículo endoplásmico prolongado, estas 
proteínas no activan directamente la muerte celular, sin embargo activan factores 
a nivel transcripcional como la proteína homóloga a C/EBP (CHOP) o la caja X de 
unión a proteína 1 (XBP1) (Lin et al., 2007; Kim et al., 2008) (Figura 6). 
 Durante el estrés de RE, BiP/GRP78 se disocia de estas proteínas y 
desencadena una serie de eventos que llevan a la translocación de ATF6 al 
núcleo (Haze et al., 1999). ATF6 es una proteína de tipo II transmembranal cuyo 
C-terminal se localiza en el lumen del RE y su N-terminal en el citoplasma. En 
respuesta al estrés, ATF6 es translocada del RE al aparato de Golgi, donde es 
procesada a su forma activa por proteasas de sitio 1 (S1P) y sitio 2 (S2P). La 
unión de S1P remueve la mayor parte del dominio del lumen de ATF6 y el 
fragmento N-terminal es cortado por S2P liberando el fragmento citosólico de la 
membrana. Tras su activación el fragmento citosólico es capaz de transitar al 
núcleo donde activa la expresión de genes de estrés de RE por unión a las 
regiones promotoras de elementos de respuesta a estrés de RE como el elemento 
de respuesta ATF/cAMP (CRE) y ERSE-1. ATF6 es inducido por altos niveles de 
proteínas mal plegadas, las cuales permanecen en la célula en forma de 
inclusiones citoplasmáticas. (Ye et al., 2000) (Figura 7). De esta manera se da el 
 
 
proceso de respuesta a estrés de retículo endoplásmico el cual si eventualmente 
no logra recuperar la homeostasis, desencadena la apoptosis celular. 
 
 
 
Figura 6.- Respuesta a proteínas mal plegadas (Modificada de Szegezdi et al., 
2006). Cuando se acumulan proteínas mal plegadas BiP/GRP78 se disocia de tres 
receptores de estrés de RE, proteína cinasa R (PERK), factor de activación de 
transcripción 6 (ATF6), y enzima 1a dependiente de inositol (Ire1), permitiendo su 
activación. PERK activada bloquea la síntesis general de proteínas al fosforilar el 
factor de iniciación 2 (eIF2), esta activación permite la translocación de ATF4 al 
núcleo, él cual induce la transcripción de genes requeridos para recuperar la 
homeostasis de RE. ATF6 se activa después de su translocación del RE al 
aparato de golgi. ATF6 activado también es un factor de transcripción y regula la 
expresión de chaperonas de RE y la caja X de unión a proteína 1 (XBP1) otro 
factor de transcripción. Para que XBP1 este activo debe pasar por un empalme 
alternativo hecho por IRE1. XBP1 empalmada se transloca al núcleo y controla la 
transcripción de chaperonas y genes involucrados en la degradación de proteínas. 
Estas acciones intentan restaurar las funciones del RE al aumentar su capacidad 
de plegado e iniciar acciones de degradación de proteínas acumuladas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7.- Translocación de ATF6 al núcleo bajo estrés de RE (Modificada de 
Shen et al., 2004). Tres compartimientoscelulares están involucrados en la 
activación de ATF6: el RE, el aparato de golgi y el núcleo. La activación se puede 
dividir en 5 pasos continuos: el estrés de RE induce la liberación de Bip/Grp78 y el 
desenmascaramiento de la secuencia de localización de golgi (GLS). ATF6 es 
transportada al aparato de golgi donde es procesada por proteasas S1P y S2P 
para así moverse al núcleo donde se une a elementos de respuesta a estrés de 
RE (ERSE). 
 
 
 
 
Apoptosis 
Es ampliamente aceptado que la necrosis y la muerte celular programada 
son las dos formas más comunes en las que una célula se puede morir. La 
necrosis es un proceso rápido y caótico, que ocurre en condiciones de una 
disminución severa de energía o de estrés oxidante, y se presenta con edema 
celular, rotura de la membrana plasmática e inflamación (Broker et al., 2005). La 
apoptosis (la forma más común de muerte celular programada) es un proceso 
controlado que no ocurre en ausencia de ATP (Nicotera et al., 1999), esta 
caracterizado por cambios morfológicos celulares como son, contracción celular, 
condensación de la cromatina, fragmentación del ADN y la desintegración de la 
mitocondria. La apoptosis juega un papel muy importante en diferentes procesos 
biológicos como la homeostasis de tejidos, el envejecimiento y la eliminación de 
células dañinas, por lo mismo un mal funcionamiento en ella está implicado en 
varias enfermedades, desde degenerativas hasta autoinmunes o cáncer (Cory et 
al., 2003; Adams, 2011). 
A nivel bioquímico existen dos cascadas apoptóticas: la vía intrínseca y la 
vía extrínseca. La vía extrínseca es activada después de la activación de 
receptores de muerte (FAS y TNF-α) por ligandos específicos, estos receptores se 
encuentran presentes en la superficie de la célula (Pereira et al., 2010). Por otro 
lado, la vía intrínseca es activada por un conjunto de señales de estrés como 
puede ser el daño al ADN, hipoxia, inhibición de síntesis de macromoléculas y 
estrés de retículo endoplásmico. Este conjunto de señales es mediado por la 
mitocondria a través de una familia de proteínas conocida como Bcl-2 que 
eventualmente llevan a la activación de las caspasas (Taylor et al., 2008; 
Ashkenazi, 2002) (Figura 8). 
 
 
 
 
 
 
Figura 8.- Diferencia celular entre apoptosis y necrosis. (Modificado de Pereira et 
al., 2010). Durante estrés u otras señales que activan la vía intrínseca la 
permeabilización de la membrana mitocondrial externa (MOMP) representa el 
switch hacia la muerte, de manera que si MOMP se previene durante un estímulo 
que induzca la muerte, las células permanecerán vivas. Una vez que MOMP 
comienza, la liberación del citocromo c activa a las caspasas ejecutoras lo que 
lleva a la apoptosis. Sin embargo cuando hay trastornos mitocondriales una 
segunda vía de muerte es activada manifestándose en disminución de los niveles 
de ATP y generación de ROS, lo que lleva a la muerte por necrosis. 
 
 
 
Los miembros de la familia Bcl-2 (Figura 9) son proteínas clave en la 
regulación de la apoptosis ya que están involucradas en la permeabilización de la 
membrana mitocondrial externa, esta familia incluye proteínas tanto anti como pro-
apoptóticas. Un pequeño cambio en el balance de estas proteínas puede resultar 
ya sea en la inhibición de la muerte celular o en un aumento de la misma (Ola et 
al., 2011). Las proteínas de esta familia comparten uno o más dominios de 
homología entre sí. Los miembros anti-apoptóticos son A1, BCL-1, Bcl-XL, MCL-1 
y BCL-W, estos comparten los 4 dominios entre sí (BH1, BH2, BH3 y BH4). Los 
miembros pro-apoptóticos son BAX, BAK y BOK y no comparten el dominio BH4. 
Existen otro tipo de proteínas pro-apoptóticas que solo comparten el dominio BH3 
conocidas como proteínas BH3 y estas son BID, BIM, BAD, BIK, BMF, NOXA y 
PUMA (Chipuk et al., 2010; Parsons et al., 2010). 
 
Figura 9. Familia Bcl-2 (Modificado de Ola et al., 2011). De acuerdo a su dominio 
conservado (BH) y su acción pro-apoptótica o anti-apoptótica la familia Bcl-2 
puede ser dividida en 3 subfamilias: antiapoptótica, proapoptótica y proapoptótica 
BH3. TM (dominio transmembranal) 
 
 
 
Las caspasas son una familia de proteasas caracterizada por una cisteína 
en su sitio activo y una especificidad inusual por residuos de ácido aspártico (Pop 
et al., 2009). Estas proteínas son mediadoras de la muerte apoptótica en un gran 
número de células, incluidas las neuronas. Las caspasas pueden ser activadas 
tanto por la vía extrínseca como intrínseca, sin embargo, la segunda es la más 
utilizada por neuronas en la mayoría de las enfermedades. Inicialmente las 
caspasas se encuentran inactivas en forma de zimógenos, estas son proteínas de 
cadena sencilla que tienen un prodominio amino terminal, una subunidad grande 
que contiene el sitio activo y una subunidad pequeña carboxi-terminal. Durante la 
apoptosis las caspasas iniciadoras (2, 8, 9,10) se activan por dimerización, esto 
ocurre en complejos multiméricos como el apoptosoma, las caspasas iniciadoras 
son las encargadas de activar a las caspasas efectoras (3, 6, 7) mediante un corte 
en sus 3 partes, el prodominio y las subunidades grande y pequeña. Una vez 
activadas las caspasas efectoras se induce la apoptosis (Shi, 2002; Boatright et 
al., 2003). 
 La vía intrínseca es activada por diferentes tipos de estrés celular que 
llevan a la permeabilización de la membrana mitocondrial externa (MOMP) y la 
liberación de proteínas apoptóticas al citosol. Después de que la mitocondria 
recibe estímulos apoptóticos, las proteínas pro-apoptóticas BH3 se unen y 
neutralizan a las proteínas anti-apoptóticas. Esto lleva a la oligomerización de las 
proteínas pro-apoptóticas Bax y Bak presentes en la superficie de la membrana 
mitocondrial y cuya activación lleva a la permeabilización o activación de poros en 
la membrana, liberando varios mediadores apoptóticos como son: citocromo c, 
Smac/DIABLO, HtrA2/Omi, endonucleasa G y AIF (Ola et al., 2011). El citocromo c 
liberado interactúa con el factor apoptótico activador de proteasa (Apaf1) y 
desoxiadenosina trifosfato (dATP) para formar el apoptosoma (Riedl et al., 2007; 
Strasser et al. 2000). El apoptosoma es una plataforma de señalización 
oligomérica que tiene siete Apaf1. Cada uno de los monómeros de Apaf1 tiene un 
dominio de reclutamiento de caspasa N-terminal (CARD), un dominio de unión a 
nucleótido y oligomerización (NOD) y una serie de repetidos de triptófano y ácido 
 
 
aspártico en su extremo C terminal, siendo este el sitio de unión del citocromo c 
(Ow et al., 2008; Riedl et al., 2007). En el apoptosoma se une la procaspasa-9 
permitiendo su autoactivación. Con la activación de la caspasa 9 se activa una 
cascada de señalización que activa a la caspasa 3, caspasa efectora involucrada 
en la muerte celular al desencadenar proteólisis y liberar DNasas que destruyen la 
cromatina. La activación de la caspasa 3 es efectuada por las caspasas 
iniciadoras activadas y la granzima B (Zhang et al., 2009; Letai, 2006; Enari et al., 
1998). 
 La liberación de los otros mediadores apoptóticos como Smac/DIABLO y 
HtrA2/Omi bloquea a las proteínas inhibidoras de la apoptosis (IAP’s) del citosol, 
mientras que la endonucleasa G entra al núcleo donde interviene en la 
degradación de ADN. (Ola et al., 2011) (Figura 10). 
Recientemente el retículo endoplásmico (RE) ha recibido atención como un 
segundo compartimento involucrado en la apoptosis inducida por estrés (Ferri et 
al., 2001). El RE es el mayor almacén intracelular de Ca2+; la salida de Ca2+ está 
asociada con la toma de Ca2+ por la mitocondria, a pesar de que parece que los 
iones de Ca2+ señalizan entre el RE y la mitocondria, si esto promueve o no la 
activación de caspasas no es claro. Hay evidencia que sugiere que las proteínas 
Bcl-2 funcionan en el RE así como en la mitocondria. Así los Bcl-2 específicos de 
RE activados por el estrésde RE interrumpen la comunicación con la mitocondria, 
previniendo así la activación de Bax localizados en la mitocondria (Hacki et al., 
2000; Thomenius et al., 2003). 
Ya sea Bax o Bak son necesarios para inducir la apoptosis y hay evidencias 
que sugieren que ambos pueden funcionar en el RE (Wei et al., 2001; Zong et al., 
2003, Scorrano et al., 2003). Bax y Bak están implicados en la movilización de 
Ca2+ a la mitocondria y al parecer pueden funcionar directamente en el RE para 
activar a la caspasa 12 (Zong et al., 2003). A pesar de que algunos problemas en 
el RE pueden llevar a un desequilibrio mitocondrial, hay evidencia que sugiere que 
hay una vía de RE independiente de mitocondria. Se ha reportado que la caspasa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10.-Vía intrínseca apoptótica (Modificado de Adams, 2011).Después de un 
estímulo apoptótico BH3 se une a Bcl-2 en la mitocondria, provocando una 
oligomerización de Bax y Bak que lleva a la permeabilización de la membrana 
mitocondrial externa (MOMP). El citocromo c liberado induce la formación del 
apoptosoma junto con Apaf-1. En el apoptosoma se autoactiva la procaspasa-9 y 
esta a su vez activa a la caspasa 3. Los factores Diablo/Smac y Omi/Htr2 
liberados se unen a los inhibidores de apoptosis (IAP´s) en el citosol y la 
endonucleasa G entra al núcleo comenzando la degradación de ADN. 
 
 
 
 
12 puede activar a la caspasa 9 sin necesidad de Apaf1, para posteriormente 
activar a la caspasa 3 (Rao et al., 2002) (Figura 11). 
La caspasa 12 de rata se encuentra en la cara citoplasmática del RE y es 
activada por el estrés de RE (Nakagawa et al., 2000). El mecanismo mediante el 
cual se activa no es totalmente claro, aunque posiblemente es a través de la 
liberación de calcio. La caspasa 12 es una caspasa iniciadora de la apoptosis que 
se activa en presencia de estrés de RE, por lo mismo es un marcador importante 
para determinar la vía mediante la cual se está activando la apoptosis celular. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11.-Activación de apoptosis vía RE (Modificado de Adams, 2011). La 
caspasa 12 se localiza en la membrana del RE, pero otras capasas iniciadoras (1, 
8, 9, 11) y ejecutoras (3, 7, 6) se encuentran en el citoplasma. Los miembros de la 
familia Bcl-2 se encuentran en la membrana mitocondrial, la membrana del RE o 
la membrana nuclear. La caspasa 9 se activa en su mayoría en el apoptosoma 
después de la permeabilización mitocondrial activando posteriormente a la 
caspasa 3. La caspasa 12 puede ser activada a través de señales mediadas por 
calcio en circunstancias de estrés del RE y esta a su vez tiene la capacidad de 
activar a la caspasa 9, sugiriendo así que la apoptosis puede ser activada por 
estrés del retículo endoplásmico independientemente de la formación del 
apoptosoma. 
 
 
 
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
 
 Existen numerosos estudios sobre el desarrollo de las enfermedades 
neurodegenerativas, sin embargo los mecanismos de daño y muerte celular aun 
no han sido esclarecidos. Se sabe que la deficiencia de ATP juega un papel muy 
importante en la activación de la muerte celular. El 3-NP es una toxina que induce 
daño cerebral a través de la inhibición en la producción de ATP. La ausencia o 
disminución de ATP, lleva a la célula a perder el equilibrio iónico, por lo que entra 
calcio de forma masiva a la célula, tanto la mitocondria como el retículo 
endoplásmico son organelos encargados de mantener las concentraciones de 
calcio intracelular, sin embargo en condiciones patológicas esto no sucede y el RE 
entra en un estado de estrés que lleva a la activación de diferentes factores como 
ATF6, BiP/GRP78 así como caspasas relacionadas con muerte celular de tipo 
apoptótico, particularmente la caspasa 12 que es activada específicamente vía 
RE. Con este estudio se pretende contribuir al mejor entendimiento de los 
procesos que suceden en las enfermedades neurodegenerativas. 
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 
¿La administración de 3-NP producirá un estado de estrés del retículo 
endoplásmico que ocasione apoptosis? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
OBJETIVOS 
 
 General 
Evaluar la expresión de ATF6, BiP/GRP78, caspasa 12 y caspasa 3 en el cuerpo 
estriado de ratas, generada por la administración intraperitoneal del ácido 3-
nitropropiónico, como modelo farmacológico para generar estrés en el retículo 
endoplásmico. 
 
 Particulares 
Cuantificar la presencia de moléculas marcadoras de estrés de RE como son 
ATF6 y BiP/GRP78 en estriado de ratas tratadas con 3-NP durante 7 días y en 
ratas control a través de técnicas de Inmunohistoquímica. 
 
Cuantificar la presencia de moléculas apoptóticas como son caspasa 12 y caspasa 
3 en estriado de ratas tratadas con 3-NP durante 7 días y en ratas control a través 
de técnicas de Inmunohistoquímica. 
 
Evaluar los cambios en la expresión de ATF6, BiP/GRP78, caspasa 12 y caspasa 
3 en estriado de ratas tratadas con ácido 3-NP y ratas control a mediante técnicas 
de Western Blot. 
 
 
 
 
 
 
 
 
HIPÓTESIS 
 
 
Si la administración de 3-NP produce estrés del retículo endoplásmico entonces 
esperamos encontrar cambios en ATF-6 y BiP/GRP78 en cuerpo estriado de ratas. 
Si este estrés conduce a apoptosis celular se espera encontrar cambios en la 
expresión de caspasa 12 y caspasa 3 en cuerpo estriado de ratas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MATERIALES Y MÉTODOS 
 
Animales 
 
Se utilizaron 24 ratas macho de la cepa Wistar de 300 a 350 g y se separaron al 
azar en dos grupos: 
 
Grupo control: n=12 
Grupo 3-NP: n=12 
 
Las ratas fueron colocadas en cajas de acrílico con agua y comida ad libitum. 
 
El grupo control recibió una inyección intraperitoneal diaria durante 7 días 
(solución salina 0.9%). El grupo de 3-NP fue administrado intraperitonealmente 
durante 7 días. 
 
La dosis de administración fue de 20 mg/kg para el 3-NP ajustado a un volumen 
de 0.1 ml de solución por cada 100 g de rata. El volumen de aplicación fue el 
mismo para las ratas control utilizando la solución salina. 
 
El 3-NP se obtuvo de la marca comercial Sigma y se preparó a una concentración 
de 20 mg/ml en solución salina pH de 7.4. El grupo control fue administrado 
intraperitonealmente con solución salina. 
 
Transcurridos los 7 días de administración las ratas se dividieron en 2 subgrupos: 
 
6 ratas control y 6 ratas administradas con 3-NP para realizar técnicas de 
inmunohistoquímica. 
6 ratas control y 6 ratas administradas con 3-NP fueron utilizadas para realizar 
Western Blot. 
 
 
 
 Inmunohistoquímica 
 
Las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico (50 mg/kg i.p.). 
Posteriormente se les perfundió con una solución de paraformaldehído 4% y se 
procedió a la extracción de los cerebros completos. Se hicieron cortes coronales 
para obtener fragmentos que contuvieran el estriado cerebral. Estos fragmentos se 
procesaron en un tren de deshidratación de alcohol etílico a diferentes 
concentraciones, xilol y parafina para obtener cubos de parafina. Se obtuvieron 20 
laminillas, con 2 cortes coronales de 5 micras cada una, para cada cerebro 
procesado. Se seleccionaron laminillas de cada cerebro (las laminillas se 
encontraban a la misma altura del estriado cerebral en relación con las laminillas 
seleccionadas para los otros cerebros) y se les realizaron pruebas 
inmunohistoquímicas de la siguiente manera. 
 
Se procedió a la desparafinización e hidratación de las laminillas. Fueron puestas 
en una solución recuperadora de antígeno (BioCare Medical dilución 1:10) y se 
hirvieron en una olla eléctrica de presión (BioCare Medical modelo DC0578) por 
20 min; Después se lavaron con agua bidestilada y fueron tratadas con peróxido 
de hidrógeno (JTBaker diluido 3:100) por 5 min. Nuevamente se lavaron con agua 
bidestilada y se les aplicó un bloqueador de proteínas inespecíficas (BioCareMedical) por 30 min. Transcurrido este tiempo se lavaron con agua bidestilada y 
se les aplicó otro bloqueo utilizando albúmina de suero bovino (JT Baker) 1% y 
Tritón x100 (Sigma) 0.025% por toda la noche en refrigeración. Al día siguiente se 
lavaron con TBS (Sigma) (Anexo 1) y posteriormente, se les aplicó el anticuerpo 
correspondiente en la dilución apropiada (Ver Tabla 1). El anticuerpo se dejo 
incubando por 1 noche en refrigeración. Al día siguiente se lavaron con TBS 
Tween 0.1% (Sigma) (Anexo 1) y se aplicó el anticuerpo secundario multilink 
biotinilado (BioCare Medical) el cual se dejo incubando toda la noche en 
refrigeración. Al día siguiente se lavaron con TBS Tween y se aplicó la 
estreptavidina peroxidasa (BioCare Medical) por 3 hr. Posteriormente se lavaron 
con TBS Tween y se aplicó el revelador DAB (BioCare Medical dilución 1:50). Se 
 
 
enjuagaron con agua bidestilada y se contrastó el tejido con hematoxilina por 5 
min, transcurrido este tiempo se procedió a deshidratar el tejido utilizando un tren 
de deshidratación y finalmente se montaron con una resina. 
 
Tabla 1. Diluciones de los anticuerpos utilizados para inmunohistoquímica 
Anticuerpo Tipo Dilución Marca Número de 
Catálogo 
ATF6 Monoclonal 1:200 Abcam ab11909 
BiP/GRP78 Policlonal 1:200 Abcam ab21685 
Caspasa 3 Policonal 1:100 Biocare CP229 A,B,C 
Caspasa 12 Policlonal 1:1000 Abcam ab62484 
 
El análisis de los cortes se hizo con un microscopio (Olympus modelo BX41). Se 
analizaron 12 cortes problema (2 por cerebro) y 12 cortes control (2 por cerebro) 
por anticuerpo utilizado. Por cada corte se contaron 20 campos a un aumento de 
40x. 
 
Las células en los cortes fueron cuantificadas usando el contador de células Image 
J (diseñado por National Institutes of Health de Estados Unidos) y posteriormente 
los resultados se analizaron estadísticamente. 
 
Se efectuó una prueba estadística no paramétrica, U de Mann-Whitney para 
comparar ambos grupos, para lo cual se consideró una p<0.05 como diferencia 
significativa. El programa utilizado fue SPSS versión 15.0 para Windows fabricado 
por IBM. 
 
 
 
 
 
 Western Blot 
 
Las ratas fueron sacrificadas por decapitación y se procedió a la extracción del 
tejido estriado en placa de hielo. Las muestras se homogenizaron con 300 µl de 
solución de lisis (Anexo 1) con inhibidor de proteasas (complete de Roche) y se 
centrifugaron a 15000 rpm a 4°C por 15 min conservando el sobrenadante. 
 
De los sobrenadantes obtenidos se cuantificaron las proteínas utilizando un equipo 
Nanodrop modelo ND1000 en el rango 260/280. Una vez cuantificadas las 
muestras se procedió a su análisis por Western Blot. 
 
Se hicieron los cálculos correspondientes para preparar 200 µl de muestra con 
una concentración de 1.5 µg/µl de proteína, se agregaron 40 µl de buffer de carga 
y se aforó a 200 µl con agua deionizada. Se hirvieron las muestras a 94°C por 5 
min. 
 
Se prepararon los geles correspondientes, del 10% para ATF6 y BiP/GRP78 y del 
12% para la caspasa 3 y caspasa 12 (Anexo 1). Se transfirieron los geles a la 
cámara (BIO RAD Mini Protean Tetra System) y se agregó buffer de corrida 
(Anexo 1) hasta la marca indicada. Se agregó el marcador de peso molecular 
(invitrogen prestained protein ladder) y 22.5 µg de proteína por cada muestra en 
los carriles. Las muestras se corrieron a 90 V durante 30 min y a 110 V el tiempo 
necesario para que recorrieran todo el gel (aprox. 2 hr 30 min) utilizando un 
generador (BIO RAD Power Pac HC). 
 
Se activó la membrana (Immobilion PVDF) con metanol y se preparó la cámara de 
transferencia (BIO RAD Tran Blot SD Cell), se dejo correr por 1 hr a 20 V con 
buffer de transferencia (Anexo 1). Transcurrido este tiempo se colocó la 
membrana en solución rojo ponceau (Anexo 1) por 5 min para comprobar la 
transferencia de las proteínas a la membrana. Se lavó con agua bidestilada hasta 
que la membrana quedo completamente libre de colorante. 
 
 
 
Posteriormente se bloqueó la membrana con una solución de bloqueo (Anexo 1) 
durante toda la noche en refrigeración. Al día siguiente se lavó con TBS y 
posteriormente se aplicó el anticuerpo primario correspondiente (Ver Tabla 2). El 
anticuerpo se dejo incubando por 2 hr. Posteriormente se lavó con TBS Tween y 
se aplicó el anticuerpo secundario multilink biotinilado (Bio Care Medical) el cual 
se dejo incubando por una hora a temperatura ambiente. Después se lavó con 
TBS Tween y se aplicó la estreptavidina peroxidasa (Bio Care Medical) por 1 hr a 
temperatura ambiente. Posteriormente se lavó con TBS Tween y se reveló con 
Diaminobencidina (DAB) (Bio Care Medical dilución 1:100) hasta obtener el color 
deseado. 
 
Ver anexo 1 para preparación de soluciones. 
 
Tabla 2. Diluciones de los anticuerpos utilizados para Western Blot 
Anticuerpo Tipo Dilución Marca Número de 
Catálogo 
ATF6 Monoclonal 1:250 Abcam ab11909 
BiP/GRP78 Policlonal 1:900 Abcam ab21685 
Caspasa 3 Policlonal 1:300 Biocare CP229 A,B,C 
Caspasa 12 Policlonal 1:1000 Abcam ab62484 
 
Los resultados obtenidos del western blot sirven como una comprobación visual de 
los resultados obtenidos mediante la técnica de inmunohistoquímica, los cuales 
fueron analizados estadísticamente. 
 
 
 
RESULTADOS 
 Tras el análisis de los experimentos realizados en estriado de ratas 
administradas 7 días con altas concentraciones de 3-NP se obtuvieron los 
siguientes resultados. Para la inmunohistoquímica de ATF6 se observó un claro 
aumento en el número de células marcadas positivamente en el grupo tratado con 
3-NP en comparación con el grupo control (Figura 12 A, B). La estadística 
realizada demostró que los resultados son significativamente diferentes entre 
ambos grupos con una p<0.008 (Figura 12 C). En el western blot realizado se 
observó una marca con mayor intensidad para el grupo de 3-NP que para el 
control (Figura 12 D). Estos resultados sugieren que el tratamiento con 3-NP en 
ratas conduce a una mayor expresión de ATF6 en cuerpo estriado, sugiriendo así 
la activación de mecanismos de respuesta a estrés de RE. 
 Dado que ATF6 regula la transcripción de BiP/GRP78 era de esperarse 
que esta proteína también se encontrara elevada para el grupo tratado con 3-NP. 
Esto se pudo comprobar a través de la inmunohistoquímica para BiP/GRP78 la 
cual reveló una diferencia entre el grupo control y el grupo 3-NP. Se observó un 
aumento en el número de células marcadas positivamente para el grupo 3-NP 
en relación con el control (Figura 13 A, B). La estadística realizada demostró que 
los resultados son significativamente diferentes entre ambos grupos con una 
p<0.05. (Figura 13 C). En el western blot se observó un aumento en la intensidad 
de la marca para el grupo tratado con 3-NP comparada con la observada para el 
control (Figura 13 D). El aumento de ambos factores, ATF6 y BiP/GRP78, nos 
indica presencia de estrés de RE ya que ambos factores son marcadores del 
mismo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12. Efecto de la administración intraperitoneal de 3-NP sobre la expresión 
de ATF-6 en cuerpo estriado de ratas. A) Micrografías de cuerpo estriado de ratas 
control inmunorreactivas para ATF6 (40x). B) Micrografías de cuerpo estriado de 
ratas tratadas con 3-NP inmunorreactivas para ATF6 (40x). (Las flechas muestran 
ejemplos de células marcadas positivamente) C) Número de células positivas para 
ATF6 en el cuerpo estriado de ratas, grupo control y 3-NP. Cada barra es el 
promedio ± EE. *p<0.008 vs control. D) Western Blot para ATF-6 grupo control vs 
grupo tratado con 3-NP. 
 
 
 
 CONTROL A 
C 
 
 
 
 
 
 
D 
3-NP Control 
85 kDa 
B 
* 
3-NP 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 13. Efecto de la administración intraperitoneal de 3-NP sobre la expresión 
de BiP/GRP78 en cuerpo estriado de ratas. A) Micrografías de cuerpo estriado de 
ratas control inmunorreactivas para BiP/GRP78 (40x).B) Micrografías de cuerpo 
estriado de ratas tratadas con 3-NP inmunorreactivas para BiP/GRP78 (40x). (Las 
flechas muestran ejemplos de células marcadas positivamente) C) Número de 
células positivas para BiP/GRP78 en el cuerpo estriado de ratas, grupo control y 3-
NP. Cada barra es el promedio ± EE. *p<0.05 vs control. D) Western Blot para 
BiP/GRP78 grupo control vs grupo tratado con 3-NP. 
 
 
A B CONTROL 
D 
3-NP Control 
78 kDa 
* 
3-NP 
 
 
 
C 
 
 
Una vez analizada la presencia de estrés de RE por medio de las moléculas 
ATF6 y BiP/GRP78 se procedió a determinar si este estrés desencadenaba una 
respuesta apoptótica dependiente de estrés de RE. Este estudio se hizo a través 
de la determinación de la caspasa 12, caspasa iniciadora de la respuesta 
apoptótica presente en la cara citoplasmática del RE y activada por estrés en el 
mismo. Para la caspasa 12 se observó la misma tendencia que en los casos 
anteriores. El grupo tratado con 3-NP tuvo mayor presencia de células marcadas 
positivamente que el grupo control (Figura 14 A, B). La estadística reveló una 
diferencia significativa entre ambos grupos con p<0.001 (Figura 14 C). En el 
western blot se puede observar una diferencia clara entre la intensidad del grupo 
control y el tratado con 3-NP, siendo el de 3-NP el que tiene mayor intensidad 
(Figura 14 D). El aumento de esta proteína nos indica que hay activación de vías 
apoptóticas a través del RE resultantes del tratamiento con 3-NP. 
Para que se lleve a cabo la apoptosis tras la activación de la caspasa 12 se 
debe activar la caspasa 3, ya que está última es la caspasa efectora que lleva a 
cabo la muerte celular. Por lo mismo, el siguiente paso en nuestros experimentos 
fue analizar el comportamiento de la caspasa 3 tras la administración del 3-NP. 
Los resultados para la inmunohistoquímica de la caspasa 3 muestran un aumento 
en el número de células marcadas positivamente para el grupo tratado con 3-NP 
en comparación al grupo control (Figura 15 A, B). La estadística realizada 
demostró una diferencia significativa con una p<0.02 (Figura 15 C). En el western 
blot realizado se observa una marca para el grupo 3-NP a diferencia del grupo 
control, donde no se observa marca, confirmando así los resultados obtenidos 
para la inmunohistoquímica (Figura 15 D). El aumento de la caspasa 3 indica que 
hay un aumento en las células que cursan procesos apoptóticos resultantes del 
tratamiento con 3-NP. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 14. Efecto de la administración intraperitoneal de 3-NP sobre la expresión 
de caspasa 12 en cuerpo estriado de ratas. A) Micrografías de cuerpo estriado de 
ratas control inmunorreactivas para caspasa 12 (40x). B) Micrografías de cuerpo 
estriado de ratas tratadas con 3-NP inmunorreactivas para caspasa 12 (40x). (Las 
flechas muestran ejemplos de células marcadas positivamente) C) Número de 
células positivas para caspasa 12 en el cuerpo estriado de ratas, grupo control y 3-
NP. Cada barra es el promedio ± EE. *p<0.001 vs control. D) Western Blot para 
caspasa 12 grupo control vs grupo tratado con 3-NP. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 3-NP CONTROL 
C 
3-NP Control 
50 kDa 
D * 
A B 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15. Efecto de la administración intraperitoneal de 3-NP sobre la expresión 
de caspasa3 en cuerpo estriado de ratas. A) Micrografías de cuerpo estriado de 
ratas control inmunorreactivas para caspasa 3(40x). B) Micrografías de cuerpo 
estriado de ratas tratadas con 3-NP inmunorreactivas para caspasa 3 (40x). (Las 
flechas muestran ejemplos de células marcadas positivamente) C) Número de 
células positivas para caspasa 3 en el cuerpo estriado de ratas, grupo control y 3-
NP. Cada barra es el promedio ± EE. *p<0.02 diferencias vs control. D) Western 
Blot para caspasa 3 grupo control vs grupo tratado con 3-NP. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CONTROL 
D 
3-NP Control 
32 kDa 
B 
* 
A 
C 
 
 
DISCUSIÓN 
Bajo condiciones fisiológicas normales el RE es el encargado del plegado 
de las proteínas, en condiciones de estrés de RE este mecanismo comienza a 
fallar y se activa un mecanismo de respuesta al estrés. El control transcripcional 
de la respuesta a estrés de RE comienza con la percepción del estrés y termina 
con la activación de genes de respuesta, ATF6 se encuentra involucrado en cada 
uno de los pasos de este proceso (Sato et al., 2011). ATF6 se induce por altos 
niveles de proteínas mal plegadas en el RE, el estrés de RE induce la movilización 
de ATF6 al aparato de Golgi, este proceso es controlado por la chaperona 
Bip/GRP78 (Shen et al., 2005). En este trabajo se encontró un aumento 
significativo en la cantidad de ATF6 tras la administración del ácido 3-
nitropropiónico (Figura 12), lo que sugiere que el 3-NP es una toxina causante de 
estrés de RE. Existen reportes que demuestran como la administración de toxinas 
como el MPTP (1metil-4-fenil-1, 2, 3, 6-tetrahidropiridina) producen estrés de RE, 
lo que se observa en un aumento de ATF6. Estos estudios muestran como el 
ATF6 tiene un papel de protección ante la toxicidad del MPTP en neuronas 
dopaminérgicas, ya que tras la activación de ATF6, se activan factores de 
transcripción de chaperonas de RE así como de elementos de respuesta a estrés 
(Egawa et al., 2010). Por otro lado otros autores han demostrado como una 
disminución de ATF6 a través de interferencia en el RNA se expresa como una 
producción disminuida de genes inducibles por estrés de RE como son 
BiP/GRP78 (Lee et al., 2003). De acuerdo con Sato y col (2011) la fracción 
citosólica de ATF6 entra al núcleo tras ser cortada en el aparato de Golgi y activa 
factores de transcripción al unirse a elementos de respuesta a estrés de RE 
(ERSE). ATF6 regula la transcripción proteica de BiP/GRP78, que de acuerdo a 
los resultados obtenidos en este trabajo se encuentra elevada en el grupo tratado 
con 3-NP en comparación con el control (Figura 13). De acuerdo con Egawa y col, 
(2010) ATF6 controla los niveles de proteínas chaperonas de retículo 
endoplásmico en neuronas dopaminérgicas del cerebro. Así nuestros resultados 
sugieren que el ácido 3-NP produce estrés de retículo endoplásmico, promoviendo 
 
 
la translocación de ATF6 al aparato de Golgi y posteriormente al núcleo donde 
activa factores de transcripción que promueven la síntesis de BiP/GRP78 en 
busca del mantenimiento de la homeostasis celular. Esto ha sido comprobado por 
los trabajos realizados por Dolai y col, (2010) en donde usando tunicamicina 
inducen un estrés de RE y observan una marcada elevación en los niveles de 
BiP/GRP78. Esta proteína chaperona aumenta la actividad de plegado de 
proteínas y previene la agregación proteínica combatiendo el estrés de RE 
(Kaufman, 2002). 
A pesar de los esfuerzos celulares por mantener la homeostasis, la 
acumulación prolongada de proteínas mal plegadas en el lumen del RE provoca 
un estrés oxidante constante que eventualmente resulta en la muerte celular. El 
estrés de RE prolongado activa a la caspasa 12 la cual activa a la caspasa 3 de 
manera indirecta y eventualmente lleva a la célula a apoptosis (Szegezdi et al., 
2003). Estudios previos realizados por Nakagawa y col, (2000) reportan a la 
caspasa 12 como una caspasa residente en la cara citoplasmática de RE que 
funciona como una caspasa iniciadora, activada por calpaína para inducir 
apoptosis vía estrés de RE, sin embargo se le han atribuido otras funciones como 
la de una caspasa antiinflamatoria. Los resultados presentados en este trabajo 
demuestran un aumento significativo en la cantidad de caspasa 12 del grupo 3-NP 
comparado con el grupo control (Figura 14), así mismo el aumento de caspasa 3 
también es claro y significativo (Figura 15). El aumento en la caspasa 3 nos indica 
que la muerte celular es vía apoptosis, sin embargo la caspasa 3 puede ser 
activada por caspasas tanto mitocondriales como de RE, el análisis de la caspasa12 nos indica que hay muerte apoptótica vía estrés de RE, sin descartar la vía 
mitocondrial o la necrosis, que probablemente también se encuentren presentes. 
Reportes previos por Ke y col, (2011) demuestran como células de ratones 
deficientes en caspasa 12 fueron parcialmente resistentes a la apoptosis inducida 
por estrés de RE, aunque aún así murieron a través de otros estímulos. Estos 
resultados dan un indicio de la participación de la caspasa 12 en la apoptosis vía 
estrés de RE. Reportes descritos por Nakagawa y col, (2000) demuestran que a 
 
 
través de la inducción de estrés de RE con tunicamicina y tapsigargina se expresa 
la caspasa 12 y la define como una molécula representativa implicada en el 
mecanismo de muerte celular relevante para estrés de RE. Existen reportes que 
muestran la activación de la caspasa 3 después de la administración del ácido 3-
NP (Almeida et al., 2006; Diwakarla et al., 2011) y otros reportes que no observan 
una activación significativa en el aumento de caspasa 3 tras la administración de 
la toxina (Del Rio et al., 2008). De acuerdo con Almeida y col, (2006) estas 
diferencias en la activación de la caspasa 3 son dependientes de la concentración. 
Cuando se administran concentraciones altas la célula no es capaz de activar los 
mecanismos de respuesta apoptótico y muere por necrosis, por el contrario con 
concentraciones más bajas la célula puede responder activando la muerte celular 
programada produciendo activación de la caspasa 3. Con la dosis que se utilizó en 
este trabajo se logró observar activación de la caspasa 3, lo que nos indica que las 
ratas que sobrevivieron a la administración de la toxina fueron capaces de efectuar 
una respuesta apoptótica. 
En resumen los resultados sugieren que tras la administración del 3-NP 
hay inducción de estrés de RE, lo que eventualmente lleva a la célula a activar 
vías apoptóticas dependientes de estrés de RE. 
El estudio de los mecanismos de muerte celular es de suma importancia 
para el mejor entendimiento de los procesos que suceden en las enfermedades 
neurodegenerativas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
CONCLUSIONES 
Los cambios observados tanto en el número de células inmunorreactivas para 
ATF6 y BiPGRP78 como para la expresión de las mismas proteínas, sugieren la 
activación del estrés de retículo endoplásmico producido por la administración de 
3-NP en ratas. 
El incremento de células inmunorreactivas para caspasa 12 y caspasa 3 así como 
para la expresión de dichas proteínas, indican la activación de rutas de muerte 
dependiente de caspasas (apoptosis) vía RE. 
Estos resultados sugieren que posterior a la administración del 3-NP se desarrolla 
un proceso de estrés de RE comprobable por el aumento de los factores ATF6 y 
BiP/GRP78. En caso de que el estrés se mantenga constante se activan vías de 
muerte celular apoptóticas dependientes de estrés de RE. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ANEXO 1 
 
Buffer TBS 10X pH 7.5 
 Tris-Base 60.5 g 
 NaCl 87.6 g 
Se ponen en agitación con agua 
destilada y se ajusta el pH con HCl. 
Se afora a 1L. 
 
 
Buffer de Corrida 10X 
 Tris-Base 29 g 
 Glicina 144 g 
 SDS 10 g 
Se pone en agitación con agua 
destilada y se afora a 1L. 
 
 
TBS Tween (TTBS) 
 TBS 1X 1000 ml 
Tween 20 1 ml 
 
Solución de Bloqueo 
TTBS 1X 50 
ml 
Leche descremada en polvo
 2.5 g 
Suero de caballo 2.5 
µl 
Buffer de Carga 5X 
 SDS 20 g 
 Glicerol 100 
ml 
 DTT 15.4 g 
 Tris 0.5M pH8.5 26 ml 
 Azul Bromofenol 0.1 g 
Poner en agitación y aforar con agua 
destilada a 200mL 
 
 
Buffer Transferencia 10X 
Tris-Base 29 g 
Glicina 144 g 
 
 
Solución Rojo Ponceau 
 Ácido Acético concentrado
 5 ml 
 Rojo Ponceau 
 0.1 g 
 Agua destilada 
 95 ml 
 
Persulfato de Amonio 
APS 0.1 g 
Agua destilada 1 ml
 
 
 
Gel de Poliacrilamida (Separador) 
Tamaño de la Proteína 
(kda) 
15-70 20-100 
%Gel 12 % 10 % 
Glicerol 50% 20 ml 20 ml 
Agua destilada 15 ml 21.68 ml 
Tris 1.5M pH8.8 25 ml 25 ml 
Bisacrilamida 30% 40 ml 33.32 ml 
SDS 10% 1 ml 1 ml 
 
Gel Concentrador (100ml) 
 Agua destilada 61 
ml 
 Tris 0.5M pH6.8 25 ml 
 Bisacrilamida 30% 13 ml 
 SDS 10% 1 ml 
 
Gel Separador (para preparar 2 
geles) 
Gel Separador 10 ml 
APS 120 µl 
TEMED 12 µl 
 
Gel Concentrador (para preparar 2 
geles) 
Gel Concentrador 4 ml 
APS 60 µl 
TEMED 6 µl 
 
 
 
 
 
Buffer Lisis de Proteínas 
NaCl 1.75 g 
Tris HCl 0.485 g 
EDTA 0.5M pH 7.4 2 ml 
Glicerol 10% 20 ml 
NP 40 1% 2 ml 
Se afora a 200 ml con agua 
deionizada y se agregan inhibidores 
de proteases (Leupeptina, Pepsatina, 
Aprotinina) en proporción 1:1000 con 
el buffer de lisis. 
 
 
 
 
Anexo 2 
 
 
SOCIEIY ,. NIURO!>o: ~: 
FINAL PROGRAM 
Wednesday to Saturday 
NOVEMBEA 10-13, 2010 
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	Portada
	Índice
	Resumen
	Antecedentes
	Planteamiento del Problema
	Objetivos
	Hipótesis
	Material y Métodos
	Resultados
	Discusión
	Conclusiones
	Anexos
	Referencias