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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA EFECTO DE LA CAFEÍNA SOBRE LA DEMOGRAFÍA DE Moina macrocopa (Cladocera) Y Plationus patulus (Rotifera) TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGA PRESENTA: MAYRA CAROLINA REYES SANTILLÁN DIRECTORA DE TESIS: DRA. NANDINI SARMA LOS REYES IZTACALA, ESTADO DE MÉXICO, 2016 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. RESUMEN La eutrofización es común en varios cuerpos de agua en México, principalmente porque reciben agua parcialmente tratada o directa, es decir, sin tratamiento. Uno de los problemas centrales, es el deficiente tratamiento del agua la cual contiene una alta carga de nutrientes que alimenta o mantiene el nivel de los sistemas acuáticos. Otras fuentes de contaminación son las aguas residuales domésticas y de actividades productivas como la ganadería, la agricultura y las actividades de traspatio. Uno de los indicadores de la entrada de aguas residuales domésticas es la presencia de cafeína. Esta sustancia es de uso común en todas las ciudades y tiende a persistir en el agua, y aun cuando se conoce que puede tener un efecto negativo sobre los organismos acuáticos, hay poca información sobre el tema. Los organismos zooplanctónicos son importantes en la transferencia de energía hacia niveles tróficos superiores en las redes acuáticas, particularmente los rotíferos y los cladóceros (crustáceos pequeños). Ambos grupos son sensibles indicadores de calidad de agua y se utilizan comúnmente en estudios de ecotoxicología. Los cladóceros aceptados para pruebas de ecotoxicología son: Daphnia magna Straus, y Ceriodaphnia dubia Richard, mientras que los rotíferos aceptados son: Brachionus calyciflorus Pallas y Plationus patulus (Müller). Sin embargo, uno de los cladóceros más comunes en los sistemas tropicales es Moina macrocopa (Straus). Se han hecho estudios profundos con efectos agudos y crónicos de la cafeína tanto en cladóceros como en rotíferos. Aunque hay registros de cafeína en aguas de desechos, hay muy poca información sobre el tema. En este estudio presentamos datos del efecto de la cafeína en pruebas agudas y crónicas con Moina macrocopa y Plationus patulus. Los resultados mostraron que M. macrocopa es resistente a la cafeína; la Concentración Letal Media (CL50) fue 141 mg L-1. Otros estudios muestran también que M. macrocopa es resistente a varios tóxicos y crece muy bien en aguas parcialmente tratadas, mientras que Plationus patulus tiene una CL50 mayor a 250 mg L-1, lo que confirma que es más tolerante al efecto de ciertos tóxicos como la cafeína. Los resultados en la demografía de ambas especies en concentraciones subletales de cafeína muestran un efecto adverso a largo plazo en tasas de crecimiento poblacional y de reproducción. Palabras clave: cafeína, cladócero, rotífero, tabla de vida, crecimiento poblacional INTRODUCCIÓN Agua El agua es vital para la existencia de todos los organismos vivos, ya que es indispensable en los procesos biológicos y es hábitat de múltiples comunidades acuáticas (SEMARNAT, 2007). Se calcula que en la Tierra existen aproximadamente 1´385,000,000 km3 de agua, de los cuales el 97.5 % es salada, el 2.5 % se encuentra congelada en los polos y solo una pequeña parte está disponible para nuestras necesidades (Jiménez, 2001; SEMARNAT, 2007). Figura 1. Modificada de SEMARNAT 2007. En general se considera como contaminante al exceso de materia que provoque daño a los animales y plantas o bien que perturbe negativamente las actividades que normalmente desarrollan cerca o dentro del agua, mientras que un tóxico es cualquier sustancia química capaz de causar daño, debilitar o matar organismos (Sánchez et al., 2010; Gil et al., 2012). El origen de la contaminación es muy variado e incluye; desechos urbanos e industriales, los drenados de la agricultura y de minas, la erosión, los derrames de sustancias tóxicas, los efluentes de plantas depuradoras, entre otros, es decir, el alto grado de contaminación acuática por contaminantes orgánicos que no se degradan fácilmente (Sánchez et al., 2010). Desde el año 2000, en México se han identificado 22 cuerpos de agua, en 12 cuencas, fuertemente contaminados (Rosales et al., 2011). Estos cuerpos de agua tienen altas concentraciones de metales pesados, pesticidas y fármacos. Recientemente han sido documentados contaminantes emergentes orgánicos en ecosistemas acuáticos especialmente provenientes de aguas de desecho y plantas de tratamiento que usan el agua para rellenar lagos y estanques (Fraker y Smith, 2004). De acuerdo a la CONAGUA (2011), sólo se trata el 30 % de aguas residuales y 9 % de las aguas industriales, sin embargo, no ha sido definida una lista de compuestos que constituyen una prioridad para el control de contaminación la acuática (CONAGUA, 2011). Los compuestos que se encuentran presentes en el agua se clasifican de la siguiente manera de acuerdo a su naturaleza (Tabla 1). Tabla 1. Clasificación de compuestos presentes en el agua según su naturaleza. (Jiménez, 2001). Químicos Compuestos de origen natural o sintético Metales pesados Detergentes Fertilizantes Plaguicidas Biológicos Seres vivos que provocan enfermedades en el hombre u otros animales Bacterias Virus Protozoos Físicos Alteraciones en las propiedades del agua Color Temperatura Contaminantes emergentes Actualmente existe un creciente interés por el estudio de contaminantes químicos en su mayoría apolares, tóxicos, persistentes y bioacumulables potencialmente peligrosos, denominados contaminantes emergentes (Barceló y de Alda, 2008). Son compuestos de distinto origen y naturaleza química, cuya presencia en el ambiente, o las posibles consecuencias de la misma, han pasado en gran medida inadvertidas, causando problemas ambientales y de riesgo a la salud (OMS, 2015). Los contaminantes emergentes son compuestos de los cuales se sabe relativamente poco o nada acerca de su presencia, impacto y tratamiento, razón por la cual no han sido regulados, suelen ser productos comunes como pesticidas, productos farmacéuticos, drogas ilícitas y productos de aseo personal, entre otros. La lista de contaminantes emergentes incluye una amplia variedad de productos de uso diario con aplicaciones tanto industriales como domésticas (Gil et al., 2012), debido a su elevada producción, consumo y continua introducción al ambiente no necesitan ser persistentes para ocasionar efectos negativos, estos compuestos se encuentran diseminados en el ambiente y se han detectado en fuentes de abastecimiento de agua potable y en aguas subterráneas (Fraker y Smith, 2004). Estos compuestos entran en el ambiente a través de aguas residuales de tipo domésticoe industrial, de los residuos de plantas de tratamiento, de efluentes hospitalarios, de actividades agrícolas, de actividades ganaderas y de tanques sépticos (Barceló y de Alda, 2008), los cuales contienen un gran número de componentes orgánicos y contaminantes emergentes que se descargan a diferentes concentraciones en las aguas superficiales; además de las que provienen de las plantas de tratamiento convencionales de aguas residuales, las cuales no están diseñadas para eliminarlos (Jiménez, 2001). Se han descrito 200 fármacos distintos que superan los 6.5 mg L-1 en diferentes cuerpos de agua (Petrie et al., 2014), incluso existen diversos trabajos que identifican más de 147 compuestos químicos que contaminan el agua de manera constante, entre ellos se encuentra la cafeína, la cual está presente en abundantes concentraciones en los cuerpos de agua (Vryzas et al., 2008). Cafeína La cafeína es un alcaloide perteneciente al grupo de las metaxantinas (1, 3, 7- trimetilxantina) (Figura 2), es uno de los derivados más importantes de la xantina, su peso molecular es de 194.19 g/mol y fue aislada por primera vez en 1820 por Friedrich Ferdinand Runge (Calle, 2011). Es un constituyente natural presente en gran diversidad de plantas, e incluso, puede encontrarse en bebidas comunes como el té, café, chocolate, refresco y medicamentos (Pardo et al., 2007). En estado puro es un sólido cristalino ( Tabla 2) y se encuentra en forma natural en las hojas, semillas y frutos de más de 60 plantas, entre las que se pueden mencionar, hojas de té, nueces, café y granos de cacao (Calle, 2011). Figura 2. Estructura química de la cafeína (Calle, 2011). Tabla 2. Propiedades físicas de la cafeína (Calle, 2011). Propiedades físicas de la cafeína Fórmula C8H10N4O2 Masa molar 194,19 g/mol Punto de fusión 238 ºC Punto de ebullición 178 ºC Densidad 1.23 g/cm3 Es un estimulante que actúa sobre el sistema nervioso central, incrementando la actividad motora, el rendimiento intelectual y disminuyendo la fatiga y el sueño. Dosis altas producen ansiedad y trastornos del sueño. En el sistema cardiovascular actúa estimulando el corazón, incrementando la frecuencia cardiaca y la fuerza de contracción, y además aumenta la presión arterial de forma transitoria (Pardo et al., 2007). El café como infusión es el principal aporte de cafeína a la dieta del adulto, el 80 % de la población adulta consume entre 200 y 300 mg de cafeína por persona por día, lo que equivale a dos o tres tazas de café. En el mundo se consumen alrededor de 2,500 millones de tazas de café al día y en promedio los mexicanos consumimos de 800 a 1,400 g anuales de café, es decir, 2.6 tazas al día (Barreda, 2011). El 100 % de la cafeína ingerida, es rápidamente absorbida a partir del tracto gastrointestinal, una vez integrada al torrente sanguíneo, la cafeína se introduce rápidamente en los tejidos y el periodo para su excreción, es decir el tiempo requerido para que el cuerpo elimine a la mitad del producto presente en el plasma sanguíneo, oscila entre 3 y 7 horas sin embargo, puede variar entre horas y días dependiendo de la edad, el sexo y las condiciones de salud (Calle, 2011), Se metaboliza en el hígado casi en su totalidad, excretándose por la orina como metabolito en muy pequeñas cantidades (Pardo et al., 2007), al igual que los fármacos y otras sustancias, estos metabolitos llegan a efluentes y aguas de desecho (Barceló y de Alda, 2008). ******* La cafeína y algunos otros componentes se han propuesto como marcadores de contaminación antropogénica, ya que tienen un alto grado de consumo, su registro se asocia a superficies con alta densidad poblacional, es usual encontrarlos en desechos urbanos, agua tratada, herbicidas y pesticidas, entre otros compuestos (Lawrence et al., 2011; Zarelli et al., 2014), además, se han encontrado en la superficie de diferentes cuerpos de agua alrededor del mundo, en concentraciones que van de los 11 µg L-1 a los 135 µg L-1 (Zarelli et al., 2014). En la naturaleza la cafeína no es diferente a cualquier otra droga o fármaco que llega a los cuerpos de agua ya que se trata de sustancias de consumo humano (Gil et al., 2012). Es importante considerar el efecto de la cafeína en los cuerpos de agua debido a que más del 90 % de la población consumen alrededor de 300 mg al día de cafeína (Vryzas et al., 2009; Rosales 2010) de los cuales excretamos solo el 3.9 mg (Vryzas et al., 2009; Barreda et al., 2011; Calle 2011). La cafeína no es totalmente removida en plantas de tratamiento de agua, lo que provoca que ríos y lagos sean constantemente contaminados con este y otros tóxicos incluidos en las descargas de agua tratada, de acuerdo con Vryzas (2009), la cafeína se encuentra de 0.005 a 2.35 µg L-1 en ríos, por estas razones se considera muy importante evaluar el efecto de los contaminantes emergentes en especies acuáticas haciendo uso de la ecotoxicología, ya que esta se basa en la sensibilidad de ciertas especies (Sánchez y Rico, 2010). Ecotoxicología La ecotoxicología se puede definir como la ciencia que estudia la contaminación, su origen y efectos sobre los seres vivos y su ecosistema (Capó, 2007) De acuerdo con Capó (2007), los efectos toxicológicos suelen ser diferentes, dependiendo de las sustancias y sus propiedades, los cuales pueden ser: Tabla 3. Posibles efectos toxicológicos de tóxicos en seres vivos (Capó, 2007). Locales La lesión solo se presenta en la zona de contacto. Sistémicos Afecta uno o varios órganos posterior a la absorción y distribución. Reversibles El efecto del toxico desaparece al mismo que el toxico desaparece. Inmediatos Aparece tras su ingestión. Retardados Se manifiesta su acción después de un periodo de espera. Morfológicos Son observables en los tejidos, suelen ser irreversibles y graves. Funcionales Afecta la función del órgano blanco y suelen aparecer a dosis bajas. La evaluación de la contaminación del agua con estudios de toxicidad son necesarios, ya que las pruebas físicas y químicas nos son suficientes para valorar los efectos potenciales de ciertas sustancias (García-García et al., 2004). Los compuestos solubles pueden llegar a contaminar aguas subterráneas debido a su movilidad, sin embargo, los compuestos no solubles tienden a acumularse en sedimentos (Isidori et al., 2005). Las descargas locales contribuyen a la contaminación ambiental en altas concentraciones. Debido a su aporte continuo y el uso persistente de tóxicos ha ocasionado efectos no deseados en los ambientes acuáticos, como daños a las comunidades microbianas, variación del ritmo de vida, reducción de la fertilidad, así como efectos tóxicos reproductivos. Por esta razón es de suma importancia detectar y conocer los efectos de los tóxicos en comunidades acuáticas (Knee, 2010). Una prueba de toxicidad es el proceso en el cual se miden respuestas en: la morfología, tiempo de vida, edad reproductiva, crecimiento poblacional y algunos otros datos demográficos de los organismos. Se utiliza para medir el efecto de una o más sustancias, actuando aisladamente o en combinación (García-García et al., 2004). El uso del zooplancton en evaluaciones ecotoxicológicas con pruebas crónicas y agudas bajo diferentes tóxicos (Santos-Medrano y Rico, 2013) ha ganado gran importancia en México y alrededor del mundo (Sarma et al., 2014). Se ha demostrado que el uso de zooplancton en evaluaciones toxicológicas permite tener ventajas ya que poseen ciclos de vida cortos, susceptibilidad a tóxicos, altas tasas de crecimiento poblacional, además, algunas especies son reconocidas por la Asociación Americana de Salud Pública (APHA por sus siglas en Inglés) (Dahms et al., 2010; Walsh el al., 2014). Existen pruebas in vivo e in vitro, que muestran generalmente los efectos tóxicos de estos compuestosaunque no sean los niveles o concentraciones presentes en el ambiente (Sarma et al., 2014). Uno de los principales factores que incentiva la regulación y la preocupación científica, es que el agua tratada que no está libre de compuestos orgánicos y contaminantes emergentes es usada para relleno de lagos y ríos, ecosistemas acuáticos que sostienen la vida de diferentes organismos. Zooplancton Dentro de los sistemas de agua dulce se encuentra el zooplancton epicontinental, (Conde-Porcuna et al., 2004), el cual contempla, cuatro grupos principales: protozoos, rotíferos, copépodos y cladóceros. Sin embargo, es importante aclarar la existencia de más organismos microscópicos que forman parte de esta comunidad, como otros taxones de microcrustáceos como son los ostrácodos y anfípodos y otros grupos como los ácaros (Elías-Gutiérrez, 2014). Los organismos zooplanctónicos están dotados de periodos de vida cortos, reproducción partenogenética sensibilidad a ciertas sustancias, marcadores biológicos y facilidad de manipulación debido a su tamaño (Conde-Porcuna et al., 2004). Estas características han permitido la formulación, a partir de hipótesis experimentales basadas en interacciones biológicas y/o físicas, de modelos sobre la estructura de comunidades más fácilmente que en los sistemas terrestres. Además, el zooplancton de agua dulce está compuesto por animales con altas tasas de crecimiento, un rasgo que permite responder rápidamente a ambientes cambiantes (Dahms et al., 2010). Los rotíferos y los cladóceros son organismos microscópicos que forman parte importante de la comunidad zooplanctónica debido al aporte energético que brindan a la comunidad , además, se caracterizan por tener un papel fundamental en las redes tróficas pelágicas (Sánchez et al., 2010), incluso, la composición específica del zooplancton puede ser un excelente criterio para caracterizar el estado trófico de los sistemas acuáticos y para deducir la estructura de las comunidades acuáticas (Conde-Porcuna et al., 2004). Estos organismos son utilizados para realizar evaluaciones toxicológicas exponiéndolos a compuestos o sustancias para obtener valores como Concentración Letal Media (CL50) y Concentración Efectiva Media (CE50) (Wallace, 2002). Los organismos zooplanctónicos son sensibles a los cambios ambientales, lo cual los hace útiles como bioindicadores de la calidad del agua debido a que se puede obtener información reproducible en poco tiempo, por su corto ciclo de vida, sin obviar la distribución cosmopolita, la producción de huevos de resistencia, amplio intervalo de temperatura para su desarrollo y más características que los hacen apropiados para llevar a cabo estos estudios (Dahms et al., 2010). Actualmente ha aumentado el interés a nivel mundial, de la detección de los residuos de sustancias tóxicas en los ambientes acuáticos. El uso de cladóceros y rotíferos en evaluaciones ecotoxicológicas ha ganado gran importancia en México y alrededor del mundo, la Norma Oficial Mexicana NOM recomienda el uso de ciertas especies para hacer bioensayos (Sarma et al., 2006). Los cladóceros y rotíferos han sido establecidos como un modelo para la ecotoxicología y para la investigación de impacto ecológico de sustancias toxicas en cuerpos de agua (Campbell et al., 2004). Antecedentes Moore y colaboradores (2008), midieron el efecto de la cafeína en Ceriodaphnia dubia, Pimephales promelas y Chironomus dilutus, estos organismos acuáticos fueron expuestos 48 h por siete días a soluciones acuosas de cafeína. Los resultados obtenidos de CL50 fueron de 60 mg L-1 para C. dubia 100 mg L-1 para P. promelas y para C. dilutus 1,230 mg L-1. Lo que nos indica que C. dubia es más sensible a la cafeína en comparación con P. promelas o C. dilutus. Baylor y colaboradores (1942), realizaron un experimento para observar el efecto de la acetilcolina sobre el ritmo cardiaco de Daphnia que va de 4 a 10 palpitaciones por segundo. Se ha demostrado que la acetylcolina incrementa la velocidad del ritmo cardiaco de diferentes crustáceos decápodos Sus datos muestran una disminución de la frecuencia cardiaca de los organismos hasta en un 25 % con una concentración de 10-9. Lawrence y colaboradores (2011), examinaron los efectos de tres contaminantes comunes; cafeína, acetaminofén y diclofenaco, así como las mezclas en el desarrollo, funcionamiento y biodiversidad de las comunidades, imágenes digitales revelaron una variedad de efectos de biomasa en algas, cianobacterias y bacterias. Entre los resultados de este experimento, no se registró ningún efecto en cuanto a biomasa de algas, cianobacterias y bacterias sometidas a tratamientos en los cuales se incluía la cafeína, sin embargo, se observó un incremento de protozoos y micrometazoos. Campbell y colaboradores (2004), evaluaron el efecto de la cafeína, lactosa, isoproteronol, adrenalina, propanolol y carbachol en el corazón de Daphnia pulex, el promedio del ritmo cardiaco es aproximadamente de 195.9 ± 27.0 latidos/min. El resultado nos muestra que la lactosa inhibe el ritmo cardiaco del 30 al 100 %, generando una severa arritmia mientras que la cafeína incrementa, en los primeros minutos, el ritmo cardiaco, sin embargo, los efectos suelen ser reversibles. Corotto y colaboradores (2010), determinaron el efecto de tres concentraciones de cafeína, nicotina y etanol en el ritmo cardiaco de Daphnia magna comprobando que el etanol al 5 y 10 % reduce el ritmo cardiaco de entre ~50 y ~20 % del valor inicial, por el contrario la nicotina incrementa en promedio ~20 % mientras que la cafeína al 0.1, 0.5 y 2 % no muestran un efecto concreto en el ritmo cardiaco. Fraker y Smith (2004), examinaron los efectos de tres contaminantes orgánicos provenientes de aguas de desecho; cafeína, acetaminofén y triclosan en el nivel de actividad, supervivencia y crecimiento de la rana leopardo (Rana pipiens). En los experimentos con acetaminofén no se observó ningún efecto en la actividad, respuesta al estímulo, supervivencia o masa final. Con triclosan tuvieron menos actividad que el control, baja supervivencia y baja respuesta al estímulo, mientras que los organismos bajo el efecto de cafeína mostraron la mayor actividad. Con estos datos los investigadores concluyen que la presencia de contaminantes afectan de manera ecológica a los organismos ya que tienen efectos fisiológicos y de comportamiento. Martínez y colaboradores (2014), obtuvieron dos poblaciones de Plationus patulus de lugares diferentes, de un sitio remoto en México (SR) y de una zona urbanizada de Rio Grande (RG) para hacer pruebas toxicológicas agudas y crónicas de cuatro sustancias (acetaminofenol, cafeína, fluoxentina y triclosan). Las pruebas agudas mostraron que ambas poblaciones son más sensibles a fluoxentina. La exposición crónica a acetaminofenol (10, 15 y 20 mg L-1) inhibió el crecimiento poblacional de los organismos de SR mientras que el crecimiento de RG fue inhibido solo por las concentraciones de 15 y 20 mg L-1. En cuanto a la cafeína, ambas poblaciones tuvieron un efecto de inhibición en concentraciones de 200 y 300 mg L-1. Ferreira (2005), evaluó la concurrencia de cafeína, su extensión y la influencia en comparación con otros parámetros de calidad de agua como microbiológicos y físico-químicos. Como resultado el investigador pudo observar que el exceso de nutrientes como el fósforo, nitrógeno y materia orgánica causa la eutrofización del agua y niveles bajos de oxígeno disuelto lo que afecta a la fauna acuática. La cafeína fue detectada en todas las muestras donde se encontraba en concentraciones entre 160 y 357 µg L-1. García-García y colaboradores (2007), probaron la respuesta de Brachionus patulus (Plationus patulus) a diferentes concentraciones de plomo (Pb). Realizaron pruebas agudas (CL50) y crónicas (tablade vida, crecimiento poblacional y demografía) en las pruebas de toxicidad se usaron sedimentos y Pb en concentraciones de 0, 0.06 y 0.6 mg L-1. La concentración letal media de Pb B. patulus (P. patulus) fue de 6.15 ± 1.08 mg L-1. Teniendo como resultado un efecto tanto en supervivencia como en la etapa reproductiva, a mayor concentración de Pb hay una diminución mayor en reproducción y supervivencia, de igual manera las variables estadísticas como promedio de vida, expectativa de vida, reproducción bruta y neta, y la tasa de crecimiento poblacional son influenciadas por la concentración del tóxico. García-García y colaboradores (2004), probaron el efecto del cadmio (Cd) en la dinámica poblacional de Moina macrocopa y Macrothrix triserialis (Cladocera) basados en las pruebas preliminares seleccionaron siete concentraciones finales; 0, 0.5, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 y 1.6 mg L-1 de Cd para M. triserialis y 0.0106, 0.0212, 0.0425, 0.085, 0.17 y 0.34 mg L-1 de Cd para M. macrocopa. Los datos muestran que M. triserialis fue más sensible que M. macrocopa, el crecimiento poblacional de M. triserialis se vio afectado por el incremento del cadmio en el medio, el alto nivel de alga contribuye a incrementar el pico de densidad sin embargo eventualmente ambas poblaciones tienden a cero a los ocho días. Estadísticamente, hubo un impacto significativo en ambas poblaciones, sin embargo existe la posibilidad de que el alga reduce el efecto tóxico del cadmio. Justificación En los últimos años han aumentado los niveles y tipos de sustancias xenobióticas y contaminantes emergentes en los sistemas de agua dulce, contaminantes provenientes de agua tratada o descargas de agua de desecho. La legislación ambiental y las normas ecológicas en materia que regulan los límites de contaminación no son tan rigurosas, lo que provoca la incidencia de contaminación regular en ecosistemas acuáticos. Las sustancias reconocidas como contaminantes antropogénicos entran de manera natural a los cuerpos de agua por medio de efluentes de plantas de tratamiento y afectan a la comunidad zooplanctónica, como los rotíferos y cladóceros; estos organismos son altamente sensibles, es por eso que suelen ser usados para bioensayos probando el grado de toxicidad de sustancias comunes en cuerpos de agua. Actualmente se han detectado sustancias conocidas como marcadores antropogénicos, tóxicos que son comunes en cuerpos de agua pero no se saben sus efectos debido a que se encuentran presentes en bajas concentraciones, sin embargo, la incidencia es constante. La cafeína es uno de esos contaminantes se ha detectado en diferentes cuerpos de agua, sin embargo, no se ha probado el daño que puede causar a organismos acuáticos. Hipótesis Si existe una presencia de altas concentraciones de cafeína en el medio, entonces podríamos observar efectos adversos en la reproducción, crecimiento poblacional y supervivencia de Moina macrocopa y Plationus patulus. Objetivos General Evaluar el impacto y la toxicidad de cafeína sobre características demográficas (reproducción, crecimiento poblacional y supervivencia) mediante bioensayos crónicos con cladócero Moina macrocopa y el rotífero Plationus patulus. Particulares Determinar la CL50 de la cafeína sobre M. macrocopa y P. patulus. Evaluar el efecto de las concentraciones sub-letales de cafeína sobre el crecimiento poblacional de M. macrocopa y P. patulus. Cuantificar el efecto de concentraciones sub-letales de cafeína en la supervivencia y reproducción de Moina macrocopa y Plationus patulus. Material y métodos Las dos especies de zooplancton, Moina macrocopa y Plationus patulus, se obtuvieron a partir de una población clonal cultivada en medio EPA y alga verde Chlorella vulgaris como alimento. El medio EPA fue preparado disolviendo 96 mg NaHCO3, 60 mg Ca SO4, 60 mg MgSO4, y 4mg KCL en agua destilada (Weber, 1993). C. vulgaris fue cultivada usando el medio basal Bold (Borowitzka y Borowitzka, 1998). La densidad de alga se estimó usando cámara de Neubauer y microscopio óptico. La cafeína pura (1, 3, 7 – Trimetilxantina) fue obtenida de la cadena comercial SIGMA – ALDRICH. (resgistro del quimico) Para establecer la concentración letal media, se preparó una solución madre con 5 mg de cafeína en 1000 ml de agua destilada, de la cual obtuvimos las diferentes concentraciones de cafeína (25, 50, 100, 150, 200 y 250 mg L-1). Cada tratamiento se estableció en recipientes con 10 individuos y 40 ml de medio EPA, preparado con cafeína en diferentes concentraciones y 0.5x106 céls ml-1 de C. vulgaris incluyendo 4 repeticiones por cada tratamiento y el grupo control. Después de 24 horas de estar expuestos al toxico se hizo un conteo de los organismos para determinar el CL50. El valor de CL50 fue determinado por el Análisis de Probit en el programa estadístico Sigma Plot versión 11. Para el estudio del crecimiento poblacional se incluyeron 10 individuos representantes de una mezcla de la población en 40 ml de EPA con cafeína en diferentes concentraciones (0, 7.5, 15, 30 y 40 mg L-1 para M. macrocopa y 0, 50, 100, 150, 200 y 250 mg L-1 para P. patulus) y 0.5x106 céls ml-1 de C. vulgaris, el conteo de individuos se realizó cada 24 horas para ambas especies. Los experimentos terminaron después de que la densidad poblacional comenzara a declinar. Este dato nos permitió calcular la tasa de crecimiento poblacional por día (r) para cada replica de acuerdo a la siguiente ecuación (Krebs, 1985): 𝑟 = (ln 𝑁𝑡 − ln 𝑁0) / 𝑡 Donde: 𝑟 = tasa de crecimiento poblacional 𝑁0 = densidad inicial 𝑁𝑡 = densidad final (ind. ml-1) 𝑡 =tiempo en días En cuanto a la tabla de vida, se tomaron cohortes de 10 neonatos, los cuales fueron distribuidos al azar en 40ml de medio EPA, preparado con cafeína en las diferentes concentraciones establecidas y 0.5x106 cels ml-1 de C. vulgaris, los conteos se realizaron cada 24hrs para M. macrocopa y cada 12 horas para P. patulus. De acuerdo a los datos colectados obtuvimos parámetros demográficos como supervivencia, esperanza de vida, variables reproductivas, fecundidad, tasa reproductiva neta y bruta, tiempo generacional y tasa intrínseca de crecimiento poblacional. Supervivencia (lx): 𝑙𝑥 = 𝑛𝑥 𝑛0 Dónde: 𝑛𝑥 = sobrevivientes 𝑛0 = Numero inicial de individuos Promedio de vida (Lx): 𝐿𝑋 = 𝑛𝑥 1 + 𝑛𝑥 2 2 Esperanza de vida (ex): 𝑒𝑥 = 𝑇𝑋 𝑛𝑥 Tasa de reproducción bruta (R): 𝑅 = ∑ 𝑚𝑥 ∞ 0 Tasa de reproducción neta (R0): 𝑅0 = ∑ 𝑙𝑥 . 𝑚𝑥 ∞ 0 Tiempo generacional (T): 𝑇 = ∑ 𝑙𝑥 . 𝑚𝑥 𝑥 𝑋 𝑅0 Tasa de crecimiento poblacional (r): ∑ 𝑒− 𝑟 𝑥 . 𝑙𝑥 𝑚𝑥 𝑛 𝑥=𝑤 = 1 Donde lx = supervivencia a una edad x (días), mx = reproducción hembra a una edad x, Tx = número de individuos de una edad x a la máxima edad, nx = número de individuos vivos a la edad x (Krebs 1985). Los datos obtenidos de tabla de vida y crecimiento poblacional fueron debidamente graficados y analizados utilizando el programa Sigma Plot versión 11. Las diferencias significativas en el crecimiento poblacional y en aspectos de tabla de vida de los organismos fueron evaluadas mediante un análisis de varianza de una vía (ANDEVA) y para las comparaciones múltiples se usó la prueba post hoc (Tukey) utilizando el programa Sigma Plot versión 11. Figura 3. Cuadro de material y métodos Resultados Concentración Letal Media (CL50) Debido a las pruebas agudas con 24 h de exposición a la cafeína pudimos obtener datos como la concentración letal media, para cada una de las especies teniendo como resultado una CL50 de 141 mg L-1 para Moina macrocopa y en concentraciones mayores a 500 mg L-1 de cafeína no se observa mortalidad en 24 h para Plationus patulus. Crecimiento poblacional De acuerdo alas pruebas crónicas se observó un decremento en el número de individuos de ambas especies, las curvas de crecimiento poblacional de M. macrocopa y P. patulus se vieron afectadas por la presencia de cafeína teniendo un efecto negativo, lo cual ocasionó una disminución en el número de individuos con respecto al tiempo en comparación con el grupo control. Conforme se incrementó la concentración de cafeína, el número de individuos descendió. Se observó que en una población de M. macrocopa sin presencia de cafeína, como el grupo control, los organismos tuvieron un pico de aumento de número de individuos alrededor del día siete y del día 13, sin embargo, los tratamientos que tuvieron una concentración mayor a 7.5 mg L-1 de cafeína tuvieron un pico de crecimiento poblacional importante, el cual no ascendió a más de 100 individuos, es decir, el número máximo de individuos fue menor en los tratamientos donde hubo cafeína, el número de organismos descendió en la mitad de tiempo, cerca de los ocho días, en comparación con el grupo control en el cual la población comenzó a decaer posterior al día 16 (Figura 4). Para el rotífero P. patulus se pudo observar que el tratamiento con 50 mg L-1 mantuvo una densidad poblacional baja en comparación con el tratamiento testigo, el cual alcanzó la densidad máxima en el día 16. El número de individuos que alcanzó el tratamiento con tóxico estuvo un 35 % por debajo del número máximo de individuos del grupo control. Para el caso de los demás tratamientos, se pudo observar que el número de individuos no incrementó, lo que ocasionó que la población siempre se mantuviera con un número menor a diez individuos, de tal manera que estas concentraciones afectaron gravemente a los individuos propiciando la no reproducción y la muerte anticipada alrededor de los primeros cinco días en los tratamientos con mayor concentración de tóxico, mientras que en el tratamiento testigo el decaimiento de la población comenzó posterior al día 20 (Figura 5). Figura 4. Curvas de crecimiento poblacional de M. macrocopa expuesta a diferentes concentraciones de cafeína durante 16 días. Los valores representan el promedio y el error estándar basados en cuatro repeticiones en un volumen 50 ml. 120 CONTROL 7.5 mg L-1 100 80 60 40 20 -ro O ...... O ~ 120 ro 15mgL-1 30 mg L-1 e 100 O .C) 80 ro .o 60 O o. "O 40 ro "O 20 C/) e O ID O O 2 4 6 8 10 12 14 16 120 100 40 mg L-1 Tiempo (días) 80 60 40 20 O O 2 4 6 8 10 12 14 16 Tiempo (días) Figura 5. Curvas de crecimiento poblacional de P. patulus expuesto a diferentes concentraciones de cafeína durante 30 días. Los valores representan el promedio y el error estándar basados en cuatro repeticiones en un volumen de 50 ml. 30 CONTROL 50 mg L- 1 25 20 15 10 5 .- O ro ...... .8 30 100 mg L-1 150 mg L-1 -- ro 25 e o .- 20 Ü .25 15 O Q. 10 "O ro 5 "O (/) O e ID O 30 200 mg L-1 250 mg L-1 25 20 15 10 5 O O 5 10 15 20 25 30 O 5 10 15 20 25 30 Tiempo (días) Tiempo (días) Supervivencia (lx) y fecundidad (mx) En la figura 6 se muestran las gráficas relacionadas con la supervivencia y la fecundidad de M. macrocopa bajo el efecto de la cafeína en diferentes concentraciones, donde se puede observar que esta especie se vio afectada tanto en la supervivencia como en la reproducción incluso es evidente la preferencia de los organismos a invertir energía en supervivencia que en reproducción. La tendencia de los organismos que se encuentran bajo el estímulo de más de 15 mg L-1 de cafeína es disminuir su supervivencia, debido a que en las concentraciones más altas el promedio de supervivencia se redujo a partir del día dos y los organismos tuvieron una longevidad máxima de ocho días, mientras que en el tratamiento testigo comenzó a disminuir a partir del cuarto día y los individuos sobrevivieron hasta el día 16. En cuanto a la fecundidad, fue muy notorio que los organismos se vieron afectados por el tóxico debido a que el número de neonatos de los tratamientos con una mayor concentración de cafeína fue menor a un 66 % aproximadamente en comparación al grupo control, por ejemplo, el tratamiento de 40 mg L-1 mostró un número máximo de neonatos de aproximadamente tres organismos en el día siete, mientras que el grupo testigo tuvo un máximo de nueve neonatos en el día 12. En los tratamientos con menor cantidad de tóxico, de igual manera se pudo observar que la reproducción del grupo control y del tratamiento con 7.5 mg L-1 de cafeína comenzó cerca del tercer día y continúo así hasta el fin de su ciclo de vida, sin embrago en los demás tratamientos el inicio de la reproducción se vio afectado por ejemplo, en los tratamiento de 30 y 40 mg L-1, la reproducción comenzó en el séptimo día y solo se extiende hasta el octavo o noveno día (Figura 6). Los efectos del tóxico sobre la reproducción y supervivencia de P. patulus se muestran en la figura 7 donde se puede observar que la supervivencia fue afectada debido a que el número de días que los organismos se pueden sobrevivir bajo la influencia de la cafeína se reduce aproximadamente el 50 % del tiempo en comparación al tratamiento testigo, los organismos que no estuvieron en contacto con el tóxico tuvieron una supervivencia mayor a 20 días, mientras que los demás tratamientos tuvieron una supervivencia no mayor a los diez días. En cuanto a la reproducción, al igual que la supervivencia, se redujo tanto en tiempo como en el número de neonatos, los organismos se reprodujeron en menor cantidad, en el grupo control el primer pico máximo de neonatos se registró en el día seis, mientras que en el tratamiento con 50 mg L-1 de cafeína se reportó en el día diez, por el contrario en el tratamiento con 250 mg L-1 no se observó un registro claro de reproducción (Figura 7). Figura 6. Supervivencia y fecundidad de M. macrocopa con diferentes concentraciones de cafeína. Media y error estándar obtenidos de cuatro repeticiones en un volumen de 50 ml. CONTROL 12 CONTROL 1 ,0 0,8 9 0 ,6 6 0,4 0,2 3 0 ,0 O 7.5 mg L-1 12 7.5 mg L-1 1 ,0 0,8 9 0,6 6 0,4 ---~ 0,2 ~3 ~ , 0 ,0 ~ O ..o E --- 15mgL-1 0)12 15 mg L-1 x 1 ,0 ..c ........- en ro 0 ,8 O 9 'ü ...... C 0 ,6 ro O) c 6 > 0,4 O '2: O) 0,2 ..s 3 O) Cl. "'O :::::¡ en 0 ,0 ro O "'O "'O 30 mg L-1 C 12 30 mg L-1 1,0 :::::¡ ü 0 ,8 .f.9 0,6 6 0,4 0 ,2 3 0,0 O 40 mg L-1 12 40 mg L-1 1 ,0 0 ,8 9 0,6 6 0,4 0 ,2 3 0,0 O O 2 4 6 8 10 12 14 O 2 4 6 8 10 12 14 Edad (días) Figura 7. Supervivencia y fecundidad de P. patulus con diferentes concentraciones de cafeína. Media y error estándar obtenidos de cuatro repeticiones en un volumen de 50 ml. CONTROL 3 CONTROL 1 ,0 0 ,8 2 0 ,6 0,4 1 0 ,2 0 ,0 ° 50 mg L-1 3 50 mg L-1 1 ,0 0 ,8 2 0 ,6 0 ,4 1 0 ,2 -0,0 -r-~ O ~ 3 100 mg L-1 , 1 ,0 ro 100mgL-1 '-..c 0 ,8 E 2 - ID X 0 ,6 ..c. -ro 0 ,4 en 0 1 - (.) ---e 0,2 ro ID e > 0 ,0 0 o -2: ID -S 3 ID 1 ,0 150 mg L -1 150 mg L-1 c.. -o :::J ro en 0,8 :0 2 0 ,6 -o e :::J 0 ,4 (.) 1 ID 0 ,2 ~ 0 ,0 ° 200 mg L-1 3 200 mg L-1 1 ,0 0 ,8 2 0 ,6 0 ,4 1 0,2 0 ,0 ° 250 mg L-1 3 250 mg L-1 1,0 0 ,8 2 0 ,6 0,4 1 0 ,2 0 ,0 ° °5 10 1 5 20 25 ° 5 10 1 5 20 25 Edad (días) Tablas de vida Moina macrocopa no mostró una diferencia estadísticamente significativa (P < 0.05) para promedio de vida, expectativa de vida y tiempo generacional, sin embargo se observó una ligera disminución en los tratamientos con concentraciones mayores a 15 mg L-1, el promedio de vida de los tratamientos con una concentración de cafeína mayor a 15 mg L-1 llego a un máximo de seis días, mientras que en los demás tratamientos se mantuvo con un máximo de ocho días. Se registró una diferencia estadísticamente significativa (P < 0.05) en la tasa bruta y neta de reproducción, donde los dos tratamientos con una mayor concentración de cafeína se vieron drásticamente disminuidos llegando a un mínimo de menos de diez neonatos, mientras que los demás tratamientos, incluido el grupo control tuvieron un máximo de aproximadamente 30 neonatos para la tasa de reproducción bruta, de igual manera en la tasa de reproducción neta los tratamientos más afectados fueron los dos con concentraciones más altas teniendo una disminución de entre 67 % y 89 %. La tasa de crecimiento poblacional también mostró una diferencia estadísticamente significativa (P < 0.05) en concentraciones de 30 y 40 mg L-1 en comparación con el tratamiento control, donde se observó una disminución aproximada del 50 % (Figura 8). En cuanto a las variables de P. patulus se observó que el promedio de vida y la expectativa de vida mostraron una disminución estadísticamente significativa (P < 0.05) en cualquiera de los tratamientos donde los organismos se mantuvieron en contacto con el tóxico, teniendo un mayor efecto en concentraciones más altas de cafeína, donde se disminuyó aproximadamente un 63.64 %. En cuanto a la tasa reproductiva bruta y neta hubo una diferencia estadísticamente significativa (P < 0.05) en comparación al control, donde se observó que la cafeína tuvo un efecto mayor en la reproducción a partir de 150 mg L-1 donde la reproducción bruta tiene una disminución del 92.1 % es decir, el tratamiento sin tóxico tuvo un aproximado de 14 neonatos mientras que el tratamiento de 250 mg L-1 solo un neonato. La tasa de crecimiento poblacional fue una de las variables más afectadas con una diferencia estadísticamente significativa (P < 0.05) debido a que en los dos tratamientos con concentraciones más altas se observó una “r” negativa lo que significa que esa cantidad de tóxico no permitió el crecimiento de organismos (Figura 9). Figura 8. Variables demográficas de tabla de vida de M. macrocopa con diferentes concentraciones de cafeína. Media y error estándar obtenido de cuatro repeticiones. Las letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos. 10 Promedio de vida 10 Expectativa de vida 8 ...-... CJ) ro ,- 6 "'C -"'C ro 4 "'C W 2 8 ...-... CJ) ro ,- 6 "'C -"'C ro 4 "'C W 2 40 Tasa de reproducción bruta 14 a CJ) o 30 ro 20 e o Q.) Z 10 8 6 ~ ~ - 4 o Q. E Q.) 2 i-- ° a b b Tiempo generacional C 7.5 15 30 40 o 12 ~ 10 ~ -CJ) 8 o ro 6 e g 4 Z 2 0,5 - ...-... c~ Q.) ~ 04 E- ' ~ ro g § 0,3 'ü Q.) ro "'C ..c 0,2 ro o CJ) Q. ro 1- 0 ,1 Tasa de reproducción neta a a a a b Tasa de crecimiento poblacional a b b C 7.5 15 30 40 Concentración de cafeína (mg L-1) Figura 9. Variables demográficas de tabla de vida de P. patulus con diferentes concentraciones de cafeína. Media y error estándar obtenido de cuatro repeticiones. Las letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos. 12 10 .--.. CJ) 8 ro ,- "'C -6 "'C ro "'C4 W 2 o Promedio de vida b b b b b 12 10 .--.. CJ) 8 ro ,- "'C - 6 "'C ro "'C 4 W 2 Expectativa de vida a b b b b b 18 Tasa de reproducción bruta 5 Tasa de reproducción neta 16 14 12 CJ) .8 10 ro c:: 8 o Q) 6 Z 4 2 o b b c c 12 Tiempo generacional .--.. 10 ~ ~ - 8 o a. E 6 Q) i- 4 2 o a a b b b C 50 100150200 250 o .--.. ~ , "'C 4 - 3 CJ) o -ro 2 c:: o Q) Z1 0,5 0,4 c~.--.. 0 ,3 Q)' .- "'C 02 E~ ' a b b c c Tasa de crecimiento poblacional ü ro 0 ,1 Q) c:: C3 ' o o, o I--"'=---'" Q) Ü -o 1 ro ' "'C .o -o 2 ro o ' ~ a. -0,3 c 1- -0,4 c -0,5 '---------------- C 50 100150200 250 Concentración de cafeína (mg L-1) DISCUSIÓN Los contaminantes emergentes tienen un efecto adverso en el sistema de diversos organismos, tal es el caso de los invertebrados acuáticos (Daughton y Ternes, 1999) se ha demostrado en muchos bioensayos la sensibilidad de los rotíferos y cladóceros a estas sustancias (Isidori et al., 2005), sin embargo existen pocas publicaciones respecto a los efectos de sustancias antropogénicas. Diversas especies de zooplancton han sido utilizadas como indicadores biológicos en ensayos toxicológicos ya que cumplen con ciertas características como amplia distribución, tolerancia o sensibilidad a sustancias tóxicas entre otras. Los rotíferos son uno de los componentes zooplanctónicos más importantes en los sistemas acuáticos (Snell, 2007). Diferentes especies de rotíferos pertenecientes a la familia Brachionidae, ya han sido utilizadas ampliamente en estudios ecotoxicológicos debido a sus características intrínsecas (Wallace, 2002) y a su sensibilidad a cambios en la calidad del agua (Snell, 2007), la especie Plationus patulus es una especie muy popular en ecotoxicología y ha sido incluida como organismo de bioensayo en la American Society for Testing Materials (ASTM, por sus siglas en inglés) (ASTM, 1991). Se ha demostrado que P. patulus es sensible a metales pesados como plomo (Pb) y cadmio (Cd) (García-García et al., 2007) y a algunos otros contaminantes de diferente orígen como son los productos farmacéuticos, antiinflamatorios y analgésicos comúnmente usados en México (ANAFARMEX, 2010). Los resultados de estos trabajos ayudan a confirmar lo obtenido y observado en esta investigación, donde se probó el efecto de una sustancia de uso común como es la cafeína, demostrando que tiene un efecto negativo en la demografía de P. patulus, ya que al estar en contacto con el tóxico la población no alcanzó su máximo desarrollo debido a la mortandad anticipada de los organismos, y al poco éxito reproductivo. Al igual que este trabajo, se realizó una prueba con cafeína y algunos otros contaminantes como fármacos, en donde se observaron resultados similares a los obtenidos con cafeína y P. patulus, como la sensibilidad de los organismos teniendo tasas de crecimiento poblacional negativas y una baja reproducción (Sarma et al., 2014). En un trabajo previo se demostró que existen diferencias significativas en las tasas de crecimiento poblacional de P. patulus conforme aumentaba la concentración del tóxico, donde se observarón tasas negativas a partir de 200 mg L-1 lo que concuerda con el presente estudio donde las tasas negativas y la inhibición del crecimiento poblacional se observó desde los 100 mg L-1 (Gómez et al., 2014). Se ha documentado la sensibilidad de los cladóceros a tóxicos vertidos en el ambiente, demostrando su eficiencia como indicadores biológicos; por ejemplo, se demostró que Moina macrocopa demuestra sensibilidad a la presencia de cadmio en cuanto a crecimiento poblacional y reproducción (García-García et al., 2004), no solo se han hecho pruebas para demostrar su sensibilidad a metales pesados también existen trabajos que prueban y reportan una alta sensibilidad a fármacos (Sarma et al., 2014) y a sustancias naturales como cianotoxinas (Zamora Barrios et al., 2014). En este ensayo se ha demostrado la sensibilidad de Moina macrocopa a tóxicos comunes como la cafeína, teniendo como resultado efectos adversos tanto en reproducción como en crecimiento poblacional. Estudios previos indicanque Ceriodaphnia cornuta es más resistente a metales pesados como cobre y cadmio en comparación con Brachionus plicatilis (Garatachia-Vargas et al., 2006) en este trabajo se observó claramente que la población de rotíferos es menos sensible a la cafeína que la población de cladóceros, esto claramente indica una respuesta diferente de acuerdo a la clase y el contaminante. Aún no se han evaluado los niveles actuales de cafeína en México, sin embargo, se ha demostrado el efecto de ciertos contaminantes emergentes sobre especies de invertebrados como para otros organismos (Gil et al., 2012). A pesar de que la cafeína tuvo un mayor efecto negativo en los rotíferos la CL50 fue mayor que en los cladóceros, lo que los hace menos sensibles al tóxico, esto concuerda con los antes descrito por Martínez Gómez y sus colaboradores (2014) quienes reportan una CL50 mayor a 250 mg/L-1 para poblaciones de Plationus patulus. Los resultados obtenidos concuerdan con la hipótesis establecida al inicio de esta investigación, dónde se esperaba que a mayor cantidad de cafeína en el medio se puedan observar efectos adversos en la reproducción y supervivencia de ambas especies. Los valores obtenidos para CL50 de ambas especies muestran un alto nivel de tolerancia para P. patulus (>250 mg/L-1) y alto nivel de sensibilidad para M. macrocopa (7.5 mg/L-1) comparado con lo reportado en la literatura para Daphnia magna con 182 mg/L-1 (Waiser et al., 2011). Se ha reportado que la tolerancia a la cafeína es menor en P. patulus en comparación a Brachionus calyciflorus (CL50 1018 mg/L-1 en 24 horas.) (Zarelli et al., 2014). En esta investigación los organismos mostraron tener diferente sensibilidad para el mismo toxico, ya ha sido reportado anteriormente la toxicidad y capacidad de bioacumulación de ciertas sustancias consideradas contaminantes antropogénicos, lo que ha provocado efectos adversos en especies de invertebrados, así como en otros organismos (Gil et al., 2012), con este trabajo y otras investigaciones se ha demostrado el efecto negativo de la cafeína sobre las tasas de crecimiento de ambos organismos, además de reducir su supervivencia y capacidad reproductiva, especialmente mientras se incrementó el tiempo de exposición en dosis altas esto concuerda con lo antes sugerido por investigadores como Daughton y Ternes (1999) quienes mencionaron la posibilidad de que ciertos tóxicos en concentraciones altas pueden llegar a ser letales. En la naturaleza las concentraciones de cafeína en aguas residuales van μg·L-1 a ng·L-1, lo que está por debajo de la concentración letal media de zooplancton (Vryzas et al., 2008; Knee et al., 2010), sin embargo, en concentraciones naturales y con tiempos de exposición largos podrían tener efectos negativos a largo plazo en las poblaciones de organismos tanto invertebrados como peces debido a la exposición prolongada (Sarma et al., 2014). Los resultados de la exposición crónica a cafeína muestran una inhibición en la reproducción de ambas poblaciones, baja producción de huevos y el incremento de desapego a los huevos lo que provoca un decremento en el crecimiento poblacional, dichas observaciones concuerdan con lo obtenido por Gómez y colaboradores en 2014. Si bien las concentraciones de cafeína utilizadas en esta investigación son mayores y un poco alejadas de las concentraciones reales encontradas en cuerpos de agua, es bien sabido que los contaminantes emergentes no están en el medio como químicos aislados, sino como una mezcla de muchos químicos, cuales generan un efecto distinto al que se obtiene solo con un toxico (Gómez et al., 2014). Muchos tóxicos se encuentran juntos en cuerpos de agua naturales y sus efectos pueden ser sinérgicos o antagónico (Santos et al., 2010). En un estudio de toxicidad aguda con Daphnia magna expuesta a una mezcla de fluoxetina y ácido clofíbrico causando una mortalidad significativa y malformación, mientras que en las mismas concentraciones pero con los tóxicos separados no se observan efectos (Gómez et al., 2014) estas observaciones confirman que la mezcla de tóxicos puede generar efectos adicionales. Es de gran importancia hacer estudios crónicos y agudos para determinar los efectos y el impacto que los contaminantes pueden provocar en el sistema acuático, algunas recomendaciones para investigaciones futuras incluyen pruebas con mezclas de químicos en ensayos crónicos y generacionales. Se ha registrado anteriormente el efecto de metales pesados a través de generaciones F1 Y F2 como el mercurio causando anormalidades en hembras (Wescott et al., 2011) lo cual concuerda con lo obtenido en un ensayo con el fármaco Vinclozolin donde de igual manera se encontraron anormalidades en hembras y en los neonatos de la F1 (Alvarado-Flores et al., 2015). El monitoreo constante de varios tóxicos debería incluir a la cafeína en cuerpos de agua en México, especialmente los que son rellenados con agua de desecho parcialmente tratada. CONCLUSIONES La cafeína es una sustancia de uso común en México, además que se encuentra en forma natural, sin embargo muestra un efecto negativo en la demografía de Moina macrocopa y Plationus patulus. De acuerdo a los resultados se observa un efecto negativo en tasas de crecimiento, abundancia máxima y tasas de reproducción de ambas poblaciones. Debido a esta y más investigaciones relacionadas con la cafeína, se considera dañina para organismos acuáticos, por lo cual es importante un monitoreo constante para estas y más sustancias. REFERENCIAS Alvarado-Flores J., Rico-Martínez R., Adabache-Ortíz A. & Silva-Briano. (2015). Morphological alterations in the freshwater rotifer Brachionus calyciflorus Pallas 1766 (Rotifera: Monogononta) caused by vonclozolin chronic exposure. Ecotoxicology (2015) 24:915-925 DOI 10.1007/s10646-015-1434-8. American Public Health Association. (2015). APHA. Revisado 13 Octubre 2015 en https://www.apha.org/. American Society for Testing Materials (2015). 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