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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO MAESTRIA EN MICROBIOLOGIA Panagrellus redivivus como indicador ecotoxicológico de aguas. TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE MAESTRIA EN MICROBIOLOGIA PRESENTA: ADRIANA LUCILA GARULO FUENTES TUTORES D. EN C. ENRIQUE SALAS TELLEZ FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN C-4 DRA. EN C. MARIBEL QUEZADA CRUZ UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE TECÁMAC CUAUTITLÁN IZCALLI, SEPTIEMBRE 2016. UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. ABSTRACT ...................................................................................................................................... 1 RESUMEN ...................................................................................................................................... 2 1.0. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 3 2.0 JUSTIFICACIÓN ......................................................................................................................... 6 3.0. MARCO TEÓRICO .................................................................................................................... 7 3.1. Contaminación del agua por nitratos ................................................................................... 7 3.1.1. Fuentes de nitratos vinculadas a la Actividad Humana .................................................. 7 3.1.2. Enfermedades relacionadas a la ingestión de nitratos ................................................... 9 3.1.2.1. Metahemoglobinemia (cianosis infantil). ................................................................... 9 3.1.2.2. Carcinogénesis ..................................................................................................... 10 3.2. Contaminación del agua por metales pesados. .................................................................. 10 3.2.1. Daños por plomo ........................................................................................................ 12 3.2.2. Daños por otros metales pesados, entre ellos el Zinc. ................................................. 13 3.3. Ensayos de toxicidad ......................................................................................................... 15 3.3.1. Toxicidad aguda .......................................................................................................... 15 3.3.2. Toxicidad crónica: ....................................................................................................... 15 3.4. Bioindicadores y/o Biomonitores ....................................................................................... 16 3.4.1. Microorganismos utilizados como bioindicadores y/o biomonitores ........................... 18 3.5. Panagrellus redivivus ......................................................................................................... 22 3.5.1. Descripción general de los nematodos ........................................................................ 24 3.5.2. Características Panagrellus redivivus ........................................................................... 24 3.5.3. Ciclo de vida. .............................................................................................................. 26 3.5.4. Hábitat. ...................................................................................................................... 27 3.5.5. Crecimiento de Panagrellus redivivus. ......................................................................... 27 4.0. ANTECEDENTES (estado del arte) .......................................................................................... 28 5.0. OBJETIVOS ............................................................................................................................ 34 6.0. HIPÓTESIS ............................................................................................................................. 34 7.0. METODOLOGÍA ..................................................................................................................... 34 7.1.1. Obtención de los organismos estadío J2......................................................................... 35 7.1.2. Control del cultivo .......................................................................................................... 36 7.2. Determinación de características físicas (tinción simple). .................................................. 36 7.2.1. Determinación del contenido de proteína. .................................................................. 37 7.2.2. Prueba de toxicidad en presencia de N-NO3 ................................................................ 37 7.2.3. Prueba de toxicidad en presencia de metales pesados. ............................................... 40 7.2.4. Prueba de medición del crecimiento ........................................................................... 40 7.2.6. Inhibición y diferencia del crecimiento. ....................................................................... 42 7.2.6. Maduración ................................................................................................................ 43 8.0. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................................... 44 8.1. Selección del medio de cultivo. .......................................................................................... 44 8.2 Determinación de características físicas (tinciones). ........................................................... 45 8.3. Prueba toxicológica en presencia de N-NO3 ....................................................................... 47 8.3.1. Medición de la sobrevivencia ...................................................................................... 47 8.3.2. Medición del crecimiento ........................................................................................... 48 8.4. Prueba toxicológica en presencia de plomo y zinc.............................................................. 53 8.4.1. Medición de la sobrevivencia en Pb y Zn ..................................................................... 53 8.4.2. Medición del crecimiento y maduración en Pb y Zn .................................................... 57 9.0. CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 63 10.0. RECOMENDACIONES ........................................................................................................... 64 BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 65 ANEXOS ....................................................................................................................................... 71 INDICE DE FIGURAS Figura 1. Morfología de macho y hembra de Panagrellus redivivus .............................................. 25 Figura 2. Metodología para la prueba de toxicidad ..................................................................... 398 Figura 3. Metodología parala pruebe de toxicidad. (Continuación) .............................................. 39 Figura 4. P. redivivus en presencia de tóxico (Rojo Congo) ........................................................... 46 Figura 5. Crecimiento de P. redivivus en presencia de nitratos ..................................................... 49 Figura 6. Concentración letal de nitratos para P. redivivus.8.3.3. Medición de la maduración. ...... 51 Figura 7. Concentración letal de plomo en P. redivivus ................................................................. 55 Figura 8. Concentración letal de Zn en P. redivivus ....................................................................... 56 Figura 9. Crecimiento de P. redivivus en presencia de plomo ....................................................... 58 Figura 10. Crecimiento de P. redivivus en presencia de Zinc ......................................................... 60 INDICE DE TABLAS Tabla 1. Listado de especies candidatas de ambientes dulceacuícolas .......................................... 19 Tabla 2. Listado de especies candidatas de ambientes salobres y marinos .................................... 20 Tabla 3. Listado de especies candidatas de ambientes terrestres ................................................. 21 Tabla 4. Comparación proteíca de P. redivivus en diferentes sustratos ........................................ 45 Tabla 5. Porcentaje de sobrevivencia de P. redivivus en presencia de nitratos ............................. 47 Tabla 6. Diferencia significativa del crecimiento entre el control y el tóxico (nitratos) .................. 50 Tabla 7. Diferencia significativa de la maduración entre el control y el tóxico (nitratos)................ 52 Tabla 8. Sobrevivencia del nematodo en presencia de plomo ....................................................... 54 Tabla 9. Sobrevivencia del nematodo en presencia de zinc ........................................................... 56 Tabla 10. Diferencia significativa de crecimiento y maduración en presencia de Pb ...................... 57 Tabla 11. Diferencia significativa en crecimiento y maduración en presencia de Zn ...................... 59 1 ABSTRACT The management of wastewater from different industries in Mexico has been a constant problem, most of the human, animal and industry wastes are generally poured into static or moving water bodies, then, most of these waters are used for irrigation in agriculture without any treatment. The proximity of aquifers, rivers or wells to the contaminated waters allows the contamination of it for simple contact or filtration, and any living population is susceptible to acquire a myriad of diseases with different etiologies. The presence of various pollutants such as nitrates, pesticides, heavy metals and hydrocarbons, among others, require the analysis to avoid damages. However, it is not economically feasible to determine the toxicity of all substances in contaminated water. Assays for identifying toxic inorganic pollutants provide results using biological agents useful for the protection of public health. Therefore, the aim of this study was to determine the feasibility of using Panagrellus redivivus as bioindicator of water pollution by nitrates and heavy metals (lead and zinc) in a research period of 96 hours. Two culture media were tested for growth of microworm (bread + yeast, and oat + yeast) to get the best massive culture of microworm. Different dyes were tested to obtain the best stain and to observe adequately to P. redivivus. A bioassay was performed, it involved the exposure of P. redivivus to the test samples prepared in the laboratory and the biological effects were determined by measuring the survival, growth and maturation in each problem group and the control. The medium yeast-oatmeal was the best to get Panagrellus redivivus massive growth. The Congo red and methylene blue were the appropriate dyes to look clearly and definitely the microworms. The goals set at the beginning of this project were successfully achieved, it is feasible to use Panagrellus redivivus as bioindicator of pollution by nitrates, lead and zinc. For higher concentrations of nitrate 30 mg / L N-NO3 and for lead and zinc to a concentration of 0.05 mg lead / L and 10 mg Zn / L. In addition to that, the tests are cheap, accessible and easy to carry out in the laboratory, which allow to see the P. redivivus as a potential microworm to be considered as a good bioindicator of contamination. 2 RESUMEN El manejo de las aguas residuales de diferentes industrias en México ha sido un problema constante ya que la mayoría, son empleadas sin previo tratamiento para riego en la agricultura. La cercanía de mantos acuíferos, ríos o pozos potables con estas aguas contaminadas permiten por simple contacto o filtración la contaminación del agua potable, y cualquier población de seres vivos es susceptible de adquirir un sin fin de enfermedades con diversas etiologías. La presencia de diversos contaminantes como nitratos, plaguicidas, hidrocarburos y metales pesados entre otros, hace necesario el análisis de las mismas para evitar daños masivos. Sin embargo, es poco viable, económicamente hablando, el determinar la toxicidad de todas las sustancias que aparecen en el agua contaminada. Los ensayos que utilizan agentes biológicos proporcionan resultados útiles para la protección de la salud pública. Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue determinar la factibilidad de utilizar Panagrellus redivivus como bioindicador de contaminación de agua por nitratos y metales pesados (plomo y zinc). Se probaron dos medios para crecimiento del microgusano (uno de pan más levadura y otro de avena más levadura) para obtener el mejor cultivo masivo del microgusano. Se probaron diferentes colorantes para obtener la mejor tinción y observar de manera adecuada a Panagrellus redivivus. Se llevaron a cabo bioensayos que consistieron en la exposición de Panagrellus redivivus a concentraciones de 5 a 50 y control negativo mg/L N-N03, de 0.01 a 0.8 mg/L de plomo y control negativo, de 3 a 10 mg/L de Zinc y control negativo. Se determinaron los efectos biológicos a través de la medición de la sobrevivencia, crecimiento y maduración en cada uno de los grupos problema y el control. El medio avena-levadura fue el más adecuado para obtener un mejor crecimiento masivo de Panagrellus redivivus. El rojo Congo fue el colorante adecuado para observar de manera más clara y nítida al microgusano. En el caso de nitratos se tuvo diferencia significativa en sobrevivencia a una concentración de 37 mg/L N-N03 (Nitrógeno en forma de nitrato) y en crecimiento y maduración a concentraciones superiores a 5 y 10 mg/L N-N03 respectivamente. Para plomo se tuvo diferencia significativa en sobrevivencia a una concentración superior a 0.01 mg/L y para crecimiento y maduración con concentraciones de 0.01 y 0.03 mg/L respectivamente. Para zinc, la diferencia significativa en sobrevivencia fue a una concentración superior a 5 mg/L y para crecimiento y maduración se tuvo diferencia significativa en todas las concentraciones probadas (3, 4, 5 y 10 mg/L). Panagrellus redivivus se puede utilizar como bioindicador de efectos subletales en presencia de contaminación por nitratos, plomo y zinc ya que presentó sensibilidad ante estos contaminantes. 3 1.0. INTRODUCCIÓN El agua es la vida del planeta. Por ello, luchar por recuperar la salud de nuestros ríos, lagos y humedales es luchar por la salud y la vida de los pueblos que habitamos. Actualmente se estiman en más de 1100 millones las personas que no tienen garantizado el acceso al agua potable; y como consecuencia de ello, unas 10 000 mueren cada día, en su mayoría niños, al ser ellos los más vulnerables. Frente a esta situación, desde las institucioneseconómicas y financieras internacionales, se viene promoviendo un modelo de globalización basado en el libre mercado que propugna la mercantilización del medio ambiente, de los servicios y patrimonios ambientales y en particular de los servicios públicos de agua y saneamiento (Arrojo, 2006). Biológicamente el agua constituye el medio esencial para el desarrollo de los procesos químicos que se producen en el interior de los seres vivos (metabolismo). Todos los organismos contienen agua como principal elemento constituyente de su cuerpo, desde un 50% en algunos insectos hasta más del 90% en las medusas y en los seres humanos existe un 65 a 75% de agua. Geológicamente, el agua surgió en la Tierra por condensación de las nubes de vapor de la atmósfera primitiva que al caer enfrió poco a poco la corteza del planeta. Constituye uno de los principales agentes modeladores de la morfología terrestre y actúa como medio en el que se producen reacciones químicas y como elemento erosionador por su acción mecánica. En su mayor parte (98.72%) se encuentra en los mares en forma líquida; el resto se distribuye entre los hielos polares, ríos, lagos y el vapor de la atmósfera. Químicamente el agua es un compuesto formado por dos átomos de hidrógeno y uno de oxígeno que constituyen una molécula polar, alcanza el punto de ebullición a los 100° C y a los 0° C el de congelación. Tiene un calor específico alto, por lo que conserva muy bien el calor y es un mal conductor de la corriente eléctrica. El agua es una sustancia inodora, insípida e incolora en pequeñas cantidades y verdosa azulada en grandes masas. Su fórmula química es (H2O). Todos los seres vivos vertebrados o invertebrados, vegetales y animales en el planeta Tierra deben su existencia al agua. El agua es esencial en toda célula, es el medio donde se disuelven todos los elementos sólidos y se producen las reacciones químicas. El agua es imprescindible para la digestión ya que la desintegración de los hidratos de carbono, proteínas y grasas necesitan de agua. El agua disuelve los desechos, regula el 4 metabolismo y distribuye el calor orgánico, a la vez que enfría el cuerpo con el sudor. El promedio de agua perdida por un ser humano al día es de dos litros, aunque varía según el clima y las actividades. El ser humano puede vivir muchas semanas sin alimentos pero sin agua sólo unos días por lo que el agua perdida por el cuerpo debe ser reemplazada prontamente. Los vegetales, las frutas y otros alimentos contienen aproximadamente el 95% de agua. El agua es esencial, sin embargo si se encuentra contaminada, afecta a todos los seres vivos y el medio ambiente; se contamina con compuestos como ácidos, bases, aromáticos, colorantes y metales pesados (Ortega, 2004). Los nitratos son el contaminante más conocido debido a la contaminación de agua subterránea, producto de la fertilización excesiva en tierras cultivables de forma orgánica e inorgánica o de la inadecuada disposición de las aguas residuales, tanto industriales como domésticas las cuales son vertidas en cuerpos de agua que posteriormente se utilizan como riego, se ha constituido en un problema de salud pública en los países considerados desarrollados y en vías de desarrollo sobre todo en la población infantil y en comunidades cercanas a áreas agrícolas (Larios, 2009). Contaminación del agua por metales pesados. Los altos niveles de metales pesados como plomo, níquel, cadmio y manganeso, presentes en agua negras utilizadas para riego agrícola, pueden acumularse en los suelos, estos sistemas de suma importancia para la agricultura. Por su carácter no biodegradable, la toxicidad que ejercen sobre los diferentes cultivos y su biodisponibilidad, puede resultar peligrosa. Los metales pesados son de cuidado porque tienden a bioacumularse en diferentes cultivos. La bioacumulación significa un aumento en la concentración de un producto químico en un organismo vivo en cierto plazo de tiempo, comparada a la concentración de dicho producto químico en el ambiente. Algunos metales pesados son esenciales para mantener un correcto metabolismo en los seres vivos y en particular en el cuerpo humano. Sin embargo, en concentraciones más altas pueden conducir al envenenamiento (Prieto et al., 2009). Para detectar contaminantes en el agua se han diseñado diferentes métodos y técnicas entre los que se encuentran la espectrofotometría de absorción atómica, 5 espectofotometría de plasma de acoplamiento inductivo o colorimétricos, los cuales al ser utilizados para la realización de análisis son de muy alto costo y se requiere personal altamente calificado para la interpretación. En la actualidad, en México, los parámetros establecidos para la vigilancia y control de la contaminación de descargas de aguas residuales, se basan en la medición de contaminantes individuales que no representan el potencial toxicológico de las mismas, y proporciona información de poca utilidad para la protección del ambiente. Es por ello que se ha considerado el desarrollo de métodos de evaluación biológica de la toxicidad (Pica et al., 2000). El uso de estos micrométodos toxicológicos con invertebrados representa una reducción significativa en costo tiempo y espacio de experimentación (Aoki et al., 2005). Se están desarrollando técnicas alternativas (Bioensayos), relativamente sencillas y económicas a partir de la reproducción de microorganismos acuáticos, los cuales modifican su ciclo de vida normal al ser afectados con determinados compuestos presentes en el agua contaminada. El principal valor de estos métodos radica en su capacidad para evidenciar la toxicidad resultante de las interacciones de los innumerables constituyentes que componen a las descargas, característica que ha contribuido a su amplia aceptación en diversos sectores de la investigación y agencias responsables de la contaminación ambiental. Esta cualidad, hasta el momento es exclusiva de los métodos biológicos de evaluación toxicológica, los cuales proporcionan una medición holística de la toxicidad y permiten hacer pronósticos de mayor certidumbre sobre el riesgo ambiental (Pica et al., 2000). Una de las especies utilizadas para este tipo de evaluaciones de toxicidad es un nematodo acuático de vida libre denominado Panagrellus redivivus, en los ensayos de toxicidad aguda no se asocian con el contenido de los contaminantes, sin embargo, se observa efecto tóxico crónico sobre el crecimiento y maduración del nematodo (Salazar, 2008). 6 2.0 JUSTIFICACIÓN El agua es un elemento esencial para todos los seres vivos, ya que de ésta depende la vida. La disponibilidad y acceso al agua potable segura previene enfermedades, lo esperado es que se encuentre libre de bacterias peligrosas, metales tóxicos disueltos o productos químicos dañinos, lo que ha despertado el interés y ocupación de científicos, tecnólogos y gobernantes en todo el mundo ya que es importante mantenerla apta para el consumo humano y animal, así como para la agricultura y piscicultura (Arrojo, 2006). El agua procedente de la industria minera, la de recubrimientos metálicos, las fundidoras, los cultivos agrícolas masivos, las producciones pecuarias intensivas y otras más, contaminan el agua con diversos compuestos químicos como son los nitratos, las sales de metales con plomo, zinc, mercurio, plata, níquel, cadmio y arsénico que son tóxicas para la flora y fauna tanto terrestre como acuática (Jiménez, 2001). Debido a la poca viabilidad económica para determinar la toxicidad específica de cada una de las sustancias contaminantes presentes en el agua por los métodos convencionales como lo son la cromatografía o espectrofotometría es necesario implementar alternativas que permitan determinar la concentración de dichas sustancias a un costo mucho menor (aunque no pueden sustituira las pruebas antes mencionadas dada la precisión de éstas) y que además proporcionen una visión integral de la afección de un pequeño ecosistema. Los ensayos de toxicidad se emplean con diferentes fines como es, el establecimiento de concentraciones aceptables de diferentes parámetros o la determinación del cumplimiento de la legislación, entre otras, y proporcionan resultados útiles para la protección de la salud pública y de la vida acuática, frente al impacto causado por la introducción de contaminantes en las aguas. Así surgen los bioensayos de toxicidad de los efluentes globales mediante la utilización de organismos vivos para la observación de cambios en su desarrollo o metabolismo normal. Una especie viable a ser utilizada en este tipo de bioensayos es el nematodo Panagrellus redivivus. Éste se ha empleado en pruebas de sensibilidad en el medio acuático para diversos contaminantes como los metales pesados, plaguicidas, fertilizantes, mezclas orgánicas, sedimentos urbanos y descargas industriales (Pica et al., 2000). http://www.miliarium.com/Paginas/Prontu/Tablas/Aguas/ContaminantesAgua.htm 7 3.0. MARCO TEÓRICO El agudo deterioro de los ecosistemas impone a la sociedad adoptar no sólo medidas de reordenamiento ecológico, sino también hacer estudios que permitan comprender en qué medida y cuáles actividades del hombre contribuyen a tal deterioro y que, al mismo tiempo, ayuden a evaluar si está en peligro la salud del hombre (López et al., 2010). 3.1. Contaminación del agua por nitratos Distribución Natural de los Nitratos Los nitratos presentes tanto en el suelo como en las aguas subterráneas son resultado de la degradación microbiana de sustancias orgánicas nitrogenadas (como proteínas) en iones amónicos (NH4+), que luego son biológicamente oxidados hasta convertirse en nitritos y nitratos en un proceso de dos etapas: 2 NH4+ + 2 OH + 3 02 2N02 + 2 H+ + 4 H20 (1) 2 N02- + 02 2 N03- (2) Las anteriores dos reacciones son realizadas por diferentes bacterias: de la reacción (1) se encargan las nitrosomonas; y de la reacción (2) las nitrobacterias. Ambos organismos son quimolitótrofos aeróbicos (Madigan et al., 1984). 3.1.1. Fuentes de nitratos vinculadas a la Actividad Humana Las principales fuentes de nitratos en la zona rural son las relativas a los desechos de granjas y a ciertas prácticas de evacuación de excretas humanas. Los desechos animales son ricos en sustancias nitrogenadas que pueden convertirse en nitratos, y este problema se agudiza cuando las actividades pecuarias son de producción intensiva. La cantidad de nitrógeno en los desechos humanos se calcula en unos 5 kg por persona al año. Por otra parte, los iones amónicos de los efluentes se pueden convertir rápidamente en nitratos y penetrar libremente en el subsuelo (Martínez y Skender, 2002; Pacheco et al., 2002). El uso generalizado de fertilizantes en las actividades de producción agrícola intensivas, ha contribuido a elevar las concentraciones de nitratos en las aguas subterráneas 8 situadas debajo de zonas de cultivo (Lewis et al., 1998; Martínez y Skender, 2002; Pacheco et al., 2002; Pérez y Pacheco, 2002 y Larios, 2009). El uso de fertilizantes ha incrementado y modificado algunos compuestos en los suelos; en el caso de los nitrogenados que incluyen los nitratos de amonio (NH4NO3) y de sodio (NaNO3); la urea CO(NH2)2; el fosfato de amonio (NH4H2PO4) y los polifosfatos amónicos, entre otros, aportan al suelo los nutrientes básicos, pero en exceso para el desarrollo de las plantas (Martínez et al., 2010 y Prieto et al., 2009). Los lagos son especialmente vulnerables a la contaminación por nitratos, se genera un proceso llamado eutrificación, que es cuando el agua se enriquece de modo artificial con nutrientes (nitratos y fosfatos), lo que produce un crecimiento anormal de las plantas. Los fertilizantes químicos arrastrados por el agua desde los campos de cultivo pueden ser los responsables. El proceso puede ocasionar problemas estéticos, como mal sabor y olor del agua, y un cúmulo de algas o verdín desagradable a la vista, así como un crecimiento denso de las plantas con raíces, que provoca el agotamiento del oxígeno en las aguas más profundas y la acumulación de sedimentos en el fondo de los lagos, así como otros cambios químicos, tales como la precipitación del carbonato de calcio en las aguas duras. Otro problema cada vez más preocupante es la lluvia ácida, que ha dejado muchos lagos del Norte y Este de Europa así como del Noreste de Norteamérica totalmente desprovistos de vida (Pérez y Pacheco, 2004). El aumento de la población y de los sistemas productivos intensivos ha traído consigo un problema de manejo de excretas y un aumento de la contaminación ambiental. Es así que es imprescindible la aplicación de tecnologías alternativas para superar los inevitables inconvenientes que la producción de residuos genera. La liberación de diversos desechos y contaminantes en el ambiente provoca problemas en la salud pública humana, animal y vegetal, sobre todo cuando hay florecimientos de cianobacterias, que pueden impedir el aprovechamiento de tierras y acuíferos. La calidad de los recursos hídricos para diversos usos se ve afectada en diferentes grados para varias cuencas del país. Las causas del deterioro incluyen entre otras, la descarga a los cursos de aguas superficiales de líquidos de drenaje y pluviales, el vertido de efluentes industriales con nulo o escaso tratamiento, el aporte del arrastre de suelo con contenido de plaguicidas, fertilizantes, vertido de 9 desechos orgánicos pecuarios y otras sustancias, cuyas aguas experimentan cambios físicos y químicos, afectando por consiguiente las distintas comunidades que en ellos viven (Martínez et al., 2010; Pérez y Pacheco, 2002 y Pérez, 2004). La materia orgánica aportada en exceso altera el equilibrio químico natural del agua, al igual que el enriquecimiento de nutrientes inorgánicos como el nitrógeno y fósforo, que tienen como consecuencia un aumento no programado de la producción primaria. (Pacheco et al., 2002 y Jiménez, 2001). 3.1.2. Enfermedades relacionadas a la ingestión de nitratos El uso extensivo de sistemas de saneamiento de disposición local de desechos puede conducir a elevadas concentraciones de nitratos en el nivel friático subyacente. Existen dos tipos de enfermedades cuyo origen tienen relación con el consumo de agua contaminada con elevadas concentraciones de nitratos: 3.1.2.1. Metahemoglobinemia (cianosis infantil). Se trata de una enfermedad que afecta principalmente a los niños pequeños. Las probables consecuencias respecto a la salud de los niños que ingieren cantidades excesivas de nitratos (mayor a 10 mg/L) son un tópico que actualmente es objeto de constante preocupación desde el punto de vista médico La toxicidad del nitrato proviene de su reducción a nitrito, proceso que puede ocurrir bajo condiciones específicas en el estómago y en la saliva. El ión de nitrito que se forma oxida el hierro en las moléculas de la hemoglobina, transformándolo de ferroso (Fe2+) a férrico (Fe3+). La metahemoglobina así producida vuelve a la sangre incapaz de fijar de manera reversible el oxígeno, la cual da como resultado una anoxia y consecuentemente la muerte, cuando tal situación no se corrige a tiempo. Se ha descubierto que las mujeres gestantes que han consumido agua excedida de los límites han presentado abortos espontáneos, es importante enfatizar en que los nitratos son solubles en agua por lo que fácilmente se filtran hasta las fuentes subterráneas de agua y permanecer ahí por décadas (Lewis et al., 1988; Larios 2004 y Larios 2009). 10 3.1.2.2. Carcinogénesis En los últimos años ha aumentado el interés en determinar el riesgode cáncer provocado por el consumo de grandes cantidades de nitratos en el agua potable. Los nitritos (e indirectamente los nitratos) pueden reaccionar con aminas y amidas para formar nitrosaminas y nitrosamidas. Se ha comprobado que la mayoría de estos compuestos son carcinogénicos en un gran número de especies animales, y muchos de ellos han sido considerados mutagénicos. Las evidencias epidemiológicas sugieren que la abundante ingestión de nitratos puede contribuir al surgimiento del cáncer gástrico. Sin embargo, se dispone aún de muy poca información como para afirmar específicamente que existe una relación entre la elevada ingestión de nitratos y algún tipo de cáncer humano (Larios, 2009). 3.2. Contaminación del agua por metales pesados. Los metales pesados pueden incorporarse a un sistema de abastecimiento de agua por medio de residuos industriales que son vertidos sin previos tratamientos, los que posteriormente se depositan en lagos, ríos y distintos sistemas acuíferos (Prieto,2009). Cuando el contenido de metales pesados alcanzan el suelo y alcanzan niveles que rebasan los límites máximos permitidos, causan efectos inmediatos como inhibición del crecimiento y desarrollo de las plantas, un disturbio funcional en otros componentes del ambiente así como la disminución de las poblaciones microbianas del suelo, el término que se usa o se emplea es “polución de suelos” (Prieto et al., 2009). En el suelo, los metales pesados como iones libres, pueden tener acción directa sobre los seres vivos lo que ocurre a través del bloqueo de las actividades biológicas, es decir, la inactivación enzimática por la formación de enlaces entre el metal y los grupos –SH (sulfhidrilos) de las proteínas, causando daños irreversibles en los diferentes organismos. La contaminación en suelos por metales pesados ocurre cuando estos son irrigados con aguas procedentes de desechos de minas, aguas residuales contaminadas de parques industriales, desechos municipales y filtraciones de presas. Los metales pesados contribuyen fuertemente a la contaminación ambiental, la cantidad de metales disponibles en el suelo está en función del pH, el contenido de arcillas, contenido de materia orgánica, la capacidad de intercambio catiónico y otras propiedades que las hacen únicas en términos de manejo de la contaminación. Por otra parte, en lugares donde se han venido 11 utilizando aguas residuales para el riego agrícola, se reporta una tendencia creciente en las concentraciones de metales en los suelos, por efecto en el tiempo (años) de uso de esta agua, donde las cantidades de metal que se extraen y se miden en estos suelos, se han asociado positivamente con el tiempo de uso de agua residual; mostrando una mayor tasa anual de acumulación el níquel (Ni) y plomo (Pb) (Prieto et al., 2009). El término calidad del agua se refiere al grado de salubridad y pureza de ésta para el consumo humano. En muchos países se ha constatado que la actividad agrícola puede afectar la calidad tanto del agua superficial (ríos y lagos) como subterránea (acuíferos). Los contaminantes del agua más importantes, relacionados con la actividad agrícola son los nitratos (NO3 -) y otros agroquímicos. La Environmental Protection Agency (EPA) ha establecido estándares de seguridad para más de 80 contaminantes que pueden encontrarse en el agua y presentan un riesgo a la salud humana. Estos contaminantes se pueden dividir en dos grupos de acuerdo a los efectos que pudiesen causar: Efectos agudos. Los efectos agudos ocurren dentro de unas horas o días posteriores al momento en que la persona consume un contaminante. Casi todos los contaminantes pueden tener un efecto agudo si se consume en niveles extraordinariamente altos en el agua potable, en esos casos los contaminantes más probables que causen efectos agudos son las bacterias y virus. La mayoría de los cuerpos de las personas pueden combatir estos contaminantes microbianos de la misma forma que combaten los gérmenes, y típicamente, estos contaminantes agudos no tienen efectos permanentes. Efectos crónicos. Los efectos crónicos ocurren después que las personas consumen un contaminante a niveles sobre los estándares de seguridad de la EPA, durante muchos años. Entre los ejemplos de efectos crónicos de los contaminantes del agua potable, están el cáncer, problemas hepáticos, renales y dificultades en la reproducción. El riesgo a la salud por contaminación de metales pesados depende principalmente de su nivel de acumulación en el cuerpo. Los riesgos son mayores si el tiempo de exposición del organismo a dicha contaminación es prolongado (Paredes, 2001). 12 3.2.1. Daños por plomo Se consideran entre los metales pesados elementos como el plomo (Pb), cadmio (Cd), cromo (Cr), mercurio (Hg), zinc (Zn), oro (Au) cobre (Cu), plata (Ag) y níquel (Ni), entre otros; algunos de los cuales constituyen un grupo de gran importancia, por ser esenciales para las células , pero en altas concentraciones pueden resultar tóxicos para los seres vivos, organismos del suelo, plantas y animales, incluido el hombre (Ramírez 2006; Hernández et al., 2007 y López et al., 2010). En bebés y niños, el plomo (Pb), puede manifestarse con retardo en el desarrollo físico o mental; sufrir leve déficit de atención y de capacidad de aprendizaje; en adultos trastornos renales e hipertensión. En el ser humano, el plomo puede tener una amplia variedad de efectos biológicos según el nivel y la duración de la exposición. Se han observado efectos en el plano subcelular y efectos en el funcionamiento general del organismo, que van desde la inhibición de las enzimas hasta la producción de evidentes cambios morfológicos y la muerte. Dichos cambios se producen a dosis muy diferentes; en general, el ser humano que se está desarrollando es más sensible que el adulto. Se ha mostrado que el Plomo tiene efectos en muchos procesos bioquímicos; en particular, en la síntesis del grupo hemo. En adultos y niños se observan niveles más altos de porfirina eritrocitaria sérica y mayor excreción urinaria de coproporfirina y de ácido delta-aminolevulínico cuando las concentraciones de Plomo-Hemo (Pb-H) son elevadas. Con niveles más bajos se observa inhibición de las enzimas dehidratasa del ácido delta-aminolevulínico y reductasa de la dihidrobiopterina. Como resultado de los efectos del plomo en el sistema hematopoyético disminuye la síntesis de hemoglobina y se ha observado anemia en niños a concentraciones de Pb-H superiores a 40 μg/dl (Hernández et al., 2007 y López et al., 2010). Por razones neurológicas, metabólicas y comportamentales, los niños son más vulnerables a los efectos del plomo que los adultos (López et al., 2010). Se sabe que el plomo provoca en los tubos proximales del riñón lesiones que se caracterizan por aminoaciduria generalizada, hipofosfatemia con hiperfosfaturia relativa y glucosuria; acompañada de cuerpos de inclusión nuclear, modificaciones mitocondriales y citomegalia de las células epiteliales de los tubos proximales. Los efectos tubulares se manifiestan después de una exposición relativamente breve y suelen ser reversibles, mientras que los 13 cambios escleróticos y la fibrosis intersticial, que dan lugar a una disminución de la función renal y a una posible insuficiencia renal, requieren una exposición crónica a niveles elevados de plomo (López et al., 2010). El plomo no parece tener efectos nocivos en la piel, en los músculos, ni en el sistema inmunitario (Blanco et al., 1998; López y Lozano, 2008; Ramírez, 2006 y López et al., 2010). Sin embargo, los efectos del plomo en la función reproductora masculina se limitan a la morfología y el número de los espermatozoides. En cuanto a la femenina, se han atribuido al plomo algunos efectos en el embarazo (López et al., 2010). 3.2.2. Daños por otros metales pesados,entre ellos el Zinc. Las actividades industriales generan una contaminación a gran escala con metales pesados (Cu, Zn, Pb, Cd, Cr, Ni, Hg, Co, Ag, Au) y radionúclidos como el uranio (U) y Torio (Th) en el medio ambiente. En el caso particular de los suelos, suelen afectar la fertilidad y/o el uso posterior de los mismos; mientras que, en el caso de los acuíferos y aguas superficiales, pueden comprometer seriamente el uso de este recurso como fuente de agua para el consumo humano (Morton-Bermea, 2006 y López et al., 2010). Los metales pesados están presentes en el suelo como componentes naturales del mismo o como consecuencia de las actividades antropogénicas. En los suelos se pueden encontrar diferentes metales, formando parte de los minerales propios; como son silicio (Si), aluminio (Al), hierro (Fe), calcio (Ca), sodio (Na), potasio (K) y magnesio (Mg). También, puede encontrarse manganeso (Mn), que generalmente se presenta en el suelo como óxido y/o hidróxido, formando complejos junto con otros elementos metálicos. Algunos de estos metales son esenciales en la nutrición de las plantas, como el Mn, imprescindible en el fotosistema y activación de algunas enzimas para el metabolismo vegetal. Sin duda la presencia de metales es importante para la vida en nuestro planeta, si se encuentran en concentraciones adecuadas. Durante siglos, los metales han sido utilizados en industrias importantes y son fundamentales en el funcionamiento de las mismas, pero perjudican la salud humana y transforman el equilibrio de los sistemas ambientales, si se permite que alcancen concentraciones excesivas en agua, suelo y aire. La presencia en los recursos hídricos con metales y sus derivados, así como sustancias 14 orgánicas diversas, entre otras, son responsables de innumerables situaciones de impacto sobre los ecosistemas y la salud pública en general. El vertimiento indiscriminado de grandes volúmenes de aguas y lodos residuales (con altas concentraciones de metales) por parte de las industrias, población e instituciones científicas, provocan, daños irreparables en los ecosistemas(Vullo, 2003; Prieto et al., 2009 y López et al., 2010). La falta de implementación de buenas prácticas en diferentes procesos industriales ha desembocado en la contaminación de las aguas de desecho y con ello, el ecosistema con metales como cadmio, cobre, plomo y zinc, entre otros. La contaminación en suelos por metales pesados ocurre cuando estos son irrigados con aguas procedentes de desechos de minas, aguas residuales contaminadas de parques industriales y municipales y filtraciones de presas. En lugares donde se han venido utilizando aguas residuales para el riego agrícola, se reporta una tendencia creciente en las concentraciones de metales en los suelos, por efecto en el tiempo (años) de uso de esta agua, donde las cantidades de metal que se extraen y se miden en estos suelos, se han asociado positivamente con el tiempo de uso de agua residual; mostrando una mayor tasa anual de acumulación de Ni y Pb. Los residuos de metales pesados, presentes en ambientes contaminados, pueden acumularse en los microorganismos, flora y fauna acuática; y, de esta manera, entrar en las cadenas alimentarias humanas y dar como resultado trastornos tales como: enfermedades de la piel, daños en el hígado y riñones, trastornos diarreicos agudos y enfermedades neurológicas; pueden llegar a ocasionar un potencial efecto nocivo sobre la salud (González et al., 2009; López et al., 2010). La contaminación ambiental por Zn y sus efectos en la población no son tan conocidos como en el caso de los producidos por los elementos anteriormente comentados. Sin embargo, cada vez son más numerosos los estudios que ponen de manifiesto su elevada concentración en aguas subterráneas y de superficie, y en las destinadas al consumo humano, siempre acompañado de concentraciones elevadas de otros elementos (Blanco et al., 1998 y Almaguer, 2011). En el caso de intoxicación aguda por Fosfuro de zinc se desencadena una insuficiencia orgánica (pulmón, riñón, hígado, corazón) fulminante. Si la ingesta del compuesto químico fue en concentraciones menores se puede esperar diaforesis, visión borrosa, nauseas, 15 vómito grisáceo, dolor abdominal, disnea de medianos esfuerzos y rubicundez facial (López y Lozano, 2008). 3.3. Ensayos de toxicidad Un ensayo de toxicidad es la determinación del efecto de un material o mezcla sobre un grupo de organismos seleccionados bajo condiciones definidas. Mide las proporciones de organismos afectados (efecto cuantitativo) o el grado de efecto (graduado) luego de la exposición a la muestra. La toxicidad que experimentan los organismos tras los ensayos puede ser de dos tipos: 3.3.1. Toxicidad aguda: efecto adverso (letal o subletal) inducido sobre los organismos de ensayo en prueba durante un periodo de exposición del material de ensayo, usualmente de pocos días. Esta toxicidad es suficientemente alta como para producir una respuesta rápida en los organismos (48 a 96 horas) y no implica necesariamente la muerte. 3.3.2. Toxicidad crónica: efectos tóxicos a largo plazo, que pueden mantenerse en alrededor de la décima parte de la vida media de la especie. Están relacionados con cambios en el metabolismo, crecimiento o capacidad de supervivencia (muerte y reducción de la capacidad reproductora) (Pica et al., 2000). Los efectos biológicos que se producen en los ensayos se pueden definir de varias formas y serán los parámetros que se utilicen para determinar la toxicidad. A continuación se definen los parámetros más usados: 1. Concentración efectiva (CEx): concentración del efluente que produce efectos negativos apreciables en un porcentaje "x" de la población de ensayo. Se usa el CE50 o EC50, que sería la concentración efectiva que afecta al 50 % de la población. 2. Concentración letal (CLx): concentración del efluente que produce la muerte de un porcentaje "x" de la población de ensayo. Se usa el CL50 o LC50, que sería la concentración letal que mata al 50 % de la población. 16 3. NEANO (nivel de efectos agudos no observados): mayor concentración del efluente para la cual la mortalidad registrada es del 10 % o menor. 4. CENO (concentración de efectos no observables): mayor concentración continua medida de un efluente para la cual no se observa reacción crónica alguna en las especies ensayadas. 5. MCEO (menor concentración que produce efectos observables): se define como la menor concentración del efluente, en la que puede observarse algún efecto sobre la especie ensayada. Se determina con técnicas de análisis de varianzas (Metcalf y Eddy, 2002). 3.4. Bioindicadores y/o Biomonitores Las especies bioindicadoras son consideradas aquellas que por sus características biológicas, presencia y/o abundancia en el ambiente, denotan una o varias propiedades del ecosistema al cual pertenecen. De los bioindicadores para la evaluación de la salud del ambiente, existen dos tipos de especies: las bioacumuladoras y las centinelas. Por sus características fisiológicas, metabólicas y tipo de vida las especies bioacumuladoras tiene la habilidad de acumular ciertos contaminantes directamente del medio ambiente o indirectamente (a través del alimento) a niveles superiores a los que se encuentran en el medio y son organismos tolerantes. Los centinelas, son indicadores de la presencia o toxicidad de al menos un contaminante y pueden utilizarse para evaluar efectos potenciales de los contaminantes para el humano y/o la salud ambiental. Los indicadores ópticos muestran la reducción en el crecimiento de una especie, la decoloración y el cambio en la abundancia y/o comportamiento de los seres vivos. Los indicadores físicoquímicos muestran, por ejemplo, la reducción de la actividad enzimática o la inhibición de algunas funciones fisiológicas. Los biomonitoressensitivos son utilizados en ecosistemas acuáticos como indicadores de estrés por contaminación. Las evaluaciones de calidad de los sedimentos, tradicionalmente emplean análisis químicos para identificar y cuantificar contaminantes, sin embargo el empleo paralelo de ensayos de toxicidad proporciona una manera directa de evaluar el potencial de efectos adversos. Las evaluaciones ecotoxicológicas proveen la medición de efectos combinados de los compuestos en muestras complejas; ya que, integran efectos aditivos, antagónicos o 17 sinérgicos e incluyen un grado de relevancia biológica. En estudios ambientales es deseable el uso y desarrollo de pruebas múltiples de toxicidad que contemplen varios parámetros de evaluación tóxica en diversas especies que representan diferentes niveles tróficos, a fin de observar la toxicidad potencial en varios niveles de organización biológica. Las pruebas ecológicas usan análisis basados en las comunidades biológicas, diversidad numérica, etc. comparan entre las áreas afectadas y las de control, y evidencian que tan saludable quedó un ecosistema expuesto a la contaminación (Salazar, 2008). Algunos microorganismos vivos de origen animal o vegetal han evidenciado, al ser cultivados en laboratorio y evaluados en medios realizados artificialmente con elementos contaminantes, que son afectados en su fertilidad, crecimiento y reproducción (Hoss et al., 2009). Se han realizado investigaciones comparándolos entre ellos, buscando la coincidencia de las afecciones respecto a las concentraciones o tipos de contaminantes, siendo variable el grado de afección entre especies pero significativo para considerar los resultados como confiables para tomar medidas respecto a las muestras analizadas (Leitgib, 2007 y Sochová et al., 2007). En diferentes países en vías de desarrollo se ha utilizado un sistema denominado “water tox” que busca dar una batería tecnológicamente simple y de bajo costo para determinar niveles de contaminación de metales y compuestos orgánicos, como pueden ser los pesticidas, esta prueba se basa en los criterios de la “International Development Research Centre” (Beauregard y Ridal, 2000). Los resultados han sido satisfactorios cuando la batería “water tox” se aplicó en Argentina, Costa Rica, Chile y México. Sin embargo, se sugiere realizar mayores estudios para validar los criterios, en cuanto a niveles de selección para confiar en los resultados arrojados con algunos nematodos (Ronco et al., 2000; Castillo y Schäfer, 2000; Boyd y Williams, 2003). 18 3.4.1. Microorganismos utilizados como bioindicadores y/o biomonitores A continuación se enlistan algunas especies o pruebas con las que a la fecha se ha trabajado de manera rutinaria y exitosa, así como aquellas que por su importancia ecológica o por ser especies estándar en otros países pudieran utilizarse en México, el resultado son tres listas (una por cada ambiente) de especies o pruebas candidatas. La lista de agua dulce (Tabla 1) incluyó 6 especies fitoplanctónicas, 18 especies de zooplancton, 10 especies nectónicas, 15 especies de hábitos bentónicos, 10 especies de plantas superiores y 2 especies bacterianas. La de ambientes marinos y salobres comprendió 5 especies fitoplanctónicas, 8 especies de zooplancton, 4 especies nectónicas, 20 especies de hábitos bentónicos y la bacteria Vibrio fischeri (Tabla 2). El listado de ambientes terrestres (Tabla 3) abarcó 5 pruebas de metabolismo microbiano, 5 especies de bacterias, 11 especies de mono y dicotiledonias y 7 otras especies/pruebas microbianas (UAM-INE, 2005). 19 Tabla 1. Listado de especies candidatas de ambientes dulceacuícolas FITOPLANCTON ZOOPLANCTON NECTON BENTOS PLANTAS SUPERIORES (Monocotiledoneas y Dicotiledoneas) BACTERIAS Selenastrum capricornutum Scenedesmus quadricauda Scenedesmus incrassatulus Scenedesmus acutus Chlorella vulgaris Ankistrodesmus falcatus Daphnia exilis Daphnia similis Daphnia magna Daphnia laevis Daphnia pulex Ceriodaphnia dubia Moina macrocopa Diaphanosoma birgei Simocephalus vetulus Brachionus angularis Brachionus patulus Brachionus calyciflorus Brachionus havanaensis Brachionus rubens Asplanchna brightwelli Asplanchna girodi Asplanchna sieboldi Eucyclops Onchorhynchus mykiss Poecilia reticulata Poeciliopsis gracilis Bufo occidentalis (larvas) Xiphophorus sp. Petenia splendida Oreochromis sp . Cyprinus carpio (juveniles) Chirostoma sp. Cichalosoma urophtalmus Hyalella azteca Chironomus tetans Cypridopsis vidua Machrobrachiu m rosenbergii Ambystoma mexicanum/pr oteg. Macrothrix triserialis Simocephalus vetulus Hydra attenuata Cambarelus moctezumae Pomacea flagellata Limnodrillus hofmeisteri Heterocypris incongruens Cypris sp. Panagrellus redivivus (específico) Caenorhabditi s elegans Lemna minor Lactuca sativa Allium cepa Glicine sp. Hordeum sp. Avena sativa Lepidium sativum Amaranthus hypochondriacus Carthamus tinctorius Vibrio fischeri Spirillum volutans 20 serrulatus Tabla 2. Listado de especies candidatas de ambientes salobres y marinos FITOPLANCTON ZOOPLANCTON NECTON BENTOS BACTERIAS Tetraselmis suecica Isochrisis galbana Dunaliella tertiolecta Chaetoceros mulleri Spirulina platensis Brachionus plicatilis Artemia franciscana Calanus sp. Litopenaeus setiferus (larvas) Litopenaeus vannamei (larvas) Larvas de erizo Brachionus rotundiformis Acartia tonsa Mugil sp. Lutjanus gutatus Sphoeroides annulatus Paralabrax sp. Mysidopsis bahia Neanthes arenaceodentata Tisbe sp. Gamarus sp. Litopenaeus setiferus Litopenaeus vannamei Uca sp. Mytella sp. Capitella sp. Nereis sp. Nephtys sp. Farfantepenaeus duorarum Crassostrea virginica Argopecten ventricosus Callinectes sp. Leptocheirus plumulosus Erizos Haliotis sp. Nematodos Vibrio fischeri 21 Crassostrea gigas (larvas) Tabla 3. Listado de especies candidatas de ambientes terrestres METABOLISMO MICROBIANO MESOFAUNA PLANTAS SUPERIORES (Monocotiledoneas y Dicotiledonias) BACTERIAS Tasa Respiratoria Lipasas Deshidrogenasas Tasa de mineralización de nitrógeno Trifosfato de adenosina (ATP) Panagrellus redivivus Caenorhabditis elegans Eisenia andrei/foetida Colembolos Enchitreidos Isópodos Lactuca sativa Allium cepa Glycine soja Hordeum vulgare Avena sativa Lepidium sativum Amarantus hipochondriatus Phaseolus sp. Zea mays Triticum aestivum Carthamus tinctorius Pseudomonas putida Pseudomonas fluorescens Vibrio fischeri Bacillus cereus Salmonella typhimurium (Microfluctuación) Escherichia coli 22 3.5. Panagrellus redivivus Los nombres comunes que recibe el nematodo objeto de estudio son, microgusano, anguililla, anguililla del engrudo, nematodo de pasta agria y nemátodo del suelo. Su nombre científico actual y válido es Panagrellus redivivus descrito por Goodney en 1945. (De Lara, 2005). La ubicación taxonómica según Nieto (1991), basado en el trabajo de Thorne (1961) para el Panagrellus redivivus es: Phyllum Nemátoda (Cobbs 1919) Potts, 1932 Clase Secementea (von Linstow, 1905) Dougherty, 1958. SubclasePhasmidia (Chitwood and Chitwood 1933) Superfamilia Rhabditoidea (Orley, 1880) Familia Cephalobidae (Chitwood and McIntosh 1934) Género Panagrellus (Thorne, 1938) Especie P. redivivus (Linnaeus, 1767) Goodey (1945) 23 P. redivivus, fue clasificado a lo largo de la historia como: (De Lara, 2005) Chaos redivivum Linnaeus, (1767). Vibrio anguílula Muller,(1773). Vibrio glutinus Muller (1783), Linnaeus,1767). Anguillula rediviva Linnaeus,(1767). Turbatrix rediviva Linnaeus,(1767), Goodey (1945) Turbator redivivus Linnaeus,(1767) Goodey(1945). Gordius glutinous Okem,(1815). Rhabditis glutinous Dujarin (1845) Leptodera oxophila Scheneider (!866) Cephalobus parasiticus Sandground, (1939). Neocephalus, Steiner,(1936).Goodey,(1943) Panagrellus leucocephalus Steiner,(1936) Goodey,(1945) Anguillula silusiae de Man, (1913). Turbatrix silusiae de Man, (1913). Turbator silusuae de Man (1913),Goodey (1943) Panagrellus silusiae de Man, (1913) Goodey (1945) 24 3.5.1. Descripción general de los nematodos Los integrantes del Phylum Nematoda, tienen una figura corporal cilíndrica, delgada y alargada, los extremos se aguzan gradualmente; presentan una cutícula flexible e inerte que cubre todo el cuerpo, incluso faringe, la parte posterior del aparato digestivo y otras oberturas del cuerpo, carecen de cilios o flagelos para la locomoción. La boca se ubica en el extremo anterior, rodeada de seis labios ligeramente separados. En el extremo posterior se ubica la cloaca que es el único poro que comunica con el exterior. En los machos aloja las espículas copulatorias que son pareadas, curvas y separadas; en las hembras la cloaca aloja a la vulva; y en los machos, la región posterior está curvada en forma de gancho como característica sexual secundaria (Figura 1) (De Lara et al., 2007). 3.5.2. Características Panagrellus redivivus Las características anatómicas particulares para esta especie, son descritas por De Lara (2005), el cuerpo de P. redivivus está cubierto con una cutícula delgada, estriada de menos de una micra, con cuatro estrías profundas, longitudinales a la mitad del cuerpo y escasas en las papilas cervicales. La cabeza ligeramente sobresale del cuerpo y tiene seis labios escasamente separados. El prostomium está parcialmente rodeado con el collar esofágico. La boca es triangular, atrás del prostomium, en donde la pared dorsal es ligeramente protuberante, con una pequeña verruga central, la cual tiene tres dientes angostos en la parte dorsal y dos pares de dientes subventrales. Un tubo circular se extiende desde la boca hasta el ano. En cuanto al tamaño, las hembras son más grandes que los machos, así De Lara (2005) registra para P. redivivus la longitud total para cuatro diferentes poblaciones, midiendo en cada una de ellas a distinto número de individuos, el tamaño para los machos fue de 0.705 a 1.806 milímetros de longitud total y para las hembras de 1.11 a 2.090 milímetros. El aparato reproductor femenino tiene un saco post-vulvar largo, casi como la mitad de la distancia desde la vulva al ano o ligeramente mayor, generalmente se observa con esperma. La vulva y el ano tienen aberturas transversales, ligeramente curvadas en la parte anterior. La cola de la hembra tiene forma cónica alargada. En el caso de los machos, la cola tiene una forma de gancho en donde sobresale el flagelum, en la parte final de la cola, existen siete pares de papilas: un par subventral, anterior a la espícula 25 manubrium, un par subventral adanal; dos pares subventrales, entre el ano y el inicio del flagelum de la cola, un par subdorsal, atrás del ano y un par suboral anterior a la cola. Otras estructuras que sirven para clasificar a las diferentes especies del género Panagrellus son las espículas, que para la especie P. redivivus, además de ser curvas, pareadas y separadas, éstas llegan a engrosarse cerca de la parte distal son cortas y se bifurcan. En relación al número de cromosomas sexuales en el macho es de nueve y en la hembra son de diez pares, La diferenciación de sexos se distingue a partir de la segunda muda de desarrollo. Las hembras de esta especie presentan un útero bastante alargado. Los huevos se producen posterior a la cópula y eclosionan en el útero (De Lara, 2005). Figura 1. Morfología de macho y hembra de Panagrellus redivivus 26 3.5.3. Ciclo de vida. El ciclo reproductivo de Panagrellus redivivus es corto; son gusanos ovovivíparos, los huevos se desarrollan en la hembra hasta el estadío jóven 2 (J2), cuando son expulsados al medio, las larvas incrementan su tamaño 3 veces durante el primer día y de 5 a 6 veces en los tres días siguientes, cuando alcanzan la madurez sexual. A continuación se presentan las etapas de desarrollo de P. redivivus, basados en su tamaño, (González, 2000). Estadío 1 o Huevo Estadío 2 0.250-0.350 mm Estadío 3 0.351-0.550 mm Estadío 4 0.551-0.750 mm Estadío 5 (Adulto) 0.750-2.00 mm Panagrellus redivivus, se localiza en medios húmedos en estado de fermentación y son organismos que se les puede ver a simple vista ya que su tamaño oscila de 0.5 a 2.0 mm de largo y 0.05 mm de diámetro. La hembra es más grande que el macho, ya que puede llegar en medir en promedio 1.63 mm, mientras que el macho alcanza una talla promedio de 1.38 mm. J1: el primer estadio de desarrollo que ocurre en el útero de las hembras y en el que se desarrolla la embriogénesis con una duración aproximada de 20 horas. J2: Cuando el J1 muda, da lugar a los juveniles que emergen del huevo y son expulsados de la vulva de la hembra como libres nadadores. J3 y J4: los recién nacidos (J2) continúan su crecimiento pasando por estos dos estadios juveniles, hasta alcanzar el estado adulto a las 96 horas de su nacimiento. 27 Tiene un intervalo amplio a la temperatura en donde puede desarrollarse, puede tolerar salinidades de hasta 40 g/L y poder mantenerse vivo en el agua por periodos mayores de 72 horas (Castro et al., 2001). Las hembras adultas producen de 1 a 16 crías en cada puesta y su madurez sexual comienza aproximadamente en el 4º día de haber nacido. La vida de estos organismos es hasta de16 días (Nieto, 1991). 3.5.4. Hábitat. En el medio natural, Panagrellus redivivus se localiza en suelos húmedos y con gran cantidad de materia orgánica, así como en medios en procesos de fermentación ácida y en donde las larvas de Drosophila sp. Actúan como dispersores de estos gusanos (. 1971). Diversas especies de Panagrellus se han colectado en una gran variedad de hábitats como son exudados de árboles, hojas de plantas acirculares y en recipientes de cerveza y sidra fermentada. A Panagrellus redivivus también se le conoce como nematodo de la pasta o masa fermentada, por ser en las panaderías donde se le encuentra con frecuencia (De Lara, 2005). 3.5.5. Crecimiento de Panagrellus redivivus. Para el cultivo de P. redivivus se han empleado como medio de cultivo a las harinas de cereales, debido a que estos granos ofrecen una fuente importante de almidón que se fermenta y permite la proliferación de bacterias y levaduras de las cuales se alimentan los nematodos. La literatura cita cultivos de estos nematodos en harina de maíz, trigo o combinadas, en harina de arroz y en harina de avena. En todas ellas crece el organismo. Para este trabajo se utilizó harina de avena por ser la más utilizada en trabajos similares. En acuicultura se utiliza como alimento vivo sustituyendo nauplios de Artemia sp. Los ensayos de toxicidad se emplean para diferentes fines y proporcionan resultados útiles para la protección de la salud pública y de la vida acuática frente al impacto causado por la introducción de contaminantes en las aguas. Panagrellus redivivus se ha empleadopara pruebas de sensibilidad a diversos contaminantes como son metales pesados, plaguicidas, mezclas orgánicas, sedimentos urbanos y descargas industriales http://www.miliarium.com/Paginas/Prontu/Tablas/Aguas/ContaminantesAgua.htm 28 entre ellas las de las refinerías del petróleo. Sin embargo, los estudios son escasos, por ejemplo en presencia de nitratos y metales pesados. Los nitratos y nitritos, así como los metales pesados son contaminantes frecuentes, por lo que es importante determinar la presencia de dichos compuestos en el agua (Pica, 2007). 4.0. ANTECEDENTES (estado del arte) El microgusano P. redivivus por sus características biológicas de rápido crecimiento, ciclo de vida corto, alta fecundidad y gran tolerancia a condiciones ambientales cambiantes, así como su fácil manejo, es considerado, a nivel mundial como un buen recurso para la investigación científica en diferentes campos (De Lara, 2005). En estudios biológicos han estudiado la evolución de mecanismos del desarrollo embrionario en nematodos; el número variable de células en nematodos; la tolerancia a aclimatación de P. redivivus a bajas temperaturas, entre otros (De Lara, 2005). En estudios bioquímicos se han realizado aislamiento y caracterización de péptidos en P. redivivus en comparación con otros nematodos; caracterización de péptidos neuroactivos que sugieren un papel importante en la fisiología hipodermal; identificación de enzimas sintetizadas por P. redivivus en el catabolismo de aminoácidos sin diferencia significativa con los mamíferos, entre otros (De Lara, 2005). Estudios genéticos han determinado efectos a diferentes dosis de rayos X, radiaciones gamma, protones y neutrones de tal manera que se ha estimado variación de mutación inducida en el cromosoma X (De Lara, 2005). En estudios agrícolas se utiliza a este nematodo para probar sustancias nematicidas o el efecto de hongos nematófogos que pueden utilizarse como control de nematodos parásitos de plantas de interés comercial. Cultivo de camarón y carpa. Otra modalidad es cuando se utiliza como vehículo en tratamiento terapeúticos (De Lara, 2005). En el campo de la toxicidad-contaminación, que es el que compete en este trabajo, el estudio de P. redivivus cobra gran importancia por el camino de publicaciones al respecto. En la toxicología ambiental destacan los bioensayos realizados en el programa “water tox” con la participación de ocho países (Argentina, Canadá, Colombia, Costa Rica, India, México y Ucrania), donde se utilizan diferentes sustancias contaminantes y diversos 29 organismos, pero siempre está presente P. redivivus. En estudios toxicológicos en el medio acuático con bioensayos de metales pesados, plaguicidas, mezclas orgánicas, sedimentos urbanos y descargas industriales y urbanas; además de estudios relacionados con efluentes de refinerías (De Lara, 2005). Los investigadores han reportado que los datos químicos por si solos no son suficientes para evaluar los efectos tóxicos de los contaminantes porque no son capaces de proveer información de la interacción entre contaminantes, matriz y biota. Es decir, que para estimar los riesgos de los contaminantes y elementos ambientales contaminados, los métodos químicos deben ser complementados con métodos biológicos y toxicológicos (Molnár et al., 2005). Dentro de los métodos toxicológicos se tienen los ensayos de toxicidad, que se emplean para diferentes fines, por ejemplo el establecimiento de concentraciones aceptables de diferentes parámetros, determinación del cumplimiento de la legislación y proporcionar resultados útiles para la protección de la salud pública y de la vida acuática frente al impacto causado por la introducción de contaminantes en agua y/o suelo. Por otra parte, es poco viable económicamente hablando (por el costo de los análisis de laboratorio) determinar la presencia y toxicidad específica de cada sustancia que aparece en el agua y suelo contaminados, por esto los bioensayos de toxicidad se han convertido en una alternativa real. Estos ensayos proporcionan además, una base para considerar a los organismos como elementos importantes para detectar la presencia, concentración e impacto en el agua contaminada de diversos compuestos químicos y sus efectos en el medio ambiente (Sánchez-Moreno et al., 2006). Se han realizado pruebas de toxicidad en agua y suelo con contaminantes orgánicos e inorgánicos, entre ellos se pueden mencionar algunos metales pesados como Zinc, Cadmio, Cobre, Plomo, Arsénico, Cromo, Mercurio, Aluminio, Fierro, Níquel y Plata; pesticidas como Aldrín, metolacloro y lindano y compuestos orgánicos como dinitrofenol, anilina, nitroquinolina, nonilfenol y pentaclofenol (Arkhipchuk et al., 2000; Castillo y Schäfer, 2000; Sánchez-Moreno et al., 2006; Leitgib et al., 2007; Shen et al., 2009 y Yeon et al., 2009). Los bioensayos emplean diferentes organismos de prueba como bacterias, protozoarios, crustáceos, algas, crustácesos, nematodos, lombrices, peces, plantas vasculares y semillas entre otros. En dichos bioensayos se miden diferentes 30 características como la inhibición de la bioluminiscencia de Vidrio ficheri (bacteria), la inhibición de la actividad deshidrogenasa de Azomonas agilis (bacterias), la inhibición de la reproducción de Tetrahymena pyriformis (protozoario) y Panagrellus redivivus (nematodo), la mortalidad de Folsomia candida (colémbolo), la inhibición de la elongación de las raíces y retoños de Sinapis alba (planta: mostaza blanca) (Lannacome, 1999; Molina-Barahona et al., 2004; Leitgib et al., 2007; Höss et al., 2009 y Salazar-Coria et al., 2010). A continuación se explican algunos estudios que se han realizado con los diferentes organismos ya mencionados. Leitgib et al., (2007) realizaron pruebas de toxicidad de suelos contaminados, el primer suelo derivado de un sitio contaminado con aceite de transformadores (PCB libre); el segundo contaminado con gasolina y el tercero contaminado con metales tóxicos (Zn, Cd, Cu, Pb, As). Los autores midieron la inhibición de la bioluminiscencia en Vibrio fischeri, la inhibición de la reproducción en Tetrahymena pyriformis y Panagrellus redivivus, la ihnibición de la actividad deshidrogenasa de Azomonas agilis, la mortalidad de Folsomia candida y la inhibición dela elongación de la raíz de Sinpis alba. Todos los organismos mostraron alta toxicidad en el suelo contaminado con el aceite de transformador. En el caso del suelo contaminado con aceite combustible se consideró muy tóxico porque afectó la reproducción de T. pyriformis y P. redivivus. Los autores mencionan que las pruebas de contacto directo son capaces de cumplir con los requisitos de la toxicidad ambiental como es: la fiabilidad, sensibilidad, reproducibilidad rapidez y bajo costo. Algunos investigadores han realizado pruebas toxicológicas para evaluar la toxicidad de dieciséis hidrocarburos aromáticos policíclicos en ocho sedimentos recogidos cerca de los lugares de procesamiento de petróleo en la costa mexicana. Los contaminantes más destacados fueron acenaftileno, acenafteno y fenantreno. En las pruebas de toxicidad aguda utilizaron a Vibrio fischeri y Daphnia magna y para la toxicidad crónica a Panagrellus redivivus. Los resultados mostraron que hubo una inhibición moderada de la bioluminiscencia en el caso de Vibrio fischeri, en el caso de Daphnia magna no hubo mortalidad o inmovilidad por lo que el efecto tóxico se clasificó como moderado. Con respecto a Panagrellus redivivus se puede comentar que se mantuvo la sobrevivencia pero los contaminantes inhibieron la maduración y el crecimiento (Salazar-Coria, 2010). 31 De todos los organismos anteriormente mencionados, algunos autores coinciden en que Daphnia magna es uno de los organismos más sensibles para pruebas de toxicidad (Arkhipchuk et al., 2000; Ronco et al., 2000 y Molina-Barahonaet al., 2004). Sin embargo, otros autores mencionan que en los bioensayos se debe considerar un número adecuado y diferente de organismos de tal modo que se tenga una batería de organismos debido a que su respuesta puede ser complementaria (Arkhipchuk et al., 2000; Castillo y Schäfer, 2000). Por otra parte, otros autores mencionan que se deben considerar organismos de los diferentes niveles tróficos (Castillo et al., 2000) por lo que sería indispensable adicionar a las baterías de los bioensayos a algunos ejemplares de nematodos como es el caso de Panagrellus redivivus o Caenorhabditis elegans. Los nematodos son organismos acuáticos no parasitarios que en estos últimos años se ha demostrado son útiles para los bioensayos de toxicidad acuática y suelo debido a su abundancia y diversidad, así como su facilidad de cultivo y mantenimiento en el laboratorio (Boyd y Williams, 2003; Sochová et al., 2007). Algunas especies de nematodos utilizados en los bioensayos son Caenorhabditis elegans, Panagrellus redivivus, Aphelenchus evenae, Cephalobus persegnis, Pristionchus pacificus, Panagrellus rigidus, Rhbditophanes sp., Steinerma carpocapsae y Ditylenchus dipsaci (Debus y Niemann, 1994; Boyd y Williams, 2003; Leitgib et al., 2007; Sánchez-Moreno et al., 2006 y Salazar-Coria et al., 2007). Sánchez–Moreno et al. (2006) trabajaron con nematodos de las especies Aphelenchus avenae y Cephalobus persegnis en presencia de metales pesados (Cu, Pb, Zn y Ni) en suelo. Las concentraciones de metales pesados fueron para Cu de 0.125 a 1 mg/L, Zn de 1 a 245 mg/L, Ni de 2-3400 mg/L y plomo de 0.25 a 15 mg/L. Los resultados mostraron que la secuencia de toxicidad en C. persegnis fue Cu>Pb>Ni>>Zn y para A. avenae fue Cu>Pb>Zn>>Ni. Estos nematodos pueden ser buenos indicadores de contaminación, sin embargo los autores mencionan que la ausencia de estas especies en ambientes naturales los hace bioindicadores inapropiados en procesos naturales y antropogénicos. Yeon et al. (2009) estudiaron la toxicidad de nanopartículas de plata en suelo con el nematodo Caenorhabditis elegans, se midió la sobrevivencia, crecimiento y reproducción así como la expresión de los genes en respuesta al estrés. La pruebas de microarreglos mostraron que el potencial de reproducción de C. elegans disminuye dramáticamente en 32 presencia de nanopartículas de plata. Se considera que el tamaño extremadamente pequeño de las nanoparticulas da como resultado propiedades diferentes a los iones de plata, debido a su relativamente gran área superficial y reactividad alta. Los autores mencionan que se ha demostrado que las nanopartículas desprenden iones de plata y subsecuentemente radicales superoxidados, los cuales son parcialmente responsables de los efectos biocidas. Sochová et al., (2007) utilizaron a Caenorhabditis elegans como modelo para las pruebas de toxicidad en las que se investigó la toxicidad de siete contaminantes orgánicos, quinoleina, acridina, fonazina, 1,10-fenantrolina, parafinas cloradas de cadena corta y dos plaguicidas organoclorados (toxafeno y hexaclorobenceno). La prueba se llevó a cabo en tres medios (suelo, agar y medio acuático) y la mortalidad de los adultos se evaluó a las 24 y 48 horas. El toxafeno fue la sustancia más tóxica con una LC50 (48h) de 379 mg/Kg en el suelo y 0.2 mg/L en el medio acuático. La quinoleina fue el producto más tóxico en la prueba de agar con una LC50 (48h) de 10 mg/L; el hexaclorobenceno mostró una toxicidad muy baja en todas las pruebas. Los investigadores mencionan que C. elegans fue menos sensible que otros invertebrados de suelo pero comparable por lo que se sugieren debe ser incluido en la batería de las pruebas. En la conclusión se preguntan si otras especies de nematodos más sensibles y relevantes ecológicamente deben ser utilizados en lugar de C. elegans. Recientemente la toxicidad crónica por la exposición a compuestos tóxicos como pesticidas y metales ha tenido cada vez más atención en estudios de bioensayos, para ello se han utilizado nematodos de vida libre como Caernohabditis elegans y Panagrellus redivivus, los cuales son microorganismos de vida libre y presentan la ventaja de generar abundantes cultivos a bajo costo y ciclos de vida cortos. En 1994 fue investigado Panagrellus redivivus para ser empleado en una prueba para determinar la toxicidad del lindano, pentaclorofenol y un “fluortensides”. La exposición del nematodo se llevó a cabo en soluciones acuosas en un periodo de 96 horas. Los resultados mostraron que para lindano disminuyó la tasa de sobrevivencia con una LC50 después de 96h a 0.4 mg/L; para pentaclorofenol se tuvo una LC50 (96 h) con 13 mg/L y para fluortenside un valor de 110 mg/L (Debus y Niemann, 1994). Es decir que el microgusano si presenta sensibilidad ante este tipo de compuestos. Los nematodos pueden cambiar sus velocidades de reproducción, ciclos de vida y otras propiedades mientras se exponen a metales tóxicos 33 (Shen et al., 2009). Algunos de los estudios realizados con estos microorganismos en presencia de metales pesados son los siguientes. Boyd y Williams (2003) realizaron uno estudio en el que se comparó la sensibilidad y facilidad de uso de dos nematodos Panagrellus redivivus y Pristionchus pacificus con respecto a Caenorhabditis elegans. Se evaluaron los efectos del cobre (Cu) en la sobrevivencia, reproducción, movimiento y comportamiento de alimentación. P. pacificus fue el más sensible en todas las pruebas y P. redivivus fue el menos sensible. La reproducción y movimiento de C. elegans y la reproducción de P. pacificus disminuyeron un 50% en concentraciones similares de Cu (2 mg/L) pero el movimiento de P. pacificus fue menos sensible al Cu (8 mg/L). En un estudio realizado por Castillo et al. (2000) con Panagrellus redivivus y otros organismos en presencia de metales y pesticidas se observó que P. redivivus fue más sensible que las semillas y plantas de cebolla. También, se observó en Panagrellus redivivus que la detección de mutagenicidad por metales pesados como arsénico, cadmio, cromo, cobre, mercurio y zinc, así como para compuestos orgánicos y pesticidas en algunos casos es similar y en otros complementaria comparado con Lacuta sativa, Allium, Hydra y Daphnia (Castillo y Schäfer, 2000). Como se observa, a través del tiempo se ha estudiado el potencial que tiene el nematodo P. redivivus en las pruebas de toxicidad en presencia de diversos compuestos, sin embargo no se observa de manera clara su sensibilidad aún cuando pareciera ser un organismo prometedor para facilitar los bioensayos; por lo anterior en el presente trabajo se plantearon los siguientes objetivos. 34 5.0. OBJETIVOS Objetivo general • Determinar la capacidad de Panagrellus redivivus para detectar contaminación por nitratos y metales pesados en agua sintética a través de una prueba de toxicidad. Objetivos específicos • Determinar la capacidad de Panagrellus redivivus para detectar contaminación por nitrógeno en forma de nitratos en agua sintética. • Determinar la capacidad de Panagrellus redivivus para detectar contaminación con metales pesados, particularmente plomo y zinc en agua sintética. 6.0. HIPÓTESIS Panagrellus redivivus se ha utilizado como bioindicador de contaminación en agua y suelo contaminados con hidrocarburos y pesticidas por lo que puede tener la capacidad de detectar contaminación por nitrógeno en forma de nitratos y algunos metales pesados como plomo y zinc. 7.0. METODOLOGÍA 7.1. Crecimiento masivo de Panagrellus redivivus El presente estudio se basó en la metodología propuesta por Pica (2008) (Figura 2). • El cultivo de microgusano se realizó en frascos de boca ancha aproximadamente de 500 ml estériles. • Se preparó una mezcla con 80 gr. de avena previamente pesada y 200 ml de agua y
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