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Efecto de la no ablación unilateral del pedúnculo ocular en el desempeño reproductivo de las hembras y la calidad de la progenie del camarón rojo del Caribe (Farfantepenaeus brasiliensis) T E S I S QUE PARA OBTENER TÍTULO DE: BIÓLOGA P R E S E N T A: LINDA MARÍA GONZÁLEZ ZÚÑIGA DIRECTORA DE TESIS: MARTHA GABRIELA GAXIOLA CORTÉS 2018 Javier Texto escrito a máquina Javier Texto escrito a máquina CIUDAD UNIVERSITARIA, CD. MX., Javier Texto escrito a máquina Javier Texto escrito a máquina Javier Texto escrito a máquina UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. HOJA DE DATOS DE JURADO 1. Datos de alumno González Zúñiga Linda María 0445529432864 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Biología 307230120 2. Datos del Tutor: Dra. Martha Gabriela Gaxiola Cortés 3. Datos sinodal 1 Dr. Juan Carlos Maldonado Flores 4. Datos sinodal 2 Mtro. Miguel Arévalo López 5. Datos sinodal 3 Dr. Edén Magaña Gallegos 6. Datos sinodal 4 Dra. Diana Aguilera Rivera 7. Datos del trabajo escrito Efecto de la no ablación unilateral del pedúnculo ocular en el desempeño reproductivo de las hembras y la calidad de la progenie del camarón rojo del Caribe (Farfantepenaeus brasiliensis). 50 2018 DEDICATORIA A mis padres, Rosalba y Gerardo por sacarnos adelante a mí y a mis hermanos a pesar de tantos obstáculos, gracias por tanta fuerza, tolerancia y energía brindada a lo largo de mi camino. A mis hermanos Rodrigo y Mariana quienes son mis mejores amigos. A mi tío Manuel por contagiarme de risas y a mi tía Lourdes por siempre aconsejarme y darme ánimos e ideas a pesar de la distancia. A mis amigas de la carrera Quetzalli y Citlali quienes compartieron conmigo risas, desveladas, enojos, prisas, fiestas, miedos y mucho más a lo largo de esta excelente etapa “la Universidad”. A la vida, por brindarme la oportunidad de cerrar un ciclo y de vivir experiencias que marcaron mi vida a lo largo de este gran camino. Fluir, no forzar… AGRADECIMIENTOS A ti mamá gracias por acompañarme, cuidarme, aconsejarme y brindarme tantos días, tantas noches, tantas madrugadas, siempre dándome esas alas tan grandes para volar y volver a despegar si era necesario (muchas veces lo fue). Gracias por siempre recibirme con una sonrisa a pesar de la hora y por siempre escucharme. A ti papá, gracias por siempre estar ahí, en especial esas noches en las que te marcaba y te decía: ¿Papá puedes venir por mí? Jajajaja. Por ser el papa enojón que lo daba todo para sus hijos y por todo el tiempo que nos brindaste. A mis hermanos por tan buenos momentos que pasamos juntos, por tantas carcajadas hasta doler la pansa, por ese gran apoyo que siempre nos brindamos, por no dejarnos caer casi por nada ja y por siempre tener la mejor vibra. Les agradezco por estar ahí siempre, por regañarme, por cubrirme, por quererme. Los quiero por siempre. A mis amigas de la facultad y de la vida Quetzalli y Citlali, que a pesar de la situación agradezco haber compartido conmigo tanto tanto, solo quiero que sepan que las recuerdo por todas las cosas divertidas que pasamos. A ti Edén, que no sé quién me pudo haber orientado y tenido tanta paciencia como tu; a pesar de ser mi tutor fuiste un gran amigo que nunca me dejo librar de esta tesis y que gracias a ti lo logre. Simplemente creo que un gracias nunca será suficiente. A Nelly mi ahora gran amiga y a Maggie con quienes compartí esta gran experiencia llamada Sisal. Experiencias que se volvieron únicas. A todas las nuevas personas que conocí en Sisal y que definitivamente me hicieron sentir parte de un nuevo núcleo familiar lejos de casa, agradezco a Rodrigo, Dianita, Cesar, Omar, Daniel, Diego, Diego Vázquez, Javi, Eloy, Misha, Vane, Marcos, y muchas tantas más. A mis profesores de la Facultad por impresionarme y apasionarme cada día en sus clases, tomando aún más gusto por la Biología Al Doctor Elpidio quien me brindo grandes consejos Por tenerme paciencia y darme la oportunidad y la confianza de compartir su trabajo de laboratorio conmigo. Gracias Pilo. El presente trabajo fue realizado en la Unidad Multidisciplinaria de Docencia e Investigación de la Facultad de Ciencias, UNAM con sede en Sisal, Yucatán. Para la realización de esta tesis agradezco ampliamente el apoyo a: Dra. Martha Gabriela Gaxiola Cortés Por haberme abierto las puertas de Sisal y dejarme ocupar un lugar en el Grupo Camarón. Agradezco el apoyo que me brindo para tomar un poco de experiencia en cuanto al manejo de los camarones y así sentir admiración por estos grandiosos organismos y a la acuacultura. Dr. Edén Magaña Gallegos Por asesorarme en la tesis. Por ser mi tutor en la práctica y en lo teórico, por aclarar mis dudas una y otra vez, gracias por esa gran paciencia. Por las correcciones que me hiciste en la parte final del documento. Por asesorarme de manera general en la tesis. M. en C Miguel Arévalo López por el apoyo de transporte de los organismos y desarrollo de la parte experimental en el área de reproducción de camarones. Por el aporte de conocimiento en lo que se refiere a la reproducción de los camarones así como a las correcciones hechas al documento. A la Doctora Diana Aguilera y al doctor Juan Carlos Maldonado por sus correcciones al documento. ÍNDICE RESUMEN ............................................................................................................................................ 1 1.- INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 3 2. ANTECEDENTES ............................................................................................................................... 6 2.1 Biología de la especie ............................................................................................................ 6 2.2 Distribución ........................................................................................................................... 7 2.3 Biología reproductiva ............................................................................................................ 8 2.4 Nutrición de camarones reproductores .............................................................................. 10 2.5 Principales biomoléculas en huevos y nauplios ................................................................. 12 2.6 Regulación hormonal de la reproducción en crustáceos. ................................................... 13 3. JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................................... 16 4. PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN ............................................................................................... 17 5. HIPÓTESIS .................................................................................................................................. 17 6. OBJETIVOS .................................................................................................................................17 7. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................................................... 18 7.1 Origen de los reproductores. ............................................................................................... 18 7.2 Fase de Aclimatación y diseño experimental ...................................................................... 18 7.3 Aceleración de la maduración gonádica .............................................................................. 19 7.3.1 Selección de las hembras maduras y cosecha de huevos ........................................... 20 7.3.2 Índices organosomáticos ............................................................................................. 21 7.3.3 Desempeño Reproductivo ........................................................................................... 21 7.4 Análisis de laboratorio ......................................................................................................... 22 7.4.1 Indicadores bioquímicos: hepatopáncreas, ovarios y hemolinfa ................................ 22 7.4.2 Indicadores bioquímicos: huevos y nauplios ............................................................... 22 7.5 Análisis estadístico de datos ................................................................................................ 23 8. RESULTADOS .............................................................................................................................. 24 8.1 Parámetros fisicoquímicos y calidad del agua .................................................................... 24 *S. E: Error estándar. ................................................................................................................. 24 8.2 Índices gonadosomático y hepatosomático ........................................................................ 24 8.3 Desempeño Reproductivo ................................................................................................... 26 8.3 Variables bioquímicas ................................................................................................... 27 9. DISCUSIÓN ..................................................................................................................................... 30 9.1 Parámetros físicos, químicos y calidad del agua ................................................................. 30 9.2 Desempeño reproductivo .................................................................................................... 30 9.2.1 Índices organosomáticos ............................................................................................ 30 9.2.2 Índices productivos ..................................................................................................... 31 9.3 Variables bioquímicas .......................................................................................................... 33 10. CONCLUSIÓN ............................................................................................................................... 36 11. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 37 Índice de tablas Tabla 1 Clasificación taxonómica de Farfantopenaeus brasiliensis (Latreille, 1817)........................ 6 Tabla 2 Variables bioquímicas en el hepatopancreas de peneidos reproductores. ............................ 11 Tabla 3 Variables bioquímicas en los ovarios de peneidos reproductores ........................................ 12 Tabla 4 Concentración de los principales metabolitos en huevos y nauplios de diversas especies de camarones peneidos. ......................................................................................................................... 15 Tabla 5 Componentes en porcentaje del alimento semi-húmedo (formulación de la dieta para reproductores de camarón; g/100g de alimento seco) ....................................................................... 19 Tabla 6 Parámetros fisicoquímicos (promedio ± S.E). ..................................................................... 24 Tabla 7 Desempeño reproductivo (promedio ± S. E.). ...................................................................... 26 Tabla 8 Análisis bioquímico (peso húmedo; promedio ± S.E) llevado a cabo en el hepatopancreas, hemolinfa y ovarios (estadio IV) de F. brasiliensis con y sin ablación en los días 5 y 45 (Latreille, 1817). ................................................................................................................................................ 28 Tabla 9 Análisis bioquímicos (promedio ±SE) llevados a cabo en huevos y nauplios (estadio IV) ablacionados y no ablacionados de reproductores F. brasiliensis (Latreille, 1817) . ....................... 29 Tabla 10 Comparación del desempeño reproductivo de varias especies de camarones peneidos en contraste con el presente trabajo. ...................................................................................................... 33 Índice de figuras Figura 1 Camarón Rojo del Caribe F. brasiliensis. (Fuente: FAO). .................................................... 7 Figura 2 Distribución geográfica de F. brasiliensis. (Fuente:FAO). ...................................................... 8 Figura 3 Télico cerrado (a) y télico abierto (b) que se presentan en las hembras de camarón. (Fuente: Edén Magaña Gallegos) ........................................................................................................ 9 Figura 4 Petasma de macho reproductor de camarón (Fuente: Edén Magaña Gallegos) .................. 9 Figura 5 Complejo del pedúnculo ocular. (Fuenta: ResearchGate). ................................................. 14 Figura 6 Área de reproducción de la UMDI/UNAM (Fuente: Edén Magaña Gallegos). .................... 19 Figura 7 Ablación unilateral del pedúnculo ocular de una hembra F. brasiliensis (Fuente: Edén Magaña Gallegos) .............................................................................................................................. 20 Figura 8 Promedios (± S.E.). A) Índice gonadosomático y B) hepatosomático de ambos tratamientos al día 5 y día 45. * S.E: Error estándar. .............................................................................................. 25 1 RESUMEN La acuacultura es una actividad que en las últimas décadas ha adquirido gran relevancia ya que la demanda de las especies que se producen por esta actividad (peces, moluscos y crustáceos) ha aumentado de manera importante, principalmente para consumo humano. En lo que se refiere a la producción de camarón en México, durante el 2014 se registró una producción promedio de 158, 128 toneladas(CONAPESCA, 2014), lo cual ha conllevado a encontrar nuevas alternativas que aumenten la producción en un menor tiempo y que permanezcan con la misma calidad. Como es bien sabido, la ablación del pedúnculo ocular es una técnica mediante la cual se acelera la maduración ovárica y por lo tanto hay un mayor número de desoves, sin embargo, se ha observado que con el paso del tiempo, dicha técnica tiende a provocar un alto desgaste energético de la hembra produciendo un declive en la frecuencia de desove así como en la calidad larval. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la ablación sobre desempeño reproductivo y la calidad de la progenie de huevos y nauplios así como también de los organismos reproductores del camarón rojo del Caribe Farfantopenaeus brasiliensis todo ello a través de indicadores bioquímicos y de producción. El experimento se llevó a cabo durante 45 días y constó de dos tratamientos, uno con ablación y otro sin ablación. Las hembras ablacionadas tuvieron un mayor índice gonadosomático mientras que el índice hepatosomático fue igual en ambos tratamientos.Las hembras ablacionadas tuvieron un mayor porcentaje de mortalidad con respecto a las no ablacionadas. La tasa de fertilización fue mayor en hembras sin ablación, sin embargo, el número de nauplios viables totales producidos fue mayor en hembras ablacionadas. Por otra parte, los análisis bioquímicos del hepatopancreas arrojaron una mayor concentración de acilglicéridos y proteína total soluble en hembras no ablacionadas mientras que en la hemolinfa hubo una mayor cantidad de colesterol y proteína total soluble en hembras no ablacionadas. En lo que se refiere a los huevos, se encontraron diferencias significativas en la concentración de proteína total soluble, siendo mayor en el tratamiento sin ablación. Los nauplios no presentaron diferencias significativas en su contenido de nutrientes, sin embargo, hubo una mayor cantidad de nauplios viables por desove en hembras no ablacionadas. Esto indica, que el tratamiento no ablación, mejora el estado fisiológico de las hembras, disminuye la mortalidad y produce huevos con mayor cantidad de reservas energéticas y al final obtenemos una mejor respuesta en cuanto a nauplios viables por desove. 2 3 1.- INTRODUCCIÓN La acuacultura es el cultivo de organismos acuáticos, donde se incluye a los peces, moluscos, crustáceos y plantas acuáticas (FAO, 2003). Dicha actividad se caracteriza por la intervención del hombre en procesos tales como la cría para aumentar la producción, la siembra, la alimentación y la protección contra depredadores, entre otras. Entre los años de 1970 a 1987, nuestro país presenta una auge significativo en cuanto a avances tecnológicos en cultivos de especies de gran importancia comercial, tales como las carpas, la tilapia, la trucha y el camarón (Ceballos Orozco & Escobar, 1988). A lo largo de los años, el crecimiento de la camaronicultura en México ha sido notorio, siendo así que entre el año 2013 y 2014 se registró un aumento en la producción de camarón de 127,517 a 158, 128 toneladas, respectivamente, siendo Sinaloa y Sonora los principales productores (CONAPESCA, 2014). La producción de camarón en México es una actividad de gran importancia, posicionándose por su volumen en el tercer lugar de la producción pesquera en México; sin embargo, por su valor, lo encontramos en el lugar número uno (CONAPESCA, 2014), generando una importante entrada de divisas al país. La camaronicultura se está desarrollando de una manera acelerada principalmente en las zonas costeras donde existe la mayoría de las condiciones necesarias para desarrollar esta actividad (SAGARPA, 2014a). A nivel mundial, las principales especies de camarones cultivadas son el langostino jumbo Penaeus monodon, camarón blanco chino Penaeus chinensis así como el camarón blanco del Pacifico Litopenaus vannamei (Boone, 1931). En lo que respecta a México, las principales especies cultivadas son el camarón blanco del pacifico L. vannamei y el camarón azul L. stylirostris (Ezquerra et al., 2004; Páez-Osuna, 2005). Por otra parte el camarón rojo Farfantepenaeus brasiliensis (Latreille, 1817) es una especie de gran importancia económica en la Península de Yucatán y con gran potencial para su cultivo, ya que posee diversas características tales como: abundancia de poblaciones en el medio silvestre, altas tasas de crecimiento bajo condiciones de cultivo, así como también el tamaño que alcanza en estado adulto (Gaxiola et al., 2010). La reproducción de especies de camarones peneidos, (L. vannamei y L. stylirostris principalmente) han sido estudiadas por diversos autores (Arcos et al., 2003; Emerenciano et al., 2013b; Vaca & Alfaro, 2000) debido a que son las especies con mayor importancia en 4 México. Por otra parte, F. brasiliensis carece de información con respecto a su nutrición y reproducción, por lo tanto es necesario llevar a cabo estudios que nos indiquen cual es el mejor manejo de la especie en cuanto a su reproducción, ya que la producción de post- larvas es de vital importancia para el arranque exitoso de las granjas camaronícolas (Racotta et al., 2003). Varios estudios han trabajado con lotes de reproductores silvestres, demostrando que éstos muestran las mejores condiciones reproductivas. Tal es el caso del estudio llevado a cabo por Emerenciano et al., (2013a) quienes trabajaron con lotes de reproductores silvestres y domesticados de F. duorarum, reportando para especies silvestres mejores resultados en cuanto a desempeño reproductivo, tales como: mayor número de huevos por desove, menor período de latencia así como también menor tasa de mortalidad y un mayor número de desoves. En cuanto a las prácticas de manejo llevadas a cabo en los programas de reproducción de camarones peneidos, la ablación unilateral del pedúnculo ocular (AUPO) es utilizada con el fin de acelerar la maduración de las gónadas así como para obtener un mayor número de desoves (Vaca & Alfaro, 2000). Sin embargo, la aplicación de la AUPO provoca cambios que se relacionan con el acortamiento del ciclo de la muda, aumento en la demanda energética, menor tasa de crecimiento así como también la pérdida de la calidad de los huevos y el aumento de la mortalidad a través del tiempo (Uawisetwathana et al., 2011), todo ellos relacionado con el desgaste reproductivo (Palacios et al., 1998, 1999c). Esto también ha provocado que el índice de condición naupliar disminuya conforme pasa el tiempo, ya que hay un desgaste de las principales biomoléculas vinculadas al desarrollo de los huevos y nauplios tales como acilglicéridos, colesterol, proteínas, carotenoides y glucosa (Palacios et al., 1999a). Además el consecuente declive de la condición naupliar puede conllevar riesgos asociados con la dispersión de enfermedades de manera vertical (Emerenciano et al., 2012a). Debido a lo anterior, es importante desarrollar alternativas de cultivo que permitan un mejoramiento de la calidad de la progenie. Al respecto, se han desarrollado varios trabajos donde se comprueba que la dieta mejora el rendimiento de hembras reproductivas así como la calidad de la progenie (Emerenciano et al., 2013a; Harrison, 1990; Wouters et al., 2001a). No obstante, pocos estudios han intentado probar el efecto de la no ablación ya que muchas 5 veces esta alternativa inhibe la cópula o la maduración de las hembras. (Palacios et al., 1999b). Sin embargo en F. brasiliensis ha sido demostrado que la cópula natural ocurre sin la ablación, pero no se ha determinado cual es el efecto en la calidad de la progenie y el estado de condición de las hembras no ablacionadas con respecto a las ablacionadas. Con el fin de evaluar el efecto en el desempeño reproductivo se pueden utilizar indicadores productivos tales como número de huevos por desove, tasa de fertilización, tasa de eclosión, la frecuencia de desove, producción total de nauplios, supervivencia en que presenta la fase de zoea (Palacios et al., 1999c); así como indicadores bioquímicos y morfológicos (Emerenciano et al., 2012b, 2013a; Palacios et al., 1998, 1999c; Primavera, 1985; Racotta et al., 2003). Es por esto que la finalidad de este trabajo fue determinar el efecto de la ablación y no ablación sobre el desempeño reproductivo y la calidad de la progenie en hembras de F. brasiliensis, todo ello, a través de la determinación de indicadores productivos y bioquímicos. 6 2. ANTECEDENTES 2.1 Biología de la especie El camarón rojo del Caribe F. brasiliensis es un crustáceo que pertenece al orden Decápoda y a la familia Penaeidae (Tabla 1, Figura 1). Su cuerpo está compuesto principalmente por el cefalotórax (cabeza) el cual se origina en la parte anterior (rostrum). El cefalotórax deriva en diversos apéndices como las anténulas, antenas, piezas bucales y cinco pares de patas llamadas pereiópodos. El abdomen se compone de seis segmentos, en los primeros cinco segmentos encontraremospares de apéndices natatorios (pleópodos) y en el último segmento una cola llamada telson, la cual se une con los urópodos (Scattergood et al., 1969). Las postlarvas dependen de lugares de crianza con bajas profundidades así como de vegetación para su refugio, es decir de sistemas lagunares, zonas de manglar y esteros para desarrollarse hasta la fase juvenil donde posteriormente migrarán hacia el mar abierto donde terminarán de madurar y se reproducirán. Los adultos son bentónicos y presentan hábitos nocturnos (SAGARPA, 2014b). Tabla 1 Clasificación taxonómica de Farfantopenaeus brasiliensis (Latreille, 1817). Clasificación taxonómica Reino Animal Phylum Arthropoda Superclase Crustacea (Pennant, 1777) Clase Malacostraca (Letreille, 1806) Subclase Eumalacostraca (Grobben, 1892) Superorden Eucarida (Calman, 1904) Orden Decáapoda (Letreille, 1803) Suborden Dendobranchiata (Bate, 1888) Sueprfamilia Penaeoidea (Rafinesque-Shmaltz, 1815) Familia Penaeidae (Rafinesque-Shmaltz, 1815) Género Farfantepenaeus (Perez-Farfante y Kensley, 1997) Especie brasiliensis (Latreille, 1817) 7 Figura 1 Camarón Rojo del Caribe F. brasiliensis. (Fuente: FAO). 2.2 Distribución F. brasiliensis, se distribuye desde Cabo Hatteras ubicado en Carolina del Norte EE.UU hasta Laguna de los patos Rio Grande Brasil (Figura 2). Su distribución abarca las Costas del Caribe Mexicano, América Central y Sudamérica, recorriendo de esta manera gran parte de la costa Atlántica (Scattergood et al., 1969). Particularmente en México, se distribuye sobre la costa noreste de la Península de Yucatán, al sur de la Isla Holbox, en la laguna de Yalahau y al sur de Cabo Catoche Q. Roo, así como en Rio Lagartos, Yucatán (SAGARPA, 2014b). F. brasiliensis es una de las dos especies pertenecientes a la pesquería del Caribe Mexicano, se le encuentra más frecuentemente entre los 45 y 64 m de profundidad. En Isla Contoy (Quintana Roo), es una de las pesquerías mejor posicionadas después de la langosta (SAGARPA, 2014b). 8 Figura 2 Distribución geográfica de F. brasiliensis. (Fuente:FAO). 2.3 Biología reproductiva El sistema reproductor de hembras de camarón está compuesto por un par de ovarios y un par de oviductos. Los ovarios son estructuras tubulares emparejadas y alargadas que van de la región cardiaca del estómago y que se extienden hacia el telson (Swetha et al., 2011). Los oviductos se originan entre el sexto y séptimo lóbulo lateral, descendiendo de esta manera hacia la abertura genital que se encuentra en el tercer par de pereiópodos. En camarones peneidos encontramos dos variedades en cuanto al télico (Figura 3), el cual es una estructura donde el macho deposita su espermatóforo. Las hembras con télico abierto carecen de receptáculos seminales, sin embrago presentan una serie de depresiones, sedas y espinas, las cuales permitirán la adhesión del espermatóforo. Por otro lado, en las hembras de télico cerrado como es el caso de F. Brasiliensis, se observan en la parte ventral del cefalotórax receptáculos seminales, cubiertos por placas laterales (FAO, 1988) 9 El sistema reproductor de los machos consiste en un par de testículos, dos vasos deferentes y dos ámpulas terminales; mientras que de manera externa podemos observar un petasma y un apéndice masculino. El petasma es una modificación de los endopoditos del primer par de pleópodos (Figura no. 4), el cual sirve para transferir el espermatóforo al télico de la hembra. En cuanto al apéndice masculino, es un anexo del segundo par de pleópodos el cual se cree que junto con el petasma sirven para estimular a la hembra (De Peralta Martínez et al., 2013) Figura 4 Petasma de macho reproductor de camarón (Fuente: Edén Magaña Gallegos) a) b) Figura 3 Télico cerrado (a) y télico abierto (b) que se presentan en las hembras de camarón. (Fuente: Edén Magaña Gallegos) 10 2.4 Nutrición de camarones reproductores Sin duda alguna, la alimentación de organismos reproductores es de suma importancia ya que este es uno de los aspectos mediante el cual se reflejará una óptima maduración, reproducción y calidad de la progenie. Es por eso que es importante identificar y proporcionar una dieta que alcance los objetivos antes mencionados. Se ha documentado que una alimentación desbalanceada así como incompleta puede provocar un bajo desempeño reproductivo (Bray et al., 1990) afectando de manera negativa la producción de post larvas. Por lo tanto las hembras deben de recibir una alimentación balanceada ya que es necesario que acumulen suficientes nutrientes en los huevos para mantener a los embriones hasta la etapa de desarrollo en la que empiecen a recibir alimento de manera exógena (Wouters et al., 2001a). En el medio natural los camarones que se encuentran en fase adulta, se alimentan principalmente de micro-invertebrados entre los cuales podemos mencionar a los gasterópodos, bivalvos, crustáceos y poliquetos así como también algunas plantas (Rothlisberg, 1998), las cuales cubren los requerimientos nutricionales para llevar a cabo la reproducción. Por otra parte, en cautiverio se pretende asemejar la misma nutrición para desencadenar ciertos procesos hormonales que tendrán como fin la maduración reproductiva de los camarones (Wouters et al., 2001a). Los requerimientos nutricionales de los camarones de manera general son: lípidos, proteínas, carbohidratos, vitaminas, carotenoides y minerales. Cada uno de ellos es obtenido en diferentes proporciones a través de alimento como la artemia, poliqueto, mejillón, calamar y alimento comercial. Cada nutriente cumple funciones muy importantes en lo referido al desempeño reproductivo, tanto de las hembras como de los machos. En este sentido, se ha documentado que durante la maduración y la reproducción, los requerimientos proteicos son mayores, debido a la intensa biosíntesis que se lleva a cabo (Harrison, 1990). Por otro lado, Palacios y Racotta, (1999), demostraron que en hembras con bajos niveles de proteína en hepatopáncreas y ovarios, no registraron desoves; mientras que en hembras donde se registraron altos contenidos de proteína en los mismos tejidos, se obtuvo un mayor desempeño reproductivo. Por otra parte, Chamberlain, (1988) observó que las vitaminas A, E y C mejoraron el desempeño reproductivo en hembras y machos. En el caso de los machos, 11 el porcentaje de esperma normal es mayor, mientras que en las hembras aumenta la tasa de maduración ovárica; por lo tanto, ante la deficiencia de vitaminas ( A, E y C) la maduración ovárica puede ser retrasada (Alava et al., 1993). La falta o deficiencia de ciertos minerales también puede afectar la reproducción, así como causar alteraciones en la calidad de los huevos (Harrison, 1990). Por tal motivo, es importante cubrir las necesidades de ciertos minerales, ya que durante la reproducción, muchos de ellos son transferidos a los huevos y otros más son utilizados durante la muda (Méndez et al., 1997). Tabla 2 Variables bioquímicas en el hepatopancreas de peneidos reproductores. Especie Tratamiento Acilglicéridos (mg/g) Colesterol (mg/g) Proteína Total Soluble (mg/g) Referencia L.stylirostris Estanques Floc 63.3 64.2 12.6 14.3 93.4 85.3 Emerenciano et al., 2012 L.vannamei FLOC FLOC+FF* 51.2 85.1 3.82 4.05 37.47 41.18 Emerenciano et al., 2013a F. duorarum Domesticados Silvestres 66.5 9.1 2.2 1.6 28.2 30.4 Emerenciano et al., 2012 *FLOC+FF (Floc + alimento fresco). Dentro de los requerimientos nutricionales también encontramos a los carotenoides, los cuales son pigmentos que no pueden ser sintetizados por los animales; por lo que deben ser administrados a través de la dieta. Tanto en los reproductores como en larvas de camarón, los carotenoides intervienen de manera importante,ya que funcionan como antioxidantes naturales, protegiendo y elevando la supervivencia de estos (Dall et al., 1995; Merchie et al., 1998). Por último, tenemos a los lípidos, los cuales son indispensables en la dieta de los camarones reproductores, debido al papel que juegan dentro del desempeño reproductivo. En todas las especies de camarones peneidos se ha observado un aumento en la concentración de lípidos durante la maduración de los ovarios, los cuales son transferidos desde el hepatopáncreas y a través de la hemolinfa hasta los ovarios, disminuyendo de esta manera la concentración de los lípidos en el hepatopáncreas (Tabla 2, 3). Tal es el caso de algunos ácidos grasos altamente insaturados, los cuales se ha demostrado juegan un papel importante en lo que se refiere al proceso de desarrollo de los ovarios, así como también en la embriogénesis temprana (Xu et al., 1994). Por otro lado, se ha observado a través de estudios 12 bioquímicos, que los fosfolípidos, acilglicéridos y el colesterol representan los principales lípidos durante el desempeño reproductivo de las hembras (Wouters et al., 2001; Tabla, 3). Se ha reportado que los niveles de acilglicéridos aumentan considerablemente en los ovarios, debido a que estos son transferidos a los huevos, proporcionándoles la energía necesaria para llevar a cabo la embriogénesis, la eclosión y el desarrollo naupliar (Wouters et al., 1999). Por otra parte, los fosfolípidos son los lípidos con mayor predominancia en los ovarios. Ravid et al., (1999) Wouters et al., (1999). Bray et al., (1990) reportaron que los fosfolípidos mejoraron la producción naupliar, la eclosión y la espermatogénesis en reproductores de L. stylorostris. Finalmente, el colesterol también desarrolla un papel importante en lo que respecta a la maduración de ovarios en la reproducción (Kanazawa et al., 1988). El éxito de algunos alimentos frescos se debe al contenido de colesterol que hay en ellos, ya que se sabe que cumple ciertas funciones endocrinológicas (segregación de ciertas hormonas) y por ende, la movilización de ciertas hormonas durante la maduración (Wouters et al., 2001b). A pesar de toda esta información, es necesario mencionar que aún falta más investigación en lo que se refiere a la alimentación de camarones reproductores, ya que cada especie requiere de cantidades específicas de los diversos nutrientes. Tabla 3 Variables bioquímicas en los ovarios de peneidos reproductores Especie Tratamiento Acilglicéridos (mg/g) Colesterol (mg/g) Proteina Total Soluble (mg/g) Referencia L. stylirostris Estanque Floc 64.2 42.2 8.1 11.6 111.0mg/g 97.4mg/g Emerenciano et al., 2012 L. vannamei Floc Floc+FF 9.05 10.6 3.14 3.65 81.24mg/g 73.01 mg/g Emerenciano et al., 2013a F. duorarum Domesticados Silvestres 15.8 26.5 0.6 1.0 25.9mg/g 38.9mg/g Emerenciano et al., 2012 *FLOC + FF (Floc + Alimento fresco) 2.5 Principales biomoléculas en huevos y nauplios Diversos estudios bioquímicos han demostrado que existen diversas biomoléculas relacionadas con el desarrollo de huevos y nauplios así como de su calidad larval (Tabla 4). Los lípidos desempeñan un papel muy importante durante la maduración gonadal y el desarrollo larval de los camarones. Se considera que los fosfolípidos, acilglicéridos y el 13 colesterol son los principales lípidos. En lo que se refiere a los acilglicéridos, estos son transferidos a los huevos, constituyendo de esta manera una de las principales fuentes de energía necesaria para la embriogénesis, eclosión y desarrollo naupliar hasta que la alimentación se vuelve exógena (Wouters et al., 2001a). Es así que se ha demostrado que organismos con mayor cantidad de acilglicéridos aumentan su tasa de sobrevivencia en la etapa de Zoea (Palacios et al., 1998). Asimismo los esteroles (principalmente el colesterol) sirven como precursores de hormonas y componentes celulares de las membranas. De hecho están correlacionados con el peso de las larvas de los camarones (Anger, 2001; Wouters et al., 2001a). Los carbohidratos no son esenciales para los camarones reproductores, sin embargo son útiles como una fuente de energía económica. Palacios et al., (1998) han demostrado que los niveles de glucosa en huevos están correlacionados con la calidad larval. Por otra parte, la proteína total soluble es el componente más abundante de huevos y nauplios, posiblemente ligado a la generación de vitelo (lipoproteína). Además de su función estructural y de transporte, la proteína puede servir como proveedora de energía en sub-estadios avanzados de nauplios (Racotta et al., 2003). 2.6 Regulación hormonal de la reproducción en crustáceos. La maduración gonadal en crustáceos está regulada por secreciones neuroendócrinas y no endócrinas (Figura 4). Diversas hormonas provenientes del sistema neuroendócrino intervienen de manera importante en el control de la maduración gonadal, tal es el caso de dos neuropéptidos antagonistas: GIH (hormona inhibidora de la vitelogénesis) la cual es sintetizada y secretada por el órgano X glándula sinusal (OX – GS) complejo del pedúnculo ocular y la hormona estimuladora de la gónada (GSH). Otras hormonas involucradas en la regulación hormonal en las hembras son farnesoato de metilo y ecdisteroides, las cuales son secretadas por el órgano mandibular y los órganos Y (Swetha et al., 2011). Es así que se ha demostrado que en diversas especies, la ablación unilateral del pedúnculo ocular en las hembras acelera el proceso de maduración ovárica así como un incremento en el número de desoves, ya que hay una disminución en la secreción de la hormona inhibidora de la vitelogénesis (Swetha et al., 2011). Sin embargo, se ha observado que con el paso del tiempo, las hembras ablacionadas evidencian un agotamiento reproductivo, viéndose 14 reflejado en las reservas de energía de los huevos así como también en el declive de la frecuencia de desove, número total de nauplios y la supervivencia a la fase Zoea (Palacios et al., 1999c). Figura 5 Complejo del pedúnculo ocular. (Fuente: ResearchGate) 15 Tabla 4 Concentración de los principales metabolitos en huevos y nauplios de diversas especies de camarones peneidos. Dos tiempos de muestreo: *inicio, +final AF: Alimento fresco, ND: No determinado Especie Tratamiento Tejido Tamaño (µm) Acilglicéridos (mg/g) Colesterol (mg/g) Glucosa (mg/g) Proteína Total Soluble (mg/g) Referencia L. vannamei Domesticados Huevo *271 ± 1 +210 ± 1 *23.19 ± 0.95 +21.80 ± 0.77 *7.32 ± 0.19 +5.12 ±0.14 *5.53 ± 0.32 +4.16 ± 0.14 *149.31 ± 6.32 +135.26 ± 5..66 Palacios et al., 1999c L. vannamei Domesticados Huevo *255.9 ± 7.1 +253.6 ± 5.3 *19.79 ± 1.53 +20.34 ± 1.24 *4.31 ± 0.48 +4.73 ± 0.47 *6.35 ± 0.48 +6.08 ± 0.40 ND Palacios et al., 1998 L. vannamei Floc Huevo ND *12.23 ± 1.34 +11.64 ± 2.33 *4.71 ± 0.50 +5.89 ± 0.42 ND *26.89 ± 3.08 +35.79 ±1.71 Emerenciano et al., 2013a F. duorarum Domesticados Huevo ND *19.5 ± 0.8 +24.4 ± 0.9 *7.4 ± 0.2 + 6.7 ± 0.8 ND *122.2 ± 13.4 +181.6 ±17.9 Emerenciano et al., 2012b F. duorarum Silvestre Huevo ND *24.7 ± 0.9 +23.9 ± 1.3 *6.8± 0.3 +6.5 ± 0.4 ND *113.7 ± 10.8 +176.6 ± 32.8 Emerenciano et al., 2012b F. duorarum Domesticados Nauplio ND *13.6 ± 0.5 +12.3± 1.2 *3.2 ± 0.2 +4.9 ± 0.8 ND *72.9 ± 5.5 + 62.5 ± 8.6 Emerenciano et al., 2012b F. duorarum Silvestre Nauplio ND *13.2 ± 0.6 + 13.9 ± 0.9 *3.7 ± 0.2 + 4.3 ±0.2 ND *42.3 ± 2.3 +33.2 ± 7.3 Emerenciano et al., 2012b L. vannamei Domesticados Nauplio *371 ± 2 +350 ± 5 *11.70 ± 0.33 +13.15 ± 0.40 *4.13 ± 0.12 +3.97 ± 0.14 *3.33 ± 0.10 +3.59 ± 0.13 *89.98 ± 2.61 +78-85 ± 2.75 Palacios et al., 1999c L.vvannameiFloc + AF Nauplio ND *10.64 ± 0.98 +9.96 ± 0.75 *3.83 ± 0.39 +3.90 ± 1.13 ND *41.94 ± 4.31 +40.22 ± 1.13 Emerenciano et al., 2013a 16 3. JUSTIFICACIÓN Debido a la gran explotación que han tenido los camarones a lo largo de los años tanto de la pesquería artesanal como de la pesquería industrial, sus poblaciones han disminuido de manera importante, teniendo como consecuencia un desequilibrio en los ciclos biológicos en los cuales se ven involucrados, afectando de manera directa e indirecta a muchas especies. Sus ciclos biológicos y reproductivos se ven afectados porque los camarones son organismos que tienen un ciclo de vida donde la fase juvenil la desarrollan en la parte de la costa y de los estuarios, viéndose esta fase afectada por la pesca artesanal mientras que la fase adulta la desarrollan en partes más profundas donde ya es explotada directamente por la pesca industrial, es así que no permiten que los organismos sigan un ciclo reproductivo continuo, desequilibrando las poblaciones de camarones. Por otra parte la extracción de post- larvas del medio natural para abastecer a las granjas camaroneras, desbalancea el equilibrio en el medio natural. Por lo tanto es vital importancia el desarrollo de técnicas e investigación sobre como reproducir y obtener a nuevos organismos en cautiverio con las mejores características y en la menor cantidad de tiempo posible. Al cerrar los ciclos reproductivos de los organismos se evitará el declive de estas pesquerías así como la dispersión de enfermedades por parte de organismos extraídos del medio silvestre (Ibarra et al., 2007) . La mejora en programas de reproducción de peneidos ha reportado un rápido crecimiento y resistencia a enfermedades así como también un mejor desempeño reproductivo (Gitterle et al., 2005). No obstante, todos los estudios evalúan el uso de la técnica de la ablación unilateral del pedúnculo ocular incluso cuando se ha reportado que compromete la integridad de los reproductores y la calidad de la progenie. 17 4. PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN - ¿Cuál es el efecto en el desempeño reproductivo y calidad de la progenie del camarón rojo del Caribe (F. brasiliensis) con y sin AUPO? 5. HIPÓTESIS La ablación unilateral del pedúnculo ocular es una técnica que acelera la maduración de las hembras, provocando un desgaste de las principales biomoléculas tales como acilglicéridos, colesterol, glucosa y proteína total soluble a través del tiempo, además de un declive en la calidad de la progenie. Por lo tanto, las hembras no ablacionadas presentarán un mejor estado de condición, mayores reservas de nutrientes en el hepatopáncreas y ovarios, así como una mejor calidad de la progenie en comparación con hembras ablacionadas. 6. OBJETIVOS Objetivo General - Determinar el desempeño reproductivo y las principales biomoléculas en ovarios, hepatopancreas, hemolinfa, huevos y nauplios en hembras de F. brasiliensis ablacionadas y no ablacionadas. Objetivos específicos - Determinar y comparar el desempeño reproductivo en hembras F.brasiliensis ablacionadas y no ablacionadas por medio de indicadores reproductivos. - Determinar y comparar el desempeño reproductivo de hembras ablacionadas y no ablacionadas de F.brasiliensis a través de indicadores bioquímicos medidos en el hepatopáncreas, ovarios y en la hemolinfa. - Determinar la calidad de huevos y nauplios producidos por hembras de F. brasiliensis ablacionadas y no ablacionadas, a través de indicadores bioquímicos. 18 7. MATERIALES Y MÉTODOS 7.1 Origen de los reproductores. Los reproductores fueron extraídos del medio natural en la Isla Controy del Estado de Quintana Roo entre los días primero y cuatro de octubre de 2015. Fueron transportados en bolsas de plástico con agua saturada en oxígeno al Área de Maduración de la Unidad Multidisciplinaria de Docencia e Investigación (UMDI) de la Universidad Nacional de México en Sisal, Yucatán para su próximo manejo. 7.2 Fase de Aclimatación y diseño experimental Los camarones fueron aclimatados por 10 días dentro del área de maduración de la UMDI/UNAM (Figura 5). Posteriormente, se seleccionaron los organismos (aquellos organismos que presentaran un morfología y comportamiento adecuado) para ser colocados en dos tanques redondos de fibra de vidrio con capacidad de 12 mil litros (un tanque para cada tratamiento; 4 m de diámetro cada uno), con una columna de agua de mar de 40 cm, implementado con un sistema de recirculación mediante diferentes filtros (mecánicos, físicos y biológicos) y recambio de agua diario del 20% (Figura 5). El agua fue esterilizada con luz UV antes de ingresar a los tanques. El experimento se llevó a cabo durante 45 días. Los tratamientos fueron: 1) F. brasiliensis sin ablación unilateral del pedúnculo ocular (FBS) y 2) F. brasiliensis con ablación unilateral del pedúnculo ocular (FBC). Se sembraron para cada tratamiento 30 hembras y 20 machos en una proporción macho: hembra 1:1.5. El agua de mar se mantuvo con aireación constante, una salinidad de 35g/l y una temperatura de 28 ± 0.5 °C. El fotoperiodo fue de 12 horas luz – 12 horas oscuridad. Los reproductores fueron alimentados con biomasa de Artemia spp adulta, poliqueto, mejillón, calamar y alimento semi-húmedo balanceado (Tabla 5) a las 8:00, 12:00, 16:00, 20:00 y 24:00 hrs respectivamente. La ración de alimento fresco (biomasa de Artemia spp. Adulta, poliqueto, mejillón y calamar) se calculó con base al 20% de la biomasa total de cada tanque. La cantidad de alimento balanceado semi-húmedo se calculó de acuerdo al 3% de biomasa total de cada tanque. Los párametros fisicoquímicos: temperatura (°C), oxígeno (mg/L) y pH fueron medidos dos veces al día (08:00 h y 20:00 h) con un multiparámetro marca Hach ® (modelo HQ40d). La salinidad fue determinada con un refractómetro (Vitalsine SR-6, EU). 19 El amonio, nitrito y nitrato se monitorearon tres veces por semana a las 08:00 h con ayuda de un kit de prueba de nitrato-nitrito, Hach ® Modelo NI-12. Figura 6 Área de reproducción de la UMDI/UNAM (Fuente: Edén Magaña Gallegos). Tabla 5 Componentes en porcentaje del alimento semi-húmedo (formulación de la dieta para reproductores de camarón; g/100g de alimento seco) Ingrediente g/100 g de alimento (%) Harina de pescado* 30 Harina de trigo** 15.6 Suero de leche** 12 Concentrado proteico de soya** 10 Hidrolizado de cabeza de mero rojo**** 10 Calamar** 5 Levadura de cerveza** 5 Aceite de hígado de bacalao** 4 Premezcla de vitaminas y minerales 2.5 Mix de aminoácidos + grenetina1 2.35 Lecitina de soya** 2 Carboximetil celulosa** 1 Colesterol*** 0.5 Carofila 0.05 *Apligén, ** Malta Cleyton, ***Sigma ****Mercado Local, 1Mezcla de aminoácidos/ 100g de dietas; LIS 0.4%, LEU 0.3%,ARG 0.4%, OH-Pro 0.2, GLUT 0.5% y MET 0.2% 7.3 Aceleración de la maduración gonádica El proceso de maduración gonádica de las hembras fue acelerado a través de la ablación unilateral del pedúnculo ocular (Sainz-Hernandez et al., 2008) ya que en su base se encuentra http://www.google.com.mx/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=QBJ0xnPGDqlIuM&tbnid=mkoG_T6QSlPpdM:&ved=0CAUQjRw&url=http://www.sisal.unam.mx/content.php?id=32&ei=qkKaUvGXMYLxoATVqoHYDg&psig=AFQjCNFIcPaJZH7ZGxylVQwTd15HqWf35w&ust=1385927651048569 20 el complejo neurosecretor órgano X- glándula del seno, el cual secreta las hormonas que inhiben el desarrollo de los ovarios (Figura 6). De acuerdo con Maldonado, (2007) este proceso acelera la maduración de las hembras de 3-4 meses a 7-12 días. Como parte del manejo, todas las hembras fueron marcadas con elastómeros de silicón para conocer el historial de desoves de cada una y tomar a cada hembra como una unidad experimental (Emerenciano et al., 2013a; Magaña-Gallegos et al., 2018). A partir de ese momento, se observó diariamentela evolución del desarrollo del ovario y la conducta reproductiva de hembras y machos. Para la identificación de los estadios de maduración gonádica se emplearon los criterios propuestos por Guitart and Quintana, (1978). Figura 7 Ablación unilateral del pedúnculo ocular de una hembra F. brasiliensis (Fotografía: Edén Magaña Gallegos) 7.3.1 Selección de las hembras maduras y cosecha de huevos Para la selección de las hembras maduras, se llevó a cabo la revisión de las gónadas durante un lapso de 45 días a las 19:00 horas, a través de la observación directa con una lámpara sumergible. Las hembras en estadio IV fueron colocadas en tanques de cosecha de 100 L (individualmente) con agua de mar filtrada y tratada con UV y EDTA con aireación continua. 21 Los tanques fueron tapados y el área se mantuvo en oscuridad. Al término del desove las hembras fueron regresadas a los tanques de maduración. Los huevos se cosecharon con una malla de 115 micras en un volumen de 10L de agua de mar filtrada y esterilizada con UV y tratada con EDTA en una concentración de 10 mg/L. Posteriormente, los huevos fueron colocados en tanques de eclosión de 100 L. El número de huevos y nauplios se estimó a partir de cinco réplicas de 4.7 mL colectados por cada desove. Se colecto una muestra por desove de huevos y nauplios para la determinación de indicadores bioquímicos. 7.3.2 Índices organosomáticos Índice gonadosomático (IGS) Un total de 10 hembras reproductoras maduras fueron sacrificadas de cada tratamiento al inicio y al final del experimento, con el fin de determinar el peso total de cada organismo así como de su respectiva gónada para obtener el IGS, el cual se calculó con la siguiente formula: IGS= (Peso de la gónada / Peso total del organismo) *100 Índice hepatosomático (IHS) Un total de 10 hembras reproductoras de cada tratamiento fueron sacrificadas al inicio y al final del experimento, con el fin de obtener el IHS. Este índice se obtiene relacionando el peso del hepatopáncreas con respecto al peso total de cada organismo. La fórmula para su cálculo es la siguiente: IHS= (Peso del hepatopáncreas/ Peso total del organismo)*100 7.3.3 Desempeño Reproductivo Para comparar el desempeño reproductivo entre tratamientos, se usaron los siguientes parámetros: porcentaje de mortalidad de las hembras, número de huevos por desove, numero de huevos por desove por gramo del peso de la hembra, numero de maduraciones consecutivas por hembra, porcentaje de hembras que desovaron al menos una vez, porcentaje de fertilización, porcentaje de eclosión, porcentaje de nauplios viables así como el total de nauplios viables en ambos tratamientos. El número de huevos y nauplios se estimaron a partir de cinco réplicas de 4.7 ml (23.5 ml en total) colectados por cada desove (Emerenciano et al., 2013a). 22 7.4 Análisis de laboratorio 7.4.1 Indicadores bioquímicos: hepatopáncreas, ovarios y hemolinfa Para la evaluación de los indicadores bioquímicos de los hepatopáncreas, ovarios y hemolinfa de las hembras de la fase de maduración se siguió la metodología propuesta por (Emerenciano et al., 2013a). Se extrajeron 200 microlitros de hemolinfa de cada hembra al inicio (día 5) y final (día 45) del experimento, para esto se contaba con jeringas de insulina de 1 mL pre-cargadas de una solución anticoagulante (SIC-EDTA). Una vez extraida la hemolinfa, esta fue transferida a un tubo Eppendorf para su centrifugación. La hemolinfa fue centrifugada a 16170 rpm (800 g) por tres minutos a 4 °C y el sobrenadante fue transferido a otro tubo eppendorf para su posterior análisis bioquímico. Para los órganos, se tomaron 10 hepatopáncreas y 10 ovarios tanto al inicio (día 5) como al final (día 45) del experimento de las hembras listas para desovar de cada tratamiento. Los órganos fueron pesados y colocados en tubos Eppendorf de 1.5.0 mL (marca Eppendorf), posteriormente fueron congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -80 °C hasta su análisis. Las muestras fueron homogenizadas con 500 µL de agua estéril, en un homogeneizador de tejidos. El homogenizado fue centrifugado a 16170 rpm (800 g) por 20 minutos a 4°C; y en el sobrenadante y en la hemolinfa se evaluaron los: i) acilgliceridos (Kit Ellitech Diagnostics, TGML-5415), colesterol (Kit Ellitech Diagnositics, CHSL-0507) y proteína total soluble (Bradford, 1974). 7.4.2 Indicadores bioquímicos: huevos y nauplios Para la determinación de los indicadores bioquímicos de los huevos y nauplios, al igual que ovarios y hepatopancreas, se tomaron muestras en el día 5 y 45 de ambos tratamientos, siguiendo la metodología propuesta por Emerenciano et al.,( 2013a) la cual consiste en colectar huevos y nauplios directamente de los tanques de desove e incubación, secarlos con papel secante cuidadosamente, pesarlos y colocarlos en tubos de microcentrifuga de 1.5Ml (marca Eppendorf), congelarlos con nitrógeno líquido y almacenarlos a -80 °C hasta su análisis. Para su análisis, a las muestras se les adiciono 200 µL de agua estéril y se homogenizaron en un homogeneizador de tejidos. Posteriormente se centrifugaron a 1670 rpm durante 10 minutos y en el sobrenadante se evaluaron los: i) acilglicéridos (Kit Ellitech 23 Diagnostics, TGML-5415), colesterol (Kit Ellitech Diagnosis, CHSL-0507) y proteínas totales solubles (Bradford, 1974). 7.5 Análisis estadístico de datos Se llevó a cabo un ANOVA de dos vías seguida de una prueba de Tukey para N´s desiguales para evaluar las diferencias significativas en lo que se refiere a la composición bioquímica del hepatopancreas, hemolinfa, ovarios, índice hepatosomático y gonadosomático, utilizando la ablación (A: ablación del ojo unilateral y no unilateral) y día (D: día 5 y 45) como factores categóricos en el modelo. Para el desempeño reproductivo y la composición bioquímica de huevos y nauplios se aplicó la prueba de T de Student. Todos los datos fueron verificados previamente para determinar la homogeneidad de varianzas y la normalidad. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando el programa RStudio versión 1.1.383 (RStudio Team, 2016) con el paquete Rcmdr (Fox, 2005). 24 8. RESULTADOS 8.1 Parámetros fisicoquímicos y calidad del agua En la tabla 6 se muestran los promedios de los parámetros físico-químicos que fueron registrados al largo del experimento de FBC y FBS en el área de maduración. Tabla 6 Parámetros fisicoquímicos (promedio ± S.E). Parámetros FBC FBS Temperatura (°C) 27.4 ±0.05 27.5 ± 0.05 Oxígeno disuelto (mg/L) 8.0 ± 0.04 8.0 ± 0.03 pH 8.09 ± 0.02 8.09 ± 0.02 Salinidad 36 ± 0.0 36 ± 0.0 Amonio (mg/L) 0.17 ± 0.04 0.17 ± 0.04 Nitrito (mg/L) 0.6 ± 0.06 0.6 ± 0.06 Nitrato (mg/L) 3.9 ± 0.4 3.9 ± 0.4 *S. E: Error estándar. 8.2 Índices gonadosomático y hepatosomático Las hembras ablacionadas del día 5 y del día 45 tuvieron un mayor índice gonadosomático en comparación con las no ablacionadas (Figura 7), mientras que el índice hepatosomático fue mayor tanto en hembras ablacionadas y no ablacionadas en el día 45 con respecto al día 5. 25 Figura 8 Promedios (± S.E.). A) Índice gonadosomático y B) hepatosomático de ambos tratamientos al día 5 y día 45. * S.E: Error estándar. 26 8.3 Desempeño Reproductivo El porcentaje de mortalidad de las hembras ablacionadas fue mayor que el de las hembras no ablacionadas (Tabla 7). El número de huevos por desove fue mayor en el caso de las hembras sin ablación aunque no se observaron diferencias significativas entre tratamientos, de igual forma el número de huevos por desove por peso de la hembra del tratamiento sin ablación fue mayor que el de las hembras ablacionada. Las hembras no ablacionadas mostraron un decremento significativo en cuanto al número de maduraciones consecutivas por hembra contra las hembras ablacionadas. Se obtuvo un mayor porcentaje de hembras que desovaronal menos una vez en el tratamiento FBC con respecto al tratamiento FBS. En el porcentaje de fertilización existieron diferencias significativas entre tratamientos, siendo las hembras ablacionadas las que obtuvieron un menor porcentaje de fertilización. La tasa de eclosión permaneció sin diferencias significativas entre tratamientos. Por otra parte, para el porcentaje de nauplios viables se observaron diferencias significativas entre tratamientos, teniendo un mayor porcentaje el tratamiento FBS. Por último, el número total de nauplios por tanque fue mucho mayor en el tratamiento de las hembras ablacionadas que en el de no ablación (Tabla 7). Tabla 7 Desempeño reproductivo (promedio ± S. E.). *S. E: Error estándar. Desempeño reproductivo FBC FBS Mortalidad de hembras (%) 33.3% 10% Número de huevos por desove (×103) 241.9±13.3 269.21±8.5 Número de huevos por desove (×103) por g del peso de la hembra 6.0±0.21 6.6±0.34 Número de maduraciones consecutivas por hembra 3.8a±0.52 1.33b±0.2 Hembras que desovaron al menos una vez (%) 83.3% 20% Tasa de fertilización (%) 45.1a ±0.9 71.6b±4.6 Tasa de eclosión (%) 34.5±5.35 37.4±12.8 Nauplios viables (%)* 14.8a±2.9 33.7b±8.6 Total de nauplios viables /tanque (×103)* 911.5 269.8 Parámetros morfométricos Peso de hembras (g) 40.8±0.6 40.2±0.7 Peso de machos (g) 24.9±0.5 24.2±0.5 27 8.3 Variables bioquímicas En lo que respecta a los análisis bioquímicos del hepatopáncreas, en el día 45 se pudo observar una diferencia significativa en las hembras no ablacionadas, las cuales presentaron el nivel más alto de acilglicéridos en dicho tejido (Tabla 8). De igual manera, las hembras no ablacionadas mostraron los niveles más altos de colesterol en el hepatopáncreas durante el mismo periodo de tiempo, teniendo diferencias significativas con respecto a las hembras del día 5 en ambos tratamientos (Tabla 8). En cuanto a la glucosa y a la proteína total soluble, en ambos tratamientos no se observaron diferencias significativas (Tabla 8). Por otra parte, se obtuvo una mayor concentración de acilglicéridos en las muestras de hemolinfa de las hembras ablacionadas del día 45, en comparación al tratamiento de hembras no ablacionadas, además de que también registraron altos niveles de colesterol en las hembras no ablacionadas del día 45, mostrando de esta manera diferencias significativas con respecto a las hembras ablacionadas (Tabla 8). Por otro lado la glucosa permaneció sin diferencias significativas, mientras que la proteína total soluble presento los niveles más altos en las hembras no ablacionadas del día 5 (Tabla 8). En los ovarios, los acilglicéridos y el colesterol no mostraron diferencias significativas entre tratamientos o el día. La glucosa se presentó predominantemente más alta en las hembras ablacionadas del día 45. Los análisis de acilglicéridos, colesterol y glucosa en los huevos no mostraron diferencias significativas entre los tratamientos (FBC vs FBS) mientras que la proteína total soluble fue mayor en los huevos de hembras sin ablación (Tabla 9). Los análisis bioquímicos para los nauplios arrojaron que no hubo diferencias significativas entre tratamientos ni en acilglicéridos, colesterol, glucosa, proteína total soluble. 28 Tabla 8 Análisis bioquímico (peso húmedo; promedio ± S.E) llevado a cabo en el hepatopancreas, hemolinfa y ovarios (estadio IV) de F. brasiliensis con y sin ablación en los días 5 y 45 (Latreille, 1817). Dentro de filas, el superíndice indica diferencias significativas. +ANDEVA bi-factorial. *S.E: Error estándar Ablación No ablación Nivel de significancia+ Variable Día 5 Día 45 Día 5 Día 45 Ablación Día AxD Hepatopancreas (N = 9) (N = 6) (N = 8) (N = 4) Acilglicéridos (mg g-1) 49.0b±7.5 35.7b±10.6 43.5b±11.5 93.6a±11.8 ⁕ ns ⁕ Colesterol (mg g-1) 1.8b±0.5 3.1ab±0.6 1.4b±0.5 5.3a±0.8 ns ⁕ ⁕ Glucosa (mg g-1) 2.5a±0.3 2.9a±0.4 2.4a±0.3 2.0a±0.5 ns ns ns Proteína total soluble (mg g- 1) 20.7a±1.5 26.2a±1.8 20.8a±1.6 23.9a±2.5 ns ns ns Hemolinfa* (N = 4) (N = 6) (N = 6) (N = 4) Acilglicéridos (mg dl-1) 83.4±0.7 158.2±39.8 88.2±13.6 94.2±44.5 ns ns ns Colesterol (mg dl-1) 20.3b±6.9 24.3b±5.7 43.3ab±4.3 50.3a±6.4 ⁕ ns ns Glucosa (mg dl-1) 32.4a±3.4 33.6a±5.7 32.3a±6.9 35.0a±6.4 ns ns ns Proteína total soluble (mg ml-1) 68.7b±22.5 103.1ab±26.2 212.7a±37.7 122.4ab±30.2 ⁕ ns ⁕ Ovario* (N = 10) (N = 6) (N = 8) (N = 4) Acilglicéridos (mg g-1) 6.3ab±0.5 7.4a±0.7 5.3ab±0.6 4.2b±0.8 ⁕ ns ns Colesterol (mg g-1) 1.6a±0.3 1.0a±0.4 1.8a±0.3 2.1a±0.5 ns ns ns Glucosa (mg g-1) 1.5b±0.2 2.8a±0.2 1.3b±0.2 0.9b±0.3 ⁕ ns ⁕ Proteína total soluble (mg g- 1) 45.5±4.1 49.1±5.3 45.2±4.6 53.4±6.5 ns ns ns 29 Tabla 9 Análisis bioquímicos (promedio ±SE) llevados a cabo en huevos y nauplios (estadio IV) ablacionados y no ablacionados de reproductores F. brasiliensis (Latreille, 1817) . Variable FBC FBS Huevos (N = 27) (N = 4) Acilglicéridos (mg g-1) 9.3±0.3 8.3±1.1 Colesterol (mg g-1) 1.6±0.0 1.3±0.1 Glucosa (mg g-1) 2.9±0.2 2.3±0.2 Proteína total sol.(mg g-1) 32.0a±3.0 56.1b±10.0 Nauplios (N = 18) (N = 4) Acilglicéridos (mg g-1) 3.7±0.5 2.4±0.4 Colesterol (mg g-1) 2.3±0.2 1.7±0.2 Glucosa (mg g-1) 3.6±0.4 2.5±0.3 Proteína total sol. (mg g-1) 27.6±2.2 19.2±1.8 Dentro de las filas, el superíndice indica diferencias significativas para la prueba de t de Student (P < 0.05). *S.E:_Error estándar 30 9. DISCUSIÓN 9.1 Parámetros físicos, químicos y calidad del agua En lo que respecta a los parámetros fisicoquímicos, ambos tratamientos no presentaron variaciones entre ellos. Los parámetros fisicoquímicos del agua son de suma importancia ya que su deterioro afecta de manera negativa la salud de los camarones (Boyd Claude, Lin Kwei Chang, Pantoja Carlos, Lightner Donald, Brock Jim, Johnson Ken, 2005), es por eso que los parámetros se deben de medir diariamente con el fin de no permitir condiciones adversas que puedan dañar a los organismos. La temperatura oscilo entre los 27.4 y 27.5 °C por lo que se mantuvo constante durante el experimento y dentro de la temperatura recomendada para camarones de aguas tropicales, la cual está en el rango de los 22 a los 30 °C (FAO, 1988). La concentración de oxígeno en nuestros tratamientos se mantuvo dentro del rango establecido para el cultivo de camarones peneidos con 8.0 ± 0.04 mg/ L (Boyd et al., 2005). Por otra parte, el pH es de gran importancia ya que nos indica que tan ácida o que tan básica se encuentra el agua; es así que nuestra agua debe de permanecer dentro del rango de entre los 7 y 9, ya que cambios abruptos pueden producir efectos negativos para el equilibrio del estanque, es así que el pH de nuestros tanques permaneció en 8, dentro del rango óptimo. La salinidad se mantuvo en 35 mg/L, reportándose que para la mayoría de las especies esta debe permanecer entre 15 y 40 (FAO, 1988). En cuanto al nitrógeno amoniacal total (TAN), nitrito y nitrato, estos se mantuvieron dentro del rango aceptable de acuerdo a Lin and Chen, (2001) y Lin and Chen, (2003). 9.2 Desempeño reproductivo 9.2.1 Índices organosomáticos El índice gonadosomático fue mayor en hembras ablacionadas desde el día 5 hasta el día 45 en comparación con las hembras no ablacionadas, esto se debe a un mayor desarrollo ovárico y un mayor estado de maduración avanzado como consecuencia de la ablación (Palacios et al., 1999a). El índice hepatosomático mostró en ambos tratamientos (ablación vs no ablación) que fue mayor en el día 45. Esto se puede deber a que las hembras necesitan reservar nutrientes para su transferencia a los huevos (Figura 7). Asimismo, el alimento que se les proporcionó durante el experimento es rico en lípidos y proteínas, tratando de asemejar y mejorar la dieta que obtienenen el medio silvestre. 31 9.2.2 Índices productivos La ablación unilateral del pedúnculo es uno de los métodos más utilizados para inducir a la maduración y desove, ya que se ha comprobado que esta técnica aumenta el rendimiento reproductivo en términos cuantitativos, principalmente se puede observar en el acortamiento del periodo de latencia así como el aumento en la frecuencia de desove, es decir una mayor producción así como un mayor número de desoves y total de nauplios por hembra (Palacios et al., 1999a; Racotta et al., 2003).Sin embargo, la ablación también afecta negativamente las variables de producción tales como el número de huevos por desove, tasa de fertilización, tasa de eclosión, mortalidad de las hembras, entre otras más (Palacios et al., 1999c). Conforme va pasando el tiempo se observa un declive en la capacidad reproductiva debido a la sucesivas remaduraciones (maduraciones consecutivas por hembra), ya que se ha demostrado que hay un mayor desgaste energético, destinando la mayor cantidad de recursos a la reproducción y no al mantenimiento, descuidando de esta manera su sistema inmunológico y por la tanto siendo también más susceptibles a enfermedades (Browdy & Samocha, 1985; Chamberlain, 1988). Es así que en el presente estudio se observó que hubo un mayor porcentaje de mortalidad en hembras ablacionadas que en hembras no ablacionadas (33.3% vs 10%) debido a la condición fisiológica de las hembras ablacionadas (Racotta et al., 2003). Como consecuencia de la ablación, se pudo observar un mayor número de maduraciones consecutivas por hembra ablacionada (Tabla 7). Otros estudios reportan un mayor como número de maduraciones en hembras ablacionadas, alcanzando hasta 10 desoves por cada hembra en 90 días, mientras que en las hembras no ablacionadas solamente se observaron dos hembras con tres desoves consecutivos durante el mismo periodo de tiempo (Palacios et al., 1999b). Por otro lado Aktaş (1999) reportó para P. semisulcatus solo tres desoves en hembras no ablacionadas en comparación con las hembras ablacionadas de las cuales solamente se obtuvieron 38 desoves durante un periodo de 45 días. De igual manera Browdy et al (1985) reportaron un mayor número de maduraciones en hembras ablacionadas (89 desoves) que en hembras no ablacionadas (14 desoves) en P. semisulcatus , confirmando de esta manera que la ablación aumenta el número de desoves de manera importante durante el mismo periodo de tiempo, es así que existe un mayor porcentaje en el número de hembras ablacionadas (83.3%) que desovan contra las que no están ablacionadas (20%) (Tabla 7). 32 Por otra parte, observamos que a pesar de que las hembras ablacionadas tengan un mayor número de desoves, tienen una menor tasa de fertilización en comparación con las hembras no ablacionadas (41. 1 vs 71.6). Esto puede ser debido a que al realizar la ablación, aceleran la producción de huevos pero el proceso de formación de huevos maduros se produce de manera desigual en la gónada. Según E Palacios et al.,( 1999) la ablación causa un desarrollo del ovario desigual, desarrollo asincrónico del ovocito y una alterada liberación de ovocitos maduros. Por otra parte las hembras no ablacionadas tienen un mejor desarrollo del ovario y por lo tanto de los ovocitos, dándose el tiempo de reabsorberlos si están malformados antes de pasar a la finalización de su maduración (Palacios et al., 1999a). Browdy L. et al Craig, Hadani Aliza, Samocha M. Tsachi, 1986; L, 1985; E Palacios et al., 1999, reportan de igual manera una mayor tasa de fertilización en organismos no ablacionados que ablacionados. En consecuencia, la no ablación, produce un mayor número de nauplios viables, no obstante la ablación, incrementa la producción de nauplios, como consecuencia de la remaduración acelerada (Tabla 7). 33 Tabla 10 Comparación del desempeño reproductivo de varias especies de camarones peneidos en contraste con el presente trabajo. 9.3 Variables bioquímicas En lo que respecta a la maduración sexual en camarones, diversos estudios demuestran que los fosfolípidos, acilglicéridos y colesterol son las principales clases de lípidos que influyen de manera importante en el desempeño reproductivo (Wouters et al., 2001a). El hepatopancreas es un importante órgano de reserva temporal, ya que almacena los nutrientes para el mantenimiento de los organismos y durante la maduración sexual transfiere nutrientes a los ovarios y posteriormente a los huevos (Tabla 2,3). Los organismos no ablacionados del día 45 tuvieron mayor cantidad tanto de acilglicéridos como de colesterol, esto debido a que Penaeus semisulcatus Penaeus semisulcatus Penaeus semisulcatus Litopenaeus vananamei Farfantopenaeus brasiliensis Referencia (Aktaş, 1999) Browdy L. Craig, Hadani Aliza, Samocha M. Tsachi, 1986 Browdy & Samocha, 1985 Palacios et al., 1999a Trabajo actual Mortalidad de hembras (%) 17(Ablación) 13( no ablación) 33.3 (Ablación) 10 (no ablación) Número de huevos por desove (x103) 177.0 ± 133.34 (ablación) 23.216 ±16.95 (no ablación) 89.2 ±33.9 (ablación) 113.6 ± 46 (no ablación) 61.327 ± 22. 957 (ablación) 81.938 ± 27.518 (no ablación) 221.9 ±32.1 (Ablación) 178.7 ±39.9 (no ablación) 241.9±13.3(ablación) 269.21±8.5 (no ablación) Número de huevos por desove por g del peso de la hembra 3.8 (ablación) 0.58 (no ablación) 2.14 (ablación) 2.7 (no ablación) 1.57 (ablación) 2.13 (no ablación) 6.66 (ablación) 4.69 (no ablación) 6.0± 0.21 (ablación) 6.6 ± 0.34 (no ablación) Tasa de fertilización (%) 83.81 ± 14.74 (ablación) 86.53 ±4.51 (no ablación) 68.6 ± 27.1 (ablación) 83.6 ±14.4 (no ablación) 65.5 ±28.2 (ablación) 81.3 ±8.8 (no ablación) 74.6 ± 2.2 (ablación) 84.5 ±7.4 (no ablación) 45.1 ± 0.9 (ablación) 71.6 ± 4.6 (no ablación) Tasa de eclosión (%) 47.82 ±24.43 (ablación) 59.99 ± 20.88 (no ablación) 65.8 ±28.9 (ablación) 83.7 ±15.5 (no ablación) 90.3 ± 6.5 (ablación) 89.6 ± 11.7 (no ablación) 45.8 ± 4.7 (ablación) 50.8 ± 14.3 (no ablación) 34.5 ±5.35 (ablación) 37.4 ±12.8 (no ablación) Peso de hembras 46.25 ± 8.34 (ablación) 39.97 ± 4.91 (no ablación) 41.6 ± 8.4 (ablación) 41.7 ± 7.0 (no ablación) 38.84 ± 4.17 (ablación) 38.43 ± 2.95 (no ablación) 33.3 ± 1.1 (ablación) 38.1 ± 2.3 (no ablación) 40.8 ± 0.6 (ablación) 40.2 ± 0.7 (no ablación) 34 las hembras no ablacionadas reservan mayor cantidad de energía tanto para el mantenimiento como para la reproducción siendo los acilglicéridos una fuente de energía para el mantenimiento de ellas mismas así como para la producción y eclosión de huevos (Xu et al., 1994). Las hembras ablacionadas tienen un desgaste energético debido a que la mayoría de las reservas energéticas las enfocan hacia la reproducción; es así que su porcentaje de mortalidad es mayor (Tabla 7). Por otro lado, la hemolinfa es la encargada de transportar las biomoléculas a todos los órganos. Observamos que hubo un mayor transporte de colesterol y proteína total soluble en los organismos no ablacionados. Estas biomoléculas están íntimamente involucradas en el crecimiento ya que la proteína total soluble es constituyente del tejido así como el colesterol es un componente importante en la membrana celular, indicando de esta manera un transporte hacia los ovarios y posteriormente a los huevos. Mientras que las hembras ablacionadas transportan una menor cantidad de nutrientes debido al desgaste energético provocado por la ablación (Rosas et al., 1993). Durante la maduración sexual se ha observado un incremento de los acilglicéridos en los ovarios en diversos estudios para después ser transferidosa los huevos. Ravid et al.,/( 1999) reportó un incremento de acilglicéridos de un 1.09% a un 39.65% para Penaeus semisulcatus así como también en L. vannamei incremento de un 8.30% a un 33.81%. En nuestro caso los ovarios no tuvieron diferencias significativas, sin embargo se observó un aumento de los acilglicéridos en los huevos siendo estos transferidos a partir de los ovarios de hembras ablacionadas. (Tabla 7). De igual manera se observó un incremento de glucosa en hembras ablacionadas, indicando una rápida transferencia hacia los huevos. La glucosa es esencial para la sobrevivencia de las larvas por ser una fuente de energía. Por otra parte, obtuvimos una mayor cantidad de proteína total soluble en los huevos de hembras no ablacionadas. No obstante, esta mayor cantidad de proteína total soluble no se vio reflejada en los nauplios, esto pudo deberse a que durante su desarrollo de huevo a nauplio (estadio IV) , las biomoléculas (acilglicéridos, proteína total soluble, carbohidratos) se distribuyeron para la formación de tejido en el caso de la proteína y en el de los acilglicéridos para proveerles de energía para su desarrollo, dando como resultado un mayor porcentaje de nauplios viables de organismos no 35 ablacionados (33.7%) que ablacionados (14.8%; Tabla 7). La proteína es una biomolécula de gran importancia durante la maduración, reproducción y crecimiento de los organismos, ya que durante este proceso se lleva a cabo una intensa biosíntesis de vitelo, hormonas y enzimas (Harrison, 1990) para posteriormente la formación de tejido. 36 10. CONCLUSIÓN La ablación es una técnica utilizada para acelerar la maduración gonádica en camarones, debido a esto hubo una mayor producción de huevos y consecuentemente de nauplios. Sin embargo, el presente estudio sugiere que la ablación produce un desgaste energético en las hembras, teniendo como consecuencia un mayor índice de mortalidad en las hembras ablacionadas ya que por el otro lado, el porcentaje de mortalidad de las hembras no ablacionadas fue muy bajo. Por otra parte, la mayor producción de huevos en el tratamiento de hembras ablacionadas confirma lo reportado en otros estudios, aunque en el presente estudio se utilizó una menor cantidad de proteína total soluble para el desarrollo larvario. En contraste, las hembras no ablacionadas presentaron un mejor estado de condición y por lo tanto, una mayor tasa de supervivencia. Asimismo, la progenie proveniente de hembras no ablacionadas tuvo una mejor calidad en términos de viabilidad de nauplios y una mayor cantidad de reservas nutricionales en huevos. En términos de producción, se sugiere que la ablación es una técnica viable, debido a que se tienen picos predecibles de producción; no obstante, puede tener implicaciones importantes en la progenie. Por otra parte, como es el caso de F. brasiliensis, se observó que se reproducen en cautiverio sin la necesidad de ablacionar, es por esto que se sugiere incrementar ciertos alimentos que contengan nutrientes que estimulen la reproducción, o en otro caso, hacer uso de otras técnicas donde no se someta al animal a tanto estrés, y por lo tanto, menos invasivas. 37 11. BIBLIOGRAFÍA Aktaş, M. 1999. Gonadal Maturation and Spawning of Penaeus semisulcatus ( Penaeidae : Decapoda ) 23: 61–66. Alava, R., Kanasawa, A., Teshima, S. & Koshio, S. 1993. 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