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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA EFECTO DEL DETERIORO DE CHÍA (Salvia hispanica L.) SOBRE SU CALIDAD NUTRIMENTAL. TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICA DE ALIMENTOS PRESENTA MARÍA CELESTE DE LA CRUZ - GARDUÑO CDMX. 2018 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO: PRESIDENTE: QFB. ORTIZ PALMA PEREZ JUAN DIEGO VOCAL: QFB. SANDOVAL GUILLEN BERTHA JULIETA SECRETARIO: DR. MARTINEZ MANRIQUE ENRIQUE 1er. SUPLENTE: QA. VEGA PEREZ ADRIANA 2° SUPLENTE: M EN C. TRAPALA REYNA JONATHAN SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: LABORATORIO DE BIOQUÍMICA Y FISIOLOGÍA DE GRANOS DE LA FES CUAUTITLÁN, UNAM. ASESOR DEL TEMA: Dr. Enrique Martínez Manrique SUPERVISOR TÉCNICO: I.A. Verónica Jiménez Vera SUSTENTANTE: María Celeste De la Cruz Garduño El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Bioquímica y Fisiología de Granos de la FES Cuautitlán, UNAM, con el apoyo del programa PIAPI – 1606 ÍNDICE RESUMEN ............................................................................................................ 10 INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 11 1. MARCO TEÓRICO ........................................................................................... 13 1.1 Chía (Salvia hispanica L.) .......................................................................... 13 1.1.1 Origen e historia de la chía .................................................................... 13 1.1.2 Características botánicas ....................................................................... 14 1.1.3 Semilla de chía ....................................................................................... 17 1.1.4 Composición química de la semilla ........................................................ 18 1.1.5 Producción ............................................................................................. 27 1.2 Aspectos generales de las semillas ......................................................... 28 1.2.1 Almacenamiento de semillas .................................................................. 29 1.2.2 Deterioro de semillas ............................................................................. 31 1.3 Factores Antinutrimentales ....................................................................... 32 1.3.1 Taninos .................................................................................................. 33 1.3.2 Ácido fítico .............................................................................................. 34 1.3.3 Inhibidores de tripsina ............................................................................ 35 2. OBJETIVOS ...................................................................................................... 36 2.1 Objetivo general ......................................................................................... 36 2.2 Objetivos particulares ................................................................................ 36 3. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................. 37 3.1 Lugar donde se desarrolló el proyecto .................................................... 37 3.2 Materiales biológicos ................................................................................. 37 3.3 Esquema General de Trabajo .................................................................... 38 3.4 Métodos ...................................................................................................... 39 3.4.1 Deterioro acelerado de las semillas ....................................................... 39 3.4.2 Evaluación de condiciones de deterioro ................................................. 39 3.4.3. Evaluación de contenido nutrimental .................................................... 40 3.4.4 Determinación de la calidad de proteína ................................................ 41 3.4.5 Factores antinutrimentales ..................................................................... 42 3.4.6. Relación de Eficiencia Proteica ............................................................ 43 3.4.7. Análisis estadístico ................................................................................ 43 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................... 44 4.1 Evaluación de condiciones de deterioro .................................................. 44 4.2 Análisis Químico Proximal ........................................................................ 45 4.3 Factores antinutrimentales ....................................................................... 47 4.4 Evaluación de la calidad proteica ............................................................. 48 4.4.1 Digestibilidad in vivo y Relación de la Eficiencia proteica ...................... 49 5. CONCLUSIONES ............................................................................................. 54 6. RECOMENDACIONES ..................................................................................... 55 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 56 ANEXO 1. MÉTODOS ANÁLITICOS ....................................................................... i ANEXO 2. RESULTADOS OBTENIDOS EN LA EVALUACIÓN BIOLÓGICA . xviii ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Jerarquía taxonómica de la chía ............................................................ 14 Tabla 2. Composición química correspondiente a la semilla de Chía ................... 19 Tabla 3. Contenido de aminoácidos correspondientes a hidrolizados de proteínas de semillas de chía ................................................................................................ 20 Tabla 4. Perfil de ácidos grasos del aceite de chía ............................................... 24 Tabla 5. Contenido de vitaminas y minerales presentes en semillas de chía ....... 25 Tabla 6. Contenido de antioxidantes presentes en semillas de chía ..................... 27 Tabla 7. Análisis Químico Proximal en base seca de la harina de chía con diferentes días de deterioro. .................................................................................. 46 Tabla 8. Contenido de factores antinutrimentales harina de semillas de chía con diferentes grados de deterioro ............................................................................... 47 Tabla 9. Digestibilidad in vitro y contenido de triptófano de harina de semillas de chía con diferentes grados de deterioro ................................................................ 48 Tabla 10. Resultados de Digestibilidad in vivo y PER ajustado para las dietas de caseína y chía con diferente grado de deterioro. .................................................. 50 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Planta de chía (Salvia hispanica L.) ....................................................... 16 Figura2. Semilla de chía (Salvia hispanica L.)...................................................... 18 Figura 3. Comparación del contenido de proteínas de diferentes cereales con el grano de chía ........................................................................................................ 19 Figura 4. Esquema general de trabajo para el estudio del efecto del deterioro de chia (Salvia hispanica L.) sobre su calidad nutrimental ......................................... 38 Figura 5. Variación de la ganancia en peso de las ratas en las dietas analizadas.52 Figura 6. Variación del peso del bíceps femoral de las ratas en las dietas analizadas. ............................................................................................................ 53 Figura 7. Variación del peso del hígado de las ratas en las dietas analizadas. .... 54 10 EFECTO DEL DETERIORO DE CHÍA (Salvia hispanica L.) SOBRE SU CALIDAD NUTRIMENTAL. RESUMEN La semilla de chía (Salvia hispanica L.), es de interés dietario-medicinal, fuente de ácidos grasos Omega-6 y Omega-3, proteínas, antioxidantes y fibras solubles e insolubles. Teniendo en cuenta su creciente demanda y su importancia como producto dietario, se propuso evaluar el efecto del almacenamiento inadecuado en esta semilla. La velocidad del deterioro de la calidad genética y fisiológica de las semillas depende de las condiciones ambientales y de la constitución genética. Con la finalidad de valorar el envejecimiento (deterioro) provocado por el almacenamiento de semillas de chía se colocaron a deterioro acelerado por 9, 18, 27, 36, 45 y 56 días a 40ºC con humedad relativa del 75%. Se evaluaron los efectos de las condiciones de deterioro mediante su poder germinativo y la conductividad eléctrica, así como su composición química, la cuantificación de factores antinutrimentales y su calidad nutrimental mediante digestibilidad de proteínas y triptófano y se realizó un estudio biológico para determinar la razón de eficiencia proteica y la digestibilidad aparente. Después del deterioro acelerado la chía perdió su poder germinativo tras el almacenamiento, posiblemente a consecuencia de daño en membranas, la disminución del poder germinativo indica la existencia de un deterioro en las semillas y esto tuvo un efecto sobre el contenido de lípidos y proteínas de las semillas. Hubo disminución en el contenido de triptófano y de digestibilidad en los diferentes periodos de tiempo. Del mismo modo los factores antinutrimentales se vieron afectados, teniendo un pequeño aumento por el deterioro. Los resultados de la relación de eficiencia proteica reflejan la deficiencia de aminoácidos en las dietas de harina de chía en comparación con la caseína. Por lo tanto, se puede concluir que, la calidad nutrimental de la chía fue afectada negativamente por el almacenamiento inadecuado. 11 INTRODUCCIÓN La planta Salvia hispanica L., mejor conocida como chía, es una planta herbácea anual perteneciente a la familia Lamiaceae, es nativa del sur de México y norte de Guatemala. La semilla de chía junto con el maíz, el frijol y el amaranto, fueron cultivos importantes para las civilizaciones precolombinas de América, incluyendo a las poblaciones mayas y aztecas (Capitani et al., 2012). Esta planta es una de las especies vegetales, cuya semilla, tiene la mayor concentración de ácidos grasos alfa linolénico (omega 3) (González - Jiménez, 2010). Además, aporta elevados niveles de fibra dietética, compuestos fenólicos, proteínas, minerales y vitaminas liposolubles como A, D, E y K (Tosco, 2004; Ixtaina, 2010; Capitani, 2013), lo que la hace un grano con alta calidad nutrimental. La chía debe ser almacenada para usarse cuando sea necesario. El principio de un buen almacenamiento es el empleo de bodegas secas, limpias y libres de plagas y el producto almacenado debe mantenerse fresco, seco y protegido de insectos, pájaros, hongos y roedores. Se ha comprobado que el almacenamiento deficiente de granos y semillas deriva en un deterioro paulatino y pérdida de la calidad sanitaria, alimentaria y agrícola. Esto se debe a que los granos y semillas, absorben humedad, lo que provoca una activación de su metabolismo, dando como resultado cambios bioquímicos que provocan la disminución de su calidad agronómica por la pérdida de su capacidad germinativa, sanitaria por contaminación de hongos y alimentaria por su pérdida de calidad nutrimental (Munguía, 2010). Durante el envejecimiento natural de la semilla se reduce el contenido total de reservas, como carbohidratos y proteínas (Basavarajappa et al., 1991), que es una causa importante de los efectos en el crecimiento y desarrollo de la nueva plántula al avanzar el deterioro de la semilla. Es importante mencionar que actualmente, la semilla se guarda para comercializarla o consumirla durante el año y es sustancial protegerlo de la humedad y la temperatura; por ello es recomendable almacenar las semillas en humedades relativas de 65% o menor y una temperatura inferior a 25° C. Los 12 gradientes de temperatura dentro de la masa de las semillas producen migración de humedad desde las zonas más calientes a las más frías, esta redistribución puede generar focos con condiciones propicias para el deterioro de la semilla almacenada. Aun conociendo esta información, generalmente los agricultores, por falta de recursos, no almacenan granos y semillas adecuadamente y bajo estas condiciones se ha probado que algunos granos disminuyen su calidad nutrimental, como es el caso del frijol (Munguía, 2010) o el amaranto (Salazar et al., 2013). Es por eso que, con base en la información antes expuesta, se propone estudiar el efecto de un almacenamiento inadecuado de la semilla chía sobre su calidad nutrimental. Se provocará un deterioro acelerado de la semilla de chía y se realizará el análisis químico proximal a la harina de las semillas de chía con diferente grado de deterioro. Además, se determinará la presencia de factores antinutrimentales (inhibidores de tripsina, taninos y ácido fítico). También se evaluará el contenido de triptófano, la digestibilidad in vitro y la digestibilidad in vivo y la relación de eficiencia proteica. Las pruebas se realizarán por triplicado; calculando su media, desviación estándar y coeficiente de variación. Las medias se analizarán mediante la prueba de rango múltiple t-student con un nivel de significancia de 0.05. 13 1. MARCO TEÓRICO 1.1 Chía (Salvia hispanica L.) 1.1.1 Origen e historia de la chía Debido a que su denominación es en lengua indígena y a que existen descripciones precisas de sus formas de uso, es probable que el conocimiento y la domesticación de la Chía se remonte a la época prehispánica (Gillet, 1981). Existen evidencias que demuestran que la semilla de chía fue utilizada como alimento hacia el año 3500 a.C., siendo cultivada en el Valle de México entre los años 2600 y 900 a.C. por las civilizaciones teotihuacanas y toltecas. Asimismo, fue uno de los principales componentes de la dieta de los aztecas (Rodríguez, 1992). La chía era uno de los granos más importantes para la subsistencia hace cinco siglos. Además, la semilla de chía la usaban en la ofrenda al dios de la lluvia. Se conoce que la ciudad de Tenochtitlán recibía cada año como tributo de los pueblos conquistados, un mínimo de 6,360 toneladas de maíz, 4,410 toneladas de porotos, 4,410 toneladas de chía y 3,780 toneladas de amaranto (Ayerza y Coates, 1996). También se utilizaba como materia prima para producir un aceite que era empleado como base en pinturas decorativas y ungüentos cosméticos (Jaramillo, 2013). El uso de la Chía en las ceremonias religiosas paganas fue el motivo por el cual los conquistadores españoles trataron de eliminarla y reemplazarla con especies traídas del Viejo Mundo (Coates,2009). Con el paso del tiempo la semilla perdió su importancia y su uso cayó en el olvido en la cultura mexicana (Salgado et al., 2005), y fue desplazada por los cereales traídos por los españoles. Durante muchos años las semillas de chía fueron comercializadas solamente en los mercados mexicanos. En 1965 la chía comenzó a estar disponible en comercios dietéticos del sudeste de California y Arizona y hacia finales del año 1980 se comenzó a comercializar como un alimento para mascotas (Chia Pets), incrementándose la demanda de las semillas y posibilitando la venta mayoritaria de su producción (Hicks, 1966). 14 1.1.2 Características botánicas Según la clasificación taxonómica propuesta por Carlos Lineo, la posición sistemática de la chía (Salvia hispanica L.) se presenta en la tabla 1 Tabla 1. Jerarquía taxonómica de la chía Jerarquía Descripción Reino Plantae Subreino Tracheobionta División Magnoliophyta o Angiospermae Clase Magnoliopsida o Dicotyledoneae Subclase Asteridae Orden Lamiales Familia Lamiaceae Subfamilia Nepetoideae Tribu Mentheae Género Salvia Especie Hispanica Fuente: Jaramillo, 2013 La familia Lamiaceae cuenta con 170 géneros y más de 3000 especies de amplia distribución en regiones tropicales y templadas (Burkart, 1979). Son hierbas anuales o arbustos perennes, que contienen aceites esenciales en los pelos glandulares de sus hojas y tallos, motivo por lo cual han sido domesticadas para ser utilizadas como condimentos y en la elaboración de perfumes. 15 El género Salvia incluye unas 900 especies y se distribuye extensamente en varias regiones del mundo, tales como Sudáfrica, América Central, América del Norte, Sudamérica y Asia Sur-Oriental. Las plantas pueden ser herbáceas o leñosas, y sus flores muy atractivas y de varios colores. Su planta tiene una altura entre un 1.0 y 1.5 metros, y sus tallos son ramificados, de sección cuadrangular con pubescencias cortas y blancas. Las hojas opuestas con bordes aserrados miden de 80 a 100 cm de longitud, y 40 a 60 mm de ancho. Sus flores de color azul intenso o blancas se producen en espigas terminales (figura 1). El pedúnculo es corto, el cáliz persistente en forma de tubo, abultado, estriado, con bello blanco, la corola es tubular, de color azul, con cuatro estambres, dos de los cuales son más grandes y estériles. El ovario es discoideo y el estigma bífido. Las características de los estambres, el color y la forma de la flor y la presencia del disco nectarífero, hacen presumir que la chía es alogamica (transfieren polen de la antera de la flor de la planta al estigma de la flor de una planta genéticamente diferente) y entomófila (polinizada por insectos) (Ayerza y Coates, 2006). 16 Figura 1. Planta de chía (Salvia hispanica L.) Fuente: Di Sapio, 2008 La Salvia hispanica L. se encuentra naturalmente en áreas de bosques de encino o de pinoencino y se distribuye en ambientes semicálidos y templados del Eje Neovolcánico Transversal de las Sierras Madre Occidental, del Sur y de Chiapas, en altitudes que oscilan entre 1400 y 2200 m. La planta de la chía se desarrolla en forma óptima en suelos ligeros a medios, bien drenados, no demasiado húmedos; como la mayoría de las salvias, es tolerante a la acidez y a la sequía, pero no soporta las heladas. Requiere abundante sol, y no fructifica en la sombra (Cahill, 2003). El mayor centro productor de México está en Acatic, Jalisco donde se tienen registradas varias empresas, algunas en 17 asociación con productores agrícolas, que procesan y exportan la semilla de chía y sus derivados, principalmente, hacia Estados Unidos, donde están logrando una demanda creciente. (González-Jiménez, 2010) 1.1.3 Semilla de chía La semilla es, de acuerdo con la botánica, la parte del fruto que contiene el embrión de una futura planta. Esta parte se encuentra protegida por una testa y deriva de los tegumentos del primordio seminal. Las plantas con semillas se conocen como espermatofitas. La semilla es producida mediante la maduración de un óvulo de una gimnosperma o de una angiosperma y además de contener al embrión de una futura planta, la semilla es una fuente de alimento (Vázquez et al., 1997). Las semillas y sus funciones tienen una gran importancia para la alimentación humana. Por eso, más allá de la acción de la naturaleza, el hombre ha desarrollado un proceso productivo que incluye la siembra, la cosecha, el secado, la clasificación, la selección, el lavado, el tratamiento, el almacenaje y el embalaje de las semillas. La semilla de chía, al igual que el fruto de otras especies de la familia Lamiaceae, es típicamente un esquizocarpo consistente en lóculos indehiscentes que se separan para formar 4 mericarpios parciales denominados núculas, comúnmente conocidos como semillas, los cuales son monospérmicos, ovales, suaves y brillantes, de color pardo grisáceo con manchas irregulares marrones en su mayoría y algunos blancos (Figura 2) (Ayerza y Coates, 2005) Hoy en día, la semilla de chía es una fuente potencial de nutrientes para las industrias de alimentación humana y animal. La producción mundial está aumentando debido a sus propiedades; se le conoce como un alimento exótico y se le atribuyen cualidades nutricionales y terapéuticas excepcionales. La chía es un cultivo viable para ser explotado es ideal para enriquecer gran cantidad de 18 productos como fórmulas para bebés, alimento para animales, barras nutritivas, entre otros. (Beltrán y Romero, 2003). Figura 2. Semilla de chía (Salvia hispanica L.) Fuente: Di Sapio, 2008 1.1.4 Composición química de la semilla Como fuente botánica, existe variabilidad en la composición de las semillas de chía, esto está en función del lugar de crecimiento, años de cosecha dentro de la ubicación, debido a los efectos del genotipo y medio ambiente, así como las interacciones genéticas por el ambiente. Las semillas de chía son notables por el contenido de sus componentes químicos relevantes para la nutrición humana. En la tabla 2, se muestra la composición química de las semillas de chía. 19 Tabla 2. Composición química correspondiente a la semilla de Chía Análisis Proximal (%) Humedad 6.8 Proteínas 17.9 Lípidos 27.3 Carbohidratos disponibles 8.9 Cenizas 4.5 Fibra dietética 34.6 Fuente: Arroyo, 2011 1.1.4.1 Contenido de proteínas La chía posee un contenido de proteínas que oscila entre un 19 y 27%, el cual es mayor que el de los cereales como el trigo, el maíz, el arroz, la avena y la cebada (Figura 3), presentando como ventaja añadida el no contener gluten, motivo por el cual ha sido aprobada como apta para su consumo en pacientes celíacos. Figura 3. Comparación del contenido de proteínas de diferentes cereales con el grano de chía Fuente: Arroyo, 2011. 23.00 13.70 9.40 6.50 16.90 12.50 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 Chía Trigo Maíz Arroz Avena Cebada 20 Las proteínas de chía presentan un adecuado perfil de aminoácidos esenciales. Entre ellos, puede destacarse el contenido de lisina, así como metionina y cistina los cuales son mayores que los presentes en las proteínas de otras semillas oleaginosas y los cereales (Ting et al., 1990). El contenido de aminoácidos de las proteínas de la chía se muestra en la Tabla 3. Tabla 3. Contenido de aminoácidos correspondientes a hidrolizados de proteínas de semillas de chía Aminoácidos g/16 g N Aminoácidos g/16 g N Ácido aspártico 7.64 Isoleucina 3.21 Treonina 3.43 Leucina 5.89 Serina 4.86 Triptófano - Ácido glutámico 12.40 Tirosina 2.75 Glicina 4.22 Fenilalanina 4.73 Alanina 4.31 Lisina 4.44 Valina 5.10 Histidina 2.57 Cistina 1.47 Arginina 8.90 Metionina 0.36 Prolina 4.40 Total80.64 Fuente: Ayerza y Coates, 2005 Se ha demostrado que la chía puede incorporarse a la dieta humana junto con otros granos a fin de producir un balance de proteínas más equilibrado (Ayerza y Coates, 2011). 21 1.1.4.2 Contenido de carbohidratos Los hidratos de carbono engloban entre el 35% y 40% de su peso final. Dentro de éstos, no se encuentran azúcares (0% de monosacáridos y disacáridos), y casi el 90% es fibra y el resto fécula. La mayoría de la fibra es soluble y de alto peso molecular (mucílagos), con una extraordinaria capacidad de retención de agua (Reyes et al. 2008). Por este motivo, cuando se ponen en contacto con agua u otro medio acuoso, incrementan su peso 14 veces más que el salvado de trigo y 16 veces más que la linaza, creando un gel de textura viscosa. 1.1.4.2.1 Contenido de Fibra La American Association of Cereal Chemists (2001) define: “la fibra dietética es la parte comestible de las plantas o hidratos de carbono análogos que son resistentes a la digestión y absorción en el intestino delgado, con fermentación completa o parcial en el intestino grueso. La fibra dietética incluye polisacáridos, oligosacáridos, lignina y sustancias asociadas de las plantas. La fibra dietética promueve efectos fisiológicos beneficiosos como laxante y/o atenúa los niveles de colesterol y/o glucosa en sangre”. En síntesis, son sustancias de origen vegetal, hidratos de carbono o derivados de los mismos, excepto la lignina, que resisten la hidrólisis por parte de las enzimas digestivas humanas y llegan intactos al colon donde algunos pueden ser hidrolizados y fermentados. La fibra dietética puede clasificarse como soluble e insoluble de acuerdo a su comportamiento en medio acuoso. La fibra soluble en contacto con agua forma un retículo donde ésta queda atrapada, dando lugar a soluciones de gran viscosidad. Los efectos derivados de la viscosidad de la fibra son los responsables de sus acciones sobre el metabolismo lipídico, hidrocarbonado y en parte de su potencial anticarcinogénico. Dada la capacidad de la fibra dietética soluble de formar geles, tiene la propiedad de retardar la evacuación gástrica, lo que a su vez hace más eficiente la digestión 22 y absorción de los alimentos, generando una mayor sensación de saciedad (Tiwary et al., 1997). Dentro de este grupo se encuentran gomas, mucílagos, algunas pectinas, ciertos tipos de hemicelulosas y polisacáridos solubles. Las fibras insolubles son capaces de retener el agua en su matriz estructural formando mezclas de baja viscosidad (Álvarez et al. 2006). El análisis comparativo del contenido de fibra de las semillas de chía respecto al de otros cereales, permite apreciar que la chía tiene 1.6; 2.3; 2.6; 8.3 y 9.8 veces más contenido de fibra dietética que la cebada, trigo, avena, maíz y arroz, respectivamente. El contenido de fibra en la harina residual de chía (luego de la extracción de aceite) representa alrededor de un 40%, del cual un 5% corresponde a fibra soluble, denominada mucílago. Las semillas de chía contienen 5-6% de mucílago que se puede utilizar como fibra dietética (Reyes et al, 2008). Los mucílagos son constituyentes normales de los vegetales, producto de su metabolismo y se acumulan en células especiales dentro de los tejidos. Se localizan como material de reserva hidrocarbonado, reserva de agua en plantas o bien como elementos estructurales en vegetales inferiores (algas), proporcionándoles elasticidad y suavidad. El mucílago de las semillas de chía es un polisacárido de alto peso molecular (Lin et al. 1994), se encuentra en las tres capas exteriores de la cubierta de la semilla. Cuando la semilla entra en contacto con el agua, el mucílago emerge inmediatamente y en un corto periodo se forma un "cápsula mucilaginosa" transparente que rodea la semilla (Muñoz et al. 2012). 1.1.4.3 Contenido de lípidos Las funciones generales que desempeñan los lípidos son cinco: 1) como componentes estructurales de la membrana celular, 2) depósito de reservas intracelulares, 3) una forma de transporte de combustible metabólico, 4) aislante térmico y eléctrico, y 5) como agente de protección de las paredes celulares de diversos organismos. También existen algunos compuestos lipídicos que poseen 23 una intensa actividad biológica, comprendiendo algunas vitaminas y precursores, así como cierto número de hormonas (Covarrubias, 2002; Andrew, 2002). Los ácidos grasos son los principales constituyentes de los lípidos, dependiendo si ellos contienen enlaces simples o dobles, darán origen a los ácidos grasos saturados (AGS) o insaturados (AGI), respectivamente (Covarrubias, 2002; Andrew, 2002). Existe un grupo de ácidos grasos poliinsaturados que se denominan ácidos grasos esenciales (AGE), los cuales son muy importantes para la nutrición humana pero no pueden sintetizarse en el organismo humano y deben ser incorporados a partir de la dieta. Los AGE para el hombre son: los ácidos grasos Omega 3 (ácido linolénico y sus derivados de cadena larga) y los ácidos grasos Omega 6, cuyo precursor es el ácido linoleico. La evidencia sugiere que los ácidos grasos Omega 3 juegan un rol importante en la membrana celular. La función de estos ácidos grasos, es aportar mayor flexibilidad a las membranas celulares, permitiendo el movimiento de proteínas en su superficie y dentro de la bicapa lipídica. Las cantidades necesarias de ácidos grasos Omega 3 van a depender del ciclo de vida de cada persona y de su estado fisiológico o patológico que pueden llevar a un aumento en las necesidades de ácidos grasos. Se estima en promedio que es necesaria una ingesta del 1% de la energía total de ácidos grasos Omega 3 y un 4% de la energía total para los Omega 6. El problema radica en que el contenido de ácidos grasos Omega 3 en nuestra alimentación es muy bajo, por lo que el consumo diario no alcanza a superar el 0.5 % de la energía total. De todas las fuentes de ácido grasos Omega 3, sólo el lino (Linum usitatissimum L.) y la chía tienen su origen en cultivos agrícolas. Ambas son especies vegetales con la mayor concentración de ácido graso linolénico conocida hasta la fecha. Estas semillas, fuentes de Omega 3, a menudo se utilizan molidas como 24 ingrediente alimenticio, o en forma natural como suplemento dietético. (Di Sapio, 2008) Las semillas de chía poseen un 33% de aceite del cual el ácido linolénico representa el 62 % y el linoleico el 20% y representan la fuente vegetal con más alta concentración de omega 3, en la tabla 4 se muestra el perfil de ácidos grasos de este aceite. Tabla 4. Perfil de ácidos grasos del aceite de chía Ácido graso (% total de ácidos grasos) Ácido mirístico - Ácido palmítico 6.9 Ácido palmitoleico - Ácido esteárico 2.9 Ácido oleico 6.8 Ácido linoleico 20.5 Ácido linolénico 62.9 Fuente: Ayerza y Coates, 2005 1.1.4.4 Contenido de vitaminas y minerales La semilla de chía se ha caracterizado por ser una buena fuente de vitaminas y minerales del complejo B como la Niacina, tiamina y ácido fólico, así como Vitamina A. Además, la semilla de chía es una fuente excelente de calcio, fósforo, magnesio, potasio, hierro, zinc y cobre, como se muestra en la Tabla 5. Otra de las grandes ventajas de esta semilla es su bajo contenido en sodio (Ayerza y Coates, 2006) 25 Tabla 5. Contenido de vitaminas y minerales presentes en semillas de chía Fuente: Instituto Nacional de Alimentos, 2003 Con respecto al contenido de minerales, las semillas de chía son una excelente fuente de calcio, fósforo, magnesio, potasio hierro, zinc y cobre. En comparación con la leche, las semillas de chía presentan un contenido 6 veces mayor de calcio, Nutriente Semilla de chía entera Macroelementos (mg/100g) Calcio 714 Potasio 700 Magnesio 390 Fósforo 1067 Microelementos (mg/100g) Aluminio 2 Boro - Cobre 0.2 Hierro16.4 Manganeso 2.3 Molibdeno 0.2 Sodio - Zinc 3.7 Vitaminas (mg/100g) Niacina 6.13 Tiamina 0.18 Riboflavina 0.04 Vitamina A 44 IU 26 el doble de fósforo y 4.6 veces más de potasio (United States Department of Agriculture (USDA), 2002; Instituto Nacional de Alimentos, 2003). Los niveles de hierro en las semillas de chía son muy elevados, presentando valores poco frecuentes en semillas (Bushway et al.,1981). 1.1.4.3 Contenido de antioxidantes La semilla de chía contiene compuestos con potente actividad antioxidante, ácido clorogénico, el ácido cafeíco, los flavonoles, la miricetina, quercetina y el kaempferol. Estos compuestos son antioxidantes primarios y sinérgicos que contribuyen a la fuerte actividad antioxidante de la chía (Taga, 1984; Castro- Martínez, 1986). El contenido de ellos se reporta en la Tabla 6. Dentro de los antioxidantes presentes la quercetina impide la oxidación de los lípidos, proteínas y ADN, y sus propiedades son más efectivas que los flavonoles no-ortohidroxi. Por su parte los ácidos cafeíco y clorogénico demostraron tener una alta actividad contra radicales libres y procesos oxidativos en general, inhibiendo la peroxidación de los lípidos, siendo estas propiedades de antioxidantes más significativas que las del ácido ferúlico y los antioxidantes comunes como el ácido ascórbico y la vitamina E (Ayerza y Coates, 2006). Entre sus propiedades funcionales la principal ventaja es la ya mencionada ayuda contra la oxidación lipídica, que en el caso de los alimentos produce sabores extraños, el típico sabor a pescado, sin embargo, en el organismo humano contribuye a disminuir los efectos del envejecimiento y enfermedades degenerativas como el cáncer, enfermedades cardiovasculares, cataratas, disminución del sistema inmunológico y disfunción cerebral (Ayerza y Coates, 2006). 27 Tabla 6. Contenido de antioxidantes presentes en semillas de chía Compuestos g/kg de semilla de chía No hidrolizados Ácidos cinámicos Ácido cafeíco 6.6 x 10-3 Ácido clorogénico 7.1 x 10-3 Hidrolizados Flavonoles Miricetina 3.1 x 10-3 Querecetina 0.2x 10-3 Kaempferol 1.1 x 10-3 Ácidos cinámicos Ácido cafeíco 13.5 x 10-3 Fuente: Taga et al., 1984 1.1.5 Producción Los principales países productores de chía son: México, Bolivia, Argentina, Paraguay, Australia, Nicaragua y Perú (Iñurrategui, 2013) A nivel internacional, la semilla de chía es considerada como un suplemento dietario por la FDA (Food and Drug Administration). En este sentido, en el año 2009, quedó autorizada en el mercado comunitario (Unión Europea) la comercialización de semillas de chía (S. hispanica) y semillas de chía trituradas, para ser utilizadas como un nuevo ingrediente alimentario en productos de 28 panadería con un contenido máximo de semillas de chía del 5% (Carrión, 2016). Además, la industria alimentaria de diversos países, incluyendo Reino Unido, Canadá, Chile, Australia, Nueva Zelanda y México, utilizan la semilla de chía o su aceite en la elaboración de productos tales como cereales para el desayuno, jugos de frutas, tortas, yogur, entre otros (Borneo et al., 2010). En nuestro país existe la oportunidad de abastecer una demanda de 5 millones y medio de toneladas, con un gasto aproximado de $2,800 millones de pesos anuales. Sin embargo, el precio medio rural es de $20,000 pesos por tonelada y el costo de producción está alrededor de $10,200 pesos permitiendo una utilidad de $13,818 pesos por hectárea, lo cual es muy superior a lo que se obtiene con maíz o sorgo de temporal. El cultivo de la chía es una alternativa rentable que puede mejorar los ingresos de los agricultores en zonas áridas y semiáridas (INTA, 2011). Las ventajas nutricionales de la chía, así como la comercialización de productos que la incluyen como ingrediente alimentario están en creciente avance a nivel mundial. Actualmente, es posible encontrar semillas de chía en alimentos destinados al consumo humano y animal, utilizándola en la elaboración de panes, galletas, barras energéticas, suplementos dietarios, bebidas energéticas y aceite. Además, se han logrado obtener productos de origen animal enriquecidos con omega 3, tales como huevos, pollo, carne bovina, chorizo, jamón, leche y quesos, los cuales presentan atributos sensoriales aceptables por parte del consumidor (Langman et al., 2006; Ramírez, 2009; Salazar-Vega et al., 2009; Salvador-Vega et al., 2010 Antruejo et al., 2011). 1.2 Aspectos generales de las semillas La semilla es el medio de reproducción sexual de las espermatofitas, gimnospermas y angiospermas, se define en un sentido botánico estricto, como un ovulo fecundado, independiente de la planta madre, que ha madurado hasta adquirir la diferenciación y capacidad fisiológica para originar un nuevo vegetal. La 29 semilla es la unidad de dispersión de las espermatofitas, es decir, el conjunto de tejidos que integran los propágalos sexuales de esta planta y que incluyen además de los tejidos derivados del ovulo, otros como el pericarpio, perianto y brácteas, que protegen a los primeros, y que ayudan tanto a diseminar los propágulos en el ambiente, como a controlar el crecimiento de los meristemos (Flores, 2004). Una semilla usualmente consta de un embrión, tejidos nutritivos y cubiertas. La forma, el tamaño, la textura, la consistencia y el color de esas partes son variables según las especies, variedades, y aun entre lotes de semillas de la misma especie y variedad. El embrión es la parte de la semilla que da origen al nuevo vegetal. En las semillas maduras de algunas plantas el embrión es rudimentario, es decir, pequeño y poco diferenciado, mientras que en otras constituye la mayor parte de la semilla y posee una morfología bien definida. En este último caso, el eje embrionario un tejido de forma alargada como un meristemo en cada punta, y según la especie, presenta una o más hojas modificadas llamadas cotiledones (Flores, 2004). El extremo del embrión que da origen al tallo de la planta y que tiene el meristemo cubierto con primordios de hojas se conoce como epicotilo o plúmula; mientras que la parte del embrión que esta entre la unión de los cotiledones con el eje y el meristemo que da origen a la raíz de la radícula se llama hipocotilo (Flores, 2004). 1.2.1 Almacenamiento de semillas La importancia del almacenamiento de semillas para la humanidad ha sido reconocida desde tiempos prehistóricos (Priestley, 1986). La mayoría de las prácticas de almacenamiento de semillas se han desarrollado empíricamente, con frecuencia como resultado de una combinación de observación casual y decisiones pragmáticas sobre lo que se puede lograr más fácilmente, a manera de control o modificación ambiental. En la agricultura, por ejemplo, la fuerza impulsora para tal conocimiento empírico ha sido el simple requisito práctico de 30 almacenar semillas con seguridad, desde una cosecha hasta la siguiente temporada de producción. Para garantizar la disponibilidad de granos y semillas en la cantidad, así como con la oportunidad y calidad requeridas, es necesario recurrir a su almacenamiento y conservación. El almacenamiento se refiere a concentrar la producción en lugares estratégicamente seleccionados; en tanto que la conservación implica proporcionar a los productos almacenados las condiciones necesarias para que no sufran daños por la acción de plagas, enfermedades o del medio ambiente, evitando así mermas en su peso, reducciones en su calidad o en casos extremos la pérdida total (SAGARPA, s.f.). El principio de un buen almacenamiento es el empleo de bodegas secas, limpias y libres de plagas y el producto almacenado debe mantenerse fresco, seco y protegido de insectos, pájaros, hongos y roedores. Se ha comprobado que el almacenamiento deficiente de granos y semillas derivaen un deterioro paulatino y pérdida de la calidad sanitaria, alimentaria y agrícola. Esto se debe a que los granos y semillas, absorben humedad, lo que provoca una activación de su metabolismo, dando como resultado cambios bioquímicos que provocan la disminución de su calidad agronómica por la pérdida de su capacidad germinativa, sanitaria por contaminación de hongos y alimentaria por su pérdida de calidad nutrimental (Munguía, 2010). Cada especie tiene una fecha idónea prevista de siembra, lo más habitual es que sea necesario almacenar la semilla durante periodos de tiempo diversos que se pueden clasificar de la manera siguiente: a) Hasta un año, cuando la producción de la semilla se efectúa con periodicidad anual, pero es necesario esperar la temporada idónea para la siembra. b) De 1 a 5 años o más, cuando una especie fructifica en abundancia a intervalo de varios años y debe recolectarse en un año semilla buena y suficiente para satisfacer las necesidades anuales en los años intermedios, en los que la producción de semilla es escasa. c) A largo plazo, con 31 fines de conservación de recursos genético. El periodo de almacenamiento varía en función de la longevidad de la semilla, de la especie y las condiciones del almacenamiento; sin embargo, en especies que se almacenan en ambientes óptimos, el tiempo de almacenamiento se suele medir en decenios (Walters et al., 2005). En México no existen cifras precisas que indiquen el volumen de pérdida de granos y semillas; sin embargo, se estima que anualmente se pierde entre el 5% y el 25% de la producción total de maíz, trigo y frijol, principales granos básicos del país. Cuando la semilla alcanza la madurez fisiológica, también está en su nivel fisiológico óptimo. Esta calidad fisiológica comienza a disminuir a una velocidad variable, pero inexorable, que depende de las condiciones de almacenamiento. Alta humedad relativa y altas temperaturas son muy desfavorables. La pérdida de germinación de semillas en proceso de deterioro es una de las últimas consecuencias; porque previamente se suceden cambios fisiológicos, bioquímicos y físicos como degradación de membranas, disminución de la respiración y biosíntesis, disminución de la tasa de germinación, crecimiento y desarrollo, desuniformidad, menor resistencia de las plántulas y finalmente pierde la germinación (Salinas, 2012). 1.2.2 Deterioro de semillas Las semillas son capaces de sobrevivir como organismos viables regenerativos hasta que el tiempo y el lugar sean adecuados para empezar una nueva generación. Sin embargo, como cualquier otra forma de vida, ellas no pueden retener su viabilidad indefinidamente y eventualmente se deterioran y mueren (Copeland y McDonald, 2001; Doijode, 2001). Durante el almacenamiento, mecanismos de deterioro de la semilla disminuyen la germinación, la velocidad de crecimiento de la plántula y la tolerancia a 32 condiciones adversas (Van Deynze, 2004). Otros síntomas de la semilla deteriorada incluyen: crecimiento anormal, daños en estructuras principales de las plántulas, pérdida de compuestos solubles debido a excesiva permeabilidad de la membrana, reducción de la actividad enzimática, daño oxidativo al ADN y a las proteínas y producción de sustancias tóxicas como ácidos grasos libres (Basavarajappa et al., 1991). La generación de radicales libres y la peroxidación de lípidos daña la integridad física de las membranas que, a su vez, causa pérdida de compartimentación celular y la expulsión de solutos (Van Deynze, 2004). La semilla de cualquier especie presenta su más alto nivel de vigor y potencial germinativo en la madurez fisiológica, desde la cual se inicia un proceso continuo e irreversible de deterioro hasta perder su capacidad germinativa. Por lo que, el deterioro de una semilla se puede entender como una serie de cambios en el tiempo, que afectan funciones vitales y su desempeño, hasta causar su muerte (Van Deynze, 2004). El deterioro de la semilla está asociado con cambios en su metabolismo; por ejemplo, la disminución de carbohidratos que ocurre con la edad de la semilla podría resultar en insuficiencia de sustratos respiratorios para la germinación o en la incapacidad para usarlos (Bernal y Leopold, 1992; Cruz-Pérez et al., 2003). 1.3 Factores Antinutrimentales Las semillas de cereales y leguminosas son alimentos completos; contienen simultáneamente carbohidratos, proteínas, lípidos, y algunos micronutrientes como vitaminas y minerales, disponibles para la alimentación directa e indirecta del hombre; razón por la cual durante muchos años han constituido la fuente principal para el suministro de energía y proteína dietaría humana, especialmente en los países pobres; sin embargo, algunas semillas, especialmente las leguminosas presentan en su composición sustancias antinutricionales (Solano et al., 2015). 33 El término antinutrientes se utiliza para calificar a aquellos compuestos que afectan el valor nutricional de algunos alimentos, especialmente semillas, pues dificultan o inhiben la asimilación de nutrientes que provienen de alimentos generalmente de origen vegetal (proteínas y minerales); desde el punto de vista bioquímico estos factores son de naturaleza variada y pueden llegar a ser tóxicos o causar efectos fisiológicos poco deseables como la flatulencia; distensión estomacal, afectaciones pancreáticas, aglutinación de glóbulos rojos, disminución en la asimilación de nutrientes, entre otros; los factores antinutricionales son sustancias naturales no fibrosas, generadas por el metabolismo secundario de las plantas como mecanismo de defensa a situaciones estresantes o contra el ataque de mohos, bacterias, insectos y aves (Elizalde, 2009) Así pues, la denominación de “antinutricional’, dada a estos compuestos, es adoptada a partir del enfoque que los ve como recursos alimenticios para animales y humanos y no de las funciones que cumplen en los tejidos de los vegetales que los contienen. Los factores antinutricionales pueden clasificarse como termo estables y termo lábiles; los factores termo estables incluyen: factores antigénicos, oligosacáridos y aminoácidos no proteicos tóxicos, saponinas, estrógenos, cianógenos, fitatos; siendo los más importantes: los factores antigénicos, los oligosacaridos, las saponinas y los fitatos. así mismo, entre los factores termo lábiles se encuentran, los inhibidores de proteasas (tripsina y quimotripsina), lectinas, goitrogenos y antivitaminas; siendo los más importantes los inhibidores de proteasas y las lectinas (Belmar, 2001). 1.3.1 Taninos Son compuestos polifenólicos de un amplio peso molecular que habitualmente se dividen en hidrolizables y condensados. Estos son capaces de unirse a enzimas, proteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos, esteroides, saponinas, y formar complejos con el hierro del alimento, dificultando la digestión de los nutrientes (De 34 Lange, 2000; Smithard, 2002; Caldas, 2004). Aunque hay diferencias químicas entre ellos, todos son compuestos fenólicos y pueden precipitar la proteína. La capacidad de ligar proteínas por los taninos, se ha considerado como un elemento importante para predecir sus efectos en sistemas biológicos (Carulla, 2002; Oloyo, 2002). 1.3.2 Ácido fítico El ácido fítico, mioinositol hexakisfosfato (IP6), y sus sales derivadas constituyen la mayor reserva de fósforo y mioinositol de las semillas de cereales y leguminosas. Desde el punto de vista nutricional, el interés del ácido fítico se debe principalmente a su capacidad de formar complejos con minerales esenciales (Cu, Zn, Fe, K, Mg y Ca), lo que disminuye la absorción intestinal y la biodisponibilidad de estos minerales para el hombre y los animales monogástricos; debido a que estos no están provistos de suficiente actividad de fosfatasas endógenas (fitasas)que sean capaces de liberar los minerales de la estructura del fitato. Además, los fitatos interaccionan con residuos básicos de proteínas formando complejos, como proteína-fitato y proteína-fitato-mineral, por lo que se paralizan muchas reacciones enzimáticas a nivel digestivo. Sin embargo, se ha demostrado que, durante el procesamiento de los alimentos y la digestión, la cantidad final de ácido fitico disminuye significativamente como consecuencia de su hidrólisis enzimática o química (Elizalde et al., 2009). Paradójicamente, el ácido fítico, a bajas dosis, presenta también efectos positivos sobre la salud como son su acción protectora frente al cáncer, reducción de la formación de cálculos renales y prevención de enfermedades cardiovasculares. (Szkudelski, 1997) El AF se encuentra en los alimentos en niveles del 0.1- 6% (Reddy, 1982; Gibson, 2010), dependiendo su concentración de la parte de la planta que se consuma: en semillas los niveles son elevados, en tubérculos, raíces y frutas moderados, y en verduras bajos (Ravindran, 1982). En países subdesarrollados y en vías de desarrollo, así como en la población vegetariana de países desarrollados, el 35 consumo de alimentos con altos niveles de AF es muy elevado (Rasco, 1990; Khokhar, 1994; Wyatt, 1994). El consumo medio de AF en la dieta se ha estimado en 0.75-0.79 g/persona/día, siendo estos niveles 2 ó 3 veces mayores en países en vías de desarrollo como la India (Khokhar, 1994). 1.3.3 Inhibidores de tripsina Los inhibidores de la tripsina son globulinas capaces de inhibir la tripsina y la quimiotripsina pancreática, impidiendo la proteólisis digestiva y aumentando las pérdidas de nitrógeno por heces. Son sustancias de carácter proteico, que se encuentran en leguminosas. En presencia de una proteasa y un sustrato producen una notoria disminución en la velocidad de la reacción catalizada por la enzima. Esta acción tiene grandes implicaciones en el valor nutricional de las semillas tanto para el hombre como para los animales; el páncreas, glándula productora de la mayoría de las enzimas digestivas, se afecta notablemente y se evidencia su hipertrofia ante la ingestión continua de semillas o derivados con el inhibidor activo (Cheftel, 1989; Liu, 2004). Aunque en alimentación animal se han logrado importantes avances (Perilla, 1997; Ruiz, 2004), en nutrición humana, para las culturas occidentales, se conoce muy poco. La degradación del inhibidor depende principalmente del tratamiento térmico, el cual presenta diferente efectividad según la presión a la cual se efectúe (Matrai, 1996; Van den Hout, 1998). 36 2. OBJETIVOS Los objetivos del presente trabajo se detallan a continuación 2.1 Objetivo general Estudiar el deterioro de la chía (Salvia hispanica L.) provocado por un mal almacenamiento, mediante un conjunto de pruebas fisicas, químicas y biológicas para evaluar el efecto sobre su calidad nutrimental. 2.2 Objetivos particulares Evaluar el grado de deterioro de las semillas de chía provocado por el almacenamiento inadecuado (75%HR y 40°C) mediante pruebas de germinación y de conductividad con la finalidad de conocer las alteraciones fisiologicas de la semilla. Evaluar el efecto del almacenamiento inadecuado de la chía sobre su calidad nutrimental mediante su análisis químico, digestibilidad in vitro y contenido de triptófano en la proteína de la semilla deteriorada, así como por un método biológico para determinar la Relación de Eficiencia Proteica (PER) y la Digestiblilidad in vivo. Evaluar los factores antinutrimentales (taninos, ácido fítico e inhibidores de tripsona) presentes en las semillas con métodos específicos para establecer la relación con su deterioro. 37 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Lugar donde se desarrolló el proyecto El presente trabajo se desarrolló el laboratorio de Bioquímica y Fisiología de Granos, de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, Universidad Nacional Autónoma de México. 3.2 Materiales biológicos El material biológico utilizado fueron semillas maduras de chía (Salvia hispanica L.), cosechadas en Puebla, México en 2016. Adquiridas en la Central de Abasto de la Ciudad de México en 2017. 38 3.3 Esquema General de Trabajo En la figura 4 se muestra es esquema general de trabajo que se siguió durante la investigación. Figura 4. Esquema general de trabajo para el estudio del efecto del deterioro de chia (Salvia hispanica L.) sobre su calidad nutrimental Semilla de chía Deterioro de semilla Germinación Conductividad Humedad en semilla Evaluación de condiciones de deterioro Harina de chía Analisis químico proximal Humedad Proteína Grasa Ceniza Fibra Carbohidratos Factores antinutrimentales Taninos Ácido Fitico Inhibidores de tripsina Determinación de la calidad de proteína Triptófano Digestibilidad in vitro Digestibilidad in vivo 39 3.4 Métodos 3.4.1 Deterioro acelerado de las semillas Las semillas de chía se sometieron a deterioro acelerado. Se colocaron en recipientes herméticos, con una solución saturada de NaCl (39.2g de sal de grano en 100 mL de agua destilada) en la parte inferior y en la parte superior se colocaron las semillas en una malla de plástico para evitar el contacto con la solución. Consecutivamente se llevaron a una temperatura de 40ºC durante diferentes periodos de tiempos (9,18, 27, 36, 45 y 56 días), además de tener un control de referencia con cero días de almacenamiento. Después de cada periodo de almacenamiento se colectó una muestra de chía, la cual se guardó en recipientes con tapa y se mantuvieron en refrigeración (8ºC) hasta su análisis. 3.4.2 Evaluación de condiciones de deterioro 3.4.2.1 Germinación La prueba de germinación se realizó de acuerdo con las Reglas de Análisis de Semillas (International Seed Testing Association, 1996). Se utilizaron tres repeticiones de cada tratamiento, colocando 50 semillas por caja Petri, manteniéndolas a una temperatura de 25ºC durante tres días, hidratándolas con agua destilada cada 24 horas; al finalizar la prueba se contaron las semillas con germinación y los resultados se expresaron como porcentaje. 3.4.2.2 Conductividad La conductividad eléctrica se determinó según el Manual de Pruebas de Vigor (International Seed Testing Association, 1995). Se colocaron tres repeticiones de 0.900 g de semillas de cada lote en matraces de 125 mL, con 20 mL de agua destilada durante un período de inmersión de 24 horas. Posteriormente se agregaron 20 mL de agua destilada en intervalos de 10mL cada 30 minutos, transcurrida la hora se midieron los valores de conductividad eléctrica con un conductímetro de marca Conment 1 modelo HI 3291. 40 3.4.2.3 Humedad en semilla El contenido de humedad se determinó por el método de sólidos totales, usando un horno de secado (925.09, AOAC, 2002) La técnica se basa en la pérdida de peso de la muestra por evaporación del agua. Para esto se requiere que la muestra sea térmicamente estable y que no contenga una cantidad significativa de compuestos volátiles. 3.4.3. Evaluación de contenido nutrimental Las muestras se secaron y molieron en un molino de cuchillas con una malla #40 USA para obtener una harina integral. A las harinas de los diferentes días de deterioro se les realizó un Análisis Químico Proximal. También se evaluó su digestibilidad in vitro y su contenido de triptófano, además de la presencia de factores antinutrimentales como los inhibidores de tripsina, taninos y ácido fítico. 3.4.3.1 Análisis Químico Proximal 3.4.3.1.1 Humedad en harina El contenido de humedad se determinó por el método de sólidos totales, usando un horno de secado (925.09, AOAC, 2002) 3.4.3.1.2 Contenido de proteínasEl contenido de proteína se determinó utilizando el método de Microkjeldahl (954.01 AOAC, 2002) empleando un digestor y destilado. Este método se basa en la transformación del N orgánico a ion NH4 + mediante una digestión de la muestra en caliente en medio sulfúrico concentrado. El ion NH4 + es neutralizado y el NH3 liberado se destila y cuantifica mediante una titulación. El Nitrógeno cuantificado se convierte a contenido de proteínas por medio de un factor. 41 3.4.3.1.3 Contenido de lípidos La determinación del porcentaje de lípidos o extracto etéreo se realizó a través de la técnica de extracción Soxhlet (954.01 AOAC, 2002). Se asume que el extracto obtenido corresponde al contenido graso de la muestra. Se determina su masa, una vez libre de disolvente, por pesada (método gravimétrico). 3.4.3.1.4 Contenido de cenizas La cuantificación de cenizas se realizó por el método de incineración (923.03, AOAC, 2002). Este método se basa en la destrucción de la materia orgánica presente en la muestra por calcinación y determinación gravimétrica del residuo. 3.4.3.1.5 Contenido de fibra cruda El contenido de fibra cruda se realizó mediante el método Weende. Este método permite determinar el contenido de fibra insoluble en la muestra, después de ser digerida con soluciones de ácido sulfúrico e hidróxido de sodio y calcinado el residuo. La diferencia de pesos después de la calcinación nos indica la cantidad de fibra presente. 3.4.3.1.6. Contenido de carbohidratos Se logró obtener el contenido de carbohidratos digeribles asumiendo que el remanente de la muestra después de depreciar agua, lípidos, proteínas, cenizas y fibra, corresponde a ellos. 3.4.4 Determinación de la calidad de proteína 3.4.4.1. Digestibilidad in vitro (Hsu et al., 1977) La digestibilidad in vitro se llevó a cabo utilizando un sistema multienzimático compuesto por tripsina, quimotripsina, peptidasa y proteasa para determinar la digestibilidad de proteínas. Se encontró que el pH de una proteína en suspensión inmediatamente después de 20 minutos de digestión tiene una gran correlación con la digestibilidad in vivo de ratas. El coeficiente de correlación entre el pH a los 42 20 minutos y la digestibilidad aparente in vitro es de 0.90, con un margen de error estimado de 2.33. 3.4.4.2. Determinación de triptófano La determinación del contenido de triptófano se realizó mediante la técnica sugerida por Rama et al., 1974, esta técnica se basa en la cuantificación espectrofotométrica del triptófano a partir de la digestión enzimática de la proteína en la muestra, y de la reacción del residuo del aminoácido con DMAB para la formación de un complejo colorido. 3.4.5 Factores antinutrimentales 3.4.5.1 Determinación de taninos La determinación de taninos se hizo mediante la técnica propuesta por ISO 9684, 1988, se basa en la extracción de los taninos hidrolizables y condensados (fenoles totales) mediante dimetilformamida (DMF) al 75% y la posterior reducción del ión férrico debido a los iones polifenoles, formando un complejo colorido en condiciones alcalinas, el cual es cuantificado espectrofotométricamente a 525nm. 3.4.5.2 Determinación de ácido fítico Se utilizó el método sugerido por (Haug y Lantzsch, 1983). Este método tiene como fundamento que el extracto de una muestra se calienta con una solución de ácido férrico para conocer el contenido de hierro libre. La disminución del hierro (determinada colorimétricamente con 2,2,-bipiridina) en el sobrenadante es la medida del contenido de ácido fítico 3.4.5.3 Inhibidores de tripsina (Kakade et al., 1974) La técnica se basa en poner en contacto el extracto acuoso o diluido de una muestra con una solución estándar de tripsina, posteriormente se determina la actividad proteolítica remanente utilizando un sustrato sintético (benzoil-arginina-p- nitroanilida o BAPNA), el cual producirá coloración, que es inversamente 43 proporcional al contenido de inhibidores de tripsina, realizándose la lectura en el espectrofotómetro a una λ=410nm. 3.4.6. Relación de Eficiencia Proteica La Relación de Eficiencia Proteica fue determinado de acuerdo al método 960.48 AOAC (1990). Las ratas fueron pesadas inicialmente y distribuidas homogéneamente de acuerdo al método de la “culebra japonesa” después fueron divididas en lotes de seis ratas, considerando el peso de cada una. Se utilizó una dieta de caseína como control, una experimental con harina de chía con 56 días de deterioro. La cantidad de proteína se ajustó a 10% para adecuar la composición de la materia prima a ensayar. Las dietas se prepararon de acuerdo a la formulación establecida por la AOAC 1990. 3.4.7. Análisis estadístico Las pruebas se realizaron por triplicado; calculando su media, desviación estándar y coeficiente de variación. Las medias se analizaron mediante la prueba de rango múltiple t-student con un nivel de significancia de 0.05 usando el programa estadístico Origin V. 4.0. 44 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 Evaluación de condiciones de deterioro Los resultados del análisis de condiciones de deterioro se muestran en la tabla 6. Tabla 6. Efecto del almacenamiento sobre las semillas de chía con diferentes grados de deterioro Muestra Humedad (%) Germinación (%) Conductividad (µS) Control 8.47±0.03ª 100e 110.6±4.2a 9 días 9.46±0.02b 92.3±0.42d 153.5±11.6b 18 días 9.52±0.02c 79.28±0.07d 149.6±3.5b 27 días 9.50±0.02c 69.30±1.83c 171.0±9.5b 36 días 9.62±0.01d 23.00±2.33b 216.6±9.3c 45 días 9.68±0.01e 23.66±1.41b 234.0±9.6c 56 días 9.70±0.02e 0a 249.6±10.4c *Diferentes letras en la misma columna indican diferencia estadísticamente significativa (P≤0.05) La prueba de conductividad eléctrica permite estimar la integridad de la membrana celular. La pérdida de la integridad de las membranas y la subsiguiente pérdida de solutos citoplasmáticos con propiedades electrolíticas son indicativas del rápido deterioro de las semillas (Tajbakhsh, 2000). El deterioro de las membranas es la principal causa de la pérdida de electrolitos y la disminución de la germinación de las semillas. El resultado de la prueba de conductividad, por lo tanto, indica que cuando un lote de semillas disminuye su germinación libera grandes cantidades de electrolitos después del remojo (Powell, 1988). Según Ferguson (1995), la prueba de germinación ofrece información suficiente sobre el desempeño de un lote de semillas, cuando este es de baja calidad. Un lote que presente 70% de germinación, seguramente se comportará presentando una baja emergencia a campo y se deteriorará rápidamente en el almacenamiento en condiciones desfavorables. 45 Se observó que las semillas aumentaron su contenido de humedad, al ser almacenadas en condiciones inadecuadas de temperatura y humedad relativa. La interacción entre los distintos niveles de humedad de la semilla y el tiempo de deterioro mostró que en todos los tratamientos hubo una disminución considerable en la germinación después del almacenamiento. El análisis estadístico indicó diferencias estadísticas significativas (P≤0.05) entre tratamientos para las variables porcentaje de germinación y de igual manera para la conductividad La disminución de la germinación y el aumento de la conductividad, indican que el almacenamiento inadecuado está provocando daños en la semilla, uno de ellos podría ser la pérdida de integridad de la membrana. Es decir, se obtuvieron semillas con diferentes grados de deterioro. 4.2 Análisis Químico Proximal Como primera etapa para evaluar el efecto del almacenamiento sobre la calidad nutrimental de la chía se determinó la composición química de las semillas de chía deterioradas. Los resultados del Análisis Químico Proximal al que fue sometido la harina de chía se observan en la tabla 7. Se presume que el aumento de la humedad activael metabolismo de la semilla de manera incompleta y provoca los cambios que afectan a la semilla (Martínez-Manrique et al., 2011). 46 Tabla 7. Análisis Químico Proximal en base seca de la harina de chía con diferentes días de deterioro. *Diferentes letras en la misma columna indican diferencia estadísticamente significativa (P≤0.05) Se nota que la humedad de la harina de chía fue aumentando con el tiempo de almacenamiento. Por otra parte, se observó una diferencia estadísticamente significativa (P≤0.05) en los porcentajes de proteína y grasa para los diferentes tiempos de almacenamiento. Mientras que en el contenido de fibra y ceniza no hubo diferencia estadísticamente significativa (P≤0.05) con el control. Los porcentajes de proteína y grasa disminuyeron en relación inversa al tiempo de deterioro. Esta pérdida pudiera asociarse a la degradación de aminoácidos y la peroxidación de grasas, por una posible generación de estrés oxidativo en los tiempos de almacenamiento prolongado. Durante el deterioro la disminución de proteína podría deberse a la acción de enzimas que participan en la germinación de la semilla, las cuales hidrolizan algunas proteínas, o bien las utilizan para el proceso (Rojas, 1993). Las causas que originan el deterioro de dichas sustancias y que conllevan a la pérdida del vigor y la germinación de las semillas son diversas y aún no se conocen, sin embargo, como las estructuras subcelulares están compuestas por lípidos y proteínas con el paso del tiempo la membrana celular podría, gradualmente, irse deteriorando perdiendo así su capacidad selectiva, y esto podría deberse a la autooxidación de los lípidos, en semillas con reservas de aceites, formando peróxidos que activan algunas enzimas y que afectan la viabilidad y vigor de las semillas (Harrington, 1973; Priestley, 1986; Niembro, 1990). Muestra Proteína (%) Grasa (%) Ceniza (%) Fibra (%) Carbohidratos (%) Control 20.02±0.50a 33.96±0.76a 4.06±0.09a 40.77±0.66a 1.19a 9 días 17.54±0.51ab 36.38±0.97a 4.77±0.05a 37.82±0.22a 3.49b 18 días 17.53±0.47ab 31.65±0.45ab 4.67±0.02a 38.21±0.31a 7.93c 27 días 18.00±0.03ab 24.70±0.38b 4.63±0.02a 40.04±0.28a 12.63d 36 días 17.07±0.02b 24.64±0.27b 4.78±0.04a 37.94±0.10a 15.58e 45 días 15.20±0.07bc 22.66±0.28b 4.90±0.03a 38.53±0.24a 18.71f 56 días 13.24±0.05c 18.71±0.32c 4.69±0.03a 38.54±0.44a 24.82g 47 4.3 Factores antinutrimentales La evaluación de los factores antinutrimentales se muestra en la tabla 8. El contenido de taninos refleja una disminución estadísticamente significativa (P≤0.05) comparado con el control, provocado por el almacenamiento. Se puede observar un aumento del porcentaje de ácido fítico en harina de chía conforme pasa el tiempo de deterioro, esto se nota a los 9 días, donde existe una diferencia estadísticamente significativa (P ≤ 0.05) comparada con el control. Estos resultados manifiestan que las condiciones de almacenamiento sí provocan cambios en los compuestos antinutrimentales, pero éstos no son suficientes para provocar una disminución en la disponibilidad de nutrientes (Morantes, 2006). Por otro lado, los inhibidores de tripsina presentaron una disminución en el día 37 con una diferencia estadísticamente significativa. Tabla 8. Contenido de factores antinutrimentales harina de semillas de chía con diferentes grados de deterioro Muestra Taninos (% Ác. Tánico) Ácido fítico (%) Inhibidores de tripsina (UTL/mg muestra) Control 0.40±0.001c 0.18±0.002a 1.31±0.01b 9 días 0.37±0.001b 1.27±0.014b 1.32±0.09b 18 días 0.51±0.002d 1.25±0.007b 1.23±0.05b 37 días 0.36±0.010b 1.27±0.02b 1.04±0.07a 36 días 0.26±0.020a 1.27±0.028b 1.36±0.05b 45 días 0.33±0.012b 1.28±0.02b 1.30±0.03b 56 días 0.27±0.010a 1.28±0.014b 1.12±0.06b *Diferentes letras en la misma columna indican diferencia estadísticamente significativa (P≤0.05) 48 4.4 Evaluación de la calidad proteica Los resultados de la digestibilidad in vitro y contenido de triptófano se exponen en la tabla 9. Un factor que condiciona la utilización de las proteínas alimenticias, modificándolas en forma variable es la digestibilidad. La disminución de la digestibilidad, a medida que se incrementa el tiempo de deterioro en las semillas, podría asociarse a la lignificación de la pared celular, por lo tanto, las semillas son más fibrosas y menos digestibles (Urriola, 1997). Tabla 9. Digestibilidad in vitro y contenido de triptófano de harina de semillas de chía con diferentes grados de deterioro Muestra Triptófano (g Try/100g proteína) Digestibilidad (%) Control 1.17±0.09a 82.48±0.47a 9 días 0.95±0.01b 82.61±0.08a 18 días 0.79±0.11c 82.54±0.34a 27 días 0.67±0.04d 83.52±0.45 36 días 0.72±0.03cd 80.50±1.37a 45 días 0.95±0.82b 70.05±0.56b 56 días 0.94±0.03b 35.24±1.62c *Diferentes letras entre columnas indican diferencia estadísticamente significativa (P≤0.05) Se puede apreciar que el contenido de triptófano disminuyó a partir de los 9 días de deterioro y a los 36 días llegó a perderse casi el 40%. La digestibilidad (tabla 9) se mantuvo sin cambios estadísticamente significativos (P ≤ 0.05) hasta los 27 días, pero disminuyó a los 45 y a los 56 días se perdió más del 50% mostrando una diferencia estadísticamente significativa (P ≤ 0.05) comparado con el control. Esto puede asociarse a la disponibilidad de las proteínas presentes en la chía debido a modificaciones químicas de los aminoácidos. 49 En la muestra control de chía presentó una digestibilidad in vitro de 83.48%, superior a la reportada para harinas de garbanzo con 75.2% (Sánchez-Vioque et al., 1999); harina de frijol negro (Phaseolus vulgaris) con 73.8%(Carbonaro et al., 1997) pero inferior a la reportada para aislado proteínico de garbanzo con 95.6% (Sánchez-Vioque et al., 1999). Sin embargo, la digestibilidad in vitro de la chía con 45 días de deterioro es inferior comparado con lo ya antes referenciado lo cual muestra que las proteínas, como se mencionó antes, pudieron haber sufrido una desnaturalización durante el deterioro. La existencia de inhibidores de tripsina sugiere que pudieran retardar la digestibilidad in vitro, así como la presencia de compuestos fenólicos antioxidantes como ya se demostró, que se sabe pueden disminuir el aprovechamiento de las proteínas (Siddhuraju y Becker, 2001) 4.4.1 Digestibilidad in vivo y Relación de la Eficiencia proteica Durante el crecimiento, además de las necesidades proteicas para la manutención del organismo, existen las exigencias para la formación de nuevos tejidos. Para garantizar que eso ocurra, las necesidades de energía del organismo también deben ser satisfechas, ya que habiendo deficiencias el organismo desvía las proteínas para producir energía. En los períodos del crecimiento intenso aumenta la necesidad proteica a ser ingerida, debido al aumento de las tasas de síntesis y degradación. Así, la calidad proteica llega a ser relacionada a su capacidad de satisfacer las necesidades del organismo, para promover adecuado crecimiento y manutención (Lajolo, 1998). En la tabla 10 se visualizan los resultados de Digestibilidad in vivo y PER ajustado para las dietas de caseína y chía con diferente grado de deterioro. El consumo de dietas a base de chía fueron inferiores a las dietas de caseína; esto refleja un menor consumo proteico cuando es comparado con las dietas de caseína. Puede deberse a la cantidad de fibras y grasas presentes en las dietas ofrecidas a los animales. Las fibras solubles e insolubles están presentes en gran 50 cantidad en la semilla de chía (34.6%), haciendo que los animales tengan una sensación más grande de saciedad, lo que conduce a menor consumo (Cárter, 1993). Aunado a esto las dietas de semilla de chía pudieron ser más susceptible que las dietas de caseína a la oxidación de lípidos por un mayor contenido de ácidos grasosinsaturados con respecto a la de caseína, por lo tanto, mayor oxidación lipídica en la chía, especialmente en las que estuvieron sometidas a un proceso de deterioro dando lugar a productos de primera y segunda generación en la oxidación de lípidos, es decir, aldehídos cetonas y ácidos y así tener mayor contenido de compuestos volátiles que generan aromas y sabor desagradables. Estos compuestos, que producen olores y sabores desagradables, pudieron provocar una disminución de su aceptabilidad. El uso de harina de chía con 27 y 56 días de deterioro provocó una disminución de la digestibilidad aparente con respecto a la dieta control de caseína (Tabla 10). Esto puede deberse a que la mayoría de las proteínas de origen animal tiene buena digestibilidad, lo que implica una absorción eficiente de aminoácidos (Bressani, 1989). Tabla 10. Resultados de Digestibilidad in vivo y PER ajustado para las dietas de caseína y chía con diferente grado de deterioro. Muestra Digestibilidad aparente PER Ajustado Lote 1 Caseína 94.64±1.20ª 3.31±0.16ª Chía 56 días de deterioro 71.60±9.76b 1.36±0.60b Lote 2 Caseína 94.56±0.01a 3.32±0.07a Chía control 78.48±0.01b 1.48±0.03b Chía 27 días de deterioro 74.23±0.01b 1.34±0.02b *Diferentes letras entre columnas indican diferencia estadísticamente significativa (P≤0.05) Las proteínas de origen vegetal son generalmente inferiores en su calidad proteica. Las variaciones en la digestibilidad pueden deberse a diferencias 51 intrínsecas a la naturaleza de las proteínas y a la presencia de factores dietéticos (fibras, taninos y otras), que modifican la digestión y las reacciones químicas que liberan los aminoácidos y proteínas por procesos enzimáticos (OMS, 1985). Se puede observar que la digestibilidad in vivo de la chía con 56 días de deterioro es mayor al compararla con la digestibilidad in vitro (Tabla 10). Por otra parte, en cuanto a la relación de eficiencia proteica (Tabla 10), los valores muestran diferencia estadísticamente significativa (P ≤ 0.05) entre las diferentes dietas. El método se utiliza como forma de evaluación del crecimiento y del beneficio de la proteína. El valor de PER arriba de 2 se relaciona con proteína de alta y buena calidad biológica y el valor de PER abajo de 1.5 con la proteína de baja y mala calidad (Friedman, 1996) Siendo así, se puede señalar que las dietas no serán de buena calidad, puesto que este grupo presentó PER inferior a 1.5. Se observa una diferencia estadísticamente significativa al comparar las dietas de caseína con las de chía, por otro lado, al comparar las dietas de chía entre si no existe diferencia estadísticamente significativa. Con base en lo anterior se puede afirmar que el deterioro no tiene efecto sobre la calidad de la proteína. El contenido de nutrientes de las dietas de chía, a pesar de estar dentro del intervalo de referencia de calidad de proteínas, no es equivalente a la dieta a base de caseína, esto indica que no puede ser utilizada como una fuente de proteínas en los alimentos por sí sola, a pesar de sus beneficios para la salud. La ganancia de peso corporal se observa en la figura 5. 52 Figura 5. Variación de la ganancia en peso de las ratas en las dietas analizadas. Existen diferencias en cuanto al peso absoluto de las ratas que consumieron las dietas de caseína y aquellas que consumieron las dietas de chía. Las dietas de chía no promovieron el crecimiento y mantenimiento adecuados del peso corporal en comparación con la dieta de caseína puesto que, de una forma general, presentó los menores valores referentes a todos los indicadores biológicos analizados. Como el consumo de alimento y de proteínas de la dieta de caseína fue mayor que el de las dietas de chía, las dietas de caseína presentaron una variación ponderal más grande, en comparación con las dietas de chía, lo que ya era esperado, pues más allá de la calidad, la cantidad de proteína ingerida interviene directamente con un mayor crecimiento corporal, acompañado de una variación ponderal más grande. Los mayores valores en cuanto al consumo de alimento y de proteínas y una variación ponderal más grande están presentes en las dietas 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 1 2 3 4 5 6 G a n a n c ia d e p e s o ( g ) Rata Caseína Caseína lote 2 Chía control Chía 27 días de deterioro Chía 56 días de deterioro 53 de caseína, que se atribuye no sólo a la mayor ingestión de alimento, sino también al alto valor biológico de la proteína presente en esa dieta. Se observa que la dieta de caseína presentó aumento de peso corporal cuando es comparado con la dieta de chía con 56 días de deterioro, existe menor variación ponderal comparando las dietas de chía entre sí. Esto pudo deberse al origen de la proteína consumida, lo que confirmó que la proteína de la harina de chía a 56 días de deterioro tuvo menor retención. En las figuras 6 y 7 se muestra el peso órganos analizados. El músculo y el hígado son órganos implicados en los procesos metabólicamente activos. Por ello, las necesidades nutricionales están generalmente relacionadas con el tamaño de estos. Figura 6. Variación del peso del bíceps femoral de las ratas en las dietas analizadas. 0 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 P e s o d e b ic e p s f e m o ra l (g ) Rata Caseína Caseína lote 2 Chía control Chía 27 días de deterioro Chía 56 días de deterioro 54 Figura 7. Variación del peso del hígado de las ratas en las dietas analizadas. El peso de bíceps femoral de las ratas sometidas a dieta de caseína es superior comparado con aquellas ratas que fueron sometidas a una dieta de chía esto se atribuye directamente a la diferencia en el perfil de aminoácidos de las dietas, la digestibilidad, además de la aceptación de las dietas por parte de las ratas. Se observa un comportamiento similar para el peso del hígado, es decir, en las ratas sometidas a las dietas de caseína el peso del hígado es superior al peso del hígado de las ratas que consumieron las dietas de chía. Esto puede ser explicado por un desgaste de glucógeno hepático en las ratas con dieta de chía. 5. CONCLUSIONES La velocidad e intensidad en el deterioro gradual, irreversible y acumulativo de la semilla de chía que ocurre durante su almacenamiento dependerá del tiempo, la temperatura del almacenamiento y las características intrínsecas de la semilla. 0 2 4 6 8 10 12 1 2 3 4 5 6 P e s o d e h íg a d o ( g ) Rata Caseína Caseína lote 2 Chía control Chía 27 días de deterioro Chía 56 días de deterioro 55 Las semillas que presentaron altos porcentajes de germinación presentaron bajos valores de conductividad eléctrica, por lo tanto, la prueba de conductividad eléctrica podría ser buen indicativo del comportamiento de semillas en condiciones extremas o desfavorables. El deterioro de la chía debido a las condiciones inadecuadas de almacenamiento provocó una pérdida de su poder germinativo y daño a nivel membrana. Las condiciones de almacenamiento inadecuado provocan el deterioro y la disminución de lípidos y proteínas. En especial disminuyó el contenido de triptófano y disminuyó su digestibilidad. Los factores anti nutrimentales también se vieron afectados, teniendo un pequeño aumento por el deterioro. Los resultados de la relación de eficiencia proteica reflejan la deficiencia de aminoácidos en las dietas de harina de chía en comparación con la caseína. La calidad nutrimental de la chía fue afectada negativamente por el almacenamiento inadecuado. 6. RECOMENDACIONES Es importante continuar con este estudio, caracterizando de forma extensiva el perfil de ácidos grasos y aminoácidos. Asimismo, correlacionar las relaciones concentración de éstos con la calidad de la proteína. 56 BIBLIOGRAFÍA Almendáriz,
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