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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
PLAN DE TESIS
EFECTO DEL TIEMPO DE GERMINACIÓN EN LA ACTIVIDAD HEMAGLUTINANTE DE LAS LECTINAS EN EL TARWI (Lupinus mutabilis Sweet).
APELLIDOS Y NOMBRES: LÓPEZ URBANO, Laedy Ruth
ASESORA: Ing. PORRAS OSORIO, Mary Ana Luisa
HUANCAYO - PERÚ
2012
I. TITULO:
EFECTO DEL TIEMPO DE GERMINACIÓN EN LA ACTIVIDAD HEMAGLUTINANTE DE LAS LECTINAS EN EL TARWI (Lupinus mutabilis Sweet).
II. TEMA DE INVESTIGACIÓN: Inactivación de antinutrientes por germinación 
III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
Si bien es cierto que hoy en día ya es conocida la presencia de antinutrientes en algunos alimentos, y de los tratamientos que se les da para obtener un alimento inocuo; aun no hay datos específicos de los tratamientos no térmicos que inactiven los antinutrientes y garanticen mantener las propiedades nutricionales que estos alimentos presentan.
Normalmente los antinutrientes están asociados con semillas proteicas, y estos causan respuestas fisiológicas adversas en el organismo humano que pueden manifestarse con enfermedades, desarreglos glandulares, y hasta la muerte como lo señala Liener (1966). Y que en el estado crudo es donde hay mayor concentración de estos antinutrientes. Por otro lado al someter a un proceso de germinación estos serán inactivados y la calidad nutricional se incrementara.
No se dispone de información acerca del efecto de la germinación del tarwi, es por ello que para llegar a aprovechar la calidad proteica del tarwi, es necesario conocer los tiempos de germinación, el cual es un método de inactivación de nutrientes no térmico y que por ende conserve e incluso aumente la calidad nutricional del mismo.
IV. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
¿Cómo influye el tiempo de germinación en la actividad hemaglutinante de las lectinas del tarwi?
V. JUSTIFICACIÓN
Actualmente no se cuenta con información concluyente acerca del efecto del tiempo de germinación como método de inactivación aglutinante de lectinas en el tarwi. Se han reportado diferentes estudios en donde realizan las inactivaciones por medio de calor, la información obtenida muestra factible realizarlo para inactivar las lectinas, empero el tratamiento térmico degrada el valor nutricional. Es necesario contar con un método bien definido que permita obtener una semilla germinada libre de lectinas y con un valor nutricional igual o mayor al inicial. Lo anterior permitirá conocer el tiempo más adecuado de germinación del grano de tarwi para poder utilizarlo directamente o como base de un proceso de industrialización. 
VI. OBJETIVO
· Evaluar el tiempo de germinación en la actividad hemaglutinante de las lectinas.
VII. MARCO TEÓRICO
7.1. LECTINAS
Debido a que los vegetales, son autótrofos (generan su propio alimento), hace que estos se mantengan en un solo sitio sin necesidad de desplazarse; este hecho de estar fijos en un solo sitio desde que nacen hasta morir los expone a la acción de todos los depredadores, incluidos los humanos. Y los vegetales al igual que todos los seres vivos han desarrollado mecanismos de defensa contra los insecticidas o fungicidas, mediante generación de olores y sabores desagradables o dañando al ser vivo que los ingiera. Y son a estas sustancias de las plantas consideradas tóxicos naturales (Calvo y Mendoza, 2012).
Las lectinas son proteínas o glicoproteínas de origen inmune que reconocen de manera específica a los carbohidratos de la superficie celular o en suspensión, aglutinan celular y precipitan glicoconjugados; las lectinas presentan por lo menos dos sitios de reconocimiento a carbohidratos, lo cual hace que se aglutinen las células. A su vez las lectinas no tienen actividad enzimática y no son producto de una respuesta inmune (Calvo y Mendoza, 2012).
Figura1. Interacción carbohidrato-lectina sobre la superficie celular en procesos celulares, fisiológicos y patológicos.
Fuente: Sharon y Lis, 2001.
La función principal de lectinas es el reconocimiento y adherencia celular, como se muestra en la figura 2 (Sharon y Lis, 2001).
Figura 2.Lectinas de la superficie regulan la adhesión por la unión al carbohidrato correspondiente.
Fuente: Sharon y Lis, 2001.
Los estudios que se han realizado sobre las lectinas, muestran diversas funciones según la especie de ser vivo en las que se encuentran, como se indica en la tabla 1, en algunas especies.
Tabla 1 Funciones de las lectinas de microorganismos, plantas y animales.
	LECTINA
	FUNCIÓN
	Microorganismos
	
	Amiba 
	Infección 
	Bacteria 
	Infección 
	Virus de la influencia
	Infección 
	Plantas 
	
	Varios 
	Defensa 
	Leguminosas 
	Simbiosis con bacterias fijadoras de nitrógeno
	Animales 
	
	Calnexin
	Control de la biosíntesis 
	Colectinas
	Inmunidad innata 
	Dectinas
	Inmunidad innata
	Galectinas
	Regulación del crecimiento celular, apoptosis, ciclo celular, modulación de interacciones celular-celular y célula-sustrato.
Fuente: Sharon y Lis, 2001.
7.1.1. Toxicidad
Algunas lectinas de plantas son tóxicas a células de animales. Las lectinas consumidas durante la dieta pueden ser inocuas, usualmente son desnaturalizadas por el cocimiento y digeridas proteolíticamente en el consumo. Sin embargo, algunas lectinas no se cocinan o son extremadamente estables a las proteasas (Varky et al., 1999).
Algunas lectinas de plantas, son clasificadas propiamente como toxinas, sin embargo están entre las proteínas más venenosas del planeta y pueden resultar en la muerte no solo de células en cultivo sino también de animales. La alta toxicidad de las lectinas es usualmente heterodimérica y contiene una subunidad para la actividad vinculante y una segunda subunidad que no tiene actividad vinculante a carbohidrato, en lugar de ello tienen un sitio catalítico (Varky et al, 1999; Sharon y Lis, 2001).
La ingesta de lectinas provoca un efecto adverso a la nutrición, ya que se unen con las células del epitelio intestinal y de esta forma inhibe el transporte y absorción de nutrimentos a través de la pared celular (vitaminas, aminoácidos, grasas, minerales); también provoca la muerte de las células del epitelio intestinal. El consumo cotidiano de legumbres crudas puede conllevar a un retraso del crecimiento o hasta el bocio. Una exposición sistemática a estos antinutrientes ocasionara daño fatal al hígado y otros órganos (Püsa, 2008, mencionado en Calvo y Mendoza, 2012).
La mayor parte de las lectinas se destruye con el calor húmedo, por lo que no representa un riesgo para la ingesta, pero en algunos lugares considerados de menor altitud en donde el punto de ebullición es mayor se consideran problemas. La mayoría de los métodos de cocción aseguran la eliminación de estas sustancias con un tiempo de cocción de 10 minutos. Debiéndose tener cuidado en las harinas de leguminosas ya que las lectinas tienen resistencia al calor seco (Calvo y Mendoza, 2012).
Los síntomas en los seres humanos por ingesta de lectinas se presentan a nivel gastrointestinal (como náuseas, vómitos, diarrea). Al ingerir de cuatro a cinco semillas crudas de las legumbres provocaría este efecto (Calvo y Mendoza, 2012).
7.1.2. Clasificación
Debido a la gran diversidad de especificidades a carbohidrato entre las lectinas de las plantas, algunos investigadores las clasifican de acuerdo al carbohidrato que reconozcan (Vargas, 2009).
Basados en sus especificidades a carbohidratos, las lectinas se clasifican en cinco grupos acorde al monosacárido por el cual tenga mayor afinidad: 1-manosa, 2 –N-acetil glucosamina, 3.-Galactosa/N-acetil galantosamina, 4 Fructosa y 5 ácido Sialico (Vargas, 2009).
7.2. GERMINACIÓN
Es la recuperación de la actividad biológica por parte de la semilla, y donde es necesario una serie de condiciones ambientales favorables como lo es un sustrato húmedo, suficiente disponibilidad de oxígeno que permita la respiración aerobia y una temperatura adecuada para los distintos procesos metabólica y para el desarrollo de la plántula (García, Caselles, Santamarina, 2006).
7.2.1. Fases de la germinación:según García et al. (2006).
1. Fase de hidratación: la absorción de agua es el primer paso de la germinación, sin el cual el proceso de ni puede darse. Durante esta fase se produce una intensa absorción de agua por parte de los distintos tejidos de la semilla. Este incremento va acompañado de un aumento en la actividad respiratoria.
1. Fase de germinación: aquí se producen las transformaciones metabólicas, necesarias para el correcto desarrollo de la plántula. Aquí también la fase de absorción de agua se reduce o llega a detenerse.
1. Fase de crecimiento: está asociada con la emergencia de la radícula, en esta fase la absorción de agua vuelve a aumentar, como también la actividad respiratoria.
La duracion de cada una de las fases es dependiente de ciertas propiedades de la semilla, como el contenido de compuesto hidratables y la permeabilidad de las cubiertas al agua y al oxígeno. También dependen de las condiciones del medio, como el nievel de humedad, características y composición del sustrato, la temperatura, etc. (García et al., 2006).
7.2.2. Factores que afectan a la germinación:
· Factores internos (intrínsecos): propios de la semilla; madurez y viabilidad de las semillas.
· Factores externos (extrínsecos): depende del ambiente; agua, temperatura y gases.
Las lectinas al igual que otros antinutrientes pueden ser inactivadas por diferentes técnicas de proceso como por ejemplo: tratamientos térmicos, germinación, digestiones enzimáticas entre otros (Vioque, Clemente, Bautista y Milan, 2000).
El uso de algunas de estos métodos sería la forma de reducir e incluso eliminar estos compuestos, lo que llevaría a un aumento de la calidad nutritiva en las leguminosas (Vioque et al., 2000).
Para la germinación se pone a las leguminosas en remojo en agua y posteriormente se deja a temperatura ambiente por varios días, en ambiente fresco lavando dos veces al día con agua corriente y hasta que los tallos tengan una longitud aproximada de un centímetro (Hernández y Sastre, 1999).
Con este tratamiento se da un aumento de la digestibilidad, aumento de algunas vitaminas y disponibilidad del hierro, disminuye los antinutrientes y los factores de flatulencia, se produce la hidrólisis del almidón y proteínas, por acción enzimática, y presenta mayor facilidad de cocción (Hernández y Sastre, 1999).
Adicionalmente, cuando las semillas son molidas, como sucede en procedimientos industriales; el proceso de inactivación de las lectinas por calor, en ocasiones no es alcanzado, esto se debe a fenómenos de transmisión de calor. Por otra parte, se ha observado que el proceso de germinación puede disminuir significativamente en contenido de estos tóxicos en algunas leguminosas, como se puede observar en la tabla 2.
Tabla 2. Reducción de la actividad hemaglutinante durante la fase de germinación de algunas leguminosas
	Leguminosa
	Semilla no germinada
(HA/g harina)*
	Tiempo de germinación
(días)
	Reducción de lectinas
(%)
	Dolichos biflorus
	2 600
	3
	77
	Glycinemax
	12 800
	3
	96
	Vigna radiata
	1 600
	4
	100
	Phaseolus vulgaris
	12 800
	4
	100
	Vicia faba
	3 200
	6
	89
* Actividad hemaglutinante por el método de Liener (1955).
Fuente: Hernández y Sastre (1999).
7.3. EL TARWI (Lupinus mutabilis Sweet)
El tarwi es una leguminosa originaria de Los Andes de Bolivia, Ecuador y Perú, tienen relevancia en la gastronomía de estos países desde la época prehispánica. Su contenido de proteínas es mayor que el de la soja, lo hace una planta de interés para la nutrición humana y animal. Según los especialistas su consumo ayuda a los niños en su crecimiento y desarrollo cerebral, pues tiene calcio y aminoácidos (Rodríguez, 2009).
Figura 3. Planta y granos de tarwi
Fuente: Rodríguez, 2009.
7.3.1. Taxonomía de Lupinus mutabilis Sweet. Según Rodríguez (2009).
Tronco			: Cormofitas
División 		: Emriofitas Sifonógamas
Sub división 		: Dicotiledóneas 
Sub clase 		: Arquiclamídeas
Orden 			: Rosales
Familia 		: Leguminosas
Sub familia 		: Papilionáceas 
Género 		: Lupinus
Especie 		: mutabilis
Nombre científico	: Lupinus mutabilis Sweet
Nombre común 	: Tarwi, Chocho
7.3.2. Composición química y valor nutricional
En los ensayos sobre los componentes químicos del grano de Lupinus mutabilis Sweet a veces se encuentran ambigüedades, incoherencias y hasta contradicciones. Diferencias que pueden deberse a la variabilidad genética y a la influencia ambiental. La semilla cruda de choco tiene in promedio del 19 % en aceite, lo que constituye un atractivo económico (Rodríguez, 2009).
7.3.3. VITAMINAS 
El contenido de vitaminas como tiamina, riboflavina, niacina (ver tabla 3), se asemeja a otras leguminosas, debido a lo cual constituye una valiosa fuente de vitamina B para el hombre (Gross, 1982).
Tabla 3. Contenido de vitaminas en la semilla cruda de tarwi
	
	Tarwi
	Soya 
	Frijol
	VITAMINAS
	mg/100g
	mg/100g
	mg/100g
	Β-caroteno
	0,09
	0,38
	0,08
	Tiamina
	0,51
	0,61 
	0,63
	Riboflavina
	0,42
	0,27
	0,17
	Niacina
	4,1
	7,90
	3,8 
Fuente: Gross, 1982.
7.4. TRABAJOS RELACIONADOS 
Centurión y Espinoza (S. F.) en el trabajo de investigación sobre el efecto del malteado para disminuir la concentración de concanavalina A (como actividad hemaglutinante) y canavanina en semillas de Canavalia ensiformis, encontraron que al aplicar el proceso de malteado, la cual consta de operaciones secuenciales y una de ellas que viene la germinación, se observó la disminución en la concentración de la concanavalina A (lectina) en 10,9 unidades de hemaglutinación (U. H.). Durante la germinación se redujo la concentración de la lectina en un 25 % y luego del proceso de secado la lectina se redujo en 8 %, con esos datos se observó que el proceso de germinado elimina una mayor cantidad de este factor antrinucional mientras que el proceso de secado solo el 8 % más por lo que no es muy viable por el alto costo de la energía eléctrica utilizada durante el secado.
En el trabajo de investigación de Goyoag (2006) se estudió de factores no nutritivos en Vicia faba L. influencia de la germinación sobre su valor nutritivo. Se estudió el efecto de la germinación sobre el contenido de los principales factores no nutritivos en las distintas partes de la semilla y de la plántula de Vicia faba L., así como su influencia sobre el valor nutritivo con animales monogástricos. Donde los factores productores de flatulencia, se redujeron drásticamente a las 48 horas de germinación y los inositoles fosfato, compuestos que interfieren con la biodisponibilidad de nutrientes, se redujeron un 43 % a las 216 horas, sin embargo la actividad de los inhibidores de tripsina permaneció constante durante la germinación. Los ensayos nutricionales se realizaron en ratas en crecimiento alimentadas con raciones de habas sin germinar y germinadas. Con la inclusión de habas germinadas en la ración, se obtuvieron mejores valores de digestibilidad de la materia seca y de utilización neta de la proteína que cuando se incorporaron habas sin germinar. Por lo tanto, estas habas germinadas serán potencialmente útiles para la alimentación de animales monogástricos, incluido el hombre.
VIII. FORMULACIÓN DE HIPÓTESIS
A mayor tiempo de germinación del tarwi, la actividad hemaglutinante de lectinas será menor, pues con este tratamiento se va produciendo la hidrólisis de las proteínas, por tanto las lectinas que vienen a ser glicoproteínas se van desnaturalizando y dejando de tener el mismo efecto.
Variable independiente:
· Tiempo de germinación.
Variables dependientes:
· Evolución de la actividad hemaglutinante de lectinas en el tarwi.
Variables intervinientes:
· Tiempo de remojo antes de la germinación.
· Cantidad de agua para el remojo del tarwi.
· Especie de semilla de tarwi.
· Temperatura de germinación.
IX. MATERIAL Y MÉTODO
Lugar de investigación: Laboratorio de microbiología de alimentos de la facultad de ingeniería en industrias alimentarias.
· Tipo de investigación: investigación experimental.
· Muestra: Se trabajará con granos de tarwi de la región Junín.
9.1. Materiales, equipos y reactivos
· Materiales:· Porta y cubre objetos
· Materiales de vidrio
· Bandejas
· Termómetro 
· Equipos:
· Balanza analítica.
· Estufa.
· Microscopio 
· Centrifuga 
· Reactivos:
· Cloruro de sodio 
· Cloruro de calcio
· Fosfato disódico
· Fosfato diácido de potasio
· Ácido clorhídrico
· Ácido sulfúrico
· Acetato de sodio
· Takadiastasa
· Permanganato de potasio
· Peróxido de hidrógeno
· Sílice
· Hidróxido de potasio
· Bromuro de cianógeno
· Procaína
9.2. Métodos.
9.2.1. Determinación de la actividad hemaglutinante del tarwi
Para la determinación de la actividad hemaglutinante, se seguirá la metodología propuesta por Aregheore et al., 1998; donde una muestra de sangre bovina al ser mezclada con el tarwi diluido en una solución de cloruro de sodio al 0,9 % y observada en el microscopio, se manifestará la actividad hemaglutinante como un anillo de eritrocitos. La actividad hemaglutinante se representará mediante unidades hemaglutinantes (U.H.), que es la inversa del valor de la concentración de la solución de tarwi (mg/mL), diluido en la solución de cloruro de sodio.
9.3. Diseño experimental:
Grano de tarwi
								T1
T2
T3
T4
Dónde: 
· T1 = 0 día de germinación
· T2 = 3 días de germinación
· T3 = 5 días de germinación
· T4 = 7 días de germinación
9.4. Diseño estadístico:
Se empleara una variable operacional que es el tiempo de germinación de la leguminosa, donde el diseño experimental a utilizar será completamente al azar (DCA) obteniéndose 4 tratamientos con 3 repeticiones. Con nivel de significancia de 0,05.
Dónde:
Observación de la actividad hemaglutinante de las lectinas, en el i tratamiento y j repetición.
Tratamiento al que se someterá a diferentes tiempos de germinación (i=1 a 4)
Repeticiones (j = 1 a 3).
Media general.
Error.
X. CRONOGRAMA.
	ACTIVIDADES
	MESES
	
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	8
	9
	10
	11
	12
	13
	14
	Revisión bibliográfica.
	X
	X
	X
	X
	X
	X
	X
	X
	X
	X
	X
	X
	X
	
	Avance del plan de tesis.
	X
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	Revisión del plan de tesis.
	X
	X
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	Corrección del plan de tesis
	
	
	X
	X
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	Presentación del plan de tesis
	
	
	
	X
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	Ejecución de la tesis.
	
	
	
	
	X
	X
	X
	X
	
	
	
	
	
	
	Elaboración de la tesis.
	
	
	
	
	
	
	
	
	X
	X
	X
	
	
	
	Revisión de la tesis.
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	X
	X
	
	Sustentación de la tesis.
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	X
XI. PRESUPUESTO.
	MATERIALES
	MONTO EN NUEVOS SOLES (S/.)
	1.
	Material bibliográfico.
	30,00
	2.
	Materiales de escritorio.
	10,00
	3.
	Uso de laboratorio, equipos e instrumentos
	500,00
	4.
	Materia prima (tarwi)
	80,00
	5.
	Reactivos
	1 820,00
	6.
	Material fotográfico.
	120,00
	7.
	Impresión.
	135,00
	8.
	Encuadernación
	170,00
	9.
	Imprevistos (10 %)
	286,5
	TOTAL
	3 151,5
El presupuesto establecido será autofinanciado. 
XII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1. Aregheore, E., Makkar, H. and Becker, K. (1998). Assessment of lectin activity in a toxic and a non-toxic variety of Jatropha curcas latex agglutination and haemagglutination methods and inactivation of lectin by heat treatments. Journal of the Science of Food and Agriculture.
2. Calvo, M. y Mendoza, E. (2012). Toxicología de los alimentos, Ed. Mc Gravo Hill. México D.F.
3. Centurión, D. y Espinoza, J. (S. F.). Efecto del malteado para disminuir la concentración de concanavalina A y canavanina en semillas de Canavaliaa ensiformis. División académica de ciencias agropecuarias, Universidad Juárez autónoma de Tabasco. 
4. García, F. J., Caselles, J. R., Santamarina, P. (2006). Introducción al funcionamiento de las plantas, Editorial Universidad Politécnica De Valencia, España. 
5. Goyoag, C. (2006). Estudio de factores no nutritivos en Vicia faba L. influencia de la germinación sobre su valor nutritivo. Tesis Doctoral. Recuperado en: http://eprints.ucm.es/tesis/far/ucm-t28827.pdf
6. Gross, R. (1982). El cultivo y la utilización del tarwi (Lupinus mutabilis Sweet), Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación. 
7. Hernández, M y Sastre, A. (1999). Tratado de nutrición, Ed. Díaz de Santos S.A. Madrid, España.
8. Liener, I. (1966).The photometric determination of hemagglutinating activity of soyin and crude soybean extracts. American Chemical Society. Washington.
9. Muzquiz, M.; Burbano, C.; Cuadrado y De La Cuadra, C. (1993). Determinación de factores antinutritivos termorresistentes en leguminosas I: alcaloides, investigación agraria producción y protección vegetal, México. 
10. Rodríguez, A. (2009). Evaluación in vitro de la actividad antimicrobiana de los alcaloides del agua de cocción del proceso de desamargado del choco (Lupinus mutabilis Sweet). Escuela superior politécnica de Chimborazo, Riobamba, Ecuador.
11. Sharon, N. and Lis, H. (2004). Lectins. Enciclopedia of life Sciences.
12. Vargas, J. A. 2009. Actividad hemaglutinante e identificación en el árbol de Neem (Azedirachtaindica). Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. 
13. Varky, A., Cumings, R., Esko, J., Freeze, H., Hart, G., Marth, J. (1999). Essentials of glicobiology. Cold spring Harbor Laboratory Press, Chapter 30. Plant Lectins. 
14. Vioque, J., Clemente, A., Bautists, J. y Milan F. (2000). Jornada internacional sobre proteínas alimentarias, España.