Efecto-del-factor-de-crecimiento-neuronal-sobre-los-canales-de-CA2-en-celulas-RINm5F-de-insulinoma-de-rata

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
 DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE CIENCIAS 
 
Efecto del factor de crecimiento neuronal sobre los 
canales de Ca2+ en células RINm5F de insulinoma de rata 
 
 
 
 
 
 
 
T E S I S 
 
 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 BIÓLOGA 
 P R E S E N T A : 
 
 MARÍA INFANTE BIEZUNER 
 
 
 
 
 
 
 
 
TUTORA 
DRA. MARCIA HIRIART URDANIVIA 
 
2009 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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Hoja de Datos del Jurado 
 
1. Datos del alumno 
Apellido paterno 
Apellido materno 
Nombre (s) 
Teléfono 
Universidad 
 
Facultad 
Número de cuenta 
Infante 
Biezuner 
María 
55133759 
Universidad Nacional Autónoma de 
México 
Facultad de Ciencias 
30250106-9 
2. Datos del tutor 
Grado 
Nombre (s) 
Apellido paterno 
Apellido materno 
Doctora 
Marcia 
Hiriart 
Urdanivia 
3. Datos del sinodal 1 
Grado 
Nombre (s) 
Apellido paterno 
Apellido materno 
Doctor 
Manuel 
Miranda 
Anaya 
4. Datos del sinodal 2 
Grado 
Nombre (s) 
Apellido paterno 
Apellido materno 
Doctora 
Tatiana 
Fiordelisio 
Coll 
5. Datos del sinodal 3 
Grado 
Nombre (s) 
Apellido paterno 
Apellido materno 
Doctor 
León David 
Islas 
Suárez 
6. Datos del sinodal 4 
Grado 
Nombre (s) 
Apellido paterno 
Apellido materno 
Maestro en Ciencias 
Julio Alejandro 
Prieto 
Sagredo 
7. Datos del trabajo escrito 
Título 
 
 
Número de páginas 
Año 
Efecto del factor de crecimiento neuronal 
sobre los canales de Ca2+ en células 
RINm5F de insulinoma de rata. 
60 p 
2009 
Agradecimientos 
A la Dra. Marcia Hiriart Urdanivia, por enseñarme a hacer ciencia, por su paciencia, 
tiempo, espacio y confianza. 
 
Al Dr. Manuel Miranda y al Dr. León Islas por su tiempo y dedicación en la revisión de 
este trabajo. 
 
A la Dra. Tatiana Fiordelisio por tanto tiempo dedicado a mi aprendizaje, a la revisión de 
mi tesis y a mi formación como bióloga. 
 
Al M. en C. Julio Prieto, por la revisión de mi tesis, pero sobre todo por ensañarme a ser 
crítica, por hacer que me enamorara de la biología y por ser un gran amigo. 
 
A Carmen Sánchez por su ayuda técnica. 
 
A mis compañeros y amigos del laboratorio, Mariana Duhne, Siraam Cabrera, Carlos 
Larqué, Selda Gezginci, Eduardo Rodríguez, Alondra Albarado, Carlos Manlio, Félix 
Sierra y muy especialmente a Víctor Navarro y a Myrian Velasco por todo el tiempo, 
esfuerzo y cariño que invirtieron para que aprendiera a hacer electrofisiología, es el mejor 
regalo que me han dado. 
 
A los chicos y chicas de C/Producciones, Lydia, Ale, Saúl, Gerardo, Luis, Manuel y 
Ángeles, por ser mis cómplices y amigos durante tanto tiempo. 
Esta tesis es para: 
Mis papás, Zlate y Gonzalo, por hacerme quien soy, quererme tanto y ser los mejores 
padres del mundo, por mucho. 
 
Mis abuelas, la Bobe y la Tita, por ser el mejor ejemplo a seguir y las mujeres más fuertes 
que he conocido. Y para mi tío, Jacobo, y mis tías, Claudia y Maricarmen, por todo el 
cariño que me han dado. 
 
Mis amigos, Mariana, Sofía, Alejandro, Andrea, Diego Mañón, Diego Goletto, Moisés, 
Elías, Armando, Ariana, Astrid, León Felipe, Arturo y Oscar; por ayudarme a crecer y por 
crecer conmigo. Son la mejor familia que alguien pudiera tener. 
 
Mis hermanos en los últimos años, Lucia, Fiorella, Gabriel, Jimena, Ricardo, Hernán, 
Georgina, Darío, Camilo y Alicia, gracias por estos años, sueños y esperanzas compartidos. 
Esta tesis es tanto mía como suya. 
 
Carlos, por compartir un pedacito de tu vida conmigo, te quiero con todo mi corazón. 
 
Paco, por las nuevas estrellas en el cielo. 
 
 
 
ÍNDICE

RESUMEN................................................................................................................................. 3

I.
 INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 5

Estructura
del
páncreas
y
del
islote
pancreático ........................................................5

Líneas
celulares
secretoras
de
insulina ......................................................................7

Canales
iónicos
en
las
células
β
pancreáticas .............................................................9

Actividad
eléctrica
de
la
célula
β
pancreática........................................................... 11

Canales
de
calcio
sensibles
a
voltaje ........................................................................ 14

Nomenclatura
de
los
canales
de
calcio
sensibles
a
voltaje ....................................... 16

Expresión
de
VGCC
en
células
β
pancreáticas
y
líneas
celulares
secretoras
de
insulina
................................................................................................................................ 17

Canales
de
calcio
tipo
L ......................................................................................................................... 17

Canales
de
calcio
tipo
N ........................................................................................................................ 19

Canales
de
calcio
tipo
P/Q .................................................................................................................... 20

Canales
de
calcio
tipo
T......................................................................................................................... 21

Regulación
de
los
canales
de
calcio
sensibles
a
voltaje
en
las
células
β .................... 21

El
factor
de
crecimiento
neuronal ............................................................................ 23

Vía
de
señalización
del
NGF ..................................................................................... 25

Señalización
mediada
por
TrkA............................................................................................................. 25

Señalización
mediada
por
p75 ............................................................................................................... 27

El
Factor
de
Crecimiento
Neuronal
y
la
célula
β
pancreática .................................... 28

II.
 PLANTEAMIENTO
DEL
PROBLEMA.......................................................................30

III.
 HIPÓTESIS ...................................................................................................................31

IV.
 OBJETIVOS...................................................................................................................31

Objetivo
general...................................................................................................... 31

Objetivos
particulares ............................................................................................. 31

V.
 METODOLOGÍA............................................................................................................32

Cultivo
celular ......................................................................................................... 32





2

Materiales ............................................................................................................... 33

Inmunocitoquímica
de
subunidades
α1
de
los
canales
de
calcio
sensibles
a
voltaje

(VGCC).....................................................................................................................33

Imágenes
y
cuantificación
de
la
fluorescencia.......................................................... 34

Registros
electrofisiológicos .................................................................................... 35

Análisis
estadístico .................................................................................................. 38

VI.
 RESULTADOS ..............................................................................................................39

Cambios
morfológicos
en
las
células
RINm5F
tratadas
con
NGF ............................... 39

Corrientes
de
Ba2+
registradas
en
células
RINm5F .................................................... 40

El
NGF
aumenta
la
IBa2+
en
las
células
RINm5F......................................................... 41

Tipos
de
corrientes
de
Ca2+
en
células
RINm5F
modulados
por
NGF......................... 43

Cambios
en
la
inmunoreactividad
para
la
subunidades
α1
de
los
VGCC
en
células

tratadas
con
NGF..................................................................................................... 44

VII.
 DISCUSIÓN..................................................................................................................48

Corrientes
de
Ba2+
presentes
en
la
línea
celular
RINm5F .......................................... 48

Las
células
RINm5F
responden
al
NGF
aumentando
la
corriente
de
Ba2+ .................. 50

El
aumento
en
la
corriente
de
Ba2+
se
debe
a
un
cambio
en
la
expresión
y
localización

de
los
VGCC ............................................................................................................. 51

VIII.
 CONCLUSIONES .......................................................................................................55

IX.
 PERSPECTIVAS ...........................................................................................................56

X.
 REFERENCIAS...............................................................................................................57

 




3

Resumen 
La actividad de los canales de K+ sensibles a ATP y los canales sensibles a 
voltaje de Na+, K+ y Ca2+ regulan la actividad eléctrica de las células β pancreáticas y la 
secreción de insulina. La entrada de Ca2+ a través de los canales de calcio sensibles a 
voltaje (VGCC) produce un aumento en la concentración de Ca2+ intracelular, lo que 
promueve la exocitosis hormonal. 
Los canales de calcio sensibles al voltaje (VGCC por sus siglas en inglés) están 
compuestos de cuatro a cinco subunidades proteícas (α1, α2, ß, δ y γ) y se clasifican de 
acuerdo a la subunidad α1 que expresan. Esta subunidad forma el poro conductor de 
iones y contiene el sensor de voltaje. Las células β pancreáticas expresan diferentes 
subunidades α1, que forman canales de calcio tipo N, L, P/Q y T. La regulación de la 
expresión y el funcionamiento de los VGCC se ven reflejados en la exocitosis 
hormonal. 
Las células RINm5F son una línea celular derivada de un insulinoma de rata, 
que secreta insulina de manera constitutiva y en menor grado glucagon y somatostatina. 
Estas fueron obtenidas a partir de un tumor inducido por una alta dosis de radiación en 
ratas y son ampliamente utilizadas para el estudio de la fisiología de las células β 
pancreáticas. 
El factor de crecimiento neuronal (NGF) es una neurotrofina secretada por el 
sistema neuroinmunoendocrino. Estas células tienen el receptor de alta afinidad al NGF 
(TrkA). Cuando las células se incuban en presencia del factor se inducen cambios 
morfológicos, así como en su expresión génica. 
Se ha demostrado que las células β de rata producen y secretan NGF y 
responden al mismo de manera autocrina, aumentado la secreción de insulina. Sin 




4

embargo no es claro si esto sucede también en las células RINm5F. Así como tampoco 
si este factor aumenta la expresión de alguno de los canales de calcio en estas células. 
En este trabajo se analizaron los efectos de una exposición prolongada al NGF 
(de 5 a 7 días) en las corrientes de Ba2+ totales de las células RINm5F; en este trabajo se 
estudió los componentes de la corriente total que son modulados por el factor, y como 
éste afecta la distribución de los VGCC en los compartimientos celulares. 
En las células RINm5F tratadas con NGF durante 4 ó 5 días, la corriente 
máxima de Ba2+ es 100% mayor que en los controles. Dicho aumento se debe, en parte, 
a un aumento en la corriente que pasa a través de los canales de calcio tipo L y tipo N. 
De igual manera, el tratamiento con el factor aumenta la inmunoractividad a las 
subunidades α1A, α1B y α1D de los VGCC, y promueve que una mayor cantidad de 
canales se encuentren en la membrana celular. 
Este estudio muestra que el NGF regula de manera positiva los VGCC en las 
células RINm5F a través de un mecanismo que promueve, al menos, un incremento en 
la corriente que pasa a través de los canales α1B y α1D. 
 




5

I. Introducción 
 
Estructura del páncreas y del islote pancreático 
En los mamíferos la glucosa representa la principal fuente para la producción de 
energía y su metabolismo es regulado por diferentes mecanismos, entre los que son 
primordiales las hormonas pancreáticas. 
A pesar de amplias variaciones en la entrada y salida de glucosa del organismo, 
la glucosa plasmática se mantiene en un intervalo relativamente estrecho, entre 4 y 8 
mM/L. Esto es posible porque en el organismo existen mecanismos que mantienen 
estables las concentraciones de glucosa, almacenando aquella que no es utilizada 
inmediatamente después de la comida y liberándola de manera paulatina durante el 
ayuno. La función primordial de las hormonas del islote pancreático es regular este 
metabolismo de los nutrientes (Hiriart, 1997). 
El páncreas es una glándula mixta compuesta por una parte exocrina y otra 
endocrina (Figura 1.1). La porción exocrina está compuesta por el tejido acinar y por el 
sistema de conductos pancreáticos que secretan y transportan, respectivamente, enzimas 
y bicarbonato necesarios para el metabolismo inicial y la absorción de los nutrientes. La 
porción exocrina comprende del 95 al 99% del páncreas total (Hiriart, 1997). 
La parte endocrina, es crucial para el control de la glucemia; está formada por 
los islotes pancreáticos que se encuentran dispersos en el tejido acinar. Los islotes son 
escasos en el páncreas y constituyen cerca del 2% del tejido total. Están constituidos por 
cuatro tipos celulares: α, β, δ y PP, que secretan hormonas peptídicas al torrente 
sanguíneo (Pippeleers, et al., 1992). 
Las células α secretan glucagon y constituyen del 15 al 20% del islote 
pancreático y generalmente se encuentran en la periferia del mismo. El glucagon es 
secretado, primordialmente, en condiciones de hipoglucemia y promueve la 




6

glucogenólisis y la gluconeogénesis hepática; dentro del islote esta hormona estimula la 
secreción de insulina (Pippeleers, et al., 1992). 
Las células δ secretan somatostatina, representan del 5 al 10% del islote. Esta 
hormona ejerce efectos inhibitorios en la secreción pancreática exocrina y endocrina 
(Hiriart, 1997). 
Las células PP secretan polipéptido pancreático, constituyen menos del 2% del 
islote pancreático y al igual que la somatostatina tiene efectos inhibitorios en la 
secreción pancreática exocrina y endocrina (Hiriart, 1997). 
Las células β secretan insulina, son el tipo celular más abundante dentro del 
islote, comprendiendo del 70 al 80% de éste y en roedores se encuentran en el centro del 
mismo. La insulina es secretada, principalmente, en respuesta a un aumento en las 
concentraciones extracelulares de glucosa así como ante la presencia de otras hormonas 
pancreáticas y por estimulación nerviosa (Kulkarni, 2004). 
La destrucción autoinmune de las células β lleva a la diabetes tipo I, mientras 
que la falta de regulación en la secreción lleva la diabetes tipo II. 




7

Figura 1.1. Estructura delpáncreas exocrino y endocrino. A. El páncreas maduro se encuentra 
adyacente al duodeno. B. La función del páncreas exócrino es la de proporcionar enzimas digestivas al 
intestino; estas enzimas son producidas y secretadas en las células acinares y transportadas al intestino vía 
el sistema de ductos pancreáticos. C. El páncreas endócrino consiste de cuatro tipos de células 
productoras de hormonas: las células α (rojo) secretan glucagon. Las células β (verde) secretan insulina. 
Las células δ (amarillo) secretan somatostatina y las células PP (azul) secretan polipéptido pancreático 
(modificado de Edlund, 2002). 
 
Líneas celulares secretoras de insulina 
Las líneas celulares secretoras de insulina se han utilizado desde hace tres 
décadas para estudiar el comportamiento de las células β y entender cómo es que 
funciona el mecanismo de secreción de insulina. Todas las líneas establecidas 
provenientes de células β son derivados de insulinomas animales, inducidos por medio 
de radiación o por la expresión de un oncogén (revisado por Hohmeier y Newgrad, 
2004). 
Las líneas celulares RIN provienen de un tumor trasplantable de islote 
pancreático. El tumor original fue inducido por medio de una alta dosis de radiación en 
ratas NEDH (New England Deaconess Hospital) (Chick et al., 1977). Para establecer la 
línea celular del tumor inicial, dos líneas fueron derivadas. Una denominada RINr fue 




8

mantenida en ratas NEDH. Otra línea, denominada RINm fue heterotransplantada a un 
ratón atímico (Gazdar et al., 1980). Las primeras líneas resultantes secretaban una 
cantidad importante de insulina, así como somatostatina y glucagon (Bhathena et al., 
1980). Más investigación en torno a estas líneas celulares derivó en varias subclonas 
originadas a partir de la línea RINm (Bhathena et al., 1982) o de la línea RINr (Philippe 
et al., 1986). 
La subclona RINm5F, derivada de la línea RINm, ha sido seleccionada para 
muchos estudios como modelo de célula β debido a su alta tasa de secreción de insulina. 
Pero incluso esta línea presenta, aunque en menor grado, secreción de somatostatina y 
glucagon (Praz et al., 1983). Esta línea celular no muestra sensibilidad a los cambios en 
la concentración extracelular de glucosa, ya que su secreción de insulina es 
independiente de dichos cambios. Sin embargo se ha demostrado que estas células son 
sensibles al gliceraldehído (Praz et al., 1983), generando una secreción robusta de 
insulina como respuesta a la entrada de iones Ca2+ a través de canales sensibles a voltaje 
(Velasco et al., 1988). Esta característica señala una falla en la fosforilación de la 
glucosa debida a la actividad de la glucocinasa en estas células, ya que los sustratos que 
actúan lejos de este punto limitante, como el gliceraldehído, estimulan la secreción de 
insulina (Halban et al., 1983). 
De igual manera se ha establecido que en el páncreas fetal, las células β no 
tienen la capacidad de discriminar los cambios en la glucosa extracelular y su secreción 
es mínima comparada con las células adultas y también ha sido demostrado que las 
células fetales tienen la capacidad de responder a otros secretagogos, sin embargo no se 
conoce el origen de este defecto. La madurez funcional caracterizada por una robusta 
secreción de insulina en respuesta a la glucosa, se alcanza sólo después del nacimiento 
(Hole et al., 1988; Bergsten et al., 1998; Aguayo-Mazzucato et al., 2006). 




9

Hasta el momento se han encontrado diferencias en el patrón de expresión de los 
canales de calcio sensibles voltaje, así como de otro tipo de canales iónicos, en células 
provenientes de tumores, existe una evidencia creciente que implica a los canales 
iónicos sensibles a voltaje en la progresión de tipos malignos de cáncer (Fiske et al., 
2006). 
 
Canales iónicos en las células β pancreáticas 
La excitabilidad celular es la propiedad que poseen las células para generar y 
transmitir señales eléctricas e involucra cambios en la resistencia membranal debidos a 
cambios en la conductancia a diversos iones. Los iones son moléculas inmiscibles en los 
lípidos de la membrana y para atravesarla requieren de mecanismos específicos de 
transporte, entre los cuales, los más importantes son los canales iónicos que atraviesan 
la bicapa lipídica. Dichas moléculas son complejos multiproteicos algunos de los cuales 
permiten el paso selectivo a un ión en específico (Hille, 2001). 
 
Los canales iónicos son considerados actualmente como moléculas excitables 
que responden a una gran variedad de estímulos, tales como la unión de 
neurotransmisores, la deformación mecánica de la membrana o el cambio en el 
potencial de membrana. Los canales iónicos no son simples poros conductores que 
atraviesan la membrana, si no que presentan 3 características fundamentales: 
1) Permiten el flujo de iones a una velocidad de hasta 108 iones ss-1. El flujo 
de iones que atraviesa un solo canal puede medirse como una corriente 
eléctrica del orden de amperes (A), misma que es capaz de producir 
cambios muy rápidos en el potencial de membrana. 




10

2) En respuesta a los estímulos, los componentes moleculares del canal son 
capaces de adoptar estados conformacionales distintos. Los canales 
activados por cambios de voltaje presentan, por lo menos, un estado 
conductor (abierto o activo) y dos no conductores (inactivo y cerrado). 
Cuando el potencial de membrana se encuentra en el reposo, la 
probabilidad de apertura del canal es muy pequeña, es decir, que será 
mínima la cantidad de canales que se abran al azar. 
 La despolarización celular (o la unión del ligando) produce la 
activación del canal al aumentar la probabilidad de apertura del mismo. 
El estado abierto es aquel que permite el paso de iones, pero si la 
despolarización es mantenida, la probabilidad de apertura vuelve a 
disminuir como consecuencia del proceso de inactivación, cuando este 
está presente. Es así que el canal pasa al estado inactivo desde el cual ya 
no puede volver a abrirse. Para que el canal vuelva a abrirse es necesario 
que regrese al estado de reposo. Por lo tanto, la magnitud de la corriente 
iónica que cruza la membrana está dada por la conductancia unitaria de 
cada canal, la densidad de canales en la membrana, y la probabilidad de 
apertura de los mismos. 
3) Los canales son capaces de discriminar los iones que pasan a través de 
ellos, a esta característica se le denomina selectividad iónica. En general, 
el poro de los canales dependientes de voltaje es altamente selectivo a un 
determinado ión. 
Los canales iónicos están involucrados en una gran cantidad de procesos 
fisiológicos que incluyen el mantenimiento del potencial de membrana, la regulación de 
la excitabilidad eléctrica, la contracción muscular, la secreción de hormonas y 




11

neurotransmisores, y la expresión génica (Hille, 2001). Estudios electrofisiológicos, 
bioquímicos y de biología molecular han demostrado la existencia de una gran variedad 
de canales iónicos, que pueden ser distinguidos con base en su selectividad iónica, 
dependencia al voltaje, conductancia iónica, inactivación y sensibilidad a fármacos, así 
como el gen que los codifica. 
 
Actividad eléctrica de la célula β pancreática 
Las células β pancreáticas son eléctricamente excitables y las señales eléctricas 
juegan un papel central en la regulación de la secreción hormonal (Mears, 2004; Dean y 
Matthews, 1968). Cuando la concentración extracelular de glucosa es basal (~5-6 mM) 
la membrana de la célula β se encuentra en reposo, en un potencial alrededor de -80 
mV. Cuando aumenta la glucosa el voltaje de la membrana oscila, generando una 
actividad eléctrica tal que provoca el aumento en la concentración intracelular de calcio 
([Ca2+]i) y la subsecuente secreción hormonal (Dean y Matthews, 1970). Esta actividad 
consiste en una despolarización inicial lenta de la membrana plasmática seguida poruna 
despolarización rápida hasta llegar a un nivel de meseta en el cual se superponen 
potenciales de acción hasta la repolarización de la membrana, misma que regresa el 
potencial de membrana a su estado polarizado. Estas oscilaciones continúan mientras 
los niveles de glucosa estén elevados (Hiriart y Aguilar-Bryan, 2008). 
Esta actividad es el resultado del funcionamiento de diversos canales iónicos 
presentes en la membrana de la célula β. Cuando la concentración extracelular de 
glucosa aumenta de una concentración basal a una concentración estimuladora aumenta 
el transporte de glucosa al interior de la célula β por medio de los transportadores de 
glucosa tipo 2 (GLUT2; en rata). Una vez dentro de la célula la glucosa es fosforilada 
por una hexocinasa (glucocinasa), produciendo glucosa 6-fosfato. Este paso es 




12

fundamental para detectar los cambios en la concentración de glucosa y es el paso 
limitante por medio del cual se regula la cantidad de insulina secretada de acuerdo al 
nivel extracelular de glucosa (Matschinsky, 2002). 
En ausencia de glucosa, la relación ATP/ADP en la célula β es baja y los canales 
de potasio sensibles a ATP (KATP) se encuentran abiertos. El constante flujo de iones 
potasio (K+) a través de estos canales y la actividad de la ATPasa de Na+/K+ mantiene el 
potencial de membrana cercano a los -70 mV. Cuando aumenta la concentración de 
glucosa, su degradación metabólica provoca el aumento en la concentración de ATP lo 
cual lleva a un aumento en la relación ATP/ADP, lo cual provoca el cierre de los 
canales KATP y la reducción en la permeabilidad al K+ (Ashcroft, et al., 1984). 
El cierre de estos canales aunado al flujo constante de iones a través de los 
canales catiónicos no selectivos provoca la despolarización de la membrana plasmática. 
Esta despolarización alcanza un voltaje tal (alrededor de -40 mV) en el que aumenta la 
probabilidad de apertura de los canales de sodio y los canales de calcio tipo T, 
aumentando la entrada de Na+ y Ca2+ a las células (Hiriart y Matteson, 1988). Esto 
despolariza aún más la membrana hasta alcanzar el umbral de activación de los canales 
de calcio tipo L (alrededor de -20 mV) provocando un incremento en la [Ca2+]i y la 
subsecuente exocitosis hormonal (Figura 1.2) (revisado por Hiriart y Aguilar-Bryan, 
2008). En esta fase, denominada meseta, es donde se superponen trenes de potenciales 
de acción dependientes de la entrada de Ca2+ que son separados por periodos de 
repolarización, estos periodos de actividad eléctrica coinciden con la liberación pulsátil 
de insulina. La repolarización de las células β está dada por la actividad de canales de 
K+ (Dean y Matthews, 1968; Bertram y Sherman, 2000; Rorsman, et al; 2000). 
 
 
 




13

 
 
 
 
Figura 1.2. Actividad eléctrica de la célula β pancreática. A. Actividad de los canales iónicos en la 
célula β en condiciones de glucosa basal. B. Cuando hay un aumento en la concentración extracelular de 
glucosa esta entra a la célula por medio de los transportadores GLUT2, dentro de la célula es 
metabolizado provocando un aumento en la relación ATP/ADP y el cierre de los canales KATP 
produciendo la despolarización lenta de la membrana. Esta despolarización provoca un aumento en la 
probabilidad de apertura de los canales de Na+ sensibles a voltaje y de Ca2+ tipo T. La entrada de iones 
Na+ y Ca2+ provoca una mayor despolarización de la membrana hasta la apertura de los canales de Ca2+ 
tipo L. El influjo de iones Ca2+ incrementa la concentración de calcio intracelular y la subsecuente 
exocitosis de los gránulos de insulina. La actividad de los canales de K+ es necesaria para la 
repolarización de la membrana (Modificado de Hiriart y Aguilar-Bryan, 2008). 
 
A 
B 




14

Canales de calcio sensibles a voltaje 
Los canales de calcio sensibles a voltaje (VGCC) son unidades multiproteicas 
localizadas en la membrana plasmática cuya probabilidad de apertura aumenta cuando 
la membrana se despolariza. El calcio que entra a través de estos canales sirve como 
segundo mensajero que acopla o traduce las señales eléctricas en respuestas celulares. 
En general el aumento en la [Ca2+]i controla una gran diversidad de eventos 
celulares incluyendo exocitosis, endocitosis, contracción muscular, transmisión 
sináptica y el metabolismo celular; participa en la fecundación y controla la 
proliferación, la diferenciación y el desarrollo celular mediante la regulación de la 
fosforilación de proteínas, la expresión génica y el ciclo celular (Catterall, 2000). 
Los VGCC están compuestos por cuatro a cinco subunidades proteícas (α1, α2, 
ß, δ y γ). El modelo propuesto indica que en estos canales, la subunidad principal (α1) 
es una proteína transmembranal, asociada con el dímero α2δ a través de enlaces 
disulfuro y que además esta unida a una subunidad β intracelular y en algunos casos a 
una subunidad transmembral γ (Figura 1.3) (Catterall, 2000). 
Las características electrofisiológicas y farmacológicas de los canales están 
dadas por la subunidad α1, para la cual se han identificado al menos diez genes 
diferentes (Catterall et al., 2003). Esta subunidad forma el poro hidrofílico que permite 
el flujo de iones y contiene regiones especializadas que determinan la selectividad del 
canal y su sensibilidad al voltaje. La misma se encuentra formada por cuatro 
repeticiones homólogas o dominios transmembranales (I al IV), unidos entre sí por asas 
intracelulares, cada uno integrado por seis segmentos transmembranales (S1 a S6), 
contiene el poro y la región de cargas positivas, conocida como sensor de voltaje, 
situado en S4 que le confiere sensibilidad a cambios de voltaje. 




15

Las subunidades α2δ, β y γ no forman directamente el poro, por lo que son 
llamada subunidades accesorias. Sin embargo, juegan un papel importante en la 
regulación de la translocación de los canales a la membrana, en las propiedades de 
compuerta así como en su dependencia al voltaje (Catterall, 2000; Arikkath y Campbell, 
2003). 
A 
 
 
 
 
 
 
B 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1.3. Topología de los VGCC. A. Topología propuesta para un canal activado a un alto voltaje 
(HVA). Se muestra el arreglo de las diferentes subunidades accesorias (β, α2δ, γ) en relación a la 
subunidad principal (α1) (modificado de Randall y Benham, 1999). B. La topología sugerida para las 
diferentes subunidades de los VGCC (modificado de Yang y Berggren, 2005). 
 




16

Nomenclatura de los canales de calcio sensibles a voltaje 
La primera clasificación de los VGCC tomó en consideración el voltaje que se 
requiere para activarlos. En los primeros estudios electrofisiológicos se logró identificar 
a dos grandes clases de canales de calcio; los de bajo umbral de activación o LVA y los 
de alto umbral ó HVA (Carbone y Lux, 1984; Matteson y Armstrong, 1986; Bean, 
1989). Los canales LVA se activan a potenciales de membrana cercanos a -60 mV, 
mientras que los canales de la familia HVA se activan a voltajes menos negativos, entre 
-30 y -20 mV. Además de su bajo umbral de activación, los canales LVA también se 
caracterizan por su rápida inactivación. Por su parte, los canales HVA se inactivan más 
lentamente y tienen una conductancia unitaria tres veces mayor que los LVA (Bean, 
1985, Matteson y Armstrong, 1986). 
Los diversos tipos de corrientes de calcio pueden ser distinguidos de forma 
individual por sus propiedades biofísicas; así como por su sensibilidad a diferentes 
toxinas y fármacos (Catterall, 2000). Los canales HVA generan corrientes tipo L (de 
larga duración); tipo N (identificadas en neuronas); tipo P (registradas por primera vez 
en neuronas de Purkinje); tipo Q (caracterizadas en celulas granulares del cerebelo) y 
las corrientes tipo R (que se refiere a la corriente de calcio remanente cuando se han 
bloqueado el resto de los canales HVA). Por su parte, los canales LVA generan 
únicamente corrientestipo T (transitorias) (Catterall et al., 2003). 
La nomenclatura CaV para los VGCC, conocida como estructural, fue propuesta 
en el año 2000 y describe tanto a las proteínas y como a los RNAm de los VGCC, 
clasificándolos en tres familias CaV1, CaV2 y CaV3 (Ertel et al., 2000). El primer 
término de la nomenclatura se refiere al ión permeante (en este caso Ca2+), seguido por 
el principal estímulo para la apertura o cierre del canal y finalmente, dos números 
separados por un punto: el primero indica la familia de proteínas, y el segundo indica la 




17

isoforma particular. Se han identificado seis tipos de corrientes CaV codificadas por la 
subunidad α11: CaV1.1 (tipo LS), CaV1.2 (tipo LC), CaV1.3 (tipo LD), CaV1.4 (tipo LE), 
CaV2 codificados por la subunidad α12: CaV2.1 (tipo P y Q), CaV2.2 (tipo N), CaV2.3 
(tipo R) y CaV3 codificados por la subunidad α13: CaV3.1 (tipo TG), CaV3.2 (tipo TH), 
CaV3.3 (tipo TI). La Tabla 1 resume la clasificación de los VGCC, sus propiedades 
biofísicas y farmacológicas. 
 
 
Tabla 1. Clasificación de las subunidades α1 de los canales de calcio. 
 Modificado de Catterall et al., 2003. 
 
 
Expresión de VGCC en células β pancreáticas y líneas celulares secretoras 
de insulina 
Las células β de diferentes especies expresan diferentes subtipos de la 
subunidades α1 responsables de generar canales de calcio tipo L, P/Q, R y T (Mears, 
2004). 
 
Canales de calcio tipo L 
Las canales de calcio tipo L que expresan las células β pancreáticas y líneas 
celulares secretoras de insulina, tienen las mismas características biofísicas que los 
Tipo 
de 
canal 
Clasificación 
alfabética del 
tipo de 
subunidad α1 
Clasificación 
numérica de la 
subunidad α1 
Rango de 
activación 
Perfil de 
inactivación 
Farmacología 
P α1A Cav2.1 HVA Muy lento ω-Agatoxina IVA 
Q α1A Cav2.1 HVA Moderado ω-Agatoxina IVA 
N α1B Cav2.2 HVA Rápido ω-Conotoxina G-VIA 
 
L 
α1C 
α1D 
α1F 
α1S 
Cav1.2 
Cav1.3 
Cav1.4 
Cav1.1 
HVA Lento Dihidropiridinas 
R α1E Cav2.3 HVA Rápido SNX-482 
 
T 
α1G 
α1H 
α1I 
Cav3.1 
Cav3.2 
Cav3.3 
LVA Muy rápido Pimozida 




18

canales neuronales: con poca o ninguna inactivación y alta sensibilidad a las 
dihidropiridinas (DHP; Smith et al., 1989). 
En las células β pancreáticas la entrada de calcio a través de los canales de Ca2+ 
tipo L representa la principal vía de entrada de calcio a la célula. Los roedores expresan 
dos diferentes subunidades α1 en los canales de calcio tipo L, la subunidadad α1D (Cav 
1.3) y la subunidad α1C (Cav1.2). Es ampliamente aceptado que en las células β 
pancreáticas de rata y líneas celulares el influjo de iones de calcio está dado 
principalmente por los canales que corresponden a la subunidad α1D o CaV 1.3, y que 
estos están más estrechamente relacionados con la secreción de insulina (Seino et al., 
1992; Ohta et al., 1993; Barnett et al., 1995; Bokvist et al., 1995; Davalli et al., 1996; 
Satin, 2000; Rosenbaum et al., 2001; Sher et al., 2003; Tylor et al., 2005; Yang y 
Berggren, 2006). 
Sin embargo, la expresión de la subunidad α1 que origina corrientes de calcio 
tipo L difiere entre las diferentes especies (Seino, 1995; Horvath et al., 1998; Barg et 
al., 2001; Liu et al., 2003). Se ha descrito que la subunidad α1C es más importante para 
la secreción de insulina en ratones (Seino et al., 1992; Schulla et al., 2003). También 
existen estudios recientes que muestran una clona de la línea celular secretora de 
insulina INS-1 en la que la secreción de insulina se encuentra más íntimamente 
relacionada con la expresión de la subunidad α1C (Cav 1.2) (Nitert et al., 2008). 
Los primeros registros de célula completa realizados en la línea tumoral 
RINm5F fueron reportados tan sólo unos meses después del primer registro de 
corrientes en células neonatales de células β pancreáticas de rata (Findlay y Dunne, 
1985). Después de esto las corrientes HVA han sido muy bien caracterizadas en la línea 
RINm5F. Las corrientes registradas en la configuración de célula completa en estas 
células se activan a potenciales más positivos de -40 mV, alcanzan una amplitud 




19

máxima alrededor de los 10 mV, y presentan un potencial de reversión alrededor de 50 
mV, también muestran muy poca inactivación (Pollo et al., 1993; Magnelli et al., 1995). 
Hasta el 80% de las corrientes de calcio pueden ser bloqueadas con una dosis saturante 
de DHP (Pollo et al., 1993). 
La caracterización de canales unitarios de las corrientes tipo L en estas células se 
han hecho tanto en la configuración de unión a la célula o “cell-attached” como con la 
cara externa hacia fuera u “outside-out” (Magnelli et al., 1996). Usando al Ba2+ como 
acarreador de carga, las corrientes unitarias de los canales tipo L pueden visualizarse en 
la mayoría de los parches con un potencial de activación entre -30 y 30 mV, y con muy 
poca inactivación. El bloqueador de corrientes tipo L nifedipina abole por completo 
estas corrientes, y su conductancia unitaria es de 21 pS (Yang y Berggren, 2006). 
 
Canales de calcio tipo N 
La aplicación de toxinas aisladas y purificadas permitió el estudio de las 
corrientes remanentes de calcio que no eran bloqueadas por las dihidropiridinas. Es así 
como se descubrieron distintos tipos de canales HVA en las células β de diferentes 
especies, así como en líneas celulares secretoras de insulina. 
La expresión de canales de calcio tipo N en las células β pancreáticas sigue 
siendo controversial, y su expresión varía ampliamente entre especies. Existen datos 
contradictorios sobre su expresión en células RINm5F, INS-1 y HIT-15T, ya que 
mientras algunos autores han detectado este tipo de corrientes en registros 
electrofisiológicos (Satin y Cook, 1988; Aicardi et al., 1991; Sher et al., 1992; Magnelli 
et al., 1996; Sher et al., 2003), otros reportan que las corrientes de calcio en estas líneas 
celulares son insensibles a la ω-conotoxina GVIA (Schmidt et al., 1991; Marchetti et 
al., 1994; Horvath et al., 1998). 




20

Canales del tipo α1B y el RNAm de la subunidad ha sido identificado en células 
β de rata, sin embargo sólo la mitad de los canales están localizados en la membrana de 
la célula (Navarro-Tableros et al., 2007). Reportes recientes confirman que estos 
canales no están presentes en células β de ratón ni de humano (Braun et al., 2008). 
 
Canales de calcio tipo P/Q 
Las corrientes de calcio tipo P/Q han sido descritas ampliamente en varios tipos 
de líneas celulares secretoras de insulina (Magnelli et al., 1995; Magnelli et al, 1996; 
Horvath et al., 1998, Pereverzev et al., 2002). En la línea celular RINm5F, la ω-Aga 
IVA bloquea aproximadamente el 30% de la corriente total de calcio (Magnelli et al., 
1995). Análisis de canales unitarios muestran una corriente única de Ba2+ en esta línea 
celular, cuando las células han sido tratadas con el bloqueador de canales tipo L, 
nifedipina, y el bloqueador de canales tipo N, ω-CTX GVIA. Esta corriente se 
caracteriza por un umbral de activación a -10 mV, una conductancia de 21 pS y poca 
inactivación, características de los canales tipo P/Q (Magnelli et al., 1996). La línea 
celular INS-1 también muestra una corriente de calcio sensible a ω-Aga IVA (Harvath 
et al., 1998; Pereverzev et al., 2002). 
También se ha demostrado la presencia de este tipo de canales en las células β 
de rata (Ligon et al., 1998), el bloqueo de estos canales en células humanas disminuye 
la capacitancia de la célula, una medida indirecta de la exocitosis celular (Braun et al., 
2008). 
 




21

Canales de calcio tipo T 
Los islotes pancreáticos de humano y las células β pancreáticas de rata expresan 
canales de calcio tipo T (Barnett et al., 1995; Ashcorft et al., 1990; Hiriart y Matteson, 
1998), sin embargo, no se han encontrado este tipo de canales en las células β de ratón 
en condiciones normales (Satin, 2000; Sher et al., 2003; Shulla et al., 2003; Yangy 
Berggen, 2005). En el caso de las ratas, los canales tipo T se activan alrededor de -40 
mV y despliegan cinéticas de inactivación rápida y desactivación lenta (Hiriart y 
Matteson, 1998). Estos canales actúan como un marcapasos provocando la 
despolarización de la membrana después del aumento en la concentración extracelular 
de glucosa (Bhattecharjee et al., 1997). 
Existe controversia con respecto a la cinética de este tipo de canales en la línea 
celular secretora de insulina RINm5F. Algunos autores mencionan la presencia de este 
tipo de corrientes en el 10% de las células registradas, y que inactivan a potenciales 
alrededor de -60 mV (Magnelli et al., 1993). Mientras que otros autores indican que las 
corrientes tipo T en esta línea celular se activan a potenciales más positivos de -60 mV 
(Juntti-Berggren et al., 1993). 
También se ha demostrado la presencia de estos canales en la línea celular INS-
1, en la que se conoce que una rampa o pulsos despolarizantes muestran cinéticas típicas 
de este tipo de canales (Bhattecharjee et al., 1997; Harvath et al., 1998). 
 
Regulación de los canales de calcio sensibles a voltaje en las células β 
A diferencia de los receptores no existen activadores ni inhibidores endógenos 
que controlan, de manera selectiva, la apertura de un tipo u otro de VGCC. De manera 
fisiológica, únicamente el nivel de despolarización de la membrana determina la 




22

apertura selectiva de los canales. Por lo que existen otros mecanismos que ayudan a 
controlar la función de los VGCC. 
 La actividad y densidad de los canales de calcio en las células β es regulada por 
una gran cantidad de mecanismos, tales como la [Ca2+]i, la fosforilación de proteínas, la 
translocación de proteínas, la interacción con otras proteínas, etc. La regulación a la alta 
o a la baja de los VGCC da como resultado una mayor o menor cantidad de insulina 
secretada, respectivamente (revisado por Yang y Berggren, 2005). 
En la regulación de los VGCC, el papel de las cinasas de proteínas es de suma 
importancia. La fosforilación de los canales provoca la formación de complejos cinasa-
canal, que son factores clave en el control de los niveles de calcio intracelular. Los 
VGCC en las células β pancreáticas se modulan por diferentes cinasa: la activación de 
la cinasa dependiente de AMPc (adenosín monofosfato cíclico) -PKA- incrementa la 
secreción de insulina mediada por Ca2+ (Yang y Bergggren, 2005); la proteína cinasa C 
-PKC- juega un papel tónico en el mantenimiento de las funciones de los canales 
(Arkhammar et al. 1994). Aún no es claro si la cinasa dependiente de GMPc (guanosín 
monofosfato cíclico) -PKG- modula o no la actividad de los canales tipo L en 
condiciones fisiológicas, pero se sabe está presente en la célula β pancreática; es bien 
sabido que la cinasa dependiente de Ca2+/calmodulina tipo II (CaM cinasa II) se une a 
los canales tipo L y es la responsable de la inactivación de los canales mediada por Ca2+ 
(revisado por Yang y Berggren, 2005). La señalización mediada por cinasas de tirosina 
juega un papel importante en la regulación de la proliferación, sobrevivencia y 
diferenciación de las células β pancreáticas (Navarro-Tableros et al., 2004). Sin 
embargo, se desconoce si su actividad afecta a los VGCC a través de la fosforilación de 
los mismos, aunque se ha demostrado que los VGCC contribuyen en el aumento del 




23

[Ca2+]i producido por la activación de los receptores a insulina (revisado por Yang y 
Beggren, 2005). 
La activación de otros receptores con actividad de cinasa de tirosina, como el 
receptor de alta afinidad (TrkA) al factor de crecimiento neuronal (NGF), produce 
efectos a corto y largo plazo, incrementando la corriente total de calcio por canales 
sensibles a voltaje (Rosenbaum et al., 2001). 
El hecho de que las propiedades electrofisiológicas de las células β de cultivos 
primarios no cambien de manera tan drástica después de la activación de las cinasas de 
proteínas antes mencionadas, como se ve en neuronas o en el músculo, puede deberse a 
que los VGCC en estas células se encuentran altamente fosforilados en su estado basal, 
por lo que es difícil fosforilarlos más después de un estímulo (Ammala et al., 1994). 
Existen varios tipos de fosfatasas de proteínas en las células β pancreáticas, y su 
inhibición no tiene ningún efecto en la actividad eléctrica de los VGCC en las células β 
de ratón, sin embargo, aumentan notablemente las corrientes de Ca2+ en la línea celular 
productora de insulina RINm5F, lo cual se traduce en un aumento en la secreción de 
insulina (Ammala et al., 1994). Esto indica que en algunas líneas celulares, los VGCC 
pueden estar en contacto con fosfatasas de proteínas que se encuentran activas de 
manera tónica, y dominando así sobre cinasas de proteínas y siendo sensibles a la 
inhibición de dichas fosfatasas (revisado por Yang y Beggren, 2005). 
 
El factor de crecimiento neuronal 
El factor de crecimiento neuronal (NGF) pertenece a la familia de las 
neurotrofinas que incluyen al factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), la 
neurotrofina 3 (NT-3) y la neurotrofina 4/5 (NT-4/5). Cada neurotrofina interactúa con 
un miembro de la familia de receptores con actividad de cinasa de tirosina (Trk); el 




24

NGF se une al TrkA, lo cual activa vías de señalización importantes (revisado en 
Patapoutian y Reichardt, 2001) 
El NGF es un complejo de alto peso molecular que contiene tres subtipos de 
cadenas polipeptídicas: la subunidad α, cuya función es aún desconocida; la subunidad 
γ que posee una actividad de proteasa y la subunidad β que es la forma biológicamente 
activa. Esta subunidad se aísla como un dímero, su forma madura tiene una secuencia 
de 118 aminoácidos y contiene tres puentes disulfuro intercatenarios (Figura 1.4). La 
habilidad del NGF para ejercer sus acciones tróficas, de diferenciación y mitogénicas 
sobre sus células blanco, está mediada por la unión a través de dos receptores: un 
receptor de baja afinidad conocido como receptor para NGF p75 y un receptor de alta 
afinidad conocido como TrkA, el cual es un miembro de las familia Trk de los 
receptores con actividad de cinasa de tirosina (Chao, 2003). 
Aunque el NGF fue identificado originalmente como una neurotrofina exclusiva 
del sistema nervioso actualmente se sabe que se expresa y tiene efectos importantes en 
otros tejidos: participa en la respuesta inflamatoria aguda; en el desarrollo de los 
ovarios, se expresa y secreta por el corazón y la adenohipófisis (Furukawa et al., 1984; 
Levi-Moltalcini et al., 1996; Missale et al., 1996; Dissen et al., 2000; Sofroniew, M. V., 
et al 2001). 




25

 
Figura 1.4. Secuencia de aminoácido de la subunidad 2.5S factor de crecimiento neuronal (NGF). 
Los aminoácidos encerrados en los recuadros negros representan los enlaces disulfuro. 
 
Vía de señalización del NGF 
Señalización mediada por TrkA 
Al unirse el NGF con su receptor, promueve la dimerización del mismo y activa 
su función catalítica. Existen 10 residuos de Tyr conservados en el dominio 
citoplasmático del receptor, tres de los cuales están presentes en el asa autorreguladora 
del dominio de cinasas, la cual es una estructura necesaria para la regulación de la 
función catalítica. 
Entre los efectos conocidos del NGF mediados a través del receptor TrkA se 
encuentran la diferenciación celular, como en el caso de las células PC12, que implican 
el término de la división celular, el inicio del crecimiento de neuritas y el incremento en 
la expresión de canales de sodio y calcio (revisado por Sofroniew et al., 2001). 
En la figura 1.5 se observa la cascada de señalización que es desencadenada por 
el NGF cuando este se une a TrkA. Después de la unión del NGF con su receptor este se 
dimeriza, se transfosforila, provocando la fosforilación de otras proteínas como PLCγ y 




26

Shc. Una vez fosforilado Shc se uneel complejo Gbr2-Sos a través de un dominio SH2, 
lo cual provoca una aproximación de Ras a la membrana plasmática y la activación de 
la cascada de señalización de las MAP cinasas. Sos es un factor intercambiador de GTP 
que promueve la transición de la forma inactiva, Ras-GDP a la forma activa Ras-GTP, 
una vez activada Ras recluta a la cinasa de serina-treonina C-Raf en la membrana. Los 
miembros de la familia de RAf medían la señalización del NGF por medio de la 
forsforilación, y la subsecuente activación, de una cinasa de cinasas de las MAP, la 
cinasa MEK1. La activación de MEK1 promueve la forsforilación de dos miembros de 
la familia de las MAP cinasas, las cinasas relacionadas con señales extracelulares 1 y 2 
(Erk 1/2, por sus siglas en inglés). Erk 1/2 son fosforiladas por MEK1 lo cual promueve 
su translocación al núcleo, pero a su vez también tienen la capacidad de fosforilar otros 
sustratos, tales como Elk-1. 
La fosforilación de Elk-1 estimula su interacción con un factor de transcripción 
denominado factor de respuesta al suero (SRF, por sus siglas en inglés) y con el sitio de 
unión del elemento de respuesta sérica (SER, por sus siglas en inglés) en el gen de c-fos. 
c-fos es un gen de muy rápida transcripción que es activado en respuesta a una gran 
variedad de estímulos extracelulares, incluido el NHG, y es un componente temprano en 
una serie de eventos transcripcionales necesarios para el inicio y mantenimiento de la 
diferenciación. La fosforilación de Rsk produce su translocación al núcleo y la 
fosforilación de CREB, el cual una vez activado, se une a la proteína coactivadora 
transcripcional CPB, la cual une también el complejo SRF-Elk, creando un complejo de 
factores de transcripción que lleva a la transcripción de c-fos (Levi-Montalcini, 1996; 
Sofroniew et al., 2001). 




27

 
Figura 1.5. Señalización del NGF mediada por TrkA. Al unirse el NGF con su receptor, promueve la 
dimerización del mismo y activa su función catalítica. La fosforilación de los otros residuos promueve la 
señalización creando sitios de anclaje para proteínas adaptadoras. Esto lleva a la activación de las cinasas 
de fosfatidilinositol 3 fosfato (PI3K), fosfolipasa C-γ (PLC-γ) y a las proteínas adaptadoras Ras (Shc, 
Grb2 y SOS) que inician el proceso de transducción de señales, operando independientemente o en 
conjunto, para generar los diferentes efectos de las respuesta neurotrófica (modificado de Sofroniew et 
al., 2001). 
 
 
Señalización mediada por p75 
El receptor p75 es un miembro de la familia de receptores de muerte del factor de 
necrosis tumoral, es una glucoproteína transmembranal que se une al dímero del NGF 
como monómero. 
Este receptor actúa como un transductor de señales de apoptosis, induciendo la 
muerte celular y juega un papel fundamental como modulador de la estructura tisular 




28

durante el desarrollo, las principales vía activadas por el NGF mediadas por p75 se 
encuentran esquematizadas en la Figura 1.6 (Chao et al., 1998). 
 
Figura 1.6. Señalización del NGF mediada por p75. El receptor de baja afinidad del NGF, p75, activa 
diferentes vías de señalización que regulan la muerte y sobrevivencia neuronal. La vía de señalización 
que promueve la apoptosis está mediada por la activación de JNK, lo cual promueve la activación de p53 
y los miembro de la familia del “dominio BH3” Bad y Bim, y la subsecuente translocación de Bax a la 
mitocondria y la liberación, por parte de la mitocondria, del citocromo c provoca la activación de la vía de 
las caspasas 9, 6 y 3 (modificado de Nykjaer et al., 2005). 
 
 
El Factor de Crecimiento Neuronal y la célula β pancreática 
En los primeros estudios relacionados con el papel del NGF en las células β 
pancreáticas se demostró la expresión del receptor de alta afinidad para NGF (TrkA) en 
islotes de ratas y líneas tumorales secretoras de insulina (Scharfmann et al., 1993). 
Estudios posteriores llevaron al descubrimiento de que en la rata adulta las 
células β sintetizan y secretan NGF biológicamente activo, el cual es secretado en 
respuesta a cambios en la concentración extracelular de glucosa (Rosenbaum et al., 
1998). El NGF produce una serie de cambios fisiológicos y morfológicos en las células 
β aisladas, tales como el aumento en la densidad de canales de sodio, lo cual modula la 




29

actividad eléctrica celular (Vidaltamayo et al., 2002). Así mismo, aumenta la corriente 
de calcio y la secreción de insulina en respuesta a la glucosa (Rosenbaum et al., 2001); 
mantiene la sobrevivencia celular (Navarro-Tableros et al., 2004) y promueve la 
extensión de procesos citoplasmáticos parecidos a neuritas (Rosenbaum et al., 1996). 
El cultivo de células β durante 5-7 días con NGF aumenta la corriente de calcio 
tipo L (Rosenbaum et al., 2002), pero una exposición corta al factor, de 5 minutos, 
también aumenta las corrientes macroscópicas de calcio. Esto sugiere que el NGF actúa 
de dos maneras en la regulación de los canales de calcio, una a largo plazo, en la que 
aumenta la cantidad de canales disponibles en la membrana plasmática y otra a corto 
plazo, en la que modula la actividad de los canales por modificaciones 
postraduccionales como la fosforilación del canal (Rosenbaum et al., 2001). 
En la línea celular RINm5F se ha demostrado la presencia de los receptores de 
alta y baja afinidad del NGF (TrkA y p75) y se ha estudiado el efecto de la exposición 
prolongada a NGF en la morfología y patrón de expresión de las células. El cultivo 
durante 4 días de las células con el factor provoca que las células elaboren procesos 
neuríticos (Polak et al., 1993). 
A pesar de estos hallazgos no se ha estudiado el efecto del NGF en las corrientes 
iónicas de esta línea tumoral, el objetivo de este trabajo es el estudio de las 
modificaciones, si es que existieran, de las corrientes macroscópicas de calcio en las 
células RINm5F, así como la contribución de los diferentes tipos de corrientes de calcio 
a la corriente total. 
Por lo anterior, el objetivo de este trabajo es estudiar el efecto que el NGF tiene 
sobre las corrientes macroscópicas de calcio en la línea celular RINm5F. 




30

II. Planteamiento del problema 
Las células RINm5F se han utilizado a lo largo de los años como un modelo de 
célula β. Esto debido a que antes del uso de animales transgénicos, era muy difícil 
identificar las células β una vez disociados los islotes, por lo que se usaron durante 
mucho tiempo líneas obtenidas de islotes pancreáticos que secretan insulina de manera 
robusta. Estas líneas celulares se pueden mantener en cultivo durante tiempos largos y 
son de fácil manipulación. 
Los canales de calcio sensibles a voltaje juegan un papel fundamental en la 
fisiología de las células secretoras de insulina. Su regulación, positiva o negativa, se ve 
directamente reflejada en la secreción de insulina (revisado por Yang y Berggren, 
2005). Se conoce detalladamente el efecto del factor de crecimiento neuronal (NGF), 
exógeno y endógeno, en la las corriente de calcio de las células β de rata adulta y 
neonatas (Rosenbaum et al., 2002; Navarro-Tableros et al., 2007), sin embargo, se 
desconoce el efecto de dicho factor en la línea celular RINm5F, y debido a que esta 
línea se ha utilizado ampliamente para estudios previos es importante hacer una 
caracterización del efecto del NGF en sus corriente iónicas. 




31

III. Hipótesis 
Los antecedentes indican que las células β de rata, tanto neonatas como adultas, 
expresan el receptor de alta afinidad a NGF, TrkA, y responden al factor aumentando 
las corrientes iónicas. Si las células RINm5F también expresan dicho receptor y 
responden al NGF extendiendo procesos neuríticos, por lo tanto es probable que el 
factor provoque un aumento en las corrientes de Ca2+ de esta línea celular. 
 
IV. Objetivos 
Objetivo general 
Determinar los efectos de una exposición a largo plazo (5 días) delNGF exógeno, sobre 
las corrientes de Ca2+ de las células RINm5F de insulinoma de rata y su mecanismo de 
acción. 
 
Objetivos particulares 
1. Analizar las principales corrientes de Ca2+ presentes en la línea celular RINm5F. 
2. Analizar el efecto de una exposición a largo plazo, del factor de crecimiento 
neuronal (NGF) en la corriente total de Ca2+ de las células RINm5F. 
3. Analizar el efecto de la exposición a NGF en dos tipos de corrientes de Ca2+: 
corriente tipo L y corriente tipo N. 
4. Caracterizar si el NGF promueve la translocación de los canales de calcio del 
citoplasma a la membrana por el método de inmunofluorescencia. 




32

V. Metodología 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cultivo celular 
La línea celular secretora de insulina RINm5F utilizada para este trabajo fue 
adquirida del American Type Culture Collection (ATCC), con el número de catálogo 
CRL-11605. Las células fueron cultivadas en cajas de cultivo Corning de plástico de 
25cm2, con medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB), 200 
unidades/ml de penicilina, 200 µg/ml de estreptomicina y 0.5 µg/ml de amfotericina B. 
Células
RINm5F

Células
cultivadas
en

RPMI
10%
SFB

CONTROL:

células

cultivadas
en

RPMI
1%
SFB

TRATADAS:

células
cultivadas

en
RPMI
1%
SFB

+
50
ng/mL
NGF

Registro
de
corrientes

de
Ca2+

Inmunocitoquímica

vs.
subunidades
α1

de
los
VGCC

5‐7
días
de

cultivo

Células
resembradas
a
baja

densidad





33

Las células fueron levantadas con una solución de tripsina-EDTA 1X y resembradas 
cada semana, al alcanzar la confluencia. 
Las células se mantuvieron en una incubadora a 37°C, a 95% de O2 y 5% de 
CO2. Cinco días antes de los experimentos las células fueron resembradas en el mismo 
medio pero con 1% de SFB y con o sin 50 ng/ml de NGF. Un día antes de los 
experimentos, las células fueron resembradas en cubreobjetos tratados previamente con 
poli-L-lisina y se dejaron pegar al vidrio durante 24 h. 
 
Materiales 
Los reactivos fueron obtenidos de las siguientes fuentes: HEPES, poli-L-lisina, 
tripsina y todas las sales para los registros electrofisiológicos de Sigma (St. Louis, MO); 
cajas Petri de cultivo (Corning); suero fetal bovino (SFB) de Equitech-BIO (Ingram, 
TX); RPMI-1640 (Sigma), solución de penicilina-estreptomicina-anfotericina B de Life 
Technologies (Grand Islan, NY), Tetrodotoxina de Calbiochem (La Jolla, CA) y factor 
de crecimiento neuronal (NGF) de USBiological (Massachusetts, EUA). 
 
Inmunocitoquímica de subunidades α1 de los canales de calcio sensibles a 
voltaje (VGCC) 
Las células fueron fijadas en paraformldehído (PFH) al 4% en PBS, durante una 
noche a temperatura ambiente, lavadas y permeabilizadas con una solución de bloqueo 
que contenía 1% de suero normal de cabra (v/v) y 0.1% de tritón (v/v) por 45 minutos a 
temperatura ambiente. La muestras se incubaron en una cámara húmeda durante una 
noche a 4ºC con el anticuerpo primario IgG levantado en conejo contra las subunidades 




34

α1A, α1B, α1C, α1D y α1G de rata (Almone labs; Jerusalén, Israel) a una dilución 
1:100. Al día siguiente, las muestras se lavaron e incubaron 2 horas a temperatura 
ambiente con el anticuerpo secundario conjugado a fluoresceína (FITC) levantado en 
cabra contra conejo (Zymed, San Fransisco, EUA) dilución 1:100. Las muestras se 
montaron en un medio que contiene 15 mM de NaN3 (DAKO). 
Se realizaron los siguientes controles negativos: 1) los anticuerpos primarios 
(anti VGCC) se preabsorbieron con su antígeno correspondiente (1 µg de péptido por 
1µg de anticuerpo); 2) las células fueron tratadas con el anticuerpo primario solo ó 3) 
con el anticuerpo secundario solamente. Como se esperaba, las muestras presentaron, en 
el primer caso sólo un fondo (background) para la fluorescencia de FITC sin ninguna 
fluorescencia en los otros casos. 
 
Imágenes y cuantificación de la fluorescencia 
La fluorescencia fue observada con un microscopio confocal de barrido láser 
(Bio-Rad MRC 1024) ensamblado con un microscopio invertido (Nikon, Diaphot 300), 
equipado con un objetivo de inmersión en aceite para fluorescencia 40X (Nikon 
Corporation). La excitación fue hecha con un filtro de 480 nm y la emisión con 522 
nm/DF32. 
El microscopio hace cortes ópticos de 1 μm de espesor, por lo que es posible 
observar la fluorescencia de regiones subcelulares, como el citoplasma y la membrana. 
Se realizaron diversos cortes ópticos en Z, sin ningún cambio en la distribución de la 
fluorescencia. 
Se realizó un análisis de la expresión de la proteína de canales de Ca2+ en la 
membrana plasmática en relación al citoplasma como fue descrito previamente por 




35

Viard et al., 2004, con algunas modificaciones; se dibujó una línea sobre la imagen de 
cada célula en el campo, evitando el núcleo (MetaMorph Universal Imaging), 
obteniéndose de esta manera el perfil de intensidad de fluorescencia (cuantificación 
sobre la distancia total de la línea). Los perfiles similares se dibujaron en 50 células de 
cada condición experimental. A partir de cada perfil de intensidad, se cuantificó el 
promedio de fluorescencia de 5 pixeles contiguos a la periferia de las células (señal de 
la membrana plasmática) también como de 5 píxeles contiguos localizados a la mitad de 
la región citoplasmática (señal citoplasmática). Las señales de la membrana, 
correspondientes a cada terminal se promediaron y dividieron por el promedio de la 
señal citoplasmática obteniendo la relación membrana/citoplasma (M/C). El promedio 
de la relación M/C de todas las células se tomó como el patrón de tinción representativo 
para cada condición. Los resultados numéricos se graficaron con el programa Origin 3.8 
(Microcal; Northampton, USA) y la composición de las imágenes se realizó con los 
programas Image J y Microsoft Power Point. 
 
Registros electrofisiológicos 
La corriente total de calcio fue analizada en células con tratamiento durante un 
periodo de 5 a 7 días para condiciones control y en presencia de NGF. Para analizar las 
corrientes macroscópicas de calcio (Ca2+), se utilizó la técnica de fijación de voltaje en 
microáreas de membrana en la configuración de célula completa (whole cell patch 
clamp) (Hamill et al., 1981) que consiste en formar un sello de alta resistencia, de 
gigaOhms (GΩ) entre la punta de un microelectrodo de vidrio y la membrana celular. 
Una vez hecho el sello se rompe la membrana que subyace al electrodo por medio de un 
pulso de succión, haciendo posible el registro de corriente macroscópicas (Neher y 
Sakmann, 1992). Se usó al ion Ba2+ como acarreador de carga, debido a que los canales 




36

de Ca2+ presentan una mayor conductancia a este ión y para evitar la inactivación de 
dichos canales mediada por Ca2+.Se empleó un amplificador de señal Axopatch 200A 
(Axon Instruments, Foster City, CA) a temperatura ambiente. Se utilizaron tubos 
capilares Kimax-51 (Kimble Glass, Vineland, NJ) para los electrodos, los cuales 
tuvieron una resitencia final de 1.5-3 MΩ. Las puntas de los electrodos fueron cubiertas 
con Sylgard (Dow Corning, Midland, MI). La solución externa consistió de (mmol/l): 
125 NaCl, 5 KCl, 2 MgCl2, 10 BaCl2, 10 HEPES y 10 de glucosa. La solución interna 
contenía (mmol/l): 120 CsAsp, 10 CsCl, 5 CsF, 2.5Cs-BAPTA, 10 HEPES y 2.5 ATP. 
Las corrientes de Na+ se bloquearon con la adición de 100 nmol/l de tetrodotoxina 
(TTX) a la solución externa. 
Los transitorios capacitivos de la pipeta fueron cancelados antes de romper la 
membrana y la capacitancia celular se determinó por la integración digital de los 
transitorios capacitivos con pulsos de +10 mV, a partir de un potencial de 
mantenimiento de -80 mV. Los transitorios capacitivos de la célula fueron cancelados y 
las resistencias en serie compensadas, usando el circuito interno de fijación de voltaje. 
Los transitorios capacitivos lineares así como las corrientes de fuga sesustrajeron por 
un procedimiento en línea de P/2. 
El protocolo de pulsos para el análisis de las corrientes de bario (IBa2+), 
consistieron de pulsos de prueba despolarizantes de 15 ms de duración, desde -60 a +50 
mV con incrementos de 10 mV, a partir de un potencial de manteniento de -80 mV. Las 
curvas de activación de la IBa fueron obtenidas por la conversión de los valores de la 
corriente al pico a conductancias (G) 
GIBa = IBa2+/(Vm-Er Ba2+) 




37

Donde IBa2+ es el valor de la corriente al pico, Vm es el potencial de pulso 
comando y ErBa2+ es el potencial de inversión aparente. 
Los valores de G fueron normalizados y ajustados a una relación de Boltzmann: 
 
GIBa/Gmax = {1 + exp [-(V – V1/2/k]}-1 
 
Donde GIBa es la conductancia al pico de IBa2+, Gmax es la conductancia 
máxima de IBa2+, V1/2 es el punto medio de la curva de activación, y k es el factor de 
activación. 
Las relaciones densidad de corriente/voltaje (I/V) se muestran como una 
normalización de la densidad de corriente, en donde la corriente total (dada en pA) 
obtenida se dividió entre la capacitancia de la célula registrada (dada en pF), para así 
obtener la densidad de corriente de cada célula. 
Para la separación de las corrientes de calcio de las células cultivadas con NGF y 
control, se utilizó ω-conotoxina GVIA (Almone labs; Jerusalén Israel), que bloquea de 
manera específica a los canales de calcio tipo N (α1B), a una concentración final de 3 
µM, aplicado con la ayuda de un picospritzer. Así también, se utilizó la nifedipina 
(Almone labs; Jerusalén Israel) que bloquea específicamente a los canales de calcio tipo 
L (α1C y α1D) a una concentración final de 5 µM. 
 




38

Análisis estadístico 
Todos los datos se reportan como promedio ± el error estándar de la media 
(EEM);n denota el número de células o experimentos. La significancia estadística 
específica fue obtenida a través de los análisis de varianza de una vía (ANOVA) (Stat 
View 4.57; Abacus Concepts, Cary, NC). 




39

VI. Resultados 
Cambios morfológicos en las células RINm5F tratadas con NGF 
Debido a que las líneas tumorales presentan una gran variabilidad es sus 
respuestas fisiológicas dependiendo de las condiciones en las que son cultivadas, así 
como, del número de pasos en los que se encuentra el cultivo y el tiempo que tiene este, 
decidimos, a menera de control, cultivar la línea celular en medio definido y en 
presencia, o ausencia de NGF. 
En la figura 2.1 podemos observar que las células cultivadas en medio RPMI 
con 1% de SFB presentan un menor número de prolongaciones neurofilamentosas en 
comparación a aquellas que crecieron en presencia de NGF. Esto nos indica que las 
células responden de la manera esperada al factor, y que expresan el receptor de alta 
finidad para NGF, TrkA. 
 
 
Figura 2.1. Efecto del factor de crecimiento neuronal en la morfología de las células RINm5F. 
A.Células cultivadas en medio RPMI con 1% de SFB durante 5 días. B. Células tratadas en medio RPMI 
con 1% de SFB más NGF durante 5 días, se observa un mayor número de prolongaciones 
neurofilamentosas. 
 
A B 




40

Corrientes de Ba2+ registradas en células RINm5F 
A manera de control estudiamos las corrientes de Ba2+ presentes en la línea 
celular secretora de insulina RINm5F, se registraron las corrientes a través de los 
canales de Ca2+ de células individuales, bajo la técnica de fijación de voltaje en su 
configuración de célula completa, utilizando bario (Ba2+) como acarreador de carga 
(Figura 2.2A). Encontramos que las corrientes HVA de dichas células se activan 
alrededor de -40 mV, alcanzan su máxima amplitud a los 10 mV y se inactivan de 
manera lenta e incompleta en pulsos de 15 ms de duración. 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2.2. Relación corriente voltaje de las corrientes macroscópicas de Ba2+ en células RINm5F. 
A. Familias de corrientes de Ba2+ de células control. B. Relación corriente y voltaje (IV) de células 
control (, n= 27). C. Curva de activación para los valores de la relación corriente-voltaje. Los datos son 
expresados como la media de la densidad de corriente ± EEM, n indica el número de células registradas. 
 
A 
B C 




41

Para conocer la aportación de los canales tipo L y N a la corriente total de Ba2+ 
utilizamos dos diferentes bloqueadores de canales de Ca2+, la nifedipina que bloquea 
canales tipo L y la ω-conotoxina GVIA que bloquea canales tipo N. Encontramos que la 
nifedipina (5 µM) bloquea aproximadamente el 58% de la corriente total (Figura 2.3A), 
mientras que la ω-conotoxina GVIA (3 µM) no provoca una disminución significativa 
en la corriente total. 
 
 
 
 
 
 
Figura 2.3. Efecto de dos diferentes bloqueadores de canales de Ca2+ en la corriente total de Ba2+ en 
células RINm5F. A. Efecto de la nifedipina (5 µM) en la corriente total, la corriente que pasa a través de 
los canales tipo L representa alrededor del 58% (n=9 células control y n=7 células tratadas). B. Efecto de 
la ω-conotoxina GVIA (3 µM) en la corriente total, la participación de los canales tipo N no es 
significativa para la corriente total (n=10 células control y n=7 células tratadas). Los datos son 
expresados como la media de la densidad de corriente ± EEM, n indica el número de células 
registradas.*p≤ 0.05 con respecto a las células control. 
 
El NGF aumenta la IBa2+ en las células RINm5F 
Dado que las células RINm5F presentan el receptor de alta afinidad al NGF, 
TrkA, y que dicho factor induce cambios morfológicos en la línea celular RINm5F 
(Polak et al., 1993) y aumenta las corrientes de Ca2+ en las células β pancreáticas de rata 
en cultivo (Rosenbaum et al., 2002) decidimos analizar los efectos del NGF sobre las 
corrientes macroscópicas de Ba2+ en las células RINm5F. 
*

*

A B 




42

Para investigar los efectos de la exposición prolongada a NGF en las corrientes 
totales de Ca2+ en las células se realizaron registros electrofisiológicos idénticos a los 
reportados para las células control (ver material y método). En las figura 2.4A se 
muestran registros de corrientes representativas, obtenidas de células control y 
cultivadas con el factor, respectivamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2.4. Efecto del NGF durante 5 días en las corrientes macroscópicas de Ba2+. A. Familias de 
corrientes de Ba2+ de células control y cultivadas de 5 a 7 días con NGF. B. Relación corriente y voltaje 
(IV) de células control (□, n= 27) y cultivadas con NGF (, n= 38). C. No se observaron diferencias en la 
dependencia al voltaje entre ambos tratamientos. Los datos son expresados como la media de la densidad 
de corriente ± EEM, n indica el número de células registradas.* p ≤ 0.001 con respecto a las células 
control. 
 
En la figura 2.4B se presenta la relación entre la densidad de corriente y voltaje 
(I/V) de los promedios obtenidos de 27 células control y 38 células tratadas con NGF. 
El tratamiento con NGF exógeno durante 5 días incrementa la densidad de corriente de 
bario (IBa2+) máxima al pico en un 101% comparado con los controles (Figura 2.4B y 
A 
B C 
*

*

*





43

Tabla 2). No hay cambios significativos en el valor de las capacitancias celulares (Tabla 
2), ni en los parámetros de Boltzmann de dependencia al voltaje para la activación 
(Figura 2.4C y Tabla 3). 
 
Tabla 2. Efecto del cultivo con NGF durante 5 días sobre la densidad de corriente de Ba2+ en células 
RINm5F. 
Tratamiento Capacitancia (pF) Densidad de 
corriente (pA/pF) 
Corriente al pico 
(+10 mV) 
Control 11.9 ± 0.79 -14.4 ± 2.6 -175.6 ± 30.3 
NGF 12.9 ± 1 -29.1 ± 3.8** -320.5 ± 41.7* 
*p ≤ 0.005 y **p≤ 0.001. 
 
Tabla 3. Parámetros de Boltzmann para la dependencia de voltaje en células RINm5F control y 
tratadas con NGF. 
Parámetro Control NGF 
Va1/2 (mV) -2.33 ± 1.61 -3.33 ± 1.48 
Ka 8.49 ± 0.40 8.20 ± 0.35 
Todos los valores fueron calculados de manera independiente para cada célula y la media± EEM fue 
usada para una prueba de ANOVA en la que se compararon las células tratadas contra los controles. No 
se presentó ninguna diferencia significativa. 
 
Tipos de corrientes de Ca2+ en células RINm5F modulados por NGF 
Para identificar los tipos de corrientes moduladas por NGF se aplicó una 
metodología similar a la descrita previamente para las células control, usando 
bloqueadores específicos para canales tipo L y canales tipo N. 
En las figuras 2.5A y B se muestra la relación corriente y voltaje de células 
cultivadas con NGF y el efecto de la nifedipina y ω-CTX sobre la corriente total de 
Ba2+, respectivamente. 
 




44

 
 
 
 
 
Figura 2.5. Efecto de dos diferentes bloqueadores de canales de Ca2+ en la corriente total de Ba2+ en 
células RINm5F tratadas durante 5 días con NGF. A. Efecto de la nifedipina (5 µM) en la corriente 
total, la corriente que pasa a través de los canales tipo L representa alrededor del 75%. B. Efecto de la ω-
conotoxina GVIA (3 µM) en la corriente total, la corriente que pasa a través de los canales tipo N 
representa alrededor del 19%. Los datos son expresados como la media de la densidad de corriente ± 
EEM, n indica el número de células registradas.*p≤0.05 con respecto a las células tratadas con NGF. 
 
La figura 2.5A muestra que en las células tratadas con NGF la nifidipina bloquea 
alrededor del 75% de la corriente de Ba2+ al pico, mientras que la ω-conotoxina GVIA 
bloquea el 19%. 
Estos resultados sugieren que el tratamiento con NGF exógeno provoca un 
aumento en la corriente tipo L de aproximadamente el 15% y un aumento en la corriente 
tipo N del 19%. 
Cambios en la inmunoreactividad para la subunidades α1 de los VGCC en 
células tratadas con NGF 
El aumento en las corrientes totales de Ca2+ en las células cultivadas con NGF se 
puede deber a dos factores: 1) un aumento en la síntesis proteica de los canales o 2) un 
aumento en la translocación de los canales a la membrana. 
Para estudiar la posibilidad de que el aumento en la corriente estuviera dado por 
una diferencia en la distribución de los canales en compartimientos celulares, 
*

A 
*

*

*

B 
*

*





45

analizamos la inmunoreactividad para las subunidades α1 de los canales de calcio 
sensibles a voltaje en las células. 
En la figura 2.6 se muestran ejemplos de las micrografías digitales de 
fluorescencia, obtenidas de células en cultivo, inmunoteñidas para las subunidades α1A, 
α1B, α1C y α1D de los canales de calcio sensibles a voltaje, en las cuales se muestra 
una distribución diferencial entre la membrana y el citoplasma, la cual es más intensa en 
la membrana. Es probable que este patrón de fluorescencia refleje la distribución 
predominante de las subunidades α1 en la membrana plasmática.








 
 
 
Figura 2.6. Expresión de VGCC. A. Expresión de las subunidades α1A. B. Expresión de las 
subunidades α1B C. Expresión de las subunidades α1C. D. Expresión de las subunidades α1D que 
forman canales de calcio sensibles a voltaje en células control (C) y tratadas durante 5 días con NGF 
(NGF). Las barras de calibración son 10 µM. 
 
Para cuantificar la inmunoreactividad a cada una de las subunidades formardoras 
de canales, cuantificamos la fluorescencia en la membrana (M) y en el citoplasma (C) 
por separado en 50 células de cada condición (ver métodos), para obtener la relación 
entre la cantidad de canal presente entre la membrana y el citoplasma (M/C). 
En la figura 2.7 se muestran gráficas de superficie para la fluorescencia de 
células representativas en ambas condiciones de tratamiento y para cada uno de los 
VGCC estudiados. La tabla 4 muestra que con respecto a las células control la 
A 
C 
NGF 
B C D 




46

fluorescencia para las subunidades α1A, α1B y α1D aumenta de manera significativa 
en la membrana y en el citoplasma, sin embargo, para la subunidad α1C disminuye, lo 
cual indica que el NGF regula de manera negativa la expresión de dicha subunidad. 
También se muestra que el tratamiento con NGF aumenta la relación M/C en la 
expresión de canales α1D (tipo L) sin afectar la relación en ningún otro tipo de canal 
indicando que únicamente en este tipo de canales es que el NGF promueve la 
translocación de canales del citoplasma a la membrana y no sólo la expresión de los 
mismos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Control NGF 
A 
B 




47

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2.7. Gráficas de superficie de fluorescencia para células representativas de cada uno de los 
VGCC estudiados en las dos condiciones experimentales. A. Inmunoreactividad para la subunidad 
α1A. B. Inmunoreactividad para la subunidad α1B. C. Inmunoreactividad para la subunidad α1C. D. 
Inmunoreactividad para la subunidad α1D. 
 
Tabla 4. Efecto del NGF sobre la expresión de las subunidades α1 de los canales de calcio en 
células RINm5F cultivadas durante 5 días. 
 Control NGF 
Subunidad 
α1 
Promedio 
membranas 
Citoplasma M/C Promedio 
membranas 
Citoplasma M/C 
A 60.65 ± 2.27 52.64 ± 1.71 1.16 ± 0.03 237.45 ± 2.83* 190.32 ± 3.49* 1.26 ± 0.02 
B 91.95 ± 5.08 82.36 ± 3.37 1.12 ± 0.03 247.75 ± 2.07* 193.98 ± 3.55* 1.29 ± 0.02* 
C 167.58 ± 6.70 166.98 ± 6.13 1.01 ± 0.02 105.96 ± 4.04* 104.72 ± 4.03* 1.02 ± 0.02 
D 219.99 ± 4.19 159.64 ± 3.92 1.41 ± 0.04 241.21 ± 3.41* 170.56 ± 4.19* 1.44 ± 0.03 
*p< 0.0001 con respecto a las células control. 
C 
D 




48

VII. Discusión 
Corrientes de Ba2+ presentes en la línea celular RINm5F 
El uso de líneas celulares para el estudio de la fisiología de las células β ha sido 
muy amplio, técnicas actuales nos permiten trabajar con líneas celulares con 
características más similares a las de los cultivos primarios (Hohmeier y Newgrad, 
2004). La línea celular RINm5F se ha utilizado ampliamente en estudios como modelo 
de célula β pancreática debido a que presenta una secreción robusta de insulina que 
disminuye muy poco conforme al tiempo en cultivo (Praz et al., 1983). Sin embargo, es 
importante mencionar que debido a que la mayoría de estas líneas son extraídas de 
tumores sus características fisiológicas pueden cambiar notablemente, como es el caso 
de éstas células que son insensibles a cambios en la concentración de glucosa 
extracelular, posiblemente debido a una falla en la fosforilación de la glucosa por la 
actividad de la glucocinasa (Halban et al., 1983). 
En este trabajo estudiamos los efectos del factor de crecimiento neuronal en 
algunos aspectos de la fisiología de estas células, teniendo como antecedentes la manera 
en la que responden las células β de cultivos primarios de rata a este factor así, como el 
hecho de que las células RINm5F expresan el receptor de alta afinidad a NGF (Polak et 
al., 1993). 
Los resultados tanto electrofisiológicos como de inmunocitoquímica, muestran 
que esta línea celular expresa diferentes subunidades α1 de los canales de calcio 
sensibles a voltaje (VGCC) responsables de generar las corrientes tipo P/Q, N y L. Sin 
embargo, la corriente tipo N, generada por la subunidad α1B, no contribuye de manera 
significativa a la corriente total (Figura 2.3B). Como se ha reportado anteriormente 
(Pollo et al., 1993), la mayor contribución está dada por la corriente tipo L (generada 
por las subunidades α1D y α1C) y representa alrededor del 60% de la corriente total 




49

(Figura 2.3A), el resto de la corriente debe de estar dada por la corriente tipo P/Q 
(generada por la subunidad α1A) y otras corrientes insensibles a la nifedipina. 
En el estudio de la porción de la corriente de Ba2+ sensible a ω-conotoxina GVIA 
en las células RINm5F, no tratadas con NGF, observamos que la aplicación de la toxina 
hasta 10 min a una concentración de 3 µM, no provoca un cambio en la amplitud de la 
corriente, a pesar de que se puede observar en la relación corriente y voltaje, una 
tendencia a la disminución de dicha amplitud (Figura