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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA “Efecto renoprotector del extracto etanólico de Hippocratea excelsa en ratas Wistar macho con Síndrome Metabólico” T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE Bióloga P R E S E N T A Silvana Andrea Díaz Portillo Directora de tesis: Dra. Elizabeth Alejandrina Guzmán Hernández Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla de Baz, Edo. de México 2018 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 AGRADECIMIENTOS A la Dra. Elizabeth Alejandrina Guzmán Hernández, por darme la oportunidad de formar parte de su equipo de trabajo, por todas las enseñanzas, paciencia y apoyo en todo momento. A mis sinodales: Dr. Maximiliano Ibarra Barajas, Dra. Rocío Serrano Parrales, Dr. Victor Manuel Rivera Aguilar y Mtro. David Segura Cobos, por sus valiosos comentarios y críticas para el mejoramiento de este trabajo. Al Biol. Gabriel Martínez Cortés, por sus enseñanzas y comentarios para el mejoramiento de este trabajo. Gracias infinitas. 3 DEDICATORIA A mis padres Verónica y Rodrigo: Gracias a ustedes estoy donde estoy y soy lo que soy, no hay nada que me haga más feliz que compartir mis logros con quien se han encargado de hacerlos posibles. Son mi más grande tesoro. Todo se los dedico a ustedes por siempre. A mi familia y a J. M., quienes siempre han sido mi apoyo incondicional. A todas las personas que me enseñaron a amar la Biología, quienes me acompañaron en esta maravillosa y apasionante carrera. 4 ÍNDICE. Resumen…………………………………………………………………………………...9 Introducción………………………………………………………………………………10 Influencia de angiotensina II en la acción de la insulina……………………..12 Insulina y disfunción endotelial…………………………………………………14 Daño glomerular, tubular y disfunción endotelial.…………………………….15 Tratamientos farmacológicos………………………………………………......17 a) Anti – obesidad………………………………………………………......17 b) Sensibilizadores de insulina…………………………………………….17 c) Reducción de lípidos…………………………………………………….18 d) Hipertensión………………………………………………………….......18 e) Agentes antidiabéticos nuevos…………………………………………19 Uso de los antioxidantes para el tratamiento del SM……,,,,………………..20 Medicina tradicional…………………………………………………………......21 Clasificación Taxónomica de Hippocratea excelsa…………………………..24 Sinonimia………………………………………………………………………….25 Descripción botánica…………………………………………………………….25 Distribución geográfica……………………………………………………….....26 Usos etnobotánicos……………………………………………………………...26 Composición química……………………………………………………………26 Antecedentes……………………………………………………………………………..27 Justificación……………………………………………………………………...............28 Hipótesis…………………………………………………………………………………..28 Objetivos………………………………………………………………………………….29 Objetivo general………………………………………………………….29 Objetivos particulares……………………………………………………29 Materiales y Métodos………….…………………………………………………….…..29 5 Material vegetal…………………………………………………………………..29 Obtención de los extractos de la corteza de Hippocratea excelsa…………29 Determinación de los principales grupos de metabolitos secundarios del extracto etanólico de Hippocratea excelsa……………………………………….……………………………………30 Determinación del perfil de compuestos fenólicos…………………………...30 Animales…………………………………………………………………………..31 Modelo de síndrome metabólico……………………………………………….31 Preparación de agua y alimento………………………………………………..31 Toxicidad aguda y crónica………………………………………………………32 Parámetros de obesidad………………………………………………………...33 Mediciones de presión arterial………………………………………………….33 Parámetros Bioquímicos………………………………………………………...33 Sacrificio de animales……………………………………………………………33 Enzimas antioxidantes…………………………………………………………..34 a) Catalasa (Método de Aebi H. 1983)……………………………………34 b) Glutatión peroxidasa (Método de Paglia y Valentine, 1967)………...34 Medición de la excreción de proteínas en orina.……………………………..35 Cuantificación de proteínas por el método de Bradford……………………..35 Cuantificación por medio de inmunoblots del receptor AT1 y TGFβ……….35 Electroforesis……………………………………………………………………..35 Histología de riñón……………………………………………………………….36 Análisis estadístico………………………………………………………………36 Resultados………………………………………………………………………..37 Identificación de la planta……………………………………………….37 Determinación de los principales grupos de metabolitos secundarios en el extracto de H. excelsa…………………………………………….37 Determinación del perfil de flavonoides………………………………..38 Toxicidad aguda y crónica………………………………………………38 6 Resultados de las variables del Síndrome Metabólico………………40 Efecto del extracto etanólico de H. excelsa sobre las variables del SM………………………………………………………………………….41 Concentración plasmática de lipoproteínas de alta (HDL) y baja densidad (LDL) en presencia de los diferentes tratamientos………..43 Efecto del extracto etanólico de H. excelsa sobre la relación peso riñón – peso corporal total...…………………………………………….43 Efecto del extracto etanolico de H. excelsa sobre proteínas urinarias…………………………………………………………………...44 Expresión del receptor AT1 y TGFβ1 en la corteza renal en presencia de los diferentes tratamientos…………………………………………..45 Cuantificación de la actividad de enzimas antioxidantes en la corteza renal en presencia de los diferentes tratamientos……………………45 Histología………………………………………………………………….46 Discusión………………………………………………………………………………….48 Conclusiones……………………………………………………………………………..53 Literatura citada………………………………………………………………………….54 7 FIGURAS Fig. 1. Arbusto de H. excelsa…………………………..............……………....26 Fig. 2. Corteza de H. excelsa…………........…………………………………..26 Fig. 3. Compuestos químicos aislados de la cancerina H. excelsa…………25 Fig. 4. Efecto del extracto etanólico de H. excelsa sobre la concentración plasmática de lipoproteinas de baja (LDL) y alta densidad (HDL) a las 18 semanas de inducción del síndrome metabólico………………………………………………………………...43 Fig. 5 a) Peso de riñon, b) Peso promedio del riñón en relación al peso corporal, en ratas Wistar macho a las 18 semanas de inducción del síndrome metabólico…………………………………………………….44 Fig. 6. Efecto del extracto etanólico de H. excelsa sobre la expresión del receptor AT1 y TGβ1 en la corteza renal a las 18 semanas de inducción del síndrome metabólico..……………………….…………..45 Fig. 7. Efecto del extracto etanólico de H. excelsa sobre la actividad antioxidante de las enzimas catalasa, superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa en la corteza renal a las 18 semanas de inducción del síndrome metabólico…………………………...………..46 Fig. 8. Efecto del extraxto etanólico de H. excelsa sobre las estructuras renales de ratas con síndrome metabólico………………………...………………………………………47 8 TABLAS Tabla 1. Resultados del análisis fitoquímico preliminar………………………..37 Tabla 2. Determinación de Compuestos Fenólicos del extracto etanólicode H. excelsa…………………………………………………………………………………….38 Tabla 3. Efectos relacionados a las dosis del extracto de H. excelsa………..39 Tabla 4. Mortalidad a siete días…………………………………………………..39 Tabla 5. Mortalidad a veintiún días……………………………………………….39 Tabla 6. Efecto de la fructosa sobre el peso y variables metabólicas en ratas alimentadas con fructosa por 12 semanas……………………………………………41 Tabla 7. Variables del síndrome metabólico a las 18 semanas de su inducción y con tratamiento…………………………………………………………………………42 9 RESUMEN El síndrome metabólico (SM) es definido por un grupo de factores de riesgo para la salud que incluyen obesidad, hipertensión, elevación de las concentraciones plasmáticas de colesterol y triglicéridos e hiperglucemia. El tratamiento para el SM requiere de un estricto control de cada uno de sus factores de riesgo. A pesar de la existencia de una gran variedad de fármacos que han mostrado ser eficaces para el tratamiento del SM, es frecuente que se presenten efectos colaterales. Una alternativa es el uso de las plantas medicinales, que continúan siendo un valioso arsenal de sustancias biológicamente activas. En el presente trabajo se evaluó la presencia de los principales grupos de metabolitos secundarios del extracto etanólico de Hippocratea excelsa y su efecto benéfico en los diferentes factores del SM y del riñón. Se trabajó con un modelo animal de ratas Wistar macho con SM, el cual fue inducido con fructosa al 20%, la cual fue añadida en agua y comida diariamente durante 12 semanas. Al término de la fase experimental, se observó que el extracto etanólico de H. excelsa mostró un efecto anti-obesidad e hipolipemiante, además de regular la actividad antioxidante de las enzimas: catalasa, superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa. El extracto etanólico de H. excelsa 30 y 100 mg/kg, presentó un efecto benéfico sobre el riñón al disminuir la concentración de proteínas urinarias y disminuir el daño renal producido tras la ingesta de fructosa. 10 INTRODUCCIÓN La obesidad, la diabetes y las enfermedades metabólicas son los problemas de salud pública más comunes en México que provocan las principales causas de muerte, lo cual impacta en todos los ámbitos de la vida de los mexicanos (Merino, 2015). El Síndrome Metabólico (SM) es definido como un grupo de factores de riesgo para la salud que incluyen obesidad, hipertensión arterial, insulino resistencia y dislipidemia (Harding et al, 2015; Chen et al, 2015). La presencia de al menos tres de estos factores indica que un paciente tiene SM (Ma y Zhu, 2013). La incidencia del síndrome metabólico está en aumento en todo el mundo, si bien este problema es de magnitud considerable a nivel mundial, cobra especial relevancia el caso de México, debido a que ocupa el segundo lugar en la prevalencia de sobrepeso, solo por debajo de los Estados Unidos, con porcentajes de entre 70% y 80% de personas adultas con estas afecciones (COFEMER, 2017). Las causas son multifactoriales y para optimizar la utilización de recursos y evitar un colapso económico y de salud pública, es necesaria la intervención en la prevención de la obesidad de manera integral (Merino, 2015). El problema del sobrepeso y la obesidad tiene diversos orígenes que pueden estudiarse desde varios puntos de vista: clínico, nutricional, familiar, social y económico, entre otros. Las autoridades mexicanas identifican como principales causas de la obesidad y transtornos metabólicos en México a las siguientes: • Desbalance: mayor ingesta calórica que consumo calórico. • El incremento en el poder adquisitivo dirigido al menor costo de alimentos procesados por avance tecnológico. • La transición nutricional que experimenta el país en su dieta, en la cual aumenta la disponibilidad a bajo costo de alimentos procesados adicionados con altas cantidades de grasas, azúcares y sal. • La disminución de la actividad física en la población. • El incremento en el consumo y disponibilidad de bebidas calóricas y alimentos industrializados (COFEMER, 2017). 11 Diversas instituciones proponen diferentes criterios para diagnosticar a un paciente con SM: OMS, 1998; ATP III, 2003; IDF adultos, 2005. A pesar de existir diferentes criterios para el diagnóstico del SM la prevalencia de este síndrome varía, en dependencia del criterio del diagnóstico utilizado. La importancia de su diagnóstico se relaciona con el potencial impacto que tiene en la morbilidad de estas patologías (Alberti et al., 2009; Sinay et al., 2010). 12 La obesidad se define como un exceso en el almacenamiento de energía en forma de grasa (Simón y Del Barrio, 2009) y ha aumentado su prevalencia de manera acelerada en las últimas décadas, alcanzando proporciones epidémicas. Según la OMS existe sobrepeso cuando el índice de masa corporal (IMC) oscila entre 25 y 29 kg/m! y obesidad cuando el IMC es ≥ 30 kg/m! (OMS, 2012). El incremento del tamaño de los adipocitos provoca varios tipos de factores estresantes (estrés oxidativo, citocinas inflamatorias y concentraciones elevadas de ácidos grasos) induce respuestas celulares mediadas por cinasas celulares, incluidas las proteínas quinasas activadas por mitógenos y varias proteínas quinasas convencionales y atípicas (Monteiro y Azevedo, 2010). El sistema renina angiotensina (RAS) es una cascada proteolítica, conectada a un sistema de transducción de señales, que se inicia con la liberación de renina. La renina es una proteasa aspártica sintetizada como un zimógeno inactivo producida en las células granulares del aparato yuxtaglomerular renal a partir de un precursor, la prorrenina. Actúa sobre su sustrato, el angiotensinógeno, glucoproteína de 452 aminoácidos, de la familia de las alfa-2-globulinas, sintetizada en el hígado, y lo transforma en el decapéptido denominado Angiotensina I (Ang I). Los estímulos principales de secreción de renina son: 1) la disminución de flujo de la arteria aferente del glomérulo renal; 2) la disminución de Na+ plasmático (sensada por la mácula densa, que es parte del aparato yuxtaglomerular renal); 3) estímulos simpáticos (estimulación beta-1-adrenérgica de las células yuxtaglomerulares); 4) factores locales como las prostaglandinas, la dopamina, la adenosina, y el óxido nítrico (NO). La Ang I es transformada en el octapéptido Angiotensina II (Ang II), por medio de una enzima dipeptidil-carboxipeptidasa ubicada en la membrana de las células endoteliales, llamada enzima convertidora de Angiotensina (ECA). Influencia de angiotensina II en la acción de la insulina Los efectos metabólicos de la insulina dependen de su unión a su receptor, el cual se encuentra en la membrana de las células, esta unión provoca la activación del 13 IRS1 y de dos enzimas la fosfatidilinositol cinasa-3 (PI3K) y la cinasa de preoteínas activada por mitógenos (MAPK) (Petersen y Shulman, 2006). La fosforilación de la fosfatidil inositol 3 cinasa (PI3K) inicia una cadena de reacciones, entre ellas la estimulación de la traslocación a la membrana celular del transportador GLUT4, lo que permite la captación de glucosa por la célula muscular, pero existen otros efectos mediados por la vía de la PI3K, como la estimulación de la síntesis de proteínas que inhiben la lipólisis, además PI3K induce la fosforilación de la cinasa de serina Akt, está enzima fosforila la sintasa de óxido nítrico. De tal forma, la insulina, vía la PI3K, estimula la síntesis del óxido nítrico y mejora la función endotelial (Montagnani et al., 2001). La Ang II impide la acción de PI3K, por lo que se reduce la estimulación de la síntesis de óxido nítrico por esta vía, la reducción en la captación periférica de glucosa y la hiperinsulinemia (que estimula a su vez mayor producción de Ang II, creandoun círculo vicioso deletéreo). Por otra parte se estímula la vía MAPK (Rubio, 2009), enzima responsable de las actividades de crecimiento y mitogénesis de insulina y mediadora de las acciones vasoconstrictoras, proinflamatorias y aterogénicas de la hormona (Kim et al., 2006). La disminución de la biodisponibilidad de óxido nítrico secundario al efecto de Ang II sobre PI3K favorece también un estado proinflamatorio derivado de la pérdida del efecto inhibitorio del óxido nítrico sobre la actividad del factor nuclear κB, principal promotor de la síntesis de diversas moléculas inflamatorias, entre las que se encuentran algunas moléculas de adhesión, tales como la molécula de adhesión vascular celular-1 (VCAM1), la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM1) y e-selectina, así como el factor de necrosis tumoral alfa, interleucina-6 e interleucina-1β (Rubio et al., 2009). La aldosterona favorece la inflamación vascular, el aumento del estrés oxidativo con la consecuente disminución de la biodisponibilidad de óxido nítrico, también promueve la proliferación de músculo liso vascular y la fibrosis perivascular, así como la reducción de la vasodilatación mediada por el endotelio (Brown, 2008). Los adipocitos producen un factor que promueve la liberación de aldosterona y la hiperinsulinemia, lo que induce aumento en los niveles de aldosterona, creando 14 así otro círculo vicioso entre hiperaldosteronismo e hiperinsulinemia, con efectos fisiopatológicas importantes en pacientes con resistencia a la insulina; además, constituye un mecanismo para la aparición de complicaciones en el paciente obeso hipertenso (Kraus et al., 2005). Insulina y disfunción endotelial Además del efecto de la insulina sobre la síntesis de óxido nítrico, interrumpida en presencia de AII, la hormona estimula una serie de vías de señalización dependientes de MAPK, la insulina libera endotelina-1 (ET1), un potente agente vasoconstrictor que, además de favorecer la resistencia a la insulina (por reducción del aporte sanguíneo al músculo esquelético), estimula a la enzima NADPH oxidasa. Esta enzima oxidasa está presente en las células endoteliales, en las células musculares lisas vasculares, en los fibroblastos y en las células mononucleares fagocíticas. La actividad vascular aumentada de NADPH oxidasa incrementa la producción de especies reactivas de oxígeno por varias vías, incluyendo el aumento en la activación de la xantina -oxidasa, la autooxidación del NADH y la inactivación de la superóxido dismutasa (Molinau et al., 2002). Existe evidencia de que el incremento resultante en la degradación del óxido nítrico o la inactivación por las especies reactivas de oxígeno más que reducir la producción de óxido nítrico por sí mismo, juega el papel principal en el deterioro de la vasodilatación dependiente del endotelio en el síndrome metabólico, caracterizadas por el aumento de la activación tisular del sistema renina angiotensina (Sowers et al., 2001). De esta forma, la producción elevada de especies reactivas de oxígeno causa una pérdida de la biodisponibilidad del óxido nítrico, que deteriora la vasodilatación dependiente del endotelio (Berry et al., 2000). La reacción de los radicales de oxígeno (anión superóxido) con el óxido nítrico produce peroxinitrito, que contribuye a la vasocontricción y al daño vascular (Stroes, 1999). En el estudio de Higashi y colaboradores, la infusión de ácido ascórbico, un antioxidante, mejora la vasodilatación dependiente del endotelio del antebrazo, antes pero no después de la angioplastía (Higashi et al., 2002). Otros 15 investigadores (Cai y Harrison, 2000) han planteado que la vasoconstricción inducida por una infusión aguda de Ang II puede ser atenuada mediante la infusión simultánea de ácido ascórbico, una observación compatible con el planteamiento de que la Ang II induce la vasoconstricción, en parte a través de la activación de NADPH oxidasa y del aumento en la producción de anión superóxido; esta observación provee evidencia adicional del papel del estrés oxidativo inducido por la Ang II mediando en el deterioro de la vasodilatación endotelio dependiente en el síndrome metabólico (Horning et al., 2001). El papel fundamental de la Ang II en generar especies reactivas de oxígeno en el lecho vascular a través de la activación de las NADPH oxidasas se evidencia posteriormente por la observación de que este efecto puede ser experimentalmente inhibido por los antagonistas de los receptores de la Ang II y en la hipertensión arterial esencial empleando dichos bloqueadores de los receptores de la Ang II e inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina (Zalba et al; 2001). Estudios en animales con hipertensión y en seres humanos con hipertensión arterial esencial han demostrado que la disfunción endotelial está asociada con un exceso de radicales de oxígeno y un incremento en la producción de especies reactivas de oxígeno. Se ha sugerido que en la hipertensión esencial existe un desbalance por el incremento en la producción de radicales de oxígeno y la disminución en la actividad antioxidante, ya que las enzimas glutatión peroxidasa, la superóxido dismutasa y catalasa se encuentran disminuidas en los pacientes con síndrome metabolico (McIntyre et al; 1999). Daño glomerular, tubular y disfunción endotelial El daño oxidativo puede alterar la estructura y función glomerular debido principalmente al efecto de las EROs sobre las células mesangiales y endoteliales. El glomérulo es considerablemente más sensible al daño oxidativo que otros segmentos de la nefrona, como son el túbulo contorneado proximal, inducido por hiperlipoproteinemia, principalmente asociado con acumulación glomerular de lipoproteínas de baja densidad (LDL) (Granqvist et al; 2010). 16 Subsecuentemente, la oxidación de LDL por las células mesangiales podría activar la vía apoptótica tanto de células endoteliales y mesangiales, tal y como lo demuestra un estudio de estas células humanas in vitro, y el efecto protector de los antioxidantes. El estrés oxidativo también puede estar involucrado en otras lesiones inflamatorias glomerulares causadas por una serie de mediadores, incluyendo citocinas y quimiocinas, como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), interleucinas como la 6 (IL 6), el factor de crecimiento transformante beta (TGFβ) y la expresión endotelial de moléculas de adhesión endotelial (VCAM-1), moléculas de adhesión intercelular (ICAM-1) y la proteína quimioatrayente de monocitos (MCP-1) (Coyoy y Morán, 2012), las cuales provocan la activación de leucocitos, producción de especies reactivas de oxígeno y un incremento del daño glomerular. Estas moléculas se asocian a un proceso inflamatorio el cual desempeña un papel importante en la estimulación a la expresión de factores de crecimiento y aumento del estrés oxidativo (Jurek et al; 2006). Por lo tanto, las especies reactivas de oxígeno podrían activar la secreción de moléculas inflamatorias y éstas, a su vez, ejercer efectos mediados por radicales libres, originando un círculo vicioso que perpetúa la respuesta inflamatoria (Tian et al; 2007). Paralelamente, la Ang II participa en la progresión de la enfermedad renal, a través de la activación de la NADPH oxidasa unida a membrana y, subsecuentemente, la generación de superóxido que provoca la hipertrofia de las células del túbulo renal (Moreno et al; 2000), inducción de la expresión del factor de crecimiento transformante beta (TGF–β) que participa en la expansión y la fibrosis del espacio túbulointersticial, mientras que el factor de necrosis tumoral alfa (TNF –α) secretado por las células del túbulo renal, ayuda al reclutamiento de células inflamatorias del intersticio renal (Hannken et al; 1998). Para el tratamiento farmacológico del SM, además de la adición de un estilo devida que ayude a la pérdida de peso, es necesario enfocarse en el tratamiento individual de cada una de las patologías del SM, brindando tratamientos particulares para cada factor. 17 Tratamientos farmacológicos a) Anti-obesidad: la lorcaserina está aprobada para su uso en adultos obesos que tienen presión arterial y colesterol altos. Lorcaserina reduce el consumo de alimentos y promueve la saciedad por activación selectiva de los receptores 5- HT2C sobre las neuronas anorexigénicas proopiomelanocortina (POMC) localizadas en el hipotálamo. Entre los efectos adversos más frecuentes reportados asociados al uso de lorcaserina se encuentran cefalea, mareos, fatiga, náuseas, boca seca, y constipación. En pacientes diabéticos se observaron episodios de hipoglucemia, además dolor de espalda y tos. Por tal motivo, se debe medir la glucemia previa a la administración de este fármaco (Politi e Isolabella, 2013) b) Sensibilizadores de insulina: Las tiazolidinedionas actúan a través de la activación de receptores nucleares específicos denominados receptores activados por proliferador de peroxisomas (PPAR). Hasta ahora se han identificado tres tipos de PPAR que se conocen como alfa, gamma y delta. Las tiazolidinedionas se fija y activa el subtipo PPAR gamma, aumentando la transcripción de muchos genes. Algunos de estos productos génicos son reguladores importantes de la diferenciación de los adipocitos, la homeostasia lipídica y la acción de la insulina. La expresión de los genes de los transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT4 es una de las actividades que son estimuladas por las tiazolidinedionas. Sus efectos son: -Aumento de la captación y utilización de glucosa mediada por la insulina. -Disminución de la hiperglucemia en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 resistentes a la insulina. -Disminución de los triglicéridos plasmáticos. -Aumento del cHDL en plasma. -Aumento de la adipogénesis. -Disminución de los ácidos grasos libres en plasma (Javier, 2000). De los efectos adversos que presentan estos fármacos son principalmente en relación a la inducción de daño hepático, otros efectos comprenden anemia (1- 18 15%); aumento de peso (de 1 a 8 kg en estudios controlados con placebo de 16 a 26 semanas), situación que se origina por un incremento en el apetito y disminución de leptina, o a retención hídrica y estimulación de adipogénesis (Kallen y Lazar, 1996; Shimizu et al, 1998; Nolan et al, 1996). La metformina es la única biguanida que está disponible en la mayoría de las regiones del mundo. Su mecanismo para reducir el nivel de glucosa se basa en la reducción de la producción de glucosa hepática y la mejora de la sensibilidad a la insulina en el músculo esquelético y los adipocitos. La monoterapia con metformina disminuye la hemoglobina glucosilada A1c (HbA1C) en un 1.0-2.0% (Mazzola, 2012). El principal efecto no glucémico de la metformina es la estabilidad del peso o la pérdida modesta de peso. Hay algunas evidencias de que la metformina tiene propiedades antioxidantes. Las propiedades antioxidantes reportadas de la metformina son: disminuir la xantina oxidasa y la lipoperoxidación, aumentar la actividad antioxidante enzimática, quelar iones metálicos como el cobre y el hierro, eliminar generaciones de radicales libres oxigenados, disminuir el nivel de ROS activando diferentes vías como la proteína cinasa AMP (AMPK) mediada por la señalización, la inhibición de la formación de productos finales de glicación avanzada (AGE), la disminución de la apoptosis de células β, y también la disminución de la producción de TNF-α (Rochette et al, 2014). c) Reducción de lípidos: Las estatinas constituyen un grupo de fármacos inhibidores de la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa, que limitan la síntesis de colesterol y la producción de compuestos isoprenoides, actividades responsables de la reducción de la enfermedad aterosclerótica en individuos con hipercolesterolemia (Rodriguez et al, 2011). La enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMGR) es una glicoproteína que interviene en el inicio de la ruta de biosíntesis del colesterol en humanos paso necesario para generar L- mevalonato, lo que resulta en la disminución de la producción de colesterol, componente de las membranas biológicas y de las balsas lipídicas (Marwali et al, 2004). d) Hipertensión: los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) reducé los niveles plasmáticos de Ang II, lo que conduce a una disminución de la 19 presión sanguínea por la vasodilatación periférica. El efecto benéficio de los inhibidores de la ECA sobre el metabolismo de la glucosa se demuestra mediante ensayos clínicos como el estudio HOPE (Evaluación de prevención de los resultados del corazón), que mostró una tasa reducida de diabetes mellitus de nueva aparición en pacientes que toman el inhibidor de la ECA ramipril, aunque este efecto ha sido variable. También se sabe que el bloqueador del receptor de Ang II ejerce una disminución de la presión arterial, sensibiliza a la insulina, induce la actividad de PPARγ, reduce el ácido úrico en suero y citocinas proinflamatorias tales como IL-6 y TNF-α (Guzmán et al, 2016). e) Agentes antidiabéticos nuevos: los agonistas del péptido-1 (GLP-1) similares al glucagón reducen la hiperglucemia mejorando la secreción de insulina estimulada por glucosa a través de la producción del monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) y regulan positivamente la proteína cinasa A (PKA), lo que conduce a aumentos rápidos en el intracelular de calcio y la exocitosis insulina de una manera dependiente de la glucosa, la ventaja de los agonistas de GLP-1 tiene el potencial de reducir la resistencia a la insulina que ayuda a revertir los defectos asociados a la resistencia a la insulina en las células β defectuosas (Tabatabaei et al; 2015). Inhibidores del transportador de glucosa y sódi (SGLT-2): el riñón juega un papel importante en la homeostasis de la glucosa mediando la reabsorción de glucosa del filtrado glomerular, que ocurre a través de SGLT-2 y SGLT-1. Los inhibidores de SGLT-2 bloquean el 90% de la reabsorción de glucosa filtrada en los túbulos proximales, lo que conduce a un aumento de la excreción urinaria de glucosa, que finalmente reduce la hiperglucemia. En 2013 y 2014, la FDA de EE. UU aprobó tres medicamentos de esta clase: canagliflozina, empagliflozina y dapagliflozina como medicamentos antidiabéticos, ya que reducen el riesgo cardiovascular no solo a través del efecto reductor de la glucosa sino a través de efectos beneficiosos sobre el peso corporal, la presión arterial y el ácido úrico sérico (Shyangdan et al; 2016). 20 Uso de los antioxidantes para el mejoramiento del SM Existen en la célula mecanismos de defensa contra el daño renal que pueden inducir los Radicales Libres (RL). Dentro de las defensas intracelulares contra el estrés oxidativo, se encuentran las enzimas: superóxido dismutasa enzima esencial para la vida aeróbica, se encuentra en la mitocondria donde contiene manganeso, y en el citoplasma, contiene manganeso y cobre. Transforma el radical superóxido en peróxido de hidrógeno. Este peróxido puede ser metabolizado por dos enzimas diferentes: la glutatión peroxidasa, única enzima humana que contiene selenio (Levander, 1987), y que oxida el glutatión, reduciendo de esta manera el peróxido de hidrógeno; la catalasa, por otra parte, descompone el H!O! en H!O y O!. Las membranas celulares y las LDL circulantes poseen además tocoferol, una molécula lipídica, que actúa deteniendo la reacción en cadena iniciada por los radicales libres. Contiene un radical OH- cuyo átomo de hidrógeno es fácil de separar. De esta manera, cuando se generan los radicales peróxilo y alcohoxilo se combinan con este antioxidante. Esto convierteel tocoferol en un nuevo radical libre, que es poco reactivo y puede migrar a través de la membrana y ser convertido de nuevo en tocoferol al reaccionar con la vitamina C. En este caso el tocoferol caería dentro de los sistemas antioxidantes extracelulares como también lo son la transferrina, la lactoferrina y los flavonoles (Castillo et al; 2003). Se ha demostrado que los antioxidantes interaccionan con los radicales libres y protegen a las células del daño. Entre los antioxidantes más utilizados se encuentran las vitaminas A, C y E, además del glutatión. Las vitaminas C y E son antioxidantes presentes en la dieta. La vitamina C (ácido ascórbico) se localiza en compartimentos acuosos; es un agente reductor y está involucrada en muchos procesos biológicos, mientras que la vitamina E (principalmente α -tocoferol) es localizada en los lípidos corporales, con importantes propiedades antioxidantes y puede prevenir enfermedades crónicas, las cuales son originadas por el estrés oxidativo (Rock et al; 1996). 21 El tripéptido L-γ-glutamilcisteinilglicina, comúnmente llamado glutatión (GSH), se encuentra relativamente en altas concentraciones (1-10 mM) en células de mamífero. El glutatión se localiza en compartimentos intracelulares, cerca del 85% se encuentra en el citoplasma y el resto permanece distribuido entre la mitocondria (10%) y otros organelos. El glutatión realiza numerosas funciones entre las que se encuentra la conjugación con xenobióticos e intermediarios electrofílicos, por la presencia de un grupo tiol y transfiere equivalentes reductores (O’Donovan y Fernández, 2000). Estos grupos de medicamentos han demostrado ser eficaces en el tratamiento del SM, sin embargo producen efectos secundarios y / o tóxicos, pueden llevar a que el paciente, abandone su tratamiento y busque otras alternativas, como es el uso de las plantas medicinales. Aunque estos tratamientos han mostrado ser eficaces para el tratamiento del síndrome metabólico, es frecuente que presenten efectos secundarios o colaterales, que llevan al paciente a abandonar su tratamiento. Otra límitante son los altos costos del tratamiento requerido y que en algunas poblaciones puede ser inaccesible, especialmente aquellas con un nivel socioeconómico bajo o las que habitan zonas rurales y cuyos servicios medicos son casi nulos o inexistentes. Una de las alternativas que se han presentado, son las plantas medicinales. Estas tienen múltiples beneficios, gracias a los componentes que contienen, y como actúan sobre diversas enfermedades ayudando a contrarrestarlas. MEDICINA TRADICIONAL La herbolaria, como se conoce a la práctica terapéutica que utiliza plantas medicinales, continúa vigente y tiene gran arraigo en nuestro país. Las plantas medicinales constituyen el recurso más conocido y accesible para grandes núcleos de la población mexicana. La Organización Mundial de la Salud (OMS) reconoce el valor de esta práctica terapéutica y le otorga gran importancia en los esquemas o sistemas públicos para la salud. En México, la mayor parte del conocimiento tradicional que se tiene acerca de las plantas medicinales proviene desde la época prehispánica y actualmente diversos 22 grupos étnicos lo conservan. Desde hace más de 30 años ha surgido la necesidad de integrar las medicinas tradicionales dentro de los sistemas oficiales para mejorar la calidad de vida de los pacientes esto por razones de orden cultural y económico (Huerta, 1997). La OMS define a las plantas medicinales como cualquier especie vegetal que contiene sustancias que pueden ser empleadas para propósitos terapéuticos o cuyos principios activos pueden servir de precursores para la síntesis de nuevos fármacos. Estima que el 80% de las personas en regiones menos desarrolladas emplean la medicina tradicional con plantas para el cuidado de la salud (Farnsworth y Soejarto,1985). Se calcula que la flora medicinal mexicana contiene entre 3,000 y 5,000 plantas que tienen potencial terapéutico. Un total de 3,000 especies han sido compiladas en un atlas de plantas medicinales empleadas por diversos grupos étnicos. Increíblemente, aproximadamente el 1% de las plantas medicinales han sido estudiadas a fondo en sus propiedades medicinales. Por lo tanto, es claro que debe realizarse una mayor investigación clínica y etnobotánica, en virtud de elucidar el posible beneficio medicinal de estas plantas (Huerta, 1997). Actualmente, se tiene el conocimiento de que muchos compuestos derivados de plantas, cuya actividad farmacológica es importante, se producen mediante vías metabólicas adicionales al metabolismo primario, conocido como metabolismo secundario (Wink, 1999), por lo que dichos compuestos son llamados metabolitos secundarios. Muchos de éstos, ya sea de forma individual o en diferentes combinaciones, poseen efectos estimulantes, calmantes o terapéuticos en el humano, además de que en su mayoría son utilizados como materias primas de la industria farmacéutica, alimentaria, textil, agroquímica, perfumería y cosmetología (Hartmann, 2007). En la medicina tradicional mexicana se usan diversas plantas a las que se les atribuyen propiedades útiles para el tratamiento del SM (Huerta, 1997), ejemplo de ellas es la Jamaica (Hibiscus sabdariffa) (Ajiboye et al; 2015), ajo (Allium sativum) (Reinhart et al; 2008), Jengibre (Zingiber officinale) (Yang et al; 2014) y matarique (Psacalium decompositum) (Merino et al; 2015). 23 Hibiscus sabdariffa L. (Hs) o jamaica: México ocupa el séptimo lugar en producción de esta planta. En estudios como el de Ekor et al; 2010 se investigó la propiedad quimiopreventiva del extracto etanólico de H. sabdariffa en la dislipidemia y el estrés oxidativo asociados con la administración prolongada de colesterol en conejos. Los resultados demostraron que el extracto atenuó significativamente la alteración en los niveles de lípidos y el estado antioxidante inducido por la alta ingesta de colesterol. Ochani y D´ Mello en 2009 demostraron en un modelo hiperlipidémico inducido por colesterol en ratas, que el extracto de las hojas y los cálices de Hibiscus sabdariffa mostraron una disminución significativa de los valores séricos de colesterol total, LDL (lipoproteínas de baja densidad), VLDL (lipoproteína de muy baja densidad). Además sugieren que el extracto etanólico de los cálices y las hojas de H. sabdarifa contienen polifenoles y flavonoides con actividad antioxidante y antihiperlipidémica. Allium sativum (ajo): es bien conocido por sus propiedades antidiabéticas, hipotensoras y reductoras de los lípidos que sugieren un papel en el tratamiento del SM (Hosseini y Hosseinzadeh, 2015). Los extractos del ajo disminuyen la presión arterial (Ried et al; 2010). El extracto seco del ajo envejecido tiene actividad inhibitoria sobre la ECA y actúa como bloqueador de los canales de calcio, lo que reduce la sensibilidad a las catecolaminas; también aumenta los niveles de bradicinina y óxido nítrico y consecuentemente mejora la presión arterial (Butt et al; 2009). Un metaanálisis reciente de ensayos clínicos aleatorizados controlados con placebo mostró reducción promedio en la presión arterial sistólica en un grupo de pacientes tratados con ajo; además, en el subgrupo de pacientes con hipertensión arterial la presión arterial sistólica y diastólica se redujo (Ried et al; 2010). Zingiber officinale o jengibre: es una de las especias y plantas medicinales más utilizadas en todo el mundo. Se ha demostrado que el jengibre tiene actividades 24 farmacológicas, como actividades gastrointestinales, analgésicas, antiinflamatorias, antioxidantes y cardiovasculares (Ali et al; 2008 y Nicoll, 2009). Se ha demostrado que el suplemento de jengibre mejora el hígado graso inducido por el consumo de fructosa (Gao et al; 2012) y la resistenciaa la insulina del tejido adiposo en ratas con alta ingesta de fructosa (Wang et al; 2013). Yang y colaboradores en (2014), examinaron el impacto del jengibre en la lesión renal inducida por el consumo de fructosa crónica en ratas. Los resultados demostraron que el suplemento con extracto de jengibre a 50 mg/kg atenúa la lesión renal inducida por el consumo de fructosa crónica en ratas. Psacalium decompositum o matarique: las propiedades hipoglucémicas de esta planta han sido ampliamente estudiadas; sus extractos y fracciones son eficaces para la reducción en los niveles de glucosa en ratones normoglucemiantes y ligeramente diabéticos (Jiménez et al; 2011), así como en conejos con hiperglucemia temporal. La fracción acuosa contiene fructanos de tipo carbohidrato (inulina), que mostró un efecto hipoglucémico en ratones diabéticos inducidos con aloxan y sanos. Los estudios fitoquímicos revelaron que contiene varios compuestos sesquiterpénicos hipoglucémicos (furanoeremofilanos), como el cacalol, y la mezcla de 3-hidroxicacalolida y epi-3-hidroxicacalolida. La fracción de fructooligosacáridos (FOS) obtenida de la raíz de P. decompositum mostró un efecto antiinflamatorio y efecto inhibidor sobre el aumento de peso, la producción de triglicéridos y colesterol en ratas Wistar con obesidad inducida por una dieta rica en fructosa (Merino, 2015). CLASIFICACIÓN TAXÓNOMICA DE HIPPOCRATEA EXCELSA Nombre Científico: Hippocratea excelsa KUNTH. Nombres Populares: Cancerina, Mata piojo, Bejuco del piojo. Origen: La especie Hippocratea excelsa K. (Hipocrateaceae) es originaria de América central y en México se encuentra en los Estados de Durango, Estado de México, Guerrero, Oaxaca, Chiapas y Yucatán (Sánchez y Durand, 1985). 25 Sinonimia. La planta que popularmente se le conoce en el país como cancerina también tiene los nombres comunes “mata piojo”, “miseg-bat” (Oaxaca), “barajillo”, “ixcate”, “ixcate rojo”, “acpatle”, “temecaixcapajtle”, “mapiojos” (Guerrero y Puebla), “hierba del piojo”, “piojo”, “zipche” (Chiapas) y palo de reguilete (Yucatán) (Villa et al., 1998 y Reyes et al., 2003). El nombre náhuatl temecaixcatl se deriva de temecatl- bejuco e ixcatl-algodón (Grupo de terapeutas y Campesinas de Copalillo y Temalac, Guerrero, 2000). Su nombre científico es Hippocratea excelsa Kunth, su sinónimo es Hemiangium excelsum (Kunth) A.C. Sm. Pertenece a la familia Hippocrateaceae (Smith, 1940). Descripción Botánica La cancerina es una planta trepadora leñosa que puede crecer hasta 10 m de altura (Figura 1), de tallos delgados, con hojas coriáceas, opuestas, elíptico- oblongas, ásperas, crenado onduladas, angostándose hacia la base, de 7 – 7.5 cm, flores pequeñas amarillas con cinco pétalos (de 5 mm), el fruto es una cápsula dividida en tres (14 cm de diámetro), y semillas aladas de 4 – 5 cm de largo (8 – 14 semillas por fruto. Las hojas tienen estomas del tipo actinocítico, el parénquima empalizada contiene abundantes espacios intercelulares, en las células epidérmicas se encuentran drusas y abundantes taninos. La corteza del tallo es fisurada a ligeramente escamosa (Figura 2), de color gris verdoso; mide 5 mm de grosor total; tiene un sabor ligeramente picante; es inodora y de textura granulosa; la corteza interna (floema) es de color rojizo a rosáceo. El sistema radical es pivotante y presenta crecimiento secundario; la corteza de la raíz es de color café rojizo a rosáceo y de textura ligeramente fibrosa, la superficie de la raíz es amarilla y algo elástica; tiene un sabor ligeramente astringente y textura fibrosa; el grosor total es de 5 mm y contiene abundantes taninos (Villa y Barajas, 1998 y Reyes et al., 2003). La estructura que se aprovecha es el floema del tallo y raíz. 26 Fig. 1. Arbusto de H. excelsa. Fig. 2. Corteza de H. excelsa. Distribución geográfica Es una planta endémica cuya distribución se encuentra restringida a Centroamérica y en México, aunque también se distribuye en el sur y sureste del país en los estados de Hidalgo, Puebla, Jalisco, Michoacán, Morelos, Guerrero, Oaxaca, Chiapas, Campeche, Tabasco y Quintana Roo. Crece en selvas tropicales secas y semi-húmedas desde el nivel del mar hasta los 1200 m, principalmente en vegetación de selva baja caducifolia (García, 2009). Usos etnobotánicos La cancerina tiene importancia medicinal y un posible uso insecticida e industrial. En la medicina tradicional se considera útil para el tratamiento de diversas enfermedades: ginecológicas (hemorragias o infecciones uterinas), infestaciones o infecciones de la piel (piojos, ectoparásitos y hongos); gastrointestinales (gastritis) y respiratorias (tos). Se le atribuyen efectos antiinflamatorios, analgésicos y antinfecciosos (Villa y Barajas, 1998; Reyes et al; 2003). Composición química. De la corteza de la raíz y el tallo se han logrado aislar e identificar las siguientes sustancias químicas: canofilol, 𝛽-sitosterol, 𝛽-amirina, ácido canafólico, friedelina, pristimerina, celastridina, sitosterol-3-O-β-glucósido, epicatequina, hidroxifriedelina, hidroxitaraxerol, hidroxiglutinol, hidroxi-amirenon, sesquiterpeno evoninota, hippocrateina I y II, así como una mezcla de alcaloides sesquiterpénicos estre otros (Reyes et al; 2003). 27 Figura 3. Compuestos químicos aislados de la cancerina Hippocratea excelsa. Antecedentes En 2002, Navarrete y colaboradores aislaron extractos acuosos y etanólicos de la corteza de la raíz de Hippocratea excelsa HBK. Localmente conocido como 'Cancerina', mostró efecto gastroprotector en varios modelos experimentales de úlceras en ratas. El fraccionamiento del extracto metanólico condujo a cuatro grupos de fracciones activas. Sitosterol, 3-O- β-glucósido, β-sitosterol y epicatequina, mostrando actividad gastroprotectora importante. Las propiedades gastroprotectoras demostradas en el estudio proporcionan apoyo adicional para el uso popular de esta planta como un remedio antiulceroso en la medicina tradicional mexicana. Pérez y colaboradores en 1995 reportaron el efecto antiinflamatorio del extracto etanólico de H. excelsa utilizando varios modelos animales. En un modelo de rata con edema plantar inducido por carragenina, el extracto etanólico mostro un efecto 28 antiinflamatorio y efecto protector sobre la lisis de eritrocitos inducida por calor a concentraciones de 25, 50 y 100 µg/ml. JUSTIFICACIÓN El porcentaje de personas que padecen uno o varios factores relacionados con el SM en México ha ido en notable aumento en años recientes debido al estilo de vida sedentario que se presenta en la modernidad, lo que ha llevado a que un mayor número de personas desarrollen daño renal. La insuficiencia renal crónica, considerada ya una epidemia por la Organización Mundial de la Salud, en México es un enorme problema de salud pública derivado del descontrol de pacientes con obesidad. En julio del 2015, el IMSS registró 59,146 pacientes bajo tratamiento sustitutivo de la función renal, ya sea diálisis peritoneal (DP, la que se hace a través de la cavidad abdominal o peritoneo) o hemodiálisis (hecha a través de la sangre). En el último año destinó 6,500 millones de pesos a ambas terapias, y la cifra año con año aumenta a consecuencia de la creciente epidemia de pacientes con insuficiencia renal crónica (IRC). Estas enfermedades ponen en declive a México, ya que los fármacos causan efectos secundarios, sus costos son altos y no toda la población tiene acceso a ellos. Una de las alternativas que se han presentado, son las plantas medicinales. Estas tienen múltiples beneficios, gracias a los componentes que contienen, y como actúan sobre diversas enfermedades ayudando a contrarrestarlas. HIPÓTESIS La corteza de Hippocratea excelsa posee metabolitos secundarios quehan mostrado tener efectos antiinflamatorios y gastroprotectores, por lo que se espera que el extracto etanólico disminuya el daño renal, la obesidad y la dislipidemia en ratas con síndrome metabólico. 29 OBJETIVOS Objetivo General • Evaluar el efecto renoprotector y antioxidante del extracto etanólico de Hippocratea excelsa en el síndrome metabólico. Objetivos particulares En ratas con síndrome metabólico inducido con fructosa y tratadas con extracto etanólico de la corteza de H. excelsa se evaluarán: • El peso corporal total, los triglicéridos, glucosa y colesterol sanguíneos. • Las lipoproteínas de alta y baja densidad plasmaticas. • Las proteínas urinarias • La expresión a nivel de proteínas del receptor AT1 y el TGFβ1. en la corteza renal. • La actividad de las enzimas antioxidantes catalasa, glutatión peroxidasa y superóxido dismutasa. MATERIALES Y MÉTODOS Material vegetal. La corteza de H. excelsa se obtuvo en el Mercado de Sonora ubicado en la Ciudad de México, posteriormente se seleccionó material vegetal para la identificación taxonómica en el Herbario “IZTA”, de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala, UNAM. Obtención de los extractos de la corteza de Hippocratea excelsa La obtención del extracto etanólico se realizó por el método de maceración (Domínguez, 1973). Consistió en colocar 3 kg de corteza seca y fragmentada en un matraz, al que se le adicionaron cinco litros de etanol (J. Baker) y se dejó en reposo durante 24 horas. El extracto se filtró y el exceso de solvente se destiló a presión reducida en un rotavapor (Buchi modelo Mp60). Para obtener el rendimiento del extracto se agregaron 100 ml de etanol a 100 g de cancerina a temperatura ambiente y el rendimiento fue de 1.8%, el rendimiento del extracto fue con temperatura a 70º C fue de 6.5%. 30 Determinación de los principales metabolitos secundarios del extracto etanólico de Hippocratea excelsa Se realizaron las pruebas fitoquímicas correspondientes para la determinación de la presencia o ausencia de los siguientes metabolitos secundarios: Metabolito Secundario Prueba y/o reactivos Alcaloides Dragendorff y Mayer Saponinas Prueba de la espuma Terpenos Vainillina+ H2SO4 Glicósidos Prueba de Molisch (α- naftol+HCl) Fenoles y Flavonoides Cloruro férrico Determinación del perfil de Compuestos Fenólicos Los cromatogramas fueron obtenidos empleando un HPLC serie 1200 infinity acoplado a un detector de espectometria de masas con tiempo de vuelo (tiempo en que tarda la muestra en irse separando), ambos de la marca Agilent technologies. Las condiciones cromatográficas fueron las siguientes: se mantuvo un flujo constante de 0.2 ml/min y gradiente con fase móvil que consistió en: fase a (agua, acetonitrilo y ácido formico), 89:10:1, y la fase b (metanol, acetonitrilo y ácido formico), 89:10:1, se inició la corrida con el 100% de la fase a durante 3 min, a los 11 min se redujo a 65% y del minuto 11 al 20 se redujo al 55%, posteriormente del minuto 20 al 35 se cambió a la fase b durante 25 min. La temperatura de la columna fue de 25º C, el volumen de inyección fue de 20 µl del extracto disuelto en etanol (1mg/mL). Con respecto al detector de masas se utilizó una adquision en modo MS1 con rango de masas de 50-1300 m/z, temperatura 31 del gas fue de 300º C, flujo del gas de 10 l/ml, presión del nebulizador fue de 60 psig, modo de ionización fue negativo. Los parámetros de la fuente de ionización fueron: volumen del capilar 4000 voltios, fragmentador 200 voltios, skimmer de 65 voltios (Hernández, 2014). Animales. Se obtuvieron treinta ratas Wistar macho de 9 y 12 semanas de edad (adultos-jóvenes) con un peso corporal entre 200 y 250 g en el Bioterio de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala, UNAM. Todos los animales fueron mantenidos bajo condiciones de temperatura e higiene controladas y ciclos de luz- obscuridad de 12 h por 12 h. Los animales fueron separados aleatoriamente en seis grupos de 5 organismos cada uno; el grupo control fue tratado con una dieta ab libitum (44,2% de carbohidratos, 18% proteína, 6.2% de grasa; 3.1kcal / g; Teklad Global dietas, Harlan Laboratories Inc., Indianapolis, IN, EE.UU.), y otro con fructosa durante 12 semanas. Modelo de síndrome metabólico A cinco grupos de organismos se les administró la siguiente dieta que consistio en alimento y agua con fructosa al 20% durante doce semanas (Merino et al., 2015), una vez establecido el SM se administraron durante 6 semanas mas, diariamente los siguientes tratamientos: Fructosa Fructosa + Losartán (30 mg/kg) Fructosa + Vitamina E (500 mg/kg) Fructosa + Extracto etanólico de H. excelsa (30 mg/kg) Fructosa + Extracto etanólico de H. excelsa (100 mg/kg) Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo a la NOM-062-ZOO-1999 (SAGARPA, México), y fue aprobado por el Comité Institucional de Investigación y Bioética. Preparación de agua y alimento. Diariamente se preparó alimento con fructosa al 20%. La preparación consistió en moler 480 g de pelets, después se vertió el contenido con 120 g de fructosa, después se le añadió un vaso de agua purificada, todo se mezcló perfectamente hasta que quedó una masa homogénea que se 32 compactó en tubitos que formaron pelets en formas cilíndricas, éstos fueron acomodados en moldes de aluminio que fueron dejados en un horno de secado a 55º C por 12 h. La preparación de agua con fructosa al 20%, consistió en diluir 20 g de fructosa en 80 ml de agua purificada. Toxicidad aguda y crónica El método utilizó dosis predefinidas y los resultados permitieron asignar y clasificar una sustancia de acuerdo con el Sistema Globalmente Armonizado para la clasificación de productos químicos que causan toxicidad aguda (OECD, 1998). Se utilizaron ratones CD-1, los cuales se agruparon en 4 cajas con 5 ratones (de forma aleatoria) con un peso inicial de entre 20 – 25 g. Se les administraron dosis únicas por vía oral de 5, 50, 300, 2000 mg/kg, de extracto etanólico de H. excelsa (vehículo de solución salina – etanol 90 ÷ 10 %) respectivamente a cada grupo de ratones. Estos se observaron individualmente después de administrar las dosis durante la primera hora y después cada 24 h por un período de 7 días. Esto es para la toxicidad aguda. Para la toxicidad crónica se pesaron 280 g de cancerina los cuales se colocaron en una licuadora semi-industrial hasta obtener un polvo fino. El polvo se maceró con 2.5 litros de etanol absoluto. El líquido obtenido se colocó en una campana de extracción a temperatura ambiente para su posterior evaporación. Se utilizaron 48 ratones CD-1, 14 machos, 16 hembras y 18 controles, los cuales fueron distribuidos en forma aleatoria en 10 cajas, con máximo de seis y mínimo de 4 ratones por cada una, y un peso inicial de entre 20- 40 g. Se administraron dosis de 1000 mg/kg por día, por vía oral (vehículo solución salina – etanol 90 ÷ 10%) de cancerina a cada grupo de ratones (machos y hembras). Los animales se observaron durante una hora después de la administración de las dosis y después de cada 24 h por un período de 21 días. Este procedimiento fue basado en la metodología de la OECD Guidelines for the Testing of Chemicals (2015). A partir de estas pruebas se decidió utilizar las dosis de 30 y 100 mg/kg para los ensayos posteriores. 33 Parámetros de obesidad. El porcentaje de aumento de peso corporal, índice de masa corporal (IMC) y la circunferencia abdominal (CA) se midieron como indicadores de obesidad. El peso corporal fue registrado semanalmente de la semana cero a la semana dieciocho. El IMC o índice de Lee se calculó dividiendo el peso (g) por la longitud (cm2). La longitud de las ratas se midió de la región nasal a la región anal con una cinta métrica flexible (Pouyal etal., 2010). Mientras que la CA fue medida con una cinta métrica flexible posicionando a las ratas verticalmente sobre sus extremidades posteriores y poder medir con la cinta su parte media. Mediciones de presión arterial. La presión arterial sistólica (PAS) fue registrada mediante pletismografia no invasiva. Consistió en colocar a cada rata en una caja inmovilizadora dejando al descubierto la extremidad caudal. Posteriormente fueron colocadas en una cámara de acondicionamiento Heater and Scanner LE565/6 LSI LETICA a una temperatura de 40º C. Se esperó un lapso de 10 min para que el registro del pulso fuera homogéneo. Se procedió a determinar la presión arterial a través del transductor de presión (LE 5007) LSI LETICA colocado en el extremo caudal y conectado a una computadora. El registro de PAS se obtuvo mediante el programa Chart 4.0. Para minimizar las variaciones inducidas por el estrés durante el registro de la presión arterial todas las mediciones fueron tomadas por la misma persona, en el mismo ambiente, día y hora, el registro de presión se realizó por cada grupo y se realizaron tres mediciones por sesión (Zhao et al., 2011). Parámetros Bioquímicos. Las mediciones de colesterol, triglicéridos y glucosa se realizaron empleando muestras de sangre extraídas de la vena caudal en las semanas cero, doce y dieciocho con los animales en ayunas (8 h) por medio de un glucómetro Accutrend (Roche) y tiras reactivas (Merino, 2015). Sacrificio de los animales. En la semana 18 los animales fueron anestesiados con pentobarbital sódico 45 mg/kg, vía intraperitoneal. Se tomaron muestras de sangre en tubos heparinizados, que fueron centrifugadas a 5000 xg durante 15 minutos. Las muestras de plasma fueron separadas en tubos Eppendorf y se almacenaron a -80° C para su posterior análisis. La concentración plasmática de 34 lipoproteínas de alta (HDL) y baja densidad (LDL), fueron determinadas mediante un Kit (Spinreact). Ambos riñones fueron extraídos por cada animal; uno fue utilizado para evaluar histológicamente las lesiones que pudieran presentarse. Otro para realizar homogeneizados de la corteza renal, en las que se cuantificó la actividad de enzimas antioxidantes y la expresión del receptor AT1 y TGF𝛽1. Los riñones no fueron perfundidos. Enzimas antioxidantes. a) Catalasa (Método de Aebi, 1983) Para la reacción se utilizo amortiguador de fosfatos 66.6 mM, pH 7.0 y peróxido de hidrógeno. La catalasa consume el peróxido de hidrógeno y forma en su lugar agua y oxígeno. Esto se observa como la disminución de la absorbancia de una muestra a 240 nm, contra el tiempo. Se determinó la absorbancia en intervalos de 15 segundos, a partir de la adición de la muestra. El espectrofotómetro se ajustó a cero con el amortiguador de fosfatos, posteriormente se agregó a una cubeta de cuarzo 1 mL de peróxido de hidrógeno, más 10 µL de la muestra y se registró la absorbancia cada 15 segundos a partir de la adición de la muestra. Se calculó la desaparición del peróxido de hidrógeno utilizando el coeficiente de extinción molar del peróxido de hidrógeno: ε= 40/M cm a 240 nm. La concentración de proteínas en la muestra, se reportó como UI/mg proteína. Una UI equivale a 1.0 µmol de peróxido de hidrógeno consumido por minuto. b) Glutatión peroxidasa (Método de Paglia y Valentine, 1967). 1. La reacción se llevó a cabo cuando la glutatión peroxidasa consume glutatión y como cofactor oxida NADPH. Se utilizó amortiguador de fosfatos 50 mM, EDTA 5 mM, pH 7.0. la reacción consistió en el consumo de glutatión generando el cofactor NADPH. La reacción se vuelve cíclica, y la diferencia en la absorbancia a 340 nm entre los 2 y 4 minutos de reacción es proporcional a la actividad de la glutatión peroxidasa presente. 35 Medición de la excreción de proteínas en orina Las ratas de todos los grupos fueron colocadas en jaulas metabólicas para recolección de orina. Cada animal se introdujo en las jaulas con 24 h de anticipación a la toma de la muestra para tener un periodo de adaptación. Posterior a este periodo, se colectaron 5 ml de orina y se almacenaron a -80 º C hasta la realización de la cuantificación de proteínas. Cuantificación de proteínas por el método de Bradford Se determinó la concentración urinaria de proteínas mediante el método de Bradford (Bradford, 1976). Cuantificación por medio de inmunoblots del receptor AT1 y TGFβ𝟏 Para las pruebas moleculares, se realizaron alícuotas de 200 µg (tejido renal), se adicionaron 10 µL de buffer Laemli (de carga) con β -mercaptoetanol al 10%, se agitaron con un agitador (Super-Mixer 1290 Lab-Line Instruments, Inc.), se hirvieron por 10 min en una placa térmica para desnaturalizar las proteínas y se almacenaron a -80° hasta su uso. Electroforesis. Las proteínas se separaron por electroforesis con geles de poliacrilamida al 10% con dodecilsulfato de sodio (SDS). Se colocaron 50 µg de proteín, y se separaron a 88 voltios durante 120 min con la fuente de poder Power PacTM HC BioRad. Una vez terminada la electroforesis, se realizó la transferencia de la proteína en los geles a membranas de difluoruro de polivinideno PVDF (Amersham HybondTM-P GE Healthcare) utilizando un sistema semiseco (Trans-blot SD BioRad) durante 60 min a 18 voltios. Para este paso se humedeció la membrana de PVDF en metanol absoluto por 5 min y posteriormente se sumergió en buffer de transferencia junto con los papeles filtro. Las membranas de PVDF, el gel y los papeles se organizaron en forma de sándwich en la cámara de transferencia. Las membranas fueron bloqueadas con leche descremada al 5% en TBST durante 2 h y posteriormente se incubaron con el anticuerpo primario en dilución 1:1000 durante 15 h, después las membranas fueron enjuagadas con TBST tres veces, 36 cada vez 10 min y fueron incubadas con el respectivo anticuerpo secundario en dilución 1:10000 durante 2 h; nuevamente fueron enjuagadas con TBST tres veces, cada vez 10 min. Las membranas fueron llevadas a un cuarto oscuro donde se tomaron cuidadosamente con pinzas y fueron colocadas en un hypercassette, protegidas por un acetato; se les agregó luminol, y se colocó una película encima de cada una. Se cerró el cassette durante 5 min. Transcurrido el tiempo se sacó la película y se colocó en una solución reveladora, durante 3 min, se enjuagó en agua desionizada y se colocó en solución fijadora durante 1 min; nuevamente se enjuagó y se dejó secar. Se comparó con el marcador de peso molecular para identificar a la proteína de interés y se analizó con un densitómetro de geles BioSens SC 645. Se realizó el cociente entre la densitometría del receptor AT1 ó TGFβ1 y β-actina), obteniendo el resultado en unidades arbitrarias (u.a.). Histología de riñón Hematoxilina y eosina. Los tejidos del riñón fueron inmediatamente fijados en formalina al 10% durante tres días. Las muestras fueron deshidratadas a través de una serie de alcoholes 70% - 96%. Posteriormente fueron incluidas en parafinas y posteriormente se colocaron en un criostato para la obtención de secciones delgadas (5 micras) y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & E). Por último, las secciones se montaron en resina. Análisis estadístico Todos los datos se presentan como la media ± error estándar de la media (EEM). Un total de 6 grupos se analizaron mediante análisis de varianza (ANOVA) de dos vías, seguido por la prueba post hoc de Tukey y la prueba se consideró significativa cuando el valor de p < 0.05 y se utilizó el programa Graph Pad Prisma versión 5 para Windows, San Diego, California, U.S.A. 37 RESULTADOS Identificación de la planta La planta fue identificada en el Herbario “IZTA” de la FES Iztacala, UNAM como Hippocratea excelsa (HBK). El ejemplar de respaldo se integró a la colección científica del herbario con elnúmero de registro 2486. Determinación de los principales grupos de metabolitos secundarios en el extracto de H. excelsa El análisis fitoquímico preliminar cualitativo mostró la presencia de saponinas, terpenos, fenoles y flavonoides (tabla 1). Tabla 1. Resultados del análisis fitoquímico preliminar. Metabolito Secundario Resultado Alcaloides - Saponinas + Terpenos + Glicósidos - Fenoles + Coumarinas - Triterpenos/Esteroides - Flavonoides + Los resultados se reportan: (+) Prueba positiva, hay presencia de este metabolito, (-) Prueba negativa, ausencia de metabolito. 38 Determinación del perfil de flavonoides El análisis fue realizado en las instalaciones del Laboratorio Nacional en Salud: Diagnóstico Molecular y Efecto Ambiental en Enfermedades Crónico- Degenerativas de la FES Iztacala. En el extracto etanólico de H. excelsa se identificaron tres compuestos principales: vainillina, ácido oleanólico y genisteína (tabla 2). Tabla 2. Determinación de Compuestos Fenólicos del extracto etanólico de H. excelsa. T.R.=Tiempo de Retención NI= No Identificado Toxicidad aguda y crónica La selección de la dosificación es de importancia excepcional para la intervención farmacológica. Dosis excesivamente altas en animales pueden resultar no benéficas. El estudio de toxicidad de 7 y 21 días en ratones a los cuales se les administraron dosis de 5, 50, 300 y 2000 mg/kg del extracto etanólico de H. excelsa presentaron los siguientes efectos: disnea, apnea, piloerección, salivación y temblores, a los siete días de tratamiento se obtuvo una supervivencia del 100%. Sin embargo, a los 21 días se obtuvo una supervivencia del 64% (tabla 3). Basándose en la información anterior, se seleccionaron las dosificaciones de 30 y 100 mg/kg de extracto etanólico de H. excelsa para el presente estudio. 39 Tabla 3. Efectos relacionados a las dosis del extracto de H. excelsa. = sin efecto, + = efecto bajo, ++ = efecto moderado, +++ = efecto alto. Parámetros relacionados con signos tóxicos y análisis de comportamiento en ratones adultos tras la administración oral del extracto etanólico de H. excelsa en dosis de 5 mg/kg, 50 mg/kg, 300 mg/kg y 2000 mg/kg. Tabla 4. Mortalidad a siete días. Grupo No. de ratones DOSIS (mg/Kg) No. de muertes No. de vivos a 7 días 1 5 5 1 4/5 2 5 50 0 5/5 3 5 300 0 5/5 4 5 2000 0 5/5 Tabla 5. Mortalidad a veintiún días. Grupo No. de ratones DOSIS (mg/Kg) No. de muertes No. de vivos % Sobrevivencia Machos 14 1000 5 9/14 64.29 Hembras 16 1000 4 12/16 68.75 Control 18 1000 0 0/18 100.00 Parámetros D O S I S 5 mg/kg 50 mg/kg 300 mg/kg 2000 mg/kg Ataxia - - - - Convulsiones - - - - Disnea +++ +++ +++ +++ Apnea +++ +++ +++ +++ Piloerección ++ ++ ++ +++ Salivación +++ ++ ++ +++ Temblores +++ ++ ++ +++ Fester - - - - Palpebral Ptosis - - - - 40 Resultados de las variables del Síndrome Metabólico Se estandarizó el modelo de SM a través de la implementación de fructosa al 20% en el agua de beber y en el alimento. En la tabla 4 se muestran las variables metabólicas determinadas a las 12 semanas del desarrollo del síndrome metabólico, en el que los animales tratados con fructosa mostraron desarrollo de los tres principales factores de riesgo del SM como son obesidad, hipertrigliceridemia e hipertensión arterial; los demás parámetros se mantuvieron estables en comparación con el grupo control. El consumo excesivo de fructosa, se relaciona con el incremento del peso corporal, obesidad y dislipidemia, al respecto encontramos un incremento significativo en los diferentes tratamientos, con respecto al peso corporal encontramos un aumento en el grupo tratado solo con fructosa (436 ± 10 Vs. 398 ± 19 g control) Como indicador de daño renal se cuantificó la presencia de proteínas urinarias, y se encontró que en los animales tratados solo con fructosa, a las 12 semanas de tratamiento mostraron un aumento en la concentración de proteínas urinarias (Control 27 ± 4 mg/24 h Vs. Fructosa 115 ± 24 mg/24 h) lo que sugiere la presencia de daño renal. 41 Tabla 6. Efecto de la fructosa sobre el peso y variables metabólicas en ratas alimentadas con fructosa por 12 semanas. Media ± EEM de 5 ratas por grupo. Estadisticamente significativo con el grupo normal *P < 0.05 control Vs. fructosa. Efecto del extracto etanólico de Hippocratea excelsa sobre las variables del SM Posterior al establecimiento del síndrome metabólico se administraron durante 6 semanas los siguientes tratamientos: Losartán (Los), Vitamina E (Vit E), Extracto etanólico de H. excelsa en dosis de 30 y 100 mg/kg. La tabla 5 muestra los resultados con los tratamientos establecidos en cada grupo de ratas. Es visible un incremento en el peso corporal, triglicéridos, índice de Lee, proteínuria y presión arterial en animales con dieta rica en fructosa, en comparación con los animales de dieta normal. Los grupos tratados con Losartán y Vitamina E mostraron diferencias en cuanto a la presión arterial en comparación Variables Control Fructosa Peso inicial (g) 231 ± 4.37 225 ± 2.99 Peso corporal 12 semanas (g) 398 ± 19 436 ± 10 * Ganancia de peso corporal (1-12 semanas) (%) 7.2 ± 1.74 9.4 ± 1.2 Índice de masa corporal (g/cm2) 0.89 ± 0.04 0.88 ± 0.05 Circunferencia abdominal (cm) 17 ± 0.58 22 ± 0.085 * Índice de Lee 0.28 ± 0.01 0.34 ± 0.01* Glucosa plasma (mmoI/L) 4.64 ± 0.48 4.89 ± 0.24 Trigliceridos plasma (mmoI/L) 1.044 ± 0.25 2.72 ± 0.46 * Colesterol plasma (mmoI/L) 39 ± 9 35 ± 9 Volumen Urinario (ml) 7 ± 2 27 ± 6 * Ingesta de alimento (g/día) 20 ± 2 48 ± 3 * Ingesta de agua (mL/día) 35 ± 9 79 ± 13 * Proteínas en orina (mg/24h) 27 ± 4 115 ± 24 * 42 con el grupo control. El extracto etanólico de H. excelsa en dosis de 30 y 100 mg/kg mostraron diferencias en peso corporal, índice de masa corporal Y proteínuria en relación a animales tratados con fructosa. Tabla 7. Variables del síndrome metabólico a las 18 semanas de su inducción y con tratamiento. Efecto del extracto etanólico de Hipocratea excelsa sobre el síndrome metabólico tras 6 semanas de administración posterior al establecimiento del SM: Cada barra representa el promedio ± EEM de 5 ratas por grupo. *P < 0.05 control vs tratamientos; & P < 0.05 fructosa vs tratamientos; # P < 0.05 losartán (Los) Vs. fructosa + Vitamina E (VIT E). El extracto etanólico de H. excelsa en dosis de 30 y 100 mg/kg mostró un efecto antiobesidad debido a que el índice de LEE se redujo en presencia de estás dosis de extracto y en cuanto a la ganancia de peso corporal se redujo con los extractos 30 y 100. 43 Concentración plasmática de lipoproteínas de alta (HDL) y baja densidad (LDL) en presencia de los diferentes tratamientos Como marcador cardiometabólico se detectó la presencia de lipoproteinas de alta (HDL) y baja densidad (LDL), en presencia de los diferentes tratamientos, en los animales solo tratados con fructosa se observó un incremento de las LDL y disminución de las HDL, de manera interesante el tratamiento con el extracto etanólico de H. excelsa en dosis de 30 y 100 mg/kg mostró un efecto antihiperlipemiante ya que redujo la concentración plasmática de las LDL, e incrementó las HDL (Fig.4). Figura 4. Efecto del extracto etanólico de H. excelsa sobre la concentración plasmática de lipoproteinas de baja (LDL) y alta densidad (HDL) a las 18 semanas de inducción del síndrome metabólico. Cada barra representa el promedio ± EEM de 5 ratas por grupo. *P < 0.05 control vs tratamientos; & P < 0.05 fructosa Vs. tratamientos; # P < 0.05 Losartán (Los) Vs. fructosa + Vitamina E (VIT E). Efecto del extracto etanolico de H. excelsa sobre la relación peso riñón– peso corporal. Tras 18 semanas de tratamiento con fructosa, el riñón presentó una atrofia y este efecto se observó mejor cuando se realizó la relación del peso del riñón con respecto al peso corporal. Sin embargo, se muestra un efecto renoprotector con 44 los tratamientos, siendo los grupos de Losartán, Vitamina E y el Extracto de H. excelsa en dosis de 30 y 100 mg/kg los que más se acercaron a los resultados del grupo control (Fig.5). Figura 5. Efecto del extracto estanólico de H. excelsa sobre el peso renal y la relación peso renal/peso corporal total en ratas Wistar macho a las 18 semanas de inducción del síndrome metabólico. Cada barra representa el promedio ± EEM de 5 ratas por grupo. *P < 0.05 control vs tratamientos; & P < 0.05 fructosa Vs. tratamientos; # P < 0.05 Losartan (Los) Vs. fructosa + Vitamina E (Vit E). Efecto del extracto etanólico de H. excelsa sobre proteínas urinarias. El grupo control mostró una concentración de proteínas urinarias de 25 µg/mL, mientras que los grupos tratados con Losartán (25.5 µg/mL) y Vitamina E (40.2 µg/mL) disminuyeron la concentración de proteínas urinarias en comparación al grupo Fructosa (102 µg/mL) El extracto 30 mg/kg mostró una concentración de 68.4 µg/mL y el extracto de 100 mg/kg una concentración de 67.4 µg/mL. 45 Expresión del receptor AT1 y TGFβ𝟏 en la corteza renal en presencia de los diferentes tratamientos Para saber si el sistema renina angiotensina participa en el daño renal, una opción es medir la expresión de cada uno de sus componentes en el riñón o a nivel plasmático, se decidió cuantificar la expresión de este receptor en la corteza renal en presencia de los diferentes tratamientos. La expresión del receptor AT1 en la corteza renal, en los animales tratados solo con fructosa aumentó en comparación al grupo control. Con respecto a los tratamientos losartán o vitamina E no modificaron la expresión de este receptor, sin embargo la expresión del TGFβ 1 ambos tratamientos disminuyeron su expresión. En cuanto al extracto etanólico de H. excelsa, la expresión del receptor AT1 no se modificó (Fig.6). Figura 6. Efecto del extracto etanólico de H. excelsa sobre la expresión del receptor AT1R y TGFβ1 en la corteza renal a las 18 semanas de inducción del síndrome metabólico. Cada barra representa el promedio ± EEM de 5 ratas por grupo. *P < 0.05 control Vs. Tratamientos; & P < 0.05 fructosa Vs. tratamientos. 46 Cuantificación de la actividad de enzimas antioxidantes en la corteza renal en presencia de los diferentes tratamientos La actividad antioxidante de la enzima catalasa disminuyó en los animales tratados con fructosa con respecto al control (30 Ul/mg proteína vs 10 Ul/mg proteína). La actividad de las enzimas antioxidantes catalasa y superóxido dismutasa mostró buenos resultados, ya que aquellos grupos a los que les fue administrado el extracto etanólico de H. excelsa en dosis de 30 y 100 mg/kg mostraron un restablecimiento en su actividad antioxidante en comparación con el grupo tratado solo con fructosa (Fig. 7). Figura 7. Efecto del extracto etanólico de H. excelsa sobre la actividad antioxidante de las enzimas catalasa, superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa en la corteza renal a las 18 semanas de inducción del síndrome metabólico. Cada barra representa el promedio ± EEM de 5 ratas por grupo. *P < 0.05 control Vs. tratamientos; & P < 0.05 fructosa Vs. tratamientos. Histología. En la Fig. 8a se observa la imagen representativa de un grupo control en el que la estructura del glomérulo se encuentra conservada, en la Fig. 8b en el grupo tratado solo con fructosa se observa que la cápsula de Bowman pierde su contorno, hay una hipercelularidad (Gh), presencia de proteínas conocidos como depósitos proteícos (Dp), y se muestra un proceso llamado tiroidización (T) (Fig. 8c). El grupo tratado con losartán muestra una delimitación de la cápsula de Bowman, hay poca hipercelularidad (Gh), lo que muestra que es un tratamiento nefroprotector, con respecto al tratamiento de vitamina E: se observa que hay 47 hipercelularidad leve (Gh), se presenta necrosis en los túbulos contorneados próximales (Nx) (Fig. 8d) y en los grupos tratados con extracto etanólico de H. excelsa 30 y 100 mg/kg, se observó una preservación del glomérulo, existe poca hipercelularidad (Gh) y es muy parecido al grupo control, por lo que se demuestra que el extracto etanólico de H. excelsa muestra efecto nefroprotector (Fig. 8 e y f). Figura 8. Efecto del extracto etanólico de H. excelsa sobre las estructuras renales de ratas con síndrome metabólico. A) Grupo Control. B) Grupo tratado solo con fructosa. C) Grupo tratado con Losartán. D) Grupo tratado con Vitamina E. E) Grupo tratado con Extracto etanólico de H. excelsa 30 mg/kg. F) Grupo tratado con Extracto etanólico de H. excelsa 100 mg/kg. Gh= hipercelularidad., Dp=dépositos proteícos., T=tiroidización., Nx=necrosis en los túbulos contorneados próximales. 48 DISCUSIÓN En este estudio se determinó que durante el establecimiento del síndrome metabólico tras la ingesta de fructosa de manera crónica, el extracto etanólico de la corteza H. excelsa mostró un efecto antihipertensor, antiobesidad, hipolipemiante y nefroprotector. El síndrome metabólico (SM) puede ser causado por la modificación de la dieta mediante el consumo excesivo de carbohidratos (fructosa) y grasas. Durante el establecimiento del síndrome metabólico, por 12 semanas de ingesta de fructosa en agua y alimento, los animales desarrollaron tres de los 5 factores de riesgo del SM como son la obesidad, la hiperlipidemia e hipertensión arterial, de manera similar a lo reportado por Merino y col. (2015). Los resultados del aumento de peso corporal se vio reflejado en el grupo tratado solo con fructosa (436 ± 10 Vs. 398 ± 19 g control), comparado con el estudio de Merino y col. en el 2015, donde sus animales tratados con fructosa a las 12 semanas mostraron un peso de 378.5 ± 10.2 vs. 307.8 ± 5.6 g control. Otra comparación respecto a la ganancia de peso corporal es con el trabajo de Mamikutty y col. en el 2014, en el cual durante ocho semanas administraron fructosa en agua al 20 % y al 25%, mostraron que el grupo tratado con fructosa al 20 % tuvo una mayor ganancia de peso corporal (0.91 ± 0.02 Vs. 0.66 ± 0.02 g control) en comparación con el tratado con 25 % de fructosa (0.77 ± 0.01 Vs. 0.66 ± 0.02 g control). En los datos de glucosa y colesterol en plasma, no se identifica un aumento elevado, esto lo podemos relacionar con el trabajo de Merino y col. (2014) y Prakash y col. (2014). Ambos reportan que la concentración de fructosa utilizada en un modelo animal con ratas Wistar es de un rango entre 20-60%, por lo que al utilizar una dosis baja de fructosa al 20%, la concentración de glucosa y colesterol plasmático no se modifican, sin embargo solo se genera un estado de insulino- resistencia. La hiperlipidemia observada en el presente estudio, se encuentra acorde a resultados de otros trabajos, donde investigadores alimentaron con dietas ricas en fructosa a diferentes grupos de roedores (Merino et al., 2015). Tal como es el caso 49 de Lozano y col. (2016) que durante ocho meses administraron diferentes dietas a grupos de roedores, un grupo fue de una dieta alta en grasas (HFD), otro grupo con bebidas con alto contenido de fructosa (HF) y otro grupo con ambas (dieta alta en calorías y fructosa) (HFHF), ellos encontraron que solo el grupo HFHF presentó hipertrigliceridemia e hiperinsulinemia después de 6 meses de seguir con la dieta. Aunque no se observó una disminución en la concentración plasmática de triglicéridos totales en presencia de los diferentes tratamientos, datos en la literatura como el trabajo realizados por Delzeene y col. en 2002, sugieren que la
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