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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas Efectos del pH de cultivo sobre la producción y agregación de una fosfolipasa A2 recombinante en Escherichia coli TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: Maestro en Ciencias PRESENTA: Carlos Calcines Cruz TUTOR PRINCIPAL Dra. Norma Adriana Valdez Cruz Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR Dra. Liliana Pardo López Instituto de Biotecnología, UNAM Dr. Julio César Carrero Sánchez Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM Ciudad Universitaria, CD. MX. Enero, 2018 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Jurado revisor Presidente: Dr. Alejandro Alagón Cano (Instituto de Biotecnología, UNAM) Vocales: Dr. José Federico del Río Portilla (Instituto de Química, UNAM) Dr. José Adelfo Escalante Lozada (Instituto de Biotecnología, UNAM) Dr. Miguel Gimeno Seco (Facultad de Química, UNAM) Secretario: Dra. Bertha Josefina Espinoza Gutiérrez (Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM) Agradecimientos Al Dr. Alejandro Alagón, del Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos del IBt, por habernos cedido amablemente la cepa recombinante modelo. Al Dr. Ricardo Castro y a la M. en C. Vanessa Hernández, del Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos del IBt, por su apoyo durante los ensayos de fluorimetría y osmolalidad. A los Dres. Laura Palomares y Octavio Tonatiuh, del Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos del IBt, por facilitar el acceso a sus laboratorios y equipos. A la Dra. Guadalupe Zavala, de la Unidad de Microscopía del IBt, por su colaboración con el proyecto y sus muchas enseñanzas sobre microscopía electrónica. A los co-autores del artículo resultante de este trabajo de Maestría: Alejandro Olvera, Ricardo Castro, Guadalupe Zavala, Alejandro Alagón, Mauricio A. Trujillo-Roldán, Norma A. Valdez-Cruz. Muchas gracias por su colaboración. Agradecimientos personales A mi tutora, la Dra. Adriana Valdez, y a mi “co-tutor”, el Dr. Mauricio Roldán, de la Unidad de Bioprocesos, Departamento de Biología Molecular y Biotecnología del IIB. Les agradezco haberme aceptado como su estudiante y haber iniciado mi formación a nivel de posgrado, y sobre todo por la magnífica preparación que adquirí en su laboratorio. A los miembros del comité tutoral, Dra. Liliana Pardo y el Dr. Julio César Carrero, por sus invaluables recomendaciones a lo largo de dos años de tutorales. Agradezco los apoyos económicos otorgados que permitieron la realización de este trabajo: Beca de Maestría CONACYT 584019 Proyectos CONACYT 178528, 247473, 230042 y 220795 PAPIIT-UNAM IN-208415 y IN-209113 Apoyos del PAEP Al excelente grupo de laboratorio, este es un trabajo del lab. A mi mamá y a quienes han sido mis amigos y familia en tierras extrañas. Índice Abreviaturas ....................................................................................................................................1 Lista de figuras ...............................................................................................................................1 Lista de tablas .................................................................................................................................4 Resumen...........................................................................................................................................5 Abstract ............................................................................................................................................8 Introducción ..................................................................................................................................10 Producción de proteínas recombinantes en Escherichia coli......................................10 Cuerpos de inclusión, aplicaciones biomédicas e importancia del sistema de chaperonas ................................................................................................................................11 Antecedentes ................................................................................................................................16 Influencia del pH extracelular en la distribución de ácidos orgánicos a través de la membrana celular. Efectos sobre el metabolismo y la producción de proteínas recombinantes en Escherichia coli .....................................................................................16 Parámetros de cultivo que afectan la formación de cuerpos de inclusión. Importancia del pH extracelular ...........................................................................................20 Escherichia coli cepa Origami ..............................................................................................24 Fosfolipasa A2 ..........................................................................................................................26 Justificación y planteamiento del problema .........................................................................28 Hipótesis.........................................................................................................................................29 Objetivos ........................................................................................................................................29 Materiales y métodos ..................................................................................................................30 Cepa bacteriana y elaboración del banco de trabajo......................................................30 Cultivos en matraces...............................................................................................................30 Cultivos en biorreactores.......................................................................................................31 Cuantificación de glucosa, ácidos orgánicos y osmolalidad .......................................32 Cuantificación de proteínas por ensayo de Bradford.....................................................32 SDS-PAGE y Western-Blot.....................................................................................................32 Concentración y rendimiento de proteínas totales y rPLA2 .........................................33 Purificación de cuerpos de inclusión .................................................................................33 Rendimiento de agregación...................................................................................................33 Análisis de la agregación por microscopía de transmisión electrónica....................34 Análisis de la estructura secundaria de cuerpos de inclusión con espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) ..................................................................34 2 Digestión de los cuerpos de inclusión con proteinasa K ..............................................34 Ensayo de unión a tioflavina T .............................................................................................35 Solubilización de los cuerpos de inclusión con cloruro de guanidinio .....................35 Análisis estadístico .................................................................................................................35 Resultados y Discusión..............................................................................................................37Descripción de la proteína modelo y análisis de su potencial de agregación .........37 Caracterización del crecimiento y la producción de rPLA2 en biorreactores bajo diferentes estrategias de pH .................................................................................................41 Caracterización de la agregación de la rPLA2..................................................................50 Caracterización estructural de los cuerpos de inclusión ..............................................57 Conclusiones ................................................................................................................................66 Perspectivas ..................................................................................................................................67 Bibliografía.....................................................................................................................................68 Anexo I. Caracterización de los cultivos en matraces........................................................84 Anexo II. Cuantificación de ácidos orgánicos en sobrenadante de cultivo en biorreactores .................................................................................................................................87 Anexo III. Cuantificación de osmolalidad de los cultivos en biorreactores..................88 Anexo IV. Solubilización de los cuerpos de inclusión con cloruro de guanidinio con y sin DTT.........................................................................................................................................89 1 Abreviaturas CI: cuerpos de inclusión DO600nm: densidad óptica a 600 nm FTIR: Espectrometría infrarroja por transformada de Fourier GFP: proteína verde fluorescente GnCl: cloruro de guanidinio Gor: glutatión óxido reductasa HPLC-RP: cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa IPTG: isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido µ: velocidad específica de crecimiento Medio LB: medio de cultivo Luria Bertani PBS: amortiguador de fosfato salino PMSF: fluoruro de fenilmetilsulfonilo rPLA2: fosfolipasa A2 recombinante de Micrurus laticollaris PR: proteína recombinante qS: consumo específico de glucosa SDS: dodecil sulfato de sodio SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio t1/2: tiempo de vida media Th-T: tioflavina T TOD: tensión de oxígeno disuelto TrxB: tiorredoxina reductasa UA: unidades arbitrarias VP1LAC: fusión de la proteína de la cápsida del virus de la enfermedad de pata-y-boca y la β-galactosidasa YX/S: rendimiento de biomasa a partir de glucosa 2 Lista de figuras Figura 1: Micrografías electrónicas de barrido y transmisión de E. coli expresando proinsulina. ………..........11 Figura 2: Principales chaperonas citosólicas de E. coli que participan en el plegamiento de proteínas recién sintetizadas y las agregadas. ……………...………………………………………………………………...……….…14 Figura 3: Células de E. coli mutantes en las chaperonas DnaK (dnaK-) y GroEL (groEL-) produciendo la proteína VP1LAC en cuerpos de inclusión 3 h después de la inducción. …………………………………………………....15 Figura 4: Inmunodetección in situ de las chaperonas DnaK, GroEL y la proteína recombinante VP1LAC formando cuerpos de inclusión en E. coli. …….…….……..…………………………….……………………………15 Figura 5: Equilibrio de disociación del ácido acético en un ambiente extracelular ácido y básico con respecto al citosol. ……..………..………………………………………….………………………………………………………….19 Figura 6: Células de ovario de hámster chino produciendo IgG en forma de cristales intracelulares. ...………23 Figura 7: Cinéticas de crecimiento de E. coli BL21 produciendo una esfingomielinasa-D recombinante de garrapata en cultivos sin control de pH y cultivos a pH 7.5. …….……………..……………………………..……..24 Figura 8: Sistema de la tiorredoxina reductasa/glutatión óxido reductasa en el citoplasma de E. coli para la trasferencia de electrones desde NADPH hasta las proteínas. …….……………………………………....………25 Figura 9: Reacción catalizada por la fosfolipasa A2. ………………………………………………………………...26 Figura 10: Mapa del plásmido pQE30. ……………………………………………………...………………………...30 Figura 11: Secuencia aminoacídica de la fosfolipasa A2 recombinante de M. laticollaris. …………….…..……37 Figura 12: Área normalizada de los hot spots de agregación según el servidor AGGRESCAN para la fosfolipasa A2 recombinante de M. laticollaris. .……………………………………………………………..…………….…..……39 Figura 13: Análisis por AGGRESCAN3D de la estructura tridimensional de la fosfolipasa A2 recombinante de M. laticollaris. ……...…………………………………………………………………...……………………….…..…….40 Figura 14: Perfiles de pH durante 15 h de crecimiento en biorreactores con medio mínimo en las cuatro estrategias de cultivo. ….…………………………………………………………………………………………..…….41 Figura 15: Cinéticas de crecimiento en escala lineal y logarítmica para las diferentes estrategias de cultivo en medio mínimo. ….…………………………………………………………………………………………………..…….43 Figura 16: Perfil representativo de tensión de oxígeno disuelto en los cultivos realizados en biorreactores durante 15 h, con medio mínimo e inyección de aire 1 vvm. …………………………..……………………………43 Figura 17: Perfiles de consumo de glucosa en las cuatro estrategias de cultivo en medio mínimo. ……………44 Figura 18: Acumulación de acetato extracelular para las cuatro condiciones de pH en los tiempos 0, 6, 10 y 15 h de cultivo. ……………………………...…….………………………………………………………………………45 Figura 19: Relación acetato-biomasa a 15 h de cultivo en las diferentes condiciones de pH. ………………..…46 Figura 20: Concentración y rendimiento de proteínas totales en las cuatro condiciones de pH a diferentes tiempos después de la inducción. …..……………………………………………………………………………….….47 Figura 21: SDS-PAGE del contenido de proteína total solubilizada obtenido en condiciones de pH no controlado, pH 6.5, 7.5 y 8.5. ………………………………………………………………………………………...………………..48 Figura 22: Producciones volumétrica y específica de rPLA2 en las condiciones de pH no controlado y controlado a pH 6.5, 7.5 y 8.5 a las 15 h de cultivo. ..…………………………………………………………………...…………49 3 Figura 23: SDS-PAGE de las fracciones insoluble y soluble de un cultivo sin control de pH a las 0, 1, 5 y 19 h después de inducir. …………………………………………………….………………………………………..……….50 Figura 24: SDS-PAGE y Western-Blot de los cuerpos de inclusión purificados a las 10 h después de inducir. …………………………...…………………………………………………………………………………………..……..51 Figura 25: Rendimiento de agregación calculado como masa de cuerpo de inclusión por unidad de biomasa seca. …………………………..…….…………………………..………………………………………………..……….51 Figura 26: SDS-PAGE y Western-Blot del contenido de proteínas solubles a 15 h de cultivo. …….……………52 Figura 27: Porcentaje de las bandas correspondientes a la fosfolipasa A2 recombinante en los geles de proteína total solubilizada y cuerpos de inclusión en las cuatro condiciones de pH. …………………..…………..……….52 Figura 28: Micrografías de células con cuerpos de inclusión colectadas a 1, 5 y 10 h después de la inducción en cultivos sin control de pH, pH 6.5, 7.5 y 8.5. …..……………………………………………………………………53 Figura 29: Porcentaje de células con 1, 2 o más de 2 cuerpos de inclusión en cultivos sin control de pH y con control a pH 6.5, 7.5 y 8.5 a diferentes tiempos después de inducir. ………………..……………..…………...…54 Figura 30: Micrografías de cuerpos de inclusión purificados de 10 h después de inducción en cultivos sin control de pH y controlados a pH 6.5, 7.5 y 8.5. .…………………………………..…………………………..………………54 Figura 31: Histogramas con los diámetros máximos de cuerpos de inclusión visualizados por micrografías de transmisión y purificados al final del cultivo a las 10 h después de la inducción. ……………………..…….……55 Figura 32: Frecuencia acumulada de los diámetros de cuerpos de inclusión de cada condición de pH visualizados en micrografías electrónicas de transmisión. ..…………………….……………………………..……56 Figura 33: Segundas derivadas de los espectros de absorbancia para cuerpos de inclusión de cultivos a pH nocontrolado y controlados a pH 6.5, 7.5 y 8.5, normalizados respecto al pico de tirosina (~1515 cm-1). .……58 Figura 34: Mínimos de la segunda derivada de los espectros de absorbancia correspondientes a las estructuras hélice α/random coil y hojas β para cuerpos de inclusión de 1h y 10 h después de inducir. …….………………58 Figura 35: Perfiles de degradación con proteinasa K de los cuerpos de inclusión obtenidos en las diferentes estrategias de pH a 1 h y 10 h después de la inducción. ……………………………………………………………...60 Figura 36: Primera derivada de los perfiles de degradación con proteinasa K de los cuerpos de inclusión obtenidos en las diferentes estrategias de pH. …………………………………………………………………….….61 Figura 37: Espectros de fluorescencia de tioflavina T incubada con los cuerpos de inclusión obtenidos en las cuatro condiciones de pH empleadas a 1 h y 10 h después de la inducción. .…………………………………….64 Figura 38: Intensidad de fluorescencia a 470 nm de tioflavina T incubada con los cuerpos de inclusión obtenidos en las cuatro condiciones de pH empleadas a 1 h y 10 h después de la inducción. ……...…………………..…64 Figura A1 Cinética de crecimiento de E. coli (Origami) productora de rPLA2 en escala lineal y logarítmica en medio mínimo y LB inducidos a las 5 h y 4 h, respectivamente, y en medio LB sin inducción. …………………………….………………………………………………………………………………………………..84 Figura A2: Perfiles de pH durante el crecimiento de E. coli (Origami) produciendo fosfolipasa A2 recombinante en medio mínimo y LB inducidos a las 5 y 4 h, respectivamente. …………………………………………….……85 Figura A3. Acumulación extracelular de citrato, formato y succinato para las cuatro condiciones de pH en los tiempos 0, 6, 10 y 15 h de cultivo. ………………………………………………………………………………………87 Figura A4. Osmolalidad de los cultivos en biorreactores en cada condición de pH. ………………………….…88 Figura A5: Solubilización por cloruro de guanidinio de los cuerpos de inclusión colectados a 1 h y 10 h después de la inducción. …………….…………………………………………………………………………………………..…89 4 Figura A6. Solubilización de los cuerpos de inclusión con cloruro de guanidinio en presencia de ditiotritol 1mM por 1 y 12 h de incubación. ………………………………………………………………………………………………91 Lista de tablas Tabla I: Estructura secundaria de la fosfolipasa A2 de N. naja y la predicha para la fosfolipasa A2 de M. laticollaris según el programa SOPMA. ……...………………………….………………………......…………………37 Tabla II: Parámetros cinéticos y estequiométricos de los cultivos en biorreactores bajo diferentes estrategias de pH. …..…………………………..…………………………………………………………………………………………44 Tabla III: Composición estructural de los cuerpos de inclusión aislados de cultivos a pH no controlado y controlados a pH 6.5, 7.5 y 8.5 en 1 h y 10 h después de inducir. ………….……...………………………………63 Tabla AI: Valores de velocidad específica de crecimiento y densidad óptica máxima de los cultivos de E. coli Origami en medio mínimo con inducción y en medio LB con y sin inducción. ……………………………….……85 5 Resumen El interés biotecnológico en los cuerpos de inclusión (CI) formados durante la sobrexpresión de proteínas recombinantes (PR) en Escherichia coli ha aumentado en los últimos años. La facilidad de aislamiento de dichas partículas, su alto contenido en PR y su estabilidad las han convertido en materia prima de preferencia para la purificación de bioterapéuticos. A nivel de laboratorio, en cambio, la producción de PR soluble, monomérica y funcional constituye el esquema ideal de expresión heteróloga. No obstante, las PR comúnmente se agregan en CI y algunos pasos posteriores de desnaturalización y replegamiento son necesarios para obtener las proteínas con conformación nativa. Estas razones explican el aumento en el número de estudios sobre los factores que influyen en la agregación de las PR y que han demostrado que el plegamiento proteico se puede favorecer de diferentes formas: disminución de la tasa metabólica por una alimentación limitada, inducción débil, baja temperatura y co-expresión de chaperonas. Adicionalmente, se ha encontrado que la disminución de la temperatura de cultivo genera CI con estructura tipo-nativa o nativa que pueden ser solubilizados en condiciones suaves de desnaturalización. Estas características permiten disminuir el costo y el esfuerzo invertidos en los procesos de replegamiento. Por su parte, la influencia del pH de cultivo sobre la agregación ha permanecido pobremente estudiada; los trabajos al respecto son escasos y usan estrategias de pH no controladas. Particularmente, nuestro grupo de investigación ha demostrado que la estructuración de los CI formados en la cepa E. coli BL21 es sensible al pH del medio extracelular. En cultivos sin control de pH en los que el medio se basificó hasta pH 8.5 se produjeron CI más relajados y menos amiloides que en cultivos controlados a pH 7.5. Sin embargo, estudios sobre la agregación y la calidad conformacional de los CI usando condiciones controladas siguen siendo necesarios para investigar con profundidad el papel del pH extracelular. En segundo lugar, se ha demostrado que el pH del medio determina el grado de afectación que tienen los ácidos orgánicos, particularmente el acetato, sobre el rendimiento de los bioprocesos con E. coli. Por ejemplo, se ha encontrado que un pH de cultivo alcalino (≥7.5) disminuye la concentración de acetato intracelular y en consecuencia aumenta el crecimiento y la síntesis de PR. Estos resultados se obtuvieron en cultivos de E. coli BL21 con medio complejo y añadiendo 300 mM de acetato. Por lo tanto, el uso de cepas de E. coli más sensibles a este ácido orgánico, como las de linaje K12, y de medios 6 suplementados con glucosa puede añadir evidencias relevantes sobre el efecto protector del pH alcalino contra la inhibición por el acetato endógeno. En este trabajo se evaluó el efecto del pH extracelular en el rendimiento de cultivos de E. coli Origami (K12) en cuanto a crecimiento, producción y agregación de una fosfolipasa A2 recombinante (rPLA2), y en la estructuración de los CI. Se realizaron cultivos en biorreactores en medio mínimo suplementado con glucosa y con control de pH, temperatura y tensión de oxígeno disuelto. Se realizaron estrategias de pH controlado a 6.5, 7.5 y 8.5 durante la producción de rPLA2 y se compararon con cultivos sin control de pH en los que ocurrió una acidificación gradual del medio desde pH 7.5 hasta 6.5. Los cultivos controlados a pH 8.5 y sobre todo a 6.5 tuvieron menor acumulación de biomasa con respecto a los cultivos controlados a pH 7.5 y sin control de pH. En todas las condiciones el acetato derivado del sobreflujo metabólico se acumuló continuamente durante el cultivo, desde 37-45 mM en biorreactores a pH 6.5 y 7.5 y hasta a 60 mM en biorreactores a pH 8.5 y sin control de pH. No obstante, los cultivos a pH 8.5 tuvieron mayor rendimiento de formación de biomasa a partir de la fuente de carbono, mayor consumo específico de glucosa y mayor producción de proteínas totales que resultó en una mayor producción de rPLA2. Lo anterior pudo deberse a que el pH extracelular alcalino minimiza la difusión del acetato al interior celular. La formación de CI se inspeccionó mediante microscopía electrónica y se observaron diferencias entre las distintas condiciones. Las células a pH 8.5 tuvieron principalmente un CI mientras que en las demás condiciones tuvieron desde uno hasta tres o más agregados. Además, los CI obtenidos en la condición no controlada tuvieron mayor tamaño comparados con los de las condiciones controladas. Finalmente, los CI producidos a pH 8.5 fueron más susceptibles a degradación por proteinasa K, unieron menos tioflavina-T que es afín por estructuras amiloides, y mostraron mayor contenido de hélices α y random coils por espectroscopía en el infrarrojo. El menor contenido amiloide de los CI generados a pH 8.5 coincide con lo reportado por nuestro grupo de investigación para una esfingomielinasa-D recombinanteexpresada en una cepa BL21. Por lo tanto, estos efectos deben ser independientes de la PR estudiada y del fondo genético de la cepa de E. coli. Los resultados aquí presentados indican la conveniencia de usar condiciones de pH alcalino para la expresión de PR en E. coli. Este tipo de estrategias serviría para elevar los rendimientos de producción de PR en medios suplementados con glucosa que favorecen 7 la formación de ácido acético y, para obtener CI menos amiloides con mayor interés biotecnológico y biomédico. 8 Abstract The biotechnological interest on inclusion bodies (IBs) formed upon recombinant protein (RP) expression in E. coli has been constantly increasing in the last few decades. The easy isolation of these particles, altogether with their high RP content and stability have made them the preferred raw material to start the purification of biotherapeutics. At laboratory scale, however, obtaining soluble, monomeric and functional RPs is instead the ideal scenario for heterologous expression. Nonetheless, RPs are commonly sequestered into IBs and then denaturing and refolding steps are necessary to attain the functionality of the polypeptides. In that matter, a literature body about the factors influencing RP aggregation has built up. It has been described in several papers that protein folding can be favored by a lowered metabolic rate at conditions of limited nutrient supply, by a weak induction or decreased cultivation temperature and alternatively, by chaperone co-expression. Moreover, it has been found that lower cultivation temperatures render IBs with native or native-like conformation which can be solubilized at mild denaturing conditions. Those features allow for less investment of effort and costs in refolding steps. The importance of cultivation pH on RP aggregation has remained poorly studied; the research on this subject is scarce and uncontrolled pH conditions are mostly employed in the papers. In particular, a contribution from our research group has demonstrated that IB structure is sensitive to extracellular pH. In cultures without pH control, where the growth medium alkalized to pH 8.5, generated more relaxed and less amyloid IBs, when compared to IBs obtained in cultures maintained at pH 7.5. Therefore, the study of aggregation and the conformational quality of IBs under controlled conditions is still needed to profoundly evaluate the role of extracellular pH. At the same time, it has been reported that medium pH influences the degree of inhibition that small organic acids, like acetic acid, have on the yield of E. coli bioprocesses. For instance, an alkaline medium (pH≥7.5) decreases the concentration of intracellular acetate and consequently improves both growth and RP synthesis. Those results were obtained by growing E. coli BL21 in a complex medium and with addition of acetate up to 300 mM. Hence, the utilization of strains more sensitive to organic acids, as those from the K12 lineage, and of media supplemented with glucose may add further evidence about the protection of alkalinity against the inhibition caused by endogenous acetate. 9 The effects of extracellular pH on the growth of E. coli Origami (K12), on the production and aggregation of a recombinant phospholipase A2 (rPLA2), as well as on the architecture of IBs have been evaluated herein. Cultures were performed in a defined medium supplemented with glucose, using bioreactors to control pH, temperature and dissolved oxygen tension. Three strategies of controlled pH were implemented: pH 6.5, 7.5 and 8.5, and compared to a strategy without pH control where the medium acidified gradually from 7.5 to 6.5. Cultures at pH 8.5 and mostly at pH 6.5 showed lower biomass accumulation with respect to cultures maintained at pH 7.5 and without pH control. In all cultivation strategies the endogenous acetate derived from metabolic overflow accumulated throughout cultivation from 37-45 mM at pH 6.5 and 7.5 and up to 60 mM at pH 8.5 and at uncontrolled cultures. Nevertheless, cultures at pH 8.5 had an improved glucose-to-biomass conversion yield, higher glucose specific consumption and an increased production of total proteins, which lead to improved rPLA2 production levels. These findings could be due to a lowered inhibition of metabolism by acetate in an alkaline environment, where the diffusion of the acetic acid into the cells is minimized. IB formation was inspected by electron microscopy and differences among pH strategies were observed. Cells at pH 8.5 bore mostly one IB while cells under the other conditions bore from one to three or more IBs. Besides, IBs collected at the uncontrolled condition had a larger diameter than those from the controlled strategies. Finally, IBs collected at pH 8.5 were more susceptible to digestion by proteinase K, bound less thioflavin-T (amyloidophilic dye), and showed a greater content of α helix and random coil structures by FTIR spectroscopy. The diminished amyloid content of IBs from cultures at pH 8.5 resembles the findings from our research group for a recombinant sphingomyelinase-D expressed in E. coli BL21. Therefore, the effects of pH on the architecture of IBs must be independent of the model RP and the genetic background of E. coli. The results here obtained add further evidence on the suitability of using alkaline pH conditions during RP expression in E. coli. This strategy could prove advantageous to increase the yields of RP production in media supplemented with glucose and to generate less amyloid IBs with increased biotechnological and biomedical significance. 10 Introducción Producción de proteínas recombinantes en Escherichia coli Escherichia coli es el hospedero más usado para la expresión de genes heterólogos en las escalas de laboratorio e industrial. Comparados con otros sistemas como levaduras y células de mamíferos, el bajo costo de los medios de cultivo de E. coli, la disponibilidad de conocimiento, herramientas y cepas, así como su rápido crecimiento, justifican su amplia utilización (Ferrer-Miralles et al., 2009; Chen, 2012; Huang et al., 2012; Rosano y Ceccarelli, 2014). En el 2010 el 68% (17 900 kg) del total de biofarmacéuticos se obtuvo en sistemas microbianos: levaduras y principalmente E. coli. Asimismo, en el período 2010-2014 el porcentaje de nuevos productos aprobados por la FDA y EMEA para E. coli fue similar al de las células de ovario de hámster chino (CHO), 29% y 33% respectivamente, mientras que para levaduras fue casi la mitad (16.5%) (Walsh, 2014). Sin embargo, el uso de E. coli como sistema recombinante impone dos problemas fundamentales: 1) la incapacidad de realizar modificaciones postraduccionales como la glicosilación y 2) la agregación de la proteína recombinante (PR) en forma de cuerpos de inclusión (CI) (Hoffman et al., 2004; Yin et al., 2007). Para abordar el primer problema se han transferido los genes codificantes para las glicosiltransferasas de Campylobacter jejuni y se ha logrado obtener algunas glicoproteínas (Wacker et al., 2002; Valderrama-Rincon et al., 2012). Sin embargo, el uso de E. coli normalmente se restringe a proteínas no glicosiladas o aquellas que no requieren esta modificación para su actividad, algunos ejemplos son la eritropoyetina humana (Lee-Huang, 1984; Jeong et al., 2014), el factor activador de plasminógeno tisular (Pennica et al., 1983; Long et al., 2015) y fragmentos Fab y Fv de anticuerpos (Venturi et al., 2002; Xiong et al., 2005). Por otra parte, los CI han sido considerados la principal limitante para la expresión de proteínas heterólogas en E. coli (Panda, 2003; Wang et al., 2010). Como la producción ideal de una PR es en forma soluble, las cepas que forman estos agregados son a menudo descartadas en los laboratorios de investigación. 11 Cuerpos de inclusión, aplicaciones biomédicas e importancia del sistemade chaperonas Los CI se describieron inicialmente por Williams et al. (1982) como agregados citoplasmáticos que ocupan alrededor del 20% del volumen celular (Figura 1). Según los autores, estas partículas son granulares, electrodensas y con estructura fibrilar en regiones visualizadas a >150 000 X. Este reporte se hizo en la cepa de E. coli que produjo la primera insulina humana recombinante (Goeddel et al., 1979). Figura 1: Micrografías electrónicas de barrido (A, 5300 X) y transmisión (B y C, 30 000 X) de E. coli expresando proinsulina en forma de cuerpos de inclusión (A y B). La cepa sin transformar se muestra en el inserto de A y en C. Tomado de Williams et al. (1982). Cuando una PR se encuentra en forma insoluble es necesario llevar a cabo la desnaturalización de los CI y la posterior renaturalización de la PR, siendo ambos procesos los de mayor dificultad durante la purificación de PR (Singh et al., 2015). Para el primero se emplean agentes solubilizantes como GnCl 6 M y urea 6-8 M, detergentes como SDS y Tritón X-100, pH alcalino o solventes orgánicos (Marston, 1986, revisión; Khan et al., 1998). La renaturalización consiste comúnmente en disminuir la concentración del agente desnaturalizante por diálisis, dilución, técnicas cromatográficas y presurización, entre otros (Leong y Middelberg, 2006; Chen y Leong, 2010; Malavasi et al., 2011). La eficiencia de recuperación de proteína correctamente plegada durante la renaturalización es variable, con ejemplos entre menos de 20 y hasta 80% de recuperación (Datar et al., 1993; Sørensen et al., 2003; Bu et al., 2013; Zaremba-Czogalla et al., 2015). Por tanto, la obtención de eficiencias rentables requiere el tamizaje de varias estrategias, lo que puede incrementar el tiempo y el costo del proceso (Middelberg, 2002). 12 No obstante, la agregación proteica en CI posee características ventajosas para la producción de biofármacos: la PR puede representar más del 95% del contenido proteico de los CI (Valax y Georgiou, 1993; Carrió et al., 1998) y la acumulación de PR agregada es comúnmente mayor que la obtenida en forma soluble (Peternel et al., 2008). Además, los agregados se pueden aislar fácilmente por centrifugación a baja velocidad (500 g), lo que permite eliminar proteínas solubles contaminantes, restos celulares y el inductor (Olsen, 1985). Particularmente, el reclutamiento de proteínas recombinantes citotóxicas a la forma inactiva dentro de los CI permite el incremento en biomasa y mejora el rendimiento de los cultivos (Soundrarajan et al., 2016). Las ventajas anteriores, junto con el desarrollo de técnicas de solubilización- renaturalización compatibles con la estructura secundaria proteica, que permiten recuperar del 50 al 70% de proteína nativa, han convertido a los CI en excelentes materiales de inicio para los procesos de purificación de biofármacos (Puri y Cardamone, 1992; Hart et al., 1994; Khan et al., 1998; Singh y Panda, 2005, Upadhyay et al., 2016). Esto se refleja en varios reportes donde PR solubles se dirigen a CI mediante etiquetas pull-down para mejorar su expresión y purificación (Wang et al., 2015; Pane et al., 2016; Zhao et al., 2016). Otras potencialidades descritas para los CI se relacionan con su uso como biomateriales. Se han empleado en la inmovilización de enzimas y de antígenos para ensayos inmunoenzimáticos (Steinman et al., 2010; Lim et al., 2015), en ingeniería tisular para construir matrices que estimulan la proliferación celular (Díez-Gil et al., 2010) o que permiten la liberación de proteínas a las células tanto in vitro como in vivo (Seras-Franzoso et al., 2014; Céspedes et al., 2016; Seras-Franzoso et al., 2016), y para inmunización de animales (Yang et al., 2011), entre otros. La concepción inicial sobre los CI como agregados desordenados y estabilizados por interacciones hidrofóbicas inespecíficas (Krueger et al., 1989) ha sido refutada por estudios que demuestran su organización de tipo amiloide. Estas evidencias resultan principalmente de difracción de rayos X (Wang et al., 2008), resonancia magnética nuclear (Wasmer et al., 2009), espectroscopía infrarroja y unión de tintes amiloidotrópicos como la tioflavina T (Th- T) y el Rojo Congo (Carrió et al., 2005; Sabaté et al., 2009). La estructura de los CI se caracteriza por la abundancia de hojas β cruzadas, como las encontradas en los agregados amiloides involucrados en el desarrollo del Alzheimer, Parkinson, enfermedad por priones, diabetes tipo II y amiloidosis sistémica (González-Montalbán et al., 2007a). Entonces, estos 13 agregados pueden servir también como modelos para el estudio de tales enfermedades (Dasari et al., 2011; Gatti-Lafranconi et al., 2011; Villar-Pique et al., 2012). La formación de CI se debe en última instancia a dos factores: 1) la tendencia intrínseca de la PR a la agregación y 2) la disponibilidad del sistema de control de calidad celular para corregir o eliminar las proteínas desplegadas. El primer factor se explica por la presencia de regiones o hot spots en la secuencia aminoacídica donde se favorece el crecimiento del agregado (Dobson, 2004; Espargaró et al., 2008a; Hamodrakas, 2011). El segundo factor se refiere a la concentración de chaperonas y proteasas citosólicas con respecto al número de copias de la PR que emergen de los ribosomas. El colapso del equilibrio entre las velocidades de plegamiento y de agregación de la PR, debido a su sobrexpresión, causa la formación de los CI (Wickner et al., 1999; Markossian y Kurganov, 2004). La importancia de las chaperonas en la agregación se ha demostrado en varios estudios la co-expresión del factor σ32, Trigger Factor, GroEL/S, DnaK/J o GrpE incrementan la solubilidad de la PR (Thomas y Baneyx, 1996; Rinas et al., 2007; Piao et al., 2016; Tong et al., 2016). Las chaperonas pertenecen al grupo de las proteínas de choque térmico (hsp) y su expresión está controlada por el factor σ32 (Grossman et al., 1984; Cowing et al., 1985). La función principal en esta red de chaperonas la realiza DnaK (hsp70), su co-chaperona DnaJ y el factor intercambiador de nucleótidos GrpE, seguidos por GroEL/S (Figura 2). Mientras que el sistema DnaK/J/GrpE ejecuta intentos locales de plegamiento en las proteínas, las chaperoninas GroEL (hsp60) y GroES forman una cámara donde encierran el sustrato y lo someten a una dilución infinita (Mayer, 2010). Además, la proteasa ClpB, de la familia AAA+, participa junto con DnaK en la remoción de polipéptidos desde los CI para su plegamiento o proteólisis (Parsell et al., 1994; Schlieker et al., 2004). Las pequeñas proteínas de choque térmico (shsp) IbpA e IbpB se han encontrado como componentes de los CI y de ahí sus nombres Inclusion body protein A y B (Allen et al., 1992). 14 Figura 2: Principales chaperonas citosólicas de E. coli que participan en el plegamiento de proteínas recién sintetizadas y las agregadas. Se indican las interacciones chaperonas/proteasas-proteína recombinante (flechas negras) y la agregación de la proteína recombinante sobrexpresada (flechas verdes). Modificado de Baneyx y Mujacic (2004). Carrió y Villaverde (2003) encontraron que la deleción de las chaperonas DnaK y GroEL tiene efectos parcialmente contrarios en la agregación. Con respecto al tamaño de los agregados, la deleción de DnaK resulta en CI de mayor volumen (0.38 µm3) y la deleción de GroEL en CI más pequeños (0.05 µm3) y numerosos que en la cepa silvestre (0.25 µm3) (Figura 3). Además, en las células dnaK- no se observó PR soluble, mientras que en las groEL- la cantidad de PR soluble y activa fue más de cinco veces mayor que en el genotipo silvestre. La deleción de DnaK generó agregados de mayor tamaño debido a una mayor agregación y/o una menor desagregación mientras que la deleción de GroEL aumentó el tamaño de los CI debido a una disminución de la desagregación (32% de desagregación contra 63% en elfenotipo silvestre). Esto último indicó que GroEL también participa en la transferencia de proteínas desde el agregado a la forma soluble (Carrió y Villaverde, 2003). 15 Figura 3: Células de E. coli mutantes en las chaperonas DnaK (dnaK-) y GroEL (groEL-) produciendo la proteína VP1LAC en cuerpos de inclusión 3 h después de la inducción. Se muestra la cepa salvaje (wt) como control. Las imágenes se obtuvieron en un microscopio óptico con un aumento de X1000 . Tomado de Carrió y Villaverde (2003). Por otra parte, la interacción de DnaK y GroEL con los CI se ha estudiado por inmunotinción usando como modelo la proteína VP1LAC (fusión entre la proteína de la cápsida del virus de la enfermedad de pata-y-boca y la β-galactosidasa). Estos experimentos revelaron que DnaK se restringe a la superficie de los CI y que GroEL se distribuye tanto dentro de los agregados como en el citosol (Figura 4) (Carrió y Villaverde, 2005). La localización de DnaK puede deberse a que esta es la primera chaperona que participa en el plegamiento de las proteínas y a su función en la desagregación, que ejecuta junto con ClpB. En cambio, la distribución homogénea de GroEL sugirió que esta no está involucrada en el intercambio soluble-insoluble. Aunque los roles de DnaK/J y GroEL/S en la formación de los CI no se han comprendido completamente las evidencias anteriores demuestran su interacción directa y compleja con los agregados. Figura 4: Inmunodetección in situ de las chaperonas DnaK (A), GroEL (B) y la proteína recombinante VP1LAC (C) formando cuerpos de inclusión en E. coli. La barra representa 200 nm. Tomado de Carrió y Villaverde (2005). 16 Antecedentes Influencia del pH extracelular en la distribución de ácidos orgánicos a través de la membrana celular. Efectos sobre el metabolismo y la producción de proteínas recombinantes en Escherichia coli E. coli es un organismo neutrófilo con pH óptimo de crecimiento alrededor de 7.2 y para colonizar el tracto digestivo necesita sobrevivir a cambios de varias unidades de pH. Se ha encontrado que el mínimo tolerable es pH ~2 (de Jonge et al., 2003) mientras que un pH mayor 8.4 disminuye la actividad respiratoria de las células en suspensión (Padan et al., 1976). El uso de técnicas radiactivas y de fluorescencia ha permitido la medición exacta del pH intracelular (pHi) de E. coli y así, describir las consecuencias de variaciones del pH extracelular (pHe) y de la presencia de metabolitos difusibles que funcionan como ionóforos. Slonczewski et al. (1981) mostraron, usando resonancia magnética nuclear con 31P, que el pHi de una cepa silvestre de E. coli (FRAG1) crecida en suspensión en un medio mínimo y en condiciones aerobias, se mantiene a 7.6 ± 0.2 en el rango de pHe de 5.5 a 9. Cuando cambia el pHe, el pHi varía en el mismo sentido y posteriormente se recupera. El cambio del pHi y el tiempo que tarda la recuperación dependen de la velocidad del cambio exterior y de sus valores inicial y final con relación a los valores fisiológicos. Con un cambio de pH de 6.8 a 5.6 en 30 s, el pHi disminuye de 7.5 a 7.1 y la recuperación ocurre en 4 min (Slonczewski et al.,1982). Zilberstein et al. (1982) obtuvieron en una cepa de linaje K12, crecida en medio mínimo en matraces, que la basificación del pHe desde 7.2 a 8.6 colapsa el gradiente entre ambos lados de la membrana y el valor inicial del pHi se alcanza hasta 20 min después. Por otro lado, un aumento secuencial, desde 7.2, a 8.3, a 8.6 y finalmente a 8.8 también anuló el gradiente y la recuperación ocurrió en 12 min, según los autores por una menor pérdida de material intracelular que facilitó la restauración de la homeostasis. La presencia de una especie difusible como un ácido orgánico afecta el perfil de variación del pHi y su recuperación. Usando la fluorescencia de GFP y YFP como sensor intracelular de pH, Wilks y Slonczewski (2007) mostraron que una acidificación en presencia de acetato o benzoato disminuye rápidamente el pHi de E. coli K12 creciendo en matraces con un medio complejo, mientras que la recuperación es solo parcial o no ocurre. Estas variables, el pHi mínimo alcanzado y el grado de recuperación, estuvieron en función de la 17 concentración del ácido orgánico y la magnitud del cambio del pHe. Por ejemplo, la acidificación del medio desde pH 7.5 a 5.5 en presencia de 1 mM de acetato varió el pHi desde 7.6 a 6.6 en menos de 10 min y este aumentó hasta 7.0 durante el resto del cultivo. Por su parte, un cambio idéntico del pHe con 20 mM de acetato varió el pHi desde 7.6 a 5.8 y este no se recuperó (Wilks y Slonczewski, 2007). Los ácidos orgánicos de bajo peso molecular como el ácido fórmico, acético y propiónico, pueden difundir a través de la membrana, transportando protones desde el lado más ácido hacia el más básico; esencialmente, una protonforesis que equilibra los iones H+ entre los compartimentos intra y extracelular (Axe y Bailey, 1995; Russell y Diez-González, 1998). Por su efecto nocivo sobre el crecimiento microbiano, estos ácidos se usan ampliamente en la industria alimentaria como preservantes de alimentos (Salmond et al., 1984). En procesos biotecnológicos, por el contrario, la formación de estas moléculas por rutas fermentativas o por sobreflujo metabólico resulta perjudicial porque además de inhibir el crecimiento, representan un gasto de la fuente de carbono y afectan la producción de PR (Jensen y Carlsen, 1990; Eiteman y Altman, 2006). La limitación de oxígeno en cultivos bacterianos favorece la síntesis de los ácidos láctico, fórmico y acético por fermentación; mientras que en cultivos aerobios el sobreflujo metabólico produce grandes cantidades de acetato. Por su parte, el sobreflujo metabólico ocurre cuando la velocidad de degradación de la fuente de carbono y su transformación a piruvato excede el consumo de acetato vía el ciclo de ácidos tricarboxílicos o el metabolismo alterno del glioxilato (Holms, 1986; Dittrich et al., 2005; Phue et al., 2005). En cultivos en lote y en lote alimentado de cepas de linaje B y K12 se ha encontrado que la síntesis de ácidos inhibitorios ocurre con concentraciones de glucosa ≤1 g/L (Luli y Strohl, 1990) y que 0.5 g/L de acetato es suficiente para afectar el crecimiento de E. coli K12 (Nakano et al., 1997). Con respecto al mecanismo que media la inhibición por acetato, Roe et al. (2002) identificaron en varias cepas de linaje K12 que este metabolito evita la conversión de homocisteína a metionina. La homocisteína es un inhibidor competitivo de la metionil-tRNA sintetasa, por lo que el aumento en la relación homocisteína/metionina es tóxico para la célula. Asimismo, Han et al. (1993) describieron que la adición de metionina 3 mM a cultivos de E. coli K12 anula o disminuye hasta un 80% los efectos negativos del acetato endógeno. Se sabe también que la acumulación de homocisteína aumenta la síntesis de homocisteín- tiolactona por edición dependiente de ATP de las metionil-, isoleucil- y leucil-tRNA 18 sintetasas, resultando en una disipación energética en E. coli MG1655. Además, la acumulación de homocisteín-tiolactona favorece la N-homocisteinilación de las proteínas en el ε-amino de las lisinas, lo que afecta su función y en última instancia detiene el crecimiento (Sikora y Jakubowski, 2009). Contradictoriamente, mientras que en el trabajo de Roe et al. la adición de acetato 8 mM aumentó la concentración intracelular de homocisteína de 0.1 a 1.6 mM, Sikora y Jakubowski observaron una disminución de la homocisteín-tiolactona en concentraciones de acetato de hasta 20 mM. Hasta ahora, el mecanismo por el que este tipo de ácidos inhibe el crecimiento y por qué ocurre una recuperación al adicionar metionina se desconoce. Salmond et al. (1984) evaluaron el efecto metabólico del acetato y otros ácidos que se usan como preservantes como el cinamato, propionato y sorbato. Describieron que la potenciade los ácidos para colapsar el gradiente está relacionada directamente con su fortaleza (pKa) y que una disminución del pHi por debajo de 6.8 es suficiente para detener el crecimiento. Esta inhibición se correlacionó con la concentración del ácido protonado y no con la del no disociado. Además, a valores mayores de pHe la concentración de ácido necesaria para causar la misma inhibición fue mayor. Ambos resultados indicaron que la especies no disociadas y difusibles, i. e. ácido acético, propiónico y sórbico, son las que afectan el crecimiento y que un pHe básico tiene efecto protector, probablemente por un desplazamiento del equilibrio ácido-base a la forma no disociada. En la figura 5 se muestra un esquema del equilibrio de disociación del acetato en condiciones de acidificación (pHe < pHi) y alcalinización (pHe > pHi) extracelulares. El desplazamiento del equilibrio en cada caso explica por qué un medio exterior más básico que el intracelular disminuye la entrada del ácido a la célula, la acidificación y la acumulación de la base conjugada. 19 Figura 5: Equilibrio de disociación del ácido acético en un ambiente extracelular ácido (A) y básico (B) (pHe) con respecto al citosol (pHi). A su vez, la dependencia de las concentraciones relativas del acetato y el ácido acético con el pH del medio se puede explicar con la ecuación de Henderson-Hasselbach (Ecuación 1). Su transformación antilogarítmica muestra que una disminución en una unidad de pH resulta teóricamente en un incremento de diez veces de la forma protonada con respecto a la aniónica (Ecuación 2). (1)𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + log10 (𝐴𝑐 -𝐻𝐴𝑐) (2)𝐴𝑐 - 𝐻𝐴𝑐 = 10 𝑝𝐻 * 𝐾𝑎 Un trabajo reciente evaluó el crecimiento y la producción de PR en E. coli BL21 en matraces con un medio complejo a diferentes valores de pHe, y en presencia de acetato exógeno 300 mM (18 g/L) (Wang et al., 2014). Los autores demostraron que la concentración de acetato intracelular fue tres veces mayor a pH 6.5 con respecto a 7.5. De manera similar, el incremento de la concentración intracelular de acetato a pH 6.5 ocasionó una disminución de tres veces en la velocidad específica de crecimiento con respecto a pH 8.0. Dicho aumento en la velocidad específica de crecimiento en presencia de 300 mM de acetato también se observó para las cepas DH5α y Origami (DE3), aunque no se analizó la expresión de PR en ninguna de ellas. Adicionalmente, los cultivos de E. coli BL21 con 300 mM de acetato a pH 6.5 y 7.0 mostraron una disminución de la actividad respiratoria en 75% y 25%, respectivamente, mientras que los cultivos a pH 7.5 a 8.0 no fueron afectados. 20 Lo anterior señaló el efecto inhibitorio del acetato intracelular sobre el metabolismo. A su vez, los cultivos de E. coli BL21 a pH 6.5 con 300 mM de acetato mostraron una disminución del 60% en la expresión de dos de las cuatro PR estudiadas, con respecto a los cultivos a pH 7.5 con la misma concentración de acetato. El trabajo de Wang et al. (2014) destacó el uso de medios alcalinos como alternativa para evitar los efectos negativos del acetato sobre el rendimiento de los cultivos de E. coli. Sin embargo, la cepa que usaron como modelo fue E. coli BL21. Esta cepa, a diferencia de la K12, tiene menor expresión de la piruvato oxidasa que convierte el piruvato en acetato, mayor actividad de las vías fosfotransacetilasa/acetato cinasa y acetil-CoA sintetasa que interconvierten acetato a acetil-CoA y mayor actividad del ciclo de Krebs y del metabolismo alterno del glioxilato que consumen acetil-CoA (van del Walle y Shiloach, 1997; Phue et al., 2005; Waegeman et al., 2012; Waegeman et al., 2013). Dichas diferencias metabólicas determinan que BL21 produzca relativamente poco acetato y sea capaz de consumirlo mientras que las cepas derivadas de K12 acumulan más acetato y lo consumen menos. Además, los autores usaron el medio BYT con extracto de levadura y triptona. Este medio complejo tiene poca disponibilidad de carbohidratos por lo que la formación de ácido acético es menor que en medios suplementados con glucosa. Parámetros de cultivo que afectan la formación de cuerpos de inclusión. Importancia del pH extracelular La formación de agregados proteicos en E. coli resulta de la competencia entre las velocidades de plegamiento y agregación, que a su vez están determinadas por la disponibilidad de chaperonas, la velocidad de síntesis de la PR y su potencial de agregación (Espargaró et al., 2008a; Castillo et al., 2011; Hamodrakas, 2011). En este sentido, algunas de las estrategias descritas para mejorar la solubilidad de las PR sobrexpresadas son co- expresar chaperonas, disminuir la intensidad de la inducción variando la concentración de IPTG o usando lactosa, modificar la secuencia peptídica y disminuir la temperatura del medio (Mitraki et al., 1991; Martínez-Alonso et al., 2007; Castro-Martínez et al., 2012; Jhamb y Sahoo, 2012). Adicionalmente, algunos estudios han demostrado que los factores que afectan la agregación también pueden influir en las características estructurales de los CI (de Groot y Ventura, 2006; Chura-Chambi et al., 2013). Por ejemplo, Vera et al. (2007) 21 encontraron que el crecimiento de E. coli BL21 a 16°C aumentó tanto la solubilidad de rGFP como la calidad conformacional de los CI, obteniendo agregados con fluorescencia específica diez veces mayor que a 37°C. Es notable que la modificación del bioproceso para favorecer la solubilidad de las PR o la calidad conformacional de los CI puede ser ventajosa sobre la co-expresión de chaperonas ya que requiere menos esfuerzo y tiempo para su evaluación (Castro-Martínez et al., 2012). En segundo lugar, las chaperonas varían en su afinidad por las proteínas por lo que la identificación de la o las chaperonas a sobre-expresar depende de experimentos de prueba y error (Schlieker et al., 2002). Igualmente, esta co-expresión puede promover la proteólisis de la PR al o afectar su plegamiento al inhibir la respuesta de choque térmico y la expresión de otras chaperonas (Martínez-Alonso et al., 2010). Además de la temperatura, otra condición de cultivo que se puede controlar y modificar fácilmente es el pH del medio. La influencia de esta última variable sobre la agregación proteica y las características de los CI ha sido escasamente evaluada. Strandberg y Enfors (1991) compararon la solubilidad y la actividad de la proteína de fusión proteína-A/β- galactosidasa (pI=5.2) en cultivos de E. coli RR1 con termoinducción a 42°C, sin control de pH y controlados a pH 7.0. En los biorreactores no controlados el pH disminuyó desde 6.5 hasta 5.0 durante el período de inducción y el porcentaje de la PR en la forma insoluble fue 6 veces mayor que en los cultivos controlados a pH 7.0. Asimismo, la actividad β- galactosidasa específica disminuyó ~3 veces en los cultivos acidificados con respecto a los de pH neutro. Estos resultados indican entonces que un ambiente extracelular ácido favorece la agregación de la PR. Contrariamente, Manderson et al. (2006) describieron que un cultivo alimentado con pH 6.8 tuvo mayores productividades volumétrica y específica de un antígeno recombinante soluble (pI=5.9), con respecto a un cultivo alimentado a pH 7.2. Sin embargo, el cultivo a pH 6.8 fue realizado a temperatura (25°C) y velocidad específica de crecimiento (0.033- 0.046 h-1) menores que los del cultivo a pH 7.2 (28°C y 0.052 h-1). Como la velocidad de crecimiento y la temperatura afectan la velocidad de síntesis de proteínas, y dada la ausencia de réplicas biológicas en este trabajo, sus resultados sobre el efecto del pH pueden ser cuestionados. Otros trabajos se enfocaron en la importancia del pH sobre la producción de PR activa. Ryan et al. (1988) mostraron que entre los valores de pH 7.0, 7.4 y 8.0, las mayores 22 actividades total y específica de la β-lactamasa recombinante (pI=5.5)se alcanzaron en pH 7.4. Kopetzki et al. (1989) obtuvieron que la actividad de la α-glucosidasa recombinante específica (pI=5.4) aumenta con la acidez del cultivo: de 180 mU/mg a pH 8.0 a 1630 mU/mg a pH 5.0. No obstante, relacionar estos resultados de actividad con condiciones que favorecen la agregación no es trivial: los CI pueden contener proteínas funcionales y las proteínas solubles no necesariamente están bien plegadas (García-Fruitós et al., 2007; González-Montalbán et al., 2007b, Martínez-Alonso et al., 2007; Martínez-Alonso et al., 2008). La similitud en pI de las PR mencionadas sugeriría que este parámetro no interviene en los efectos del pH del medio sobre la agregación, solubilidad o actividad proteicas en E. coli, contrariamente a lo mostrado por trabajos con proteínas puras y en solución. La relación entre el pI de la β-lactoglobulina (pI=5.1) y el pH de la solución donde se encuentra disuelta determina el tipo de agregado amiloide que se forma: agregados fibrilares a un pH lejos de su pI o agregados esféricos a un pH igual o cercano a su pI (Langton y Hermansson, 1992; Krebs et al., 2009). Schmittschmitt y Scholtz (2003) encontraron que la ribonucleasa Sa de Streptomyces aureofaciens (pI=3.5) y dos mutantes de esta proteína con pI 6.4 y 10.2, exhibieron la máxima agregación amiloide en valores de pH cercanos a sus pI: 3.1, 6.4 y >10, respectivamente. Un reporte sobre la producción de un anticuerpo monoclonal en células de ovario de hámster chino también resaltó la importancia del pI de la proteína, su concentración y el pH intracelular (Hasegawa et al., 2011). Los autores describieron que la IgG sobrexpresada, con pI=7.4, formaba cristales en el interior del retículo endoplasmático cuyo pH es ~7.2 (Figura 6). Sin embargo, las características de dicha cristalización deben ser tomadas en cuenta: 1) los cristales se solubilizaron completamente en solución, 2) el contenido proteico de los cristales estuvo predominado por la IgG y solo se observó actina como contaminante, 3) las moléculas de IgG en los cristales estuvieron correctamente plegadas ya que detectaron su antígeno correspondiente y se unieron a proteína A, y 4) la cristalización solo ocurrió al sobrepasar determinado valor umbral de concentración. Estas propiedades implican que este fenómeno es cualitativamente diferente a la agregación por sobrexpresión de PR en E. coli: los CI son estables en solución, su formación ocurre por un pobre plegamiento de la PR que pierde significativamente su estructura nativa y están constituidos por varias proteínas co-precipitantes (Rinas y Bailey, 1992; Jürgen et al., 2010). 23 No obstante, el papel del pI de la PR como mediador en la influencia del pH extracelular sobre la agregación no debe ser descartado completamente. En ciertos casos donde el pH intracelular se iguala al extracelular (ver en la siguiente sección) se podría favorecer la agregación de aquellas proteínas citosólicas altamente expresadas con pI cercano al pH extracelular. Figura 6: Formación de cristales con forma de bastón en células de ovario de hámster chino produciendo una IgG humana recombinante. La barra representa 50 µm. Tomado de Hasegawa et al., 2011. Por otro lado, el único reporte sobre la importancia del pH de cultivo sobre las características estructurales de los CI proviene de nuestro grupo de investigación. En dicho trabajo se caracterizaron los CI producidos en biorreactores con un medio rico sin control de pH o con control a pH 7.5 (Castellanos-Mendoza et al., 2014). La cepa y el medio de crecimiento usados fueron E. coli BL21 y Super Broth (peptona 3.2% m/v, extracto de levadura 2% m/v y NaCl 0.5% m/v), respectivamente. Como en el medio Super Broth el carbono se encuentra formando principalmente compuestos aminados como aminoácidos y bases nitrogenadas, su metabolización resultó en la liberación de amoniaco y la correspondiente basificación del medio (Sezonov et al., 2007). El perfil de pH en los cultivos no controlados y las cinéticas de crecimiento se muestran en la figura 7. En los cultivos no controlados hubo una acidificación inicial hasta pH 6.5, probablemente por la producción de ácidos orgánicos a partir de azúcares disponibles en el medio, como se ha demostrado en cultivos creciendo en medio Luria Bertani (triptona 1%, extracto de levadura 5% y NaCl 1%) (Li et al., 2014). Después de esta acidificación inicial el pH aumentó hasta 8.5 y se mantuvo en este valor desde las 5 h de cultivo (~1 h después de la inducción) hasta el final del cultivo. 24 Figura 7: Cinéticas de crecimiento de E. coli BL21 produciendo una esfingomielinasa-D recombinante de garrapata en cultivos sin control de pH (●) y cultivos a pH 7.5 (□). En el inserto se muestra el perfil de pH en los cultivos no controlados. La inducción se hizo por adición de IPTG 1 mM a las 4 h de crecimiento. Tomado de Castellanos-Mendoza et al. (2014). Este trabajo demostró que la estructuración de los CI es sensible al pH del medio: los CI obtenidos en la condición sin control de pH fueron más sensibles a la degradación por proteinasa K y a la solubilización por GnCl. Además, estos agregados fueron menos afines por el colorante amiloidofílico tioflavina-T (Th-T). Sin embargo, el diseño experimental de este primer reporte (medio de cultivo complejo y condición de pH no controlada) no permitió evaluar el efecto de una acidificación del medio en la arquitectura de los CI. Por lo tanto, aún era necesario realizar un estudio con diferentes condiciones controladas de pH para profundizar en su importancia sobre la calidad conformacional de estos agregados proteicos. Escherichia coli cepa Origami El ambiente reductor citoplasmático de E. coli impide la formación de cistinas y el plegamiento correcto de las PR citosólicas estabilizadas por estos enlaces (Zhang et al., 2011a). El sistema encargado de reducir las cistinas en el citoplasma de E. coli es el de la tiorredoxina reductasa/glutatión óxido-reductasa (TrxB/Gor). Estas dos enzimas transfieren continuamente los pares de electrones desde el NADPH, vía las tiorredoxinas, el glutatión y las glutarredoxinas, a los enlaces disulfuro que ocurren en las proteínas (Figura 8) (Stewart et al., 1998; Seras-Franzoso et al., 2012). El transporte continuo de electrones es necesario para mantener la actividad de varias enzimas que requieren un evento de reducción en cada ciclo catalítico. De estas las más importantes son la 3’-fosfoadenosina- 5’-fosfosulfato reductasa que participa en la asimilación del SO42- para la biosíntesis de 25 cisteína, la metionina-sulfóxido reductasa que participa en la biosíntesis de metionina y la ribonucleótido reductasa que produce los desoxinucleótidos necesarios para la replicación del ADN (Aberg et al., 1989). Figura 8: Sistema de la tiorredoxina reductasa/glutatión óxido reductasa en el citoplasma de E. coli para la trasferencia de electrones desde NADPH hasta las proteínas. GSH: glutatión reducido. GSSG: glutatión oxidado. Tomado de Stewart et al., 1998. Actualmente, una de las principales estrategias para la producción de PR con varios enlaces disulfuro en E. coli es el uso de la cepa Origami, que tiene mutados los genes que codifican para la TrxB y la Gor (Xiong et al., 2005; Peti y Page, 2007; Long et al., 2015). Derman et al. (1993) fueron los primeros en describir un mutante trxB- con potencial oxidante en el citoplasma y luego se obtuvo el doble mutante ΔtrxB:gor con mayor formación de enlaces disulfuro (Prinz et al., 1997). Estas mutaciones promueven la formación de enlaces disulfuro porque la acumulación de las tiorredoxinas y las glutarredoxinas oxidadas catalizan la oxidación la de las cisteínas. Esta cepa mostró un crecimiento lento en cultivos aerobios con medios complejos, lo que era solucionado con la adición de un agente reductor como el ditiotreitol (DTT) o β-mercaptoetanol. Posteriormente,se identificó una mutación en la alquil-hidroperoxidasa que suprimía dicho defecto en el crecimiento. Esta mutación consistió en la adición de un residuo de Phe en la posición 38 cercana al sitio activo (Bessette et al., 1999; Ritz et al., 2001). La alquil-hidroperoxidasa en forma nativa actúa como peroxidasa protegiendo a la célula del estrés oxidativo mediante la reducción de peróxido de hidrógeno y alquil-hidroperóxidos. En la forma mutada la actividad de esta enzima cambió a disulfuro reductasa y entonces puede transferir electrones del NADH al 26 glutatión. Según Ritz et al. (2001) este nuevo flujo de electrones permite el funcionamiento de las enzimas esenciales como la ribonucleótido reductasa, aunque el citoplasma continúa siendo oxidante. Esta cepa triple mutante con genotipo trxB-, gor-, ahpC* y de linaje K12 se conoce como FÅ113 y se comercializa con el nombre de Origami (Novagen) (Berkmen, 2012). La cepa Origami fue una de las usadas por Wang et al. (2014) para demostrar que el uso de un pH alcalino aumenta la velocidad de crecimiento de E. coli en un medio complejo suplementado con acetato, sin evaluar la producción de PR. Asimismo, y según nuestro conocimiento, el crecimiento de E. coli Origami en medios definidos no se ha reportado. Entonces, el crecimiento de la cepa Origami expresando una PR en un medio definido suplementado con glucosa permitirá evaluar de manera directa los efectos del acetato endógeno sobre la producción heteróloga en diferentes ambientes de pH. Fosfolipasa A2 La proteína usada en este trabajo es la fosfolipasa A2 (PLA2) del veneno de Micrurus laticollaris (Squamata: Elapidae). Esta especie se conoce comúnmente como serpiente coralillo o serpiente de doble coral y es endémica de México (http://www.reptile- database.org/) (Ramírez y Aizmendi, 2004). Las PLA2 (E.C. 3.1.1.4) son enzimas hidrolasas que escinden el ácido graso en posición sn-2 de los glicerofosfolípidos produciendo el lisofosfolípido y el ácido graso correspondientes (Figura 9) (http://www.brenda-enzymes.info/). Existen seis familias de PLA2 que se diferencian en su estructura, mecanismo catalítico, localización celular y filogenia: PLA2 citosólicas, independientes de calcio, secretorias, lisosomales, acetilhidrolasas del factor activador plaquetario y PLA2 específicas de tejido adiposo (Murakami et al., 2011). Figura 9: Reacción catalizada por la fosfolipasa A2 (PLA2). Tomado de Dennis et al. (2011). Las PLA2 del veneno de las serpientes pertenecen a los grupos I y II de las PLA2 secretorias. Estas PLA2 son en general proteínas pequeñas de 13 a 15 kDa de peso molecular. El sitio activo está formado por la díada catalítica His48 y Asp93 y el sitio de http://www.reptile-database.org/ http://www.reptile-database.org/ http://www.brenda-enzymes.info/ 27 unión a calcio, que funciona como activador alostérico, está formado por Asp49, Tyr28, Gly30 y Gly32 (Burke y Dennis, 2009). La histidina y el aspartato del sitio activo polarizan la molécula de agua para hacerla un buen agente nucleofílico capaz de atacar el carbono carbonílico del enlace éster. El calcio, requerido en concentraciones milimolares, estabiliza el estado de transición al coordinar el oxígeno del carbonilo y el oxígeno del fosfato. Las PLA2 secretorias tienen cinco, seis, o hasta siete enlaces disulfuro como la PLA2 del veneno de la cobra india Naja naja (Chakraborti, 2003; Dennis et al., 2011; Quach et al., 2014). Las PLA2 son ubicuas en los venenos de serpiente, siendo en muchos su principal componente proteico (Possani et al., 1979; Clement et al., 2012). Estas enzimas actúan como β-neurotoxinas y pueden tener efectos mio-, cardio- y neuro-tóxicos, entre otros (Kini, 2003). 28 Justificación y planteamiento del problema La investigación sobre los CI en E. coli se ha intensificado en las últimas dos décadas; debido principalmente a que estos agregados se han constituido como la principal limitante para obtener PR solubles y nativas. Por ejemplo, según Butt et al. (2005) alrededor del 80% de las PR producidas en E. coli son insolubles. En consecuencia, varios parámetros de cultivo y genéticos han sido evaluados extensivamente en cuanto a su importancia sobre la agregación. Particularmente, la inducción a bajas temperaturas (15-25°C) ha demostrado ser un método eficaz para disminuir la agregación de las PR o para generar CI con menor contenido amiloide (de Groot y Ventura, 2006; Vera et al., 2007). La disminución del contenido amiloide en los CI puede ser ventajoso para la producción industrial de biofármacos ya que favorece la solubilización de los agregados en condiciones suaves, lo que a su vez aumenta la recuperación de PR activa (Jevševar et al., 2005; Singh y Panda, 2005; Singh et al., 2015). En este sentido, nuestro grupo de investigación ha reportado que los CI generados en medios sin control de pH, en los que ocurrió una alcalinización durante el crecimiento, fueron menos amiloides que los obtenidos a pH 7.5. Sin embargo, los trabajos acerca de la influencia del pH sobre la agregación son escasos y al igual que el trabajo de nuestro grupo, emplean estrategias no controladas. Wang et al. (2014) también han propuesto el uso de un pH de cultivo alcalino como alternativa para disminuir la inhibición ocasionada por el ácido acético sobre el metabolismo de E. coli. Con base en estos antecedentes aún es necesario evaluar el efecto de condiciones controladas de pH sobre la agregación de las PR y las características estructurales de los CI. Adicionalmente, el empleo de una cepa más sensible y con mayor producción de acetato, como las de linaje K12, y de un medio suplementado con glucosa puede ofrecer evidencias más relevantes sobre la protección de un ambiente alcalino contra la inhibición por acetato. En el presente trabajo se evalúa el efecto del pHe en el rendimiento de los cultivos de E. coli usando una cepa productora de acetato, de linaje K12, y en un medio mínimo suplementado con glucosa. Estas condiciones pueden ser útiles para demostrar la robustez de la protección por pHe alcalino contra la inhibición por acetato endógeno derivado del sobreflujo metabólico. 29 Hipótesis El uso de pH de cultivo 8.5 aumenta la producción de rPLA2 en E. coli (Origami) y genera cuerpos de inclusión menos amiloides que los producidos a pH no controlado y a pH 6.5 y 7.5. Objetivos Objetivo general Evaluar el efecto del pH de cultivo en la producción y agregación de la rPLA2 de Micrurus laticollaris y en las características estructurales de los cuerpos de inclusión obtenidos en E. coli Origami. Objetivos específicos 1. Caracterizar cinética y estequiométricamente los cultivos de E. coli Origami expresando la rPLA2 en biorreactores sin control de pH y controlados a 6.5, 7.5 y 8.5. 2. Caracterizar la producción y agregación de la rPLA2, y la arquitectura de los cuerpos de inclusión obtenidos en condiciones de pH no controlado y controlado a 6.5, 7.5 y 8.5. 30 Materiales y métodos Cepa bacteriana y elaboración del banco de trabajo Se empleó la cepa E. coli Origami (DE3) (Novagen-EMD Millipore, USA) proporcionada por el Dr. Alejandro Alagón, IBt-UNAM. La cepa tiene el genotipo Δara-leu7697 araD139 ΔlacX74 galE galK rpsL ΔphoAPvuIIphoR F’[lac+(lacIq)pro] gor522::Tn10 (Tetr) trxB::kan. Está transformada con un plásmido pQE30 (Qiagen, USA) que contiene el gen codificante para la PLA2 de Micrurus laticollaris (GeneBank No. MF624273), bajo el promotor lac y con el gen bla para la resistencia a ampicilina (Figura 10). Figura 5: Mapa del plásmido pQE30 (Qiagen, USA). PT5: promotor T5, lac O: operador lac, RBS: sitio de unión al ribosoma, ATG: codón de inicio, 6xHis: etiqueta de seis histidinas, MCSI/MSCII sitios de clonación múltiple, Col E1: origen de replicación Col E1, Ampicillin: gen de resistencia a ampicilina. Para elaborar el banco de trabajo se tomó 1 mL del bancomaestro de la cepa y se cultivó en matraces convencionales de 250 mL, a 200 rpm, 37°C y con 50 mL de volumen de llenado. Se usó el medio LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura y 10 g/L de NaCl), a pH 7.5 con 50 μg/mL de ampicilina (Sigma, USA). Cuando se alcanzó DO600nm=1 UA se añadieron 15 mL de glicerol y se agitó para mezclar ambas fases. La suspensión se almacenó en viales con alícuotas de 1 mL a -70°C. Cultivos en matraces La caracterización inicial del crecimiento de la cepa se hizo en matraces convencionales con medio LB o mínimo, con ampicilina 100 μg/mL y pH 7.5. El medio mínimo fue similar al 31 descrito por Caspeta et al. (2013): (NH4)2HPO4 4.0 g/L, KH2PO4 13.3 g/L, ácido cítrico 1.7 g/L, MgSO4·7H2O 1.2 g/L, hidrocloruro de tiamina 0.045 g/L, 2 mL/L de una solución elementos traza concentrada a 500X (citrato de Fe(III) 100.8 g/L, ZnSO4•2H2O 22.5 g/L, MnCl2•4H2O 15.0 g/L, EDTA 14.1 g/L, H3BO3 3.0 g/L, CoCl2•6H2O 2.5 g/L, Na2MoO4•2H2O 2.1 g/L, CuCl2•2H2O 1.5 g/L). El medio mínimo se suplementó con glucosa 17.5 g/L, casaminoácidos 3.0 g/L y CaCl2 0.1 mM. La inducción se hizo con IPTG 0.1 mM al final de la fase exponencial. Todos los cultivos se hicieron por triplicado. Cultivos en biorreactores Los cultivos en biorreactores y los inóculos se hicieron en medio mínimo. Para los inóculos se usaron matraces de 250 mL con 50 mL de volumen de llenado, incubados por 12 h a 200 rpm, 37°C y pH 7.5. Los inóculos estuvieron al final de la fase exponencial en el momento de adicionarlos a los biorreactores para una DO600nm inicial de 0.1 UA. Se emplearon biorreactores Applikon (Applikon, Países Bajos) de volumen total 1.2 L y 800 mL de volumen de llenado, con dos turbinas Rushton de 6 paletas planas y acoplados a un Biocontrolador ADI 1010. Todos los cultivos se mantuvieron a 37.0 ± 0.1°C, con flujo de aire de 1 vvm y tensión de oxígeno disuelto (TOD) a 30% controlada por regulación automática de la agitación, por 15 h. El pH de los biorreactores se ajustó a 7.5 después de la esterilización. El control del pH durante el cultivo se hizo por adición manual de NaOH o HCl 2.5 N. Se emplearon tres estrategias de cambio de pH: i) pH no controlado, iii) pH controlado a 7.5 y alcalinización hasta 8.5 a las 5 h de cultivo y iv) pH controlado a 7.5 y acidificación hasta 6.5 a las 5 h de cultivo; que fueron comparadas con la estrategia de mantenimiento de pH a 7.5 (ii). La inducción se hizo con IPTG 0.1 mM a las 5 h, al final de la fase exponencial. Para los cultivos a pH 6.5 y 8.5 la inducción se hizo inmediatamente después del cambio de pH. Los cultivos se hicieron por triplicado y los datos se adquirieron con el programa BioXpertR Lite (Applikon, Países Bajos). El factor de conversión entre DO600nm y biomasa en peso seco se midió por triplicado a las 5 y 15 h de cultivo en biorreactores sin control de pH, inducidos y no inducidos. Para esto se filtraron 10 mL de cultivo en filtros (0.2 µm) previamente secados a 60°C por 72 h y pesados. Los filtros con el material no filtrado se secaron por 72 h y se volvieron a pesar. Estos factores de conversión fueron dependientes del tiempo de cultivo por lo que se usaron de manera cinética para transformar los valores de DO600nm en biomasa. 32 Cuantificación de glucosa, ácidos orgánicos y osmolalidad La concentración de glucosa, ácidos orgánicos y osmolitos se midieron en el sobrenadante del cultivo de biorreactores. Para esto, 1 mL de medio se centrifugó a 8 000 g por 10 min y el sobrenadante se guardó a -20°C hasta el análisis. El perfil de consumo de glucosa se midió con el analizador bioquímico YSI 2900 (YSI Life Sciences, USA). Los ácidos orgánicos se cuantificaron por cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (HPLC-RP) (Shimadzu, Japón), con una columna C18 Aminex-HPX87H (BioRad, USA) y fase móvil H2SO4 8 mN, a 50°C y un flujo de 0.6 mL/min. La concentración de los ácidos se obtuvo a partir de un estándar con citrato, succinato, formato y acetato (BioRad, USA). El software usado para el análisis fue el LC Solutions v1.25 (Shimadzu, Japón). La osmolalidad se midió en los tiempos 0 y 15 h con un microsmómetro de punto de congelación (µOsmetteTM, Fisher Scientific, EE.UU.). Se usaron los tubos de 1.5 mL (Eppendorf AG, Alemania) y el volumen de muestra fue 50 µL. La calibración del equipo se hizo con estándares del proveedor a 100 y 500 mOsm/KgH2O. Cuantificación de proteínas por ensayo de Bradford La concentración de proteínas se midió por el método de Bradford para microplacas, con el reactivo de Bradford (BioRad, EE.UU.) y un espectrofotómetro UV-2450 (DU 730 Beckman Coulter, USA). La curva de calibración se hizo con seroalbúmina bovina (BSA) (Equitech- Bio Inc., USA) en el intervalo de 0 a 1 g/L. Antes de la cuantificación las muestras que contenían agregados proteicos se solubilizaron con buffer IEF (urea 7 M, tiourea 2 M, DTT 40 mM, CHAPS 2% m/v) por 30 min a temperatura ambiente. SDS-PAGE y Western-Blot La electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) se hicieron según Laemmli et al. (1970), con 50 µg de proteína en cada pozo, gel separador al 12% de acrilamida-bisacrilamida y en condiciones reductoras. El análisis densitométrico se hizo con el programa Image Lab v5.2 (BioRad, USA). La identificación de rPLA2 en el contenido proteico total, y en las fracciones agregada y soluble se hizo por Western-Blot; con 50 µg de proteína total para el lisado y los CI, y 100 µg para la fracción soluble. La transferencia desde geles de poliacrilamida se hizo en cámara semi-seca (Bio-Rad) por 45 min a 25 V. La membrana de nitrocelulosa se bloqueó con leche 5% (w/v) en TBS (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7.6) por 40 min y se lavó tres veces con Tween-20 0.05% (v/v) en TBS. Se incubó por 50 min con anti-His Tag de ratón 33 (Sigma, USA) (1:1,000), se lavó tres veces y se incubó por 50 min con anti-IgG de ratón acoplado a peroxidasa de rábano (Sigma, USA) (1:1,500). Se hicieron tres lavados y se reveló con las soluciones de revelado SuperSignal West Pico y SuperSignal West Femto (Thermo ScientificTM, USA). Concentración y rendimiento de proteínas totales y rPLA2 Para evaluar la concentración de proteínas totales en el lisado celular se cuantificó el contenido proteico en muestras de 1 mL de cultivo. El rendimiento de proteínas totales se obtuvo dividiendo la concentración de proteínas totales por la biomasa del cultivo. La concentración y el rendimiento de rPLA2 se calcularon de manera similar a partir del porcentaje de rPLA2 en el contenido proteico total, obtenido por densitometría de geles de SDS-PAGE. Purificación de cuerpos de inclusión La purificación de los CI se hizo según el protocolo descrito por Carrió et al. (2000). La biomasa de los cultivos en biorreactor se recuperó por centrifugación a 8 000 g por 10 min y el pellet se reconstituyó en solución de lisis (Tris-HCl 50 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7.5) con fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, Sigma, USA) 1 mM. Las células se sonicaron sobre hielo en un SoniPrep 150 (Richmond Scientific, Reino Unido) con 10 pulsos de 30 segundos de sonicación y 30 segundos de reposo, amplitud de 10 micrones. Se añadió al lisado NP-40 1% v/v (Sigma, USA) y se incubó con agitación a 4°C por 30 min. Se centrifugó a 8000 g por 10 min y el precipitado se lavó una vez con Tritón X-100 0.5% v/v (Sigma, USA) en solución de lisis y tres o más veces con agua milli-Q para eliminar sales, detergente y restos de ADN. El análisis conformacional de los CI se hizo justo después de su aislamiento para evitar cambios estructurales por congelación; de lo contrario se almacenaron a -20°C para SDS-PAGE. Rendimiento de agregación El rendimiento de agregación o masa de CI por unidad de biomasa (g/g) se midió por un método gravimétrico. Primeramente, se pesó biomasa húmeda en tubos previamente pesados y secados por 12 h a 60°C. La biomasa
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