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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA “Efecto Sinérgico Entre Antiinflamatorios no Esteroideos y Diligustilido en la Antinocicepción Visceral en Ratón” T E S I S Que para obtener el título de: QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA Presenta: PERLA ARELI VÁZQUEZ RAMÍREZ DIRECTOR: Dr. Héctor Isaac Rocha González. ASESOR: M. en F. Ma. Martha Ugalde Hernández. MÉXICO D. F. FEBRERO 2012. UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES "ZARAGOZA" DIRECCiÓN UNIVERSIDAD NAGONAL AUTON OMA DE , MEXICO JEFE DE LA UNIDAD DE ADMINISTRACIÓN ESCOLAR P R ES E N TE. Comunico a usted que la alumna VÁZQUEZ RAMíREZ PERLA ARELI con número de cuenta 300164703 de la carrera de Q. F. B. se le ha fijado el día .1l. del mes de Febrero de 2012 a las 09:00 hrs., para presentar examen profesional, que tendrá lugar en la sala de exámenes profesionales Campus 11 de esta Facultad, con el siguiente jurado: PRESIDENTE VOCAL· SECRETARIO SUPLENTE SUPLENTE M. en F. MA. MARTHA UGALOE HERNÁNOEZ OR. HÉCTOR ISAAC ROCHA GONZÁLEZ Q.F.S. MA. DEL ROSARIO SENíTEZ VELÁZQUEZ Q.F.S. MA. ELENA FLORES PONCE Q.F.S. MIRIAM HINOJOSA MORALES El título de la tesis que se presenta es : Efecto Sinérgico Entre Antiinflamatorios No Esteroideos y Diligustilido en la Antinocicepción Visceral en Ratón. Opción de titulación: Tesis Experimental RECIBI: OFICINA DE EXÁMENES PROFESIONALES YDEGBADO ATENTAMENTE "POR MI RAZA HABLARÁ EL EspíRITU" México, D.F. a, 07 d~icüi~O: . ... tri ::a -, _ o UNE 1"1 ZARAGOZA OlRECCION 2 (/.;:-"1 VO.So. ~ .... ~l DRA. MARTHA A. SÁNCHEZ RODRm'li'EZ JEFA DE LA CARRERA DE O.F.B. La parte experimental de esta tesis se realizó en la Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional y el Departamento de Farmacobiología del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados - Sede sur bajo la dirección de los Doctores Héctor Isaac Rocha González y Vinicio Granados Soto, respectivamente. El presente proyecto fue financiado por los proyectos SIP 20113892 y Conacyt 154880. AGRADECIMIENTOS Al Dr. Héctor Isaac Rocha González por confiarme este proyecto, por su infinita paciencia y compartir sus conocimientos. Al Dr. Vinicio Granados Soto que me facilitó los medios para la realización de esta tesis y también por todos los comentarios y enseñanzas. A la M. en F. Ma. Martha Ugalde Hernández por su apoyo. A la Dra. Beatriz Godínez Chaparro, Dra. Claudia Cervantes Durán, M. en C. Paulino Barragán Iglesias, M. en C. Jorge Baruch Pineda Farías y a la M.V.Z. Mariana Bravo Hernández por su amistad y colaboración durante mi estancia en el CINVESTAV- Sede sur. A Eduardo, Vladimir y Javier, que fueron mis compañeros en el laboratorio 12. A Consuelo Lezama, Sandra Saavedra, Cinthya Solís, Gabriela Buenfil, Jesús Chaires, Amílcar López, Manuel De los Santos, Jesús Morales, Misael Montes de Oca y Marco Jiménez, por su amistad y apoyo, por ser mis cómplices durante toda la carrera. A Arendi Segoviano, Paloma Velázquez, Laura Rodríguez, César Rivero, José Hernández, Aníbal Guzmán, Isaac Nequiz, Baruch Martínez y demás compañeros de “la cueva” que desde la preparatoria me brindaron su amistad, apoyo y comprensión. A Janeth González Cabañas de quien nunca me separe en la carrera y a quien considero una hermana. A Mario Emmanuel Velasco Xolalpa quien me alentó a realizar esta tesis. Por cuidar de mí y llegar a ser una parte importante en mi vida. Por todo su amor, apoyo y confianza. DEDICATORIA A Dios por haberme permitido llegar hasta aquí. Por ser mi fortaleza y mi guía. A mi padre Ubaldo Vázquez, quien me apoyó siempre. Por su insistencia en hacerme una mujer de provecho, por sus sabias palabras que llevo siempre conmigo: “Haz lo difícil porque lo fácil cualquier persona lo hace”. A mi madre, Paula Ramírez, por todo el amor que me ha dado y ser mi principal apoyo, por sus desvelos y regaños. Porque me ha enseñado a salir adelante. Por ser siempre mi razón de todo. A mis abuelos quienes fueron la base de mi educación y que sin duda alguna son mi ejemplo a seguir. A mi amada hermana Karen, pues ha sido mi consejera y amiga. Porque ella siempre estuvo en mis buenos y malos ratos. Por su paciencia, amor y apoyo. Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 5 Tabla de contenido 1. RESUMEN ...................................................................................................................... 11 2. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 13 3. FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA ....................................................................................... 15 3.1. Dolor ...................................................................................................................... 15 3.1.1. Clasificación del Dolor .................................................................................... 15 3.2. Fisiología del Dolor ................................................................................................. 17 3.2.1. Nocicepción. ................................................................................................... 17 3.2.2. Fibras aferentes primarias .............................................................................. 19 3.2.3. Vías Ascendentes ............................................................................................ 21 3.2.4. Tálamo y proyecciones corticales ................................................................... 22 3.2.5. Sistemas inhibidores de control descendente. .............................................. 24 3.3. Mecanismos moleculares ...................................................................................... 25 3.4. Neurorreguladores ................................................................................................. 26 3.4.1. Principales neurorreguladores implicados en la respuesta del dolor. ........... 27 3.5. Modelos Experimentales de Dolor ........................................................................ 32 3.5.1. Modelos de Dolor Fásico. ............................................................................... 32 3.5.2. Modelos de Dolor Tónico ............................................................................... 34 3.6. Analgésicos............................................................................................................. 35 3.6.1. Analgésicos Opioides ...................................................................................... 35 3.6.2. AINEs ............................................................................................................... 36 Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 6 3.6.3. Diligustilido ..................................................................................................... 38 4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................................40 5. HIPÓTESIS. ..................................................................................................................... 41 6. OBJETIVOS. .................................................................................................................... 41 6.1. Objetivo general. ................................................................................................... 41 6.2. Objetivos particulares. ........................................................................................... 41 7. MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................................. 42 7.1. Material .................................................................................................................. 42 7.2. Animales ................................................................................................................. 43 7.3. Reactivos ................................................................................................................ 43 7.4. Preparación de fármacos y el vehículo. ................................................................. 43 7.5. Preparación del ácido acético al 0.6%. .................................................................. 44 7.6. Metodología ........................................................................................................... 44 7.7. Prueba de contorsión en ratón .............................................................................. 44 7.8. Combinaciones de dosis ........................................................................................ 45 7.9. Análisis estadístico ................................................................................................. 45 8. RESULTADOS ................................................................................................................. 47 8.1. Evaluación del Ácido acetilsalicílico (AAS), Indometacina, Diclofenaco y Diligustilido en la prueba de contorsiones abdominales en ratón. .................................. 47 8.2. Obtención de las Dosis de la Coadministración .................................................... 51 8.3. Obtención y evaluación de la curva dosis-respuesta (CDR), ärea bajo la curva (ABC) y % Antinocicepción de las coadministraciones. .................................................... 54 8.4. Obtención del isobolograma del diligustilido + AAS, diligustilido + indometacina y diligustilido + diclofenaco. ................................................................................................ 57 Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 7 9. ANÁLISIS DE RESULTADOS ............................................................................................. 61 9.1. Evaluación del efecto antinociceptivo producido por el diligustilido, el AAS, la indometacina y el diclofenaco en la prueba de contorsiones abdomionales en ratón. .. 61 9.2. Obtención y evaluación de las curvas dosis respuesta de diligustilido, AAS, indometacina y diclofenaco. ............................................................................................. 61 9.3. Obtención de las Dosis de Coadministración ........................................................ 62 9.4. Obtención y evaluación de las curvas dosis – respuesta y % de antinocicepción de las combinaciones. ............................................................................................................ 63 10. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 66 11. PROPUESTAS Y RECOMENDACIONES. ....................................................................... 67 12. BIBLIOGRAFÍA. ........................................................................................................... 68 Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 8 Índice de tablas Tabla Pág. Tabla 1. Características de los nervios periféricos. 20 Tabla 2. Pruebas de estímulo mecánico. 33 Tabla 3. Pruebas de estímulo térmico. 33 Tabla 4. Pruebas de estímulo químico. 34 Tabla 5. Dosis que fueron utilizadas para la obtención de las curvas dosis-respuesta de los fármacos. 44 Tabla 6. ABC y % Antinocicepción obtenidos para cada fármaco a las diferentes dosis evaluadas. 47 Tabla 7. Combinaciones diligustilido + AAS calculadas a partir de la DE30 en fracciones de 0.5 para cada fármaco. 53 Tabla 8. Combinaciones diligustilido + indometacina calculadas a partir de la DE30 en fracciones de 0.5 para cada fármaco. 53 Tabla 9. Combinaciones diligustilido + diclofenaco calculadas a partir de la DE30 en fracciones de 0.5 para cada fármaco. 53 Tabla 10. ABC y % Antinocicepción obtenidos para cada combinación a las diferentes dosis evaluadas. 54 Tabla 11. Análisis estadístico de la coadministración de Diligustilido + AAS. 58 Tabla 12. Análisis estadístico de la coadministración de Diligustilido + Indometacina. 59 Tabla 13. Análisis estadístico de la coadministración de Diligustilido + diclofenaco. 60 Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 9 Índice de figuras Figura Pág. Figura 1 Clasificación del dolor de acuerdo a sus características neurofisiológicas y a su temporalidad. 17 Figura 2 Esquema que representa el procesamiento de los mensajes nociceptivos. 18 Figura 3 Estructura química del AAS. 36 Figura 4 Estructura química de la Indometacina. 37 Figura 5 Estructura química del diclofenaco. 38 Figura 6 Ligusticum porteri. 39 Figura 7 Curso temporal obtenido con diligustilido en la prueba de contorsiones abdominales en ratón y % de Antinocicepción obtenido en cada dosis. 48 Figura 8 Curso temporal obtenido con AAS en la prueba de contorsiones abdominales en ratón y % de Antinocicepción obtenido en cada dosis. 49 Figura 9 Curso temporal obtenido con indometacina en la prueba de contorsiones abdominales en ratón y % de Antinocicepción obtenido en cada dosis. 50 Figura 10 Curso temporal obtenido con diclofenaco en la prueba de contorsiones abdominales en ratón y % de Antinocicepción obtenido en cada dosis. 51 Figura 11 Curvas Dosis Respuesta de AAS, indometacina, diclofenaco y diligustilido. 52 Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 10 Figura 12 Curso temporal obtenido con diligustilido + indometacina en la prueba de contorsiones abdominales en ratón y % Antinocicepción obtenido en cada dosis. 55 Figura 13 Curso temporal obtenido con diligustilido + indometacina en la prueba de contorsiones abdominales en ratón y % de Antinocicepción obtenido en cada dosis. 56 Figura 14 Curso temporal obtenido con diligustilido + diclofenaco en la prueba de contorsiones abdominales en ratón y % de Antinocicepción obtenido en cada dosis. 57 Figura 15 Isobolograma de la interacción existente entre el Diligustilido y el AAS en la prueba de contorsiones abdominales en ratón inducidas con ácido acético al 0.6%. 58 Figura 16 Isobolograma de la interacción existente entre Diligustilido e indometacina en la prueba de contorsiones abdominales en ratón inducidas con ácido acético al 0.6%. 59 Figura 17 Isobolograma de la interacción existente entre Diclofenaco y Diligustilido en la prueba de contorsiones abdominales en ratón inducidas con ácido acético 0.6%. 60 Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 11 1. RESUMEN El Ligusticum porteri, conocida comúnmente como hierba del oso, o chuchupate, es unaplanta que habita en climas templados a una altura de 2557 metros sobre el nivel del mar. Crece en Chihuahua y Durango, regiones donde es utilizada para el tratamiento de dolores de pulmón, estómago, reumáticos, de cabeza o cólicos en niños (Biblioteca Digital de la medicina Tradicional mexicana, 2009). La hierba del chuchupate es una planta de alrededor de 1 m de altura, de raíz gruesa y dura, hojas pequeñas y flores de forma esférica de color blanco y tamaño pequeño. En las raíces del chuchupate se han encontrado sustancias, tales como monoterpenos, lactonas y compuestos fenílicos. Uno de los cuales en años recientes fue objeto de estudio, en específico el compuesto llamado diligustílido, el cual arrojó resultados que mostraban efectos gastroprotectores importantes, atribuidos a una acción presumible sobre la síntesis de prostaglandinas y sulfuro de hidrógeno (Martínez, 2007). Con base a lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue determinar el potencial antinociceptivo del diligustilido sólo o combinado con antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) de uso común, y establecer si la coadministración del diligustilido con Acido Acetilsalicílico (AAS), indometacina y diclofenaco potencian el efecto analgésico de los AINEs, respecto a su administración de manera individual. Para cumplir con estos objetivos se llevó a cabo la prueba de contorsiones abdominales en ratón(Collier et al., 1967; Bartolini et al., 1991; Naidu et al., 2008) y se realizó una curva dosis-respuesta de cada fármaco a las dosis establecidas en la metodología. La disminución del número de contorsiones se interpretó como un efecto antinociceptivo. Cada experimento se llevó a cabo entre 21 y 25 °C (Collier et al., 1967). Para las coadministraciones entre AINEs y Diligustlilido, se les administró vía oral las combinaciones de fármacos obtenidas por el isobolograma, se determinó el % antinocicepción experimental y se calculó la DE30 experimental. Finalmente, con la ayuda del isobolograma se evaluó si el diligustilido potenciaba el efecto antinociceptivo de los AINEs. La potenciación se comprobó mediante la prueba t-Student, el índice de interacción y los intervalos de confianza. Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 12 La administración de los AINES como AAS, diclofenaco, indometacina y diclofenaco presentaron actividad antinociceptiva en la prueba de contorsiones abdominales, Finalmente, el diligustilido disminuyo el número de contorsiones abdominales de manera estadísticamente significativa (p < Hasta el momento, ésta es la primera evidencia de la que tenemos conocimiento que demuestra las propiedades antinopciceptivas del diligustilido. Los resultados muestran que en la combinación del diligustilido con los diferentes AINEs existió un efecto sinérgico en su actividad antinociceptiva en la prueba de contorsiones abdominales en ratón. Dando como consecuencia una reducción en la dosis efectiva de los AINEs al combinarse con el diligustilido. Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 13 2. INTRODUCCIÓN Entre los fármacos antiinflamatorios más utilizados a nivel mundial, se encuentran los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), los cuales cuentan con más de 50 variedades diferentes en el mercado. Son ampliamente prescritos para tratar enfermedades reumáticas u osteomusculares, pero también son consumidos sin prescripción para dolores y molestias menores (Rang et al., 2004). Así mismo, poseen una alta variedad de indicaciones de uso, que van desde los tratamientos de dolor agudo, hasta condiciones más crónicas, tales como la artritis reumatoide (Teeling et al., 2003) Los AINEs deben sus efectos antiinflamatorios, analgésicos y antipiréticos a la inhibición de la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX), dando como resultado la inhibición de la síntesis de prostaglandinas, las cuales son moléculas que se sintetizan a partir de fosfolípidos de membrana por la activación de la lipólisis y mediante la acción de la fosfolipasa A2 (PLA2) y fosfolipasa C (PLC), que llevan a la liberación de ácido araquidónico, principal precursor de prostaglandinas en mamíferos (Campbell y Halushka, 1996). Mientras que estos fármacos son agentes analgésicos eficaces, también presentan una serie de efectos secundarios serios, que son en parte debidos a la inhibición general de una variedad de productos de la COX (Stock et al., 2001). Entre los principales problemas clínicos reconocidos causados por los AINEs, se encuentran los daños gastrointestinales, como la úlcera péptica (Hawkey y Langman, 2003) y el sangrado gástrico. Hoy en día, los analgésicos antiinflamatorios no esteroideos disponibles ejercen un amplio número de efectos secundarios, esto ha llevado tanto a farmacólogos, como a farmacéuticos a la búsqueda de nuevos compuestos analgésicos (Golshani et al., 2004), los cuales ofrezcan menor número de problemas a la salud o que reduzcan los efectos secundarios de los fármacos existentes sin sacrificar su eficacia analgésica. Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 14 Golshani et al. (2004) sugiere que las plantas medicinales son una importante fuente de nuevas sustancias químicas con posibles efectos terapéuticos, por lo que el estudio de las especies vegetales que tradicionalmente han sido utilizadas como analgésicos, representan una estrategia de investigación lógica en la búsqueda de nuevos fármacos. Por esto, la exploración de nuevas alternativas ha llevado a los investigadores a mirar la medicina tradicional mexicana como una opción tangible, no solo para el tratamiento del dolor, sino para el alivio de un sin número de enfermedades, que desde siglos pasados han encontrado mejora en sus legendarias propiedades. Un claro ejemplo es la planta Ligusticum porteri o hierba del oso, a la cual se le atribuye un efecto analgésico en dolor de pulmón y estómago, no obstante, a la fecha no existen reportes científicos que validen o rechacen dicha actividad. Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 15 3. FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA 3.1. Dolor De acuerdo con la Organización Internacional para el estudio del Dolor (International Association for the Study of Pain, IASP), el dolor está definido como una experiencia sensorial y emocional desagradable, asociada a un daño tisular real o potencial que puede describirse en términos de la magnitud del daño (Merskey, 1979). Por ello, la palabra "dolor" y sus sinónimos más usuales se refieren a experiencias conscientes asociadas a lesiones o enfermedad, pero también se utilizan para describir el malestar relacionado con otros sentimientos desagradables (Perl R, 2007). Fisiológicamente, el dolor es un mecanismo de defensa, cuya función es proteger la integridad del organismo de agentes que pudieran dañarlo, sin embargo, si se presenta un funcionamiento anormal en las estructuras que se encargan de regular este mecanismo, el dolor adquiere características patológicas al sobrepasar su función. (Bowman y Rand, 1984). 3.1.1. Clasificación del Dolor La clasificación del dolor no ha sido fácil, debido a la gran cantidad de factores fisiológicos, anatómicos y psicológicos que lo originan, por lo que en la actualidad es un tema de debate entre clínicos e investigadores. (Turk y Okifuji, 1999). A pesar de ello, el dolor puede clasificarse de acuerdo a sus características neurofisiológicas y a su temporalidad en cuatro tipos (Woolf, 2004): Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 16a) Dolor Nociceptivo: Tiene la función de proteger al individuo de un posible daño provocado por un daño físico o estrés excesivo sobre algún tejido, su duración es de pocos segundos y no es necesario tratamiento médico. (Loeser y Melzack, 1999). b) Dolor Inflamatorio: Este tipo de dolor se origina por las sustancias que se liberan durante el proceso inflamatorio del tejido dañado. Trabaja como señal de alarma y tiene una función biológica protectora. Sus secuelas no son importantes y desaparecen con la lesión que lo originó. (Cervero y Laird, 1995). La mayoría de los pacientes no requieren cuidado médico, pues el dolor dura usualmente pocos días o algunas semanas. (Loeser y Melzack, 1999). c) Dolor Neuropático: Este tipo de dolor no cumple una función protectora, es un estado patológico originado por alguna enfermedad o daño al sistema nervioso. En el dolor crónico la intensidad del dolor sobrepasa la magnitud del daño y logra presentarse aún en ausencia de éste, así mismo, no es un proceso autolimitado y puede persistir por meses o años (Cervero y Laird, 1995). El dolor crónico produce secuelas en la calidad de vida del paciente, requiere tratamiento médico y a menudo éstos son poco eficaces. (Loeser y Melzack, 1999). d) Dolor Funcional: Este se presenta al existir una respuesta anormal en el funcionamiento del sistema nervioso central (SNC), ya que en el dolor funcional es imposible detectar un déficit neurológico o alguna anormalidad periférica que lo origine. Es espontáneo, de duración variable y en la mayoría de las veces es difícil de tratar (Woolf, 2004). Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 17 Figura 1. Clasificación del Dolor de acuerdo a sus características neurofisiológicas y a su temporalidad. (Modificado de Woolf, 2004). 3.2. Fisiología del Dolor 3.2.1. Nocicepción. La nocicepción se refiere a los mecanismos neurales por los cuales se detectan los estímulos nocivos y consta de 4 procesos fisiológicos: • Transducción: Es el proceso que explica la conversión de estímulos nocivos en señales eléctricas por las terminales nerviosas periféricas. • Transmisión: Propagación de las señales eléctricas a través de las vías nociceptivas. Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 18 • Modulación: Describe las alteraciones de las señales nociceptivas a lo largo de la vía nociceptiva. Dentro de esta se entrecruzan terminaciones nerviosas que liberan neurotransmisores que inhiben o amplifican la señal sensorial • Percepción: Se define como la integración de los impulsos nociceptivos con factores cognoscitivos y emocionales, creando la experiencia subjetiva del dolor. Figura 2. Esquema que representa el procesamiento de los mensajes nociceptivos. Para transmitir información nociceptiva la neurona debe ser selectiva, es decir, ser capaz de distinguir entre estímulos inocuos y nocivos (Hyman y Cassem, 1995). La función del sistema nociceptivo es detectar el daño, localizarlo e identificar el estímulo que lesionó al tejido. Para ello, existen dos características importantes de los nociceptores que consiste en detectar estímulos de alta intensidad que pudieran dañar el tejido y relacionar directamente la frecuencia de la descarga con la intensidad del estímulo (Besson, 1969). El axón periférico pertenece a una neurona monopolar que tiene la peculiaridad de emitir una proyección periférica y otra central. Su rama central penetra en las astas Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 19 posteriores medulares estableciendo la primera sinapsis mientras, que la rama periférica inerva piel, músculos y vísceras. El conjunto de cuerpos celulares de estas neuronas monopolares conforman el ganglio posterior o ganglio de la raíz dorsal (Rexet, 1952; Sorkin et al., 1997). El sistema nociceptivo comprende de la periferia a la médula espinal y de ahí a diferentes estructuras del tallo cerebral, siendo una estructura principal el tálamo, sitio de modulación que envía la información a la corteza cerebral, en la que se perciben las sensaciones. El dolor puede darse por la estimulación de los receptores del dolor o nociceptores en 3 zonas del cuerpo: piel, estructuras músculo-esqueléticas y vísceras. 3.2.2. Fibras aferentes primarias Los nervios cutáneos periféricos poseen una o varias clases de axones, que se clasifican dependiendo de su diámetro y su grado de mielinización en: Fibras Aβ, Aδ y C (Julius y Basbaum, 2001). (Tabla 1). • Fibras Aβ: Densamente mielinizadas, de diámetro grande. Tienen mecanoreceptores cutáneos que responden al tacto ligero y al estiramiento de los vellos. La actividad de estas fibras no produce dolor en sujetos normales. Normalmente actúan como mecanoreceptores de bajo umbral en la percepción táctil, pero que ante el proceso inflamatorio modifican su fenotipo convirtiéndose en fibras Aδ de alto umbral (Costigan y Woolf, 2000). Además, las fibras Aβ dan cambios en su patrón de inervación en el asta dorsal de la médula espinal, inervando láminas más superficiales (lámina II) permitiéndoles contribuir en el dolor inflamatorio y especialmente en la alodinia (Sawynok y Liu, 2003). • Fibras Aδ: Velocidad de conducción media, poco mielinizadas. Se clasifican funcionalmente en dos categorías de acuerdo a su temperatura de activación. Las fibras Aδ tipo 1, se activan a temperaturas mayores a 52°C, mientras que las fibras Aδ tipo II lo hacen a temperaturas mayores a 43°C. Ambos tipos responden a estímulos mecánicos (Caterina y Julius, 2001). Las fibras Aδ lo realizan en las láminas II y V (Sawynok y Liu, 2003). Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 20 • Fibras C: Velocidad de conducción lenta, amielinizadas (Bowman y Rand, 1984). Tienen nociceptores polimodales que responden a estímulos térmicos, mecánicos y químicos. Las Fibras C se clasifican anatómicamente en dos grupos: Fibras C peptidérgicas y fibras C no peptidérgicas. Las fibras C peptidérgicas contienen Sustancia P y el péptido relacionado al gen de la calcitonina; expresan el receptor tirosina cinasa A, responden al factor de crecimiento neural y son las responsables de la vasodilatación y extravasación plasmática durante el evento inflamatorio. Las fibras C no peptidérgicas expresan sitios de unión a isolectina B4 y a receptores purinérgicos P2X3; responden al factor neurotrófico derivado de la glía y se sugiere que son las responsables del establecimiento del estado de dolor crónico. Tanto las fibras C purinérgicas como las no purinérgicas expresan al receptor valinoide de potencial transitorio 1 (TRPV1) y son sensibles a capsaicina (Snider y McMahon, 1998; Hunt y Mantyh, 2001; Sawynok y Liu, 2003). Las Fibras C realizan sinapsis en las láminas I y II del asta dorsal de la médula espinal, principalmente. Tabla 1. Características de los nervios periféricos (Modificado de García y Herrero, 1998. Millan, 1999). Figura Tipo de fibra Velocidad de conducción (m/s) Diámetro (µm) Grado de mielinización Tipo de estímulo Aβ 30-100 > 10 ++++ Mecánico Aδ 12-30 2-6 ++ Mecánico Térmico C 0.5-2 0.4-1.2 Mecánico Térmico Químico Las terminales de los nociceptores aferentes primarios, al contactar neuronas en láminas específicas del asta dorsal, liberan glutamato y péptidos que activan neuronas de segundo orden (Ren et al., 1992; Ma y Woolf, 1995) Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 21 Los axones de estas neuronas cruzan al cuadrante anterolateralcontralateral para formar un tracto ascendente que termina en el tallo cerebral y varias áreas del tálamo, y subsiguientemente en varias regiones corticales. Como la corteza somatosensorial, corteza del cíngulo anterior y corteza insular. 3.2.3. Vías Ascendentes Las vías ascendentes se agrupan en dos sistemas generales: el sistema de columnas dorsales-lemnisco y el sistema contralateral (García y Herrero, 1998). El primero se integra por grandes fibras mielinizadas que transmiten información táctil no nociceptiva y de orientación espacial (Guyton y Hall, 1996). Las segundas se originan principalmente en las láminas I, IV, VII y X del asta dorsal de la médula espinal, que reciben generalmente aferencias de fibras Aδ y C (García y Herrero, 1998). Cuando salen del asta dorsal pasan al lado opuesto y ascienden por columnas laterales de la médula, terminando en diferentes alturas del tronco encefálico. Estas se dividen filigenéticamente en dos sistemas (Almeida et al., 2004): • Sistema Neoespinotalámico. Ocupa la región lateral del tallo cerebral y comprende los tractos espinotalámico y la vía postsináptica de la columna dorsal. • Sistema Paleoespinotalámico. Ocupa la región media del tallo cerebral. Integra los tactos espinotalámico medio, espinoreticular, espinomesencefálico, espinoparabraquioamigdaloide, espinoparabraquiohipotálamico y espinohipotálamico. (Almeida et al., 2004). Dentro de las dos vías principales involucradas en el dolor, se encuentran las que involucran al tracto espinotalámico y al tracto espinoparabraquial. • El tracto espinotalámico se origina principalmente de las láminas I y V, no obstante también salen fibras de las láminas II, IV, VI-VIII y X. Algunos autores, basándose en el origen y proyección de las fibras, describen tres vías de aferenciación para este tracto: • Vía Neoespinotalámica: monosináptica o tracto espinotalámico ventral. Proyecta directamente a los núcleos del complejo ventral del tálamo involucrados en el componente sensorial discriminativo del dolor (Dubner y Bennett, 1983). Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 22 • Vía multisináptica: paleoespinotalámica o tracto espinotalámico medio, Hace conexión con los núcleos intralaminar y posterior medial del tálamo involucrados en el componente afectivo-motivacional del dolor. • Vía espinotalámica monosináptica: Proyecta directamente al núcleo central medial del tálamo, involucrado en la parte afectiva de la experiencia dolorosa (Millan, 1999; Almeida et al., 2004). Estos sistemas ascendentes son los encargados de llevar la información nociceptiva hacia centros supraespinales, donde se generan la conciencia del dolor y su percepción mediante el paso de impulsos sensoriales que llegan a las áreas talámicas, corticales y límbicas, las cuales están involucradas en aspectos afectivos, sensitivos y cognositivos (Besson, 1969). Al aplicarse estímulos nocivos repetidos, los nociceptores disminuyen su umbral de activación, incrementan su respuesta a los estímulos o bien, inician la aparición de actividad espontánea (Levine et al., 1993). Estas manifestaciones son conocidas como sensibilización, puesto que un estímulo que antes era inocuo, ahora se percibe como doloroso, dando como resultado un estado de sensibilidad aumentada o hiperalgesia a un estímulo (Levine, 1996), en donde la hiperalgesia suele extenderse más allá del sitio de lesión (Dougherty y Willis, 1991). El fenómeno de sensibilización es inducido cuando se estimula constantemente y repetidamente una fibra C. En este fenómeno se incrementa la respuesta de las neuronas del asta dorsal, y la duración de la respuesta se sigue llevando a cabo aún después de eliminarse el estímulo periférico (Dickenson, 1990). 3.2.4. Tálamo y proyecciones corticales Cuando las vías aferentes primarias transmiten el impulso a las estructuras supraespinales, la experiencia dolorosa adquiere su carácter desagradable (percepción). Estudios muestran que el cerebro medio, el hipotálamo, el tálamo, el núcleo lentiforme, los cíngulos insular, prefontal, anterior y parietal, así como la corteza somatosensorial primaria y secundaria, son estructuras básicas en la percepción del dolor (Millan, 1999). De todas estas estructuras el tálamo es el centro principal de relevo de la información sensorial destinada a la corteza y sus núcleos son los que definen el procesamiento de esta información (Almeida et al., 2004). Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 23 El complejo nuclear lateral está integrado por los núcleos ventroposterolateral (VPL), ventroposteromerodial (VPM) y ventroposteroinferior (VPI). El complejo nuclear lateral recibe aferencias de los tractos espinocervical, espinorreticular, espinotalámico y espinoparabranquial (Almeida et al., 2004), sus neuronas poseen una organización somatotópica, proyectan a la corteza somatosensorial secundaria y son capaces de responder a estímulos térmicos y mecánicos. De estos núcleos, el llamado ventroposterolateral es reconocido como el centro somatosensorial de relevo debido a sus conexiones con la corteza somatosensorial primaria, que es la responsable de la localización e intensidad del dolor (Willis et al., 2001). Así mismo, el núcleo ventroposteromedial participa en el aspecto sensorial discriminativo del dolor y se relaciona con aspectos emocionales, autónomos y psicomotores pues sus fibras proyectan a la corteza prefrontal y se encuentran interconectadas con el hipotálamo, la amígdala y la sustancia gris periacueductal (PAG). También en este núcleo convergen fibras provenientes de la región parabraquial y del núcleo paratrigeminal (Li et al., 1997; Gauriau y Bernard, 2002; Almeida et al., 2004). El núcleo pulvinar oralis, el núcleo posterior (PO) y la división del núcleo ventromedial posterior (VmPO), son los elementos por los cuales está integrado el complejo posterior del tálamo, el cual recibe aferencias de los tractos espinohipotalámico, espinobraquial, espinotalámico y de la vía postsináptica de la columna dorsal. Éste establece un circuito reverberante con la corteza que recuerdan el circuito de retroalimentación existente entre el tálamo y la corteza, el cual se activa frente a estímulos nocivos (Roberts et al., 1992; Millan, 1999). Los núcleos ventromedial posterior y posterior forman parte del sistema nociceptivo medial estableciendo conexiones con la corteza insular y cingular, las cuales están involucradas en el componente afectivo-emocional del dolor. Así mismo, los núcleos responden a información térmica nociva y a estímulos mecánicos inocuos y nocivos (Yezierski, 1990; Treede et al., 1999). El complejo medial del tálamo está conformado por los núcleos intralaminar y medial dorsal (MDvc). El complejo medial del tálamo recibe aferencias de los tractos espinotalámico, y espinomescencefálico, y proyecta a la corteza del cíngulo, sugiriendo una contribución en aspectos afectivos-motivacionales del dolor. Así mismo se interconecta con estructuras responsables de respuestas y atención motoras como el Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 24 estriado y el cerebelo con lo que posiblemente participa en conductas de escape ante un estímulo nocivo (Millan, 1999). 3.2.5. Sistemas inhibidores de control descendente. De acuerdo a los distintos niveles de la transmisión del dolor, existen distintos sistemas de control endógeno que de manera constante modulan la transmisión de la información nociceptiva (Basbaum y Fields. 1984). En este caso, las vías descendentes permiten que el organismo responda a un estímulo nocivo facilitándolo o inhibiéndolo (modulación). La teoría de la compuerta de Melzacky Wall (1965) propone que la transmisión a nivel espinal del dolor, se encuentra bajo control segmental y supraespinal. En el primero los efectos inhibitorios son causados por la activación de fibras aferentes de gran diámetro Aα y Aβ que bloquean presinápticamente a nivel espinal el estímulo doloroso transmitido por las fibras de diámetro pequeño Aδ y C (Besson, 1997). Este efecto de inhibición está mediado por el ácido γ-aminobutírico (GABA) y por péptidos opioides endógenos (Besson y Chaouch, 1987). La PAG y el núcleo del rafé magno, a nivel supraespinal tienen una función importante en la modulación de la transmisión nociceptiva a nivel espinal (Basbaum y Fields, 1984). La PAG participa en la modulación y procesamiento del dolor. Su principal circuito intrínseco en una red GABAérgica tónicamente activa (Behbehani, 1995). En el núcleo del rafé magno existen tres tipos de células: las on-cells, o células de encendido; las off-cells o células de apagado y las neutral-cells o células neutrales, las cuales se proyectan hacia el trigémino y médula espinal a lo largo del funículo dorsolateral. Las on- cells facilitan las aferencias nociceptivas en la médula espinal, mientas que las off-cells tienen una aferencia inhibitoria tónica sobre éstas, y las neutral-cells no experimentan cambios (Fields, et al., 1991). Al estimularse la PAG se produce analgesia debido a que se excitan las off-cells y se inhiben las on-cells del núcleo del rafé magno, con lo que se bloquean las neuronas nociceptivas del asta dorsal y la respuesta nociceptiva de las fibras Aδ y C. Esto se conoce como “Teoría de la desinhibición” (Behbehani, 1995; Harris, 1996). Cuando el sistema de control supraespinal es activado por aferencia nociceptivas, éste se proyecta desde la corteza cerebral hacia la PAG, activándose los sistemas encefalinérgicos, serotonérgicos y noradrenérgicos, los cuales bloquen la transmisión a nivel espinal de la información nociceptiva (Fields, et al., 1991). Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 25 3.3. Mecanismos moleculares Un estímulo intenso que no daña el tejido da como resultado un dolor transitorio y localizado que no desencadena procesos de sensibilización y que dura pocos segundos. En el dolor transitorio participan receptores que responden a agentes químicos y físicos nocivos. Pertenecientes a estos receptores se tienen a los receptores de potencial transitorio, TRPV (Patapoutian et al., 2009); canales iónicos sensibles a ácido, ASICs y al canal TREK-1(Mercado et al., 2005; Bayliss and Barrett, 2008). Estos receptores en su totalidad son canales iónicos que despolarizan a la neurona (Costigan y Woolf, 2000; Scholz y Wolf, 2002). Sin embargo, cuando el estímulo es capaz de producir daño al tejido, un gran número de sustancias endógenas son liberadas en el sitio de lesión, éstas forman parte de la sopa inflamatoria, siendo capaces de sensibilizar o excitar las fibras aferentes primarias (Woolf y Costigan, 1999; Sawynok y Liu, 2003). En un principio, el daño producido a las células del tejido libera protones (H+) y ATP, despolarizando fibras aferentes primarias por medio de la activación de terminales que contienen canales sensibles a ácido y purínergicos (Costigan y Woolf, 2000). Las fibras aferentes primarias (principalmente fibras C) al ser activadas generan potenciales que liberan neuropéptidos como la sustancia P y el péptido relacionado al gen de la calcitonina (Wall y Devor, 1983; Willis, 1999). Estos péptidos despolarizan terminales nerviosas vecinas y causan vasodilatación y extravasación plasmática, así mismo promueven la secreción de varios mediadores inflamatorios provenientes de varios tipos celulares (Szolcsányi, 1988a; Costigan y Woolf, 2000). La migración de células al tejido dañado provoca la liberación de cuantiosos mediadores del dolor, entre ellos la serotonina que es liberada por plaquetas, células cebadas y endoteliales (Taiwo y Levine, 1992) de igual forma, las células cebadas son capaces de añadir histiamina, prostaglandinas y bradicinina a la sopa inflamatoria (Costigan y Woolf, 2000). Así mismo, los macrófagos liberan citocinas (Interleucina-1, interleucina-6 y el factor de necrosis tumoral-α) y factores de crecimiento (factor de crecimiento neural y factor inhibidor de la leucemia). Cada uno en su totalidad actúa sobre receptores específicos sensibilizando o despolarizando fibras aferentes primarias (Fajardo et al., 2001; Kidd y Urban, 2001). Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 26 La sensibilización periférica se presenta en un inicio por medio de la activación de diversas cinasas, que a su vez fosforilan diversas proteínas, entre las cueles se encuentran canales iónicos operados por ligando, que ocasionan un aumento de corrientes de Na+ y Ca2+, así como una disminución de corrientes de K+ (Gold, 1999; Millan, 2002). En seguida de estos cambios tempranos (segundos), se inician cambios transcripcionales (minutos) causados por la activación de proteínas cinasas que fosforilan factores de transcripción y neurotrofinas, como el factor de crecimiento neural, que se internaliza con su receptor de membrana TrkA al núcleo celular, donde se inician los cambios transcripcionales (Leslie et al., 1995). Estos cambios fortalecen la excitabilidad neuronal pues se aumenta la síntesis de moléculas implicadas en la transmisión nociceptiva como el péptido relacionado al gen de la calcitonina y la sustancia P (Apfel, 2000; Costigan y Wolf, 2000), las cuales afectan tanto a las fibras C como a las fibras Aβ y Aδ, modificando su fenotipo e inervación en el hasta dorsal (Woolf et al., 1992; Woolf y Salter, 2000; Sawynok y Liu, 2003). Dentro del asta dorsal de la médula espinal, un estímulo nocivo que no daña al tejido libera glutamato de las terminales centrales de las fibras aferentes primarias. El glutamato transmite el impulso nociceptivo por el receptor α-amino-3-hidroxi-5-metil-4- isoxazolpropionato (AMPA) que crea potenciales post-sinápticos excitatorios rápidos que señalan la duración, la intensidad y la localización del estímulo periférico nocivo y por lo tanto sirve como un sistema de advertencia al organismo (Woolf y Costigan, 1999). No obstante, al existir daño al tejido, los potenciales creados son más intensos y sostenidos por lo que también liberan neuropéptidos como la sustancia P y el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), que a su vez activan receptores post-sinápticos liberando múltiples cascadas de transducción (Michael et al., 1997; Costigan y Woolf, 2000; Khasabov et al., 2002). 3.4. Neurorreguladores Al generarse daño tisular e inflamación, el metabolismo y actividad de las fibras sensoriales son alteradas de manera importante por una gran variedad de mediadores, los cuales incluyen sustancias liberadas por el tejido dañado, sustancias de origen vascular, de fibras aferentes, de fibras simpáticas y diversas células inmunes. Su efecto consiste en activar o sensibilizar fibras aferentes generando cambios en la expresión y Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 27 estructura de canales iónicos y receptores de membrana. Todos estos cambios pueden producir alteraciones en la transcripción de genes e inducir a largo plazo alteraciones bioquímicas de las neuronas sensoriales (Dray, 1995). Los neurorreguladores juegan un papel importante en la comunicación celular nerviosa. Estos pueden subdividirse en neurotransmisores y neuromoduladores (Barchas et al., 1978). Los neurotransmisores llevan información entre células nerviosas adyacentes, mientras que los neuromoduladores aumentan o disminuyen la actividad de los neurotransmisores,afectando su síntesis, recaptura, biotransformación o unión al recepto (Barchas et al., 1978; Stimmel, 1983). 3.4.1. Principales neurorreguladores implicados en la respuesta del dolor. 3.4.1.1. Acetilcolina. Es el neurotrasmisor más abundante en el cuerpo y se encuentra en diversas regiones del SNC, principalmente en el hipocampo, núcleo caudado y núcleo supraóptico (Stimel, 1983). La acetilcolina interactúa con opioides estimulando su liberación a la médula espinal, lo cual produce antinocicepción en animales como en humanos (Chen y Pan, 2001). Así mismo, la administración de agonistas para receptores colinérgicos neuronales e inhibidores de la colinesterasa producen analgesia (Naguib y Yaksh, 1997). 3.4.1.2. Ácido γ aminobutírico (GABA) Se encuentra relacionado con un alto número de funciones fisiológicas en el cerebro y tejidos no neuronales (Watanabe et al., 2002), siendo el neurotransmisor inhibidor que se encuentra con mayor abundancia en el SNC. De los receptores GABA descubiertos hasta la fecha se encuentran 2 receptores ionotrópicos ligados a canales de cloro (GABAA y GABAC) (Stephenson, 1995; Watanabe et al., 2002), y uno metabotrópico (GABAB) acoplado a partir de proteínas G a canales de K+ (Bowery, 1993). Todos han sido relacionados con una acción analgésica a nivel espinal y supraespinal (Sawynok, 1987). Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 28 3.4.1.3. Bradicinina Pertenece al grupo de las cininas, es un péptido, no una enzima. Sus principales efectos son atribuidos a los receptores B1 y B2, que se encuentran acoplados a proteínas G. Al estimularse los receptores B2, Éstos activan a la PLA2 y PLC. La PLA2 estimula el incremento en la liberación de ácido araquidónico, que posteriormente es transformado en prostaglandinas; con este aumento la bradicinina se involucra en la liberación de otros mediadores del dolor tales como neurocininas, neuropéptidos, citocinas, CGRP, óxido nítrico, histamina y serotonina, que participan en procesos de vasodilatación, incremento de la permeabilidad vascular, extravasación plasmática, migración celular e hiperalgesia (Calixto et al., 2000). Por otro lado, por acción de la PLC se aumenta la concentración de calcio intracelular, que prolonga la sensación de dolor. 3.4.1.4. Dopamina Las neuronas dopaminérgicas existen en la sustancia negra, el tegumento ventral del cerebro medio, núcleo interpeduncular del mesencéfalo y el hipotálamo. Los mecanismos dopaminérgicos poseen un rol importante en la modulación del dolor ya que la dopamina administrada de forma intracerebral da un aumento en el efecto analgésico de la morfina (Stimmel, 1983). 3.4.1.5. Encefalinas, Endorfinas y Dinorfinas Todos estos péptidos son consideradas opioides endógenos. Los opioides poseen 5 tipos de receptores en las diferentes regiones del SNC: mu (µ), delta (δ), sigma (σ), kappa (κ) y épsilon (ε) (Terenius, 1985), siendo µ, κ y δ de mayor importancia. Los receptores µ son asociados con la analgesia espinal, la depresión respiratoria, euforia, relajación muscular, sedación y problemas de adicción. Por otro lado, los receptores κ producen analgesia espinal y disforia. Por último los receptores δ se involucran en el desarrollo de tolerancia, náusea, vómito y depresión respiratoria (Björkman, 1995). Los opioides endógenos al unirse a sus receptores acoplados a proteínas G producen analgesia (Reisine y Pasternak, 1996). La unión a receptores opioides inhibe la actividad de la adenilato ciclasa, reduciendo los niveles de AMPc (Andrade y Aghajanian, 1985), que Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 29 a su vez trae como consecuencia el cierre de canales Ca2+ y apertura de canales K+, llevando a una hiperpolarización que impide la liberación de neurotransmisores y por lo tanto, impide la transmisión del dolor (Duggan y North, 1983). Las endorfinas se encuentran en abundancia en el hipotálamo, el locus céruleo, el tálamo y la glándula pituitaria (Björkman, 1995). Las encefalinas se encuentran en la PAG, globo pálido, núcleo magno del rafé y en el núcleo reticular paragigantocelular. Así mismo, también se encuentran distribuidas en las láminas I, II, V, VII y X de la médula espinal, contribuyendo considerablemente en la modulación del dolor (Glazer et, al., 1981; Basbaum y Fields, 1984). 3.4.1.6. Factor de Crecimiento neural (NGF) Como respuesta al proceso de inflamación o daño tisular se sintetiza el NGF, que se une al receptor TrKA, que se expresa en nociceptores viscerales y estimula la liberación y regulación de varios péptidos, tales como la sustancia P y el CGRP (McMahon et al., 1994). La importancia del NGF radica en su contribución a la sobrevivencia de las células (Anand, 1995). 3.4.1.7. Aminoácidos excitatorios (AAE) El glutamato, aspartato y la homocisteína han sido clasificados como AAE pues se relacionan con una neurotransmisión excitatoria rápida (Wilcox, 1991). Estos AAE se encuentran en fibras aferentes primarias de diámetro grande (Aβ) y diámetro pequeño (Aδ), son liberados por estímulos nociceptivos y no nociceptivos (Kangrga y Rnadic, 1991), el glutamato posee mayor afinidad por receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA), pero también actúa sobre receptores de ácido α-amino-metil-isoxazolpropiónico (AMPA), kainato y metabotrópicos (Haley et al., 1990). Se ha involucrado al glutamato en la plasticidad neuronal (Collingridge y Singer, 1990) y en la tolerancia a opioides (Kolesnikov y Pasternak, 1999). Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 30 3.4.1.8. Histamina Puede encontrarse libre o en vesículas sinápticas (Stimmel, 1983). Ésta es liberada durante el proceso de desgranulación de células cebadas (Dray, 1995). La histamina activa receptores H1 (Mobarakeh et al., 2000) que producen un aumento en la entrada de calcio a la célula, y liberan neuropéptidos y cininas que ocasionan la amplitud de la señal dolorosa (Besson y Chaouch, 1987). 3.4.1.9. Noradrenalina Es almacenada en vesículas y se libera (Lefkowitz et al., 1996) por toda la via bulboespinal (Ruda et al., 1986). La noradrenalina se une a receptores α y β, siendo los receptores α adrenérgicos (Kuraishi et al, 1985), principalmente los α2 (Mansikka y Pertovaara, 1995; Galeotti et al., 1999), los que inhiben la nocicepción impidiendo la liberación de sustancia P (Kuraishi et al., 1985). 3.4.1.10. Óxido Nítrico (ON) Es sintetizado enzimáticamente (conversión de L-arginina a L-citrulina) en el SNC, por la sintasa de çoxido nítrico (SON) en respuesta a la activación de receptores NMDA (Garthwaite, 1991). Estos receptores provocan la apertura de canales Ca2+, aumentando la concentración intracelular de este ión. El Ca2+ entonces se une a la calmodulina, formando un complejo para que la óxido nítrico sintasa neuronal (nSON) lleve a cabo la síntesis de ON. El ON sintetizado activa a la guanilato ciclasa (GC), provocando un aumento en los niveles de GMPc y la activación de varias cinasas de proteínas (Moncada et al., 1989). El ON es un radical libre soluble en medios lipídicos y acuosos, lo cual le permite difundir rápidamente desde su lugar de síntesis hasta otros sitios (Schuman y Madison, 1994), por lo que se sugiere que juega un papel importante en la transmisión tanto a nivel del SNC como a nivel periférico (Sousa y Prado, 2001). Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 31 3.4.1.11. Prostaglandinas Las Prostaglandinas (PGs) junto con los leucotrienos y el tromboxano, pertenecen al grupo de los prostanoides (Abbadie y Besson, 1993). Las PGs son moléculas que se sintetizana partir de fosfolípidos de membrana por la activación de la PLA2 y PLC, llevando a la liberación de ácido araquidónico, principal precursor de prostaglandinas en mamíferos (Campbell y Halushka, 1996). Éste ácido después es transformado en varios intermediarios por la acción de la ciclooxigenasa 1 (COX1) o constitutiva, responsable de la biosíntesis de PGs importantes en la homeostasis la ciclooxigenasa (COX2) o inducible que aparece en respuesta al daño tisular (Vanegas y Schaible, 2001). Aunque Willoughby et al. (2000) en algunos estudios proponen una tercera isoforma, estas 2 son las más estudiadas. La liberación de prostaglandinas ocurre en la medula espinal y en la raíz ganglionar, ahí se unen a sus receptores, los cuales se encuentran acoplados a proteínas G y al ser activados inhiben canales de K+ y activan canales de Na2+ vía AMPc y PKA. Este mecanismo despolariza a las neuronas incrementando la velocidad de disparo, que a su vez favorece la liberación de aminoácidos excitatorios AAE, sustancia P y CGRP, así como PGs que juegan un papel importante en el desarrollo de la hiperalgesia y la alodinia (Vanegas y Schaible, 2001). 3.4.1.12. Protones Se producen en ciertos procesos como en la isquemia, hipoxia e inflamación. Producen dolor, espasmos musculares y en estados de enfermedad producen hiperalgesia, pues aumentan la permeabilidad de la membrana. Su participación en dolor es principalmente a través de la activación de fibras polimodales (Steen, et al., 1992; Dray, 1995). 3.4.1.13. Serotonina Es liberada por neuronas serotoninérgicas que se proyectan del núcleo del rafé a la PAG en vías ascendentes y hacia las láminas I, II, IV y V del asta dorsalen vías descendentes (Roberts 1984; Ruda et al., 1986). Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 32 3.4.1.14. Sustancia P Pertenece a la familia de las neurocininas, junto con la neurocinina A y el péptido relacionado al gen de la calcitonina, se une a los receptores NK1, NK2 y NK3. La sustancia P es un neurotransmisor que en las fibras aferente primarias es liberado por activación de fibras C y se encuentra involucrado en respuestas inflamatorias por daño tisular químico o térmico (Gamse 1984). 3.5. Modelos Experimentales de Dolor Los Modelos Experimentales de Dolor realizados en animales, llevan consigo un gran número de problemas éticos, filosóficos y técnicos, debido a que se aplican estímulos de alta intensidad en seres vivos. Por ello los investigadores deben de tener un protocolo minucioso del cómo y por qué se hará. Así mismo, se debe de informar de todos los pormenores para evitar el sufrimiento innecesario. Desde este punto de vista, los científicos tienen que seguir las recomendaciones dadas por la IASP (Zimmermann, 1983; Roberts, 1989), en las que se establece principalmente que todos los animales de experimentación no deberán ser vistos como objetos, sino como seres vivos con sensaciones, deben minimizarse el número de individuos a evaluar, así como resaltar la importancia-beneficio del estudio y que éste no sea invasivo. Hasta la fecha se encuentran un gran número de modelos experimentales de dolor, diseñados con la finalidad de determinar la actividad antinociceptiva de fármacos en animales de laboratorio o comprender el mecanismo de acción de éstos a nivel del sistema nervioso periférico y central. 3.5.1. Modelos de Dolor Fásico. Los modelos de dolor fásico son utilizados para el estudio del dolor somático, en ellos se estimula una superficie mínima y pueden clasificarse según la naturaleza del estímulo en 3: mecánicos, térmicos o eléctricos (Le Bars et al., 2001) Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 33 3.5.1.1. Pruebas de Estímulo mecánico. En estas pruebas se tiene la ventaja de poder graduar la intensidad o duración del estímulo, pero se tiene la desventaja de que no son específicos (Bianchi y Francheschini, 1954). Tabla 2. Pruebas de estímulo mecánico. Modelo Mecánico Ventajas Desventajas Randall-Selitto Presión sobre la pata Aplicación precisa del estímulo Requiere entrenamiento Filamentos de von Frey Aplicación precisa del estímulo Respuesta inestable Es laboriosa y requiere mucho tiempo 3.5.1.2. Pruebas de Estímulo Térmico Estos modelos utilizan como fuente de estimulación el calor. Su principal desventaja radica en el hecho de que activan las fibras nociceptivas de manera no sincronizada y lenta. Tabla 3. Pruebas de estímulo térmico Modelo térmico Ventajas Desventajas Retiro de la Pata Aplicación precisa del estímulo (Pata derecha vs pata izquierda). No requiere entrenamiento Respuesta inestable y tardada Retiro de la Cola Simple Respuesta inestable y tardada Plancha Caliente No requiere entrenamiento El animal puede desarrollar hiperalgesia Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 34 3.5.2. Modelos de Dolor Tónico Producen una estimulación dolorosa sostenida. Generalmente se utilizan para estos modelos que producen estímulos progresivos y largos, con los que se pueden medir el comportamiento del animal a través del tiempo (Le Bars et al., 2001). 3.5.2.1. Pruebas de Estímulo Químico Entre las más importantes destacan la prueba de contorsión abdominal (writhing) y la prueba de Formalina. La prueba de writhing es utilizada para identificar analgésicos o que pudieran tener potencial para tratar el dolor visceral (Ness y Gebhart, 1990). Por otro lado, la prueba de formalina es llevada a cabo principalmente en roedores, consistiendo en la administración subcutánea de formalinaen un rango de 0.5 al 10%, dada generalmente en la superficie dorsal de la pata posterior derecha. Tabla 4. Pruebas de estímulo químico. Modelo químico Ventajas Desventajas Contorsión Abdominal Sensible a analgésicos débiles Alta variabilidad Formalina Sensible a analgésicos opiáceos y no opiáceos. Curso temporal Bifásico Laborioso y tardado 3.5.2.1.1. Prueba de Contorsión Abdominal Consiste en la administración intraperitoneal de sustancias que irritan la membrana serosa, dando como resultado una curvatura del tronco, alternada por la extensión y flexión de las extremidades del animal (Naidu et al., 2008; Ness y Gebhart, 1990). El grado de dolor en este modelo se obtiene contando el número de contorsiones por unidades de tiempo (Siegmund et al., 1957). La prueba de contorsión abdominal es una clara manifestación de la respuesta visceromotora a la exposición de productos químicos algésicos. Dentro de las sustancias Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 35 más utilizadas que producen esta conducta encontramos a la benzoquinona, al ácido acético, ácido etacrínico, p-benzoquinona, fenilquinona, solución salina hipertónica, bradicinina, serotonina, cloruro de potasio, adenosin trifosfato, acetilcolina y sulfato de magnesio (Jaques, 1977). 3.6. Analgésicos Un analgésico es una sustancia que a través de su acción sobre el sistema nervioso central o en la periferia, sirve para abolir o reducir el dolor, sin producir inconsciencia (Levine et al, 1996) Los analgésicos utilizados comúnmente pueden clasificarse en dos grupos: analgésicos narcóticos u opioides, los cuales se emplean para el tratamiento del dolor intenso o crónico y analgésicos no narcóticos o antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) que se utilizan para tratar el dolor de leve a moderado (Kuhar y Pasternark, 1984). 3.6.1. Analgésicos Opioides El término opioide se aplica a toda sustancia endógena o sintética capaz de producir efectos similares a los de la morfina (Levine et al., 1996). Los analgésicosopioides pertenecen a varios subgrupos químicos, tales como los fenantrenos (morfina, codeína), fenilpiperidinas (butorfanol), fenilheptilaminas (metadona) y benzomorfanos (pentazocina). La mayor parte de estas sustancias se absorben en las superficies mucosas de la nariz o boca, de manera intramuscular y subcutánea, por lo que pueden administrarse por vía oral, parenteral o intratecal (Levine et al., 1996). Se unen a proteínas plasmáticas con afinidad variable y se distribuyen con una elevada concentración en el cerebro, hígado, riñón, bazo y pulmones. Son biotransformados por metabolismo hepático antes de ser excretados por riñón. Se unen a receptores µ, κ, δ, impidiendo la liberación de neurotransmisores y por ende, la transmisión del dolor (Duggan y North, 1983). La mayor parte de los analgésicos opiáceos son agonistas de los receptores µ, siendo los responsables de la mayoría de los efectos analgésicos y de algunos de sus efectos adversos. Así mismo, se sospecha que los receptores δ son más importantes en la periferia, mientras que los receptores κ Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 36 contribuyen a la analgesia en la médula espinal y podrían intervenir en la sedación y en la disforia. 3.6.2. AINEs Los AINEs son un grupo de fármacos con acciones farmacológicas similares, pero con estructura química diversa (Clive et al., 1998) Los AINEs llevan a cabo su acción farmacológica inhibiendo a la enzima ciclooxigenasa, lo que trae como consecuencia la reducción de la síntesis de prostaglandinas (PGs) y tromboxanos. La inhibición de la COX-2 es responsable en gran medida del efecto antiinflamatorio, analgésico y antipirético de los AINEs, y aunque la COX-1 también influye en la producción de prostaglandinas, su inhibición trae consigo efectos colaterales no deseados, tales como hemorragias digestivas y úlceras (Katzung, Bertram, 2007). 3.6.2.1. Ácido Acetilsalicílico El ácido acetilsalicílico (AAS) fue uno de los primeros fármacos sintetizados y es en la actualidad uno de los AINEs más utilizados por la población en general. Pertenece a la familia de los salicilatos, por lo que tiene la capacidad de acetilar proteínas. Figura 3. Estructura química del AAS. Al ser un ácido débil, se encuentra en forma no ionizada en el ambiente ácido del estómago, absorviendose por esta razón en mayor parte en el íleon. Produce una inactivación irreversible de la ciclooxigenasa e inhibe la agregación plaquetaria. Es administrado vía oral y se absorbe rápidamente, llevándose a cabo el 75% de su metabolismo por el hígado. Su eliminación a dosis bajas sigue una cinética de primer orden. Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 37 El AAS es utilizado comúnmente para combatir la fiebre, la intensidad de dolory la inflamación, así como, uricosúrico y antiagregante plaquetario. A pesar de ser ampliamente utilizado, posee efectos adversos importantes, pues provoca con frecuencia hemorragias gástricas, así como irritación gástrica, náuseas, vómito, entre otras. 3.6.2.2. Indometacina Es un derivado indólico metilado. Constituye un potente inhibidor de la ciclooxigenasa. Desacopla la fosforilación oxidativa a concentraciones supraterapéuticas y deprime la síntesis de los mucopolisacáridos. Se absorbe en forma rápida y casi completa por vías intestinales. El 90% del fármaco se liga a proteínas plasmáticas y tejidos. Del 10 al 20% se excreta en orina. Figura 4. Estructura química de Indometacina La indometacina como los salicilatos, posee actividad antipirética, analgésica y antiinflamatoria. Es utilizado en casos de inflamación reumatoide y no reumatoide. Puede utilizarse para suprimir las contracciones uterinas durante el trabajo de parto y para el control de la insuficiencia cardiaca en neonatos (Goodman & Gilman, 1996). Entre sus efectos adversos produce insuficiencia renal, citopenia, hiperbilirrubinemia y complicaciones gastriontestinales como anorexia, náusea y dolor abdominal, así como perforaciones y hemorragias. 3.6.2.3. Diclofenaco El diclofenaco es un derivado fenilacético. Es un inhibidor de la ciclooxigenasa y posee mayor potencia que la indometacina y naproxeno. Disminuye las concentraciones Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 38 intracelulares de ácido araquidónico libre. Se absorbe de forma rápida y completa y es metabolizado en el hígado. Se liga en un 99% a proteínas plasmáticas (Goodman & Gilman, 1996). Figura 5. Estructura química de diclofenaco. Posee actividad analgésica, antiinflamatoria y antipirética. Es utilizado para el tratamiento a largo plazo de la artritis reumatoide y osteoartritis. Sus efectos adversos en vías gastrointestinales son los más habituales, observándose hemorragias, úlceras o perforaciones de la pared intestinal. 3.6.3. Diligustilido La Ligusticum porteri, conocida comúnmente como hierba del oso, raíz del cochino o chuchupate, es una planta de origen desconocido, que habita en climas templados a una altura de 2557 metros sobre el nivel del mar. Se encuentra asociada a pastizales y bosques de encino-pino, crece en Chihuahua y Durango, regiones donde es utilizada para el tratamiento de dolores de pulmón, estómago, reumáticos, de cabeza o cólicos en niños (Biblioteca Digital de la medicina Tradicional mexicana, 2009). Pero también posee una gran aceptación en los tratamientos de afecciones en el sistema respiratorio e infecciones bacterianas, así como; dolor asociado a principios de ulceración. La hierba del cochino es una planta de alrededor de 1 metro de altura, de raíz gruesa y dura, hojas pequeñas y flores de forma esférica de color blanco y tamaño pequeño, las cuales nacen del centro del tallo de la planta y las cuales al llegar a su madurez se tornan de color amarillo. Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 39 Figura 6. Ligusticum porteri En las raíces del chuchupate se han encontrado diversas sustancias, tales como monoterpenos, lactonas y compuestos fenílicos. Uno de los cuales en años recientes fue objeto de estudio, en específico el compuesto aislado llamado diligustílido, el cual arrojó resultados que mostraban efectos gastroprotectores importantes, atribuidos a una acción presumible sobre la síntesis de prostaglandinas y sulfuro de hidrógeno (Martínez, 2007). Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 40 4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA En la actualidad, entre los fármacos más ampliamente usados se encuentran los AINEs, los cuales son utilizados como antipiréticos, antiinflamatorios o para tratar determinados tipos de dolor. Sin embargo, su uso trae consigo efectos adversos tales como dispepsia, diarrea, algunas veces estreñimiento, náuseas y vómito. Ya en casos de consumo crónico producen gastritis aguda, úlcera péptica o perforaciones gástricas y duodenales. Cifras revelan que el 80% de la población mundial en vías de desarrollo han presentado un episodio de gastritis, ya sea por la bacteria Helicobacter pylori o por consumo de medicamentos, en especial por AINEs. Así mismo, las cifras por esta enfermedad han aumentado tanto que en 2003 se incluyó éste padecimiento en los casos nuevos bajo vigilancia epidemiológica, de registro obligatorio para instituciones públicas (ISSSTE, 2005). Por otra parte, la úlcera péptica ocupa del 5 al 20% de incidencia en pacientes mexicanos que utilizan AINEs de manera crónica o en dosis altas, tales como piroxicam, ketorolaco, ketoprofeno, diclofenaco e indometacina; o en dosisbajas, como el Ácido acetilsalicílico (AAS) (Raña, 2009). Por ello, la búsqueda de nuevos fármacos que disminuyan estos efectos adversos sin sacrificar su eficacia resulta de interés, y una buena alternativa es el uso de compuestos extraídos de plantas medicinales mexicanas, que han sido usadas desde épocas ancestrales y parecen tener un potencial terapéutico no muy bien aprovechado en la actualidad. Entre estas se encuentra la hierba del oso (Ligusticum porteri), en específico un compuesto de ésta llamado Diligustilido, el cual demostró tener efecto gastroprotector. Por esta razón, el objetivo del presente trabajo fue determinar si el diligustilido poseía efecto antinociceptivo y si este efecto era potenciado con algunos AINEs de uso común. Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 41 5. HIPÓTESIS. Si el Diligustilido posee propiedades antinociceptivas y además potencia el efecto antinociceptivo de los AINEs, entonces será un buen candidato para reducir los efectos adversos gastrointestinales que se presentan con el consumo de los AINEs, debido a que es un fármaco gastroprotector por sí solo y en combinación reduciría la dosis necesaria de los AINEs para aliviar el dolor. 6. OBJETIVOS. 6.1. Objetivo general. • Determinar el potencial antinociceptivo del diligustilido sólo o combinado con Ácido acetilsalicílico, Indometacina y Diclofenaco. 6.2. Objetivos particulares. • Determinar el efecto antinociceptivo del diligustilido.en la prueba de contorsión en ratón. • Establecer si la coadministración del diligustilido con AAS, indometacina y diclofenaco potencia el efecto analgésico de los AINEs, respecto a su administración de manera individual en la prueba de contorsiones en ratón. Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 42 7. MATERIAL Y MÉTODOS 7.1. Material • Cilindros de acrílico transparente de 20 cm de diámetro y 30 cm de altura. • Cronómetro CASIO HS-70. • Contador manual metálico AUXILAB. • Cánula para administración oral. • Jeringas TERUMO® de tuberculina con tapa de rosca de 1cm3 de capacidad. • Frascos de vidrio de 4 mL de capacidad. • Frascos de vidrio de 7 mL de capacidad. • Frascos de vidrio de 25mL de capacidad. • Vortex Genic 2 Scientific Industries. • Balanza analítica OHAUS. • Sonicador Cole-Parmer. • Campana de extracción. • Calentador Pelonis. • Termómetro con escala de 0 a 100°C. • Espátula. • Brocha. Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 43 7.2. Animales Se utilizaron ratones swiss machos de 20 a 30 g de peso provenientes del CINVESTAV (Sede Sur), que se trataron según la NOM-162-ZOO-1999 (Especificaciones técnicas para la producción, cuidados y usos de animales de laboratorio) y a las guías sobre aspectos éticos para la investigación del dolor experimental en animales (Zimmermann, 1983). Los animales se colocaron en cajas de acrílico y se privaron 24 horas de alimento, teniendo libre acceso al agua. Cada grupo de trabajo fue formado de 6 a 8 ratones. 7.3. Reactivos En el estudio se utilizaron los siguientes reactivos: • Indometacina grado reactivo marca Sigma-Aldrich. • Diclofenaco sódico grado reactivo marca Sigma-Aldrich. • Ácido acetilsalicílico grado reactivo marca Sigma-Aldrich. • Diligustilido obtenido en el laboratorio 126 del edificio “E”, de la Facultad de Química de la Universidad Nacional Autónoma de México, y donado por el Dr. Andrés Navarrete Castro. • Ácido acético glacial grado reactivo marca Sigma-Aldrich. • Tween 80 grado reactivo marca Sigma-Aldrich. • Solución isotónica de cloruro de sodio Abbott®. 7.4. Preparación de fármacos y el vehículo. El vehículo utilizado se preparó con Tween 80 al 10% v/v en solución isotónica de cloruro de sodio. Los fármacos y el diligustilido se disolvieron en este vehículo a las dosis requeridas. Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 44 7.5. Preparación del ácido acético al 0.6%. El ácido acético glacial, inductor de las contorsiones abdominales, se preparó en Solución isotónica de cloruro de sodio en una razón de 0.6% v/v. 7.6. Metodología Para determinar el efecto antinociceptivo de los fármacos se llevó a cabo la prueba de contorsiones abdominales en ratón y se realizó una curva dosis-respuesta de cada fármaco a las dosis mostradas a continuación: Tabla 5. Dosis que fueron utilizadas para la obtención de las curvas dosis-respuesta de los fármacos. Fármacos Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3 Dosis 4 (mg/Kg) Ácido Acetlsalicílico 35 75 150 300 Diclofenaco 0.3 1 3 10 Diligustilido 1 3 10 30 Indometacina 0.3 3 10 30 Estas dosis fueron diluidas en el vehículo descrito anteriormente. A cada grupo de 6 a 8 ratones se administró la dosis vía oral por medio de una cánula de metal para ratón, en una razón de 10 mL/Kg de peso. 7.7. Prueba de contorsión en ratón Posteriormente se colocó cada ratón en un cilindro de acrílico trasparente (pexiglas) de 20 centímetros de diámetro y 30 centímetros de altura durante 30 minutos. Esto con la finalidad de que se adaptaran a su entorno y se absorbiera y distribuyera el fármaco. Después se retiró a cada ratón del cilindro y se les administró el ácido acético al 0.6% a razón de 0.1mL/10g de peso vía intraperitoneal e inmediatamente después se contó la conducta nociceptiva como el número de contorsiones evocadas cada 5 minutos durante 30 minutos (Collier et al., 1967; Bartolini et al., 1991; Naidu et al., 2008). Las Efecto sinérgico entre antiinflamatorios no esteroideos y diligustilido en la antinocicepción visceral en ratón. 45 cuales se caracterizan por una curvatura del tronco y extensión de las extremidades (Naidu et al., 2008). La inyección fue en un ángulo de 45°, para asegurar que se aplicara en el lugar correcto y evitar daños en órganos vitales. La disminución del número de contorsiones se interpretó como un efecto antinociceptivo. Cada experimento se llevó a cabo entre 21 y 25 °C (Collier et al., 1967). 7.8. Combinaciones de dosis Se calculó el área bajo la curva de cada dosis sumando el número total de contorsiones evocadas por el ratón en los 30 minutos. Se obtuvo la curva dosis-respuesta de indometacina, AAS, diclofenaco y diligustílido. Con las curvas dosis-respuesta se calculó el porciento de antinocicepción y se obtuvieron las DE30 de cada fármaco. En seguida, se construyeron los isobologramas para la coadministración de diligustilido+indometacina, diligustilido+AAS y Diligustilido+diclofenaco en una proporción 1:1. Posteriormente se les administró vía oral las combinaciones de fármacos obtenidas por el isobolograma, y se determinó el % antinocicepción experimental y se calculó la DE30 experimental. Finalmente, con la ayuda del isobolograma se evaluó si el diligustilido producía sinergismo en el efecto antinociceptivo de los AINEs. El sinergismo se comprobó mediante una prueba t-Student, el índice de interacción y los intervalos de confianza. 7.9. Análisis estadístico Los resultados se expresaron como el promedio ± el error estándar de la media de cada grupo experimental conformado por al menos seis ratones. Se construyeron curvas del promedio del número de contorsiones en función del tiempo en minutos. Se calculó el área bajo la curva (ABC) y el % de antinocicepción (% de antinocicepción = (1- (ABCFármaco/ABCVehículo) x 100) en los cursos temporales (Tallarida y Muray, 1987). Las curvas dosis-respuesta se ajustaron por regresión lineal empleando el método de los mínimos cuadrados. La dosis efectiva treinta (DE30) y su error estándar de la media fueron calculados de acuerdo a lo
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