Estudio-de-la-acetilacion-del-alginato-producido-por-la-cepa-mutante-AT6-de-azotobacter-vinelandii-no-productora-de-poli--hidroxibutirato-en-cultivos-continuos

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas 
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA 
 
 
ESTUDIO DE LA ACETILACION DEL ALGINATO PRODUCIDO POR LA CEPA 
MUTANTE AT6 DE Azotobacter vinelandii NO PRODUCTORA DE POLI β-
HIDROXIBUTIRATO EN CULTIVOS CONTINUOS. 
 
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
Maestro en Ciencias 
 
PRESENTA: 
QBP. ALMA LUCERO JIMÉNEZ PATIÑO 
 
DIRECTOR DE TESIS: 
Dr. CARLOS F. PEÑA MALACARA, IBT UNAM 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR 
Dr. DANIEL SEGURA GONZÁLEZ, IBT UNAM 
Dr. MAURICIO A TRUJILLO ROLDAN, IIB UNAM 
 
 
CUERNAVACA, MORELOS. JULIO, 2015 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
El presente proyecto fue desarrollado en el 
departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis del 
Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional 
Autónoma de México, bajo la dirección del Dr. Carlos 
F. Peña Malacara, en el grupo del Dr. Enrique 
Galindo. 
Durante la realización de este proyecto se contó con 
el apoyo de beca de maestría (355895) otorgada por 
el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología 
(CONACyT) y el financiamiento del Programa de 
Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación 
Tecnológica de la Universidad Nacional Autónoma 
de México (PAPIIT-UNAM) a través del proyecto 
IT100513. 
 
 
 
NDICE Página 
Índice de figuras…..………………………………….……………………………. iv 
Índice de tablas.……………………………………………………………….…… vi 
Nomenclatura……………………………………………………………………….. vii 
RESUMEN….……………………………………………………………………..… viii 
1 INTRODUCCIÓN………………………………………………………..…… 1 
2 ANTECEDENTES.…………………………………………………………… 3 
 2.1 GENERALIDADES…………………………..…………….………..…. 3 
 2.1.1 Estructura y propiedades del alginato…………………….…. 3 
 2.1.2 Aplicaciones comerciales…………….………….……..……... 5 
 2.1.3 Azotobacter vinelandii…………………………………..……... 7 
 2.1.4 Síntesis de alginato………………..………………….……..… 7 
 2.1.5 Síntesis de poli-(3-hidroxibutirato)…………………………… 12 
 2.1.6 Localización y regulación de los genes estructurales de la 
biosíntesis de alginato y PHB en A. vinelandii…..…………. 
 
12 
 2.2 PRODUCCION DE ALGINATO POR A. vinelandii…………..…..... 14 
3 HIPÓTESIS……………………………………..…………………….....…… 19 
4 OBJETIVOS………………………………………………………………..... 19 
5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL………………………………………..… 20 
6 MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………….…….... 22 
 6.1 Cepas de trabajo……………………………………………..………... 22 
 6.2 Medio de cultivo………………………………………..……………… 22 
 6.3 Sistemas de cultivo…………………………………..………….…… 23 
 6.4 Métodos analíticos…………………………………………………..…. 26 
 
 
ii 
 
 ÍNDICE 
 
Página 
7 RESULTADOS Y DISCUSIÓN...………………………………………….. 31 
 CAPITULO 1. Cultivos en matraces agitados 
 7.1 Cultivos desarrollados en matraces agitados bajo condiciones de 
fijación de nitrógeno …………………………………………………. 
 
31 
 CAPITULO 2. Cultivos en biorreactores 
 7.2 Cultivos desarrollados a 1 % de TOD y 300 rpm……………..….… 35 
 7.2.1 Control de TOD y perfiles de VTO………………………….. 35 
 7.2.2 Cinética de crecimiento y producción de alginato………… 36 
 7.3 Cultivos continuos desarrollados a 1 % de TOD y D= 0.04 h-1….... 43 
 7.3.1 Control de la tensión de oxígeno disuelto (TOD)...…….…. 44 
 7.3.2. Control de la velocidad específica de crecimiento (µ)...….. 44 
8 CONCLUSIONES…………………………..…………………………..…..... 48 
9 PERSPECTIVAS…………………………………………..……………..….. 49 
10 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………..…. 50 
 
iii 
 
 ÍNDICE DE FIGURAS Página 
 
Figura 2.1 
 
Ácido β-D manurónico y α-L-gulurónico….……………..………. 3 
Figura 2.2 Estructura del alginato producido por A. vinelandii……..……… 4 
Figura 2.3 Estructura del alginato algal y alginato microbiano.………….… 5 
Figura 2.4 Ruta de síntesis del alginato y PHB en A. vinelandii………….... 9 
Figura 2.5 Modificaciones del alginato sintetizado por A. vienlandii....….. 11 
Figura 2.6 
 
 
Organización y modelo de regulación de los genes de 
biosíntesis de Alginato y PHB en A. vinelandii…………..…….... 14 
Figura 2.7 
 
 
Relación entre el grado de acetilación del alginato y el contenido 
de PHB en A. vinelandii…………………………………………….. 
 
18 
Figura 2.8 
 
Inserción del mini transposón Tn5 en el gen phbB de A. 
vinelandii…….………………………………………………………. 
 
 
19 
 
Figura 5.1 
 
Estrategia experimental………………………………………….... 22 
Figura 6.1 
 
 
 
 
Principio de operación del sistema de monitoreo de la actividad 
respiratoria (RAMOS) y los parámetros obtenidos a través de la 
medición en línea…………………………………………………. 
 
 
31 
Figura 7.1 
 
 
 
 
 
Cinética de crecimiento con base en proteína (a), consumo de 
glucosa (b) y evolución del pH (c) para la cepa ATCC 9046 y 
AT6 de A. vinelandii, en cultivos en matraces agitados a 200 
rpm, bajo condiciones de fijación de nitrógeno………………… 
 
 
 
 
 
33 
Figura 7.2 
 
 
 
Grado de acetilación del alginato obtenido por las cepas ATCC 
9046 y AT6 de A. vinelandii en cultivos en matraces agitados a 
200 rpm, bajo condiciones de fijación de nitrógeno…………… 
 
 
 
35 
Figura 7.3 
 
 
Control de la TOD y perfil de VTO de cultivos en lote para las 
cepas ATCC 9046 y AT6 de A. vinelandii………..…………….. 
 
37 
iv 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 ÍNDICE DE FIGURAS Página 
Figura 7.4 
 
 
 
Cinética de crecimiento con base en proteína y consumo de 
glucosa para las cepas ATCC 9046 y AT6 de A. vinelandii en 
cultivos lote desarrollados a 1 % de TOD……………….….….. 
 
 
 
38 
Figura 7.5 
 
 
Grado de acetilación del alginato producido por las cepas ATCC 
9046 y AT6 de A. vinelandii en cultivos lote a 1 % de TOD..….. 
 
40 
Figura 7.6 
 
 
Posible distribución del acetil-CoA en la cepa AT6 de A. 
vinelandii en cultivos lote a 1 % de TOD……………………... 
 
43 
Figura 7.7 
 
 
 
 
Control de TOD durante el estado estable en cultivos continuos 
a 1 % de TOD y D= 0.04 h-1 para las cepas ATCC 9046 y AT6 
de A vinelandii…………….……………………………………..….. 
 
 
45 
Figura 7.8 
 
 
 
Cinética de crecimiento con base en proteína y consumo de 
glucosa para las cepas ATCC 9046 y AT6 de A vinelandii en 
cultivos continuos a 1 % de TOD y 0.04 h-1………………..……. 
 
 
 
46 
v 
 
 
 
 
 
 
 
 ÍNDICE DE TABLAS Página 
Tabla 2.1 
 
Aplicaciones del alginato en diferentes sectores industriales…. 6 
Tabla 2.2 
 
 
Factores que alteran el grado de acetilación del alginato 
producido por A. vinelandii……..…….………………..…………. 16 
Tabla 6.1 
 
 
Valores de las constantes P,I y D del Controlador Digital 
Universal UDC 1200 MCRO PRO……………..…...….………. 
 
25 
Tabla 7.1 
 
 
 
Parámetros cinéticos de los cultivos en matraces agitados 
para la cepas ATCC 9046 y AT6 de A. vinelandii, bajo 
condiciones de fijación de nitrógeno…………………………… 
 
 
 
34 
Tabla 7.2 
 
 
Parámetros cinéticos y estequiométricos para la cepas ATCC 
9046 y AT6 de A. vinelandii en cultivos en lote a 1% TOD…… 
 
38 
Tabla 7.3 
 
 
 
Consumo específico de oxígeno (qO2), producción y 
rendimientos de alginato para las cepas ATCC 9046 y AT6 de 
A. vinelandii en cultivos desarrollados en lote a 1 % de TOD….. 
 
 
39 
Tabla 7.4 
 
 
 
 
 
Velocidad máxima de transferencia de oxígeno (VTO) y 
consumo específico de oxígeno (qO2) para las cepas ATCC 
9046 y AT6 de A. vinelandii en cultivos desarrollados en 
matraces agitados…………………………………………………. 
 
 
 
 
41 
Tabla 7.5 
 
 
 
Parámetros estequiométricosde cultivos continuos 
controlando la TOD a 1 % y D=0.04 h-1 para las cepas ATCC 
9046 y AT6 de A. vinelandii………………………………………. 
 
 
 
47 
vi 
 
NOMENCLATURA 
 
 
D Tasa de dilución (h-1) 
F Velocidad de flujo de la solución de nutrientes (L h-1) 
KLa Coeficiente de transferencia de oxígeno por unidad de área (h-1) 
qs Velocidad específica de consumo de sustrato (gglu gprot-1 h-1) 
qO2 Velocidad de consumo específico de oxígeno (mmolO2 gprot-1 h-1) 
R Constante de gases ideales (bar L mol-1h-1) 
T Temperatura (°C) 
TOD Tensión de oxígeno disuelto (%) 
V Volumen de cultivo constante (L) 
VL Volumen de líquido (L) 
VG Volumen de gas (L) 
VTO Velocidad de transferencia de oxígeno (mmol L-1 h-1) 
X Concentración de biomasa medida como proteína (g L-1) 
Y x/s Rendimiento de proteína con base en sustrato (gpro gglu-1) 
Y p/s Rendimiento de producto con base en sustrato (galg gglu-1) 
Y p/x Rendimiento de producto con base en proteína (galg gpro-1) 
ΔpO2 Diferencial de presión parcial de oxígeno (bar) 
Δt Diferencial de tiempo de la fase de medición (h) 
µ Velocidad específica de crecimiento (h-1) 
 
 
 
 
 
vii 
 
RESUMEN 
El alginato es un polímero compuesto por unidades de ácido β-D-manurónico (M) y α-L-gulurónico 
(G), se utiliza en industrias como la farmacéutica, médica, textil y alimentaria debido a sus 
propiedades gelificantes y viscosificantes, estas propiedades se ven afectadas por el peso 
molecular, la relación G/M y el grado de acetilación del polímero, siendo esta última una 
característica única del alginato bacteriano. La acetilación de los residuos manurónicos mejora 
las propiedades gelificantes y viscosificantes del polímero, incrementando su valor comercial 
principalmente en el área médica. Estudios recientes revelan que la tensión de oxígeno disuelto y 
la velocidad específica de crecimiento afectan el grado de acetilación del polímero sintetizado por 
Azotobacter vinelandii (Castillo et al., 2013a). En este trabajo se encontró que, el mayor grado de 
acetilación correspondía con una menor producción de poli-β-hidroxibutirato (PHB) y dado que 
ambos procesos involucran al acetil-CoA como precursor, se relacionó el grado de acetilación del 
alginato con la producción de PHB, pero la relación bioquímica de estos procesos aún no es clara. 
Por lo anterior, este trabajo empleó la cepa mutante AT6 de A. vinelandii, no productora de PHB, 
para evaluar el efecto de la eliminación de ésta vía sobre el grado de acetilación de alginato. El 
estudio fue desarrollado en tres etapas. En la primera etapa, los cultivos a nivel de matraz 
permitieron confirmar que los cultivos bajo condiciones de fijación de nitrógeno propuesto para 
este estudio permitirían desarrollar los cultivos sin problemas de crecimiento. En la segunda etapa, 
los cultivos en biorreactor desarrollados a 1 % de TOD revelaron que, no existen diferencias 
significativas en el comportamiento cinético de crecimiento entre la cepa silvestre ATCC 9046 y la 
cepa mutante AT6 de A. vinelandii. Sin embargo, los rendimientos en la producción de alginato y 
el consumo específico de oxígeno fueron mayores en la cepa mutante que en la cepa silvestre, 
mientras que, el grado de acetilación del alginato fue similar entre ambas cepas (1.39 ± 0.08 % 
para la cepa ATCC 9046 y 1.45 ± 0.39 % para la cepa AT6). Estos resultados sugieren que la 
distribución de carbono en la cepa mutante AT6 favorece la producción de alginato y que además, 
gran parte del acetil-CoA se dirige principalmente hacia el metabolismo respiratorio en lugar de 
dirigirse al proceso de acetilación. Finalmente, en la tercera etapa se realizaron cultivos continuos 
controlando la TOD a 1 % y la velocidad específica de crecimiento a 0.04 h-1, en donde se esperaba 
que el flujo de carbono favoreciera la producción y acetilación de alginato en la cepa AT6. Sin 
embargo, los valores obtenidos en relación al grado de acetilación producido por la cepa AT6 
parecen indicar que, el bloqueo de la síntesis de PHB no favorece el proceso de acetilación. No 
obstante, es necesario evaluar la expresión de los genes y/o la actividad de las enzimas 
involucradas en el proceso de acetilación para lograr comprender los mecanismos que lo 
controlan. 
 
 
1.- INTRODUCCIÓN 
El alginato es un biopolímero lineal constituido por monómeros de ácido -D-
manurónico y su epímero el ácido -L-gulurónico unidos por enlaces  1-4. Las 
propiedades gelificantes y viscosificantes que presenta este compuesto dependen de 
la longitud y de la distribución de estos monómeros (Moe et al., 1995; Sabra et al., 
2001). Debido a sus características, el alginato presenta un amplio rango de 
aplicaciones tanto médicas como industriales, por ejemplo como un agente 
estabilizante, gelificante y espesante en la producción de alimentos o para la 
inmovilización de células en la industria biotecnológica (Pawar y Edgar, 2012). 
Este exopolisacárido es sintetizado por algas marinas del grupo de las feofitas y por 
algunas especies bacterianas, entre ellas especies de los géneros Pseudomonas y 
Azotobacter (Gacesa, 1998). La acetilación de los residuos de ácido manurónico del 
alginato bacteriano es la principal diferencia con el producido por las algas (Sabra et 
al., 2001). Las presencia de grupos O-acetil permite una mejor interacción del 
polímero con las moléculas de agua, incrementado la viscosidad de las soluciones 
acuosas y mejorando la capacidad de hidratación de los geles de alginato, esta 
propiedad expande el potencial comercial del polímero principalmente en el área 
farmacéutica y médica, por lo que se ha incrementado el interés de la industria 
biotecnológica en la modificación y el desarrollo de procesos para optimizar su 
producción (Sabra et al., 2001; Straatmann et al., 2004; Peña et al., 2006). 
Particularmente, en cepas de Azotobacter vinelandii se han realizado diversos 
estudios sobre los factores ambientales que influyen en la producción de alginato y 
sus características. Por ejemplo, se ha estudiado el efecto de los nutrientes, la 
concentración de oxígeno disuelto, el pH, la temperatura y la velocidad de agitación 
sobre la síntesis del polímero (Flores et al., 2014). Sin embargo, existen pocos 
estudios en relación a los factores que alteran el grado de acetilación del alginato 
(Castillo et al., 2013a). 
Hasta el momento se ha reportado que modificaciones en el medio de cultivo, tales 
como la adición del amortiguador de pH, el Ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico 
2 
 
(MOPS), así como cambios en la concentración de calcio y fosfato influyen en el grado 
de acetilación del alginato (Annison y Couperwhite, 1986; Peña et al., 2006). Estudios 
más recientes han descrito el efecto de la velocidad específica de crecimiento () y de 
la tensión de oxígeno disuelto (TOD) sobre la acetilación del alginato producido por la 
cepa silvestre de A. vinelandii ATCC 9046 (Castillo et al., 2013a). En este último 
trabajo, el mayor grado de acetilación (6.88 %) se observó a 9 % de TOD, mientras 
que, el incremento en la velocidad específica de crecimiento tiene un efecto negativo 
sobre ésta propiedad del polímero. Sin embargo, los mecanismos moleculares que 
regulan el grado de acetilación en función de estos parámetros no son claros. 
Por otro lado, A. vinelandii sintetiza poli -hidroxibutirato (PHB), un polímero 
intracelular que funciona como reserva de carbono y energía. Tanto la síntesis de PHB 
como el proceso de acetilación del alginato tienen como precursor común al acetil-
CoA. De esta manera, es posible que al limitar la producción de PHB, se promueva la 
movilización de acetil-CoA hacia el proceso de acetilación del alginato. En este 
contexto resulta interesante estudiar el grado de acetilación en una cepa no 
productora de PHB. 
La cepa AT6 posee una mutación en el primer gen del operón phbBAC que impide 
totalmente la síntesis de PHB,por lo que en este trabajo se propone utilizar la cepa 
mutante AT6 de A. vinelandii para estudiar el efecto de la eliminación de la síntesis de 
PHB sobre el grado de acetilación del alginato. 
 
 
 
 
 
 
3 
 
2.- ANTECEDENTES 
2.1 GENERALIDADES 
El alginato es un polisacárido presente en las paredes celulares de las algas marinas 
confiriéndoles resistencia mecánica y flexibilidad (Phaeophyta), fue descrito por 
primera vez a finales del siglo XIX por el químico E.C. Stanford que lo llamó "algin" 
(Draget et al., 2001). Este polímero se puede obtener principalmente de las algas 
marinas de las especies Laminaria hyperborea, L. digitata, L. japonica, Macrocystis 
pyrifera y de algunas especies de los géneros Lessonia, Ecklonia, Durvillaea y 
Ascophyllum. Todas estas algas contienen entre el 20 y el 30% de alginato sobre su 
peso seco (Minoletti, 2003). 
Aunque la producción del alginato comercial está prácticamente restringida a la 
extracción de las algas, este polímero también es producido por especies bacterianas 
como Pseudomonas y Azotobacter (Sabra et al., 2001). 
2.1.1 Estructura y propiedades del alginato 
El alginato es un biopolímero no ramificado compuesto por unidades de ácido -D-
manurónico y su epímero el ácido -L-gulurónico unidos por enlaces  1-4 (Figura 
2.1). De acuerdo a la distribución de los monómeros, este copolímero puede formar 
bloques homopoliméricos de manuronato (bloques M) o guluronato (bloques G), y 
bloques heteropoliméricos de residuos alternantes (bloques MG) (Figura 2.2a). 
 
 
 
 
Figura 2.1 Ácido -D-manurónico y su epímero el ácido -L-gulurónico. 
 
4 
 
El alginato tiene propiedades gelificantes y viscosificantes que dependen de sus 
características estructurales, en otras palabras, que se ven afectadas por el peso 
molecular, la relación G/M y otras modificaciones como por ejemplo, el grado de 
acetilación (Remminhorst y Rhem, 2006a; Draget y Taylor, 2011; Pawar y Edgar, 
2012). 
Con relación al peso molecular (PM), la mayoría de los alginatos presentan 
polidispersidad, es decir, que en el mismo polímero existen moléculas con PM distinto. 
Clementi propuso en 1997 una clasificación de acuerdo a su peso molecular y 
viscosidad, teniendo alginatos de alta viscosidad con PM promedio de 150 kDa, 
viscosidad intermedia con PM de 120 kDa y de baja viscosidad con pM de 80 kDa. 
Con respecto a la relación G/M, la presencia de poliguluronatos (bloques GG) les 
permite formar geles rígidos en presencia de iones divalentes, siendo en orden de 
afinidad: Pb>Ba>Sr>Ca>Cu>Cd>Co=Ni=Zn>Mn (modelo de la caja de huevo) (Figura 
2.2b y c) (Pawar y Edgar, 2012). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2.2 Estructura del alginato producido por A. vinelandii. a) Estructura de los bloques, b) 
Epimerización y formación del modelo “caja de huevo”, c) Formación de gel (Sabra 
et al., 2001). 
5 
 
Por otro lado, la presencia de grupos O-acetil en las posiciones O-2 y/o O-3 de las 
unidades de manuronato son características únicas del alginato bacteriano (Figura 
2.3). Los grupos acetilo incrementan la flexibilidad del polímero, generando matrices 
más laxas que dificultan la interacción entre los monómeros de guluronato y los iones 
Ca+, lo que ocasiona la reducción de la capacidad gelificante y de la rigidez de los 
geles resultantes. Sin embargo, incrementa la interacción entre la cadena del polímero 
y el agua mejorando su solubilidad en soluciones acuosas y por ende su viscosidad. 
Estas características son de gran utilidad para la fabricación de material de curación 
y encapsulamiento de fármacos en la industria médica y farmacéutica. (Skjak-Braek 
et al., 1989; Straatmann et al, 2004) 
Figura 2.3 Estructura del alginato. a) Monómeros de alginato algal y b) monómeros de alginato 
microbiano, acetilado en residuo manurónico en posición O-2 y O-3 (Modificado de 
Pawar y Edgar, 2012; Franklin et al., 2011). 
2.1.2 Aplicaciones comerciales 
El valor comercial del alginato radica en su capacidad de modificar las propiedades 
reológicas de los sistemas acuosos, lo que le permite ser empleado en diferentes 
áreas de la industria (Sutherland, 1990). Algunas de sus aplicaciones se muestran en 
la Tabla 2.1. 
Ya que las propiedades del alginato están intrínsecamente relacionadas con las 
características del polímero, los esfuerzos para manipular sus propiedades son un 
área de oportunidad para que su utilidad se extienda a múltiples sectores industriales. 
Sin duda, una de las propuestas más interesantes es el uso del alginato como material 
de inmovilización celular que permita formar una barrera entre células de trasplante y 
el sistema inmune (Draget y Taylor, 2011). 
6 
 
Entre las propiedades que se busca mejorar para éste propósito se encuentran: la 
estabilidad química y mecánica, la propiedad de controlar la hidratación o hinchazón, 
el bajo contenido de compuestos inmunogénicos, tóxicos o pirógenos y el control de 
la difusión; además de la solubilidad, hidrofobicidad y afinidad por proteínas 
específicas (Pawar y Edgar, 2012). Sin embargo, el potencial del polímero a ser 
modificado representa un reto para las industrias química y bioquímica, con respecto 
a la calidad y cantidad de sustituyentes así como la secuencia y patrones de 
monómeros, ya que las características intrínsecas del polímero como su solubilidad, 
sensibilidad al pH y complejidad dificultan la modificación química y los métodos de 
análisis (Pawar y Edgar et al, 2012). 
Tabla 2.1. Aplicaciones del alginato en diferentes sectores industriales. 
Industria Aplicación 
Textil Como espesante en colorantes 
Alimentaria Utilizado como espesante en salsas, jarabes y helados. Forma emulsiones 
estables con saborizantes volátiles. Se utiliza como estabilizante de 
suspensiones 
Cosméticos Como estabilizante de espumas e hidratante de cabello, suavizante de 
jabones, shampoos y cremas de afeitrar. 
Farmacéutica y 
usos médicos 
Elaboración de impresiones dentales, encapsulación de compuestos 
activos de liberación controlada, en apósitos para el tratamiento de 
heridas y enfermedades como pie diabético. Fungen como una matriz 
extracelular artificial para la reconstrucción celular. 
Biotecnología Utilizado en técnicas de inmovilización o microencapsulación enzimática 
o celular. 
Tratamiento 
de aguas 
Favorece la agregación en los procesos de floculación. 
otras Agente gelificante en explosivos (geles de alginato de borato). Fotografía 
(endurecimiento de geles) y juguetería (moldes). 
Tabla adaptada de Gacesa, 1998; Orive et al. 2002 y Millán, 2006. 
 
 
 
7 
 
2.1.3 A. vinelandii 
A. vinelandii es un bacilo corto Gram-negativo que pertenece a la familia 
Pseudomonadaceae y es móvil por flagelos perítricos. Es un microorganismo aerobio 
estricto, presente en el suelo, que puede crecer a bajas concentraciones de oxígeno 
y es de las pocas especies capaz de fijar nitrógeno bajo condiciones de aireación, 
aunque se sabe que la fijación de nitrógeno es más eficiente cuando la concentración 
de oxígeno en el medio es baja (Sabra et al, 2001). 
La fijación de nitrógeno es un proceso altamente sensible a la concentración de 
oxígeno y en otras bacterias se realiza comúnmente bajo condiciones de anaerobiosis. 
Sin embargo, en especies como A. vinelandii, se conocen dos mecanismos que puede 
utilizar para protección del sistema nitrogenasa (Sabra et al, 2001). Por un lado, una 
tasa de respiración elevada (característica de estas especies), permite crear un 
ambiente intracelular para el correcto funcionamiento del sistema nitrogenasa. Por 
otro lado, un mecanismo de protección conformacional que da origen a un sistema 
“apagado” en presencia de altas concentraciones de oxígeno. 
Además, A. vinelandii es capaz de sintetizar dos polímeros de interés industrial: el 
alginato y el poli -hidroxibutirato (PHB). 
2.1.4 Síntesis de alginato 
En las bacterias del género Azotobacter la produccióndel alginato está principalmente 
asociado al proceso de enquistamiento. Este proceso permite que la célula se 
mantenga en latencia por largo tiempo, cuando las condiciones ambientales son 
desfavorables para su desarrollo. Entre los componentes de mayor importancia que 
se modifican durante esta etapa se encuentran, la producción de alginato, PHB y la 
formación de lipídicos fenólicos (Segura et al., 2014). Durante el proceso de 
enquistamiento se generan dos capas alrededor de la célula conocidas como exina e 
intina, de las cuales el 32 y el 13 % de su peso seco es alginato, respectivamente. 
 
 
8 
 
Por otro lado, el cuerpo central del quiste está constituido principalmente por gránulos 
de PHB que funcionan como reserva de carbono y energía durante el periodo de 
latencia. Además durante la etapa de enquistamiento se induce la producción de 
alquilresorcinoles (ARs) y alquilpirones (APs), lípidos fenólicos que remplazan a los 
lípidos de la membrana y que son parte estructural de la exina. Estos son sintetizados 
a partir de acetil-CoA por la vía de los policétidos (Funa et al., 2006; Segura et al., 
2014). 
La producción de alginato en A. vinelandii es indispensable para la formación de 
quistes resistentes a la desecación, sin embargo también es producido por células 
vegetativas. La síntesis de alginato inicia en el citosol a partir de la fructosa-6-fosfato 
que se convierte en manosa-6-fosfato por medio de una isomerasa (fosfo-manosa-
isomerasa, PMI ó AlgA). La manosa-6-fosfato se modifica en manosa-1-fosfato por 
acción de una mutasa (fosfo-mano-mutasa, PMM ó Alg C). Posteriormente, la 
manosa-1-fosfato es activada por una pirofosforilasa (GDP-manosa-pirofosforilasa, 
GMP), formando GDP-manosa que será oxidada por medio de una deshidrogenasa 
(GDP-manosa deshidrogenasa, GMD ó Alg D) en ácido GDP-manurónico (Figura 2.4) 
(Remminghorst y Rhem, 2006a; Galindo et al., 2007). 
La polimerización de los monómeros de GDP-manurónico se lleva a cabo en el 
espacio periplásmico por acción del complejo alginato polimerasa. Este complejo está 
conformado por las enzimas Alg8 y Alg44 (Flores et al., 2014). La proteína Alg8 está 
clasificada en la familia de las β-glicosiltransferasa Clase II. Tiene cuatro dominios 
transmembranales (TM) y una región glicosiltransferasa citoplasmática (GT) (Franklin 
et al., 2011). En un estudio realizado por Remminghorst y Rehm (2006b) se encontró 
que la sobre expresión del gen alg8 produjo un incremento de 20 veces la producción 
de alginato con respecto a la cepa nativa. También se observó un incremento en el 
grado de acetilación y una disminución en la relación G/M. 
 
 
9 
 
Por otro lado, la proteína Alg44 tiene un dominio TM y una región citoplasmática PilZ, 
que es un dominio de unión al guanosín monofosfato cíclico (c-di-GMP), un segundo 
mensajero universal en bacterias. Esta región es necesaria para la polimerización del 
alginato (Merigui et al., 2007). Si bien, no se conoce con claridad el papel que juegan 
las enzimas Alg8 y Alg44 en la producción de alginato, se sabe que ambas enzimas 
son requeridas para la producción de alginato tanto en A. vinelandii (Mejía-Ruiz et al., 
1997) como en P. aeruginosa (Franklin et al., 2011); además, cepas mutantes alg8 - y 
alg 44 - son incapaces de producir alginato (Remminghorst y Rhem, 2006a). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2.4 Síntesis de alginato y poli--hidroxibutirato en A. vinelandii. A la derecha se 
muestran las enzimas que participan y a la izquierda los genes correspondientes. 
PMI, fosfomanosa isomerasa; GMP, guanosina difosfomanosa pirofosforilasa; 
PMM, fosfomanosa isomerasa; GMD, GDP-manosa deshidrogeasa; MP, 
manurato polimerasa; MEs, manuronato epimerasa AlgE 1-7 (Galindo et al., 
2007). 
10 
 
Después de la polimerización, el alginato sufre un proceso de modificación y 
transporte, este proceso se lleva a cabo del periplasma hacia el exterior de la célula. 
Una de las principales modificaciones consiste en la acetilación de algunos residuos 
manurónicos; donde se ha propuesto como principal donador de grupo acetilo al 
intermediario acetil-CoA (Figura 2.5) (Clarke et al., 2000). 
La acetilación específica en los residuos de ácido manurónico del alginato bacteriano 
es la principal diferencia con el producido por las algas marinas (Sabra et al., 2001). 
El proceso de acetilación se lleva a cabo en el espacio periplásmico, por acción del 
complejo de acetilación que comprende las proteínas AlgI, AlgV y AlgF en A. 
vinelandii, estas presentan homología con el complejo AlgI, AlgJ y AlgF de P. 
aeruginosa (Galindo et al., 2007). Estos complejos se encargan de acetilar en la 
posición 2 y/o 3 de los residuos manurónicos (Vázquez et al., 1999). 
Se sabe que la proteína AlgI de P. aeruginosa tiene siete dominios TM. Se ha 
propuesto, de acuerdo a su homología con proteínas acil-acarreadoras, que es 
responsable de transportar los grupos acetilo del citoplasma hacia el periplasma, 
donde posteriormente será utilizado para el proceso de acetilación (Franklin et al., 
2004). Por otro lado, la proteína AlgV de A. vinelandii (AlgJ en P. aeruginosa) es una 
acetil-transferasa anclada a la membrana citoplasmática y finalmente AlgF se 
encuentra en periplasma (Franklin et al., 2004). Recientemente se ha propuesto la 
participación de la proteína AlgX como una proteína acetil-transferasa. Esta proteína 
muestra un 69% de similitud a la proteína AlgJ de P. aeruginosa, su estructura muestra 
homología con los miembros de la superfamilia de las enzimas hidrolíticas (SNGH) y 
tiene un sitio de unión a carbohidratos (Weadge et al., 2010). También, se ha 
observado que una mutación en el sitio Ser-Hist-Asp de la proteína AlgX genera la 
producción de alginato no acetilado, sugiriendo que este sitio forma parte de la triada 
catalítica (Riley et al., 2013). La acetilación del alginato se ha propuesto como un 
mecanismo de protección del polímero frente a las actividades de alginato liasas y 
epimerasa (Vázquez et al., 1999). 
 
11 
 
 
Figura 2.5. Modificaciones del alginato sintetizado por A. vinelandii. a) Formación del 
precursor DGP- manurónico en citoplasma; b) Polimerización (Alg8), Acetilación 
(AlgI, V, F y AlgX), epimerización (AlgG), hidrólisis (AlgL, AlyA 1 y 2) y transporte 
(AlgK) en periplasma; c) Exportación (AlgJ) y epimerización (AlgE1-7) en el 
espacio extracelular. 
En A. vinelandii el proceso de acetilación puede estar relacionado con la síntesis de 
PHB, ya que presentan como precursor común al acetil-CoA. La expresión de los 
genes phbA, phbB y phbC dirigen una parte del acetil-CoA a la síntesis de PHB. Se 
sabe que, la modificación de estos genes influye en la producción de PHB y alginato 
(Segura et al., 2003b). 
12 
 
Además de la acetilación, el alginato puede sufrir otras modificaciones como la 
epimerización, en donde participan enzimas con actividad epimerasa que actúan 
sobre el C-5 de los residuos manurónicos no acetilados convirtiéndolos en ácidos 
gulurónicos (Figura 2.5). Para P. aeruginosa se ha reportado que la proteína AlgG 
(epimerasa plasmática) es la principal responsable del proceso de epimerización. Sin 
embargo, en el caso de A. vinelandii además de la proteína AlgG, se han encontrado 
hasta siete epimerasas extracelulares (AlgE1-AlgE7); que además son esenciales 
para el proceso de enquistamiento (Svanem et al., 2001; Galindo et al., 2007). 
Por otro lado, en P. aeruginosa se ha observado que la proteína AlgL participa en el 
transporte y protección del polímero desde el interior del periplasma al medio 
extracelular. Sin embargo, en el caso de A. vinelandii AlgL presenta actividad de 
alginato liasa degradando el polímero de alginato que se acumula en periplasma, 
además se han identificado otras proteínas con actividad de liasa, dos en periplasma 
(AlyA1 y AlyA2) y una en el espacio extracelular (AlyA3) (Gimmestad et al., 2009). 
Finalmente,para que el polímero pase al exterior de las célula se ha propuesto que 
las proteínas AlgX y AlgK protegen al polímero de la degradación en el periplasma 
(Hay et al., 2012), antes de ser transportado al especio extracelular por la proteína 
AlgJ (AlgE en P. aeruginosa). Ya en el espacio extracelular algunos residuos 
manurónicos no acetilados son epimerizados a residuos gulurónicos por las 
epimerasas extracelulares AlgE1-7 en A. vinelandii (Figura 2.5). 
2.1.5 Biosíntesis de poli-(β-hidroxibutirato) 
El poli-β-hidroxibutirato (PHB) es un poliéster intracelular perteneciente a la familia de 
los polihidroxialcanoatos (PHA´s). Presenta características mecánicas similares al de 
los plásticos convencionales. Sin embargo, forma plásticos biodegradables y 
biocompatibles que pueden utilizarse para la fabricación de productos plásticos, 
membranas y fibras. 
 
 
13 
 
Existen más de 300 especies de microorganismos capaces de producir éste polímero. 
Sin embargo, muy pocos se han utilizado para su producción. Entre éstos destacan 
Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus, Pseudomonas oleovorans y A. vinelandii (Choi 
y Lee, 1999). 
El PHB es un metabolito de reserva de carbono para los microorganismos que lo 
producen. Su síntesis involucra la condensación de dos moléculas de acetil-CoA por 
la enzima β-Cetotiolasa para formar acetoacetil-CoA, el cual es reducido 
posteriormente por la enzima Acetoacetil-CoA reductasa dependiente de NADPH para 
producir β-hidroxibutiril-CoA. Finalmente, la reacción de polimerización es realizada 
por la enzima PHB sintasa (Figura 2.4) (Anderson y Dawes, 1990). 
2.1.6 Localización y regulación de los genes estructurales de la biosíntesis de 
Alginato y PHB. 
Se han logrado identificar en A. vinelandii los genes que codifican para las enzimas 
que participan en la síntesis de alginato y PHB (Figura 2.6). Para la síntesis de 
alginato, se encuentra la región algD-8-44-K-J-G-X-L-I-V-F-A y el gen algC y para la 
síntesis de PHB, el operón phbBAC (Hay et al., 2014; Peña et al., 2011a). 
Para la síntesis de alginato se han identificado varias regiones reguladoras. Tres 
regiones promotoras río arriba del gen algD que corresponden a algDp1, algDp2 y 
algDp3, un promotor río arriba del gene alg8 (alg8p), un posible promotor sigma 70 río 
arriba de algG y uno más río arriba de algA. Además, se identificaron los promotores 
algCp1 y algCp2 río arriba del gen AlgC, los cuales están regulados por el gen algU 
que codifica para dos factores sigma E. Estos factores además de regular la síntesis 
de alginato, participan en la activación de genes relacionados con la resistencia a 
condiciones de estrés, por ejemplo agentes oxidantes o antimicrobianos, elevadas 
temperaturas o cambios en la presión osmótica (Hay et al., 2014). Los promotores de 
algD también se encuentran regulados por algU y además por el sistema de dos 
componentes GacS-GacA. En donde GacS actúa como un sensor tipo histidin cinasa 
que fosforila a GacA en presencia de una señal ambiental, esta a su vez activa la 
trascripción del gen rpoS que codifica para el factor sigma RpoS quien activa la 
trascripción del gen algD (Figura 2.6) (Castañeda et al., 2001). 
14 
 
Con respecto a la regulación de la síntesis de PHB, se sabe que está controlada a 
diferentes niveles. El primero se describió a nivel enzimático, controlado 
alostéricamente por las enzimas involucradas en la síntesis. Uno de los controles más 
importantes, es la regulación de la primera enzima que participa en la síntesis, la β-
cetotiolasa. Esta enzima se activa cuando la relación del sustrato acetil-CoA/ CoA es 
alta. Ese fenómeno se observa cuando la concentración de oxígeno en el medio es 
baja, debido a la disminución del flujo de acetil-CoA hacia el ciclo de Krebs, puesto 
que bajo estas condiciones de crecimiento, los cofactores NADH y NADPH se 
acumulan en la célula y provocan la inhibición de las enzimas citrato sintasa e 
isocitrato deshidrogenasa (Senior et al., 1972). 
Figura 2.6 Organización y modelo de regulación de los genes de biosíntesis de alginato y PHB 
en A. vinelandii (Modificado de Galindo et al., 2007). 
El segundo nivel de control es mediante la regulación de los genes involucrados en la 
síntesis de PHB. En el operón phbBAC se encuentran los genes que codifican para 
las enzimas de síntesis de PHB (β-cetotiolasa, acetoacetil-CoA reductasa y PHB 
sintasa), además se encuentran en la misma región del gen phbR que codifica para 
un activador transcripcional perteneciente a la familia AraC, phbP que codifica para 
una proteína que posiblemente interacciona con los gránulos de PHB y finalmente, 
phbF un posible regulador de phbP (Figura 2.6) (Segura et al., 2014). 
15 
 
Existen otros reguladores que participan en el control de la síntesis de PHB. Por 
ejemplo, el sistema de regulación global GacA-GacS. Este sistema de dos 
componentes actúa a través del factor sigma RpoS para activar los genes phbR y 
phbB. También, se ha observado que una mutación en el gen ptsP que codifica para 
la enzima INtr del sistema fosfotransferasa asociado a nitrógeno PTSNtr, homólogo al 
sistema fosfotransferasa para azúcares (PTS), tiene un efecto negativo en la 
acumulación de PHB en A. vinelandii (Galindo et al., 2007). 
Además, se ha propuesto la posible participación de la proteína CydR en la regulación 
de la síntesis de PHB, esta proteína está asociada al mecanismo de protección del 
sistema nitrogenasa a través de la regulación de la expresión del citocromo terminal 
bd oxidasa (Wu et al., 1997). Wu y colaboradores (2001), encontraron que una 
mutación en cydR genera la sobreexpresión de las enzimas β–cetotiolasa y 
acetoacetil-CoA reductasa. Donde es probable que la participación de CydR sobre el 
control de la síntesis de PHB esté relacionada con el estado de óxido-reducción de la 
célula (Galindo et al., 2007). 
2.2 PRODUCCIÓN DE ALGINATO POR A. vinelandii 
 El alginato algal ha sido comercializado desde su descubrimiento, sin embargo este 
polímero presenta amplia variabilidad en su composición ya que depende de cada 
especie de alga y de las condiciones ambientales donde se cultive (Remminhghorst y 
Rehm, 2006). Por otro lado, la producción de alginato bacteriano por vía fermentativa 
tiene la ventaja de poder controlar las propiedades del polímero, por lo que representa 
una oportunidad para obtener un polímero de mayor homogeneidad y calidad. 
 Existen diversos estudios de los factores ambientales que influyen sobre la 
producción de alginato en cepas de A. vinelandii. Por ejemplo, se ha estudiado el 
efecto de los nutrientes, de la concentración de oxígeno disuelto, el pH, la temperatura 
y la velocidad de agitación sobre la producción y peso molecular del alginato (Flores 
et al., 2014). Sin embargo, son pocos los estudios relacionados con las condiciones 
que alteran su grado de acetilación (Tabla 2.2). Por ejemplo, uno de los primeros 
estudios sobre el grado de acetilación del alginato fue desarrollado por Annison y 
Couperwhite (1986). En este trabajo se desarrollaron cultivos continuos (sin control de 
16 
 
oxígeno disuelto), donde se evaluaron diversas velocidades específicas de 
crecimiento (D= 0.16, 0.18 y 0.32 h-1) y concentraciones de calcio de 0.068 a 2.72 mM. 
Ellos observaron que el grado de acetilación se incrementaba hasta 3.4 veces cuando 
la concentración de calcio se modificó de 0.068 a 2.72 mM (a una D=0.32 h-1). 
Además, observaron que independientemente de la concentración de calcio, el grado 
de acetilación se incrementaba con respecto a la velocidad específica de crecimiento 
(D), obteniendo el mayor grado de acetilación a 0.32 h-1 (0.35 molAce molAlg-1). 
En otro estudio, Peña y colaboradores (2006) reportaron que en cultivos desarrollados 
en matraces agitados, la adición de la sal reguladora de pH, MOPS (ácido 3-[N-
morfolino] propanosulfónico) generaba un incremento de hasta dos veces el gradode 
acetilación del alginato con respecto a aquellos que no contenían MOPS. Estos 
autores sugieren que las enzimas AlgI, AlgV y AlgF involucradas en el proceso de 
acetilación, funcionaban en condiciones óptimas de pH. 
Tabla 2.2. Factores que alteran el grado de acetilación del alginato producido por A. vinelandii 
 
MOPS: Ácido 3-[N-morfolino] propanosulfónico, VTO: Velocidad de Transferencia de Oxígeno (mmol 
O2 L h-1), TOD: Tensión de Oxígeno Disuelto (%), µ: velocidad específica de crecimiento (h-1). 
 
Factor de 
impacto 
Variable 
evaluada Aportación Autor 
Medio de 
cultivo 
[Ca
++
 ] 
El incremento de la concentración de 
calcio favorece el grado de 
acetilación. 
Annison y 
Couperwhite, 
1986 
[MOPS] 
El grado de acetilación se duplica en 
cultivos adicionados con el regulador 
de pH MOPS. 
Peña et al., 
2006 
Disponibilidad 
del oxígeno 
VTO 
El grado de acetilación se incrementa 
con la disminución de la VTOmax y la 
potencia volumétrica. 
Peña et al., 
2011b 
 % TOD El incremento de la TOD promueve el 
grado de acetilación. 
Castillo et 
al.,2013ª 
Velocidad 
específica de 
crecimiento 
µ 
El incremento en la velocidad 
específica de crecimiento tiene un 
impacto negativo sobre el grado de 
acetilación. 
Castillo et 
al.,2013ª 
17 
 
Además de los componentes del medio de cultivo, factores como la disponibilidad de 
oxígeno y la velocidad específica de crecimiento han sido evaluados. Con respecto a 
la disponibilidad de oxígeno, se ha observado que el grado de acetilación se ve 
afectado por cambios en la velocidad de transferencia de oxígeno máxima (VTOmax). 
En el trabajo desarrollado por Peña y colaboradores (2011b) se observó que al 
disminuir la VTOmax de 6 a 2.6 mmol L-1 h-1 se logró un incremento en el grado de 
acetilación de 3.5 a 5.8 %.No obstante, bajo estas condiciones de cultivo la producción 
de PHB también se vio favorecida. Como se ha descrito previamente, el proceso de 
acetilación y la síntesis de PHB comparten al mismo precursor (acetil-CoA) (Senior et 
al., 1972), por lo que se ha propuesto que bajo condiciones de limitación de oxígeno 
como las evaluadas en este trabajo (baja VTOmax) el flujo de acetil-CoA estuvo limitado 
para el ciclo de Krebs, incrementando su disponibilidad para la síntesis de PHB y el 
proceso de acetilación (Peña et al., 2011b). 
Estudios más recientes reportan que la tensión de oxígeno disuelto (TOD) y la 
velocidad específica de crecimiento (µ) tienen efecto sobre el grado de acetilación del 
alginato. Castillo y colaboradores (2013a) observaron que en cultivos continuos el 
incremento de TOD en un rango de 1 a 9 % favorecía el proceso de acetilación 
obteniendo valores de hasta 6 %, mientras que al evaluar la producción de PHB 
observaron un efecto inverso, en donde la mayor acumulación (33% de PHB) se 
obtuvo disminuyendo la TOD de 9 a 1%. Con respecto a la velocidad específica de 
crecimiento encontraron que ambos procesos se benefician a bajos valores de µ (0.02 
y 0.04 h-1) independientemente de la TOD. En este trabajo se propuso que la relación 
inversa entre producción de PHB y el grado de acetilación (Figura 2.7) podría estar 
asociada a la competencia entre una y otra ruta por el precursor acetil-CoA. (Castillo-
Marenco, 2013) 
 
 
 
 
18 
 
1 (♦) 5 (●) y 9% (■) de TOD 
 
 
 
 
 
 
Figura 2.7. Relación entre el grado de acetilación del alginato y el contenido de PHB en 
cultivos A. vinelandii (Castillo-Marenco, 2013). 
 
Como se mencionó anteriormente, el acetil-CoA es empleado como precursor tanto 
para la síntesis de PHB (Senior et al., 1972) como en el proceso de acetilación (Clarke 
et al., 2000). En este sentido se ha planteado que ambos procesos se encuentran 
relacionados de forma directa a través del intermediario acetil-CoA y que el flujo hacia 
uno u otro proceso dependen de las condiciones de crecimiento. En este contexto, 
sería interesante estudiar el impacto del bloqueo de la síntesis de PHB, sobre el grado 
de acetilación ya que al suprimir la producción de PHB en A. vinelandii mayor cantidad 
de acetil-CoA podría utilizarse como donador de grupos acetilo durante el proceso de 
acetilación. 
Además, se sabe que la actividad del ciclo de Krebs se encuentra disminuida a bajas 
concentraciones de oxígeno disuelto, debido a que la acumulación de los cofactores 
NADH y NADPH provocan la inhibición de las enzimas citrato sintasa e isocitrato 
deshidrogenasa (Senior et al., 1972), incrementando la concentración de acetil-CoA 
para el proceso de acetilación. Considerando lo anterior, este trabajo se realizó con la 
finalidad de estudiar el efecto que presenta la eliminación de la síntesis de PHB sobre 
el grado de acetilación del alginato bajo condiciones controladas de crecimiento (1 % 
de TOD y 0.04 h-1) que pudieran favorecer el proceso de acetilación. Para ello, fue 
seleccionada la cepa mutante AT6 de A. vinelandii debido a que posee la mutación 
phbB::mini-Tn5 con el marcador de resistencia a kanamicina que impide la síntesis de 
PHB (Segura et al., 2003a). 
19 
 
Tn5 
El gen interrumpido (phbB) codifica para la enzima acetoacetil-CoA reductasa que 
participa en el segundo paso de la biosíntesis del polímero. Sin embargo, al ser 
codificada por el primer gen del operón phbBAC, la inserción ejerce un efecto polar 
sobre los genes phbA y phbC, impidiendo también, la trascripción de las enzimas -
cetotiolasa y PHB sintasa, respectivamente (Figura 2.8) (Segura et al., 2003b; Mejía 
et al., 2010). 
 
 
 
 
Figura 2.8 Posición de la inserción del mini transposón Tn5 en el gen phbB de A. vinelandii 
(Segura et al., 2003a) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
 3.- HIPÓTESIS 
 
En la cepa mutante AT6 de A. vinelandii no productora de PHB, bajo condiciones 
controladas de oxígeno disuelto (1 %) y bajas velocidades específicas de crecimiento 
(0.04 h-1), se obtendrá un incremento en el grado de acetilación del alginato con 
respecto a la cepa silvestre ATCC 9046. 
 
 
4.- OBJETIVOS 
 
Objetivo General 
 
Estudiar el grado de acetilación del alginato producido por la cepa mutante AT6 de A. 
vinelandii no productora de PHB en cultivos continuos, controlando la TOD y la 
velocidad específica de crecimiento. 
 
Objetivos particulares 
 Caracterizar el comportamiento cinético de la cepa AT6 en cultivos lote 
a 1 % de TOD y 300 rpm. 
 Caracterizar la composición química del alginato sintetizado por la cepa 
mutante AT6, con respecto al grado de acetilación en cultivos continuos 
y compararlo con el producido por la cepa silvestre ATCC 9046. 
 
 
21 
 
5.- ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 
 
El presente trabajo plantea como objetivo principal, analizar el grado de acetilación del 
alginato producido por una cepa de A. vinelandii no productora de PHB (cepa mutante 
AT6), en cultivos continuos bajo condiciones controladas de tensión de oxígeno 
disuelto y velocidad específica de crecimiento. 
En la primera etapa, se caracterizó el comportamiento cinético de la cepa AT6 en 
cultivos en matraces agitados bajo condiciones de fijación de nitrógeno y de forma 
preliminar se evaluó el grado de acetilación del alginato sintetizado por esta cepa. En 
la segunda etapa, se desarrollaron cultivos en lote controlando la TOD a 1 %, lo cual 
nos permitió determinar el inicio de la alimentación para los posteriores cultivos en 
quimiostato y observar el comportamiento de la cepa AT6, con respecto al grado de 
acetilación del alginato. Una vez establecido el tiempo en que debe iniciarse la 
alimentación, se evaluó (en cultivos continuos) una concentración de oxígeno disuelto 
de 1 % y una tasa de dilución (D) de 0.04 h-1. Bajo estas condiciones se ha reportado 
que la producción de PHB en la cepa silvestre se ve favorecida (Castillo et al., 2003a) 
y se esperaba un alto grado de acetilación del alginato producido por la cepa mutante. 
Estos cultivos, permitieron evaluar el grado deacetilación del alginato bajo 
condiciones controladas de crecimiento. 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5.1 Estrategia experimental para evaluar el grado de acetilación del alginato producido 
por la cepa mutante AT6 de A. vinelandii. 
ETAPA 1 
Grado de acetilación del 
alginato producido por la 
cepa AT6 a 1% de TOD y 
D= 0.04 h-1 
 
 
 
Cultivos en Lote 
 Caracterización de la cepa AT6 
Cultivos en Quimiostato 
Respiration Activity Monitoring 
System (RAMOS). 
Grado de acetilación del 
alginato producido por 
la cepa AT6 a 1% de TOD 
 [Alginato], 
Yp/s, Yp/x 
% Acetilación. 
µ, Yx/s 
% Acetilación. 
Evaluación del grado 
de acetilación del 
alginato producido por 
A. vinelandii AT6 
Cultivos en matraces agitados 
Análisis 
respirométrico 
 VTO y qO2 
µ, Yx/s, qs, 
[Alginato], Yp/s, Yp/x 
% Acetilación 
VTO y qO2 
ETAPA 2 
ETAPA 3 
23 
 
6.-MATERIALES Y MÉTODOS 
 
6.1 Cepas de trabajo 
Para este estudio se empleó la cepa parental ATCC 9046 de A. vinelandii y la cepa 
no productora de PHB, AT6 (Segura et al., 2003a). 
La cepa AT6 se recuperó a partir de un liofilizado. Para ello, liofilizado fue 
resuspendido en agua estéril y se sembró una alícuota en caldo nutritivo como medio 
de recuperación. Posteriormente, se realizó una resiembra en Medio Burk Modificado 
(MBM) sólido, suplementado con kanamicina (2 g mL-1). La cepa parental ATCC 
9046 fue resembrada en MBM sin antibiótico. 
Ambas cepas se conservaron en medio MBM inclinado a 4 °C, con resiembras 
mensuales. 
6.2 Medio de cultivo 
Todos los cultivos se llevaron a cabo bajo condiciones de fijación de nitrógeno 
(condiciones diazotróficas), por lo que no fue adicionada ninguna fuente nitrogenada al medio 
de cultivo. La composición del MBM fue (en g L-1): K2HPO4 0.66, KH2PO4 0.16, CaSO4 0.05, 
NaCl 0.2, MgSO4 0.2, NaMoO4▪2 H2O 0.0029, FeSO4▪7 H2O 0.027 y MOPS 1.42 (Castillo et 
al., 2013a). 
6.3 Sistemas de cultivo 
6.3.1 Preparación del inóculo. 
Para las cultivos en matraces agitados, el inóculo se preparó resembrando dos 
asadas de la cepa en tubo inclinado a medio sólido MBM para la cepa silvestre y medio 
sólido MBM suplementado con kanamicina (2 g mL-1) para la cepa mutante. Se dejó 
en incubación a 29 °C durante 48 h. Posteriormente, se inoculó con tres asadas del 
cultivo sólido un matraz de 250 mL que contenía 50 mL de MBM. Para los cultivos en 
biorreactor se prepararon matraces de 500 mL que contenían 100 mL de volumen de 
24 
 
llenado. Los matraces se inocularon con tres asadas del cultivo sólido y se incubaron 
durante 24 h a 29 °C a una velocidad de agitación de 200 rpm. 
6.3.2 Cultivos en matraces. 
En la primera etapa se realizaron cultivos en matraces de 500 mL con 100 mL 
de volumen de llenado que fueron inoculados con el 10 % (v/v) de su volumen final. 
Los cultivos se incubaron a 29 °C durante 72 h a una velocidad de agitación de 200 
rpm. 
6.3.3 Cultivos en biorreactor. 
Los biorreactores se inocularon con un 10 % (v/v) del volumen total del volumen 
de trabajo. Antes de iniciar las fermentaciones, el inóculo fue centrifugado por 15 min 
a 11000 rpm, se desechó el sobrenadante y el paquete celular fue resuspendido en 
medio de cultivo fresco para eliminar los productos extracelulares presentes en el 
medio de cultivo gastado, que pudieran alterar el alginato producido durante la 
fermentación (Trujillo Roldán et al., 2003). 
6.3.3.1 Condiciones de cultivo. 
De acuerdo a lo descrito por Castillo y colaboradores (2013a), se trabajó con 
una TOD de 1 %, donde se reportó la mayor producción de PHB en la cepa silvestre 
y dónde se esperaba obtener un incremento en el grado de acetilación del alginato 
producido por la cepa mutante. Para el seguimiento de la TOD se empleó un electrodo 
polarográfico marca Applisens (Applikon, USA). El control de la TOD se realizó en 
línea por mezcla de gases (O2 y N2) empleando dos controladores de flujo másico. 
El control de la mezcla de gases a la entrada del fermentador se llevó a cabo 
empleando un controlador proporcional integral derivativo (PID) (Controlador Digital 
Universal UDC 1200 MCRO PRO). Las constantes para el controlador se muestran 
en la Tabla 6.2. El flujo total entregado al equipo fue de 1 L min-1, equivalente a 0.5 
vvm para 2 L de medio. 
 
25 
 
Tabla 6.1. Valores de las constantes P, I y D del Controlador 
Digital Universal UDC 1200 MCRO PRO 
 
 
 
 
6.3.3.2 Cultivo en Lote. 
En la segunda etapa se llevaron a cabo cultivos en lote controlando la tensión 
de oxígeno disuelto a 1 %. Para ello, se empleó un biorreactor Applikon de 3 L de 
capacidad con un volumen de operación de 2 L. Este fermentador cuenta con dos 
impulsores tipo turbina Rushton (4.5 cm de diámetro) y un difusor de 7 orificios. Se 
emplearon cuatro puertos en el reactor: uno para adición de sales e inoculación, otro 
para el muestreo y otros dos para la adición de NaOH 1N y antiespumante. Los 
cultivos se desarrollaron empleando glucosa como fuente de carbono a una 
concentración de 6 g L-1. El pH se mantuvo a 7.2 adicionando el volumen necesario 
de NaOH 1N con una bomba peristáltica, la temperatura se controló a 29 °C con una 
chaqueta térmica (Applikon). La agitación se mantuvo constante a 300 rpm. 
6.3.3.3 Cultivos en Quimiostato. 
En la tercera etapa se llevaron a cabo cultivos continuos controlando la 
concentración de oxígeno disuelto (1 %) y la velocidad específica de crecimiento (0.04 
h-1). Se sabe que en cultivos continuos es posible controlar la velocidad específica de 
crecimiento manipulado la tasa de dilución (D) dado que la concentración de células 
no cambia con el tiempo y de acuerdo a: 
𝑑𝑥
𝑑𝑡
= 𝑥 (µ − 𝐷) ∴ µ = D 
 
Constante Valor 
P 850 % 
I 0.31 min 
D 2.04 s 
26 
 
Las condiciones de agitación, pH y temperatura se controlaron de igual manera que 
para los cultivos lote. Los cultivos fueron limitados por glucosa a una concentración 
de 4 g L-1. El flujo de entrada y salida se calculó a partir de la siguiente expresión: 
𝐷 =
F 
𝑉
 ∴ 𝐹 = 𝐷 ∗ 𝑉 
Para una D= 0.04 h-1 y un volumen constante de 2 L, se obtuvo un flujo de 0.08 L h-1. 
Para los flujos de entrada y salida, se adaptaron dos puertos adicionales al 
fermentador Applikon descrito en el apartado 6.3.2.2; uno para la alimentación del 
medio y otro para la cosecha del caldo de fermentación, éste último se adaptó como 
nivel para mantener el volumen constante dentro del reactor. La alimentación y la 
cosecha se realizaron con una bomba peristáltica de doble cabezal. 
El flujo se controló por la línea de alimentación, empleando una manguera de silicón 
Masterflex L/S 14 equivalente a 1.6 mm de diámetro interno. 
Todos los cultivos continuos iniciaron con un cultivo lote, monitoreando el crecimiento 
celular durante la fase exponencial hasta las 22 h de cultivo. Posteriormente, se inició 
la alimentación y cosecha del cultivo. Este periodo de tiempo fue determinado a partir 
de cultivos en lote previamente realizados. 
Los cultivos se mantuvieron durante al menos seis tiempos de residencia () en dónde 
el coeficiente de variación fue <10%. Durante cada tiempo de residencia se monitoreó 
el crecimiento celular, la producción de biomasa, proteína y alginato así como la 
concentración de glucosa residual y el grado de acetilación. 
6.4 Métodos analíticos 
6.4.1 Cuantificación de biomasa. 
El análisis de crecimiento se realizó mediante espectrofotometría. Se tomó una 
alícuota del caldo de fermentación y se realizaron diluciones (1:10) empleando agua 
destilada. Posteriormente, se midió la absorbancia a 560 nm en un espectrofotómetro 
Beckman modelo DU 650. 
27 
 
6.4.2 Cuantificación de proteína. 
El análisis de proteína se llevó a cabo mediante el método de Lowry et al., 
(1951). Se mezcló 1 mL de solución de Lowry (Na2CO3 2 % en NaOH 0.1 N; Tartrato 
de Na y K2 % y CuSO4 1 %; 1:1:98 (v/v/v)) con 100 L de muestra y se dejó incubar 
por 10 min. Después se adicionaron 100 l de reactivo de Folin Ciocalteu diluido 1:2, 
se agitó y se dejó reaccionar en obscuridad por 30 min. 
Al finalizar la reacción, las muestras fueron centrifugadas 5 min a 13000 rpm para 
eliminar los restos celulares. Finalmente, se midió la absorbancia a 625 nm en un 
espectrofotómetro contra un blanco de reactivos. La concentración de proteína fue 
comparada con una curva patrón utilizando albúmina bovina (Sigma-Aldrich) con las 
siguientes concentraciones: 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 g L-1, obteniéndose la siguiente 
ecuación: 
 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 (𝑔
𝐿
) =
 𝐴𝑏𝑠 625𝑛𝑚−0.0097
1.0085
 
6.4.3 Cuantificación de glucosa. 
 Para la cuantificación de glucosa residual, se recuperó 1 mL de medio de cultivo 
libre de células. Las muestras se diluyeron con agua MiliQ para alcanzar 
concentraciones dentro de la curva de calibración. El análisis de glucosa se llevó a 
cabo mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) empleando una 
columna de intercambio iónico Aminex HPX-87H (300 x 7.8 mm) (Bioard, Hércules, 
CA, USA). Se empleó como fase móvil H2SO4 7 mM a 50 °C con un flujo de 0.65 mL 
min-1 y un volumen de inyección de 20 L. 
Se empleó un detector de índice de refracción a una longitud de onda de 210 nm 
(Waters, 2996). Las concentraciones de glucosa fueron comparadas con la curva 
patrón de glucosa empleando concentraciones de 2.5 a 20 mM, obteniéndose la 
siguiente ecuación: 
𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 (𝑚𝑀) = 
𝐴𝑟𝑒𝑎 + 103413
565347
 
 
28 
 
6.4.4 Análisis de la concentración de alginato y grado de acetilación 
La producción de alginato se cuantificó por gravimetría. Esta técnica se basa 
en la precipitación del polímero con isopropanol y su posterior cuantificación 
gravimétrica (Jarman et al., 1978). Para ello se tomaron 10 mL de caldo de cultivo y 
se centrifugaron a 11,000 rpm (centrífuga Eppendorf 5804) por 15 min. Se obtuvo sólo 
el sobrenadante y se mezcló con 30 mL de isopropanol, dejando reposar 10 min para 
la precipitación del producto (centrifugándose nuevamente a 11,000 rpm por 20 min). 
El producto se filtró en membranas Nucleopore de 0.22 m, previamente puestos a 
peso constante, (tratamiento a 70 °C por 24 h en una estufa). Finalmente se pesó y 
cuantificó la concentración por diferencia de peso. 
Para evaluar el grado de acetilación, el alginato precipitado con isopropanol se 
decantó y se colectó el precipitado en tubos Eppendorf de 2 mL, posteriormente se 
dejó secar a 60 °C por 24 h en un concentrador (Eppendorf Vacufuge 5301). Se 
pesaron de 5 a 10 mg de alginato seco y se solubilizaron en 500 L de agua MiliQ, 
posteriormente se adicionó 500 L de NaOH 1N y se mezcló en un agitador tipo vórtex. 
La mezcla se incubó en agitación por 2 h a 80 °C a 700 rpm. Después de la incubación 
se dejó enfriar y se adicionó 625 L de H3PO4 1.5 M para acidificar el extracto. 
Finalmente, el extracto fue centrifugado y se recuperó el sobrenadante. 
Las muestras fueron analizadas mediante HPLC, bajo las mismas condiciones 
empleadas para la cuantificación de glucosa (a apartado 6.4.3), el volumen de 
inyección fue de 40 L. Se empleó un detector de arreglo de diodos a una longitud de 
onda de 210 nm (Waters, 2996). 
Los valores obtenidos fueron comparados con una curva patrón de acetato de amonio 
como estándar disuelto en agua bidestilada para obtener la concentración de acetato 
en la muestra se utilizó la siguiente ecuación: 
𝐴𝑐𝑒𝑡𝑖𝑙𝑜𝑠 (𝑚𝑀) = 
𝐴𝑟𝑒𝑎210𝑛𝑚 − 6983.7
120053
 
 
29 
 
El porcentaje de acetilación se obtuvo mediante la siguiente ecuación: 
%Acetilación =
[(mM)(PMgrupo acetilo)/100][Vm]
Peso muestra 
 
 
mM= Mili moles de acetato presentes en la muestra (M) 
Vm= Volumen de la muestra cuando se decanta el alginato (L) 
PM= Peso molecular del grupo acetilo (0.043 g mol-1) 
Peso muestra= Peso de la muestra analizada (g) 
 
6.4.5 Cuantificación de PHB. 
Para evaluar la producción de PHB por la cepa parental y confirmar la ausencia 
en la cepa mutante, se cuantificó el PHB por cromatografía líquida de alta resolución 
(HPLC). Para esto, se resuspendió la biomasa por centrifugación y se llevó a 
desecación al vació a 60 °C. Se hidrolizaron 3.5 mg de biomasa con 1 mL de ácido 
sulfúrico concentrado. 
 Los hidrolizados se incubaron durante 1 h a 90 °C. Posteriormente, se enfriaron a 4 
°C. Se realizó una curva estándar empleando PHB comercial que fue procesado de la 
misma forma que la muestra. 
La hidrólisis de PHB da como resultado ácido crotónico que puede ser cuantificado 
por HPLC, empleando una columna Aminex HPx-87H (300 x 7.8 mm). Para esto, se 
empleó como fase móvil H2SO4 7 mM a 50 °C con un flujo de 0.65 mL min-1 y un 
volumen de inyección de 20 L. Se empleó un detector de arreglo de diodos a 220 nm 
(Waters, 2996). Las muestras fueron comparadas con una curva patrón, empleando 
concentraciones de 0.12 a 1.2 g L-1, obteniéndose la siguiente ecuación: 
𝑃𝐻𝐵 (
𝑔
𝐿
) = 
𝐴𝑟𝑒𝑎220𝑛𝑚 − 274246
2𝐸 + 07
 
 
 
 
30 
 
6.4.6 Análisis respirométrico. 
Para evaluar los perfiles de respiración de las cepas de A. vinelandii ATCC 
9046 y AT6 se empleó el sistema de monitoreo de la actividad respiratoria en línea 
(RAMOS por sus siglas en inglés) (Figura 6.1). El equipo cuenta con ocho matraces 
de 250 mL de volumen de llenado, que están adaptados a los sistemas de medición 
(válvulas de entrada de aire y sensor de oxígeno galvánico). La cabina cuenta con una 
plataforma de agitación que entrega velocidades de agitación entre 100 y 280 rpm, en 
la que se ajustan los matraces y finalmente un equipo de control de temperatura. 
Los cultivos se llevaron a cabo bajo condiciones de fijación de nitrógeno, en matraces 
de 250 mL con volumen de llenado (VL) de 10 y 50 mL a 200 y 100 rpm 
(respectivamente) y controlando la temperatura a 29 °C durante 24 h. 
El equipo RAMOS, permite determinar valores de velocidad de transferencia de 
oxígeno en cultivos desarrollados en matraces agitados a través de los diferenciales 
de presión parcial de oxígeno. El sistema funciona en ciclos repetitivos de medición y 
purga. Durante la fase de purga el flujo de aire es pasado a través del matraz a una 
velocidad de flujo específica (1.5 vvm). Al inicio de la fase de medición, las entradas y 
salidas de aire permanecen cerradas. Durante esta etapa, el metabolismo del 
microorganismo permite disminuir la presión de oxígeno e incrementar la presión 
parcial del dióxido de carbono (Figura 6.1). Posteriormente, las presiones parciales 
son monitoreadas por dos tipos de sensores, uno de concentración de oxígeno y otro 
que registra la diferencia de presiones parciales (Anderlei et al., 2004). Asumiendo 
que durante la fase de medición los cambios en las presiones son lineares, se calcula 
el valor para VTO, de la siguiente manera: 
𝑉𝑇𝑂 = 
∆𝑝O2
∆𝑡
VG
𝑅𝑇𝑉𝐿
 
 
 
 
31 
 
Una vez concluida la fase de medición, las válvulas se abren de nuevo para comenzar 
un nuevo ciclo de calibración y medición. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6.1 Principio de operación del equipo RAMOS (a), Parámetros obtenidos a través de 
la edición en línea (b) (Anderlei et al., 2004). 
 
Dado que los diferenciales de presión parcial de oxígeno en el matraz dependen del 
consumo de oxígeno por parte del microorganismo, se puede calcular el consumo 
específico de oxígeno a partir de los valores de VTO, en donde: 
𝑉𝑇𝑂 = 𝑉𝐶𝑂 ∴ 𝑞𝑂2 =
𝑉𝐶𝑂
𝑋
=
𝑉𝑇𝑂
𝑋
 
 
 
 
 
32 
 
7. – RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
CAPITULO 1 
Cultivos en Matraces Agitados 
7.1 Cultivos desarrollados bajo condiciones de fijación de nitrógeno. 
Se realizaron cultivos en matraces agitados para evaluar el efecto de la 
inactivación del gen phbB sobre el crecimiento y el grado de acetilación del alginato 
bajo condiciones de fijación de nitrógeno en la cepa AT6.Como se puede observar en la Figura 7.1a, bajo condiciones de fijación de nitrógeno 
los cultivos de la cepa mutante AT6 mostraron un comportamiento similar al de la cepa 
silvestre ATCC 9046 con respecto al crecimiento; obteniéndose hasta 0.53 ± 0 y 0.59 
± 0.03 g L-1 de proteína para la cepa AT6 y ATCC 9046 respectivamente (Figura 7.1a). 
Del mismo modo, este comportamiento también se ve reflejado en el consumo de 
glucosa, que mostró tendencias similares para ambas cepas (Figura 7.1b). En otras 
palabras, la cepa AT6 y la cepa parental ATCC 9046 presentan la misma velocidad 
específica de crecimiento y rendimientos similares de biomasa (medidas como 
proteína) con respecto a la fuente de carbono (Tabla 7.1). 
Estudios previos reportaron que al eliminar la ruta de síntesis de PHB en la cepa AT6, 
se generaba una descompensación en la regulación del poder reductor, favoreciendo 
la acumulación de metabolitos ácidos del ciclo de Krebs, los cuales acidificaron el 
medio de cultivo y limitaron el crecimiento de la cepa AT6 en cultivos no diazotróficos 
(Mejía Mandujano, 2004). Sin embargo, en este mismo trabajo se propuso que el 
proceso de fijación de nitrógeno podría compensar esta regulación, evitando la 
acumulación de metabolitos ácidos y permitiendo el correcto funcionamiento de las 
vías oxidativas y, de la misma forma, permitiendo el crecimiento. 
 
33 
 
Figura 7.1. Cinética de crecimiento con base en proteína (a), consumo de glucosa (b) y 
evolución del pH (c) para la cepa ATCC 9046 (-○-) y AT6 (-Δ-) de A. vinelandii en 
cultivos en matraces agitados a 200 rpm, bajo condiciones de fijación de nitrógeno. 
c 
a 
b 
c 
b 
34 
 
Tabla 7.1 Parámetros cinéticos de los cultivos en matraces agitados para las cepas ATCC 
9046 y AT6 de A. vinelandii bajo condiciones de fijación de nitrógeno. 
A. vinelandii 
µ 
h-1 
Y x/s 
gpro gglu-1 
ATCC 9046 0.11 ± 0.005 0.23 ± 0.06 
AT6 0.11 ± 0 0.24 ± 0.03 
 
Por otro lado, la evolución del pH en los cultivos nos permite observar que bajo 
condiciones de fijación de nitrógeno la acidificación del medio es similar en los cultivos 
de las cepas ATCC 9046 y AT6 (Figura 7.1c). Como se mencionó anteriormente, es 
posible que el proceso de fijación de nitrógeno juegue un papel de consumidor de 
poder reductor, evitando la acumulación de metabolitos ácidos en la cepa AT6, tal y 
como lo propuso Mejía Mandujano (2004), obteniéndose un comportamiento similar 
en los perfiles de pH entre la ATCC 9046 y la cepa AT6. Lo anterior confirma que las 
condiciones de cultivo bajo fijación de nitrógeno propuestas para este estudio 
permitieron desarrollar los cultivos sin problemas de crecimiento. 
Si bien, el desarrollo de cultivos bajo condiciones de fijación de nitrógeno nos permitió 
obtener cultivos sin problemas de crecimiento en la cepa AT6, estos resultados 
contrastan con lo reportado por Segura y colaboradores (2003b). Ellos reportan un 
crecimiento pobre en la cepa AT6 con respecto a la cepa silvestre ATCC 9046 en 
cultivos diazotróficos. Esta diferencia en el comportamiento del crecimiento puede 
deberse a las diferencias en el medio de cultivo empleadas entre ambos estudios. En 
el presente trabajo, el Medio Burk Modificado empleado por Segura y colaboradores 
fue suplementado con el regulador de pH, MOPS (Ácido 3-[N-morfolino] 
propanosulfónico) que posiblemente contribuyó con el crecimiento de la cepa AT6, al 
mejorar la regulación del pH en el medio. 
 
 
35 
 
Con respecto al grado de acetilación del alginato, se observa en la Figura 7.2 que el 
alginato producido por la cepa ATCC 9046 mostró un porcentaje de acetilación de 4.7 
± 0.7%, lo que corresponden a lo previamente descrito (4.7 ± 0.5 %) por Castillo y 
colaboradores (2013b), bajo las mismas condiciones de crecimiento. Por otro lado, 
para la cepa mutante AT6 se obtuvo un valor de 4.4 ± 0.4 %. 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7.2.Grado de acetilación del alginato obtenido para las cepas ATCC 9046 (█) y AT6 
(:::) de A. vinelandii en cultivos en matraces agitados a 200 rpm, bajo condiciones 
de fijación de nitrógeno. 
Bajo estas condiciones de crecimiento, no se encontraron diferencias significativas en 
el grado de acetilación entre ambas cepas. Sin embargo, tanto la velocidad especifica 
de crecimiento como la tensión de oxígeno disuelto se modifican a lo largo de la 
fermentación y se sabe que estos parámetros influyen sobre el grado de acetilación 
del alginato (Castillo et al., 2013a). 
 
 
 
 
 
 
36 
 
CAPITULO 2 
Cultivos en Biorreactores 
 
Con el propósito de evaluar el grado de acetilación del alginato producido por 
ambas cepas bajo condiciones de crecimiento controladas, se desarrollaron cultivos 
en biorreactores en donde es posible controlar tanto la tensión de oxígeno disuelto 
(TOD) como la velocidad específica de crecimiento (µ). 
7.2 Cultivos en lote desarrollados a 1 % de TOD y 300 rpm. 
En la segunda etapa del proyecto, el desarrollo de cultivos diazotróficos 
controlando la TOD (1 %) nos permitió conocer el comportamiento cinético de la cepa 
mutante para establecer el tiempo de inicio de alimentación y cosecha para los 
posteriores cultivos continuos; así como analizar las diferencias en el grado de 
acetilación del alginato bajo condiciones controladas de TOD. 
7.2.2. Control de TOD y perfiles de VTO. 
En la Figura 7.3a y b se muestra el control de la tensión de oxígeno disuelto 
(TOD) y el perfil de la velocidad de transferencia de oxígeno (VTO), en los cultivos 
desarrollados bajo condiciones de fijación de nitrógeno. El control del oxígeno disuelto 
fue cercano a 1%, tanto en los cultivos de la cepa silvestre como para la cepa mutante, 
manteniéndose constante en valores promedio de 0.82 ± 0.15 % y 0.82 ± 0.12 % 
respectivamente (Figura 7.3a).Por otro lado, en la Figura 7.3b se observa que para 
ambas cepas el perfil de la velocidad de transferencia de oxígeno (VTO), se 
incrementa desde el inicio de la fermentación hasta las 20 y 22 h de cultivo, llegando 
a un valor máximo de 22.8 ± 7.09 mmol L-1h-1 y de 13.3 ± 2.0 mmol L-1h-1 para la cepa 
AT6 y ATCC 9046 respectivamente. Posteriormente, los valores de VTO disminuyen 
hasta 2.8 y 3.9 mmol L-1 h-1 respectivamente. De la misma forma, se observa en la 
Figura 7.4b, que para estos tiempos de cultivo, las concentraciones de glucosa en el 
medio son cercanas a cero (0.48 ± 0.87 y 0.15 ± 0.13 g L-1 para la cepa AT6 y ATCC 
9046 respectivamente). Este comportamiento en la VTO es característico de los 
cultivos cuando la fuente de carbono es limitante, de acuerdo con lo reportado por 
Anderlei y colaboradores (2004). 
37 
 
Figura 7.3 Control de la TOD (a) y perfil de VTO (b) en cultivos en lote, para la cepa ATCC 
9046 y AT6 de A. vinelandii. 
7.2.3. Cinéticas de crecimiento y producción de alginato. 
Con respecto al crecimiento, se encontró que no existen diferencias 
significativas en la velocidad específica de crecimiento () entre ambas cepas, siendo 
de 0.11 ± 0.003 h-1 y 0.12 ± 0.038 h-1 para la cepa silvestre y mutante (Tabla 7.2). 
Además, los rendimientos de biomasa (medida como proteína) con base en la fuente 
de carbono, al igual que las velocidades específicas de consumo de sustrato, 
muestran que la distribución de glucosa hacia el crecimiento celular fue similar entre 
ambas cepas, obteniendo una concentración de proteína máxima de 0.61 ± 0.05 y 
0.64 ± 0.1 g L-1 para la cepa mutante y silvestre respectivamente (Figura 7.4a). 
0.82 ± 0.15 
 
0.82 ± 0.12 
 
a 
 
 
 
 
 
 
b 
 
ATCC9046 
AT6 
38 
 
Figura 7.4 Cinética de crecimiento celular con base en proteína (a) y consumo de glucosa (b) 
para la cepa ATCC 9046 (-●-) y AT6 (-▲-) de A. vinelandii en cultivos lote 
desarrollados en diazotrofía a 1 % de TOD. 
Tabla 7.2 Parámetros cinéticos y estequiométricos para la cepa ATCC 9046 y AT6 de A. 
vinelandii en cultivos lote a 1 % de TOD 
A. vinelandii 
µ 
(h-1) 
Y x/s(gprot gglu-1) 
qs 
(gglu gprot-1 h-1) 
ATCC 9046 0.11 ± 0.003 0.10 ± 0.03 0.69 ± 0.12 
AT6 0.12 ± 0.03 0.12 ± 0.02 0.58 ± 0.11 
a) 
 
 
 
 
 
b) 
 
 
 
 
 
c) 
a 
 
 
 
 
 
 
 
b 
39 
 
Por otro lado, se calcularon las velocidades específicas de consumo de oxígeno (qO2) 
a partir de los valores de VTOmax determinados en ambos cultivos. Como se observa 
en la Tabla 7.3, el qO2 fue 62 % mayor en la cepa mutante con respecto a la cepa 
silvestre. No obstante, este incremento en el metabolismo respiratorio no se reflejó en 
el crecimiento celular, aunque, sí se observaron diferencias significativas en la 
producción de alginato. 
Se observó que la producción de alginato se duplicó en los cultivos con la cepa AT6 
con respecto a la cepa silvestre ATCC 9046, siendo la máxima producción de alginato 
de 1.14 ± 0.06 g L-1 y 0.6 ± 0.03 g L-1, respectivamente. De la misma forma, los 
rendimientos de alginato con base en proteína y fuente de carbono muestran que la 
distribución de la fuente de carbono hacia la síntesis de alginato se ve favorecida en 
la cepa AT6 con respecto a la cepa ATCC 9046 (Tabla 7.3). Este comportamiento se 
había observado anteriormente en cultivos en matraces agitados, en donde la 
eliminación de la ruta de síntesis de PHB en la cepa AT6 permitió obtener hasta 2.09 
g L-1 de alginato, 1.4 veces más con respeto a la cepa silvestre ATCC 9046 (1.47 g L-
1) (Segura et al., 2003b). 
 
Tabla 7.3 Consumo específico de oxígeno (qO2), producción y rendimientos de alginato para 
la cepa ATCC 9046 y AT6 de A. vinelandii en cultivos lote a 1 % de TOD. 
 
 
 
 
Con respecto al grado de acetilación del alginato, Castillo-Marenco (2013) reportó que 
existe una relación inversa entre la producción de PHB y el proceso de acetilación, 
asociada a la distribución del precursor acetil-CoA entre ambas rutas. Con base en lo 
anterior, se esperaría que en la cepa AT6 incapaz de producir PHB dispusiera mayor 
cantidad de acetil-CoA para el proceso de acetilación del alginato. Sin embargo, como 
A. vinelandii 
qO2 
(mmolO2 gprot-1 h-1) 
Alginato 
(g L-1) 
Yp/s 
(galg gglu-1) 
Yp/x 
(galg gpro-1) 
ATCC 9046 27.1 ± 7.2 0.60 ± 0.03 0.10 ± 0.01 1.09 ± 0.2 
AT6 43.9 ± 13.9 1.14 ± 0.06 0.22 ± 0.02 1.92 ± 0.35 
40 
 
se observa en la figura 7.5, el grado de acetilación obtenido para el alginato producido 
por las cepas ATCC 9046 y AT6 no muestra diferencias significativas, siendo de 1.68 
± 0.51 y 1.41 ± 0.19 % respectivamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7.5 Grado de acetilación del alginato producido por la cepa ATCC 9046 (█) y AT6 (:::) 
de A. vinelandii en cultivos lote desarrollados en diazotrofía a 1 % de TOD. 
Los valores obtenidos en el grado de acetilación del alginato para la cepa AT6, podrían 
estar asociados a la distribución del intermediario acetil-CoA hacia el ciclo de Krebs. 
Senior y colaboradores (1972) propusieron que la actividad del ciclo de Krebs en A. 
beijerinckii se veía afectada negativamente bajo condiciones de limitación de oxígeno, 
observando bajas velocidades de consumo de oxígeno. Bajo este contexto, se 
esperaría una mayor disponibilidad de acetil-CoA para el proceso de acetilación en la 
cepa AT6 en cultivos a 1 % de TOD, ya que la producción de PHB está bloqueada y 
la actividad del ciclo de Krebs debería estar reducida. Sin embargo, se observa que el 
metabolismo respiratorio en la cepa AT6 es más activo que en la cepa silvestre ATCC 
9046, por lo que es posible que bajo estas condiciones de crecimiento (1 % TOD) el 
flujo de acetil-CoA se dirija en mayor medida al ciclo de Krebs que al proceso de 
acetilación, reflejándose en el incremento del metabolismo respiratorio. 
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Es importante señalar que en los cultivos lote, tanto los valores de VTO y qO2 fueron 
estimados mediante el análisis de los cambios en la presión parcial de oxígeno y 
nitrógeno en la alimentación, en dónde se asume que el valor de KLa es constante 
durante todo el cultivo. Sin embargo, derivado de la producción de alginato, este 
parámetro cambia conforme avanza el cultivo, por esta razón, se decidió llevar a cabo 
un experimento adicional para evaluar la actividad respiratoria de las cepas ATCC 
9046 y AT6 empleando un método en donde se consideran estos cambios en el KLa. 
Para esto se utilizó un sistema de monitoreo de la actividad respiratoria bajo 
condiciones de esterilidad (RAMOS por sus siglas en inglés Respiration Activity 
Monitoring System) (Anderlei y Büchs, 2001). 
Este sistema se utilizó para corroborar las diferencias en el metabolismo respiratorio 
entre la cepa AT6 y la cepa ATCC 9046. Para ello se llevaron a cabo cultivos por 
triplicado bajo condiciones de fijación de nitrógeno empleando el medio de cultivo 
MBM previamente descrito (sección 6.2), con volúmenes de llenado (VL) de 50 y 10 
mL a 100 y 200 rpm a 29 °C. 
Los valores que arrojó el análisis con respecto a la velocidad de transferencia de 
oxígeno se muestran en la Tabla 7.4. Se observa que, en los cultivos con VL de 50 mL 
a 100 rpm, la VTOmax fue de 3.1 y 3.4 mmol L-1 h-1 para la cepa ATCC 9046 y AT6 
respectivamente. Bajo estas condiciones de crecimiento, el consumo específico de 
oxígeno (qO2) en la cepa AT6 presenta un incremento del 9% con respecto al 
observado en la cepa silvestre (Tabla 7.4). Por otro lado, los cultivos a VL de 10 mL a 
200 rpm permitieron incrementar 10 veces la VTO y obtener cultivos sin limitación de 
oxígeno, llegando a un valor máximo de VTO de 29.8 y 23.7 mmol L-1 h-1 para la cepa 
ATCC 9046 y AT6 respectivamente. 
 
 
 
 
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Tabla 7.4. Velocidad máxima de transferencia de oxígeno y consumo específico de oxígeno 
para las cepas ATCC 9046 y AT6 de A. vinelandii. 
 
Cepa 
VTOmax 
mmolO2 L-1 h-1 
qO2 
mmolO2 gpro-1 h-1 
* ** * ** 
ATCC 9046 3.1 ± 0.0 29.8 ± 0.0 7.42 ± 1.4 17.9 ± 0.8 
AT6 3.4 ± 0.0 23.7 ± 0.0 8.11 ± 0.9 29.2 ± 4.7 
 *Cultivos a 100 rpm y VL de 50mL y ** Cultivos a 200 rpm y VL de 10mL 
 
En términos de consumo específico de oxígeno, las diferencias fueron evidentes en 
los cultivos sin limitación de oxígeno, es decir, con mayor VTO (200 rpm y 10 ml de 
volumen de llenado), ya que el consumo de oxígeno no estuvo limitado por la 
transferencia del mismo en el medio, en contraste con lo observado en los cultivos de 
menor VTO (cultivos desarrollados a 100 rpm y 50 mL). 
Las condiciones utilizadas en este último experimento permitieron identificar, el 
consumo específico de oxígeno para la cepa AT6 fue 63% mayor que para la cepa 
silvestre ATCC 9046 (Tabla 7.4). Lo anterior, nos permite apoyar la hipótesis de que 
el flujo de acetil-CoA en la cepa mutante (AT6) se dirige en mayor medida hacia 
metabolismo respiratorio y no al proceso de acetilación. 
El incremento en el metabolismo respiratorio en la cepa AT6 podría estar relacionado 
con la regulación del poder reductor en la célula. 
Es importante recordar que la síntesis de PHB también funciona como un regulador 
del poder reductor. Sin embargo, en la cepa mutante esta regulación podría estar 
asociada al proceso de fijación de nitrógeno a través de la activación de la cadena 
respiratoria desacoplada, que incrementa el consumo de oxígeno para oxidar las 
moléculas de poder reductor y para la protección del sistema nitrogenasa sin generar 
un exceso de energía (Berstsova et al., 2011). 
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Como se mencionó anteriormente, la cepa mutante muestra un comportamiento 
similar en crecimiento y acetilación del alginato con respecto a la cepa silvestre. Sin 
embargo, las diferencias en el metabolismo respiratorio y la producción de alginato 
permiten sugerir que tanto la fuente de carbono como de energía se dirigen en mayor 
medida hacia la producción de alginato. 
La figura 7.6 es un modelo que muestra el comportamiento de la cepa AT6 bajo estas 
condiciones de cultivo (1 % TOD y fijación de nitrógeno). Se observa que al bloquear 
la ruta de síntesis de PHB,