Estudio-de-la-biodegradacion-de-DIESEL-por-pseudomonas-SP

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
ESTUDIO DE LA BIODEGRADACIÓN DE DIESEL POR 
PSEUDOMONAS SP. 
 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA 
 
 
PRESENTA 
 
PRISCILLA CARRILLO BARRAGÁN 
 
 
 MÉXICO, D.F. ENERO 2012 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO 
 
PRESIDENTE: Profesora: María Guadalupe Tsuzuki Reyes 
VOCAL: Profesora: Adriana Guadalupe Mejía Chávez 
SECRETARIO: Profesor: Víctor Manuel Luna Pabello 
1er. SUPLENTE: Profesor: José de Jesús García Trejo 
2° SUPLENTE: Profesor: Luciano Hernández Gómez 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL, FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM. 
 
 
ASESOR DEL TEMA: DR. VÍCTOR MANUEL LUNA PABELLO 
 
SUPERVISOR TÉCNICO: M. EN C. LUCIANO HERNÁNDEZ GÓMEZ 
 
SUSTENTANTE: PRISCILLA CARRILLO BARRAGÁN 
AGRADECIMIENTOS 
A México, por la motivación para mejorar. 
A la Universidad Nacional Autónoma de México, por su grandeza, por las infinitas oportunidades. 
A la Facultad de Química, porque las lecciones que recibí en esta, mi casa, trascienden el ámbito 
académico. Por enseñarme humildad. 
Al Dr. Víctor Manuel Luna Pabello, por el apoyo, la confianza y las sonrisas. 
A los Maestros Guadalupe Tsuzuki, Adriana Mejía, Jazmín Aguilar, y Luciano Hernández, por 
compartir con tanta paciencia y amabilidad sus conocimientos. 
A mis profesores, muy especialmente al Dr. Rodolfo Pastelín, quien me reveló por primera vez el 
fascinante mundo de las bacterias, una de mis grandes pasiones. Y con todo el cariño, a la Dra. 
Perla Castañeda, porque siempre he podido contar con ella. 
A Canadá, a la Universidad de Alberta, por todo, por tanto. Con todo mi respeto y admiración, a la 
Dra. Julia Foght y a la Maestra Kathleen Semple, por abrir mi mente y nutrir mi amor hacia la 
microbiología ambiental. 
A mis compañeros y amigos del Laboratorio de Microbiología Experimental, especialmente a 
Teresa, que con su compañía y amistad hizo más feliz mi estancia en el laboratorio. Y a Edgar, por 
la generosidad de su amistad. 
A mis compañeros y amigos de la generación 2007, especialmente a Rafael Espejel Venado, el 
amigo incondicional con el que he recorrido el muy pesado camino de la química. 
A Francisco, por el aquí y el ahora, por vivir conmigo lo extraordinario en lo cotidiano. 
A mis amigas, Blanca, Giselle, Marcela, Paloma y Carla, por el tiempo juntas, por la aceptación, por 
el cariño, por la confianza, por su permanencia. 
A mi familia, abuelitos, tíos, primos, porque siempre me han creído mejor de lo que realmente soy. 
Espero no defraudarlos. 
DEDICATORIA 
A Dios, porque ha hecho maravillas. 
 
A mi mamá, María Guadalupe Barragán Limón, porque si tengo su amor, no me 
hace falta nada. Por ser mi puerto seguro, el refugio en el que siempre me puedo 
apoyar. Por su entrega y devoción. Por su infinita paciencia. Por su ternura y alegría. 
Por ser mí mejor amiga. 
 
A mi papá, Jorge Carrillo Romero, por su generosidad, por su esfuerzo, por sus 
sacrificios, por el coraje de su espíritu. Por enseñarme a ser mejor siempre, a no 
rendirme y a trabajar por conseguir mis sueños. Por ser mí más duro crítico, y así 
impulsarme siempre hacia adelante. 
 
A mi hermanita, Paulina Carrillo Barragán, por ser una fuente inagotable de alegría, 
porque con cada discusión siempre me enseña algo, por ser mi compañera 
incondicional desde toda la vida y para siempre. 
 
A la Naturaleza, por ser mi gran pasión, mi fuente de inspiración, el origen de todo 
lo asombroso. Porque la deuda es eterna. 
Este trabajo es resultado de su amor. 
 
 
 
 
 
 
“El árbol que mueve algunos a lágrimas de felicidad, 
en la mirada de otros no es más que un objeto verde 
que se interpone en el camino. 
Algunas personas ven la Naturaleza como algo ridículo y deforme, 
pero para ellos no dirijo mi discurso; 
y aún algunos pocos, no ven en la naturaleza nada en especial. 
Pero para los ojos de la persona de imaginación, 
la Naturaleza es imaginación misma.” 
William Blake 
 
 
 
“Empieza por ser tú el cambio que quieres ver en el mundo”. 
Mahatma Gandhi 
 
 
 
 
 
 
Índice 
 
ÍNDICE 
1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………..…... 1 
2. OBJETIVOS E HIPÓTESIS………………………………………………………….….. 3 
3. ALCANCES Y LIMITACIONES………………………………………………….……… 4 
4. ANTECEDENTES………………………………………………………………...………. 5 
 4.1. Diesel………………………….............................................................................. 5 
4.1.1 Características fisicoquímicas y composición…………………...………. 5 
4.1.2 Importancia……………………………………….…………………………... 6 
4.1.3 Contaminación y toxicidad asociadas al diesel………………………….. 7 
4.1.4 Normatividad………………...……………………………………………….. 8 
4.1.5 Remoción de hidrocarburos.……………………………………………..… 9 
4.1.6 Biorremediación…………………………………………………………..….. 9 
4.2 Biodegradación de hidrocarburos…………………..……………………………… 10 
4.2.1 Bacterias degradadoras de hidrocarburos……….………………….…… 10 
4.2.2 El género Pseudomonas………………………..………………………..… 11 
4.2.3 Pseudomonas aeruginosa…………………………………………….…… 13 
4.2.4 Mecanismos de biodegradación de alcanos en agua………………….. 15 
4.2.5 Degradación de alcanos por Pseudomonas……………………………... 16 
 4.3 Factores ambientales que limitan la degradación de hidrocarburos.....……..… 19 
4.4.1 Las proporciones Carbono:Nitrógeno y Carbono:Fósforo…………...…. 22 
 
 
 
 
Índice 
 
5. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………………... 23 
 5.1 Estrategia de trabajo…………………………………………………………………. 23 
 5.2 Descripción bacteriana…………………………...…………..………………………. 24 
 5.2.1 Preservación de cepas………………………………………………………. 24 
 5.2.2 Descripción morfológica, bioquímica y de crecimiento…………………... 24 
 5.2.3 Aislamiento, purificación de ADN 25 
 5.2.4 Secuenciación del gen 16S rRNA…………………………………………... 25 
 5.2.5 Tolerancia al diesel………………………………………………….............. 25 
 5.3 Crecimiento bacteriano…….……………………………………………………….... 26 
5.3.1 Curva de crecimiento en medio mineral con glucosa……………………. 26 
5.3.2 Curva de crecimiento en medio mineral sin fuente de carbono……….... 26 
 5.3.3 Curva de crecimiento en medio mineral con diesel………………………. 26 
 5.3.4 Determinación del porcentaje de biodegradación………………………… 27 
 5.3.4.1 Extracción de diesel……………………………………………………... 28 
 5.3.4.2 Cromatografia de gases……………………………………………….… 28 
 5.3.4.3. Curva patrón…………..……………………………………………..…. 28 
 5.4 Modificación de las proporciones de nitrógeno y fósforo en el medio…..………. 28 
 5.4.1 Modificación de la formulación del medio mineral…………………………. 29 
 5.4.2 Determinación de las cinéticas de degradación………………………….… 29 
 5.5 Estudio del crecimiento bacteriano en agua residual sintética…………….….… 30 
 5.5.1 Curvas de crecimiento………………………………………………………… 30 
 5.5.2 Cuantificación de la concentración de glucosa…………………………….. 31 
Índice 
 
6. RESULTADOS Y ANÁLISIS……………………………………………..……………….. 32 
 6.1 Descripción bacteriana………………………………………………….………. 32 
 6.1.1 Descripción morfológica, bioquímica y de crecimiento.…...………………32 
 6.1.2 Secuenciación del gen 16S rRNA de Pseudomonas aeruginosa………... 34 
 6.1.3 Tolerancia al diesel……………………………………………………………. 35 
 6.2 Crecimiento bacteriano……………………………………………………………….. 35 
 6.2.1 Control positivo y negativo…………………………………………............... 35 
 6.2.2 Crecimiento bacteriano en medio mineral con diesel……………………... 37 
 6.2.3 Porcentaje de biodegradación de las cinco cepas en estudio……………. 38 
 6.3 Modificación de las proporciones de nitrógeno y fósforo en el medio…………... 41 
 6.3.1 Porcentaje de biodegradación en las diferentes formulaciones………….. 41 
 6.3.2 Curvas de crecimiento en medio mineral y medio mineral adicionado 
con nitrógeno………………………………………………………................ 
 
43 
 6.3.3. Cinéticas de degradación de diesel en medio mineral y medio mineral 
adicionado con nitrógeno…………………………………………………… 
 
46 
 6.4 Estudio del crecimiento bacteriano en agua residual…………………………….. 48 
 6.4.1 Curva de crecimiento en agua residual……………………………………... 48 
 6.4.2 Concentración de glucosa en agua residual……………………………….. 51 
 6.4.3 Cinética de degradación de diesel en agua residual……………………… 52 
7. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………………. 55 
 7.1 Crecimiento en diesel……………………………………………………………….... 55 
 7.2 Modificación de las proporciones carbono:nitrógeno y carbono:fosforo………… 56 
 7.3 Crecimiento en agua residual………………………………………………………... 58 
Índice 
 
 
ECUACIONES 
 
5.1 Porcentaje de biodegradación…………………………………………………………... 27 
5.2 Cinética de biodegradación de diesel….………………………...…………………….. 29 
6.1 Número aproximado de bacterias en función de la turbidez del medio………..…... 35 
6.2 Concentración de HTP’s como función del área cromatográfica……………..…….. 38 
6.3 Concentración de glucosa a partir de la absorbancia a 490nm………..……………. 51 
 
FIGURAS 
 
4.1 Estructura del sistema alcano hidroxilasa de P. putida GPo1………………………. 17 
4.2 Ejemplos de reacciones de oxidación catalizadas por el sistema alcano 
hidroxilasa……….………………………………………………………………...…………… 
 
18 
5.1 Etapas del desarrollo experimental…….………………………………………………. 23 
6.1 Geles de agarosa de la purificación del gen 16S rRNA........................................... 34 
8. CONCLUSIONES………………………………………………………………………….. 59 
ANEXOS……………………………………………………………………………………….. 60 
 1. Preparación de la curva de McFarland….…………………………………............... 60 
 2. Procedimiento para las extracciones y determinaciones cromatográficas………. 62 
 3. Técnica de calibración de asas bacteriológicas…………………………………….. 65 
 4. Procedimiento de conteo en placa por el método de Miles y Misra………………. 67 
 5. Método de amplificación de ADN…………………………………………………….. 68 
 6. Determinación de azúcares por el método fenol-ácido sulfúrico…………………... 69 
REFERENCIAS………………………………………………………………………………... 71 
Índice 
 
GRÁFICAS 
6.1 Crecimiento bacteriano en medio mineral con glucosa al 4% en función del 
tiempo…………………………………………………………………………………………… 
 
35 
6.2 Curva de crecimiento de las cinco especies en medio mineral con diesel al 4%..... 37 
6.3 C0 y C14 de diesel para las cinco especies de Pseudomonas……………................. 39 
6.4 Porcentaje de biodegradación de diesel por las especies de Pseudomonas……… 39 
6.5 C0 y C14 de diesel en las diferentes formulaciones de medio mineral………………. 42 
6.6 Porcentaje de biodegradación de P. aeruginosa en las diferentes formulaciones 
de medio mineral………………………………………………………………………………. 
 
42 
6.7 Curva de crecimiento de P. aeruginosa en medio mineral original y medio mineral 
adicionado con nitrógeno. Monitoreo de la turbidez del medio…………………………... 
 
44 
6.8 Curva de crecimiento de P. aeruginosa en medio mineral original y medio mineral 
adicionado con nitrógeno. Conteo en placa………………………………………………... 
 
44 
6.9 Curva de la concentración de diesel en medio mineral y medio mineral adicionado 
con nitrógeno en función del tiempo…………………...……………………………………. 
 
47 
6.10 Curva del porcentaje de biodegradación de diesel en medio mineral y medio 
mineral adicionado con nitrógeno en función del tiempo................................................ 
 
47 
6.11 Curva de crecimiento de P. aeruginosa en medio mineral y agua residual. 
Monitoreo de la turbidez del medio…………………………….……………………………. 
 
48 
6.12 Curva de crecimiento de P. aeruginosa en medio mineral y agua residual. 
Conteo en placa…………………………………………………….…………………………. 
 
48 
6.13 Concentración de glucosa en agua residual sintética como función del tiempo.... 51 
6.14 Curva de la concentración de diesel en medio mineral y agua residual sintética 
en función del tiempo …………………………………………………..…………………….. 
 
53 
6.15 Curva del porcentaje de biodegradación de diesel en medio mineral y agua 
residual sintética en función del tiempo …….……………………………………………… 
 
53 
Índice 
 
TABLAS 
4.1 Límites máximos permisibles de grasas y aceites en aguas residuales de México 
y Los Estados Unidos de América…...……………………………………………………… 
 
8 
4.2 Diferentes hidrocarburos presentes en el petróleo crudo y sus derivados y los 
géneros bacterianos capaces de degradarlos……………………………………………... 
 
11 
4.3 Pseudomonas degradadoras de alcanos……………………..……………................. 12 
5.1 Cantidades y proporción de los nutrientes N y P en el medio de cultivo…………… 29 
5.2 Fórmula del agua residual sintética…………………………………………………….. 30 
6.1 Pruebas bioquímicas y de crecimiento de las cinco cepas en estudio……………… 32 
6.2 Características micro y macroscópicas, metabólicas y de pigmentación de P. 
aeruginosa……………………………………………………………………………………… 
 
33 
6.3 Parámetros del crecimiento exponencial en medio mineral con glucosa al 4% para 
las cinco cepas de estudio……………………………………………………………............ 
 
 36 
6.4 C0 y C14 de diesel para cada cepa de estudio y sus porcentajes de 
biodegradación…………………………………………………………………………………. 
 
38 
6.5 Análisis estadístico de la gráfica 6.3……………………………………………………. 39 
6.6 Análisis estadístico de la gráfica 6.4……………………………………………………. 39 
6.7 C0 y C14 y % de biodegradación de diesel obtenidos en las diferentes 
formulaciones de medio mineral……………………..………………………………………. 
 
41 
6.8 Análisis estadístico de la gráfica 6.7……………………………………………………. 42 
6.9 Análisis estadístico de la gráfica 6.8..…….……………………………………………. 43 
6.10 ANOVA de una vía de las formulaciones: original, adicionada con fósforo y 
adicionada con nitrógeno y fósforo………………………………………………………….. 
 
43 
6.11 Correlación entre las curvas de crecimiento determinadas mediante turbidez y 
conteo en placa………………………………………………………………………………… 
 
45 
Índice 
 
6.12 Parámetros del crecimiento exponencial de P. aeruginosa en medio mineral y 
medio mineral adicionado con nitrógeno……………………………………………………. 
 
46 
6.13 Concentración de diesel y % de biodegradación en medio mineral y medio 
mineral adicionado con nitrógeno en función del tiempo....………………………………. 
 
46 
6.14 Parámetros cinéticos de la degradación de diesel en medio mineral y medio 
mineral adicionado con nitrógeno………………………………………………………........ 
 
47 
6.15 Concentración de diesel y % de biodegradación en medio mineral y agua 
residual sintética en función del tiempo……………………………………………………... 
 
52 
6.16 Parámetros cinéticos de la degradación de diesel en medio mineral y agua 
residual sintética……………………………………………………………………………….. 
 
54 
 
 
Priscilla Carrillo Barragán 1 
 
 
1. INTRODUCCIÓN 
 
Los productos del petróleo son una de las principales fuentes de energía para la 
vida humana y la producción industrial alrededor del mundo. Sin embargo, la 
contaminación ambiental asociada a su procesamiento es una característica común en 
naciones productoras de petróleo (Kim et al., 2003). 
Se ha reportado que el diesel, proveniente de la refinación del petróleo crudo,causa gran variedad de efectos sub-letales en una amplia gama de organismos vivos 
(Head et al., 1999). Las consecuencias de toxicidad causadas por hidrocarburos del 
petróleo han sido documentadas en peces, aves marinas, ratones y poblaciones 
bacterianas. Además, debido a que el diesel contiene muchos compuestos tóxicos 
concentrados, puede influir negativamente en el desarrollo de plantas y 
microorganismos del suelo, así como contaminar el agua subterránea, que puede ser 
de consumo humano o de uso agrícola. Así, el agua contaminada por diesel representa, 
aún a las más bajas concentraciones, una amenaza para el ambiente (Chukwuneke et 
al., 2011). 
En el esfuerzo por solucionar esta problemática, una gran variedad de métodos han 
sido desarrollados. Si bien, muchos de los métodos físicos y químicos establecidos son 
eficientes, también son caros y pueden causar nueva contaminación por la producción 
de contaminantes secundarios. Por lo que un tratamiento biológico puede ser adecuado 
(Leahy et al., 1990). 
La biorremediación es la degradación biológica de contaminantes orgánicos. Esta 
técnica no siempre es apropiada pues el tipo de sustancias para el que es efectiva es 
limitado y los niveles de contaminantes residuales alcanzados pueden no ser los 
requeridos (Vidali, 2001). Sin embargo, ha sido utilizada exitosamente en la remoción 
de petróleo y sus derivados, presentes en suelos y aguas; demostrando ser un 
tratamiento altamente eficiente, de bajo costo, relativamente rápido, de aplicación in situ 
y ex situ, además de ser compatible con otras técnicas (Hong, 2005). 
Introducción 
 
Priscilla Carrillo Barragán … 2 
 
Los microorganismos que pueden degradar hidrocarburos están distribuidos de 
manera ubicua en ambientes terrestres y marinos. Sin embargo, cuando su número es 
poco o inexistente, o cuando no hay tiempo para esperar el enriquecimiento natural de 
una población apropiada, la inoculación (bioaumentación) puede ser una opción viable 
que reducirá el tiempo de tratamiento (Venkateswaran et al., 1995). 
Por lo anterior, resulta importante el estudio de especies bacterianas que puedan 
degradar un espectro amplio de hidrocarburos, especialmente los compuestos de difícil 
transformación (Yuste et al., 2000). 
Las pseudomonas tienen requerimientos nutritivos muy simples y crecen 
quimioorganotróficamente a pH neutro en un rango mesofílico de temperaturas. Una de 
las características más representativas de las pseudomonas, es el amplio abanico de 
compuestos que pueden utilizar como fuentes de carbono y energía. Las pseudomonas 
son ecológicamente significativas en el suelo y agua, y probablemente los 
responsables de la degradación de muchos de los compuestos presentes en estos 
ambientes (Madigan et al., 2004). 
Se ha reportado que algunas especies de Pseudomonas presentan afinidad para 
utilizar hidrocarburos (Garrity, 2005; Hong, 2005), por lo que en este estudio se evaluó 
la capacidad de algunas cepas del género Pseudomonas, aisladas previamente del 
piso de un taller mecánico, para degradar diesel, medida como desaparición de la 
concentración de Hidrocarburos Totales del Petróleo rango diesel (HTP’s rd) por 
cromatografía de gases, seleccionando a la cepa que tuvo mayor porcentaje de 
degradación de este combustible. Posteriormente, se obtuvo la cinética de degradación 
de la cepa seleccionada en medio mineral adicionado con diesel como única fuente de 
carbono. Se evaluó la inducción de la degradación de diesel modificando las 
proporciones carbono:nitrógeno y carbono:fósforo de la fórmula original de medio 
mineral (Foght et al., 1990). Finalmente, se determinó la cinética de degradación en 
agua residual sintética contaminada con diesel, observando el efecto de la presencia de 
otra fuente de carbono en la degradación de diesel. 
 
 
Priscilla Carrillo Barragán 3 
 
 
2. OBJETIVOS E HIPÓTESIS 
 
2.1 Objetivo general. 
 Estudiar la degradación de diesel, a nivel laboratorio, por Pseudomonas sp. 
 
2.2 Objetivos particulares. 
 Determinar la capacidad de degradación en diesel de las cinco especies del 
género Pseudomonas. 
 Seleccionar la especie con mayor capacidad degradadora de diesel. 
 Identificar a la especie con mayor capacidad degradadora de diesel. 
 Incrementar la capacidad de degradación de diesel de la especie seleccionada 
modificando las proporciones C:N y C:P en el medio de cultivo. 
 Estudiar el crecimiento de la especie seleccionada en el agua residual sintética. 
 
2.3 Hipótesis. 
 Las especies del género Pseudomonas presentarán afinidad diferencial para 
degradar diesel contenido en agua. 
 El porcentaje de biodegradación de la cepa seleccionada se incrementará al 
modificar las proporciones de C:N y C:P en el medio. Por otra parte, es de 
esperarse que el porcentaje de degradación de diesel disminuya en agua residual 
sintética debido a la presencia de una fuente de carbono alterna al diesel.
 
Priscilla Carrillo Barragán 4 
 
 
3. ALCANCES Y LIMITACIONES 
3.1 Alcances 
 Determinación, por cromatografía de gases, del porcentaje de degradación de 
diesel de las cinco especies de Pseudomonas en estudio. 
 Aislamiento, purificación y secuenciación del 16S rRNA de la especie 
seleccionada. 
 Evaluación del porcentaje de degradación de diesel de la especie seleccionada en 
cuatro modificaciones de la fórmula original del medio mineral. 
 Selección de la mejor modificación de medio mineral. 
 Determinación de la cinética de degradación de diesel de la cepa seleccionada en 
las formulaciones original y modificada de medio mineral, así como en agua 
residual. 
3.2 Limitaciones 
 Los experimentos se realizaron a escala laboratorio, bajo condiciones controladas 
de temperatura (30°C ± 2°C) y agitación (200 rpm). 
 La concentración de diesel inicial en todos los experimentos fue de 40000.00 ppm 
±1459.93ppm 
 Se utilizaron cultivos axénicos. 
 La medición del crecimiento bacteriano, para las curvas de crecimiento de las 
cinco especies en estudio, se realizó mediante turbidimetría. 
 La concentración de diesel se midió por cromatografía de gases como el área de 
los HTP’s rd de C-10 a C-28. 
 El agua residual sintética se preparó con base en las proporciones de nutrientes 
presentes en agua residual doméstica. 
 
Priscilla Carrillo Barragán 5 
 
4. ANTECEDENTES 
4.1. DIESEL 
 
El diesel es una mezcla compleja de hidrocarburos entre 9 y 28 carbonos 
predominantemente, con densidad menor a la del agua, baja solubilidad, viscosidad de 
media a baja, absorción variable en suelos y susceptible de ser biodegradada (Penet et 
al., 2004). 
 
4.1.1. Características fisicoquímicas y composición. 
Este combustible es producido en diferentes grados, dependiendo del uso para el 
que se planea, y se encuentra constituido por parafinas, isoparafinas, naftenos, 
oleofinas y compuestos aromáticos; cada uno con sus propias características físicas y 
químicas (Hagenow et al., 2010). 
 Parafinas (alcanos). Son cadenas de hidrocarburos con enlaces simples de 
carbono. Representan un subgrupo de hidrocarburos saturados, el término 
saturado hace referencia a que el enlace simple de carbono produce el potencial 
máximo de contenido de hidrógeno. 
 
 Naftenos. Son hidrocarburos cíclicos saturados. Su cantidad varía en el petróleo 
crudo. Se generan a partir de la hidrogenación de compuestos aromáticos. 
 
 Oleofinas (alquenos). Soncadenas lineales o ramificadas de hidrocarburos 
simples o poli-insaturados. Su presencia es menor que las n-parafinas, pero se 
encuentran en altas concentraciones. 
 
 
 
Antecedentes 
 
Priscilla Carrillo Barragán 6 
 
 Compuestos aromáticos. Son hidrocarburos cíclicos en los que los átomos de 
carbono presentan enlaces dobles de carbono entre ellos de manera alternante. 
Se distinguen en mono, di y tri aromáticos, con base al número de anillos 
aromáticos en su estructura. En el diesel predominan los compuestos 
monoaromáticos con cadenas laterales de diferentes longitudes (15-25% en 
peso). Los compuestos diaromáticos representan el 5% y los triaromáticos y 
poliaromáticos son menos del 1% en peso. 
 
 En menor cantidad pueden encontrarse diferentes aditivos, como mejoradores de 
flujo (etil-vinil acetatos), mejoradores de ignición (etil-hexil nitrato), compuestos 
anti-desgaste (ácidos grasos), compuestos anti-espuma (silicón a bajas 
concentraciones), detergentes (derivados de aminas, amidas y polieteraminas), 
agentes anti-corrosión y anti-oxidantes. 
 
4.1.2. Importancia. 
Por mucho tiempo, el diesel fue visto únicamente como un producto secundario de 
la producción de gasolina. Actualmente es utilizado en todo el mundo, obteniéndose 
casi exclusivamente de la refinación del petróleo crudo. 
Este combustible se utiliza comúnmente en motores mecánicos y generadores de 
energía. Es de amplio uso en locomotoras, maquinaria de construcción, medios de 
transporte urbano y camiones de carga pesada, además de sus múltiples aplicaciones 
industriales. 
En México, la Secretaría de Energía (www.sener.gob.mx) reportó que en abril de 
2011 la producción de diesel registró un promedio de 202,2 miles de barriles diarios. 
Mientras que la Administración de la Información en Energía de Estados Unidos 
(www.eia.gov), reportó un consumo de 306,0 barriles diarios durante el mismo mes. 
Resultando evidente la importancia del diesel en el desarrollo de la vida diaria así como 
en la producción industrial en nuestro país y alrededor del mundo. 
 
 
Antecedentes 
 
Priscilla Carrillo Barragán 7 
 
4.1.3. Contaminación y toxicidad asociadas al diesel. 
Sin embargo, ligada a su procesamiento, la contaminación ambiental ocasionada 
por combustibles derivados del petróleo es una característica común en las naciones 
que los producen. De manera particular, el tratamiento de aguas contaminadas con 
hidrocarburos es un tema cada vez más relevante, pues estos compuestos llegan a 
cuerpos de aguas naturales como consecuencia de vertidos naturales de pozos 
petroleros submarinos o son resultado de actividades humanas, tales como el 
transporte o explotación industrial del petróleo, y accidentes provocados en zonas 
costeras; acciones que de manera individual o en su conjunto, pueden suponer grandes 
catástrofes ecológicas por su impacto sobre el ecosistema, así como por sus 
repercusiones sociales y económicas (OMS, 2005; Ortíz, 2011). 
Particularmente, se ha reportado que el diesel causa gran variedad de efectos sub-
letales en una amplia gama de organismos vivos (Gold-Bouchot et al., 1997). Las 
consecuencias de la intoxicación causada por hidrocarburos del petróleo han sido 
documentadas en peces, aves marinas, ratones y microorganismos. El diesel contiene 
muchos compuestos tóxicos concentrados, y la contaminación por diesel puede 
influenciar negativamente el desarrollo de plantas y microorganismos del suelo, así 
como contaminar el agua subterránea, que puede ser de consumo humano o de uso 
agrícola (Connell et al., 1981). 
La presencia de diesel en agua es de especial importancia, pues Chukwuneke y 
colaboradores (2011), monitorearon parámetros sanguíneos en ratones que bebieron 
agua contaminada con diesel al 1% durante seis semanas, encontrando disminución en 
el paquete celular, en la concentración de hemoglobina y eritrocitos, lo que afecta la 
capacidad de transporte de oxígeno en la sangre. Observaron además, efectos 
hemolíticos atribuibles a la reducción de anti-oxidantes causadas por los hidrocarburos 
(Chiu et al., 1982). Por otra parte, las concentraciones de los productos de desecho 
creatinina y bilirrubina aumentaron significativamente, así como la cantidad de enzimas 
como la fosfatasa alcalina, que indican daño hepático. Las concentraciones de 
neutrófilos y basófilos aumentaron considerablemente, lo que sugiere que los productos 
del petróleo podrían producir alergia. Connell y Miller (1981), por su parte, ya habían 
Antecedentes 
 
Priscilla Carrillo Barragán 8 
 
reportado la supresión en la eritropoyesis ocasionada por la intoxicación con 
hidrocarburos. 
 Así, el agua contaminada por diesel representa, aún a las más bajas 
concentraciones, una amenaza para el ambiente, pues la salud de los seres humanos y 
otras especies expuestas a este contaminante puede ser afectada (Chukwuneke et al. 
2011). 
 
4.1.4. Normatividad. 
Debido a lo anterior, el vertido de hidrocarburos en aguas residuales se encuentra 
regulado. En México, la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales en la 
NOM-001-SEMARNAT-1996 define como aguas residuales a ―las aguas de 
composición variada provenientes de las descargas de usos municipales, industriales, 
comerciales, de servicios, agrícolas, pecuarios, domésticos, incluyendo 
fraccionamientos y en general de cualquier otro uso, así como la mezcla de ellas.‖ 
Incluyendo a los hidrocarburos en la categoría de grasas y aceites como 
contaminantes. 
En los Estados Unidos de América, la Agencia de Protección Ambiental (EPA) ha 
establecido pautas para regular la concentración de contaminantes en el efluente de 
aguas residuales, según la rama industrial. En la tabla 4.1 se resumen los límites 
permitidos de grasas y aceites para las industrias relacionadas con la refinación del 
petróleo. 
Tabla 4.1. Límites máximos permisibles de grasas y aceites en aguas residuales de México y 
Estados Unidos. 
Entidad gubernamental Límite máximo permisible 
Promedio diario (mg/L) 
Norma 
SEMARNAT 75 NOM-002-SEMARNAT-1996 
EPA 100 EPA-821-R-04-014 
 
 
Antecedentes 
 
Priscilla Carrillo Barragán 9 
 
4.1.5. Remoción de hidrocarburos. 
Debido a la necesidad de tratar la contaminación por hidrocarburos, una gran 
variedad de métodos han sido desarrollados, entre los que se encuentran la excavación 
y confinamiento, extracción con vapor, estabilización y solidificación, lavado de suelos, 
extracción crítica de fluidos, precipitación química, vitrificación, desorción térmica, 
incineración, entre otras (Skladany y Metting, 1993). Desafortunadamente, algunos de 
estos tratamientos fisicoquímicos no destruyen a los hidrocarburos sino que los 
transfieren de un lugar a otro; y los que son eficientes llegan a ser costosos y pueden 
causar nueva contaminación por la producción de contaminantes secundarios (Quijano, 
2006). Por lo que un tratamiento biológico puede ser adecuado (Yuste et al., 2000). 
En referencia al tratamiento de aguas residuales, los procesos biológicos son 
comúnmente empleados para eliminar el material orgánico disuelto, que es 
frecuentemente el más difícil y costoso de eliminar. Cuando dichos materiales son 
biodegradables, puede involucrarse la intervención de microorganismos procariontes, 
como las bacterias, y de los eucariontes, como las algas, hongos, protozoos, rotíferos y 
nematodos(Luna-Pabello, 2006). 
 
4.1.6. Biorremediación. 
Una de las funciones principales de los microorganismos en el medio ambiente es 
mineralizar la materia orgánica en los grandes ciclos del nitrógeno, carbono y azufre, 
entre otros. Desde hace tiempo se ha utilizado esta capacidad degradadora de ciertos 
grupos microbianos para eliminar hidrocarburos derivados del petróleo cuando entran 
en contacto con el medio ambiente (Atlas, 1998). 
Así, la biorremediación es la degradación microbiológica de contaminantes 
orgánicos, tales como el petróleo y sus derivados presentes en suelos y aguas. Esta 
técnica tiene los beneficios de ser un tratamiento altamente eficiente, de bajo costo, 
relativamente rápido, de aplicación in situ y ex situ, además de ser compatible con otras 
técnicas (Hong, 2005). 
Antecedentes 
 
Priscilla Carrillo Barragán 10 
 
4.2. BIODEGRADACIÓN DE HIDROCARBUROS 
 
El gran espectro metabólico existente entre los distintos microorganismos, les 
permite colonizar cualquier ambiente por inhóspito que parezca (Rosas et al, 2004). 
Los microorganismos con la habilidad de degradar hidrocarburos están distribuidos 
de manera ubicua en ambientes terrestres y marinos. Sin embargo, cuando el número 
de microorganismos propios del área contaminada y que son capaces de biodegradar 
estos compuestos es poco o inexistente, o cuando no hay tiempo para esperar el 
enriquecimiento natural de una población apropiada, la inoculación (bioaumentación) 
puede ser una opción realista que reducirá el tiempo de tratamiento (Venkateswaran et 
al. 1995). 
 
4.2.1. Bacterias degradadoras de hidrocarburos. 
Por lo anterior, resulta importante el estudio de cepas bacterianas que puedan 
degradar un espectro amplio de hidrocarburos (Yuste et al. 2000). 
Los alcanos son hidrocarburos altamente reducidos que constituyen alrededor del 
20 al 50% del petróleo crudo. Estos compuestos son una fuente de carbono y energía 
para microorganismo de diferentes géneros pertenecientes a las -, - y -
Proteobacterias. Entre dichos géneros, destacan Mycobacterium, Rhodococcus, 
Bacillus, Acinetobacter y Pseudomonas. Especialmente el último ha jugado un rol 
destacado en estudios de degradación de petróleo y alcanos. 
En la tabla 4.2 se mencionan diferentes hidrocarburos presentes en el petróleo 
crudo y sus derivados, y algunos de los grupos y géneros bacterianos más 
representativos capaces de degradarlos. 
 
 
Antecedentes 
 
Priscilla Carrillo Barragán 11 
 
Tabla 4.2. Hidrocarburos presentes en el petróleo crudo y sus derivados; y los grupos y géneros 
bacterianos capaces de degradarlos. 
Clase de hidrocarburo Bacterias degradadoras 
 
 
Alcanos 
Pseudomonas 
Acinetobacter 
Rhodococcus 
Nocardia 
Burkholderia 
 
Alquenos 
Methylococcus 
Methylosinus 
 
Isoalcanos 
Pseudomonas 
Brevibacterium 
Cicloalcanos Xanthobacter 
 
Monoaromáticos 
Pseudomonas 
Syntrophus 
 
Poliaromáticos 
Pseudomonas 
Rhodococcus 
 
 
Heterocíclicos 
Pseudomonas 
Syntrophus 
Bacterias sulfatoreductoras 
Bacterias desnitrificantes 
*Modificada de Quijano, G.G. (2006) 
 
4.2.2. El género Pseudomonas. 
Pseudomonas es un género versátil, de las -proteobacterias, que es capaz de 
degradar una amplia variedad de compuestos. Todos los miembros de este género son 
bacilos rectos o ligeramente curvos; tamaño de 0,5-1,0m por 1,5-4,0m; no 
esporulados; Gram negativos; con presencia de flagelos polares normalmente aislados; 
metabolismo respiratorio, no fermentativo, aunque pueden producir pequeñas 
cantidades de ácido a partir de la glucosa en aerobiosis; quimioorganotrofos; algunos 
pueden utilizar nitrato como aceptor de electrones en anaerobiosis (Garrity et al., 2005; 
Madigan et al., 2004). 
 
Antecedentes 
 
Priscilla Carrillo Barragán 12 
 
Las Pseudomonas tienen requerimientos nutritivos muy simples y crecen 
quimioorganotróficamente a pH neutro en un rango mesofílico de temperaturas. Una de 
las características que más llaman la atención de Pseudomonas, es el amplio abanico 
de compuestos que pueden utilizar como fuentes de carbono y energía. Algunas de las 
especies utilizan más de 100 compuestos y solamente unas pocas especies utilizan 
menos de 20. Debido a que el catabolismo de los sustratos orgánicos a menudo precisa 
la actividad de varias enzimas diferentes, las Pseudomonas son ecológicamente muy 
significativas en el suelo y agua y probablemente las responsables de la degradación 
de muchos de los compuestos presentes en estos ambientes (Garrity et al., 2005; 
Madigan et al., 2004). 
 En cuanto a degradación de hidrocarburos se refiere, varias cepas alcano-
degradadoras de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens y 
Pseudomonas putida han sido bien caracterizadas. Los otros linajes principales de 
Pseudomonas; Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas chlororaphis, y Pseudomonas 
syringae, también contienen alcano-degradadoras, pero estas no se han estudiado en 
detalle (van Beilen et al., 2004). En la tabla 4.3 se resumen algunas cepas 
degradadoras de alcanos. 
Tabla 4.3. Pseudomonas degradadoras de alcanos 
Cepa Colección 
Degradación de alcanos 
reportados 
P. putida GPo1 ATCC 29347 C5-C13 
P. putida P1 - C6-C12 
P. aeruginosa KSLA 473 KSLA 473 C6-C18 
P. aeruginosa 196 Aa NCIMB 9571 C7-C16 
P. aeruginosa Sol 20 NCIMB 8704 C6-C16 
P. aeruginosa LA-P-6 ATCC 17423 C6-C16 
P. aeruginosa NCIMB 9904 C12 
P. fluorescens CHA0 - C10-C32 
P. indica IMT37 DSM 14015T C4-C10 
Pseudomonas sp. 7/156 - - 
P. aureofaciens RWTH 529 - C10 
P. denitrificans - C6-C10 
P. oleovorans DSM 1045T, ATCC 8062 C8 
*Modificada de van Beilen et al., 2004 
Antecedentes 
 
Priscilla Carrillo Barragán 13 
 
4.2.3. Pseudomonas aeruginosa. 
Pseudomonas aeruginosa es un organismo con un gran repertorio de rutas 
metabólicas, que no sólo es capaz de adaptarse, sino de sobrevivir y persistir en una 
amplia gama de condiciones medio ambientales. P. aeruginosa es probablemente la 
especie bacteriana más generalizada, ya que puede ser aislada de suelos y agua. 
Bacilos Gram-negativos, mótiles por medio de un solo flagelo polar, este organismo 
utiliza la vía Entner-Doudoroff en lugar de la glucólisis para oxidar azúcares, incluidas la 
fructosa, la galactosa, la glucosa y la xilosa, es positiva a la oxidasa, y puede crecer a 
temperaturas de hasta 42° C, aunque su temperatura óptima de crecimiento es 37°C 
(Palleroni, 1984). Pese a que P. aeruginosa se clasifica como un aerobio obligado, 
algunas cepas crecen anaeróbicamente por desnitrificación. También pueden generar 
ATP en condiciones anaerobias por la fermentación de arginina y piruvato (Yahr et al., 
2006). La morfología colonial, pigmentación y propiedades de motilidad de las cepas de 
P. aeruginosa pueden ser bastante heterogéneas. El prototipo de colonia es grande y 
suave, con un centro elevado dándole la apariencia de ―huevo frito‖ (Palleroni, 1984). 
Variantes con alteraciones en la morfología colonial, surgen durante la formación de 
biopelículas, a raíz de la exposición al medio ambiente, el estrés a antibióticos, y 
durante las infecciones crónicas de la las vías respiratorias humanas (Yahr et al., 2006). 
Las colonias de P. aeruginosa son comúnmente pigmentadas y, de hecho, la 
designación de la especie deriva del significado de aeruginous "el color de óxido de 
cobre " reflejando el color característicoazul verdoso impartido en las colonias por la 
fenazina piocianina, siendo además, un producto único de esta especie. Otros 
pigmentos comunes son el amarillo-verde fluorescente debido al sideróforo pioverdina y 
el café tostado de la piorubina (Yahr et al., 2006). 
Presenta un repertorio igual de grande de mecanismos patogénicos, P. aeruginosa 
es capaz de infectar a los organismos eucariotas que van desde las amebas sociales a 
los seres humanos (Yahr et al., 2006). Es frecuentemente aislada de especímenes 
clínicos (heridas, quemaduras e infecciones del tracto urinario). Agente causal de la 
―pus azul‖ o piocianosis. Ocasionalmente patógena para las plantas. La especie puede 
ser dividida internamente en subgrupos para propósitos epidemiológicos (Garrity et al., 
2005). 
Antecedentes 
 
Priscilla Carrillo Barragán 14 
 
Concerniente a la degradación de hidrocarburos por esta especie, Das y 
colaboradores (2006) reportaron que una cepa de Pseudomonas aeruginosa aislada de 
una muestra de suelo contaminado con petróleo, creció en un gran número de 
hidrocarburos, siendo estos la única fuente de carbono y energía presentes en el 
medio, lo que demuestra que esta cepa puede ser degradadora de hidrocarburos. 
Dichos autores mencionan también, que P. aeruginosa es, en general, productora 
eficiente de biosurfactantes en medio de cultivo rico en hidrocarburos. 
Zhang y Miller (1992, 1994, 1995) han descrito que las cepas de P. aeruginosa 
producen 4 tipos principales de biosurfactantes: ácido mono-ramnolipídico, mono-
ramnolípido metil-éster, ácido di-ramnolipídico y di-ramnolípido metil éster. Estos 
compuestos son producidos en mezclas, y son estructuralmente similares, pero con 
variaciones en sus propiedades fisicoquímicas. Los autores explican que estos 
compuestos afectan la proporción de biodegradación de hidrocarburos de dos maneras: 
incrementando la solubilidad y dispersión del hidrocarburo, y cambiando la afinidad 
entre las células bacterianas y los hidrocarburos al inducir el aumento en la 
hidrofobicidad de la superficie celular. 
Por otra parte, Chayaburtra y Ju (2000), realizaron estudios secuenciales de 
degradación de n-hexadecano, en los que observaron que P. aeruginosa es capaz de 
mineralizar completamente este compuesto en anaerobiosis, si en un principio crece en 
condiciones aerobias, tiempo en el que se llevan a cabo las reacciones que requieren 
oxígeno, y realizar las reacciones posteriores, aunque más lentamente, bajo 
condiciones anaerobias, utilizando nitrógeno como aceptor final de electrones. 
Demostrando así, la versatilidad de esta especie para degradar hidrocarburos. 
Mientras que, Hong y colaboradores (2005) aislaron 8 cepas diferentes de P. 
aeruginosa capaces de degradar diesel, encontrando que la que presentó mayor 
afinidad fue capaz de mineralizar el 60% de diesel presente en una muestra de suelo, 
después de 13 días de incubación. Algunas de estas cepas fueron, además, capaces 
de crecer en benceno, tolueno, xileno y algunos hidrocarburos aromáticos policíclicos 
(HAP’s). 
 
Antecedentes 
 
Priscilla Carrillo Barragán 15 
 
4.2.4. Mecanismos de biodegradación de alcanos en agua. 
Los alcanos, como componentes principales del petróleo y de otros productos 
refinados, se han convertido en una importante fuente de contaminación durante las 
últimas décadas (Pepi et al., 2005). La baja solubilidad de estos compuestos en el agua 
hace que se separen y formen un sistema de dos fases, lo que plantea inmediatamente 
un problema de contacto entre dos superficies inmiscibles, la de la gota de alcano y las 
células microbianas, que prefieren los sustratos solubles en agua (Beal et al., 2000). 
Se han propuesto tres posibles mecanismos de internalización de alcanos en medio 
líquido (Beal et al., 2000): 
 El primer mecanismo consiste en la captación directa de los alcanos disueltos en 
la fase acuosa. Esto es en reducida cantidad debido a la baja solubilidad de la 
mayoría de los alcanos (10-7–10-2mgL-1 para alcanos de C9 en adelante). Sin 
embargo, este mecanismo puede ser eficiente en la toma de alcanos de cadena 
corta (Ratledge, 1988; Hommel, 1990). 
 
 El segundo mecanismo propone que el contacto directo de las célula 
microbianas con el alcano mediante la adherencia de las células a las gotas de 
hidrocarburo. La asimilación del sustrato se llevaría a cabo mediante difusión o 
transporte activo. En especies productoras de biosurfactantes, la excreción de 
estos, supondría el aumento en la superficie disponible para que los 
microorganismos se adhieran a las gotas de alcano. 
 
 En el tercer mecanismo se propone la incorporación de los alcanos en una forma 
pseudo-solubilizada. Este mecanismo fue propuesto a partir del descubrimiento 
de canales hidrofóbicos en la pared celular de Candida tropicalis. El transporte 
de alcanos está mediado por micelas o complejos alcano-surfactante, los cuales 
se piensa, son captados y disociados en canales hidrofóbicos de la pared 
celular, de tal manera que el alcano podría entrar ya sea por transporte activo o 
pinocitosis. (Quijano, 2006) 
 
Antecedentes 
 
Priscilla Carrillo Barragán 16 
 
4.2.5. Degradación de alcanos por Pseudomonas. 
A pesar de la gran diversidad de microorganismos degradadores de alcanos, casi 
toda la investigación enzimológica de la oxidación de alcanos en bacterias se ha 
llevado a cabo en P. putida GPo1 y P. aeruginosa cepas Sol 20 y 196 Aa, pues 
prácticamente las tres contienen idénticos sistemas enzimáticos (van Beilen et al., 
2004). 
Cuando a principios de la década de los 70’s Coon y colaboradores reportaron que, 
en ensayos con enzimas libres de células, el n-octano marcado radiactivamente era 
hidroxilado a ácido octanóico, con octanol y octaldehido como productos de oxidación 
intermedia, el sistema enzimático responsable de la primera etapa de oxidación fue 
originalmente llamado -hidroxilasa con base a la -oxidación de ácidos grasos. Sin 
embargo, en estudios posteriores la designación cambió a "sistema alcano-hidroxilasa", 
ya que el sistema enzimático para el metabolismo de lípidos parece haber evolucionado 
para la utilización de n-alcanos como fuentes de carbono y energía (van Beilen et al., 
2007). 
La caracterización bioquímica del sistema alcano-hidroxilasa mostró que dicho 
sistema consiste en tres componentes: una hidroxilasa particulada, y dos proteínas 
solubles, que actúan como acarreadoras de electrones entre NADH y la hidroxilasa 
(Lee et al., 1998). 
 La alcano-hidroxilasa es una proteína integral de membrana que requiere 
fosfolipidos y hierro para su actividad y es inhibida por cianida. Su secuencia 
primaria contiene seis segmentos hidrofóbicos que atraviesan la membrana 
citoplasmática como -hélices. Contiene además, cuatro motivos de histidinas 
altamente conservados que son esenciales para la actividad catalítica. Estas 
histidinas probablemente forman la esfera de coordinación rica en nitrógeno para 
dos átomos de hierro. Esta es la enzima responsable de la oxidación de los 
alcanos. 
 
Antecedentes 
 
Priscilla Carrillo Barragán 17 
 
 Las dos proteínas transferidoras de electrones son la rubredoxina y la 
rubredoxina reductasa La reductasa es una flavoproteina que transfiere 
electrones de NADH a la rubredoxina. Esta última pertenece a una familia de 
pequeñas proteínas transferidorasde electrones que contienen un hierro 
coordinado con cuatro cisteínas, y provee de electrones a la alcano hidroxilasa 
para la reacción de monooxigenación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4.1. Estructura del sistema alcano hidroxilasa de P. putida GPo1. La hidroxilasa poseé seis 
hélices transmembranales y cuatro motivos conservados ricos en histidina (H). Los dos átomos de hierro 
en el sitio activo se señalan como (Fe). Rubredoxina contienen un átomo de hierro marcado como (•) que 
se encuentra ligado a cuatro cisteínas. Rubredoxina reductasa es una enzima que contiene FAD y es 
dependiente de NADH. Modificada de van Bielen et al., (2004); Rojo, (2005). 
 
La transferencia de electrones entre la rubredoxina reductasa y rubredoxina ha sido 
estudiada en proteínas aisladas y purificadas. Sin embargo, la transferencia de 
electrones de rubredoxina a la alcano hidroxilasa aún no ha sido estudiada en detalle 
(van Bielen et al., 2004). 
e- 
e- 
Antecedentes 
 
Priscilla Carrillo Barragán 18 
 
En pasos posteriores, los alcanos son metabolizados a CO2 y agua, formando 1-
alcanoles, aldehídos y ácidos grasos como intermediarios en la vía catabólica. Los 1-
alcanoles formados por oxidación terminal son sometidos a reacciones metabólicas 
posteriores que no son estrictamente hablando, exclusivas de la degradación de 
alcanos y son llevadas a cabo por enzimas que también están presentes en 
pseudomonas que no crecen en alcanos (van Bielen et al., 1998). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4.2. Ejemplos de algunas reacciones de oxidación catalizadas por el sistema alcano 
hidroxilasa (van Bielen et al., 2004). 
 
Como se mencionó anteriormente, el producto de la reacción de hidroxilación es 
usualmente, un 1-alcanol. Pseudomonas poseé alcohol y aldehído deshidrogenasas 
que convierten estos alcoholes a ácidos grasos. Estos ácidos grasos pueden ser 
activados a acil-CoA, por una acil-CoA sintetasa cromosomal. Sin embargo, se ha 
demostrado que el operón donde se encuentran los genes del sistema alcano 
hidroxilasa, codifica para una acil-CoA sintetasa adicional que previene la acumulación 
de ácidos grasos, los que posteriormente serán degradados mediante -oxidación a 
acetil Co-A (van Bielen et al., 1992). 
 
Antecedentes 
 
Priscilla Carrillo Barragán 19 
 
4.3. FACTORES AMBIENTALES QUE LIMITAN LA DEGRADACIÓN DE 
HIDROCARBUROS 
 
Gran variedad de microorganismos son capaces de utilizar hidrocarburos como 
única fuente de carbono y energía. Sin embargo, se ha reconocido que dicha utilización 
es altamente dependiente de la naturaleza química y composición de los hidrocarburos, 
así como de las condiciones ambientales (Leahy, et al., 1990). 
Los factores que influyen en las tasas de crecimiento microbiano y las actividades 
enzimáticas afectan también la velocidad de biodegradación de hidrocarburos del 
petróleo (Atlas, 1995). Entre dichos factores se encuentran: 
 Composición. Como se revisó con anterioridad, los hidrocarburos del petróleo 
pueden dividirse según su estructura química. Esta división también está 
relacionada con la susceptibilidad de estos compuestos a la degradación 
microbiana. Generalmente se han clasificado en el siguiente orden de 
susceptibilidad al ataque microbiano: n-alcanos, alcanos ramificados, 
compuestos aromáticos de bajo peso molecular, cicloalcanos, heterocíclicos. 
Así, la composición del petróleo crudo y sus refinados influye en la tasa global de 
biodegradación de la mezcla y de sus componentes individuales (Leahy et al., 
1990). 
 
 Concentración y estado físico. A muy bajas concentraciones, los hidrocarburos 
son solubles en agua, sin embargo, en la mayoría de los casos de 
contaminación, estos se encuentran en concentraciones que exceden por mucho 
los límites de solubilidad. En sistemas acuáticos, el petróleo normalmente se 
extiende formando una película delgada. Los microorganismos degradadores de 
hidrocarburos actúan principalmente en la interfase hidrocarburo-agua. 
Posteriormente, los hidrocarburos del petróleo suelen emulsificarse debido a la 
acción del viento, las corrientes marinas y foto-oxidación. Además de que varios 
microorganismos degradadores son capaces de producir biosurfactantes que 
estimulan este proceso. Esta emulsión es química y físicamente heterogénea, y 
Antecedentes 
 
Priscilla Carrillo Barragán 20 
 
se encuentra formada por pequeñas gotas de hidrocarburos en agua o de gotas 
de agua en la masa de hidrocarburos. En este estado, dichos compuestos son 
más susceptibles a la degradación microbiana, y su destino es similar al de los 
hidrocarburos solubles (Atlas,1995; Leahy et al., 1990). 
 
 Temperatura. Influye en la biodegradación del petróleo por su efecto sobre la 
naturaleza física y composición química de este, en la tasa del metabolismo de 
hidrocarburos por microorganismos, y la composición de la comunidad 
microbiana. A baja temperatura, la viscosidad del petróleo aumenta, la 
volatilización de alcanos de cadena corta se reduce, y su solubilidad en agua es 
menor, retrasando el inicio de la biodegradación. La degradación generalmente 
disminuye con la disminución de la temperatura, lo que se cree, es resultado 
principalmente, de la disminución de la actividad enzimática. Por otra parte, las 
altas temperaturas aumentan la tasa de metabolismo de hidrocarburos a un 
máximo, por lo general en el rango de 30 a 40 ° C, por encima de las cuales 
llega a observarse toxicidad en la membrana por hidrocarburos. El clima y la 
temporada suelen seleccionar para diferentes poblaciones de microorganismos 
degradadores de hidrocarburos que se adaptan a la temperatura ambiente 
(Leahy et al., 1990). 
 
 Oxígeno. La concentración de oxígeno ha sido identificado como una de las 
variables que limita la velocidad de biodegradación del petróleo en el suelo y en 
aguas subterráneas, ya que los pasos iniciales en el catabolismo de 
hidrocarburos alifáticos, cíclicos y aromáticos por bacterias y hongos involucran 
la oxidación del sustrato por oxigenasas, por lo que se requiere oxígeno 
molecular. Sin embargo, las condiciones de limitación de oxígeno normalmente 
no se producen en los niveles superiores de columnas de agua marina y de agua 
dulce (Leahy et al., 1990). 
 Nutrientes. La liberación de hidrocarburos en los ambientes acuáticos que 
contienen bajas concentraciones de nutrientes inorgánicos a menudo produce 
proporciones excesivamente altas de carbono : nitrógeno o de carbono : fósforo, 
Antecedentes 
 
Priscilla Carrillo Barragán 21 
 
o ambos, que son desfavorables para el crecimiento microbiano. Es bien sabido 
que la disponibilidad de nitrógeno y fósforo limita la degradación microbiana de 
hidrocarburos en aguas de estuarios y sedimentos, agua de mar, sedimentos 
marinos, lagos y lagunas del Ártico, sedimentos de agua dulce, y aguas 
subterráneas. El ajuste de las proporciones de carbono : nitrógeno : fósforo con 
la adición de nitrógeno y fósforo en la forma de fertilizantes oleofílicos como la 
urea parafinizada, estimula la biodegradación del petróleo crudo e hidrocarburos 
individuales en agua de mar. Las sales inorgánicas de nitrógeno y fósforo son 
eficaces en sistemas cerrados (Head et al., 1999). 
 
 pH. Este factor es de mayor importancia en suelos, donde a diferencia del 
promedio de los ambientes acuáticos, puede variar de 2,5 enminas a 11,0 en 
desiertos alcalinos. La actividad de la mayoría de las bacterias y los hongos se 
ven favorecidos en un pH neutro. Los extremos de pH tienen efectos negativos 
en la degradación de hidrocarburos, observando mejores resultados en un rango 
de pH de 6,5 a 8,5 (Leahy, et al., 1990). 
Otros factores como la salinidad, presión y actividad del agua pueden ser de 
importancia dependiendo del ecosistema. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Antecedentes 
 
Priscilla Carrillo Barragán 22 
 
4.3.2. Las proporciones carbono : nitrógeno y carbono : fósforo. 
Debido a que los microorganismos requieren nitrógeno y fósforo para su 
incorporación en la biomasa, la disponibilidad de estos nutrientes dentro de la misma 
área que el hidrocarburo, es crítica. Se ha reportado que las concentraciones de 
nitrógeno y fósforo disponibles en agua de mar limitan de manera importante la 
degradación microbiana de hidrocarburos. Proporciones mayores en la biodegradación 
de hidrocarburos pueden obtenerse mediante la adición de nitrógeno y fósforo (Atlas, 
1993). 
El suministro de nitrógeno y fósforo es dependiente de su difusión en la capa de 
hidrocarburos. La tasa de difusión de estos nutrientes puede ser inadecuada para 
proveer suficiente nitrógeno y fósforo y así establecer las proporciones óptimas de C:N 
y C:P para el crecimiento y metabolismo microbianos (Atlas, 1981). 
La modificación en las proporciones de N y P ha sido más bien empírica y puede 
basarse en la consideración de la cantidad de N y P necesario para convertir una 
determinada masa de hidrocarburos a dióxido de carbono, agua y biomasa bajo 
condiciones aerobias, o de la concentración de nutrientes que ayuda a obtener las 
tasas máximas de crecimiento de microorganismos en escala de laboratorio (Smith, 
1993). 
También cabe destacar el hecho de que la óptima relación entre N y P es diferente 
para lograr la máxima degradación de ciertos componentes del petróleo crudo. Además 
de que un análisis limitado de las poblaciones bacterianas, indica que según el 
suministro de nutrientes, se desarrollan diferentes comunidades microbianas. 
Asimismo, la degradación de hidrocarburos alifáticos se ha visto estimulada al modificar 
estos nutrientes, mientas que la degradación de hidrocarburos aromáticos no (Head et 
al., 1999). 
Por lo tanto, existe poco consenso sobre cómo optimizar mejor la modificación de 
nutrientes, pero por lo general, valores alrededor de 1-5% de N por masa de 
hidrocarburos han sido utilizados, en una proporción de N: P de entre 5:1 y 10:1 (Head 
et al., 1999). 
 
Priscilla Carrillo Barragán 23 
 
 
5. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
5.1. ESTRATEGIA DE TRABAJO 
El siguiente diagrama muestra las etapas durante las cuales se desarrolló 
progresivamente, la metodología para obtener los resultados planteados en los 
objetivos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Materiales y Métodos 
 
Priscilla Carrillo Barragán 24 
 
5.2 DESCRIPCIÓN BACTERIANA 
 
5.2.1. Preservación de cepas. 
Se preservaron las cepas bacterianas de Pseudomonas empleando solución de 
glicerol al 30% y caldo nutritivo 1:1 en tubos de micro centrífuga de 1,5mL. 
 
5.2.2. Descripción morfológica, bioquímica y de crecimiento. 
Cuatro de las cinco cepas en estudio fueron previamente aisladas del piso de un 
taller mecánico y caracterizadas e identificadas con base a pruebas bioquímicas, 
dichas cepas pertenecen al cepario del laboratorio de Microbiología Experimental de la 
Facultad de Química, UNAM, exceptuando a P. putida KT2440 que es una cepa 
donada por la Dra. Herminia de Jesús Loza Tavera, investigadora del área de 
Bioquímica de la Facultad de Química. Para comprobar la identidad bacteriana, en este 
estudio se realizaron algunas de las pruebas bioquímicas y de crecimiento 
representativas. (Garrity, 2004). 
Se realizó un análisis macroscópico (morfología colonial y producción de 
pigmentos), microscópico (tinción de Gram y morfología celular) y metabólico de las 
cepas de estudio. Se prepararon los medios necesarios para realizar cada una de las 
siguientes pruebas: utilización de citrato, desnitrificación, hidrólisis de almidón y 
gelatina, movilidad; oxidación de fructuosa, glucosa, lactosa, maltosa, manitol y xilosa; 
crecimiento a 42°C, crecimiento en agar cetrimida, y producción de pigmentos en agar 
nutritivo y cetrimida. 
 
 
 
 
Materiales y Métodos 
 
Priscilla Carrillo Barragán 25 
 
 
5.2.3. Aislamiento y Purificación de ADN. 
El ADN bacteriano fue aislado utilizando el kit DNAeasy Blood and Tissue, 
siguiendo el procedimiento recomendado por el fabricante (Anexo 4). 
El material obtenido se sometió al procedimiento de reacción en cadena de la 
polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) con cebadores que permitieran la 
amplificación del 16S rRNA. El procedimiento se detalla en el anexo 4. 
 
5.2.4. Secuenciación del 16S rRNA. 
La muestra fue enviada al Instituto de Fisiología Celular de la UNAM donde se 
realizó su secuenciación 
La identificación de la especie se llevó a cabo mediante el uso de la base de datos 
NCBI con la herramienta BLAST n. 
 
5.2.3. Tolerancia al diesel. 
Para evaluar la tolerancia de las bacterias al diesel se observó el crecimiento 
bacteriano en medio mineral con diesel como única fuente de carbono. Se prepararon 
placas de agar con medio mineral y se inocularon por agotamiento con cada cepa de 
estudio. Se agregó de manera homogénea 1mL de diesel en la superficie de cada 
placa. Las placas fueron incubadas durante 3 días a 30°C. 
 
 
 
 
Materiales y Métodos 
 
Priscilla Carrillo Barragán 26 
 
5.3. CRECIMIENTO BACTERIANO 
 
5.3.1. Curva de crecimiento en medio mineral con glucosa. 
 Para caracterizar el crecimiento de cada una de las especies con una fuente de 
carbono óptima, estas fueron inoculadas en 100mL de medio mineral adicionado con 
glucosa al 4% (m/v). Los matraces nefelométricos en los que se llevó a cabo el 
experimento se mantuvieron en agitación constante a 200rpm y 30°C±1°C. Se midió la 
turbidez en el medio durante 24h con ayuda de un colorímetro fotoeléctrico Klett-
Summerson modelo 2193437. La relación entre la turbidez del medio con el número 
aproximado de bacterias se determinó según la escala de McFarland (Anexo 1). 
 
5.3.2. Curva de crecimiento en medio mineral sin fuente de carbono. 
 Como control negativo, cada especie fue inoculada en medio mineral sin ningún 
tipo de fuente de carbono adicional, de esta manera se esperaba comprobar que las 
cepas no son capaces de utilizar los componentes del medio mineral como fuente de 
energía (Dimitrios et al., 2010). Los matraces nefelométricos se mantuvieron bajo las 
condiciones antes descritas. En este caso, se midió la turbidez del medio durante 14 
días. 
 
5.3.3. Curva de crecimiento en medio mineral con diesel. 
 Las especies bacterianas fueron inoculadas por triplicado y en una relación 1:1 
(v/v) con el sustrato (Hong et al., 2005), en 100mL de medio mineral adicionado con 
diesel 4% (m/v), es decir, se agregaron 4mL de inóculo y 4mL de diesel. Los matraces 
nefelométricos se mantuvieron bajo agitación constante a 200rpm y 30°C. Se 
monitoreó la turbidez en el medio durante 14 días. 
 
Materiales y Métodos 
 
Priscilla Carrillo Barragán27 
 
De estos mismos matraces se tomó 1mL de muestra y se agregó a 99mL de 
solución salina isotónica, realizando diluciones sucesivas de 10-2, 10-4, 10-6, 10-8. De 
cada uno de los frascos de dilución se tomó una alícuota con un asa bacteriológica de 
2,4L (calibrada según el anexo 3) colocando este volumen en cajas Petri con agar 
nutritivo, según el método de Miles y Misra. Se realizó el conteo de unidades 
formadoras de colonias. Este procedimiento se realizó cada tercer día durante 14 días. 
 
5.3.4. Determinación del porcentaje de biodegradación. 
De cada uno de los matraces utilizados para la curva de crecimiento en diesel, se 
tomó una muestra de 3mL de la superficie del medio, (ya que el diesel permanecía en 
la superficie), el primer y último día de experimentación para las determinaciones 
cromatográficas. 
El porcentaje de biodegradación, se calculó con base a la concentración total de los 
HTP’s rd según la siguiente fórmula: 
Ecuación 5.1. Porcentaje de biodegradación. 
 
Donde: 
Cdía14 es la concentración (ppm) de dr HTP’s rd en el medio el día 14. 
 C0 es la concentración inicial (ppm) de dr HTP’s rd en el medio de cultivo. 
El tratamiento de las muestras se realizó según se explica en los siguientes 
apartados y en el anexo 2. 
 
 
 
 
 
Materiales y Métodos 
 
Priscilla Carrillo Barragán 28 
 
5.3.4.1. Extracción de diesel. 
Las muestras fueron adicionadas con 3mL de diclorometano rango HPLC, de 
manera que la proporción muestra/disolvente fue 1:1. Se agitaron durante 5 minutos y 
se dejaron reposar durante otros 5 minutos, colectando posteriormente la fase orgánica 
(inferior). La fase acuosa (superior) se sometió a una segunda extracción con el 
procedimiento antes descrito. Las dos fases orgánicas colectadas se mezclaron. 
 
5.3.4.2. Cromatografía de gases. 
Se evaluó la biodegradación de diesel a través de la desaparición de sustrato, 
medido como hidrocarburos totales de petróleo rango diesel (HTP’s rd), en un 
cromatografo de gases marca Alltech modelo SRI 8610C con detector de ionización en 
flama, columna Alltech Part No. 13658 AT-5 30mx0.32mm 1D x 0,25m. Se inyectaron 
5L de la fase orgánica en modo splitless para las lecturas en el cromatógrafo. 
 
5.3.4.3. Curva patrón. 
Se realizó una curva estándar con diferentes concentraciones de HTP’s rd 
(5000ppm, 10000ppm, 20000ppm, 40000ppm, 50000ppm, 60000ppm), con la finalidad 
de obtener una ecuación que permitiera relacionar el área cromatográfica con la 
concentración de diesel inyectada. 
 
5.4. MODIFICACIÓN DE LAS PROPORCIONES DE N Y P EN EL MEDIO. 
 
Se evaluó el efecto individual del aumento de nitrógeno y fósforo, así como su 
combinación (N + P), por medio del monitoreo de la desaparición de diesel mediante 
cromatografía de gases, siguiendo el procedimiento anteriormente descrito. 
Seleccionando así, el medio que contribuyera a una mayor degradación de diesel. 
Materiales y Métodos 
 
Priscilla Carrillo Barragán 29 
 
5.4.1. Modificación de la formulación del medio mineral. 
Se modificó la fórmula original de Foght y colaboradores (1990), para ajustarla a las 
proporciones de carbono, nitrógeno y fósforo comunes en un medio de cultivo nutritivo: 
C100:N10:P1, según se observa en la tabla 5.1. 
Tabla 5.1. Cantidades y proporción de N y P en el medio de cultivo. 
Compuesto Fórmula original* 
[g/L] 
Cantidad de N y P 
[g/L] 
Fórmula 
modificada [g/L] 
Cantidad de N y P 
[g/L] 
K2HPO4. 3H2O 0,5 0,1 2,9 0,4 
NH4Cl 1,0 0,3 7,6 2,0 
KNO3 2,0 0,3 14,4 2,0 
Na2SO4 2,0 - 2,0 - 
MgSO4.7H20 0,2 - 0,2 - 
FeSO4.7H2O Trazas - Trazas - 
Diesel 40 - 40 - 
*Fórmula original tomada de Foght et al., (1990). 
 
5.4.2. Determinación de las cinéticas de degradación. 
Se realizaron los mismos procedimientos que en la curva de crecimiento con diesel 
(pág. 26), en este caso con la fórmula original de medio mineral y su mejor 
modificación. El muestreo se realizó cada tercer día durante 14 días. La concentración 
de diesel se determinó de la manera antes descrita por cromatografía de gases. La 
cinética se determinó con base al cambio de la concentración de diesel a través del 
tiempo según se observa en la siguiente ecuación. 
Ecuación 5.2. Cinética de biodegradación de diesel. 
 
 
 Donde: 
Dieselt es la concentración de diesel (ppm) al tiempo t 
Diesel0 es la concentración inicial de diesel (ppm) 
Kd es la constante de biodegradación 
t es el tiempo al que se desea conocer la concentración de sustrato 
Materiales y Métodos 
 
Priscilla Carrillo Barragán 30 
 
5.5. ESTUDIO DEL CRECIMIENTO BACTERIANO EN AGUA RESIDUAL 
SINTÉTICA. 
 
5.5.1. Curvas de crecimiento. 
Las curvas de crecimiento se realizaron según lo descrito en el apartado 5.3.3, 
utilizando medio mineral (Foght et al., 1990) y agua residual sintética, formulada según 
la tabla 5.2. 
 
Tabla 5.2. Fórmula del agua residual sintética. 
Compuesto [g/L] Cantidad de N y P [g/L] 
NaCl 0,30 - 
MgSO4. 7H2O 0,14 - 
FeSO4.7H2O 0,13 - 
KH2PO4 1M 10mL 0,031 
(NH4)2SO4 0,22g 0,05 
Glucosa 0,9g - 
Solución nutritiva 0,2mL - 
H3BO3 0,63 - 
CuSO4 0,33 - 
ZnSO4 0,34 - 
Ca(NO3)2 0,36 0,0002 
 En donde las cantidades de glucosa y sulfato de amonio, corresponden a 60mg/L de carbono y 
60mg/L nitrógeno amoniacal, respectivamente. 
 
La proporción de nutrientes del agua residual sintética es C100: N 5,6: P 3,3; 
considerando la glucosa como única fuente de carbono. Al tomar en cuenta la cantidad 
de diesel agregada (40g/L), las proporciones se modifican como sigue: C100: N 0,12: 
P0,76. 
 
Materiales y Métodos 
 
Priscilla Carrillo Barragán 31 
 
 
5.5.2. Cuantificación de la concentración de glucosa en el agua residual sintética. 
Para monitorear la concentración de glucosa se utilizó el método fenol-ácido 
sulfúrico para la determinación de azúcares reductores y no reductores. Esta prueba se 
basa en la absorción a 490nm de un complejo aromático colorido formado entre el 
carbohidrato y el fenol. La cantidad del carbohidrato presente se determinó por 
comparación con una curva de calibración utilizando un espectrofotómetro UV/Visible 
modelo Ultrospec 3000 de la marca Pharmacia Biotech. Se tomaron muestras de 
0,5mL de los matraces nefelométricos y se centrifugaron durante 5 minutos a 7000rpm 
para separar los componentes no solubles de las muestras. Se tomaron alícuotas de 
0,2mL para ser analizados por este método. La técnica se detalla en el anexo 5. 
 
Priscilla Carrillo Barragán 32 
 
 
6. RESULTADOS Y ANÁLISIS 
 
6.1. DESCRIPCIÓN BACTERIANA 
 
6.1.1. Descripción morfológica, bioquímica y de crecimiento. 
En la tabla 6.1 se presentan las pruebas bioquímicas realizadas. Estos resultados 
se compararon con lo reportado por Garrity y colaboradores (2005), en Bergey’s 
Manual of Systematic Bacteriology, encontrado que las pruebas son consistentes, 
excepto para P. alcaligenes, que se ha clasificado, en todos los casos, como no 
productora de pigmentos, y según se observó en agar nutritivo la cepa utilizada en este 
estudio produce gran cantidad de pigmento verde, por lo que es probable que se trate 
de otra especie de Pseudomonas. Sin embargo, no es objetivo del presente trabajo 
elucidar la identidad de todaslas especies bajo estudio, por lo que se recomienda 
hacer mayor cantidad de pruebas bioquímicas a esta cepa y someterla a estudios 
moleculares como la secuenciación del gen 16S rRNA. 
 Tabla 6.1. Descripción morfológica, bioquímica y de crecimiento de las cinco especies en estudio. 
Prueba P. aeruginosa P. alcaligenes P. fluorescens P. putida P. stutzeri 
Citrato permeasa + + + + + 
Denitrificación + + + + + 
Hidrólisis de gelatina + - + - - 
Movilidad + + + + + 
Oxidación de: 
fructuosa 1% + - + + - 
glucosa 1% + + + + + 
lactosa 1% - - - - - 
maltosa 1% - - - - - 
manitol 1% + - - + - 
xilosa 1% - - + - - 
Crecimiento a 42°C + + - - + 
Crecimiento en agar 
cetrimida 
+ + + + + 
Producción de 
pigmento verde en agar 
nutritivo y cetrimida 
 
+ 
 
+ 
 
+ 
 
- 
 
- 
Morfología 
microscópica 
--------------------Bacilos cortos, Gram negativos, sin agrupación característica--------------- 
 
 Resultados y análisis 
 
Priscilla Carrillo Barragán 33 
 
En la tabla 6.2 se presenta una descripción más detallada de P. aeruginosa, debido 
a que fue la cepa que se eligió para realizar los experimentos posteriores en este 
estudio. Estos resultados también fueron comparados con lo establecido en el Manual 
Bergey’s. 
Tabla 6.2. Características micro y macroscópicas, metabólicas y de pigmentación de P. aeruginosa. 
 
 
 
Descripción microscópica 
 
 
 
 
 
 
Bacilos cortos, 
Gram negativos, 
Sin agrupación característica. 
 
 
Descripción macroscópica 
en agar nutritivo 
 
 
 
 
 
 
 
1día. Colonias color beige, 
puntiformes. 
 
2días. Colonias circulares, 
planas, de bordes irregulares. 
 
6 días. Colonias grandes, 
circulares, con centro elevado, 
de apariencia rugosa, color 
beige. 
 
 
Pruebas bioquímicas 
 
 
 
 
Pruebas de oxidación: 
1. Fructuosa + 
2.Glucosa + 
3.Maltosa - 
4.Manitol + 
5.Xilosa + 
 
6. Reductora de nitratos. 
 
 
Producción de pigmentos 
 
 
 
 
 
 
 
1. Producción de pigmento 
amarillo-verdoso hidrosoluble 
en agar cetrimida. 
2. Pigmento amarillo-verdoso 
hidrosoluble en agar nutritivo. 
3. Pigmentación azul verdosa 
después de 4 días de 
incubación en agar nutritivo. 
6 días 
1 día 
2 días 
1 2 3 4 5 6 
2 
1 
3 
 Resultados y análisis 
 
Priscilla Carrillo Barragán 34 
 
6.1.2. Secuenciación del gen 16S rRNA de Pseudomonas aeruginosa. 
De manera complementaria al análisis bioquímico, se realizó la extracción, 
amplificación y purificación del gen 16S rRNA, según se detalla en la sección 5.3.5 del 
capítulo de Materiales y Métodos, y en el anexo 4 de este trabajo. La secuenciación se 
llevó a cabo en el Instituto de Fisiología Celular, UNAM. 
La secuencia se sometió a un análisis de BLAST-n en la página electrónica del 
Centro Nacional para la Información en Biotecnología (NCBI, por sus siglas en inglés), 
de los Estados Unidos de América. Se encontró un 99% de identidad con las cepas de 
Pseudomonas aeruginosa CGR y Pseudomonas aeruginosa ARSKS 20 (anexo 4), 
confirmando la identidad de la especie bajo estudio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Gel A de agarosa al 2%. El pozo marcado como ―M‖ corresponde al marcador de peso 
molecular (100pb, Vivantis® Selangur Darul Ehsan, Malaysia), los cuatro pozos a la izquierda del 
marcador contenían 25L del producto de PCR. De este gel se cortaron las bandas que se observan 
alrededor de 1000 pb para su posterior purificación con el PCR purification kit (QIAGEN® GmbH, Hilden, 
Alemania). 
Gel B. Las bandas que se observan alrededor de 1000pb corresponden al producto de PCR purificado. 
En el primer pozo de izquierda a derecha se cargaron 3L de ADN, mientras que en el segundo, se 
cargaron 5L. 
 
A) B) 
 Resultados y análisis 
 
Priscilla Carrillo Barragán 35 
 
6.1.2. Tolerancia al diesel 
Para evaluar la tolerancia al diesel por parte de las cinco cepas en estudio se 
realizaron dos pruebas: En la primera, cada cepa se sembró por agotamiento en cajas 
Petri con medio mineral y agar, agregando 1mL de diesel en la superficie del medio. 
Después de 3 días de incubación a 28°C, todas las cepas presentaron crecimiento. 
 
6.2. CRECIMIENTO BACTERIANO 
 
6.2.1. Controles positivo y negativo. 
Se graficó la escala de McFarland, obtenida según se especifica en el anexo 1, con 
un coeficiente de correlación (R2) de 0,9787, como curva estándar que relaciona la 
turbidez del medio con el número aproximado de bacterias. Al despejar la ecuación de 
la recta, se obtuvo la ecuación 6.1. 
Ecuación 6.1. Número aproximado de bacterias en función de la turbidez del medio. 
 
 
 
 
 
 
Como control positivo del crecimiento de las cinco cepas, estas se inocularon en 
medio mineral adicionado con glucosa al 4%. La gráfica 6.1 muestra su crecimiento 
durante 24h a 30°C ± 2°C y 200r.p.m. 
 
 
 
 
 
 
0.00E+00 
5.00E+08 
1.00E+09 
1.50E+09 
2.00E+09 
2.50E+09 
3.00E+09 
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 
B
ac
te
ri
as
/m
L 
Tiempo (h) 
P. aeruginosa 
P. alcaligenes 
P. fluorescens 
P. putida 
P. stutzeri 
Blanco 
Gráfica 6.1. Crecimiento bacteriano en medio mineral con glucosa al 4% en función del tiempo. 
 
 Resultados y análisis 
 
Priscilla Carrillo Barragán 36 
 
Al graficar el logaritmo base 10 en función del tiempo de los datos pertenecientes a 
la fase exponencial de cada una de las cepas, que en la gráfica 6.1 se observan entre 
aproximadamente, las 3h y las 8h., es posible obtener los parámetros del crecimiento 
exponencial: tiempo de generación (g) y constante de velocidad de crecimiento (k), que 
se presentan en la tabla 6.3. 
Tabla 6.3. Parámetros del crecimiento exponencial en medio mineral con glucosa al 4% para las 
cinco cepas de estudio. 
Parámetro P. aeruginosa P. alcaligenes P.fluorescens P. putida P. stutzeri 
Ec. de la 
recta 
 
Pa=0,085t+8,807 
 
Pal=0,128t+8,658 
 
Pf=0,078t+8,745 
 
Pp=0,087t+8,749 
 
Ps=0,083t+8,773 
R2 0,9824 0,9886 0,9714 0,9904 0,9812 
g [h] 3,537 2,357 3,859 3,480 3,609 
k [h-1] 0,196 0,294 0,180 0,199 0,192 
*Pa, Pal, Pf, Pp, Ps representan el logaritmo de la concentración de bacterias/mL. Las unidades de 
la pendiente son h-1 y t representa al tiempo en horas. 
 
En la tabla 6.3 se observa que el tiempo de generación para las 5 cepas varía entre 
2,4 y 3,9h, y la constante de velocidad de crecimiento va de 0,180h-1 a 0,294h-1, siendo 
la llamada P. alcaligenes, la cepa que duplica el número de su población en menor 
tiempo, mientras que P. fluorescens es la que presenta mayor velocidad de 
crecimiento. Sin embargo, estos valores sólo son válidos bajo las condiciones 
experimentales que se mencionan al inicio de esta página. 
Como control negativo, se monitoreó el crecimiento en medio mineral sin fuente de 
carbono de las cinco cepas en estudio a 30 °C ± 2°C y 200r.p.m. durante 14 días. No 
se observó crecimiento en ninguno de los casos. 
 
 
 
 
 Resultados y análisis 
 
Priscilla Carrillo Barragán 37 
 
6.2.2. Crecimiento bacteriano en medio mineral con diesel. 
Se monitoreó durante 14 días la turbidez del medio mineral adicionado con diesel. 
Según se observa en la gráfica 6.2, únicamente P. aeruginosa y P. alcaligenes 
presentaron crecimiento.