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23/7/2022

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Biología

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1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

“ESTUDIO DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE
Heteropterys cotinifolia.”

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

PRESENTA

RAFAEL ÁLVAREZ CHIMAL

MÉXICO, D.F. 2014

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

JURADO ASIGNADO:

PRESIDENTE: Profesor: Martha Eugenia Albores Velasco
VOCAL: Profesor: Manuel Jiménez Estrada
SECRETARIO: Profesor: María Eva González Trujano
1er. SUPLENTE: Profesor: Silvia Citlalli Gama González
2° SUPLENTE: Profesor: Mabel Clara Fragoso Serrano

SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA:
Laboratorio 2-10. Departamento de Productos Naturales. Instituto de Química,
UNAM.

ASESOR DEL TEMA:

________________________________
Dr. Manuel Jiménez Estrada

SUPERVISOR TÉCNICO:

________________________________
Dra. Maira Estrella Huerta Reyes

SUSTENTANTE:

________________________________
Rafael Álvarez Chimal

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN. .................................................................... 1
2. ANTECEDENTES. ..................................................................... 3
2.1 Medicina tradicional y plantas medicinales. ................................ 3
2.2 Metabolitos primarios y secundarios. ........................................ 4
2.3 Síntesis y función de los metabolitos secundarios. ...................... 5
2.4 Aplicaciones de los metabolitos secundarios. ............................. 7
2.5 Heteropterys cotinifolia. .......................................................... 8
2.5.1 Clasificación taxonómica .................................................... 9
2.6 Información de otras plantas pertenecientes al género
Heteropterys. ............................................................................ 10
2.7 Actividad antioxidante. ......................................................... 13
2.7.1 Ensayo de actividad atrapadora sobre el radical 2,2-Difenil-1-
picrilhidrazilo (DPPH•). ............................................................. 14
2.7.2 Ensayo de inhibición de la peroxidación de lípidos en términos
de especies reactivas del ácido tiobarbitúrico (TBARS). ................ 14
2.8 Actividad antidiabética. ......................................................... 15
2.8.1 Ensayo de inhibición de la enzima α-glucosidasa. ................ 16
2.9 Actividad anti-inflamatoria..................................................... 16
2.9.1 Modelo de edema en oreja de ratón inducido por el 12-O-
tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA). ........................................ 17
3. JUSTIFICACIÓN. .................................................................. 18
4. OBJETIVOS. ......................................................................... 18
4.1 Objetivos generales. ............................................................. 18
4.2 Objetivos particulares. .......................................................... 18
5. METODOLOGÍA. .................................................................... 20
5.1 Esquema general de trabajo. ................................................. 20
5.2 Materiales. .......................................................................... 21
5.3 Identificación y colección del material vegetal. ......................... 22
5.4 Preparación del extracto metanólico. ...................................... 22
5.5 Tamizaje fitoquímico. ............................................................ 24
5.6 Aislamiento y purificación del compuesto denominado “Hc-1”. ... 28
5.7 Identificación del compuesto “Hc-1”. ...................................... 30
5.8 Pruebas de actividad biológica. ............................................... 31
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ................................................ 33
6.1 Heteropterys cotinifolia. ........................................................ 33
6.2 Identificación y colección. ...................................................... 33
6.2.1 Datos de colecta. ............................................................ 34
6.3 Extracto Metanólico. ............................................................. 35

6.3.1 Eliminación de clorofilas. ................................................. 35
6.4 Tamizaje fitoquímico. ............................................................ 36
6.5 Identificación del compuesto “Hc-1”. ...................................... 42
6.5.1 Identificación cualitativa .................................................. 43
6.5.2 Cromatografía en capa fina. ............................................. 44
6.5.3 Cromatografía de líquidos de alta resolución. ..................... 45
6.5.4 Espectro de Infrarrojo. .................................................... 47
6.5.5 Espectro de RMN-1H. ....................................................... 47
6.5.6 Espectro de RMN-13C. ...................................................... 48
6.5.7 Espectro de masas. ......................................................... 49
6.6 Pruebas de actividad biológica. .............................................. 50
6.6.1 Ensayo de actividad atrapadora sobre el radical 2,2-Difenil-1-
picrilhidrazilo (DPPH•). ............................................................. 50
6.6.2 Ensayo de inhibición de la peroxidación de lípidos en cerebro
de rata en términos de especies reactivas del ácido tiobarbitúrico
(TBARS). ............................................................................... 53
6.6.3 Ensayo de inhibición de la enzima α-glucosidasa. ................ 55
6.6.4 Actividad anti-inflamatoria por el método de edema en oreja
de ratón inducido por 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA). . 58
6.6.5 Ensayo de inhibición del crecimiento celular (citotoxicidad). . 59
7. CONCLUSIONES. .................................................................. 61
8. PERSPECTIVAS. .................................................................... 63
9. REFERENCIAS. ..................................................................... 64
10. ANEXOS ............................................................................... 76
Anexo 1. Espectros de IR, RMN y EM de la 5,4’-dihidroxi-3,6-
dimetoxiflavona obtenida del extracto metanólico de Heteropterys
cotinifolia. ................................................................................. 76
Anexo 2. Fundamento de la reacciones del tamizaje fitoquímico. ...... 83
Anexo 3. Metodologías de las pruebas de actividad biológica. .......... 88
Anexo 4. Preparación de reactivos y reveladores. ........................... 99

iii

ÍNDICE DE FIGURAS, GRÁFICOS, TABLAS Y ANEXOS

Figuras
Figura 1. Rutas metabólicas implicadas en la síntesis de los
metabolitos secundarios.. ................................................................ 6
Figura 2. Funciones de los metabolitos secundarios en las plantas.. ...... 7
Figura 3. Heteropterys cotinifolia; flores y frutos.. .............................. 9
Figura 4. Reducción del radical DPPH por acción antioxidante.. ........... 14Figura 5. Fundamento del ensayo de inhibición de la enzima
α-glucosidasa.. ............................................................................. 16
Figura 6. Preparación del embudo de filtración para eliminar clorofilas. 24
Figura 7. Material vegetal colectado. ............................................... 34
Figura 8. Estructura del compuesto 5,4’-dihidroxi-3,6-dimetoxiflavona 42
Figura 9. Cromatografía en capa fina del compuesto obtenido. ........... 44
Figura 10. Cromatograma del compuesto “Hc-1”, se marca con un
cuadro rojo el pico más abundante.. ............................................... 45
Figura 11. Espectro UV del pico más abundante del cromatograma de
“Hc-1”. ........................................................................................ 46

Gráficos
Gráfico 1. Porcentaje de reducción del DPPH• por el extracto y Hc-1 ... 50
Gráfico 2. Determinación de la CI50 del radical por acción del extracto y
Hc-1.. ......................................................................................... 52
Gráfico 3. Porcentaje de inhibición de la peroxidación lipídica por el
extracto y Hc-1.. .......................................................................... 53
Gráfico 4. Determinación de la CI50 de la peroxidación lipídica por acción
del extracto y Hc-1... .................................................................... 54
Gráfico 5. Porcentaje de inhibición de la enzima α-glucosidasa por el
extracto y Hc-1.. .......................................................................... 56
Gráfico 6. Determinación de la CI50 de la enzima por acción del extracto
y Hc-1.. ....................................................................................... 57

Tablas
Tabla 1. Compuestos identificados en plantas del género
Heteropterys... ............................................................................. 11
Tabla 2. Resumen del resultado del tamizaje fitoquímico... ................ 41
Tabla 3. Valores de CI50 para el extracto metanólico, Hc-1 y la
quercetina (control positivo)... ....................................................... 52
Tabla 4. Valores de CI50 para el extracto metanólico, Hc-1 y el BHT
(control positivo).. ........................................................................ 55
Tabla 5. Valores de CI50 para el extracto metanólico, Hc-1 y la
quercetina (control positivo)... ....................................................... 57
Tabla 6. Valores de porcentaje de inhibición del edema por el extracto,
Hc-1 y la indometacina (control positivo).. ....................................... 58
Tabla 7. Porcentajes de inhibición del crecimiento celular por acción del
extracto, Hc-1 y la adriamicina (control positivo). ............................. 60

Anexos
Anexo 1.1. Espectro de infrarrojo (Pastilla KBr) de la 5,4’-dihidroxi-3,6-
dimetoxiflavona obtenida del extracto metanólico de Heteropterys
cotinifolia.... ................................................................................ 76
Anexo 1.2. Espectro de RMN-1H (CDCl3, 300Mhz) de la 5,4’-dihidroxi-
3,6-dimetoxiflavona obtenida del extracto metanólico de Heteropterys
cotinifolia... ................................................................................. 77
Anexo 1.3. Espectro de RMN-13C (CDCl3, 75Mhz) de la 5,4’-dihidroxi-
3,6-dimetoxiflavona obtenida del extracto metanólico de Heteropterys
cotinifolia... ................................................................................. 78
Anexo 1.4. Experimento COSY de la 5,4’-dihidroxi-3,6-dimetoxiflavona
obtenida del extracto metanólico de Heteropterys cotinifolia... ........... 79
Anexo 1.5. Experimentos DEPT de la 5,4’-dihidroxi-3,6-dimetoxiflavona
obtenida del extracto metanólico de Heteropterys cotinifolia... ........... 80
Anexo 1.6. Experimento HETCOR de la 5,4’-dihidroxi-3,6-
dimetoxiflavona obtenida del extracto metanólico de Heteropterys
cotinifolia... ................................................................................. 81
Anexo 1.7. Espectro de masas (IE) de la 5,4’-dihidroxi-3,6-
dimetoxiflavona obtenida del extracto metanólico de Heteropterys
cotinifolia.. .................................................................................. 82

ABREVIATURAS
%ICC
Porcentaje de inhibición
de crecimiento celular KOH Hidróxido de potasio
°C Grados Celsius M Molar
AcOEt Acetato de Etilo m/z Relación masa/carga
ANOVA Análisis de Varianza mbar Milibares
ATCA Ácido tricloroacético MeOH Metanol
BHT Butilhidroxitolueno Mg Magnesio
c.c.f.
Cromatografía en capa
fina MHz Megahertz
CDCl3 Cloroformo deuterado min Minutos
CH2Cl2 Diclorometano ml Mililitros
CHCl3 Cloroformo mm Milímetros
CI50
Concentración inhibitoria
50 mM Milimolar
COSY
Espectroscopia de
correlación Na2CO3 Carbonato de sodio
CuSO4 Sulfato de Cobre NaOH Hidróxido de sodio
d Doblete nm Nanómetros
DEPT
Realce sin distorsión por
transferencia de
polarización NP Productos Naturales
DMSO Dimetilsulfóxido OMS
Organización Mundial de la
Salud
DPPH 2,2-Difenil-1-picrilhidrazilo PBS Buffer de fosfatos
EDTA
Ácido etilendiamino
tetraacético PNP-G
4-Nitrofenil α-D-
glucopiranósido
EM Espectrometría de masas ppm Partes por millón
ERO
Especies reactivas del
oxígeno PS Pentobarbital sódico
Fe Fierro R.F. Factor de retención
FeCl3 Cloruro férrico RMN-
13C
Resonancia Magnética
Nuclear de Carbono 13
FeSO4 Sulfato ferroso RMN-
1H
Resonancia Magnética
Nuclear de Protón
g Gramos rpm Revoluciones por minuto
GSH Glutatión reducido s Singulete
h Horas S.A. Sin actividad
Hc-1
5,4'-dihidroxi-3,6-
dimetoxiflavona SRB Sulforodamina B
H2SO4 Ácido sulfúrico Tamb Temperatura ambiente

HCl Ácido clorhídrico TBA Ácido tiobarbitúrico
HCR
Homogeneizado de
cerebro de rata TBARS
Especies reactivas del ácido
tiobarbitúrico
HETCOR Correlación heteronuclear TMS Tetrametilsilano
HNO3 Ácido nítrico TPA
12-O-tetradecanoilforbol-13
acetato
HPLC
Cromatografía de Líquidos
de Alta Resolución UV Ultravioleta
IE
Ionización por impacto
electrónico δ Desplazamiento químico
IR Infrarrojo μg Microgramos
J
Constante de
acoplamiento μL Microlitros
Kg Kilogramos μm Micrometros
KBr Bromuro de potasio μM Micromolar

vii

COLABORACIÓN

Para la realización de este trabajo se contó con la colaboración de la
Dra. Maira Estrella Huerta Reyes, investigadora del Instituto Mexicano
del Seguro Social (IMSS), quién con su grupo de trabajo fueron los
responsables de la colecta, identificación y depósito del ejemplar de
herbario de la especie vegetal Heteropterys cotinifolia, así como de la
preparación del extracto metanólico empleado en el presente trabajo.

Introducción

1. INTRODUCCIÓN

Las plantas han sido desde la antigüedad un recurso al alcance del ser
humano para alimentación y tratamiento de enfermedades. Estas
últimas, llamadas plantas medicinales, eran veneradas por las virtudes
que les habían reconocido, trasmitiéndose su conocimiento de
generación en generación (Martínez, 1989).

En la actualidad cientos de plantas son utilizadas en los tratamientos de
diversas enfermedades, la ciencia moderna, analizando y estudiando los
efectos terapéuticos de las plantas, se ha dedicado a precisar, comparar
y clasificar las diversas propiedades para el conocimiento de los
principios activos responsables de aliviar o curar enfermedades. Así
mismo, una vez separados dichos principios activos de las plantas que
los contienen, se han determinado sus estructuras químicas e incluso
propuesto sus síntesis o modificaciones estructurales en búsqueda de
una mayor actividad (Lock, 1994).

Un gran porcentaje de los principios activos de las plantas están
comprendidos dentrode los llamados productos naturales o metabolitos
secundarios, que son compuestos químicos de estructura relativamente
compleja, de distribución restringida y que pueden ser característicos de
ciertas fuentes botánicas específicas. Los productos naturales o
metabolitos secundarios representan una parte medular en el estudio de
la química (Butler, 2004).

Las etapas requeridas para obtener los compuestos orgánicos de interés
de la fuente natural adecuadamente identificada consisten en:
extracción, aislamiento y purificación. Diversas técnicas extractivas y
Introducción

cromatográficas están involucradas en cada una de estas etapas. Desde
el punto de vista estructural, los productos naturales suponen retos
importantes para la aplicación de estrategias analíticas que permitan
elucidar su estructura química (Pomilio, 2012).

Una vez identificados, son de interés para ser evaluados en distintos
ámbitos biológicos con el propósito de encontrar moléculas activas y que
sirvan para el desarrollo de nuevos fármacos o se utilicen en otras
industrias como la alimenticia, agroquímica, etc.

En el presente trabajo se realizó el estudio de la planta Heteropterys
cotinifolia, que tradicionalmente es usada para el tratamiento de
enfermedades del sistema nervioso (Juárez, 1998; León, 2005), con el
fin de conocer, identificar, aislar y caracterizar a los principales
metabolitos secundarios presentes, así como su evaluación biológica
para aportar al conocimiento de las propiedades medicinales de esta
planta y establecer otros posibles usos en la medicina tradicional.

Antecedentes

2. ANTECEDENTES

2.1 Medicina tradicional y plantas medicinales
Desde tiempos antiguos el hombre ha recurrido a las plantas sabiendo
que poseen las propiedades medicinales que necesita para curar sus
afecciones. No se sabe quién utilizó por primera vez las plantas con fines
curativos, seguramente la búsqueda de algún remedio fue algo que se
dio en todas las culturas a la vez, fruto del deseo del hombre por sanar.
De ahí el aprovechamiento de los recursos naturales como tratamientos
curativos siendo éstos los inicios de la herbolaria. El aprovechamiento de
las propiedades curativas de las plantas es una práctica milenaria que
siempre ha estado vigente (Martínez, 1989).

Una planta medicinal es un recurso, cuyos órganos (raíces, hojas, flores,
frutos, etc.) o extractos se emplean como drogas en el tratamiento de
alguna afección. La parte de la planta empleada medicinalmente se
conoce con el nombre de droga vegetal y puede suministrarse bajo
diferentes formas galénicas: cápsulas, comprimidos, crema, decocción,
elixir, infusión, jarabe, tintura, ungüento, etc. En muchas ocasiones se
utilizan los extractos totales para el tratamiento o control de
enfermedades por ser más accesibles, asequible económicamente e
inclusive por presentar un efecto terapéutico mayor (Flores-Soria,
2010).

La Organización Mundial de la Salud (OMS) define a las plantas
medicinales como cualquier planta que en uno o más de sus órganos
contiene sustancias que pueden ser utilizadas con finalidad terapéutica
(OMS, 1998).

Antecedentes

2.2 Metabolitos primarios y secundarios
Para poder vivir, crecer y reproducirse los organismos necesitan
transformar una gran variedad de compuestos orgánicos. El conjunto de
reacciones específicas mediante el cual un organismo fabrica sus propias
sustancias y mantiene la vida se conoce como metabolismo (Pomilio,
2012).

Las moléculas más importantes para la vida son las proteínas, los
carbohidratos, las grasas y los ácidos nucleicos. A pesar de las
características extremadamente diferentes de los distintos seres vivos,
las rutas generales para modificar y sintetizar estas sustancias son
esencialmente las mismas para todos con muy pequeñas modificaciones.
Estos procesos se conocen como “metabolismo primario” y los
compuestos implicados en las diferentes rutas se conocen como
metabolitos primarios. Se denomina “metabolismo secundario” al
conjunto de procesos en el que participan compuestos con una
distribución mucho más limitada y específica según el ser vivo. Los
compuestos que participan en este metabolismo se denominan
metabolitos secundarios, son específicos de las especies y se les nombra
como productos naturales. En sentido amplio los productos naturales
está formado por los compuesto que hay en la naturaleza, en sentido
más restrictivo un producto natural sólo es un metabolito secundario
(Gutiérrez, 2009).

De los metabolitos secundarios, cuya función no se conoce con
exactitud, se cree que muchos se originaron como defensa de diversos
agentes externos, pueden ser considerados como productos para la
adaptación de un organismo a sobrevivir en un ecosistema particular.

Antecedentes

2.3 Síntesis y función de los metabolitos secundarios
La formación de los metabolitos secundarios en la naturaleza tiene lugar
a partir de los metabolitos primarios.

La síntesis de los productos naturales comienza con la fotosíntesis que
tiene lugar en plantas superiores, algas y algunas bacterias. Existen tres
intermedios químicos principales, el acetil-coenzima A, el ácido
siquímico y el ácido mevalónico, a partir de estos compuestos se
biosintetizan los principales grupos de productos naturales como son los
ácidos grasos, antraquinonas, terpenos, esteroides, alcaloides,
cumarinas, lignanos, etc. Algunos esqueletos de productos naturales se
biosintetizan utilizando fragmentos que provienen de más de una ruta
específica tal es el caso de los flavonoides que se forman a partir de la
ruta del acetato y del ácido siquímico, a estos compuestos se les
denomina de biogénesis mixta (Gutiérrez, 2009) (Figura 1).

Antecedentes

Figura 1. Rutas metabólicas implicadas en la síntesis de los metabolitos
secundarios

Los metabolitos secundarios de origen vegetal se encuentran
generalmente como mezclas de compuestos en compartimientos. Suelen
variar en su concentración y presencia en las distintas partes de la
planta según su etapa de desarrollo. Algunos de ellos, ya presentes en
la planta de origen, suelen activarse como compuestos de defensa o
aumentar en su concentración, ante estímulos externos. También se
producirán otros nuevos como mecanismo de defensa de la planta. Los
metabolitos secundarios actúan en los mecanismos de defensa,
atracción y protección UV de la planta como señalización de estrés
(Pomilio, 2012) (Figura 2).
Antecedentes

Figura 2. Funciones de los metabolitos secundarios en las plantas

2.4 Aplicaciones de los metabolitos secundarios
La actividad biológica presentada por muchos metabolitos secundarios y
sus derivados los hace sumamente atractivos en la búsqueda y
desarrollo de nuevos fármacos. La importancia de los productos
naturales radica en la propia función biológica en la que son
biosintetizados. Como consecuencia del resultado de una selección a lo
largo de la evolución de las especies, los productos naturales poseen
actividades biológicas muy altas (Pomilio, 2012).

De esta forma, los productos naturales o sus derivados constituyen una
buena parte del arsenal terapéutico disponible, además de resultar
esenciales en algunos casos para identificar la “diana” (proteínas de
Antecedentes

membrana o canales iónicos) de un fármaco sintético o establecer su
implicación en una determinada ruta bioquímica (Avendaño, 2010).

El éxito de los productos naturales se centra en que son compuestos que
ya han sido validados por la evolución, biosintetizados, degradados y
transformados por sistemas enzimáticos. Por tanto, al interactuar con
moléculas “dianas” como proteínas de membrana, lo realizarán de una
manera privilegiada (Butler, 2004).

Por último,los productos naturales son una fuente potencialmente
importante de materias primas para la industria. Pueden ser útiles por
sus posibilidades directas como agentes terapéuticos, servir como
modelos para la preparación de sustancias bioactivas, como materia
prima para la síntesis de sustancias de interés farmacológico o para
realizar modificaciones estructurales específicas y generar nuevos
fármacos (Dias, 2012).

La química de los productos naturales se refiere a la investigación de los
metabolitos secundarios de fuentes naturales de origen vegetal, animal,
marino, fúngico y bacteriano (Pomilio, 2012).

2.5 Heteropterys cotinifolia
La especie Heteropterys cotinifolia (Figura 3) es una liana, se le conoce
comúnmente como coralilla o bejuco, pertenece a la familia botánica
denominada Malpighiaceae. Heteropterys cotinifolia es una especie
endémica de México y se localiza los Estados de Chiapas, Estado de
México, Guerrero, Jalisco, Michoacán, Morelos, Nayarit, Oaxaca, Puebla
y Sinaloa. Como único antecedente de su uso en la medicina tradicional,
se ha descrito que en el Estado de Morelos, el tallo y las hojas se utilizan
para tratar enfermedades del sistema nervioso (Juárez, 1998; León,
Antecedentes

2005). Recientemente se publicó que el extracto metanólico de las
partes aéreas produce un efecto antidepresivo en ratones. En dicha
publicación se identificaron el flavonoide rutina y al ácido clorogénico
como posibles compuestos responsables de las propiedades biológicas
observadas (Huerta-Reyes, 2013).

Figura 3. Heteropterys cotinifolia; flores (a) y frutos (b)

2.5.1 Clasificación taxonómica (Gernandt, 2010)
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Polygalales
Familia: Malpighiaceae
Género: Heteropterys
Especie: Heteropterys cotinifolia Adr. Juss.

Antecedentes

2.6 Información de otras plantas pertenecientes al género
Heteropterys
Heteropterys aphrodisiaca contiene flavonoides, glucósidos cardiotónicos
con núcleo esteroidal, glucósidos aromáticos, saponinas, taninos y
compuestos nitrogenados alifáticos (Galvao, 2002; Marques, 2007). De
esta planta, se ha aislado e identificado un compuesto nitrogenado
alifático, el 2,3,4,6-Tetra-O-(3-nitropropanoil)-O-β-D glucopiranósido
(Tabla 1) y se le comprobó actividad antiviral contra el virus de herpes
bovino tipo 1 y el poliovirus tipo 1 (Melo, 2008; Roman-Júnior, 2005).
Se usan las raíces en infusiones o maceraciones alcohólicas, algunos
estudios la señalan con efecto afrodisíaco (mayor liberación de
testosterona) (Coelho, 2011), como adaptógeno (incrementa resistencia
física y reduce el estrés) (Mendes, 2007; 2011), para el fortalecimiento
de huesos (Monteiro, 2010; 2011), antioxidante (Mattei, 2001) y se
sabe que mejora la memoria en ratas adultas (Galvao, 2002).

De la planta Heteropterys glabra se ha descrito un estudio
neurofisiológico del extracto etanólico de sus frutos comprobando su
actividad sedante y ansiolítica (Galietta, 2005).

La planta Heteropterys tomentosa contiene polifenoles, taninos,
alcaloides, flavonoides, glucósidos cardiotónicos, glucósidos aromáticos
y saponinas. Se han identificado al ácido clorogénico y a los flavonoides
rutina, catequina y taxifolina (Tabla 1). El macerado de sus raíces con
alcohol tiene efecto afrodisíaco, se ocupa para el tratamiento de la
diabetes, gripe, úlceras, infecciones estomacales y renales, para el
fortalecimiento de la memoria, como antioxidante y antimicrobiano
(Coelho, 2011; Paula-Freire, 2013).

Antecedentes

En cuanto a Heteropterys brachiata, se ha comprobado que el extracto
metanólico de sus partes aéreas (ramas, hojas, flores y frutos) presenta
actividad antidepresiva, sedante y anticonvulsiva. De esta planta se ha
identificado al ácido clorogénico y su respectivo éster metílico (Huerta-
Reyes, 2013) (Tabla 1).

Finalmente, de Heteropterys angustifolia se ha aislado e identificado un
compuesto nitrogenado alifático, la hiptagina (Stermitz, 1975) (Tabla 1).

Compuesto

Estructura
Especie
vegetal donde
ha sido
identificado

Ácido
clorogénico

Heteropterys
cotinifolia

Heteropterys
brachiata

Heteropterys
tomentosa

Rutina

Heteropterys
cotinifolia

Heteropterys
tomentosa
Antecedentes

Éster metílico
del ácido
clorogénico

Heteropterys
brachiata

2,3,4,6-Tetra-O-
(3-
nitropropanoil)-
O-β-D-
glucopiranosido

Heteropterys
aphrodisiaca

Catequina

Heteropterys
tomentosa

Taxifolina

Heteropterys
tomentosa

Hiptagina

Heteropterys
angustifolia
Tabla 1. Compuestos identificados en plantas del género Heteropterys

Antecedentes

Como se mencionó anteriormente, las acciones biológicas que presentan
los metabolitos son de interés en la búsqueda de nuevas moléculas que
sirvan de base para la obtención de nuevos fármacos, a continuación se
mencionan la actividades biológicas que se evaluaron así como los
ensayos utilizados.

2.7 Actividad antioxidante
Las especies reactivas del oxígeno (ERO) son especies químicas a partir
de las cuales se producen reacciones en cadena que provocan la
alteración de biomoléculas, incrementan la peroxidación de los lípidos de
membrana, dañan células y tejidos. Son especies reactivas de oxígeno,
el radical anión superóxido (O2∙
_), radical hidroxilo (OH˙), así como el
peróxido de hidrógeno (H2O2) y oxígeno singulete (
1O2) (Servais, 2003).

Cuando por determinadas razones los procesos de oxidación que
generan radicales libres en el organismo se incrementan o disminuyen
las defensas antioxidantes, se produce lo que se conoce con el nombre
de estrés oxidativo. La producción de radicales libres forma parte de la
fisiopatología de padecimientos como Parkinson, Alzheimer,
enfermedades cardiovasculares, daño por isquemia, choque circulatorio,
insuficiencia cardiaca, aterosclerosis, diabetes, cataratas, daño por
radiaciones, el síndrome de respuesta inflamatoria, envejecimiento etc.
(Carpenter, 1991; Jules, 1992; Kalra, 1994).

Los antioxidantes son compuestos que inhiben o retardan los procesos
oxidativos, abatiendo la iniciación de las reacciones oxidantes. Existen
diferentes métodos para determinar la actividad antioxidante, los cuales
difieren en el mecanismo de acción de los compuestos hacia los
radicales. Dentro de éstos se encuentran el ensayo de actividad
atrapadora sobre el radical 2,2-Difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH•) y la
Antecedentes

inhibición de la peroxidación lipídica en términos de especies reactivas
del ácido tiobarbitúrico (TBARS).

2.7.1 Ensayo de actividad atrapadora sobre el radical 2,2-
Difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH•)
La prueba se basa en la reducción del radical DPPH por acción de alguna
sustancia antioxidante.

La reducción del DPPH se mide a 515 nm por la disminución del color
violeta del radical provocando un vire a color amarillo cuando este se
pone en contacto con la sustancia antioxidante (Figura 4). Este método
es rápido y de mucha ayuda en la investigación, ya que mide la
actividad atrapadora de radicales libres por cualquier sustancia evaluada
(Molyneux, 2004).

Figura 4. Reducción del radical DPPH por acción antioxidante

2.7.2 Ensayo de inhibición de la peroxidación de lípidos en
términos de especies reactivas del ácido tiobarbitúrico
(TBARS)
La peroxidación de lípidos es una consecuencia principal del estrés
oxidativo y se considera generalmente como el resultado de una
Antecedentes

interacción de las especies reactivas de oxígeno con lípidos poli-
insaturados en membranas celulares. El ensayo de TBARS es un método
extensamente utilizado para la medida deperoxidación de lípidos. Este
método mide un producto secundario de la oxidación de los lípidos: el
malonaldehído. La reacción del malonaldehído con el ácido tiobarbitúrico
produce un compuesto rojo, que puede ser medido
espectrofotométricamente a 535 nm, la intensidad de éste será
proporcional al grado de oxidación de los aceites y grasas (Esterbauer,
1990).

2.8 Actividad antidiabética
La diabetes es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad
en el mundo. Muchos estudios están dirigidos hacia la búsqueda de
componentes que sean benéficos para su tratamiento y prevención. Uno
de los enfoques terapéuticos más importantes para disminuir la
hiperglucemia postprandial es retardar la absorción de la glucosa a
través de la inhibición de las enzimas que hidrolizan carbohidratos como
la α-glucosidasa. Las enzimas glucosidasas, localizadas en los vellos de
la superficie de la membrana intestinal, son enzimas clave en la
digestión de carbohidratos. La administración oral de inhibidores de
glucosidasas retarda la digestión y absorción de carbohidratos y
modulan así la elevación de la glucosa postprandial en sangre. Estos
medicamentos no ocasionan hipoglucemia ya que no producen secreción
de insulina. Por lo general, estos se administran con otros
medicamentos como hipoglucemiantes e insulina. Hay ensayos in vivo e
in vitro para evaluar la inhibición de la enzima α-glucosidasa (López-
Martínez, 2013), a continuación se describe el ensayo in vitro utilizado.

Antecedentes

2.8.1 Ensayo de inhibición de la enzima α-glucosidasa
Para el ensayo in vitro de inhibición de la enzima α-glucosidasa se
obtiene la enzima de la levadura Saccharomyces cerevisiae.

La enzima α-glucosidasa hidroliza al 4-Nitrofenil α-D-glucopiranósido
(PNP-G) que es incoloro, la enzima cuando está activa rompe el enlace
α-1,4 entre el nitrofenol y el α-D-glucopiranósido, el nitrofenol sin el
glucopiranósido, genera una coloración amarilla que se lee a 405 nm
(Figura 5). Si los compuestos evaluados tienen actividad sobre esta
enzima, al inhibirla no permiten que se encuentre con el PNP-G, por lo
tanto, no se lleve a cabo la reacción y no hay generación de coloración
amarilla, es decir, a menor coloración amarilla mayor es la actividad de
los compuestos sobre la enzima (López-Martínez, 2013).

Figura 5. Fundamento del ensayo de inhibición de la enzima α-
glucosidasa

2.9 Actividad anti-inflamatoria
El proceso inflamatorio es una respuesta del organismo ante un estímulo
nocivo. La misma tiene lugar en el tejido conjuntivo e implica cambios
vasculares, eventos celulares y la producción de mediadores químicos
de la inflamación. Todos estos componentes del sistema están
Antecedentes

estrechamente vinculados. La inflamación presenta dos fases bien
diferenciadas: aguda y crónica. La fase aguda se caracteriza por su
breve duración, la exudación de líquido y de proteínas plasmáticas y la
migración de leucocitos, predominantemente neutrófilos. La fase crónica
se caracteriza por la duración mayor, la presencia de linfocitos y
macrófagos, la proliferación de vasos sanguíneos, la fibrosis y la
necrosis. La inflamación es una señal de alerta al organismo, sin
embargo, la prolongación del proceso inflamatorio puede provocar daño
a células y tejidos, de ahí el interés en la búsqueda de agentes anti-
inflamatorios siendo las plantas medicinales una fuente importante de
nuevos agentes con capacidad anti-inflamatoria (Choyillas, 2000).

2.9.1 Modelo de edema en oreja de ratón inducido por el
12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA)
Es un modelo para evaluar la actividad anti-inflamatoria, el TPA se
encuentra en el aceite de crotón que se obtiene de la especie Croton
tiglium L. y posee propiedades irritantes, proinflamatorias y promotora
de tumores. La aplicación del TPA desencadena todos los eventos
propios del proceso inflamatorio: vasodilatación y eritema entre 1-2 h,
extravasación y edema entre 3-4 h, llegando al máximo a las 6-8 h. A
las 12-14 h el edema desaparece, pero la vasodilatación y el eritema
pueden persistir entre 24-48 h. La evaluación del efecto se realiza
mediante la medición de la diferencia de peso entre una oreja inflamada
y la oreja no inflamada, el porcentaje de inhibición del edema es el
incremento de peso de la muestra de la oreja con inflamación con
respecto a la que no se inflama. La ventaja del método es la rapidez y la
poca muestra requerida para desarrollar el estudio. El principal
inconveniente radica en la falta de selectividad, debido a que un elevado
número de sustancias suelen dar resultados positivos en esta prueba
(Choyillas, 2000; Young, 1989).
Justificación y objetivos

3. JUSTIFICACIÓN

Las plantas han sido usadas para el tratamiento y control de distintos
padecimientos, entre ellas, las del género Heteropterys han sido muy
estudiadas. La especie Heteropterys cotinifolia ha demostrado efecto
antidepresivo, por lo que en el presente estudio decidimos identificar los
compuestos presentes en las parte aéreas de esta especie vegetal así
como determinar otras propiedades biológicas.

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivos generales

 Aislar e identificar a los metabolitos secundarios presentes en el
extracto metanólico de las partes aéreas de Heteropterys
cotinifolia.
 Evaluar la capacidad antioxidante, anti-inflamatoria, antidiabética
y citotóxica del extracto metanólico y de los compuestos
identificados.

4.2 Objetivos particulares

 Identificar la especie vegetal Heteropterys cotinifolia.
 Colectar el material vegetal, en específico las partes aéreas
(hojas, flores, frutos y tallos).
 Obtener el extracto metanólico mediante maceración del material
vegetal con metanol para su posterior concentración.
 Identificar cualitativamente los grupos de compuestos o
metabolitos secundarios presentes en el extracto mediante un
tamizaje fitoquímico.
Justificación y objetivos

 Lograr la separación de los compuestos presentes aplicando
extracciones sucesivas con disolventes en incremento de
polaridad.
 Purificar los compuestos obtenidos por cromatografía en placa
preparativa.
 Caracterizar los compuestos utilizando experimentos de
resonancia magnética nuclear, espectroscopia de infrarrojo,
espectrometría de masas y cromatografía de líquidos de alta
resolución.
 Evaluar la capacidad antioxidante del extracto metanólico y los
compuestos usando los ensayos de actividad atrapadora sobre el
radical 2,2-Difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH•) e inhibición de la
peroxidación de lípidos en cerebro de rata en términos de especies
reactivas del ácido tiobarbitúrico (TBARS).
 Determinar la actividad antidiabética mediante un ensayo in vitro
de inhibición de la enzima α-glucosidasa.
 Evaluar la capacidad anti-inflamatoria del extracto y compuestos
por el método de edema en oreja de ratón inducido por el 12-O-
tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA).
 Determinar la inhibición del crecimiento celular mediante un
ensayo de citotoxicidad sobre la líneas celulares de cáncer PC-3
(cáncer de próstata), HCT-15 (cáncer de colón), K-562 (leucemia),
MCF-7 (cáncer de mama), SKLU-1 (cáncer de pulmón) y U-251
(tumor cerebral).

Metodología

5. METODOLOGÍA

5.1 Esquema general de trabajo

Metodología

5.2 Materiales
Los disolventes hexanos, diclorometano, acetato de etilo y metanol,
marca Fermont, fueron destilados antes de su uso.

Para la cromatografía en capa fina se utilizaron placas de aluminio de
20x20 cm, recubiertas con gel de sílice 60 (ALUGRAM Xtra SIL G/UV254
MACHEREY-NAGEL) de 0.20 mm de espesor.

Para la cromatografía en placa preparativa se usaron placas de vidrio de
10x20 cm, recubiertas de gel de sílice 200 (ALUGRAM SIL G-200 UV254
MACHEREY-NAGEL)de 2.0 mm de espesor.

 2-amino-etil éster difenilbórico; SIGMA.
 Ácido acético glacial; MERCK
 Ácido clorhídrico; 37.5%, Fermont.
 Ácido nítrico; 65.4%, Fermont.
 Ácido sulfúrico; 96.7%, Fermont.
 Anhidro acético; 97%, MERCK
 Benceno; 99.7%, MERCK
 Carbón activado; Darco, SIGMA-ALDRICH.
 Cloroformo; 99.9%, Fermont
 Cloruro Férrico; SIGMA.
 Hidróxido de Amonio; Baker Analyzed.
 Nitrato de Bismuto; 99.1%, Baker Analyzed.
 p-dimetil amino benzaldehído; ALDRICH.
 Yoduro de potasio; 99.0%, SIGMA.

Metodología

5.3 Identificación y colección del material vegetal
El material vegetal se identificó y colectó en el Estado de Morelos, se
eligieron las partes aéreas de la planta (hojas, tallo, flores y frutos) y se
obtuvo un extracto con un disolvente orgánico.

5.4 Preparación del extracto metanólico
1. Secado
El material vegetal de Heteropterys cotinifolia se secó en
oscuridad en un área ventilada a una temperatura entre 22°C a
32°C, manteniendo una humedad relativa de 15% a 20%, con un
tiempo de secado entre 10 a 15 días.

2. Molienda
El material vegetal se trituró en seco en un molino de aspas hasta
obtener un polvo fino.

3. Desceración
El material vegetal seco y molido (1 kg) se cubrió con 7.5 litros/kg
con el disolvente hexano, a una temperatura de 28°C por 24 h. Se
filtró la solución y el disolvente se recuperó en un evaporador
giratorio (marca BUCHI, modelo R-114), manteniendo la
temperatura del baño a 45ºC, con la aplicación de vacío a una
presión de 310 mbar. El disolvente recuperado se utilizó
nuevamente para repetir la desceración del material vegetal. La
operación se realizó por seis veces. El material vegetal descerado
resultante se colocó disperso sobre papel absorbente para permitir
por evaporación la eliminación de los restos del disolvente que se
utilizó en la desceración. Esta acción se llevó a cabo en oscuridad
y a 28ºC.

Metodología

4. Extracción metanólica
El material vegetal obtenido del paso anterior se cubrió con 7.5
litros/kg con el disolvente metanol (MeOH), a una temperatura de
28°C, sin agitación y por 24 h. Se filtró con algodón para obtener
el líquido de extracción. Dicho líquido se concentró en evaporador
rotatorio, manteniendo la temperatura del baño en 52C con la
aplicación de vacío a una presión de 300 mbar. El disolvente
recuperado se utilizó nuevamente para repetir la extracción del
material vegetal. Esta etapa se realizó por ocho veces para
obtener un extracto crudo. Dicho extracto se almacenó en frascos
de vidrio con tapa a una temperatura de 4C hasta su uso.

5. Eliminación de clorofilas
El extracto metanólico presentó una coloración verde fuerte
debido a las clorofilas, las cuales se eliminaron para facilitar el
tratamiento del extracto, para realizarlo se utilizó carbón activado.
El extracto seco se resuspendió en MeOH, se le agregó el carbón
activado en proporción 2:1, es decir, 2 g de carbón activado por
cada gramo de extracto a tratar, se le adicionó una pequeña
cantidad de sulfato de sodio anhidro, se dejó actuar al carbón
activado con un poco de agitación por 5 min y se filtró mediante
un embudo de filtración rápida. El embudo se preparó colocando
primero un filtro de algodón, sobre éste un papel filtro y dentro
del papel un tercer filtro hecho con sulfato de sodio anhidro o
celita, como se muestra en la Figura 6.

Metodología

Figura 6. Preparación del embudo de filtración para eliminar clorofilas

5.5 Tamizaje fitoquímico
El tamizaje o “screening” fitoquímico constituye una de las etapas
iniciales en la investigación sobre plantas medicinales. Se entiende por
tamizaje fitoquímico, un conjunto de técnicas relativamente simples y
de bajo costo que permiten determinar cualitativamente los principales
grupos de metabolitos presentes en una planta y orientar la extracción
y/o fraccionamiento de los extractos en el sentido de los metabolitos de
mayor interés. El tamizaje fitoquímico consiste en la extracción de la
planta con solventes apropiados y la aplicación de reacciones de
coloración. Debe permitir la evaluación rápida, con reacciones sensibles,
reproducibles y debe interpretarse como una orientación (Sherapin,
2000) (Anexo 2).

Al extracto metanólico de Heteropterys cotinifolia se le realizó un
tamizaje fitoquímico para identificar cualitativamente los compuestos
presentes en dicho extracto, se siguió la metodología que se indica a
continuación (Anyasor, 2010; Rafia, 2010).

Metodología

 Flavonoides
 Prueba de Shinoda (reducción con HCl-Mg): a 2 ml del extracto se
le agregaron 20-25 gotas de ácido clorhídrico (HCl) concentrado y
después unas virutas de Magnesio (2-3 virutas). La prueba es
positiva si aparece un color rojo, rosa, morado o anaranjado en la
solución.

 Reacción con hidróxido de sodio (NaOH): a 2 ml del extracto se le
agregaron 2 ml de una solución al 1% de NaOH y se mezclaron. La
prueba es positiva si aparece un color amarillo en la solución que
desaparece al agregar gotas de HCl al 1%.

 Prueba de Cloruro Férrico (FeCl3): a 2 ml del extracto se le
agregaron 2-3 gotas de una solución al 2% de FeCl3. La prueba es
positiva si aparece una coloración azul, verde o negra en la
solución.

 Alcaloides
 Prueba con reactivo de Dragendorff: se pesaron 0.5 g del extracto
y se le agregaron 5 ml de una solución al 1% de HCl y se
mezclaron, la mezcla se calentó en baño María por 10 minutos
aproximadamente, se filtró en caliente y al filtrado se le agregaron
10 gotas del reactivo de Dragendorff (Anexo 4). La prueba es
positiva si aparece un precipitado rojo ladrillo.

 Prueba de Ehrlich: se pesaron 10 mg del extracto y se le
agregaron 2 ml de una solución etanólica al 1% de p-
dimetilbenzaldehído, posteriormente se adicionaron 1 o 2 gotas de
HCl concentrado (Anexo 4). La prueba es positiva si la solución
vira a anaranjado.
Metodología

 Prueba de Vitali-Morin: Se pesaron aproximadamente 10 mg del
extracto y se le adicionaron 10 gotas de ácido nítrico (HNO3), se
calentó por 10 min y al enfriar se adicionaron 1 ml de etanol y
0.5 ml de acetona gota a gota, una vez mezclado se agregó una
hojuela de hidróxido de potasio (KOH). La prueba es positiva si
aparece una coloración morada en la orilla de la hojuela de KOH.

 Fenoles
 Prueba de Cloruro Férrico: a 2ml del extracto se le agregaron 2-3
gotas de una solución al 3% de FeCl3. La prueba es positiva si
aparece una coloración verde fuerte a negro en la solución.

 Taninos
 Prueba de Cloruro Férrico: se pesaron aproximadamente 0.2 g de
extracto, se le agregó agua destilada para tratar de disolver la
mayor cantidad posible del extracto, se filtró y al filtrado se le
agregaron 2-3 gotas de una solución al 10% de FeCl3. La prueba
es positiva si aparece una coloración verde-negra o azul-negra en
la solución.

 Saponinas
 Prueba de la espuma: a 2 ml de extracto se le agregaron 2 ml de
agua destilada y se agitó vigorosamente. La prueba es positiva al
aparecer espuma persistente y estable con apariencia de panal de
abeja.

 Glucósidos cardiotónicos
 Prueba de Keller-Kiliani: se disolvieron aproximadamente 20 mg
del extracto en 2 ml de ácido acético glacial, se le agregaron 2
gotas de una solución al 2% de FeCl3 y 2 ml de ácido sulfúrico
Metodología

(H2SO4) concentrado para formar 2 fases. La aparición de un anillo
café en la interfase indica la presencia de desoxiazúcares
característicos de los glucósidos cardiotónicos.

 Esteroles
 Prueba de Liebermann-Burchard: a 0.2 g del extracto se le
adicionaron 2 ml de anhídrido acético y una gota de H2SO4
concentrado. La presencia de anillos esteroidales se observa al
aparecer una solución de color verde, violeta, roja o azul. Terpenos
 Prueba de Salkowski: a 2 ml del extracto se le agregaron 2 ml de
agua destilada, 5 ml de cloroformo, 2 ml de anhídrido acético y 1
ml de H2SO4 concentrado. La prueba es positiva si aparece una
coloración café rojiza en la interfase o un precipitado verde.

 Antraquinonas
 Prueba de Bortränger: a 10 mg del extracto se le agregaron 10ml
de benceno y se mezclaron, se filtró la solución y al filtrado se le
adicionaron 10 ml de una solución al 10% de hidróxido amonio
(NH4OH) para formar 2 fases. La formación de una coloración roja,
rosa o violeta en la fase amoniacal da la prueba positiva.

 Cardenólidos
 A 1ml de extracto se le adicionaron 2 ml de benceno. La aparición
de turbidez o una coloración café en la solución, da la prueba
positiva.

Teniendo como base el resultado del tamizaje, se aisló y purificó uno de
los metabolitos, al que se le denominó “Hc-1”, mediante una reacción
Metodología

con HCl, su extracción con disolventes en incremento de polaridad y su
posterior purificación por cromatografía en placa preparativa. El
procedimiento se muestra a continuación.

5.6 Aislamiento y purificación del compuesto denominado
“Hc-1”
Para el aislamiento se empleó el siguiente procedimiento (Sherapin,
2000).

1. Se pesó una cantidad del extracto metanólico sin clorofilas (5 g) y
se resuspendió en MeOH.

2. Se le agregó HCl al 1% (pH=0-1) en proporción 2 ml de HCl por
cada 0.5 g de extracto y se calentó a baño María por espacio de
30 min con agitación constante.

3. Trascurrido el tiempo, se filtró en caliente y el filtrado se colocó en
un embudo de separación para hacer extracciones sucesivas con
disolventes.

4. La primera extracción se realizó con hexano (3 x 75 mL), la fase
orgánica hexánica se colectó por separado, la fase acuosa
obtenida se depositó de nuevo en el embudo de separación.

5. A la fase acuosa, obtenida en paso anterior, se le sometió a una
segunda extracción ahora con diclorometano (3 x 75 mL), la fase
orgánica y la fase acuosa resultantes se colectaron por separado,
la fase acuosa se conservó.

Metodología

6. Se trabajó con la fase orgánica obtenida con diclorometano, se
concentró para eliminar el disolvente.

7. Para la purificación del compuesto Hc-1, se utilizó la técnica de
cromatografía en placa preparativa. Se tomaron de 150 a 200 mg
de la fase orgánica seca obtenida en el paso anterior, se disolvió
en poca cantidad de diclorometano y se aplicó a lo largo de una
placa preparativa de 10x20 cm cubierta con gel de sílice.

8. Después de aplicar toda la muestra sobre la placa, se colocó
dentro de una cámara de elusión que contenía una mezcla de
CH2Cl2:MeOH (9.5:0.5) como fase móvil, se dejó eluir, la elusión
se hizo por duplicado dejando secar entre cada una de las
elusiones.

9. La placa seca se visualizó bajo una cámara de UV a las longitudes
de onda de 254 nm y 365 nm (Imagen 1). Se reveló con el
revelador de productos naturales (solución de ácido 2-amino-etil
éster difenilbórico a 1 % en metanol) y se visualizó al UV a
λ=365 nm (Anexo 4).

Imagen 1. Placas preparativas visualizadas a 254 nm(a) y a 365 nm (b)
donde se marca con un cuadro rojo la franja que se separa para obtener
el compuesto “Hc-1”.
Metodología

10. Se separó el gel de sílice de la placa que contenía al
compuesto de interés (franja con R.F.=0.4) y se extrajo del gel
de sílice disolviéndolo en 100 ml de CH2Cl2 con una poca cantidad
de MeOH.

11. Se concentró la fracción con un evaporador giratorio para
eliminar el disolvente y así obtener el compuesto de interés al que
se le denominó “Hc-1” el cual se identificó y evaluó
biológicamente.

5.7 Identificación del compuesto “Hc-1”
La identificación del compuesto se realizó mediante:
 Identificación cualitativa (pruebas de Shinoda, NaOH y FeCl3).

 Cromatografía en capa fina (c.c.f.).

 Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) con el equipo
y condiciones que se muestra a continuación:
-Cromatógrafo de Líquidos: Marca Agilent 1200
-Detector: UV-Visible de arreglo de diodos marca Waters modelo 2996
-Longitud de onda del detector: 215 nm
-Columna Synergi Polar-RP, C-18, 80A, 150x2.00 mm, 4 μm
-Eluyente: Acetonitrilo Agua
Inicial 5 95
30 min 100 0
-Flujo: 0.2 ml/min

 Espectroscopia de Infrarrojo (IR) realizada en un
espectrofotómetro FT-IR Bruker Tensor 27, en pastilla de bromuro
de potasio (KBr).
Metodología

 Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear de Protón (RMN-
1H), de carbono 13 (RMN-13C), los experimentos de 2
dimensiones; espectroscopia de correlación (COSY), correlación
heteronuclear (HETCOR) y realce sin distorsión por transferencia
de polarización (DEPT), todos los experimentos se realizaron en un
equipo Bruker-Avance (300 MHz) utilizando cloroformo deuterado
(CDCl3) como disolvente y tetrametilsilano (TMS) como referencia
interna.

 Espectrometría de masas (EM) utilizando la técnica de ionización
por impacto electrónico en un equipo Jeol Ax505 HA.

Los estudios y experimentos se realizaron en el Instituto de Química de
la UNAM.

5.8 Pruebas de actividad biológica (Anexo 3)
 Para el ensayo de actividad atrapadora sobre el DPPH•, inhibición
de la peroxidación de lípidos en cerebro de rata e inhibición de la
enzima α-glucosidasa se evaluaron el extracto metanólico y el
compuesto Hc-1 a las concentraciones de 1, 10 y 100 μg/ml. La
quercetina se utilizó como control positivo en la pruebas de DPPH•
e inhibición de la enzima α-glucosidasa y al butilhidroxitolueno
(BHT) en la prueba de inhibición de la peroxidación lipídica.

 Para la prueba de capacidad anti-inflamatoria por el método de
edema en oreja de ratón inducido por TPA se evaluaron al extracto
metanólico y a Hc-1 a una dosis de 1 mg/oreja. La indometacina
fue el control positivo para esta prueba.

Metodología

 En el ensayo de citotoxicidad sobre las línea celulares tumorales
PC-3 (cáncer de próstata), HCT-15 (cáncer de colón), K-562
(leucemia), MCF-7 (cáncer de mama), SKLU-1 (cáncer de pulmón)
y U-251 (tumor cerebral) se evaluaron el extracto metanólico y el
compuesto obtenido a una concentración de 50 μg/ml. La
adriamicina se utilizó como control positivo y se evaluó a una
concentración de 0.5 μg/ml.

Todos los ensayos de actividad biológica se realizaron en la Unidad de
Pruebas Biológicas del Instituto de Química de la UNAM.

Resultados y discusión

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 Heteropterys cotinifolia
En la búsqueda de información bibliográfica sobre Heteropterys
cotinifolia se encontró que tradicionalmente se usa para el tratamiento
de padecimientos mentales (Juárez, 1998; León, 2005) y que el extracto
metanólico de sus parte aéreas producen un efecto antidepresivo,
además se identificó al flavonoide rutina y al ácido clorogénico en el
extracto (Huerta-Reyes, 2013).

Al investigar estudios realizados a otras especies pertenecientes al
género Heteropterys se encontró que la mayoría se usan para el
tratamiento de afecciones mentales, esta actividad biológica se
fundamenta en varios estudios realizados a estas especies
comprobándoseles actividades anticonvulsivas, ansiolíticas,
antidepresivas, sedantes, entre otras (Galietta, 2005; Huerta-Reyes,
2013; Paula-Freire, 2013).

En años recientes a la especie Heteropterys cotinifolia se está
comenzando estudiar con el objetivo de fundamentar su uso tradicional
y determinar otras propiedades medicinales.

6.2 Identificación y colección
La identificación de la planta fue realizada por María Esther León Velasco
del Instituto de Biología de la UNAM y se depositó unamuestra en el
Herbario Medicinal del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSSM)
para futuras referencias. Las partes aéreas de la planta se colectaron en
el Estado de Morelos en Octubre del 2007 (Figura 7).

Resultados y discusión

6.2.1 Datos de colecta
Nombre científico: Heteropterys cotinifolia A. Juss.
Nombre común: Coralilla Familia: Malpighiaceae
Localidad: El pájaro verde. A 2 km de la Mina Santiago en Huautla
Municipio: Tlaquiltenango Estado: Morelos País: México
Altitud: 1056 msnm N 18° 26´ 28.5” O 99° 02´ 19.9”
Tipo de vegetación: Selva Baja Caducifolia Flor: Roja-rosada
Fruto: Sámara rojiza
Forma biológica: Bejuco
Abundancia: Escasa Asociado a: Pachycereus sp.
Determinó: Esther León
Colector: Esther León y Maira Huerta
Número de colecta: 578
No. De Registro Herbario IMSSM: 15451

Figura 7. Material vegetal colectado
Resultados y discusión

6.3 Extracto metanólico
El extracto seco obtenido presentó una consistencia viscosa y coloración
verde fuerte. El rendimiento aproximado del extracto fue de 8.6%.

6.3.1 Eliminación de clorofilas
La solución del extracto al inicio es de color verde debido a la presencia
de clorofilas, después del tratamiento con carbón activado, el extracto
obtenido es de color café obscuro (Imagen 2). Mediante una
cromatografía en capa fina se compararon ambos extractos, el que
contenía clorofilas presentó una mancha de color rojo al ser visualizada
con una lámpara UV de λ=365 nm, esa mancha es característica de las
clorofilas, mientras que el extracto sin clorofilas no presentó esa mancha
roja, con lo cual se confirmó la eliminación de clorofilas. Se recuperó el
75% del extracto después del tratamiento con carbón activado.

Imagen 2. Apariencia de los extractos, con clorofilas (a) y sin clorofilas
(b)

Resultados y discusión

6.4 Tamizaje fitoquímico
 Flavonoides (Imagen 3)
 Prueba de Shinoda (reducción con HCl-Mg): Positivo, formación de
una coloración rojo-anaranjado en la solución.
 Reacción con hidróxido de sodio: Positivo, la solución se tornó
amarilla virando hasta rojo y al agregar HCl 1% se decoloró.
 Prueba de Cloruro Férrico: Positivo, apareció una coloración verde
fuerte en la solución.

Imagen 3. Resultado de las prueba de identificación de flavonoides,
Shinoda (a), NaOH (b) y FeCl3 (c)

 Alcaloides (Imagen 4)
 Prueba con reactivo de Dragendorff: Positivo, presencia del
precipitado rojo ladrillo.
 Prueba de Ehrlich: Positivo, aparición de la coloración anaranjada
en la solución.
 Prueba de Vitali-Morin: Positivo, en la orilla de la hojuela de KOH
se formó la coloración morada.

Resultados y discusión

Imagen 4. Resultado de las pruebas de identificación de alcaloides,
Dragendorff (a), Ehrlich (b) y Vitali-Morin (c)

 Fenoles (Imagen 5)
Prueba de Cloruro Férrico: Positivo, formación de la coloración verde
fuerte en la solución.

Imagen 5. Prueba de FeCl3 para identificar fenoles

Resultados y discusión

 Taninos (Imagen 6)
Prueba de Cloruro Férrico: Positivo, presencia de la coloración verde-
negra en la solución.

Imagen 6. Resultado de la identificación de taninos

 Saponinas (Imagen 7)
Prueba de la espuma: Positivo, presencia de la espuma en la solución y
se mantuvo estable, se revisó la prueba a las 24 h y la espuma
continuaba.

Imagen 7. Formación de espuma en la identificación de saponinas

Resultados y discusión

 Glucósidos cardiotónicos (Imagen 8)
Prueba de Keller-Kiliani: Positivo, formación del anillo café en la
interfase.

Imagen 8. Formación del anillo café en la prueba de Keller-Kiliani

 Esteroles (Imagen 9)
Prueba de Liebermann-Burchard: Negativo, no hubo cambio en la
coloración de la solución.

Imagen 9. Sin cambio en la coloración de la solución en esta prueba

Resultados y discusión

 Terpenos (Imagen 10)
Prueba de Salkowski: Negativo, no apareció la coloración café rojiza en
la interfase ni el precipitado verde.

Imagen 10. Resultado de la prueba de Salkowski

 Antraquinonas (Imagen 11)
Prueba de Bortränger: Negativo, no hubo ninguna coloración en la fase
amoniacal (inferior) ni en la fase orgánica (superior).

Imagen 11. Resultado en la prueba de identificación de antraquinonas

Resultados y discusión

 Cardenólidos (Imagen 12)
Negativo, no hubo cambio en la solución ni aparición de la turbidez.

Imagen 12. Resultado de la identificación de cardenólidos

Compuesto Prueba Resultado

Flavonoides
Shinoda +
NaOH +
FeCl3 +

Alcaloides
Dragendorff +
Ehrlich +
Vitali-Morin +
Fenoles FeCl3 +
Taninos FeCl3 +
Saponinas Formación de espuma +
Glucósidos
cardiotónicos
Keller-Kiliani +
Esteroles Liebermann-Burchard -
Terpenos Salkowski -
Antraquinonas Bortränger -
Cardenólidos Turbidez -
Tabla 2. Resumen del resultado del tamizaje fitoquímico
Resultados y discusión

Como se observa en los resultados del tamizaje fitoquímico realizado
(Tabla 2), se pudieron identificar de manera cualitativa varios
metabolitos secundarios; con esto se tuvo una visión general de los
posibles compuestos presentes en el extracto, esto coincide con los
resultados de tamizajes aplicados a otras especies de Heteropterys,
donde se identifican a estos mismos grupos de metabolitos (Galvao,
2002; Marques, 2007).

El tamizaje también fue de utilidad para orientar el aislamiento,
mediante cromatografía en placa preparativa, de un compuesto al que
se le denominó “Hc-1” y se identificó.

6.5 Identificación del compuesto “Hc-1”
Se obtuvo un flavonoide que pertenece al grupo de las flavonas con el
nombre químico: 5,4’-dihidroxi-3,6-dimetoxiflavona que como se
mencionó anteriormente, para fines de este trabajo se le denominó
“Hc-1” (Figura 8).

O
O
O
OH
OH
H
H
H
H
H
O
CH3CH3
H
1´
2´
3´
4´
5´
6´
2
3
45
6
7
8
9
10
A C
B
Figura 8. Estructura del compuesto 5,4’-dihidroxi-3,6-dimetoxiflavona
Resultados y discusión

Características físicas: El compuesto presenta una consistencia
semisólida, de coloración amarilla claro con olor característico.

A continuación se muestran los resultados y el análisis de las distintas
técnicas y experimentos empleados para determinar la estructura del
compuesto obtenido.

6.5.1 Identificación cualitativa
Para la identificación de “Hc-1”, se comenzó con la realización de
reacciones químicas para identificar cualitativamente grupos
funcionales.

En la reacción con NaOH apareció una coloración amarilla en la solución
del compuesto que desaparece al agregar HCl 1%, esto indica la
presencia de grupos fenólicos en la estructura. En la prueba de Shinoda
hubo un vire a anaranjado en la solución, esto es indicativo de
compuestos de tipo flavona (Anexo 2), finalmente en la prueba con
FeCl3, la solución se tornó verde fuerte, con lo que se confirma que en la
estructura hay grupos fenólicos (Imagen 13).

Imagen 13. Identificación de Hc-1; Pruebas de Shinoda (a), NaOH (b) y
FeCl3 (c)

Resultados y discusión

6.5.2 Cromatografía en capa fina
Se continuó con la elaboración de c.c.f. utilizando el revelador de
productos naturales (Figura 9).

Figura 9. Cromatografía en capa fina del compuesto obtenido
Fase móvil: CH2Cl2: MeOH (9.5:0.5)
Revelador: Productos Naturales, visualizado al U.V. (λ=365 nm)
Factor de retención (R.F.): 0.4

Realizando la cromatografía en capa fina, el compuesto tomó una
coloración azul-verdosa al ser impregnado con el revelador de productos
naturales y su posterior visualización a λ=365 nm, este revelador es
específico para reconocer estructuras del tipo flavonoide por lo que seasumió que el compuesto obtenido presentaba esa estructura (Wagner,
1996) (Anexo 4).

Resultados y discusión

6.5.3 Cromatografía de líquidos de alta resolución
En el cromatograma obtenido del HPLC realizado a “Hc-1” se observaron
varios picos siendo el mayoritario el que se obtuvo a un tiempo de
retención de 2.75 min y un porcentaje de área de 33.87% (Figura 10).

Figura 10. Cromatograma del compuesto “Hc-1”, se marca con un
cuadro rojo el pico más abundante

El espectro de ese pico obtenido con el detector UV-Visible muestra 2
bandas, una a 320 nm y otro a 240 nm (Figura 11), por la región donde
se encuentran y el comportamiento de las bandas, éstas corresponden a
compuestos del tipo flavonoide en específico a las flavonas debido a que
Resultados y discusión

la banda I que generan los anillos B (sistema cinamoilo) de estos
compuestos va de 310-350 nm y la banda II producida por el anillo A
(sistema benzoilo) va de 240-285 nm. Por lo tanto se puede decir que la
banda I a 320 nm la origina el anillo B y la banda II a 240 nm
pertenece al anillo A de la estructura del compuesto Hc-1 (Gattuso,
2007; Martínez, 2005; Pinheiro, 2012; Tsimogiannis, 2007).

Figura 11. Espectro UV del pico más abundante del cromatograma de
Hc-1

Con estos resultados se tuvo un punto de partida para comenzar a
elucidar la estructura del compuesto obtenido.

Resultados y discusión

6.5.4 Espectro de Infrarrojo (Anexo 1.1)
En el espectro de infrarrojo aparece una señal gruesa a 3250 cm-1
característica de las vibraciones O-H. Las señales a 2922 cm-1 y 2853
cm-1 son características del estiramiento C-H saturado correspondientes
a grupos CH3 que se confirma con la señal a 1390 cm
-1. Se observan
señales a 1697 cm-1 correspondiente a núcleos bencílicos y la señal a
1260cm-1 corresponde al estiramiento C-OH de fenoles. La señal intensa
a 1599 cm-1 corresponde al estiramiento C=O de cetonas.

6.5.5 Espectro de RMN-1H (Anexo 1.2)
Datos espectroscópicos: 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ ppm: 7.57 (d, J =
15.9 Hz, 2H), 7.02 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.25
(d, J = 15.9 Hz, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.73 (s, 3H).
(J: constante de acoplamiento, MHz: megahertz).

Primero se observan dos señales singulete (s) a campo alto, una muy
intensa a una desplazamiento químico (δ) de 3.79 ppm y otra de menor
intensidad a 3.73 ppm que corresponden a los hidrógenos de grupos
metoxilos unidos a C6 y C3 respectivamente, la señal a 6.25 ppm es un
doblete (d) que corresponde a los hidrógenos unidos a C3’ y C5’ en el
anillo B (sistema cinamoilo) de la flavona, el corrimiento a campo alto es
probablemente debido a la influencia del grupo hidroxilo de C4’ y al
posible acomodo de los electrones por efecto del anillo aromático, en la
región de grupos aromáticos, el doblete que aparece a 6.87 ppm
corresponde al hidrógeno unido a C7 en el anillo A (sistema benzoilo) de
la flavona, es un doblete por la interacción con el hidrógeno vecino
unido a C8 cuya señal aparece a 7.20 ppm e igualmente es un doblete,
finalmente la señal a 7.57 ppm es la que origina los hidrógenos unidos a
C2’ y C6’ del anillo B de la flavona.

Resultados y discusión

Con el experimento COSY (Anexo 1.4), confirmó la correlación que hay
entre los hidrógenos cuyas señales aparecen a 6.3 ppm y 7.6 ppm que
corresponde al anillo B de la flavona, en el mismo espectro se observa la
correlación entre los hidrógenos unidos a C7 y C8 del anillo A.

6.5.6 Espectro de RMN-13C (Anexo 1.3)
Datos espectroscópicos: 13C RMN (75 MHz, CDCl3) δ ppm: 168.09 (C4),
146.43 (C6), 145.02 (C2’), 143.95 (C6’), 127.45 (C5), 125.03 (C7),
122.36 (C5’), 120.96 (C9), 117.86 (C2), 116.28 (C3), 115.44 (C8),
114.27 (C3’), 113.19 (C4’), 111.35 (C1’), 64.21 (C10), 51.67 (O-CH3),
51.43 (O-CH3).

Las señales que se observan a un δ 117.86 ppm y a 116.28 ppm
corresponden a C2 y C3 respectivamente, la señal a más campo bajo, a
168.09 ppm, corresponde a C4, el que está unido al grupo oxo en el
anillo C de la flavona, continuando con la señales del anillo A (sistema
benzoilo) corresponden; a 127.45 ppm para C5, 146.43 ppm para C6,
125.03 ppm para C7, 115.44 ppm para C8, 120.96 ppm para C9 y a
64.21 ppm para C10. Para el anillo B de la flavona (sistema cinamoilo)
corresponde las señales; a 111.35 ppm para el C1’, a 145.02 ppm para
C2’, a 114.27 ppm para C3’, 113.19 ppm para C4’, 122.36 ppm para C5’ y
a 142.95 ppm para C6’. Finalmente la señal a 51.67 ppm corresponde al
carbono del grupo metilo en el metoxilo unido a C3 y la señal a 51.43
ppm corresponde al otro carbono del metilo del otro grupo metoxilo
unido a C6.

Los experimentos DEPT 90 y DEPT 135 (Anexo 1.5) mostraron señales
que correspondían a 2 metilos (CH3), 5 metinos (CH) y 9 carbonos
cuaternarios, lo que coincide con la estructura propuesta.

Resultados y discusión

El experimento HETCOR (Anexo 1.6) sirvió para correlacionar las señales
de los hidrógenos con sus correspondientes carbonos y elucidar la
estructura del flavonoide: 5,4’-dihidroxi-3,6-dimetoxiflavona.

6.5.7 Espectro de masas (Anexo 1.7)
La fórmula condensada del compuesto Hc-1 es; C17H14O6
Se observan un señal a 252 relación masa/carga (m/z) que corresponde
a la especie [C15H8O4]
+, y a 254 m/z de la especie [C15H10O4]
+, la
señales corresponden a la flavona sin los grupos metoxilos. Se esperaría
una señal a 314 m/z, que corresponde a la masa molecular del
compuesto obtenido, no se observa esa señal en el espectro debido a
que quizá las señales de las impurezas en la muestra están interfiriendo
con la interpretación.

En base a los resultados, se propuso que Hc-1 tiene la estructura del
5,4’-dihidroxi-3,6-dimetoxiflavona (Figura 8). No hay muchos estudios
que mencionen este compuesto, pero coincide con los datos publicados
(Sahu, 1984) y lo denominan como peduncularisina, por lo que se
requiere hacer una mejor purificación de este compuesto para
asegurarse completamente de la estructura.

Una vez caracterizado el compuesto, se realizó la evaluación
antioxidante, antidiabética, anti-inflamatoria y citotóxica del mismo, al
igual que del extracto metanólico. Los resultados se muestran a
continuación.

Resultados y discusión

6.6 Pruebas de actividad biológica

6.6.1 Ensayo de actividad atrapadora sobre el radical 2,2-
Difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH•)
Como se muestra en el gráfico 1, el extracto metanólico y el compuesto
Hc-1 inhibieron al radical por encima del 80% a la concentración de
100 μg/ml.

Gráfico 1. Porcentaje de reducción del DPPH• por el extracto y Hc-1. El
resultado muestra el promedio de 3 experimentos independientes, los
valores p≤0.05(*) y p≤0.01(**) se consideran con diferencia
significativa respecto al control.

Esto quizá se debió a que en el extracto hay varios compuestos que
tienen grupos funcionales fenólicos y son los responsables de la acción
antioxidante como atrapadores de radicales, formando moléculas menos
perjudiciales, evitando así que puedan reaccionar y generar una mayor
tasa de radicales libres (Zaragozá, 2002; Zavaleta, 2005).

Resultados y discusión

En cuanto al compuesto aislado (Hc-1), al ser un flavonoide, estos
actúan como atrapadores o secuestradores de radicales debido a los
grupos hidroxilo presentes en sus anillos, los cuales le confieren una
mayor estabilidad a la forma radical porque participan en la
deslocalización de los electrones y a la donación de grupos hidrógeno, lo
que interrumpe la reacción en cadena de producción de más radicales
(Escamilla, 2009; Martínez-Flórez, 2002).

Se calculó la concentración inhibitoria 50 (CI50) en ambos casos y se
comparó con el obtenido para la quercetina (control positivo) (Gráfico 2,
Tabla 3). El extracto, al presentarcompuestos con grupos fenólicos,
probablemente actuaron de manera sinérgica como atrapadores de
radicales y es por eso que su CI50 (25.92 μg/ml ) es menor que la de
Hc-1.
La CI50 del compuesto Hc-1 fue de 35.88 μg/ml y el de la quercetina de
3.68 μg/ml, por lo que se requirió mayor concentración de Hc-1 para
obtener la reducción del 50% del radical. Lo anterior quizá se debió a
que, aunque ambos son flavonoides, la diferencia principal entre dichos
compuestos es la presencia de los grupos hidroxilos en sus respectivas
estructuras, la quercetina tiene estos grupos en sus anillos B y C
mientras que Hc-1 los tiene en los anillos A y B además de presentar
dos grupos metoxilo, los grupos hidroxilo aumentan la actividad
antioxidante por incremento de la deslocalización electrónica, por el
contrario, la metoxilación o la glicosilación en los flavonoides disminuyen
el potencial antioxidante (Pérez, 2003; Schneider, 2009).
Resultados y discusión

Gráfico 2. Determinación de la CI50 del radical por acción del extracto y
Hc-1. El resultado muestra el promedio de 3 experimentos
independientes, los valores p≤0.05(*) y p≤0.01(**) se consideran con
diferencia significativa respecto al control.

Compuesto CI50 (μg/ml)
Quercetina
(control positivo)

3.68 ± 0.16
Extracto 25.92 ± 0.56
Hc-1 35.88 ± 2.24
Tabla 3. Valores de CI50 para el extracto metanólico, Hc-1 y la
quercetina (control positivo)

Resultados y discusión

6.6.2 Ensayo de inhibición de la peroxidación de lípidos en
cerebro de rata en términos de especies reactivas del ácido
tiobarbitúrico (TBARS)
El gráfico 3 muestra que el compuesto Hc-1 inhibió la peroxidación por
encima del 50% a una concentración de 10 μg/ml, mientras que el
extracto lo hizo a una mayor concentración (100 μg/ml).

Gráfico 3. Porcentaje de inhibición de la peroxidación lipídica por el
extracto y Hc-1. El resultado muestra el promedio de 3 experimentos
independientes, los valores p≤0.01(*) se consideran con diferencia
significativa respecto al control.

La inhibición de la peroxidación por parte del extracto se debió a la
presencia de compuestos con fenoles en sus estructuras aunque se logró
el efecto a una concentración mayor (100 μg/ml) que la obtenida por el
compuesto Hc-1 (10 μg/ml). El flavonoide obtenido inhibió la
peroxidación a un concentración menor ya que uno de los mecanismo de
acción antioxidante de los flavonoides es mediante la inhibición de
determinadas oxidasas, como la lipoxigenasa, la ciclooxigenasa, la
mieloperoxidasa, etc., evitando así la formación de ERO y de
Resultados y discusión

hidroxiperóxidos orgánicos perjudiciales para las células (Pérez, 2003;
Procházková, 2011).

Se determinaron la CI50 del extracto y del compuesto, se comparó con la
obtenida para el control positivo, el BHT. Se necesitó menor
concentración de Hc-1 (9.54 μg/ml) que del extracto (24.46 μg/ml)
para inhibir la peroxidación en un 50% aunque los valores siguen siendo
altos comparados con el BHT (0.27 μg/ml) que es un antioxidante
sintético ocupado ampliamente en la industria para disminuir la rancidez
de los productos (Dergal, 2013) (Gráfico 4, Tabla 4).

Gráfico 4. Determinación de la CI50 de la peroxidación lipídica por acción
del extracto y Hc-1. El resultado muestra el promedio de 3 experimentos
independientes, los valores p≤0.05(*) y p≤0.01(**) se consideran con
diferencia significativa respecto al control.

Resultados y discusión

Compuesto CI50 (μg/ml)
BHT
(control positivo)

0.27 ± 0.09
Extracto 24.46 ± 5.96
Hc-1 9.54 ± 0.14
Tabla 4. Valores de CI50 para el extracto metanólico, Hc-1 y el BHT
(control positivo)

Tanto el extracto como el flavonoide obtenido presentaron una actividad
antioxidante significativa, para seguir siendo evaluados y posiblemente
ser utilizados en el tratamiento de enfermedades o padecimientos que
afectan el sistema nervioso central, que es el uso que se le da
tradicionalmente a la mayoría de las plantas que pertenecen al género
Heteropterys. La gran cantidad de ERO que generan estos
padecimientos dañan al cerebro y al ser éste un órgano que utiliza
mucho oxígeno, esta especie reactivas se acumulan y provocan un daño
más severo, por lo que uno de los tratamientos que se aplican es
disminuir esas ERO usando agentes antioxidantes y así contrarrestar los
efectos degenerativos de estas enfermedades (Estrada-Reyes, 2012).

6.6.3 Ensayo de inhibición de la enzima α-glucosidasa
En el gráfico 5 muestra que tanto el extracto como el compuesto Hc-1
tuvieron actividad inhibiendo la enzima, logrando una mayor inhibición
por parte de Hc-1 a una concentración de 100 μg/ml.

La actividad de los flavonoides inhibiendo esta enzima se debe a los
grupos hidroxilo presentes en la estructura de estos compuestos, el
mismo mecanismo de acción antioxidante. Esto también se ve reflejado
en la actividad del extracto, la presencia de compuestos fenólicos
Resultados y discusión

contribuyen a la inhibición de la enzima (López-Martínez, 2013; Luyen,
2013).

Gráfico 5. Porcentaje de inhibición de la enzima α-glucosidasa por el
extracto y Hc-1. El resultado muestra el promedio de 3 experimentos
independientes, los valores p≤0.05(*) y p≤0.01(**) se consideran con
diferencia significativa respecto al control.

Se determinaron los valores de CI50 del extracto y del compuesto
obtenido y se compararon con el de la quercetina (control positivo)
(Gráfico 6, Tabla 5). El cálculo mostró que se necesita menor cantidad
del compuesto (11.60 μg/ml) que del extracto (208.03 μg/ml) para
inhibir la enzima pero los valores siguen siendo mayores al obtenido
para la quercetina (5.28 μg/ml), que como ya se analizó anteriormente
(acción antioxidante), la cantidad y posición de los grupos hidroxilo en la
estructura de la quercetina le favorecen en su acción biológica (Hong,
2013; Tadera, 2006).

Resultados y discusión

Gráfico 6. Determinación de la CI50 de la enzima por acción del extracto
y Hc-1. El resultado muestra el promedio de 3 experimentos
independientes, los valores p≤0.05(*) y p≤0.01(**) se consideran con
diferencia significativa respecto al control.

Compuesto CI50 (μg/ml)
Quercetina
(control positivo)

5.28 ± 0.57
Extracto 208.03 ± 24.68
Hc-1 11.60 ± 1.13
Tabla 5. Valores de CI50 para el extracto metanólico, Hc-1 y la
quercetina (control positivo)

Este estudio es uno de los primeros realizados para evaluar la capacidad
que tiene la planta Heteropterys cotinifolia y el compuesto obtenido
como inhibidores de esta enzima y por lo tanto, para ser potencialmente
utilizables en el tratamiento de la diabetes.
Resultados y discusión

6.6.4 Actividad anti-inflamatoria por el método de edema
en oreja de ratón inducido por 12-O-tetradecanoilforbol-13-
acetato (TPA)
En la tabla 6 se muestran el porcentaje de inhibición del edema por
parte del extracto y del compuesto Hc-1.

Compuesto Dosis
(mg/oreja)
Porcentaje de
inhibición del edema
Indometacina
(control positivo)

0.4

78.76
Extracto 1 1.05
Hc-1 1 24.43
Tabla 6. Valores de porcentaje de inhibición del edema por el extracto,
Hc-1 y la indometacina (control positivo)

Con el compuesto obtenido se logró una inhibición mayor del edema que
con el extracto.

La gran cantidad de interacciones que hay entre los compuestos
presentes en los extractos aumentan o disminuyen las actividades
biológicas, este puede ser el caso del extracto que no presentó acción
anti-inflamatoria bajo este modelo.

El mecanismo de acción anti-inflamatorio de los flavonoides es mediante
la supresión de la fagocitosis de los macrófagos, liberación de sustancias
oxidantes de los neutrófilos, activación de los mastocitos e inhibición