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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
 DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE CIENCIAS 
 
 
Estudio de la diversidad microbiana de 
bacterias anoxigénicas púrpuras del azufre 
en las lagunas de Cuatrociénegas, Coahuila. 
 
 
 
 
 
T E S I S 
 
 
 
 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO 
DE: 
 
 BIÓLOGA 
 
 
 
 P R E S E N T A : 
 
 PAOLA ANGÉLICA VÁZQUEZ CISNEROS 
 
 
 
 
 
DIRECTORA DE TESIS: 
DRA. VALERIA SOUZA SALDÍVAR 
 
 
 
 Ciudad Universitaria, Cd. Mx, 2017 
 
 
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ÍNDICE 
 
 Resumen 
1. Introducción 
1.1 El estudio de la diversidad biológica 
 1.1.1 Componentes de la diversidad 
1.2 Estudio de la diversidad microbiana 
 1.2.1 El gen rRNA 16S y la filogenia molecular como herramientas 
 Para estudiar la diversidad bacteriana 
2. Antecedentes 
2.1 El valle de Cuatrociénegas, Coahuila 
2.2 Bacterias púrpuras de azufre 
2.3 Justificación 
3. Objetivos 
 General 
 Particulares 
4. Material y métodos 
4.1 Sitio de muestreo 
4.2 Medios de cultivo y condiciones de crecimiento 
4.3 Construcción de librerías de clonas utilizando el gen rRNA 16S 
 4.3.1 Extracción de DNA 
 4.3.2 Amplificación del gen rRNA 16S mediante la técnica de PCR 
 4.3.3 Clonación 
 4.3.4 Secuenciación y análisis de las secuencias 
 4.3.5 Análisis filogenético 
5. Resultados 
5.1 Enriquecimiento y aislamiento de BPS y BPNS 
5.2 Clonación del gen rRNA 16S 
5.3 Análisis de las secuencias 
 5.3.1 Proporciones de los taxa en las pozas de Cuatrociénegas 
 5.3.2 Unidad taxonómica operacional (OTU) 
5.4 Filogenia 
5.5 Curva de rarefacción 
6. Discusión 
6.1 ¿Por qué estudiar diversidad microbiana en Cuatrociénegas? 
6.2 ¿Qué encontramos? 
6.3 Distribución y estilos de vida 
7. Conclusión 
8. Perspectivas 
9. Referencias 
10. Apéndices 
 
 
 
 
 
RESUMEN 
 
 
El Valle de Cuatrociénegas Coahuila, presenta un conjunto de condiciones particulares que 
lo hacen ser un sitio de idóneo para la investigación científica. La baja cantidad de nutrientes 
ha generado que las bacterias sean la base de la pirámide alimenticia, por lo que se han 
adaptado a distintas formas de vida muy interesantes. 
Para estudiar la diversidad microbiana de bacterias púrpuras anoxigénicas se colectaron, 
cultivaron, clonaron y secuenciaron 40 muestras, tomadas en 3 sitios hidrológicos en el Valle 
de Cuatrociénegas. Las muestras tanto de sedimento como de agua. Cada muestra fue 
dividida y colocada en medio rico en azufre y medio sin azufre, después fueron sometidas en 
completa oscuridad a 4 longitudes de onda distintas, 470nm, 565nm, 700nm y 940nm. 
Únicamente se observó crecimiento a 940nm. Se construyeron 40 librerias de clonas del gen 
16S que codifica para ARN ribosomal, cada una compuesta por 4 secuencias. También las 
secuencias obtenidas, fueron caracterizadas taxonómicamente en la base de datos 
nucleotídica de NCBI. Con las secuencias se construyó una filogenia para conocer las 
relaciones filogenéticas. 
Encontramos que dentro de los sitios hidrológicos Churince, Pozas Rojas y Pozas Azules, la 
diversidad de bacterias púrpuras se comparte, predominando los grupos taxnómimicos: 
gammaproteobacteria, alphaproteobactera y deltaproteobacteria. 
La mayor parte de los OTUs son únicos y hay pocos que ya hayan sido registrados en la base 
de datos NCBI. Por otra parte, la curva de rarefacción nos muestra que aún falta 
representatividad de las especies en los sitios. Por lo que para estudios futuros será necesario 
definir todos los grupos que conforman esta comunidad. 
 
1. INTRODUCCIÓN 
 
1.1 El estudio de la diversidad biológica 
 
La diversidad biológica hace referencia a la variabilidad de organismos vivos y comprende a 
la diversidad genética, la diversidad de especies y también incluye a los ecosistemas 
(Convenio Diversidad Biológica 1992). La diversidad biológica ha sentado las bases para 
entender los procesos y mecanismos que sustentan la vida sobre el planeta. Su importancia 
radica en tres aspectos: 1) la diversidad biológica se acumula y se mantiene a través del 
tiempo y el espacio, siendo su comprensión uno de los objetivos fundamentales de la ecología 
(Loureau et al. 2001); 2) es importante para la ciencia ya que su conocimiento permite 
formular teorías sobre la evolución de la vida en nuestro planeta y realizar predicciones sobre 
la existencia de vida en otros puntos del universo (Urbieta 2013); y finalmente 3) la 
estimación del valor de la diversidad biológica de cualquier ambiente natural es fundamental 
para reconocer taxa y regiones prioritarias para la conservación (Eguiarte et al. 1999). 
 
1.1.1 Componentes de la diversidad 
 
En la naturaleza la diversidad se encuentra estructurada de manera que las especies puedan 
interaccionar en un espacio y tiempo determinados, a este conjunto de especies que cohabitan 
se le denomina comunidad biológica (Escalante 2008), la cual expresa una serie de 
características únicas y diferenciales y a su vez, es capaz de adaptarse a variaciones que 
pueden generar desequilibrio. 
Las características y componentes de la diversidad se analizan de manera comparativa 
y requieren una referencia espacial y temporal. El análisis de la diversidad ocurre a escalas 
distintas y uno de los enfoques más usados, concibe la diversidad en tres componentes: local 
(α), regional (γ) y la diferencia entre comunidades locales (β) (Whittaker 1960-1972). 
Diversidad alfa. Hace referencia a la diversidad en un sitio o una muestra y puede ser 
expresada de dos formas. Una es la riqueza de especies: el número total de las 
diferentes especies presentes. La otra es la abundancia de especies: muestra la 
proporción de cada especie en la comunidad. La riqueza y la abundancia de especies 
pueden variar rápidamente en poco tiempo. Estas dos formas nos sirven para conocer 
las actividades asociadas a la comunidad y al ambiente no vivo, lo anterior para poder 
modelar el ecosistema y observar los cambios en la comunidad en caso de existir 
alguna perturbación (Brock 2009). 
Diversidad beta. Es el recambio entre las especies de dos comunidades o dos paisajes. 
Estas diferencias pueden ocurrir en el espacio (entre dos sitios diferentes), o en el 
tiempo (en el mismo lugar, pero en tiempos distintos). Se entiende como el grado de 
diferenciación en composición o en la estructura (Brock 2009). 
Diversidad gama. Hace referencia a la diversidad regional, incluye varias localidades. 
Su estimación expresa la diversidad en función de la riqueza local (alfa) y el recambio 
(beta) de manera aditiva: 𝛾 = ∝ + 𝛽 (Brock 2009). 
Los patrones dentro de la diversidad de especies proporcionan ideas importantes acerca de 
los mecanismos que regulan la diversidad biológica y son centrales para el desarrollo de 
modelos y teorías ecológicas. 
Desde sus inicios, las teoríasecológicas y biogeográficas se han centrado en el estudio de 
macroorganismos, incluyendo plantas y animales. Por su lado, debido a las dificultades para 
su estudio y a pesar de que constituyen en conjunto la mayor biomasa sobre el planeta. Los 
microorganismos presentan sin duda la mayor diversidad dentro de todos los ecosistemas, y 
son los principales agentes de transformación y flujo de materia y energía en los ciclos 
biogeoquímicos. Por lo que han sido recientemente incluidos en estudios ecológicos. 
Para poder hablar de ecología hay que hablar primero de diversidad y para ello es 
necesario conocer los elementos que la componen. Conocer los patrones de la diversidad 
pueden darnos información sobre la diversidad en un sitio (local), el recambio entre las 
especies de dos comunidades o dos paisajes y con esa información es posible generar 
hipótesis acerca de los papeles que juegan las diferentes especies bacterianas, de acuerdo a 
las características del ambiente que las rodea, en los diferentes manantiales de vida que 
afloran en el valle de Cuatrociénegas. 
 
1.2 Estudio de la diversidad microbiana 
 
Durante más de dos décadas la comprensión de la diversidad microbiana se vio obstaculizada 
por la falta de métodos y herramientas adecuadas para su investigación. En los noventas, el 
uso de técnicas moleculares para estimar la diversidad y estructura microbiana tales como 
pruebas de hibridación específica, amplificación de rRNA 16S, TRFLPs (Terminal 
Restriction Fragment Length Polymorphism) y DGGE (Denaturing Gradient Gel 
Electrophoresis), revelaron una alta diversidad microbiana, en relación con lo que se había 
observado con técnicas dependientes de cultivo y microscopía (DeAnda, en preparación), en 
particular, el uso del gen rRNA 16S, permitió sentar las bases para la taxonomía microbiana 
al definir una especie bacteriana, como el conjunto de cepas que comparten una similitud 
mayor del 70% en asociación DNA-DNA. Esta similitud significa una identidad mayor del 
97% entre sus genes para el rRNA 16S. Por lo tanto, cepas con menos del 97% de identidad 
en las secuencias de dichos genes, es improbable que lleguen a estar relacionadas a nivel de 
especie (Forney et al. 2004; Rodicio y Mendoza 2004). 
En la práctica, la identidad taxonómica ha sido utilizada para reconocer grupos de 
organismos, al agrupar las secuencias con una similitud mayor al 97% en unidades 
operacionales taxonómicas (OTU, Operational Taxonomic Unit). El gen de rRNA 16S dio 
paso a establecer una clasificación bacteriana ahora muy utilizada por taxónomos llamada 
Manual de Bergey´s (Garrity 2001). 
A principios del siglo XXI, el uso de marcadores moleculares para identificar las 
funciones abrió la posibilidad de estudiar el potencial metabólico de las comunidades 
microbianas en sistemas ecológicos, para determinar el papel de grupos metabólicos 
específicos (De Anda en preparación). 
 Los diferentes metabolismos que poseen los microorganismos de una comunidad, se 
integran a los procesos que tienen lugar en un ecosistema y dependiendo de muchos factores, 
pueden tener un mínimo o un profundo impacto y pueden disminuir o enriquecer las 
actividades de otros organismos (Whitman et al. 1998). 
Las actividades microbianas en un ecosistema pueden estar dados en función de las 
especies presentes, los tamaños de las poblaciones y el estado fisiológico de los 
microorganismos en cada hábitat. Las tasas de actividad van a ser controladas por los 
nutrientes presentes y las condiciones de crecimiento que prevalezcan. Por esta razón se 
busca primeramente el conocimiento de las bacterias que se encuentran presentes en un sitio 
dado y donde es posible trabajar con un grupo de bacterias con características únicas. 
1.2.1 El gen rRNA 16S y la filogenia molecular como herramientas para estudiar la 
diversidad bacteriana 
 
Para estudiar la diversidad genética en diferentes niveles de integración, existe una 
herramienta fundamental: el uso de filogenias. En ellas se resume el grado de divergencia 
entre diferentes grupos de organismos y el concepto de filogenia se puede usar a todos los 
niveles de la jerarquía biológica (Eguiarte; 1999). 
En 1987, Woese (Woese 1987, Woese et al. 1990) publica una propuesta basada en el 
análisis del gen 16S que codifica el RNA ribosomal como marcador universal. Esto permitió 
conocer aquellos microorganismos que no son posibles de cultivar. Con ayuda de este gen, 
se pueden clasificar distintos tipos de organismos debido a su alto grado de conservación en 
los tres dominios de la vida: Bacteria, Archaea y Eucarya. Mediante el nivel de similitud de 
las secuencias de este gen, Woese construyó la filogenia universal la cual constituye las 
relaciones de miles de organismos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Árbol filogenético universal, enraizado, que muestra los tres dominios de la vida, se 
construyó a partir del gen 16S ribosomal. (Woese 1990). 
 
 
Las secuencias nucleotídicas de genes de DNA ribosomal son las aproximaciones más 
comunes en el estudio de la diversidad en comunidades microbianas. El gen rRNA 16S es 
un gen esencial en todos los organismos y se eligió porque posee regiones altamente 
conservadas y a su vez regiones altamente variables, siendo las regiones altamente variables 
las que permiten realizar la clasificación. (Escalas et al. 2013). 
Las técnicas moleculares han facilitado el estudio de las comunidades bacterianas, 
generando rápidamente información acerca de su composición, número e identidad de 
unidades taxonómicas y la distribución de la abundancia entre estas unidades, así como sus 
relaciones filogenéticas. Estas técnicas han permitido explorar líneas evolutivas de gran 
interés para la ciencia, como por ejemplo desarrollo de la fotosíntesis en los organismos 
vivos. 
Para la comprensión de la dinámica de los sistemas ecológicos y del ciclaje de materia y 
energía, es necesario el reconocimiento y la descripción de los organismos que están 
implicados en estos procesos. La falta de información taxonómica en los ecosistemas 
naturales, conlleva a un desconocimiento de la producción primaria de la mayoría de la 
biomasa mundial, la cual principalmente está basada en las interacciones microbianas 
(Yanine 2010). 
Como parte de un estudio multidisciplinario en el cual se pretende entender la dinámica 
de un sistema ecológico completo, así como formar un inventario de todas las especies, 
tomando en cuenta los microorganismos y macroorganismos, se llevó a cabo un estudio de 
caracterización, identificación y descripción de bacterias púrpuras anoxigénicas que llevan a 
cabo el ciclaje de nutrientes y energía mayoritarios en nuestro sitio de estudio, localizado en 
Cuatrociénegas, Coahuila, México. 
2. ANTECEDENTES 
 
2.1 El valle de Cuatrociénegas, Coahuila 
 
El valle de Cuatrociénegas, se ubica en el centro del estado de Coahuila está decretada como 
zona protegida en la categoría de Área de Protección de Flora y Fauna por el estado mexicano 
desde 1994, debido a la gran cantidad de especies endémicas, con una superficie de cerca de 
85,000 Ha. Se encuentra localizado en 26° 45’ 00” y 27° 00’ 00” de latitud Norte; 101° 48’ 
49” y 102° 17’ 53” de longitud Oeste (Espinoza 2005) y forma parte del Desierto 
Chihuahuense, su altitud promedio es de 735 msnm (Souza et al. 2004). Está ubicado al Este 
de la Sierra Madre Oriental y al Oeste de la Sierra Madre Occidental (Rodríguez 2007). Estas 
sierras llegan a medir hasta 3,000 metros de altura y están formadas principalmente por rocas 
calizas (figura 1). Tiene una precipitación media anual de 200 mm y temperaturas entre 0° 
en invierno y 44°C en verano (Minckley 1969). Con tan poca precipitación anual la recarga 
del manto freático por lluvias es lenta, por lo que la mayor parte del agua subterránea 
proviene de un acuífero profundo que recarga los sistemas acuáticos (Wolaver et al. 2012).Figura 1. Ubicación del estado de Coahuila, en la parte norte del país. En el estado se localiza el 
municipio Cuatrociénegas de Carranza y alberga un área de protección de flora y fauna. 
México 
Coahuila 
Cuatrociénegas 
APFF 
 
 
Figura 1.1 Ubicación del área de estudio. Los sitios de muestreo comprendieron 3 sistemas 
hidrológicos: Churince, Pozas Rojas y Pozas Azules 
Cuatrociénegas 
Sitios de muestreo 
 Churince Pozas Azules Pozas Rojas 
Los manantiales se llaman localmente pozas; las áreas se conocen como lagunas o lagos. La 
mayoría de estos ambientes acuáticos se caracterizan por presentar pocos nutrientes y altas 
concentraciones de minerales provenientes de las rocas cársticas que existen en la zona 
(Espinoza 2005). Principalmente estos ambientes presentan un bajo contenido en fósforo 
(6.68 (0.25) µg g-1), por lo que se consideran oligotróficos extremos (Tapia-Torres et al. 
2016). 
Por sus peculiares características, el valle de Cuatrociénegas representa un laboratorio 
natural y ha sido objeto de diversos estudios de investigación. Existe un fuerte interés 
biogeoquímico en la naturaleza de las comunidades microbianas, como también interés 
puramente microbiológico debido a que los ambientes de las pozas ofrecen una oportunidad 
única para estudiar la complejidad de hábitats biológicos en condiciones extremas. 
Los llamados ambientes extremos se caracterizan por presentar un factor selectivo alto y sólo 
podrán establecerse aquellos microorganismos que presenten las adaptaciones necesarias 
para sobrevivir (Horner-Devine et al. 2004). El valle de Cuatrociénegas presenta una 
estructura de comunidades bacterianas muy antigua. Estas comunidades están formadas por 
un bajo número de microorganismos muy abundantes generalmente en la naturaleza (como 
las cianobacterias) y un número muy elevado de microorganismos raros o poco abundantes 
(como las bacterias anoxigénicas y reductoras de azufre). 
Las características geológicas e hidrológicas del valle de Cuatrociénegas dieron lugar a 
una diversificación de linajes microbianos y la emergencia de endemismos en las 
comunidades acuáticas del valle (Souza et al. 2008). Como parte de estas características 
extremas, Cuatrociénegas también alberga una gran cantidad de estromatolitos, tapetes 
microbianos y biofilms de bacterias púrpuras que están restringidos a muy pocos sitios en el 
mundo. La importancia de estas comunidades bacterianas radica en su capacidad de llevar a 
cabo los mayores ciclos biogeoquímicos: carbono, oxígeno y azufre (Bonilla-Rosso 2012). 
Estas comunidades bacterianas se organizan de acuerdo con los gradientes de oxígeno y 
nutrientes en diferentes regiones donde se especializan para diversas tareas. Utilizan señales 
intercelulares para coordinar el comportamiento de la colonia (Clarke 2016). Su organización 
permite la convivencia de una gran cantidad de especies que interactúan cercanamente para 
sobrevivir en un medio adverso. 
Los tapetes microbianos y estromatolitos en el valle de Cuatrociénegas han sido muy 
bien caracterizados mediante técnicas de secuenciación masiva (metagenomica) en diversos 
puntos del valle (Bonilla-Rosso 2012). Sin embargo, no se tiene conocimiento alguno de los 
biofilms de bacterias púrpuras que habitan en las pozas de Cuatrociénegas, Coahuila y por lo 
tanto se consideran un grupo importante para estudiar. 
Este grupo de bacterias son capaces de fotosintetizar sin generar una molécula de oxigeno 
como producto, por lo que se considera que presentan un metabolismo primigenio (Bui, E.T. 
et al. 1996). 
2.2 Bacterias púrpuras fotosintéticas 
 
Las bacterias púrpuras del azufre (BPS) son microorganismos gram-negativos que convierten 
la energía luminosa en energía química por medio del proceso llamado fotosíntesis 
anoxigénica. Participan en el ciclo anóxico del carbono como productores primarios (fijando 
carbono por fotoautotrofía) y como consumidores de luz en la reducción de compuestos 
orgánicos (fotoheterotrofía). 
Las BPS a diferencia de otros grupos de fotótrofos como las cianobacterias y las bacterias 
verdes del azufre, pueden crecer de forma aerobia, anaerobia, fotoautótrofa, fotoheterótrofa 
y quimiorganótrofa (Hunter et al. 2009). Son organismos que ocupan una posición única 
entre las bacterias fotosintéticas y aunque no forman un grupo monofilético se encuentran 
entremezclados con otros fenotipos (Overmann 2005). 
Las BPS requieren condiciones de anoxia porque la síntesis de pigmentos es reprimida 
en presencia de oxígeno molecular (Cohen-Bazire et al. 1957). La condición de anoxia 
combinada con la incidencia de luz adecuada es mayormente encontrada en lagos, lagunas, 
estuarios y otros ambientes acuáticos donde está presente en altas concentraciones el sulfuro 
de hidrógeno (H2S) (Pfennig 1989). Una vez que las condiciones se cumplen, la naturaleza 
del hábitat se encarga de controlar la abundancia y diversidad de estas bacterias (Madigan 
1988). 
Por otro lado, una contribución importante de las bacterias púrpuras al ambiente es el 
consumo de sulfuro de hidrógeno (H2S), el cual es un gas altamente tóxico para plantas, 
animales y también para algunas bacterias. La oxidación de H2S por las bacterias púrpuras 
produce formas no tóxicas de azufre, como azufre elemental (S°) y sulfato (SO4)
2-, 
permitiendo que las capas superiores del agua se mantengan óxicas y adecuadas para otros 
organismos (Hunter et al. 2009). 
Las bacterias púrpuras se dividen, de acuerdo a sus características generales en bacterias 
púrpuras del azufre (BPS) y en bacterias púrpuras no del azufre (BPNS). Las BPS y BPNS 
fueron originalmente distinguidas por sus características fisiológicas basándose en su 
tolerancia y utilización del sulfuro. Sin embargo, experimentos de Hansen y Van Gemerden 
(1972) demostraron que ese criterio de clasificación no era absoluto ya que existen BPNS 
capaces de crecer a niveles de sulfuro menores a 0.5 mM y son capaces de oxidar sulfuro a 
azufre elemental, tetrationato (S4O6
2-) o sulfato (SO4)
2-. Por otro lado, análisis filogenéticos 
basados en comparaciones de rRNA 16S han mostrado que las BPS pertenecen a las 
gammaproteobacterias mientras que las BPNS pueden pertenecer a las alfa o a las 
betaproteobacterias. Ambas pueden coexistir en hábitats anóxicos iluminados (Imhoff et al. 
2005). 
Se reconocen más de 25 géneros de BPS y consisten en tipos morfológicos muy variados, 
este grupo incluye especies que almacenan S° dentro de la célula (ej. Chromatiaceae) 
mientras que otros lo almacenan de manera extracelular (ej. Ectothiorhodospiraceae). A 
pesar de tener un metabolismo íntimamente ligado al azufre (Pfennig 1989) y a la 
fotoautotrofía, las BPS también son capaces de tener fotoheterotrofía limitada, al estar 
adaptadas para crecer en la oscuridad (Hunter et al. 2009). Estas especies toleran niveles de 
concentración de milimoles de sulfuro que oxidan en glóbulos de azufre intracelulares. La 
forma de crecimiento fotoautotrófico utiliza como donadores de electrones azufre (S°), 
tiosulfato (S2O3) o hidrógeno (H2) (Tüper and Fischer 1982). Algunas especies más versátiles 
pueden utilizar otros donadores de electrones como el Fe2+, el que oxidan a Fe3+ (Ehrenreich 
and Widdel 1994). Otras especies pueden utilizar nitrito (NO2-) el cual oxidan a nitrato (NO3-
) (ej. Thiocapsa). Los géneros de BPS que si pueden crecer en la oscuridad como 
Allochromatium, Thiocystis, Amoebobacter y Thiocapsa, pueden crecer de manera 
quimiorganótrofa o quimiolitótrofa cuando la concentración de O2 es baja. Thiocapsa 
roseopersicina y Thiocystis violacea son las BPS más tolerantes al oxígeno (Kämp and 
Pfennig 1980). 
Dentro de las BPNS se reconocen 20 géneros, entre los más estudiados se encuentran 
Rhodobacter y Rhodopseudomonas. Presentan un metabolismo predominante que es la 
fotoheterotrofía,pero también son capaces de poseer metabolismo fotóautótrofo. A 
diferencia de las BPS, las BPNS poseen capacidades diversas para crecer y metabolizar en la 
oscuridad. El mejor ejemplo hasta ahora conocido es Rhodobacter capsulatus, que puede 
crecer bajo condiciones fotótrofas utilizando CO2 o carbono orgánico, también puede crecer 
en la oscuridad por respiración, fermentación o quimiolitotrofía (Madigan and Gest 1979). 
Así, las BPNS no son un grupo monofilético pues sus miembros pertenecen tanto a las 
alfaproteobacteras como a las betaproteobacterias, compartiendo sus historias evolutivas con 
muchas especies de bacterias no fotótrofas (Imhoff et al. 2005). Dado que la capacidad 
fotótrofa no es común en estos dos grandes grupos de bacterias y si se toma en cuenta que 
los pigmentos y fotocomplejos en diferentes especies de BPNS son similares, es posible 
proponer dos hipótesis. Por un lado, una innovación metabólica que fue adquirida por 
transferencia genética horizontal (Nagashima et al. 1997). Por otro lado, diferentes especies 
de bacterias perdieron la capacidad fotótrofa. 
 
2.3 Justificación 
 
La comprensión de la dinámica de los sistemas ecológicos y del ciclaje de materia y energía, 
es necesaria la identificación taxonómica de los organismos. 
La gran mayoría de estudios sobre la diversidad microbiana del valle de Cuatrociénegas, 
han sido enfocados principalmente al estudio de organismos aeróbicos, siendo los linajes de 
Pseudomonas (Escalante 2008; García-Ulloa en proceso; Rodríguez-Verdugo et al 2012; 
Ponce-Soto et al. 2015), Vibrio (Vazquez-Landa en proceso), Bacillus (Alcaraz 2008, 2009; 
Avitia, 2014) y Exiguobacterium (Rebollar 2012), los más estudiados. Sin embargo, no 
existen reportes de la diversidad de bacterias anaerobias existentes en valle de 
Cuatrociénegas debido a la dificultad que existe para su cultivo e identificación. 
Las BPS tienen una gran importancia como productoras primarias, puesto que forman 
parte del ciclo del carbono y del azufre y sirven como alimento de diversos organismos. Las 
BPS pueden revelar información acerca de la estructura de la comunidad en el valle de 
Cuatrociénegas. En consecuencia, el esfuerzo puesto en este estudio está contribuyendo 
rápidamente a la generación de una gran base de datos sobre la abundancia y distribución de 
las especies microbianas que habitan en el valle de Cuatrociénegas. Este proyecto generará 
conocimientos para la ecología microbiana, así como para generar un valor que apoye a la 
conservación de la diversidad biológica. 
 
3. OBJETIVOS 
 
GENERAL 
Identificar la diversidad bacteriana de biofilms de bacterias púrpuras del azufre y no del 
azufre, de las pozas de Cuatrociénegas, utilizando técnicas de cultivo anoxigénicos con 
diferentes aceptores de electrones y fuentes de luz para obtener aislados de tres sistemas 
hidrológicos del valle. 
 
PARTICULARES 
- Aplicar la técnica de librerías de clonas utilizando el gen rRNA 16S para determinar 
las especies bacterias obtenidas en los diferentes cultivos anoxigénicos. 
- Aplicar filogenia molecular a partir de secuencias del gen rRNA 16S para determinar 
las relaciones entre especies de BPS en los sistemas hidrológicos de Cuatrociénegas. 
4. MATERIAL Y MÉTODOS 
 
 4.1 Sitio de muestreo 
 
El muestreo se realizó en los meses de febrero y mayo de 2012. Se tomaron muestras de agua 
y sedimento en los sistemas hidrológicos de Churince, Pozas Rojas y Pozas Azules. Se 
tomaron muestras en 6 sitios del Sistema Laguna Intermedia Churince (CHLI1, CHLI2, 
CHLI3, CHLI4, CHLI6, CHLI7), 3 sitios en el Sistema Pozas Rojas (PRB, PRob, PRS3) y 2 
sitios en el Sistema Pozas Azules (PA1, PACHs), señalados en el mapa que se presenta en la 
introducción (figura 1). Los sitios de cada sistema se ubicaron geográficamente (tabla 1). En 
cada sitio, se muestreó la columna de agua y el sedimento superficial (aproximadamente 3 
cm de la superficie) con tubos de polipropileno de 50 ml estériles, los cuales fueron 
transportados inmediatamente al laboratorio en el Centro de Bachillerato Tecnológico 
Agropecuario CBTa en Cuatrociénegas, Coahuila. 
Tabla 1. Ubicación GPS de los sitios de colecta en los sistemas Churince, Pozas Rojas y 
Pozas Azules. 
Sistema hidrológico Sitio de colecta Latitud °N Longitud °W 
Churince LI1 N 26° 50´ 54.2´´ W 102° 08´ 25.90´´ 
LI3 N 26° 50´ 53.2´´ W 102° 08´ 29.9´´ 
LI4 N 26° 50´ 53.1´´ W 102° 08´31.6´´ 
LI6 N 26° 50´ 55.6´´ W 102° 08´ 31.2´´ 
LI7 N 26° 50´ 53.3´´ W 102° 08´ 33.7´´ 
Pozas Rojas Berries N 26° 52´ 18.68´´ W 102° 01´ 17.00´´ 
Obispo N 26° 52´ 18.16´´ W 102° 01´ 17.78´´ 
Sitio 3 N 26° 52´ 18.39´´ W 102° 01´ 12.27´´ 
Pozas Azules Sitio 1 N 26° 48´ 41.53´´ W 102° 0´ 46.47´´ 
Ch Sal N 26° 48´ 41.30´´ W 102° 0´ 45.22´´ 
4.2 Medios de cultivo y condiciones de crecimiento 
 
Se mandaron fabricar tubos de vidrio con tapón de rosquilla para el cultivo de estas bacterias 
(figura 4b) cuyo diseño es aquel que se usa tradicionalmente en el curso de Microbial 
Diversity de los Marine Biological Laboratories en Woods Hole, MA, USA para aislar 
rutinariamente a estos organismos. Estos recipientes son conocidos como botellas Pfennig y 
hacen referencia al pionero en el estudio de bacterias anoxigénicas. 
Las muestras de agua y de sedimento fueron divididas en seis tubos Pfenning, 
enriquecidas con medios flexibles: 3 tubos con medio marine sulfur phototrophs enriquecido 
con tiosulfato de sodio (Na2O3S2) y 3 tubos con medio marine acetate- degrading nonsulfur 
phototrophs enriquecido con Sulfato de Sodio (Na2SO4) (apéndice 1). 
Cada muestra tomada se repartió en 4 tubos de cultivo diferentes los cuales se colocaron 
en cuatro cajas obscuras que contenían placas LEDs en las longitudes de onda: 470nm, 
565nm, 700nm y 940nm, +/- 20 nm. Debido a que las BPS y las BNPS tienen un rango de 
crecimiento entre los 815 a los 1049 nm, se construyeron cajas de crecimiento con placas de 
LEDs y se verificó con un luxómetro digital HER-410 de STEREN, que la luz emitida fuera 
suficiente para iluminar sin exceder la capacidad de fototrofía de las bacterias. 
Para que fuera posible crecer en el laboratorio diferentes tipos de fotótrofos y a su vez 
limitar el crecimiento de cianobacterias, se utilizó un compuesto encargado de inhibir al 
fotosistema II. El compuesto DCMU (3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea) de Sigma-
Aldrich, forma parte de las condiciones de crecimiento preferencial que incluye: un donador 
de electrones (Na2SO4 y S2O3), una fuente de carbono (acetato y CO2 respectivamente) y la 
condición de luz infrarroja (Madigan 2007). 
El cultivo y crecimiento de los microorganismos se llevó a cabo en colaboración con el 
laboratorio de la Dra. Katy Juárez en el Instituto de Biotecnología, UNAM. Con el fin de 
obtener cultivos puros se realizaron tres traspasos en los meses de junio, julio y agosto de 
2012, de los cuales se tomó 1 mL de cultivo y se colocó en medio nuevo (este procedimiento 
se realizó en la cámara anaeróbica para mantener las condiciones de anoxia). Debido al lento 
crecimiento de las BPS y la dificultad de obtener cultivos axenicos de BPNS se decidió llevar 
a cabo la construcción de librerías de clonas del gen rRNA 16S, con el fin de conocer todas 
las especies de bacterias presentes en los cultivos y poder establecer sus relaciones 
filogenéticas. 
 
4.3 Construcción de librerías de clonas utilizando el gen rRNA 16S 
 
4.3.1 Extracción de DNA 
 
Se realizó una extracción de DNA con el protocolo de extracción para bacterias Gram 
negativas incluido en el kit Qiagen, tissues & blood, de acuerdo a las instrucciones del 
proveedor. 
 
4.3.2 Amplificación del gen 16S rRNA, mediante la técnica de PCR 
 
El DNA extraído de las muestras se amplificó mediante la Reacción en Cadena de la 
Polimerasa (PCR) para el gen rRNA 16S y para cada una de las muestras con los 
oligonucleótidos universales para bacteriasy arqueas: 27 Forward 
5´AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3´ y 1492 Reverse 5´GGTTACCTTGTTACGACTT-3´ 
(Lane et al. 1991) (apéndice 2). Las amplificaciones del gen rRNA 16S fueron utilizadas para 
la construcción de librerías de clonas. Los productos de PCR se observaron en un gel de 
agarosa al 2%, TAE 1X. 
 
4.3.3 Clonación 
 
Para clonar los productos de PCR, se utilizó el kit TA Cloning, PCR 2.1 de Invitrogen con 
algunas modificaciones (apéndice 3). Este método consiste en clonar los fragmentos del gen 
rRNA 16S obtenidos en la técnica de PCR en vectores. Las reacciones de ligación se 
utilizaron para transformar células competentes de Escherichia coli TOP10 de Invitrogen 
(apéndice 4). Las clonas con inserto se seleccionaron y se crecieron en medio LB 2X con 
Ampicilina 25mg/mL para posteriormente realizar la extracción del plásmido por medio del 
Kit Plasmid Miniprep96 Millipore (apéndice 5). Las clonas con inserto se seleccionaron con 
base en su tamaño observado en un gel de agarosa al 1%. Se construyeron 40 librerías de 
cuatro secuencias cada una, obteniendo un total de 160 secuencias que fueron enviadas a 
secuenciación. 
 
4.3.4 Secuenciación y análisis de las secuencias 
 
Los plásmidos con inserto fueron secuenciados en MACROGEN South Corea, con los 
oligonucleótidos 27F y 1492R mediante la tecnología Sanger. Se obtuvieron 95 secuencias 
de aproximadamente 1200 pb. 
Las secuencias obtenidas fueron analizadas por diferentes programas para corrección de 
errores. Algunas de ellas fueron eliminadas en este proceso. 
Las secuencias fueron sometidas a un análisis en el programa BioEdit (Biological 
Sequence Alignment), que arroja una opción de alineación y permite editar manualmente los 
errores. Una vez que se prepararon las secuencias, se procedió a verificar que las secuencias 
fueran únicas y que no existieran quimeras, es decir, fragmentos de gen que se hayan unido 
por error generando una falsa secuencia. Para esté análisis se utilizaron los softwares en línea 
DECIPHER (Wright et al. 2013) y Bellerophon (Huber et al. 2004), que fueron empleados 
para confirmar que las secuencias del gen rRNA 16S fueron amplificadas correctamente sin 
evidencia de ser quimera. 
Se realizó un BLASTn en la base de datos de secuencias no redundantes que se encuentra 
en NCBI (National Center for Biotechnology Information) para inferir la taxonomía 
aproximada de las cepas obtenidas, utilizando siempre la cepa con el porcentaje de mayor 
identidad. 
Las secuencias de rRNA 16S de referencia que se integraron con las secuencias de 
Cuatrociénegas para construir el árbol filogenético fueron obtenidas de la base de datos 
SILVA que provee información integral y actualizada de las subunidades pequeñas (16S/18S, 
SSU) y la subunidad grande (23S/28S, LSU) del RNA ribosomal de los tres dominios de la 
vida (bacterias, arqueas y eukarya), (Quast et al. 2013). El alineamiento se realizó en ssu-
aling y ssu-mask. El resultado del alineamiento de secuencias fue visualizado y editado con 
SeaView. 
 
 
 
4.3.5 Análisis filogenético 
 
Para identificar los OTUs se utilizó el programa MOTHUR versión 1.30.1 (Schloss 2009) y 
se configuró para trabajar a una identidad del 97%. Para evaluar el esfuerzo de muestreo, se 
elaboraron curvas de rarefacción con el programa EstimateSWin910 (RK Colwell 2013). 
Los programas utilizados para el alineamiento de las secuencias fue Infernal: Inference 
of RNA alignment (Nawrocki et al. 2013) y SSU-ALIGN: Structural Alignment of SSU rRNA 
Sequences (Nawrocki 2009). El árbol filogenético fue construido con el cluster Mr. Bayes 
(Huelsenbeck el al. 2001) con 3,000,000 generaciones. 
 
5. RESULTADOS 
5.1 Enriquecimiento y aislamiento de BPS y BPNS 
 
Las muestras obtenidas en campo de sedimento y agua (figura 2 y 3), fueron cultivadas en 
dos tipos de medio: marine sulfur-phototrophs y marine acetate-degrading nonsulfur-
phototrophs (apéndice 1). De las cuatro longitudes de onda probadas sólo crecieron a una 
longitud de Infrarrojo a 940nm. Los cultivos enriquecidos de bacterias fotótrofas 
anoxigénicas tardaron de 2 a 3 meses en desarrollarse en tubos con tapa de goma, mientras 
que en los tubos Pfenning tardaron cerca de 1 mes. 
Al observar el lento crecimiento de los cultivos, se contactó con el experto en bacterias 
fotosintéticas anoxigénicas, Michael T. Madigan, Universidad de Wisconsin, quien hizo la 
observación acerca de los frascos de cultivo. Mencionó una experiencia en la cual los tapones 
de goma absorbieron la fuente de S, dejando desprovistas a las cepas en crecimiento. 
Se midió la cantidad de S al momento de la preparación del medio y se volvió a medir 
dos días después, confirmando la teoría donde el tapón de goma absorbe el S del medio, 
dejando a las cepas con una cantidad de alimento muy limitada. Por otra parte, el hecho de 
utilizar tubos de 10 mL de capacidad también estaba retrasando el crecimiento de las cepas. 
Esto nos llevó a conseguir tubos con tapa de rosca y con capacidad para 5 mL como lo sugirió 
el Dr. Michael T. Madigan. Los primeros tubos utilizados se pueden observar en la figura 4a 
mientras que los tubos que favorecieron el crecimiento de las cepas se pueden observar en la 
figura 4b. En la tabla 2, se muestra la cantidad de cultivos exitosos. 
 
Tabla 2. Número de cultivos obtenidos en este estudio 
 
Sistema acuático No. de cultivos 
totales 
Aislados en 
sedimentos 
Aislados en 
agua 
Churince 20 14 6 
Pozas rojas 17 8 9 
Pozas azules 3 0 3 
Total 40 22 18 
 
La segunda columna muestra el número de cultivos por sistema hidrológico muestreado. La 
tercera y cuarta columna muestran el número de cultivos obtenidos en sedimento y en agua. 
 
Se realizaron tres transferencias de 1 mL de cultivo a medio nuevo cada 2 meses. Sin 
embargo, después de 6 meses aún no se obtenían cultivos 100% axénicos por lo que se optó 
por construir librerías de clonas para obtener la mayor cantidad de los organismos presentes 
en los cultivos. Se obtuvieron cultivos que iban desde colores rojos-rosados hasta cafés-
verdosos (figuras 2 y 3). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Tapete microbiano. Organización bacteriana de arriba-abajo en los tapetes encontrados en 
los sitios de Cuatrociénegas, Coahuila: 1. Polímero producido para protección solar, 2. Diatomeas, 
3. Cianobacterias, 4. Purpuras anoxigénicas, 5. Sulfatoreductoras y 6. Metanogenas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Florecimiento de bacterias purpuras anoxigénicas en poza rica en compuestos de azufre. 
 
1 
 
2 
 
3 
 
 
4 
 
5 
 
6 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
a) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
b) 
 
Figura 4. Coloración de los cultivos. a) Primeros cultivos en tubos con tapa de goma, b) tubos 
Pfenning, que permitieron un crecimiento más rápido. 
 
5.2 Clonación del gen rRNA 16S 
 
El DNA extraído de los cultivos se utilizó para obtener las amplificaciones por PCR 
utilizando primers para el gen rRNA 16S de bacterias, (véase método). Las reacciones de 
PCR, al utilizar los primers 27F y 1492R específicos para rRNA 16S, produjeron 
amplificaciones positivas para todas las muestras. 
Las amplificaciones del gen rRNA 16S fueron utilizadas para la construcción de librerías 
de clonas. De los 40 cultivos se hicieron librerías donde se amplificaron cuatro clonas de 
cada una, dando un total de 160 secuencias que fueron enviadas a secuenciar. Únicamente se 
obtuvieron 95 secuencias. Las secuencias presentaron una extensión de más de 1200 
nucleótidos. 
Las secuencias se sometieron a un proceso de detección de quimeras para localizar 
aquellas secuencias que contienen fragmentos que provienen de dos o más organismos. Para 
la detección de quimeras se utilizaron los programas Bellerophone y DECIPHER. Los 
resultados mostraron que no se encontró ninguna quimera. 
 
5.3 Análisisde las secuencias 
 
En la base de datos del GenBank se realizaron las consultas necesarias para conocer los 
índices de identidad de las secuencias de bacterias púrpuras del azufre obtenidas de las pozas 
de Cuatrociénegas con secuencias de otras partes del mundo analizadas y registradas en 
NCBI. 
De las secuencias obtenidas, 67 de ellas presentaron una identidad dentro del rango 97% 
- 100%. Sin embargo, 46 de estas secuencias son de bacterias que en la actualidad no se han 
logrado cultivar y por lo tanto no contamos con una clasificación precisa. 
 
Tabla 3. La primera columna muestra diferentes porcentajes de identidad, mientras que la segunda 
columna proporciona información sobre cuantas secuencias se hallaron dependiendo del 
porcentaje de identidad. 
 
Grados de identidad Identidad de secuencias obtenidas 
85% - 90% 
91% - 96% 
97% - 100% 
2 
26 
67 
Total 95 
 
5.3.1 Proporciones de los taxa en las pozas del valle de Cuatrociénegas 
 
Se asignó taxonomía a las 95 clonas las cuales se analizaron por BLASTn, utilizando ambos 
sentidos de la secuencia para obtener las proporciones de los taxa aproximados que se 
muestran en las figuras 5 y 6. 
Esta información nos permite definir cuáles son los filotipos más abundantes en los 
cultivos obtenidos de los sitios muestreados. La mayor parte de la diversidad conocida está 
representada por Proteobacteria (41.1%), alfa (12.6), gamma (23.2%) y delta (5.3%). En 
menor proporción, están los phyla: Bacteroidetes (3.2%), Chlorobi (2.1%), Chloroflexi 
(1.1%), Firmicutes (7.4%) y Spirochaetes (2.1%). Existe una predominancia de las 
gammaproteobacterias (23.2%). El 43.2% de las clonas fueron halladas en el BLASTn como 
no cultivadas, por lo que no tenemos un grupo perteneciente aproximado (figura 5). 
En el sistema Churince obtuvimos representantes de los phylas: Bacteroidetes, 
Firmicutes, Alfaproteobacteria, Gammaproteobacteria y Deltaproteobacteria más aquellas 
clonas sin clasificación. 
En Pozas Rojas se encontraron 3 phylas: Alfaproteobacteria, Gammaproteobacteria y 
Deltaproteobacteria más las que no tienen clasificación. 
Por último, en el sistema de Pozas Azules se obtuvieron 2 phylas: Gammaproteobacteria 
y Bacteroidetes y también aquellas clonas sin clasificación. 
 
 
Figura 5. Proporciones de los taxa de bacterias encontrados en el valle de Cuatrociénegas. 
 
• Bacteroidetes 
• Chlorobi 
• Chloroflexi 
• Firmicutes 
• Alfaproteobacteria 
• Gammaproteobacteria 
. Oeltaproteobacteria 
• Spirochaetes 
• Sin clasificación 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Distribución taxonómica de las clonas de estudio por sistema hidrológico. 
 
5.3.2 Unidad Taxonómica operacional (OTU) 
 
Además de realizar el análisis taxonómico mediante comparación con especies reportadas, 
en NCBI, también se realizó la asignación de OTUs. Para los tres sitios, se definieron 75 
OTUs en total utilizando como punto de corte 0,03 de distancia filogenética, lo que equivale 
a un 97% de similitud entre las secuencias. Se decidió trabajar con todas las secuencias 
obtenidas debido a que la diferencia no era mucha entre las secuencias totales y los OTUs. 
Una gran parte de las secuencias del presente estudio están asociadas a especies no 
cultivadas a excepción de las siguientes, encontradas en 53 secuencias: Thiobaca sp; 
Thiococcus pfennigii, Thioflavicoccus mobilis, Haloalkaliphilic bacterium, Roseospirillum 
parvum, Rhodovulum lacipuncei, Marinobacter flavimaris, Ectothiorhodospira mobilis, 
Vibrio anguillanm, Halomonas guaonensis, Halochromatium sp; Alkaliphilus sp; 
Geosporobacter, Exiguobacterium, Desulfotignum toluenicum, Oceanimonas denitrificans. 
La diversidad de OTUs encontrados en las pozas de los sistemas Churince, Pozas Rojas 
y Pozas Azules se muestra en la figura 7. Es posible observar que la mayoría de los OTUs se 
agrupan en el sistema Pozas Rojas y la minoría en Pozas Azules. Esta diferencia puede 
deberse a que la cantidad de muestras tomadas en campo fue mucho menor en Pozas Azules. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Abundancia de OTUs por sistema hidrológico 
 
De los 75 OTUs, únicamente tuvieron identidad mayor a 97% 13 OTUs, de los cuales dos 
tuvieron el 100%, seis tuvieron el 99%, cuatro el 98% y uno el 97%. 
La mayor parte de la diversidad en términos de filotipos se encontró dentro de las 
proteobacterias. La subdivisión alfaproteobacteria fue representada por las familias 
Rhodobiaceae, Rhodospirillaceae y Rhodobacteraceae. La subdivisión gammaproteobacteria 
fue representada por Chromatiaceae, Ectothiorhodospiraceae y Alteromonadales. La 
subdivisión deltaproteobacteria fue representada por Desulfobacteraceae y Desulfarculaceae. 
Dentro de los firmicutes fueron identificados Clostridiales. Otro grupo abundante fue el 
Bacteroidetes. 
Fue posible detectar estas familias de bacterias, sin embargo, se dificulto detectar algunos 
géneros y especies. La literatura nos muestra que la mayoría de las cepas encontradas en el 
valle de Cuatrociénegas, no han sido cultivadas en ninguna otra parte del mundo. 
5.4 Filogenia 
 
Para realizar la reconstrucción filogenética, se utilizó el cluster Mr. Bayes (Huelsenbeck, el 
al. 2001) con 3,000,000 generaciones. Se incluyeron todas las secuencias obtenidas y se 
utilizaron secuencias representantes del gen rRNA 16S. La estructura de la filogenia se 
muestra congruente con las ya reportadas hasta el momento. 
En la filogenia se observa la representación de los 8 phyla.(figura 8). No se alcanza a 
distinguir ninguna asociación entre la estructura y el sitio de origen. Se esperaba que cierto 
tipo de bacterias fuera afín un sitio determinado. Sin embargo, casi todas las familias de 
bacterias están representadas en los tres sistemas hidrológicos. Las clonas, a pesar de provenir 
de diferentes pozas, se distribuyen de manera homogénea por todo el árbol. 
El phylum Proteobacteria fue el más abundante, con representantes del grupo alfa, 
gamma y delta. Las gammaproteobacterias son las que presentan la mayor cantidad de 
bacterias púrpuras del azufre, mientras que las alfaproteobacterias presentan la mayor 
cantidad de bacterias púrpuras no del azufre. Dentro de las Deltaproteobacteria se encuentran 
muchas bacterias que no han podido ser cultivadas y también algunas sulfatorreductoras. 
Los phyla Chlorobi, Chloroflexi y Spirochaetes son los menos abundantes. Después se 
encuentra al phylum Bacteroidetes que se distingue por tener la mayor cantidad de clonas 
que no se han podido cultivar. Hay una variedad amplia en el phylum Firmicutes pero sólo 
fue encontrado en el sistema de Churince y de Pozas Rojas. 
 
Figura 8. Filogenia realizada con las secuencias obtenidas por clonación del gen 16S rRNA. 
Cada phylum está representado por un color y del lado derecho se observa un código de color 
que corresponde a las diferentes variables utilizadas. 1. Sitios de colecta, 2. Ambiente, 3. 
Medio de cultivo, 4. Metabolismo (véase la leyaenda) 
.-. -.--_._. -.--.--
__ o. 
-,-.::... ._-
0-• --'I=-----
--
- .--- -__ o 
---
.-----------_. -
=--
-= 
--- ---~ -~ --
--
5.5 Curva de rarefacción 
 
Se elaboraron curvas de rarefacción del muestreo en los tres sistemas hidrológicos utilizados 
en este estudio, este análisis permite hacer comparaciones entre el número de especies de 
distintos puntos aun cuando el tamaño de las muestras no sea igual. El programa utilizado 
para su construcción fue EstimateSWin910 (RK Colwell 2013) (figura 10). Lo que este 
análisis expresa es que aún falta un esfuerzo de muestreo mayor para poder representar a la 
comunidad de bacterias púrpuras del azufre en las pozas estudiadas. 
Cuando la gráfica llega a su límite de carga comienza a acostarse indicando que el 
muestreo realizado contiene la mayoría de las especies (del grupo o grupos elegidos) que 
viven en un sitio dado. Este análisis indica que la diversidad de BPS y BPNSen el valle de 
Cuatrociénegas puede ser mayor a lo estimado en este estudio.
 
Figura 10. Curvas de rarefacción de los sistemas hidrológicos, Churince, Pozas Rojas 
y Pozas Azules. 
6. DISCUSIÓN 
 
6.1 ¿Por qué estudiar la diversidad microbiana en el valle de Cuatrociénegas? 
 
Generar datos descriptivos en el contexto de una nueva investigación, nos orienta hacia dónde 
debe seguir una investigación. El valle de Cuatrociénegas es un ambiente extremo y es 
considerado como un sistema modelo ideal para el estudio de linajes antiguos y grupos 
endémicos (Souza et al. 2006; Escalante et al, 2008). 
Sorprendentemente, muchos taxones microbianos del valle de Cuatrociénegas no se han 
descrito previamente en otros sitios del mundo y la mayoría de ellos muestran la divergencia 
de las especies conocidas a nivel rRNA 16S y con otros marcadores y funciones metabólicas 
(Souza et al. 2006; Escalante et al. 2009; Cerritos et al. 2008; Alcaraz et al. 2008). Varios 
factores ambientales son probablemente responsables del alto nivel de la diversidad 
microbiana, incluyendo la preservación geológica a largo plazo del sitio (Taylor 1966; Meyer 
1973; Minckley y Jackson 2008; Szynkiewicza et al. 2009), la fluctuación temporal 
(Escalante et al. 2008) y el resultado de adaptaciones antiguas a la oligotrofia extrema (Souza 
et al. 2008). Por otro lado, las interacciones bióticas también generan diversidad, al presentar 
una tasa de especiación acelerada promovida por la recombinación, la diversificación de 
nicho, la depredación y la competencia lo que ha generado una diversidad abundante. 
Las características particulares de las Pozas de Cuatrociénegas, como la alta oligotrofía 
en fósforo y gran concentración de azufre (Wolaver 2013), han permitido el desarrollo y 
proliferación de grupos bacterianos específicos como las bacterias púrpuras del azufre, por 
lo que conocer a las bacterias púrpuras es un punto clave para generar información necesaria 
para el desarrollo teórico de este campo. 
6.2 ¿Qué encontramos? 
 
Nuestra estrategia consistió en tomar muestras en tres sistemas hidrológicos del valle y 
en sitios donde fueran visibles las bacterias púrpuras. Los medios de cultivo se eligieron para 
lograr el crecimiento y asilamiento de BPS y BPNS. En un inicio lograr el crecimiento de 
dichas bacterias en medios de cultivos específicos presentó grandes dificultades, sin 
embargo, gracias a la intervención del Dr. Michael Madigan, experto en el crecimiento de 
bacterias púrpuras, se pudo lograr su crecimiento. De manera muy detallada nos compartió 
varias de sus experiencias y dificultades, y debido a ello, se realizaron pruebas para medir la 
cantidad de compuestos de azufre en el medio al momento de su preparación y en una semana 
posterior a la inoculación. En esta prueba se logró detectar que el tapón de goma utilizado en 
los primeros tubos de cultivo (figura 3a) estaba absorbiendo los compuestos de azufre, 
provocando que el medio no tuviera las fuentes de electrones necesarias para el crecimiento 
de las bacterias púrpuras. 
Inicialmente se buscaba obtener cultivos axénicos para poder detallar algunas de las 
especies presentes en las pozas, con el fin de caracterizarlas y entender su metabolismo y 
bioquímica. Sin embargo, debido a la complejidad de las comunidades microbianas de los 
biofilms, y el constante intercambio de materia y energía no se pudieron obtener cultivos 
axénicos. 
Existen 7 diferentes tipos de bacterioclorofila (a, b, c, cs, d, e, y g) que se distinguen por 
sus espectros de absorción únicos. Dependiendo de las especies, van a presentar diferencias 
en algunas proteínas de pigmentos y la absorción máxima de bacteroclorofila en cada 
organismo va a depender en cierto grado de la naturaleza de esas proteínas y como están 
arregladas para formar fotocomplejos en la membrana fotosintética. La bacterioclorofila a 
presente en la mayoría de las bacterias púrpuras del azufre presenta un rango de absorción de 
805,830-890 nm, mientras que la bacterioclofila b presenta un espectro de absorción de 835-
850, 1020-1040nm). Los diferentes pigmentos van a permitirle a los fotótrofos hacer un 
mejor uso de la energía disponible en el espectro electromagnético y van a permitir la 
coexistencia de diferentes fotótrofos en el mismo hábitat (Okube 2006; Brooke 2012). 
Nuestros cultivos se sometieron a 4 longitudes de onda diferentes: 470nm, 565nm, 700nm 
y 940nm, +/- 20nm. La bacterioclorofila, como se mencionó anteriormente, absorbe en un 
rango de 805-1040nm, por lo que desde un principio se creyó que sólo crecerían en la 
longitud de onda de 940nm, sin embargo con el fin de abarcar un rango más amplio y no 
sesgar la probabilidad de obtener un organismo raro, se decidió utilizar las longitudes, 
470nm, 565nm, 700nm. 
Con el fin de obtener información más detallada acerca de la diversidad taxonómica de 
las clonas, las secuencias de las librerías fueron analizadas con la herramienta Blast, en 
NCBI, utilizando la base de datos de nucleótidos no redundantes, en Ribosomal Data Project 
(RDP) y en la base de datos Greengenes. Sin embargo, sólo se utilizó la información obtenida 
en NCBI de nucleótidos no redundantes debido a que las bacterias de Cuatrociénegas son 
muy raras y la mayoría no han sido descritas, por lo que no se obtuvo suficiente información 
en las bases de datos RDP y Greengenes. 
Para estimar las relaciones filogenéticas entre las secuencias, el árbol filogenético se 
construyó utilizando el programa Mr. Bayes (Huelsenbeck et al. 2001). Una vez realizado el 
análisis de las clonas aisladas, fue posible identificar 8 phylas y de forma similar a otros 
estudios, las Proteobacterias (en este caso: Alfaproteobacterias, Gammaproteobacterias y 
Deltaproteobacterias) son el phylum con mayor representatividad. Se encontraron otros 4 
phyla (Bacteroidetes, Ignavibacteriae, Chloroflexi, Spirochaetes y Firmicutes) en menor 
proporción (Bonilla-Rosso et al. 2013, Pajares et al. 2012; Espinoza 2005). 
Las bacterias dominantes en estas pozas fueron principalmente afiliadas a bacterias 
encontradas comúnmente en ambientes petroleros, incluyendo bacterias reductoras de azufre, 
púrpuras y halófilas como Roseospirillum parvum, Thiococcus pfennigii, Desulfotignum 
toluenicum, entre otras. Estas bacterias juegan papeles importantes en el proceso de 
reducción de compuestos produciendo en ocasiones sulfuro de hidrógeno (Ommedal 2007). 
Con respecto a los OTUs, se encontraron en su mayoría representados por una sola 
secuencia, es decir OTUs únicos. Esto indica que las cepas encontradas son muy distintas 
entre sí. Más del 60% de las secuencias obtenidas no se han logrado cultivar y muchas otras 
no están reportadas en las bases de datos. Lo anterior nos puede indicar la presencia de 
bacterias únicas en Cuatrociénegas que no han sido cultivadas en ningún otro lugar del 
mundo y por lo tanto no tienen ninguna representación en las bases de datos. Los endemismos 
se han encontrado en bacterias, especialmente en sitios extremos (Whitaker et al. 2013). Por 
lo que el valle de Cuatrociénegas es un sitio ideal para hallarlos. 
Se esperaba encontrar cepas únicas de algunas pozas, sin embargo, notamos que existen 
representantes de todos los phyla encontrados tanto en el sistema Churince como en Pozas 
Rojas. Pozas Azules por su parte únicamente tuvo representantes de los phyla Bacteroidetes 
y gammaproteobacteria. 
Las funciones de las comunidades en las pozas están asociadas a su composición y 
estructura, por lo que conocerlas, permite saber quién está ahí y suponer qué funciones puede 
estar llevando a cabo. Si conocemos su abundancia, podríamos estimar qué tan importante 
sería un cambio en el ecosistema. Es por eso que nuestros resultados nos permiten especular 
acerca de las posibles funciones ecológicas, en este estudio encontramos organismos 
anaerobios, fotótrofos y quimioautótrofos, quimioheterótrofosy grupos involucrados en la 
fijación de carbono y nitrógeno. 
Las diferencias entre la presencia de grupos funcionales de bacterias en los cultivos, 
sugiere la existencia de distintas estrategias basadas tanto en heterotrofía como en autotrofía. 
Bonilla Rosso y colaboradores en 2012 propusieron que esta variación en las estrategias 
sucede como respuesta adaptativa en ambientes oligotróficos como el Valle de 
Cuatrociénegas. 
 
6.3 Distribución y estilos de vida 
 
La distribución de la diversidad filogenética (figuras 8 y 9), muestra que la abundancia y 
amplitud de la distribución es similar para todos los grupos taxonómicos, en el caso de los 
sitios Churince y Pozas Rojas. Sin embargo, es importante señalar que el tipo de clonas 
obtenidas en los resultados, además de reflejar los grupos más abundantes, puede estar 
sesgado y lo que se observa es producto del muestreo y de la técnica utilizada (gen rRNA 
16s), por lo que para nuestros estudios futuros sería recomendable utilizar distintos tipos de 
oligonucleótidos que permitan amplificar a otros grupos distintos de las proteobacterias. 
Por otro lado, el estudio realizado con el programa AdaptML (Hunt et al. 2008) diseñado 
para inferir hábitats, permitió analizar se existía algún tipo de correlación entre los sitios de 
colecta con el tipo de ambiente donde fueron colectados (agua o sedimento) y le medio de 
cultivo que se utilizó. Los resultados muestran que no hubo relación entre las características, 
lo cual puede indicar que las bacterias están respondiendo a variables ambientales en otras 
escalas que no hemos tomado en cuenta, o bien que las comunidades de bacterias en cada 
sitio son distintas. 
La mayoría de los tipos de bacterias que hemos encontrado en nuestras muestras 
pertenecen a bacterias involucradas en procesos de reducción de azufre, uno de los procesos 
metabólicos claves en sedimentos y biofilms bacterianos. Debido a las restricciones del uso 
del rRNA 16S como marcador molecular, no es posible hacer determinaciones a nivel de 
especie ni tampoco poder hacer inferencias sobre funciones metabólicas. Sin embargo, se 
realizó un análisis de los tipos de bacterias hallados en cada cultivo. No fue posible inferir de 
todos debido a que las secuencias que sirven como referencia son clonas sin identificar y 
proceden de muestras no cultivables. 
Las funciones de las comunidades estás asociadas a su composición y estructura ya que 
sus atributos dependen de la identidad y abundancia de los organismos en la comunidad, así 
como los factores y procesos que afectan su presencia y distribución en ecosistemas. En este 
sentido, al conocer la composición y estructura de una comunidad, podemos saber quién está 
ahí y suponer las funciones que está llevando a cabo. 
Como se mencionó anteriormente, las PSB y PNSB crecieron tanto en el medio con 
azufre y sin azufre. Debido a la complejidad de las comunidades microbianas de los biofilms, 
y el constante intercambio de materia y energía. Para dar algunos ejemplos en la laguna 
intermedia Churince en un cultivo se obtuvo a la bacteria Roseospirullim parvum que es una 
PNSB, Alfaprotobacteria y a Desulfotignum toluenicum que es una Deltaproteobacteria y 
anaerobia estricta. Este caso es interesante debido a que los medios de cultivo no eran 
específicos para bacterias sulfatorreductoras y sin embargo desarrollo de estos grupos fue 
posible gracias al intercambio de materia y energía que Desulfotignum toluenicum y 
Roseospirillum parvum llevaron a cabo. R. parvum utilizó el acetato del medio para asimilar 
L-alanina y L.glutamato contenido en la solución multivitamínica agregada (ver apendice 1), 
por su parte D. toluenicum pudo utilizar sulfato como aceptor terminal de electrones el cual 
se reduce a H2S. Es posible hacer especulaciones sobre las fuentes de energía, probablemente 
al terminarse el acetato del medio R. parvum comenzó a oxidar el H2S para producir sulfato, 
lo cual permitió que estas bacterias se mantuvieran en un constante recambio de energía. 
En Pozas Rojas se halló en un mismo cultivo a Rhodovulum lacipuncei y 
Halochromatium. R. lacipuncei es una alfaproteobacteria que utiliza compuestos orgánicos 
como fuente de carbono y donador de electrones. Halochromatium es una 
gammaproteobacteria púrpura del azufre que utiliza sulfuro y azufre elemental como donador 
de electrones y su producto final es el sulfato que será utilizado posteriormente por R. 
lacipuncei. 
En el caso de Pozas Azules, los cuatro cultivos obtenidos presentaron clonas no 
cultivadas, por lo que resulta difícil realizar alguna inferencia. 
Las comunidades en el valle de Cuatrociénegas son muy interesantes y presentan 
metabolismos sumamente complejos y diversos, por lo que vale la pena buscar alternativas 
que permitan interpretar los datos de forma más precisa. 
 
7. CONCLUSIÓN 
 
El valle de Cuatrociénegas ofrece una gran oportunidad para el estudio de los sistemas 
acuáticos en desiertos. Se encuentra en una zona en extremo árida. Sin embargo, la 
persistencia de los cuerpos de agua hace que la cuenca presente un amplio espectro de 
hábitats. La riqueza, la variedad y el alto endemismo incrementan la importancia del sitio. 
Cada “poza” o cada sistema de “pozas” contienen características físicas y elementos 
bióticos que representan los remanentes del pasado. La extinción de los cuerpos de agua 
puede terminar con un gran número de organismos o bien reducir la cantidad de hábitat 
disponible para el uso de una especie. 
De los estudios de la biota de Cuatrociénegas ha emergido un patrón que implica 
antigüedad y continuidad en el tiempo de los hábitats acuáticos (Minckley, 1969). Las 
relaciones filogenéticas de algunas de las especies de cada taxón estudiado son altamente 
diferenciadas de sus parientes en otras partes y datan de antigüedad extrema 
(Exiguobacterium; DW Taylor, 1996). 
Los documentos existentes sobre la cuenca y su biota, incluyendo éste, son en su mayoría 
descriptivos; sin embargo, gracias a la información obtenida en estos estudios será posible 
poner en marcha investigaciones más complejas como la ecología de las comunidades. Esta 
tesis forma parte del inventario de biodiversidad total de Churince. 
 
8. PERSPECTIVAS 
 
Sin duda hay mucho por explorar sobre la diversidad de las bacterias de Cuatrociénegas. Este 
trabajo utilizó el gen rRNA 16S y nos ha arrojado información acerca de quiénes están 
conformando estas comunidades de bacterias púrpuras fotótrofas. Sería muy interesante 
utilizar un gen más específico para estas bacterias como lo son los genes pufM y pufL. Estos 
genes se encargan del proceso de fotosíntesis en las bacterias, siendo muy informativo acerca 
del rol ecológico. Por otro lado, para conocer la ancestría de las bacterias púrpuras se necesita 
de la secuenciación de todo el genoma, si se hiciera esto en un futuro podríamos estar 
hablando sobre divergencia y evolución. 
 
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 X APÉNDICES 
 
APÉNDICE 1 
MEDIOS DE CULTIVO 
 
MEDIO MARINE SULFUR-PHOTOTROPHS 
1x SW-Base……………………………………………………….3.6 L 
Solución 0.5 M NH4Cl……………………………………………40mL 
Solución 150 mM K fosfato………………………………………40mL 
Buffer 1 M MOPS, pH 7.2………………………………………...20mL 
NTA-Oligoelementos…………………………..…………………...4mL 
Solución multivitamínica…………………………………………..40mL 
Bicarbonato 1 M………………………………………….……….280mL 
Tiosulfato de sodio 1 M……………………………………………40mL 
Sulfuro 1 M………………………………….………………………4mL 
*Utilizar autoclave para esterilizar 
Enfriar bajo una corriente del gas CO2 
Después de haberse enfriado, y dentro de la cámara anaeróbica, añadir: 
DCMU…………………………………………………...…………50mg 
Los frascos utilizados deben estar completamente estériles 
Deben ser inoculados con ~1 ml de muestra de agua o 200 mg de muestra de sedimento.