Estudio-de-la-prostaglandina-reductasa-1-como-posible-biomarcador-de-carcinoma-hepatocelular-en-modelos-experimentales

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UNIVERSIDAD NACIONAL 
AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
ESTUDIO DE LA PROSTAGLANDINA REDUCTASA 1 COMO POSIBLE 
BIOMARCADOR DE CARCINOMA HEPATOCELULAR EN MODELOS 
EXPERIMENTALES. 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO 
 
PRESENTA: 
Ricardo Sánchez Rodríguez 
 
 
 
 MÉXICO, D.F. 2011 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
PRESIDENTE: Profesor: JESUS FERNANDO MONTIEL AGUIRRE. 
VOCAL: Profesor: LUZ DEL CARMEN CASTELLANOS ROMAN. 
SECRETARIO: Profesor: JULIO ISAEL PEREZ CARREON. 
1er. SUPLENTE: Profesor: MARTHA PATRICIA COELLO COUTIÑO 
2° SUPLENTE: Profesor: MARIA ELENA BRAVO GOMEZ 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
INSTITUTO NACIONAL DE MEDICINA GENÓMICA 
 
 
ASESOR DEL TEMA: 
 
 
 
_______________________________ 
DR. JULIO ISAEL PÉREZ CARREÓN 
(Nombre y firma) 
 
 
 
SUSTENTANTE: 
 
 
 
 
_______________________________ 
RICARDO SÁNCHEZ RODRÍGUEZ 
(Nombre y firma) 
 
 
 
- 3 - 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Esta tesis se realizó en el Instituto Nacional de Medicina Genómica en el laboratorio 
del Dr. Jorge Melendez Zajgla bajo la dirección del Dr. Julio Isael Pérez Carreón. 
Contó con el apoyo del Dr. Saúl Villa Treviño y la M. en C. Julia Esperanza Torres 
Mena en la experimentación en animales de laboratorio, así como de la Bióloga 
Valeria Quintanar Jurado, M. en C. Nelly Patiño, Q.B.P. Karol Carrillo, Dra. Nora 
Gutiérrez Nájera en histología, Western Blot, qRT-PCR y actividad enzimática 
respectivamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedicatoria. 
- 4 - 
 
A mi madre Odelva Rodríguez Ortíz, por darme el regalo más grande que es la vida y 
darme los elementos necesarios para ser quien soy ahora, pero sobretodo ser mi 
inspiración para lograr todas mis metas. 
 
A mi hermana Leticia Sánchez Rodríguez, por vigilar de mi educación desde mi 
infancia, por todo su cariño y cuidados pero sobretodo por ser mi ejemplo de lucha, 
amor y fortaleza. 
 
A mi cuñado Luis Alberto Flores y mi sobrino Luis Ángel Flores, por su compañía y 
apoyo a lo largo de mi carrera. 
 
A mi abuelita Hermelinda Ortíz, por estar siempre al pendiente de mí, por todo su 
amor y compresión. 
 
A mi familia por su entusiasmo, afecto y motivación para que alcanzara esta meta. 
 
A esa persona que estuvo hasta en los momentos más difíciles, Lluvia Alarcón 
gracias por cada uno de los momentos que he podido pasar a tu lado y por 
enseñarme a ser mejor persona cada día. 
 
Al Dr. Julio por darme esta gran oportunidad de desarrollarme, por sus enseñanzas 
no solo en el ámbito profesional si no como persona, que me permitieron llevar a 
término este trabajo. 
 
 
 
 
 
 
 
Agradecimientos. 
- 5 - 
 
 
A la Dra. Perla Carolina Castañeda por todo el apoyo y orientación que me ofreció a 
lo largo de la carrera. 
 
A ese gran equipo de trabajo Dra. Valeria Quintanar, cDra. Julia Torres y M. en C. 
Violeta Zuñiga por su ejemplo y ayuda para que pudiera desarrollar este proyecto, 
así como hacer amena la convivencia y amistad en el laboratorio. 
 
 A mis amigas Marlene Hernández y Thalía García Rodríguez por estar en las 
alegrías y tristezas sin pedir nada a cambio. 
 
A mis maestros de la facultad por brindarme sus enseñanzas, actitudes y 
conocimientos para formarme como profesional. 
 
A mis amigos y compañeros de la facultad por su ayuda, apoyo y muestras de cariño 
a lo largo de estos 4 años y medio, gracias por todos esos grandes momentos que 
pase a su lado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Índice. 
- 6 - 
 
1.- Introducción………………………………………………………………….………...11 
2.- Marco teórico……………………………………………………………………….…...13 
2.1 Cáncer………………………………………………………………………..….13 
2.2 Anatomía del hígado………………………………………………………...…16 
2.3 Carcinogénesis hepática…………………….………………………………...18 
2.4 Epidemiología del carcinoma hepatocelular…………………………………20 
2.5 Fibrosis-Cirrosis en el desarrollo del cáncer hepático……………………...23 
2.6 Modelos de hepatocarcinogénesis…………………………………………...25 
2.7 Mecanismo de acción de los carcinógenos; DEN y 2-AAF………………..27 
2.8 Principales biomarcadores conocidos de hepatocarcinogénesis…………30 
2.9 Estrés oxidante y su impacto en la carcinogénesis………………..............32 
2.10 Prostaglandina reductasa 1………………………………………………….34 
2.10.1 Antecedente directo………………………………………………...36 
3.- Objetivos………………………………………….……………………………………...37 
4.- Hipótesis………………………………………………………………………………….37 
5.- Metodología……………………………………………………………………………...38 
5.1 Modelos animales de hepatocarcinogénesis química……………………...38 
5.1.1 Regímenes de administración……………………………………....38 
5.1.2 Sacrificio de animales………………………………………………..38 
5.1.3 Procesamiento de tejido congelado………………………………..39 
5.2 Ensayos histológicos………………………………………………………..39 
5.2.1 Determinación de actividad γ-Glutamiltranspeptidasa……………39 
 5.2.2 Inmunofluorescencia Ki67/Laminina-DAPI………………………...40 
5.3 Estudios del nivel de expresión genética……………………..….………….41 
5.3.1 Extracción de RNA……………………………………………………41 
5.3.2 Confirmación de integridad del RNA……………………………….42 
5.3.3 Formación de banco de cDNA………………………………………43 
5.3.4 PCR tiempo real………………………………………………………43 
 5.4 Estudios a nivel de proteínas………………………………………………….44 
5.4.1 Extracción de proteína…………………………………………….....44 
5.4.2 Cuantificación de proteína…………………………………………...45 
- 7 - 
 
5.4.3 Actividad de Ptgr1…………………………………………………….45 
 5.5 Inmunodetección de Ptgr1, Gstp1 y Actina mediante Western Blot……...46 
5.5.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida al 8%...............................46 
5.5.2 Transferencia a membrana PVDF………………………………….47 
5.5.3 Inmunodetección en membrana para GSTp.………..…………….47 
5.5.4 Inmunodetección en membrana para PTGR1…………………….48 
5.6 Análisis estadístico……………………………………………………………..49 
6.- Resultados…………………………………………………………………………….…50 
 6.1 Desarrollo de fibrosis en el modelo experimental de cáncer………………50 
6.2 Determinación de las lesiones neoplásicas con marcadores de 
hepatocarcinogénesis………………………………………………………………………54
 6.3 Índice de proliferación celular (KI67)………………...………………………58 
6.4 Expresión genética de genes relacionados a la carcinogénesis…………..60 
 6.5 Expresión de Ptgr1 como nuevo biomarcador………………………………65 
 6.6 Correlación de la expresión de Ptgr1 con biomarcadores de la 
carcinogénesis, la fibrosis y la angiogénesis…………………………..……………....67 
7.- Discusión…………………………………………………………………………………71 
8.- Conclusiones……………………………………………………………………….……79 
9.- Bibliografía……………………………………………………………………………….80 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Abreviaturas: 
- 8 - 
 
2-AAF: 2-Acetilaminofluoreno 
4-HNA: 4-Hidroxinonanal 
4-HNE: 4-Hidroxinonenal 
8-oxodG: 8-Oxodeoxigunosina 
AFB1: Aflatoxina B1 
AKR1B10: Aldosa reductasa 
ALDH1A1: Aldehído deshidrogenasa 1A1 
ARE: Elementos de respuesta antioxidante 
ATP: Adenosín trifosfato 
CDK: Cinasas dependientes de ciclinas. 
cDNA: DNA complementario 
CES: Células Endoteliales del Sinusoide 
CHC: Carcinoma hepatocelular 
ChIP: Inmunoprecipitación de cromatina 
Col1α1: Colágeno 1α1 
CYP450: Citocromo P450 
DAPI: 4,6-diamidino-2-fenilindolDEN: Dietilnitrosamina 
DNA: Ácido desoxirribonucleico 
DTT: Ditiotreitol 
E2F: Factor de transcripción E2F 
GADPH: Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa 
GGT: Gamma-glutamiltranspeptidasa 
GMNA: Gamma-glutamil-4-metoxi-2-naftilamina 
GPE-1: GSTP enhancer 1 
GSH: Glutatión reducido 
- 9 - 
 
GSTA4-4: Glutatión-S-transferasa A4-4 
Gstp: Glutatión-S-transferasa pi 
GS-X: Glutatión conjugado 
HIF: Factor Inducible por hipoxia 
HO-1: Hemooxigenasa 1 
HRP: Enzima Peroxidasa de Rábano 
IL-1b: Interleucina 1b 
JNK: Jun-N-terminal cinasa 
Keap1: Proteína represora asociada a ECH tipo Kelch 1 
Ki67: Proteína nuclear Ki67 
LTB4: Leucotrieno B4 
LTB4DH: Leucotrieno B4 deshidrogenasa 
MDR: Deshidrogenasas/reductasas de cadena media 
MEC: Componentes de Matriz extracelular 
mRNA: RNA mensajero 
NADH: Nicotinamida Adenina Dinucleótido 
NADPH: Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato 
Nfkb: Factor Nuclear kappa b 
NK: Células Natural Killer 
Nrf2: Factor 2 relacionado a factor nuclear eritroide-2 
NT: No tratado 
OMS: Organización Mundial de la Salud 
PBS: Regulador fosfato salino 
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa 
pRb: Proteína retinoblastoma 
Ptgr1: Prostaglandina reductasa 1 
- 10 - 
 
Ptgs2: Prostaglandina endoperoxidasa sintasa 2 
PUFA: ácidos grasos n-6 poliinsaturados 
PVDF: Polifluoruro de vinilideno 
RelA: Oncogén viral A homólogo del reticuloendoteliosis del v-rel 
RIPA: Regulador de ensayos de radio inmunoprecipitación 
RNA: Ácido ribonucleico 
ROS: Especies reactivas de oxígeno 
rRNA: RNA ribosomal 
SAM: S-adenosilmetionina 
SD: Desviación estándar 
SDS: Dodecilsulfato de sodio 
SIDA: Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida 
SINAIS: Sistema Nacional de Información en Salud 
Sp1: Factor de transcripción Sp1 
TAE: Tris, Acetato, EDTA 
TBS: Regulador Tris salino 
TEMED: N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina 
TGF-β: Factor de crecimiento transformante tipo beta 
Vegf: Factor de Crecimiento Endotelial Vascular 
 
 
 
 
 
 
 
1.- Introducción. 
- 11 - 
 
 La hepatocarcinogénesis es un proceso complejo que involucra más de un tipo 
de células hepáticas para dar origen a los tumores, implica la interacción celular con 
los componentes de la matriz extracelular que de forma conjunta contribuyen al 
desarrollo de las neoplasias. El carcinoma hepatocelular (CHC) generalmente se 
desarrolla como consecuencia de otras enfermedades crónicas como son, la fibrosis 
y la hepatitis crónica por virus de hepatitis tipo B y C, además de que el 85% de los 
casos de cáncer hepático se encuentran asociados al desarrollo de cirrosis. En el ser 
humano el tiempo de desarrollo del CHC desde el inicio de una enfermedad hepática 
crónica hasta el desarrollo de la neoplasia varía de 5 hasta 30 años. 
 Los modelos experimentales de hepatocarcinogénesis química en ratas son 
una herramienta útil para la investigación de esta patología. El presente proyecto 
estudia el material biológico de dos modelos experimentales obtenido a diferentes 
tiempos de progresión, para investigar la expresión de los genes a nivel de RNA y/o 
proteína referentes a la inflamación, fibrogénesis y la carcinogénesis, con la finalidad 
de comprender a nivel molecular la etapa de progresión, comparar con resultados de 
la literatura y entender su participación en el desarrollo del CHC, así como 
caracterizar los modelos comparándolos entre ellos. 
 La investigación desarrollada ofrece perspectiva de investigación sobre la 
participación de algunos de los genes estudiados en el proceso de 
hepatocarcinogénesis, la investigación en un nuevo modelo de hepatocarcinogénesis 
ofrece oportunidades de estudio para entender el papel de las células progenitoras 
hepáticas en el desarrollo del cáncer; el análisis de lo referente a la enzima 
Prostaglandina reductasa 1 (Ptgr1) como posible biomarcador podría ayudarnos a 
entender la transición de células preneoplasicas a células neoplásicas. El elevado 
nivel de expresión de la Ptgr1, motiva a la investigación de esta enzima en muestras 
clínicas de pacientes con CHC donde con una validación pertinente, se podría contar 
con un biomarcador para el diagnóstico del CHC y abrir nuevas opciones para el 
tratamiento de esta patología. 
 Los resultados revelan que además de la participación de los oncogenes 
clásicos de la carcinogénesis, las enzimas de destoxificación tales como la Glutatio-
S-transferasa pi (GSTp) y la gamma-glutamiltranspeptidasa (GGT) juegan un papel 
- 12 - 
 
trascendental en el desarrollo del CHC, residiendo en ellas principalmente las 
características de evasión de la apoptosis, resistencia al estrés oxidante y resistencia 
a los fármacos antineoplásicos. Estas características son frecuentes en el CHC y 
contribuyen a la alta tasa de mortalidad de esta enfermedad. Lo que resulta en la 
necesidad de investigar un biomarcador temprano para esta patología. Asimismo 
esta tesis destaca la importancia de la participación de diferentes componentes de la 
matriz extracelular y de células no parenquimales, en el desarrollo de la fibrogénesis 
y la carcinogénesis. 
 La continuidad de este proyecto contribuirá de forma importante para la 
comprensión de la carcinogénesis hepática y sienta las bases para cuestionar ¿Por 
qué es importante la expresión de la Ptgr1? ¿Qué ventajas podría ofrecer a las 
células tumorales? y ¿Cuál es la participación de las células progenitoras hepáticas 
en el desarrollo del cáncer hepático en el modelo experimental estudiado? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2.- Marco Teórico. 
- 13 - 
 
 2.1.- Cáncer. 
La palabra cáncer deriva del griego karkinos (cangrejo), término acuñado por 
Galeno s. II d.C. esto debido al parecido que hallaba entre las arterias que rodeaban 
a los crecimientos anormales y las patas de este tipo de crustáceo, sin embargo 
Hipócrates 400 a.C fue el primero en realizar una división entre cáncer y adenoma 
basado en el desarrollo del crecimiento celular del órgano como maligno y benigno 
respectivamente (Garrison, 1926) 
Actualmente cáncer es una palabra genérica que no hace alusión exclusiva a una 
enfermedad, sino a un conjunto de enfermedades que puede surgir prácticamente en 
cualquier órgano y a cualquier edad (Torpy et al., 2010) La Organización Mundial de 
la Salud (OMS) ha definido al cáncer como un término genérico para más de 100 
enfermedades con la característica de generación rápida de células anormales más 
allá de sus límites y que pueden invadir otros tejidos (WHO, 2009). Esta definición no 
contiene todas las características distintivas del cáncer, ni resalta la importancia que 
tiene el microambiente que engloba a una célula tumoral, por lo que (Hanahan and 
Weinberg, 2000) han propuesto seis alteraciones en la fisiología celular que 
caracterizan a las neoplasias, sin importar el tipo de cáncer, y que en conjunto 
conllevan a los crecimientos malignos, las cuales son: 
1. Autosuficiencia en señales de crecimiento celular.- Las células normales 
requieren señales para entrar de una fase quiescente a un estado activo de 
proliferación, dichas señales pueden ser factores solubles, que se unen a sus 
receptores, componentes de matriz extracelular o mediante interacción 
molecular célula-célula. Esta característica es diferente en las células 
tumorales al presentar una reducción a la dependencia de estimulación 
exógena para su crecimiento. Muchos tipos de cánceres se caracterizan por 
adquirir la capacidad de sintetizar sus propios factores de crecimiento, siendo 
el más descrito el factor de crecimiento tumoral alfa (TGF-α) 
2. Insensibilidad a señales anti-crecimiento.- En un tejido normal en homeostasis 
existen diferentes tipos de señales antiproliferativas, que mantienen a las 
células en estado quiescente y que se asocian de forma directa al control del 
- 14 - 
 
ciclo celular, un ejemplo frecuente es la vía TGF-β, las células tumorales 
evadenestas señales antiproliferativas. 
3. Evasión de la apoptosis.- La capacidad de las células tumorales para 
expandirse no está dictaminado únicamente por su proliferación celular, 
también por la tasa de muerte celular, la resistencia a la muerte celular 
programada es una característica que se preserva en la mayoría de los tipos 
de cáncer. 
4. Potencial de replicación celular ilimitado.- Las células normales tienen un 
número limitado de divisiones, que una vez agotado entran en un estado 
denominado senescente, asociado al acortamiento del telómero. El número de 
divisiones se puede ver incrementado al disminuir la expresión de proteínas 
que bloquean la proliferación celular como pRb y p53, hasta entrar a una 
segunda fase o estado de crisis; muerte celular masiva. Las células 
resistentes con mutaciones y fusión de cromosomas, pueden generar 
variantes capaces de proliferar indefinidamente, cuya característica principal 
es la sobreexpresión de la enzima telomerasa, que se encarga de restaurar al 
telómero (Hanahan and Weinberg, 2000) y evitar los procesos de senescencia 
celular. 
5. Capacidad sostenida de angiogénesis.- Tanto los nutrientes como el oxígeno 
requerido para la función y sobrevivencia celular, son abastecidos mediante 
los vasos sanguíneos. Las células tumorales en etapas tempranas, tienen la 
capacidad de generar energía en forma de ATP únicamente mediante 
glucólisis, sin depender de la fosforilación oxidativa, así ocurre una elevada 
producción de lactato y la disminución del pH (Levine and Puzio-Kuter, 2010). 
En las células tumorales como respuesta a estados de hipoxia por el 
crecimiento tumoral, se da una activación para la generación de nuevos vasos 
sanguíneos, mediante cambios en el balance de inhibidores y activadores de 
angiogénesis a nivel transcripcional, en respuesta a la falta de nutrientes 
dentro de las células tumorales, siendo el Vegf el más potente angiogénico 
presente en diferentes tipo de tumores (Zhao et al., 2007). 
- 15 - 
 
6. Invasión de tejido y metástasis.- Esta condición se va a presentar en los 
diferentes tipos de cáncer como consecuencia de la progresión tumoral, y es 
la responsable del 90% de las muertes por neoplasias. Para que se lleve a 
cabo se requieren modificaciones a nivel bioquímico y genético, que 
involucran cambios en la interacción de las células con su microambiente, las 
células tumorales suelen activar proteasas extracelulares. Esta capacidad 
genera que se formen colonias de células malignas de forma adyacente en un 
tejido, incluso realizar metástasis, el colonizar otros órganos. Donde las 
células malignas viajan por fluidos como sangre y linfa (Hanahan and 
Weinberg, 2000) . 
Estas seis características presentes en mayor o menor proporción en los tumores 
reflejan una percepción holística del cáncer, lo cual quiere decir que esta patología 
no solo involucra las células neoplásicas, sino también las interacciones con otro tipo 
de células y componentes de la matriz extracelular, generando un microambiente 
celular donde diversos factores fisiológicos y tisulares intervienen en el desarrollo de 
los tumores. 
Los tipos de cáncer se han clasificado en cinco categorías principales de acuerdo 
al lugar de desarrollo del tumor; el término carcinoma se usa para los tumores 
malignos que se desarrollan en los tejidos epiteliales que recubren a los órganos y 
representan el 80% de todos los tipos de cáncer, los sarcomas son las neoplasias 
desarrolladas en el tejido mesenquimatoso, los linfomas son los tumores que afectan 
al sistema linfático, las leucemias a los cánceres asociados a la sangre y cáncer 
neuroendócrino a los que afectan al sistema nervioso y endócrino (Cancer-center, 
2010). 
El cáncer en las últimas décadas se ha convertido en un grave problema de salud 
pública a nivel mundial, situándose con 7-8 millones de muertes superando a las 
muertes causadas por el SIDA, malaria y tuberculosis de forma conjunta (Fig. 1), 
presentándose el 70% de los casos en países de bajos ingresos (Love, 2010). 
 
 
 
- 16 - 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El 80% de los cánceres están asociados etiológicamente al medio ambiente y 
a factores de riesgo que en conjunto conllevan al desarrollo de neoplasias, algunos 
ejemplos importantes son: el hábitos como el fumar, agentes tóxicos ocupacionales, 
fármacos, alimentos e infecciones crónicas por algún patógeno, entre otros, por lo 
que son prevenibles adoptando estilos de vida saludables (Cancer-center, 2010). 
 
2.2.- Anatomía del hígado. 
El hígado es el segundo órgano de mayor tamaño en el ser humano después 
de la piel, con un peso que oscila entre 1.2-1.8 Kg, el cual se encuentra ubicado en el 
cuadrante superior derecho del abdomen (Luna, 2005), tiene forma semiovoidea y 
recibe irrigación sanguínea por la arteria hepática (oxigenada) y la vena porta (rica en 
nutrientes); el 75% de la sangre proviene de la vena porta. 
El hígado tiene la capacidad de realizar múltiples funciones vitales para el 
organismo como lo son el metabolismo de carbohidratos y aminoácidos, formación 
de urea y sales biliares, síntesis de colesterol, ácidos grasos y cuerpos cetónicos, 
síntesis e inactivación de hormonas, síntesis y degradación de componentes de 
matriz extracelular, reserva de sangre y regulación del pH sanguíneo, presentación 
- 17 - 
 
de antígeno a linfocitos y síntesis de proteínas de fase aguda, función 
hematopoyética en etapas fetales y metabolismo de xenobióticos (Kmiec, 2001). 
El hígado está compuesto por diferentes tipos celulares donde el 80% del 
parénquima está compuesto por los hepatocitos (Luna, 2005), células de 25 a 30 μm 
de diámetro mono y binucleadas, los hepatocitos son los responsables de las 
funciones principales realizadas por el hígado. 
En el hígado existen otros tipos de células no parenquimales como son: 
1) Las células endoteliales del sinusoide (CES) que se diferencian de otras 
células endoteliales, al no poseer membrana basal regular y formar una barrera de 
filtración a través de fenestras para el paso de macromoléculas, y células desde el 
lumen sinusoidal al espacio de Disse donde están los hepatocitos. 
2) Las células de Kupffer, son macrófagos residentes del tejido hepático y son 
los responsables de la protección inmunológica de este órgano y de la liberación de 
citocinas y factores de crecimiento como Interlecucina-1 (Il-1) y TGF-β (Kolios et al., 
2006). 
3) Las células estelares que en estado de salud, se denominan quiescentes, 
están asociadas a la absorción de acido retinoico, pero al activarse por diferentes 
patologías liberan el acido retinoico, cambian su morfología e inician la síntesis de 
componentes de matriz extracelular (Kmiec, 2001). 
4) Las células denominadas ovales o progenitoras hepáticas son capaces de 
diferenciarse a hepatocitos o colangiocitos (células del epitelio biliar), bajo señales de 
matriz extracelular como son Laminina o Fibronectina (Lorenzini et al., 2010). 
5) Las células Pit son linfocitos granulares de gran tamaño ubicadas en el 
sinusoide hepático que funcionalmente desempeñan un papel a las células Natural 
Killer (NK) del sistema inmune, por lo que también se les considera células NK 
residentes de tejido hepático (Kmiec, 2001). 
En el hígado la unidad estructural son los lobulillos hepáticos, los cuales 
consisten en hileras de hepatocitos que se disponen de forma radiada a una vena 
central (vena hepática), dando una perspectiva hexagonal donde en los vértices se 
localizan los tractos portales compuestos por la arteria hepática, vena porta y 
conductos biliares (Kmiec, 2001) (Fig. 2). 
- 18 - 
 
La más pequeña unidad de microcirculación hepática es denominada el acino, 
la cual se constituye de una masa de hepatocitos de forma elipsoidal, que se alinean 
alrededor de las vénulas y arteriolas hepáticas (Fig. 2). Los acinos son divididos en 
treszonas diferentes dependiendo el suministro de sangre arterial, la zona 1 
corresponde a la cercana a la arteria hepática y es rica en sangre oxigenada y son 
las primeras en entrar en contacto con toxinas por lo que las células de esta zona 
son propensas a daños, la zona 2 o zona de transición la concentración de oxígeno 
en la sangre está disminuida mientras que la zona 3 cercana a la vena central es 
pobre en oxígeno (Bowen, 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2.3.- Carcinogénesis hepática. 
El cáncer primario de hígado puede referirse al carcinoma hepatocelular 
(CHC), al colangiocarcinoma y al angiosarcoma hepático, donde el CHC es el más 
frecuente, del 85 al 90% de estos tipos de cáncer (Huang and He, 2010). 
El desarrollo y progresión del CHC es caracterizado por ser un proceso de múltiples 
etapas, la transformación inicial del tejido hepático bajo estímulos externos o también 
denominados factores de riesgo, donde los principales son; infecciones crónicas por 
virus de hepatitis tipos B o C, la ingesta de Aflatoxinas y el consumo crónico de 
alcohol (Parkin et al., 2005). La progresión conlleva a una serie de estados de 
hiperplasia y displasia hasta finalmente adquirir un fenotipo maligno con capacidad 
Fig. 2 Representación de las unidades estructurales (lobulillos) y 
unidad funcional (ascino) del hígado. 
1 2 3 
- 19 - 
 
de generar invasión de tejido y metástasis, proceso que en el humano pude llevar de 
5 a 30 años (El-Serag et al., 2008). 
El CHC al ser una enfermedad multifactorial, cada uno de los factores de 
riesgo produce carcinogénesis por un mecanismo diferente; la infección crónica por 
virus de hepatitis B se asocia a la generación de especies reactivas de oxígeno 
(ROS) y se investiga si la inserción de su material genético al DNA de los hepatocitos 
provocan alteración en las células; la infección por hepatitis C está asociada a la 
evasión de la respuesta inmune por parte del virus, mediante la formación de 
partículas defectuosas generando una exacerbación en la muerte celular hepática 
por el sistema inmunológico (Tsai and Chung, 2010). Para el caso de la Aflatoxina B1 
al ser metabolizada por el hígado forma un intermediario, AFB1 exo-8,9-epóxido, que 
es altamente reactivo y puede unirse al DNA formando aductos. El alcohol 
principalmente tiene un efecto sinergista con la hepatitis por infecciones virales, sin 
embargo, el acetaldehído formado durante su metabolismo es potencialmente 
carcinógeno (Wu et al., 2006). 
En animales de laboratorio como la rata, la progresión del cáncer hepático 
inducido mediante agentes químicos, involucra la desregulación de diferentes genes 
los cuales pueden ser sobreexpresados como son la gamma-glutamiltranspeptidasa, 
la glutatión-s-transferasa pi o la epóxido hidrolasa, o subexpresados como p53 o 
pRb. Al igual que en otros tipos de cáncer, el de hígado se caracteriza por requerir 
señales de crecimiento, evasión de las señales de anti-proliferación, evasión de la 
apoptosis, potencial de replicación ilimitado por actividad telomerasa, capacidad para 
generar vasos sanguíneos inducido por el VEGF y capacidad de producir metástasis. 
(Ogawa, 2009). 
A pesar de los avances en el diagnóstico y tratamiento del cáncer, para el 
CHC el pronóstico es desfavorable, con una esperanza de vida menor del 5% (Parkin 
et al., 2005), debido a la falta de un diagnóstico temprano y el impedimento de usar 
quimioterapéuticos. En la actualidad existe un algoritmo empleado para la decisión 
del tratamiento del CHC; para un nódulo menor a 2 cm in situ, puede ser tratado con 
una resección quirúrgica, de 1 a 3 nódulos menores a 3 cm se puede manejar con un 
tratamiento de inyecciones percutáneas de etanol o mediante ablación por 
- 20 - 
 
radiofrecuencia, para ambos casos el tratamiento es potencialmente curativo. Para el 
caso de estados intermedio o avanzado de CHC únicamente se cuenta con la 
quimioembolización y tratamiento con Sorafenib (fármaco inhibidor de ciertas 
cinasas), los cuales únicamente son considerados paliativos (El-Serag et al., 2008). 
Debido a la capacidad del hígado para metabolizar xenobióticos, aunado a la 
sobreexpresión de ciertos genes por la alteración de la homeostasis celular como lo 
son los relacionados al metabolismo del glutatión, y control óxido-reducción por parte 
de las células tumorales (Perez-Carreon et al., 2006) se imposibilita el uso de 
agentes quimioterapéuticos. 
 
2.4.- Epidemiología del Carcinoma Hepatocelular. 
El CHC es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad, siendo la 
séptima causa más frecuente de cáncer, y la tercera causa de muertes por cáncer a 
nivel mundial, tan solo en el 2008 se presentaron 748,000 nuevos casos de cáncer 
hepático y aproximadamente 696,000 murieron (Yang and Roberts, 2010), lo que 
denota la limitación en las opciones de tratamiento. 
La mayoría de los casos se presentan en países subdesarrollados como son los 
ubicados en África subsahariana, el este y sureste de Asia; en contraste la incidencia 
es menor en América, Europa y Australia (Fig. 3). Las variaciones en las incidencias 
reflejan claramente la variación de los factores de riesgo para el CHC (El-Serag and 
Rudolph, 2007). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 3.- Variaciones regionales en los rangos de mortalidad de HCC. Los rangos son 
reportados por 100,000 habitantes. Fuente: (El-Serag and Rudolph, 2007) 
- 21 - 
 
En México según el SINAIS en el 2008 las enfermedades crónicas del hígado 
ocuparon la cuarta causa de muerte a nivel nacional, no obstante los tumores 
malignos de hígado ocupan el lugar 17 en defunciones en lo general (Tabla 1), 
ocupan la cuarta posición en mortalidad por tumores malignos, solo precedido por el 
cáncer de vías respiratorias, estómago y próstata. 
Principales causas de mortalidad general, 2008. 
Nacional 
Orden Clave CIE 10a. Rev. Descripción Defunciones Tasa 
1
/ % 
 
 
 
 
A00-Y98 
Total 538 288 504.6 
100
.0 
 
1 
E10-E14 Diabetes mellitus 
75 572 
70.8 
14.
0 
2 
I20-I25 Enfermedades isquémicas del corazón 
59 579 
55.8 
11.
1 
3 
I60-I69 Enfermedad cerebrovascular 
30 212 
28.3 5.6 
4 
K70, K72.1, K73, 
K74, K76 
Cirrosis y otras enfermedades 
crónicas del hígado 28 422 
26.6 5.3 
5 
J40-J44, J67 Enfermedad pulmonar obstructiva crónica 
20 565 
19.3 3.8 
13 
C33-C34 Tumor maligno de tráquea, bronquios y pulmón 
6 697 
6.3 1.2 
14 
C16 Tumor maligno del estómago 
5 509 
5.2 1.0 
15 
B20-B24 VIH/SIDA 
5 183 
4.9 1.0 
16 
C61 Tumor maligno de la próstata 
5 148 
4.8 1.0 
17 C22 Tumor maligno del hígado 5 037 4.7 0.9 
18 C50 
Tumor maligno de la mama 
4 840 
4.5 0.9 
19 
X60-X84, Y87.0 
Lesiones autoinfligidas intencionalmente 
(suicidios) 
4 668 
4.4 0.9 
20 
C53 Tumor maligno del cuello del útero 
4 031 
3.8 0.7 
 
R00-R99 Causas mal definidas 
10 514 
9.9 2.0 
 
 Las demás 
175 070 
164.1 
32.
5 
1/ Tasa por 100,000 habitantes 
Los totales no incluyen defunciones de residentes en el extranjero 
Las principales causas de mortalidad están basadas en 
la lista GBD de 165 
 
Fuente: Secretaría de Salud/Dirección General de Información en Salud. Elaborado a partir de la base de datos de defunciones 1979-2008 
INEGI/SS 
 
El cáncer de hígado es la tercera causa de muerte por neoplasias en mujeres 
mexicanas, únicamente precedido por el cáncer cérvico uterino y cáncer de mama. 
(Fig. 4), mientras que en los hombres el CHC ocupa la sexta causa de muerte por 
cáncer, precedido por cáncer en las vías respiratorias, el cáncer de próstata, cáncer 
de estómago, cáncer de colon y leucemias. 
 
 
- 22 - 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Aunque en México las muertes en hombres por cáncer de hígado son 
menores que en las mujeres, a nivel mundial este tipo cáncer se presenta en mayor 
proporción en hombres que en mujeres (Fig. 5), además de tener un tiempo de 
supervivenciamenor. Esto se ha asociado a la inhibición de los estrógenos al efecto 
inflamatorio de la Il-6 producida por las células de Kupffer en las mujeres, además de 
incrementar los receptores de andrógenos en los hombres cuya participación no está 
completamente clara (Yeh and Chen, 2010). 
 
 
 
 
 
 
 
1998-2008
Nota: El porcentaje está en relación con el total de defunciones por tumores registradas en cada año, en general y por sexo.
Fuente: INEGI. Estadísticas Vitales, 1998-2008. Bases de datos.
Porcentaje de defunciones en mujeres debidas a tumores malignos (cinco principales causas)
15.8
15.6
15.4
14.8
13.8
13.5
12.9
12.6
12.0
11.5
11.2
11.7 11.6 11.6
11.8
12.3
12.1
12.7 12.5
12.9
13.1
13.4
7.4
7.9
7.5 7.6
7.6
7.5 7.4 7.5 7.2
7.1 7.1
7.3
6.8
7.6 7.6
7.5
7.9
7.7
7.5 7.9
7.2
7.5
6.9
6.8
6.7 6.6
6.9 6.7 6.8 6.6 6.6
6.4 6.2
1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
Cuello del útero Mama
Estómago Hígado y de las vías biliares intrahepáticas
Tráquea, de los bronquios y del pulmón
Fig. 4.- Porcentaje de defunciones debidas a tumores malignos en mujeres 1998-2008 
- 23 - 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2.5.- Fibrosis-Cirrosis en el desarrollo del cáncer hepático. 
La fibrogénesis es un proceso que deriva en cirrosis causado por 
enfermedades crónicas hepáticas, además es una condición patológica asociada al 
desarrollo del CHC sin importar el agente etiológico que lo genere. La cirrosis está 
presente en más del 85% de los casos de CHC, por lo que es de suma importancia el 
conocer las bases moleculares involucradas en el microambiente del desarrollo de la 
cirrosis y la formación de tumores (El-Serag and Rudolph, 2007). 
En estado de salud el hígado tiene componentes de matriz extracelular bien 
organizado en membranas basales dispuestas en los tractos portales y vena central, 
compuesta principalmente por colágeno y laminina. La laminina es una proteína de 
200 y 400 kDa con la capacidad de unirse al colágeno tipo IV y heparán sulfato por lo 
que es parte esencial en la morfogénesis y regeneración del hígado (Luna, 2005). 
Recientemente se ha asociado a la laminina como un modulador de la diferenciación 
de células ovales a hepatocitos maduros (Lorenzini et al., 2010). El colágeno es una 
familia de proteínas codificadas por diferentes genes, está compuesta por tres 
Fig. 5 Mortalidad de cáncer de hígado por sexo. Estandarizado por edad por 
cada 100,000 habitantes. Fuente: (Parkin et al., 2005) 
- 24 - 
 
cadenas de polipéptidos características para cada tipo, en el hígado se ha 
identificado en las membranas basales colágenos de los tipos I, III, IV, V y VI (Luna, 
2005). 
En el hígado con daño crónico el mecanismo de fibrogénesis y su participación 
en el desarrollo del cáncer involucra un microambiente con múltiples interacciones 
entre células de tipos diferentes. Cualquiera de los agentes etiológicos de la cirrosis, 
induce un estado de inflamación mediado por las células de Kupffer y otras células 
del sistema inmune, llevando a un recambio constante de células del tejido hepático 
(muerte celular y regeneración). Durante el intercambio celular hepático se liberan 
factores solubles como el TGF-β, principal inductor de fibrogénesis, se incrementan 
las especies reactivas de oxigeno (ROS) (Kolios et al., 2006), se induce la 
producción de componentes de matriz extracelular como el colágeno 1αI y laminina 
por parte de las células estelares activas o miofibroblastos (Liu and Gaston Pravia, 
2009), también se ha descrito la posibilidad de que los colangiocitos y las células 
endoteliales participen en el proceso de fibrogénesis, pero continua siendo 
controversial (Friedman, 2010). 
 La producción de los componentes de matriz extracelular (MEC) por parte de 
las células estelares está condicionada al daño generado, por lo que en situaciones 
agudas, los miofibroblastos pueden revertir su activación o entrar a un estado de 
senescencia, sin embargo, en enfermedades crónicas como la cirrosis se lleva a los 
miofibroblastos a un estado de perpetuación, donde la proliferación y activación de 
células estelares conduce a la producción constante de componentes de MEC. Así el 
cúmulo de tejido fibroso lleva a una remodelación del tejido hepático formando 
nódulos y provocando alteraciones en conexiones vasculares y entre hepatocitos 
(Friedman, 2010). 
Los nódulos cirróticos, también llamados de regeneración, se caracterizan por 
una disminución en la proliferación de hepatocitos, indicativo del agotamiento en la 
capacidad de regeneración del hígado. En las enfermedades crónicas las células 
realizan su número finito de divisiones, produciendo como resultado el acortamiento 
del telómero y una acumulación de células senescentes o apoptóticas. El 
acortamiento de los telómeros induce inestabilidad cromosómica, favoreciendo las 
- 25 - 
 
aberraciones cromosómicas estructurales, translocaciones, y fusiones entre otras. La 
alteración genética puede causar la reactivación de la enzima telomerasa, lo que 
permite que las células entren al ciclo celular generando nódulos displásicos y 
tumores. Dentro de los nódulos se crea un microambiente con células estelares 
activas y del sistema inmune que liberaran citocinas y factores de crecimiento, que 
incrementan el estrés oxidante en las células, generando un mayor número de 
células alteradas en su material genético (El-Serag and Rudolph, 2007), lo que 
genera una presión selectiva para que aquellas células capaces de proliferar generen 
tumores. 
 
2.6.- Modelos de hepatocarcinogénesis. 
Las etapas pre-tumorales del CHC en los humanos están caracterizadas por la 
presencia de lesiones preneoplásicas, denominadas nódulos displásicos, que 
pueden ser analizados para la identificación de tumores tempranos y diseñar 
estrategias preventivas para el desarrollo de la enfermedad, sin embargo, los 
nódulos son difíciles de obtener debido a su tamaño, por lo que su detección es 
incidental, además de coexistir con otras patologías lo que complica el diagnóstico 
oportuno. (Perez-Carreon et al., 2006), también otra característica que complica el 
estudio de esta patología en los humanos es el tiempo de desarrollo, que va de 5 a 
30 años, haciendo prácticamente imposible el seguimiento clínico desde etapas 
iniciales de la carcinogénesis hasta la aparición del CHC. 
Los modelos animales de hepatocarcinogénesis se han diseñado como 
estrategia para el estudio del CHC, permiten entender el mecanismo molecular de la 
progresión del cáncer desde la iniciación celular, la formación de los nódulos 
preneoplásicos hasta la formación de CHC. Los animales de laboratorio, como los 
roedores tienen hígado con estructura celular y molecular similar al del ser humano; 
así las vías metabólicas y función fisiológica tienen la misma importancia entre 
especies cuando son sometidas a procesos carcinogénicos, las células sufren daño 
en su DNA, RNA y proteínas de forma similar a lo ocurrido en los seres humanos 
(Guengerich, 2000). 
- 26 - 
 
Existe una gama de modelos animales para estudiar el CHC. La elección del 
modelo más apropiado dependerá de la pregunta en específico que se requiere 
investigar, entre los diversos modelos experimentales están; 1) Modelos de 
implantación de CHC, es ampliamente usado para la investigación de fármacos 
antineoplásicos, primordialmente en aquellos que involucren al sistema inmune. 2) 
Modelos genéticamente modificados, por ejemplo, los transgénicos y knockout, estos 
modelos permiten investigar el papel específico de los genes, en combinación con un 
carcinógeno específico. 3) Modelos virales de CHC esta clase de modelos tratan de 
explicar el mecanismo de carcinogénesis por infecciones por hepatitis virales, sin 
embargo, la estabilidad de los virus y la especificidad hacia hepatocitos humanos 
continúan siendo una limitante para su uso, un ejemplo quepodría ser importante 
para estudiar la infección viral es el ratón quimérico con hepatocitos humanos (Bissig 
et al., 2010); y 4) Modelos de CHC inducidos por carcinógenos químicos, permiten 
entender como agentes externos contribuyen al desarrollo del cáncer (Leenders et 
al., 2008) además de permitir recrear el proceso de carcinogénesis desde etapas 
tempranas, e inclusive recrear el proceso con otra patología asociada al CHC como 
lo es la cirrosis. 
Los carcinógenos químicos que se pueden emplear se dividen en genotóxicos 
y en no genotóxicos. Los agentes no genotóxicos, también algunos de ellos 
denominados epigenéticos, contribuyen al desarrollo del cáncer sin generar daño al 
DNA, por ejemplo los modelos con una dieta deficiente en colina, metionina o folatos 
perturba la transferencia de grupos metilo a través de S-adenosilmetionina (SAM) y 
produce alteración en los patrones de metilación de histonas (Feo et al., 2009). Los 
agentes genotóxicos generan de forma directa daño en el DNA como el 
dimetilsulfato, formando aductos con el material genético de las células sin necesidad 
de biotransformación, o de forma indirecta, es decir, que requiere biotransformación 
(activación metabólica) para generar su efecto formando aductos con el DNA 
(Ogawa, 2009). Diversas sustancias han demostrado ser hepatocarcinógenas en 
animales pero no necesariamente lo son para el ser humano como los proliferadores 
de peroxisomas, por ejemplo el clorfibrato, lo cual imposibilita traslapar los 
- 27 - 
 
resultados entre especies (Leenders et al., 2008), no obstante existen diversos 
modelos ya reportados y validados. 
Para fines de investigación y compresión del proceso de carcinogénesis se ha 
dividido en tres etapas principales: Iniciación corresponde a la etapa donde las 
células sufren alteración en su genoma, la etapa de promoción se refiere al suceso 
que causa proliferación de las células alteradas que dan lugar a la neoplasia y la 
etapa de progresión se refiere a la expansión clonal de las células alteradas con la 
aparición de nuevas mutaciones y nuevas subclonas (Stevens, 2001). El modelo del 
hepatocito resistente considera las etapas de iniciación, promoción y progresión, éste 
modelo consiste en la administración de una dosis necrogénica 200 mg/kg de 
dietilnitrosamina (DEN) vía intraperitoneal, con una posterior administración vía oral 
al día 7, 8 y 9 de 2-acetilaminofluoreno (2-AAF) 20 mg/kg por día con una posterior 
hepatectomía parcial (Carrasco-Legleu et al., 2006), estos tres estímulos son 
suficientes y necesarios para generar lesiones que llevan al desarrollo de tumores en 
14 meses, dando como ventaja el desarrollo de neoplasias de forma secuencial (Solt 
et al., 1983), sin embargo, la principal desventaja como modelo es que no desarrolla 
fibrogénesis ni cirrosis como ocurre en el ser humano. 
Un segundo modelo desarrollado por otros investigadores (Schiffer et al., 
2005) consiste en la administración de DEN 50 mg/kg una vez por semana durante 
16 semanas, esto permite recapitular un proceso crónico similar al ser humano ya 
que de 12 a 16 semanas de tratamiento se produce un hígado cirrótico, mientras que 
desde la semana 16 se presenta el CHC en el hígado cirrótico. Así en el modelo en 
pocas semanas se generan patologías que en el ser humano ocurren en decenas de 
años. 
 
2.7.- Mecanismo de acción de los carcinógenos; DEN y 2-AAF. 
La dietilnitrosamina (DEN) es un carcinógeno químico con el potencial de 
generar tumores en varios órganos como en tracto gastrointestinal, sistema 
respiratorio e hígado. Específicamente en el hígado es un carcinógeno completo, es 
decir, puede ser iniciador y también promotor del desarrollo del cáncer, además de 
inducir fibrogénesis (Park et al., 2009). La DEN es un agente alquilante de 
- 28 - 
 
biomoléculas como el DNA, ya que forma enlaces covalentes con las bases 
nitrogenadas, formando etil-aductos y alterando la regulación de los genes. En ratas 
tratadas con DEN, se ha observado la formación de focos de hepatocitos alterados 
con niveles disminuidos de p53 (Qi et al., 2008). Para que la DEN lleve a cabo su 
efecto carcinogénico requiere ser biotransformada en moléculas reactivas, este 
proceso que inicia con la hidroxilación de un grupo etilo mediante monooxigenasas 
P450 dependientes, principalmente por la CYP2A6 y CYP2E1, formando un 
carbocatión (etilcarbonio) altamente reactivo con el DNA y otras macromoléculas, o 
bien sufriendo un segundo proceso de biotransformación por la acción de N-
acetiltransferasas u O-acetiltransferasas, pero este proceso al final forma también 
una especie reactiva (Fig. 6) (Aiub et al., 2006). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 La acción carcinogénica de DEN además de involucrar la alquilación del DNA, 
también implica la formación de especies reactivas principalmente de oxígeno que 
son formadas por la activación de DEN. Las especies reactivas de oxígeno 
reaccionan con las bases nitrogenadas, donde la deoxiguanosina es frecuentemente 
oxidada formando 8-hidroxideoxiguanosina (8-oxodG). El efecto de DEN también 
puede ocasionar cambios en la expresión de genes entre las que se encuentran las 
Fig. 6.- Vías de activación de dietilnitrosamina (DEN), (Aiub et al., 2006). La DEN es metabolizada 
inicialmente por enzimas de la familia CYP450, generando un ión etilcarbonio capaz de reaccionar con 
el DNA, o bien un segundo paso en el metabolismo de la DEN puede generar otra especie por la acción 
de las N-acetiltrasferasas y las O-acetiltransferasas 
- 29 - 
 
proteínas ciclina D1, p53 y cdk4, involucradas en la regulación del ciclo celular en el 
paso de fase G1 a fase S (Park et al., 2009). 
El 2-Acetilaminofluoreno (2-AAF) es considerado una sustancia carcinógena 
por formar compuestos electrófilos en su metabolismo, como el N-
hidroxiacetilaminofluoreno (Fig. 7), los metabolitos pueden reaccionar con el DNA y 
generar lesiones neoplásicas, además otro mecanismo del 2-AAF que se le ha 
asociado es el de inhibir la mitosis de hepatocitos maduros, pero no en células 
ovales ni colangiocitos (Custer and Sorof, 1984). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El mecanismo por el cual el 2-AAF ejerce su efecto mitoinhibidor ha sido 
ampliamente estudiado, diversos investigadores (Lindeman et al., 1999) (Trautwein 
et al., 1999) (Ohlson et al., 2004), han reportado que la detención del ciclo celular por 
el efecto del 2-AAF, se presenta en la transición de fase G1 a fase S mediante 
diversos mecanismos moleculares como la acumulación nuclear del complejo ciclina 
D1-CDK4, la inhibición de la translocación al núcleo de CDK2, el aumento de niveles 
nucleares de la proteína p53, disminución en la expresión de la ciclina E, disminución 
de expresión de factores de transcripción E2F. Una característica importante del 
efecto mitoinhibidor del 2-AAF, es que se ejerce principalmente en hepatocitos y no 
así en otras células hepáticas como colangiocitos y células ovales, que mantienen 
su capacidad de proliferación (Trautwein et al., 1999) 
El efecto mitoinhibidor del 2-AAF especifico para hepatocitos y no en otros 
tipos de células hepáticas, puede explicarse por la capacidad de los hepatocitos de 
realizar biotransformación de xenobióticos por la expresión elevada de diferentes 
electrófilo
N
H
CCH3
O
2- acetilaminofluoreno
(2-AAF)
N
CCH3
O
OHP 450
N-hidroxi-AAF
N
CCH3
O
O
glucurónido
N
CCH3
O
O SO3
-
sulfotransferasa
sulfato de AAF
N
CCH3
O
+
unión a macromoléculas
Fig. 7 Metabolismo de 2-Acetilaminofluoreno (2-AAF) 
- 30 - 
 
tipos de enzimas de destoxificación como los CYP450, produciendo una activación 
metabólica del 2-AAF a N-hidroxiacetilaminofluoreno, proceso que no ocurre en otras 
células hepáticas. 
 
2.8.- Principales biomarcadores conocidos de hepatocarcinogénesis. 
 Un biomarcador es cualquier biomolécula presente por la respuesta biológica 
frente a una patologíao agresión por algún xenobiótico que indique alteración en un 
órgano o tejido. Las características ideales de los biomarcadores son: alta 
especificidad, que permita un diagnóstico temprano y alta sensibilidad con la finalidad 
de evitar falsos positivos. Actualmente para el diagnóstico del CHC en los seres 
humanos se emplea como biomarcador la medición de α-fetoproteína en suero, sin 
embargo, no cumple las características idóneas ya que sólo se presenta en el 70% 
de los casos de CHC y puede verse incrementada en otras patologías como 
infección por virus de hepatitis, enfermedad inflamatoria del intestino y 
teratoblastomas de ovario y testículos (Sharma, 2009). 
Existen otros biomarcadores para los modelos de hepatocarcinogénesis 
propuestos para la identificación de nódulos y tumores; la gamma-glutamil 
transpeptidasa (GGT) y la glutatión-s-transferasa pi (GSTp), las cuales incrementan 
su expresión y actividad conforme avanza el desarrollo del cáncer (Carrasco-Legleu 
et al., 2006). 
La GGT es una proteína membranal expresada en diferentes tipos de células; 
en riñones, en capilares cerebrales, en el epitelio biliar (colangiocitos) y en células 
ovales hepáticas. La GGT cataliza la degradación extracelular del glutatión reducido 
(GSH) y conjugado (GS-X), mediante la hidrólisis del enlace entre los aminoácidos 
glutamato y la cisteína generando como productos glutamato y cisteinil-glicina. La 
cisteinil-glicina por efecto de las dipeptidasas puede ser hidrolizada, y los productos 
pueden ser transportados al interior de la célula para regular los niveles intracelulares 
de GSH manteniendo los niveles de antioxidantes celulares (Pompella et al., 2006). 
La GGT se sobreexpresa en el hígado fetal y su actividad decrece posterior al 
nacimiento, también se ha demostrado (Yao et al., 2004) que diferentes células 
tumorales frecuentemente presentan alta expresión de GGT, vía activación del 
- 31 - 
 
oncogén ras. La actividad de GGT se correlaciona con el estado de algunas 
alteraciones hepáticas en los hepatomas, el CHC y la colestasis. La presencia de 
GGT en células tumorales ofrece protección contra agentes prooxidantes endógenos 
y exógenos regulando el nivel de GSH intracelular. El producto cisteinil-glicina, 
favorece la destoxificación de xenobióticos electrófilos como el antineoplásico 
cisplatino de forma extracelular, por lo que el tratamiento con antineoplásicos del 
cáncer de hígado no es efectiva ya que las células tumorales con expresión de GGT 
presentan un fenotipo más agresivo y resistente (Pompella et al., 2006). 
La GSTp pertenece a la familia de las GST consideradas enzimas de 
destoxificación de fase II, catalizan la conjugación del GSH con compuestos 
electrofílicos protegiendo a las células de los efectos tóxicos de estos (Adler et al., 
1999). La GSTp se expresa en hígado fetal pero no durante la regeneración 
hepática, no se induce por xenobióticos electrófilos como otras isoenzimas, por lo 
que la expresión de GSTp se asocia estrechamente con la hepatocarcinogénesis. La 
transcripción de GSTp está regulada por el factor de transcripción Nrf2, asociado al 
enhancer GPE1 los cuales en conjunto incrementan la expresión de GSTp, conforme 
avanza el proceso de carcinogénesis en modelos experimentales y la consecuente 
disminución del silenciador C/EBPα para la expresión de GSTp (Sakai and 
Muramatsu, 2007). Otra característica que se ha descrito para la GSTp es su función 
de sensor de cambios intracelulares del estado redox de la célula, esto porque regula 
la actividad de Jun-N-terminal cinasa (JNK), proteínas de estrés que implican 
cambios en la reparación del DNA, el ciclo celular y la apoptosis, al inhibir su 
fosforilación en respuesta al estrés celular (Adler et al., 1999). 
Tanto la GGT y GSTp han demostrado ser muy consistentes marcadores en 
diferentes modelos experimentales para el CHC, sin embargo, en el ser humano la 
enfermedad es multifactorial y estos biomarcadores son heterogéneos en su 
expresión, además la GGT y GSTp no son limitantes para la progresión del CHC. 
(Adler et al., 1999) (Sakai and Muramatsu, 2007). 
 
 
 
- 32 - 
 
2.9.-Estrés oxidante y su impacto en la carcinogénesis. 
El estrés oxidante se refiere al incremento de las especies reactivas oxidantes, 
como radicales libres, los cuales son moléculas, átomos y iones con electrones 
desapareados en alguno de sus orbitales, siendo altamente reactivos con las 
biomoléculas. Los radicales libres en los sistemas biológicos derivan de moléculas de 
oxígeno, nitrógeno y azufre, formando grupos denominadas especies reactivas de 
oxígeno (ROS), nitrógeno y azufre. Las ROS incluyen radicales libres como el anión 
súper óxido (O2
-.), radical perhidroxilo (HO2
.), radical hidroxilo (.OH), peróxido de 
hidrógeno (H2O2), oxígeno singlete (
1O2), ácido hipocloroso (HClO), entre otros (Lu et 
al., 2009). 
El hígado es la primera línea de defensa contra muchas sustancias tóxicas, 
cuya exposición de forma aguda o crónica genera inflamación como respuesta a la 
irritación o infección, caracterizada por la movilización de células del sistema inmune, 
esto es seguido de la reparación de tejido caracterizada por la proliferación celular. 
Asociado a los procesos de inflamación-regeneración se encuentra la formación de 
ROS, generando peroxidación de lípidos, proteínas o DNA, alterando la proliferación 
celular y la apoptosis (Roberts et al., 2010). El origen de las ROS también puede ser 
por otros mecanismos endógenos o exógenos, entre los endógenos se encuentra el 
transporte de electrones para la fosforilación oxidativa, contribuyendo con el 4 al 5% 
de las especies reactivas en forma de O2
-. principalmente, y por los peroxisomas, 
mientras que los mecanismos exógenos incluyen agentes ambientales, fármacos y 
químicos industriales (Klaunig et al., 2011) que de forma directa o indirecta pueden 
contribuir a la formación de ROS. 
Se ha asociado que durante el metabolismo de carcinógenos químicos como 
DEN se da un incremento de ROS, mostrando el importante papel del estrés 
oxidante en la carcinogénesis hepática (Sanchez-Perez et al., 2005). El mecanismo 
por el cual las ROS generan alteraciones en el DNA, puede ser de forma directa 
formando 8-oxodG por el radical hidroxilo o de forma indirecta por la formación de 
productos finales de lipoperoxidación como el 4-hidroxinonenal (4-HNE), el cual 
puede formar aductos con el material genético de los hepatocitos. La alteración del 
material genético puede activar diversos factores de transcripción como el Nfr2 
- 33 - 
 
(Klaunig et al., 2011) y diferentes vías de señalización que involucran a JNK, p38 y 
AP-1, vías relevantes en la regulación de la apoptosis, además de activar la 
transcripción de enzimas de fase II, para la destoxificación de metabolitos pro 
oxidantes como el 4-HNE (Uchida et al., 1999). 
El 4-HNE es producto de la degradación oxidante de ácidos grasos n-6 
poliinsaturados (PUFA) por ROS, es considerado el producto final de 
lipoperoxidación más tóxico y el principal responsable de la degeneración celular. 
Recientemente el 4-HNE ha sido motivo de estudio por su participación en la 
regulación en vías de señalización para diferenciación, proliferación y control del ciclo 
celular, donde cada uno de sus efectos los realiza dependiente de su concentración 
intracelular. 
En estado de salud la concentración de 4-HNE en tejidos y plasma se 
encuentran en el rango de 0.5 μM a 6 μM, mientras que en enfermedades con 
continuo estrés oxidante, como el cáncer, el nivel incrementa hasta 15 veces más 
(Awasthi et al., 2005). Recientemente se ha demostrado (Chaudhary et al., 2010) que 
el 4-HNE induce apoptosis en líneas celulares de CHC, vía ligando de Fas y vía 
intrínseca mediada por p53, además induce necrosis a partir de concentraciones de 
20 μM. Así, existe una paradoja en la cual las células neoplásicas mantienen unelevado nivel de estrés oxidante, que puede dar lugar a metabolitos que afectan las 
funciones celulares como el 4-HNE, y las células resisten evadiendo la muerte 
celular, esto muestra la necesidad de las células tumorales de protegerse de los 
efectos proapoptóticos del 4-HNE y mantenerlo en niveles que favorezcan su 
proliferación. En modelos de hepatocarcinogénesis en rata, se ha visto el incremento 
en la expresión de GSTA4-4 la cual está asociada al metabolismo del 4-HNE, sin 
embargo, existen otras proteínas que contribuyen al mantenimiento de los niveles del 
4-HNE (tabla 2), generando cada una diferentes productos (Awasthi et al., 2005). 
 
 
 
 
 
- 34 - 
 
 Tabla 2. Enzimas involucradas en el metabolismo del 4-HNE 
(Awasthi et al., 2005) 
Enzima Ejemplo Sustrato Producto 
GST’s GSTA4-4 HNE-ω-OH Hemicetal HNE-GSH 
Aldocetoreductasas AKR1B10 HNE 1,4-dihidroxinonenol 
Aldosa reductasa Aldehído 
reductasa 
HNE-GSH Acido-4-hidroxinonenoico 
(HNA) 
Aldehído 
deshidrogenasas 
ALDH1A1 HNE Lactona GSH-HNA 
CYP450 CYP450-4A HNA-lactona Ω-hidroxi-HNA-lactona 
Alquenal 
oxidoreductasas 
OH-1 y 
PTGR1 
HNE 4-hidroxinonanal 
 
2.10.- Prostaglandina reductasa 1. 
La Prostaglandina reductasa 1 (PTGR1), es una proteína de 329 amino ácidos y un 
peso molecular de 34 kDa y es capaz de formar tetrámeros. La PTGR1 es codificada 
en el brazo largo del cromosoma 9 en los humanos, mientras que su gen ortólogo en 
ratas se localiza en el brazo largo del cromosoma 5. La PTGR1 ha sido denominada 
con varias funciones como alquenal/ona óxido reductasa dependiente de NADPH 
(AO), leucotrineno B4 12-hidroxidehidrogenasa (LTB4DH) y gen-1 inducido por 
ditioletionas (DIG-1). 
La PTGR1 fue descubierta en la fracción citosólica de extracto renal de cobayos con 
nefropatías, tiene capacidad de metabolizar el leucotrieno B4 (LTB4), potente 
quimioatractor de neutrófilos, a 12-oxo-LTB4 por la hidroxilación en la posición 12 
usando como cofactor NADPH, este mecanismo difiere a la ω-oxidación vía 
citocromos P450 de los neutrófilos que además dependen de NADH (Yokomizo et 
al., 1993). Del análisis y clonación de cDNA para PTGR1 de riñón humano y porcino 
se detectó que entre especies se comparte un 97.1% de homología en su secuencia, 
además de su presencia en otras especies como, conejos, ratas y ratones (Yokomizo 
et al., 1996). De acuerdo a las características y homología en su secuencia la 
- 35 - 
 
PTGR1 forma parte de la superfamilia dehidrogenasas/reductasas de cadena media 
(MDR), a la cual pertenecen también otras enzimas de destoxificación como la 
alcohol deshidrogenasa y la NADPH quinona oxidoreductasa, las MDR se 
caracterizan por la capacidad de llevar a cabo su función en ausencia de Zn2+ y 
transfiriendo el grupo hidruro de forma estereoespecífica al carbono β del doble 
enlace (Dick and Kensler, 2004). 
La detección mediante inmunohistoquímica en tejidos de cobayos reveló que 
la PTGR1 no solo se localiza en el riñón, sino que también está presente en otros 
órganos como hígado, intestino delgado, alveolos y colon pero no en células del 
sistema inmune como se esperaría para el metabolismo del LTB4 (Yamamoto et al., 
2001). La expresión de PTGR1 puede ser inducida en respuesta a niveles elevados 
de LTB4 en infecciones crónicas o por agentes quimioprotectores como las 
ditioletionas, compuestos organosulfurados contenidos en vegetales. Uno de los 
mecanismos de las ditioletionas para ejercer su efecto protector contra carcinógenos, 
consta en la inducción en la expresión de enzimas de destoxificación como GST’s, 
epóxido hidrolasa, UDP-glucoronosiltransferasas, PTGR1, entre otras. 
La PTGR1 se comenzó a considerar una enzima quimioprotectora contra la 
formación de tumores de colon por su capacidad de inactivar el LTB4, lo cual 
conlleva a una disminución de la quimiotaxis de neutrófilos, disminución en la 
respuesta inflamatoria y el daño por ROS (Primiano et al., 1998). La propuesta de la 
PTGR1 como enzima de protección, se reforzó con la descripción de su función 
antioxidante por la reducción de dobles enlaces en posición α-β de diversos 
aldehídos y cetonas con una alta eficiencia contribuyendo a la destoxificación de 
estas sustancias. Entre los aldehídos metabolizados por la PTGR1 destaca la 
elevada capacidad de reducir el 4-HNE, con una Km de 0.12 mM, Kcat de 4040 min-1 
y eficiencia catalítica de 3.3x107 min-1M-1 (Dick et al., 2001), comparada con la 
eficiencia catalítica de GST-A4A para 4-HNE ≥ 2.0x106 min-1M-1 (Awasthi et al., 
2005), por lo que contribuye a proteger a las células de los efectos citotóxicos del 4-
HNE. Otro aspecto que contribuye a la idea de PTGR1 como enzima protectora, es 
que su transcripción está regulada por el factor de transcripción Nrf2, el cual se 
encuentra unido a Keap1 en forma inactiva en el citoplasma, pero frente a estímulos 
- 36 - 
 
de estrés oxidante constante, como suele ocurrir en las células cancerosas, se activa 
mediante fosforilación translocándose al núcleo y formando heterodímeros con las 
proteínas Maf. Estos complejos de proteínas se unen a secuencias del DNA 
denominadas elementos de respuesta antioxidante (ARE), responsables de la 
transcripción de enzimas de destoxificación, también la inactivación de Nrf2 se ve 
regulada por la PTGR1 por un mecanismo de feedback, ya que la PTGR1 es capaz 
de metabolizar las sustancias que activan a Nrf2, como la prostaglandina J2, 
disminuyendo la translocación de Nrf2 al núcleo (Yu et al., 2006). 
La inducción de PTGR1 mediante infección por adenovirus recombinantes en 
líneas celulares de cáncer de pulmón, suprime su crecimiento, además de 
incrementar los niveles de apoptosis en las células, corroborando la disminución de 
su potencial tumorigénico por implantación en ratones desnudos, con lo que se 
propuso que su expresión previene el desarrollo de cáncer de pulmón (Zhao et al., 
2010). 
2.10.1 Antecedente directo sobre el estudio de la Ptgr1 en 
hepatocarcinogénesis. 
En el Instituto Nacional de Medicina Genómica (INMEGEN) en un modelo de 
hepatocarcinogénesis química, se realizaron estudios del proteoma de tejido 
hepático de rata por electroforesis y espectrometría de masas MALDI-TOF-TOF, 
donde se identificó a la PTGR1, únicamente en tejido tumoral y no así en el tejido no 
tumoral ni en lesiones preneoplásicas, por lo que la PTGR1 surgió como molécula 
relacionada a la transición de preneoplasia a neoplasia en el hígado. La presencia 
exclusiva de esta proteína únicamente en tejido tumoral, deja la interrogante de en 
qué momento de la hepatocarcinogénesis se expresa en las neoplasias, de cómo es 
su expresión en un modelo de hepatocarcinogénesis que además esté asociado a 
cirrosis y de las ventajas que puede otorgar su expresión. Si la presencia de esta 
posible proteína es consistente y se extrapola al ser humano se tendría un 
importante biomarcador molecular del cáncer hepático. 
 
- 37 - 
 
3.- Objetivos. 
 Objetivo general: 
Determinar el nivel de expresión de la Ptgr1 y otros genes relacionados a la 
fibrogénesis y la carcinogénesis, en modelos de inducción de cirrosis y de cáncer 
hepático con la finalidad de caracterizarlos, compararlos y reforzar la propuesta de la 
presencia de la Ptgr1 en la carcinogénesis hepática. 
Objetivos específicos: 
 Analizar cuantitativamente el nivel de RNAm de Ptgr1 en tejido hepático de 
rata de dos modelos de hepatocarcinogénesis química, a diferentes tiempos 
de desarrollo. 
 Cuantificar la actividad alquenal/ona oxidoreductasa de la PTGR1 en tejido 
hepático de rata de dos modelos de hepatocarcinogénesis química, a 
diferentes tiempos de desarrollo. 
 Medir y comparar el índice de fibrosis generado, a diferentes tiempos de 
desarrollo en dos modelos de hepatocarcinogénesis química. 
 Evaluar el nivel de los biomarcadores de cáncer hepático GGT y GSTp, a 
diferentes tiempos de tratamiento de los modelosde hepatocarcinogénesis y 
establecer si existe correlación con la expresión de PTGR1. 
 Determinar el índice de proliferación celular y su ubicación histológica, en los 
dos modelos de hepatocarcinogénesis empleados. 
 Evaluar la expresión de genes relacionados con la carcinogénesis y la 
inflamación, Vegf, Ptgs2, Sp1, Nfkb e IL-1b. 
 
 4.- Hipótesis. 
 Si la expresión de la Prostaglandina reductasa 1 está vinculada a la presencia 
de tumores hepáticos, entonces se espera encontrarla altamente expresada a nivel 
de mRNA, proteína y actividad enzimática en las etapas avanzadas de cáncer en los 
modelos de hepatocarcinogénesis química asociados a cirrosis y presentará 
correlación con algún biomarcador ya reportado o gen involucrado en la 
carcinogénesis. 
 
- 38 - 
 
5.- Metodología 
5.1 Modelos animales de hepatocarcinogénesis química. 
5.1.1 Regímenes de administración. 
Se emplearon ratas Fisher 344 macho de acuerdo al tratamiento correspondiente 
(fig. 8). 
 Modelo Dietilnitrosamina (D) 
Se administró cada semana Dietilnitrosamina 50 mg/Kg vía intraperitoneal hasta la 
semana 16 (Schiffer et al., 2005). 
 Modelo Dietilnitrosamina y 2-Acetilaminofluoreno. (DA) 
Se administró Dietilnitrosamina 50 mg/Kg semanalmente vía intraperitoneal y de 
forma diferida 3 días después, semanalmente se administró el 2-Acetilaminofluoreno 
25 mg/Kg vía intragástrica por 16 semanas. 
 
 
 
 
 
 
 
5.1.2 Sacrificio de animales. 
 Para ambos modelos los tiempos de sacrificio de animales fueron 6, 12 y 18 
semanas a fin de poder apreciar el desarrollo de la fibrosis y del cáncer desde sus 
Fig. 8. Esquematización de los regímenes de 
administración y sacrificio para los modelos D y DA. 
- 39 - 
 
etapas tempranas. Un tercer grupo control se sacrificó de forma paralela a las 18 
semanas el cual no recibió ningún tratamiento (NT). 
 Para el sacrificio se empleó como método de anestesia una cámara de éter. A 
las ratas anestesiadas se les realizó una punción cardiaca donde se obtuvo 5 mL de 
sangre, y mediante una resección quirúrgica se obtuvo el tejido hepático, el cual fue 
congelado con nitrógeno liquido y embebido en 2-metil butano como crioprotector y 
almacenado a -70°C, para su conservación, formando así un banco de tejidos para 
los diferentes ensayos. 
 
 5.1.3 Procesamiento de tejido congelado. 
 Del tejido hepático congelado se realizaron cortes histológicos para cada 
muestra con un Crióstato Leica CM3050 a una temperatura de corte de -15°C. Los 
cortes fueron utilizados en dos aspectos; cortes histológicos adheridos a portaobjetos 
para obtener muestras representativas del tejido hepático y donde el corte fue 
almacenado en tubo de microcentrífuga de 1.5 mL y en congelación para la 
extracción de biomoléculas (RNA y proteínas) para los diferentes ensayos. 
 
 5.2 Ensayos histológicos. 
 5.2.1 Determinación de actividad γ-Glutamiltranspeptidasa (GGT) in situ. 
 Se realizaron cuatro cortes de 16 μm por hígado de cada animal colocados en 
un portaobjetos a los cuales se les realizó la reacción histoquímica descrita por 
Rutenburg y colaboradores. (Rutenburg et al., 1969), la cual permite visualizar la 
actividad de la enzima GGT aprovechando su capacidad de transferir grupos γ-
Glutamil entre diferentes péptidos mediante un activador. 
 Las secciones histológicas fueron fijadas con etanol 96% por 10 minutos y 
posteriormente fueron incubados durante 30 minutos con una solución 125 μg/mL de 
γ-glutamil-4-metoxi-2-naftilamina (GMNA), 500 μg/mL de glicil-glicina, 500 μg/mL de 
fast blue BB en Tris 100 mM pH 7.4, transcurrido el tiempo de reacción donde se 
forma el producto de color rojo que se deposita en el tejido, se realizó un lavado con 
agua destilada y se agregó con una solución de CuSO4 0.1 M por 5 minutos para la 
quelación y estabilidad del producto de reacción; el principio de la reacción consiste 
- 40 - 
 
en que la GGT transfiere el grupo gamma-glutamil del GMNA al activador glicil-glicina 
para formar un tripeptido gamma-glutamil glicil glicina y 4-metoxi-2-naftilamina, éste 
ultimo reacciona con el fast blue formando un colorante azo, el cual puede ser 
quelado mediante sales de cobre (fig. 9). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Los resultados de la histoquímica fueron capturados en imagen mediante un 
escáner HP F4280. Las imágenes histológicas con actividad GGT fueron analizadas 
mediante el software IMAGEJ for microscopy versión 1.43 del National Institute of 
Health de los Estados Unidos, cuantificando la proporción del tejido GGT positivo en 
cada modelo y en cada tiempo de sacrificio. 
 
 5.2.2 Inmunofluorescencia Ki67/Laminina-DAPI. 
 Se realizaron cortes de 10 μm de espesor y se colocaron en laminillas 
silanizadas. Una vez colocados los cortes en el portaobjetos se permitió el secado 
del tejido dejando a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se efectuó el fijado 
del tejido con Paraformaldehído al 4% (m/v) por 10 minutos, posteriormente se 
realizaron cuatro lavados con PBS pH 7.2 y se colocó Tritón 1% (v/v) en PBS durante 
10 minutos, se retiró y se hizo un lavado con PBS. El bloqueo se realizó con una 
solución de albúmina al 1% (m/v) en PBS a temperatura ambiente por 2 horas, 
trascurrido el tiempo de incubación se colocó el anticuerpo primario monoclonal de 
conejo anti-Ki67 (Cell Marker) en una dilución 1:100 en PBS pH 7.2, bajo las 
Fig. 9 Principio de la reacción de Rutenburg para visualizar la 
actividad γ- Glutamil transpeptidasa. 
- 41 - 
 
condiciones de incubación en una cámara húmeda a 4°C durante una noche. 
Posteriormente se realizaron 4 lavados con PBS de 5 minutos cada uno, colocando a 
continuación el anticuerpo secundario Alexa 488 anti-conejo 1:200 por 1 hora a 
temperatura ambiente, posterior a la incubación se realizaron 4 lavados con PBS de 
5 minutos posterior a la incubación. 
 Para el doble marcaje se evitó que el tejido se secara, se volvió a realizar los 
pasos desde la fijación hasta la adición del anticuerpo primario, donde en este punto 
se colocó el anticuerpo primario de conejo anti-Laminina (Biogene) a una dilución 
1:200 en PBS pH 7.2, se efectuaron 4 lavados de 5 minutos cada uno, 
subsecuentemente se colocó el anticuerpo secundario Alexa 633 anti-conejo una 
hora a temperatura ambiente, posteriormente se colocó el reactivo DAPI diluido 
1:2000 en PBS por 2 minutos realizando después 4 lavados de 5 minutos cada uno. 
Finalmente se realizó el montaje con Fluorescent mounting medium DAKO, 
conservando las laminillas a 4°C protegidas de la luz. 
 Los ensayos fueron visualizados y capturados en imagen mediante 
microscopio confocal Carl Zeiss LSM 510. 
 El análisis de imágenes se llevo a cabo mediante el programa IMAGEJ versión 
1.43 para la cuantificación de núcleos celulares totales y positivos a Ki67 y el 
porcentaje de tejido positivo a Laminina. 
 
5.3 Estudios de la expresión genética. 
5.3.1 Extracción de RNA 
Se realizó la extracción de RNA total a partir de tejido de 10 cortes histológicos 
de 10 μm (20-30 mg) mediante columnas RNAeasy, Qiagen Germany para cada 
tejido. Los cortes realizados se colocaron en tubos de microcentrífuga de 1.5 mL con 
300 μL de reactivo de lisis RLT con β mercaptoetanol al 1% (v/v) y se homogenizó de 
forma mecánica, posteriormente se añadió gota a gota 300 μL de etanol 70% (v/v) 
homogenizando nuevamente. El volumen generado se colocó en la columna de 
extracción y se dejó en reposo por 5 minutos, después se centrifugó durante 15 
segundos a 10,000 rpm, se desechó el volumen eluido, inmediatamente se añadió a 
la columna 700 μL de reactivo de lavado RW1 con reposo de 5 minutos y se 
- 42 - 
 
centrifugó a 10,000 rpm por 15 segundos, se descartó el líquido y se agregaron 500 
μL de reactivo RPE centrifugando 15 segundos a 10,000 rpm, se eliminó el líquido y 
se añadieron nuevamente 500 μL de reactivo RPE centrifugando por 2 minutos a 
10,000 rpm yse desechó el líquido. Se retiró el tubo de recolección de la columna 
sustituyéndose por uno nuevo, centrifugando posteriormente 1 minuto a 13,000 rpm, 
se retiró nuevamente el tubo de recolección colocando en su lugar un tubo de 
microcentrífuga de 1,5 mL y se eluyó el RNA de la columna con 35 μL de agua libre 
de RNAsas centrifugando 1 minuto a 10,000 rpm. 
 De la elución se tomó una alícuota de 6 μL, 1 μL se empleó para su 
cuantificación espectrofotométrica a 260 nm y 280 nm mediante NanoDrop ND1000 
Spectrophotometer, los 5 μL restantes se emplearon para la verificación de integridad 
mediante gel de agarosa 1.5 %. 
 
 5.3.2 Confirmación de integridad del RNA. 
 Se preparó una solución de agarosa 1.5 % (m/v), disolviendo mediante 
calentamiento por microondas, también se preparó solución reguladora de corrida 
Tris, Acetato, EDTA (TAE) 1X y solución reguladora de corrida con 50 μL solución de 
carga (Buffer Loading FERMENTAS), 3,7 μL formaldehido y 15.4 μL de formamida 
para geles de 8 pozos. 
 En un tubo de microcentrífuga se colocaron de 3 a 5 μL del eluido de RNA 
(100ng/μL-1μg/μL) con 3 μL de solución de carga, se calentó la muestra durante 5 
minutos a 70°C. 
 Se efectuó la electroforesis de las muestras con una fuente BIORAD 
PowerPac HC a 30 V por 10 minutos, incrementando posteriormente el voltaje a 100 
V por 30 minutos. Posteriormente se tiñó el gel con 3 μL de Bromuro de Etidio 0,5 
μg/mL y se capturó la imagen del gel mediante foto documentador KODAK Gel Logic 
1500. La imagen obtenida se analizó mediante el programa IMAGEJ versión 1.43 en 
la opción gel analysis, obteniendo valores relativos de abundancia de RNA ribosomal 
18S, 28S y efectuado la relación 28S/18S, se pudo obtener la calidad del RNA 
siendo considerados de buena calidad con un valor de cociente superior a 1.5. 
 
- 43 - 
 
 5.3.3 Formación de banco de cDNA. 
 A partir del RNA extraído se sintetizó cDNA siguiendo el protocolo High 
Capacity RNA to cDNA Master Mix de Applied Biosystems, en una placa MicroAmp 
Optical Applied Biosystems de 96 pozos se colocaron 750 ng de RNA de cada 
muestra, se adicionaron 3 μL de Master Mix y se llevó a un volumen final de 15 μL 
con agua libre de RNAsas. La amplificación se realizó en un termociclador GeneAmp 
PCR system 9700 Applied Biosystems bajo las siguientes condiciones: 
 
 Step 1 Step 2 Step 3 Step 4 
Temperatura (°C). 25 42 85 4 
Tiempo 5 min. 40 min. 5 min. ∞ 
 
Del cDNA obtenido se realizó una dilución 1:5 con agua libre de RNAasas. 
 
 5.3.4 PCR tiempo real. 
 Se empleó el sistema de sonda TaqMan en placas MicroAmp Optical Applied 
Biosystems de 96 pozos; para cada pozo se colocaron 8 μL de la dilución 1:5 del 
cDNA generado. 
 En cada pozo se añadieron 10 μL de TaqMan Universal PCR Master Mix 2X 
más 1 μL de sonda TaqMan del gen de interés y 1 μL de sonda TaqMan del 
housekeeping (ribosomal 18S). Las sondas empleadas reconocen transcritos en su 
región exón-exón para descartar la amplificación de DNA genómico. La amplificación 
se llevó a cabo en un equipo 7900HT Fast siguiendo el protocolo recomendado: 
 
 45 Ciclos 
 Step 1 Step 2 Step 3 Step 4 
Temperatura (°C). 50 95 95 60 
Tiempo 5 min. 10 min. 15 s. 1 min. 
 
- 44 - 
 
 Los fluorocromos reporteros empleados en las sondas TaqMan fueron: para 
los genes de interés el fluorocromo FAM, mientras que para el gen ribosomal 18S fue 
el fluorocromo VIC, empleando también como referencia pasiva en el ensayo al 
fluorocromo ROX. 
 El valor del umbral y de la línea base fueron estimados de forma manual con 
el programa SDS 2.3 Applied Biosystems, ajustando a las zonas de inicio de 
amplificación y previo a la curva de amplificación (ΔRN vs ciclos) respectivamente, 
una vez ajustados estos valores se determinó el valor del Ct para cada muestra. 
 Una vez obtenidos los resultados, se realizó la determinación de expresión 
relativa de los genes mediante el cálculo doble delta Ct con respecto a la ecuación: 
 
 
 
Donde: 
R = Expresión relativa 
Ctgene = Ct del gen de interés 
CtHK = Ct del Housekeeping ribosomal 18S 
candidato = se refiere a las muestras en estudio. 
referencia = indica a los grupos controles o de valores basales contra los que se 
comparara el resto de las muestras. 
 
 5.4 Estudios a nivel de proteína. 
 5.4.1 Extracción de proteína. 
 Se realizó la extracción de proteína del tejido hepático, a partir de 40 cortes 
histológicos de 16 μm de espesor (100-200 mg), que se colocaron en un tubo de 
microcentrífuga de 1.5 mL con 500 μL de solución reguladora RIPA con inhibidor de 
proteasas (Fermentas Life Sciences), el tejido se homogenizó de forma mecánica en 
tubo Potter, el homogenizado se centrifugó a 10,000 rpm por 10 minutos, separando 
la fracción soluble de la insoluble y congelando ambas fracciones a -20 °C para su 
conservación. 
- 45 - 
 
 5.4.2 Cuantificación de proteína. 
 La cuantificación se realizó de acuerdo al protocolo DC Protein Assay de 
BioRad, tomando una alícuota de las muestras y efectuando una dilución 1:50. En 
una placa de 96 pozos se colocaron 5 μL de la dilución 1:50 de proteína, así como 
200 μL de reactivo B y 25 μL de reactivo AS (20 μL S por cada 1 mL A) manteniendo 
la mezcla de reacción en reposo durante 15 minutos, a continuación se leyó la placa 
en un multidetector Multimode Detector DTX880 Beckman Coulter a 620 nm. Para la 
curva de calibración se emplearon diluciones seriadas del estándar de Globulina 1.56 
μg/mL. El límite de detección del método es de 0,2 mg/mL a 1,5 mg/mL. 
 
 5.4.3 Actividad de Ptgr1. 
 La actividad enzimática Ptrg1 fue determinada mediante una adaptación del 
estudio realizado por Dick y colaboradores (Dick et al., 2001). Empleando como 
sustrato trans-2-nonenal (Sigma), 20 µL a una concentración 5 mM, 50 µL del 
cofactor ß-NADPH (Sigma) 2 mM, para cada ensayo se adicionó 200 µg de proteína, 
el medio de reacción empleado fue solución reguladora de fosfatos 50 mM pH 7.0 
con el que se llevó a un volumen final de 1 mL. Para cada muestra se realizó un 
blanco tratado del mismo modo que la reacción pero sin la adición de NADPH que es 
el sustrato que se mide. La extinción del NADPH es lo que se determinó 
espectrofotométricamente a una longitud de onda de 340 nm con el equipo 
Spectrophotometer UV/VIS Ultraspec 21000 Amersham Biosciences en celdas de 
cuarzo (fig. 10). Se determinó el valor de Absorbancia durante 10 a 15 minutos cada 
medición, primero en ausencia del sustrato y posteriormente en presencia del 
sustrato. 
 
 
 
 
 
 
Fig. 10 Principio de la reacción para la determinación de la actividad 
alquenal/ona oxidoreductasa de la PTGR1. 
- 46 - 
 
 Para el cálculo de la actividad enzimática se aplicó la ecuación que se 
presenta a continuación: 
Donde: 
K: es la constante de velocidad determinada de la pendiente generada por la 
diferencia de Absorbancia en los primeros 2 minutos de reacción, considerando la 
ausencia y presencia del sustrato (K=ksustrato - ksin sustato) 
Vol. Ensayo: Volumen del ensayo en mL 
ε: coeficiente de extinción molecular del NADPH que es de 6220 M-1cm-1 
b: longitud de la celda de cuarzo. 
 
 5.5 Inmunodetección de PTGR1 y GSTp1 mediante Western Blot. 
 5.5.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida al 8%. 
 Se empleó el sistema MiniProtean de BioRad para geles de 1.5 mm de 10 
pozos. Se prepararon 20 mL para el gel separador al 8% (9.3 mL de agua, 5.3 mL 
Acrilamida, 30% Acrilamida y 0.8% Bisacrilamida, 5 mL Tris 1.5 M pH 8.8, 0.2 mL 
SDS 10%, 0.2 mL persulfato 10% y 0.012 mL TEMED). Para 5 mL de gel 
concentrador al 5% (3.4 mL de agua, 0.83 mL Acrilamida, 0.63 mL Tris 1 M pH 6.8, 
0.05 mL SDS 10%, 0.05 mL persulfato 10% y 0.005 mL de TEMED). Para cada pozo 
se cargó 100 μg/μL de proteína cuyo tratamiento previo fue: realizar la dilución 
necesaria para la concentración con solución reguladora RIPA, añadir 1/5 del 
volumen de solución Loading