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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES-ZARAGOZA BIOLOGÍA EXPERIMENTAL ESTUDIO DEL EFECTO DE 3 ÓXIDOS DE VANADIO SOBRE LA PROGRESIÓN DEL CICLO CELULAR: ¿MECANISMO DIRECTO Ó INDIRECTO? TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: DOCTOR EN CIENCIAS PRESENTA: M. EN C. RODRIGO ANÍBAL MATEOS NAVA TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: DR. MARIO AGUSTÍN ALTAMIRANO LOZANO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA, UNAM COMITÉ TUTOR: DRA. TERESA IMELDA FORTOUL VAN DER GOES FACULTAD DE MEDICINA, UNAM COMITÉ TUTOR: DR. JOSÉ MIGUEL BETANCOURT RULE UAM-IZTAPALAPA CIUDAD DE MÉXICO. MAYO, 2017. UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Ciencias Biológicas Lic. Ivonne Ramírez Wence Directora General de Adminlstracl6n Escolar, UNAM Pr ••• nt. COORDINACiÓN Me permito informar a usted que el subcomilé ele BioiOgla E~penmental y BiomedtCina del Posgrado en Ciencias Biológicas, en su seSKm ordinaria del dla 13 de lebref'o cie 2017, aprobó el Jurado para la ptesentaaOn del e~amen para 00tenef el grado de DOCTOR EN CIENCIAS del alumno, MATEOS NAVA RODRIGO ANiBAl con nUmero de cuenla 92019809 con la testS titulada "ESTUDIO OEl EFECTO DE 3 ÓXIDOS DE VANADIO SOBRE LA PROGRESIÓN DEL CICLO CELULAR : ¿MECANISMO DIRECTO Ó INDIRECTO?", bajo la dirección del Tutor Principal: DA.. MARIO AGUSTIN AL TAMIRANO lOZANO: Presidente: ORA. SANORA LUZ GOMEZ AAROYO Vocal. ORA. MARIA GUADALUPE ANTONIA PALOMINO Y HASBACH Secretario ORA. TERESA IMELCA FQRTOUL VAN OER GOES Suplenle. DA. JUAN JOS¡: RODRIGUEZ MERCADO Suplente: DA. EOELMIRO SANTIAGO 050010 &n Olro J*'1lCullr, mi as grito enVllrle un cordlll salido ATENTAMENTE · POR MI RAZA HABLARA EL ESPIRITU~ Có UniverUanl, ed, M~" • 21 oe .br~ de 2017 ORA. MARIA DEL CORO ARIZMEJ\loí ARRIAGA COORDINADORA DEL PROGRAMA e e p Exp&dlente del (11) interesado (a) t."idltd cStt I'ootc'rada . ~ d~ ""'JI1ldo ~" c;"ociaJ Biol&,~ tdificio o. lu. PiMI, Ci"""uo .... """~ .......... CeI. Uon"'r" ........ n.. ..... ...:K,n ~ C.P LW!tIO M~ nF. T"I. !lfi2J 700'2 b .. p:lIpo: ..... I ...... , .......... n .... ..... . Agradecimientos Al Posgrado en Ciencias Biológicas, UNAM. Al Programa de Becas para Estudios de Posgrado del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo económico recibido, número de becario 210454. Al proyecto DGAPA-PAPIIT UNAM IN224916 para la realización del trabajo. Al Dr. Mario Agustín Altamirano Lozano y a los miembros del Comité Tutoral, Dra. Teresa Imelda Fortoul van der Goes y Dr. José Miguel Betancourt Rule por todos sus comentarios y enseñanzas para la mejora de este trabajo. A los miembros del jurado Dra. Sandra Luz Gómez Arroyo Dra. María Guadalupe Antonia Palomino y Hasbach Dra. Teresa Imelda Fortoul van der Goes Dr. Edelmiro Santiago Osorio Dr. Juan José Rodríguez Mercado Por sus observaciones que enriquecieron el presente trabajo. En especial al Dr. Mario por permitirme formar parte de esta Unidad. A los Doctores Juan José y Lucy por todos sus consejos para llevar a buen término este proyecto. Al Dr. Arturo Valle Mendiola por el apoyo para la estandarización de la técnica de Western Blot. A la Biól. Guadalupe Gómez García por su asistencia técnica en la adquisición de datos del Citómetro de Flujo. A la Maestra Verónica Martínez Zarco por su apoyo en la realización de las pruebas. Este trabajo fue desarrollado en la Unidad de Investigación en Genética y Toxicología Ambiental de la Facultad de Estudios Superiores-Zaragoza, UNAM. Dedicatorias A mi madre y hermano (Petra y Augusto), ya que éste trabajo es el resultado de todas las platicas que tuvimos y en donde quiera que se encuentren me siguen apoyando y dando sus consejos. A mi padre Lázaro por su cariño y consejos que como él dice son de amigos más que de padre a hijo. A Lulú, Misa, Leti, Lili, Omar, Mari, Sandi, Lore y todos los sobrinos por su apoyo incondicional, los quiero. A todos los miembros de la Unidad de Investigación en Genética y Toxicología Ambiental que hacen ameno el trabajo en el laboratorio, gracias por su apoyo. Índice 1. Resumen 1 2. Abstract 3 3. Introducción 5 3.1. Vanadio 5 3.2. Ciclo celular 8 3.3. Control del ciclo 9 3.3.1. Fase G1 10 3.3.2. Fase S 11 3.3.3. Fase G2/M 11 3.4. Inhibidores del ciclo 12 3.5. Efectos de los compuestos de vanadio sobre el ciclo celular 14 3.6. Separación e identificación de proteínas 16 4. Planteamiento del problema 17 5. Hipótesis 18 6. Objetivos 18 6.1. General 18 6.2. Particulares 18 7. Materiales y métodos 19 7.1. Separación de linfocitos de sangre periférica 19 7.2. Tratamientos 19 7.3. Viabilidad 19 7.4. Análisis de la proliferación celular 20 7.5. Evaluación del contenido de ADN en el ciclo celular 21 7.6. Extracción y análisis de las proteínas p21, p53 y CDC25C 21 7.7. Análisis estadístico 23 8. Resultados 24 8.1. Efecto de los óxidos de vanadio sobre la viabilidad 24 8.2. Efecto del trióxido de vanadio sobre la proliferación celular 24 8.3. Efecto del trióxido de vanadio sobre el contenido de ADN en las diferentes fases del ciclo celular 29 8.4. Efecto del tetraóxido de vanadio sobre el contenido de ADN en las diferentes fases del ciclo celular 31 8.5. Efecto del pentóxido de vanadio sobre el contenido de ADN en las diferentes fases del ciclo celular 33 8.6. Efecto de los óxidos de vanadio sobre los niveles de las proteínas p21, p53 y CDC25C 35 8.6.1. Efecto del trióxido de vanadio 35 8.6.2. Efecto del tetraóxido de vanadio 38 8.6.3. Efecto del pentóxido de vanadio 40 9. Discusión 43 9.1. Viabilidad 43 9.2. Efecto del trióxido de vanadio sobre la proliferación celular de linfocitos humanos 44 9.3. Efecto de los óxidos de vanadio sobre el ciclo celular 47 9.4. Efecto de los óxidos de vanadio sobre los niveles de las proteínas p21, p53 y CDC25C 48 10. Conclusiones y Comentarios 53 11. Referencias 54 12. Anexos 66 Lista de abreviaturas Compuestos de vanadio con estado de oxidación 3+ V2O3 trióxido de vanadio VCl3 tricloruro de vanadio Con estado de oxidación 4+ V2O4 tetraóxido de vanadio VOSO4 sulfato de vanadilo (VO(aca)2) Bisacetilacetonato de vanadilo Con estado de oxidación 5+ V2O5 pentóxido de vanadio NaVO3 metavanadato de sodio Na3VO4 ortovanadato de sodio NH4VO3 metavanadato de amonio AC Aberrraciones Cromosómicas ADN Ácido desoxirribonucleico ARN Ácido ribonucleico CDC25C Ciclo de División Celular 25 isoforma C Cdk Cinasa dependiente de ciclina CF Citometría de Flujo DE Desviación Estándar ERO Especies Reactivas del Oxígeno E2F Factor de transcripción que se une al gen E2 ICH Intercambio de Cromátidas Hermanas IM Índice Mitótico IR Índice de Replicación MAPK Proteína Cinasa Activadora de Mitógenos SPC Sepración Prematura de las CromátidasTPC Tiempo Promedio de Crecimiento celular PCNA Antígeno Nuclear de Células en Proliferación pRB Proteína del Retinoblastoma 1 1. Resumen El vanadio se encuentra ampliamente distribuido en la Tierra y es liberado al ambiente por causas naturales o antropogénicas como la quema de combustibles fósiles; sus óxidos son los principales compuestos liberados a la atmósfera los cuales se acumulan en el suelo y el agua, lo que resulta en la constante exposición de los organismos a ellos. En estudios in vitro se ha demostrado que los compuestos de este metal interactúan con las moléculas biológicas, en especial aquellas que dependen del ión fosfato, cinasas y fosfatasas, lo que retrasa la proliferación de las células; esto se ha hecho evidente en ensayos citogenéticos previos con los óxidos de vanadio (en estado de oxidación 4+, 5+ y muy poco con 3+) los cuales, en cultivos de linfocitos humanos disminuyen los índices mitótico y de replicación e incrementan el tiempo de proliferación celular; sin embargo, no se conoce en qué fase del ciclo celular actúan estos compuestos ni a qué proteínas alteran para producir dichos efectos. Por tal motivo en el presente trabajo se evaluó el efecto de la administración de trióxido, tetraóxido o pentóxido de vanadio (V2O3, V2O4, V2O5, respectivamente) en concentraciones de 2, 4, 8 o 16 µg/mL a cultivos de linfocitos humanos sobre la proliferación celular, así como en la posible modificación de los niveles de las proteínas que la controlan como p53, p21 y CDC25C, y en el caso del V2O3 si induce daño a los cromosomas. Primero se evaluó el efecto del V2O3 sobre la proliferación y el daño a los cromosomas mediante el ensayo de intercambio de las cromátidas hermanas (ICH) y se obtuvieron los siguientes parámetros: la frecuencia de ICH, la separación prematura de las cromátidas (SPC), el índice mitótico (IM) y el de replicación (IR). Cabe mencionar que se evaluó la viabilidad al inicio y final de todos los tratamientos. En este caso se observó que la administración de V2O3 no modifica la viabilidad ni la frecuencia de los ICH, sin embargo, incrementa la SPC y disminuye tanto al IM como al IR de manera significativa. Con base en lo anterior se puede mencionar que el V2O3 induce efecto genotóxico a nivel centrómero en los linfocitos humanos y tiene efectos citostáticos ya que es capaz de alterar la progresión del ciclo celular. 2 Posteriormente, se determinó en cuál fase del ciclo se detienen las células evaluando el contenido de ADN por citometría de flujo y a continuación se determinaron los niveles de las proteínas mediante la técnica de “Western blot”. Con respecto al contenido de ADN no presentan cambios significativos en las fases de los grupos tratados en comparación con el grupo sin tratamiento, en cuanto a los niveles de p53, p21 y CDC25C existe incremento en las concentraciones más altas, 8 y 16 µg/mL. Si bien de manera citogenética se presenta retraso en la proliferación, no se observó que sea en alguna fase en específico, aunque es probable que el aumento en los niveles de p53 y p21 por un lado, sean los responsables de esto, ya que no son específicas de una fase, además de que haya otras moléculas involucradas y por el otro, que a su vez se dé la señal por parte de CDC25C de que proliferen y esto propicie que no se vea respuesta clara en las fases. 3 2. Abstract Vanadium is a widely distributed metal in the Earth’s surface and is released into the environment by either natural or anthropogenic causes such as fossil fuel burning, and the main compounds consist of vanadium oxides which accumulate in the soil and water, resulting in constant exposure to organism. In vitro assay was demonstrated that vanadium compounds interact with biological molecules, such as protein kinases and phosphatases, which might modify the proliferation of the cells. In previous cytogenetic tests, the oxides of this metal decreased the mitotic and the replicative index and increment the average growth time of human lymphocytes, however, it is not known the mechanism and at what phase of the cell cycle they are or who proteins are responsible for this. Therefore, in this study evaluated if the vanadium trioxide, tetraoxide or pentoxide (V2O3, V2O4 and V2O5, respectively) administrated at human lymphocytes cultures (in concentration of 2, 4, 8, or 16 µg/mL) modify cellular proliferation as well as the levels of the proteins that control it such as p53, p21 and CDC25C, in the case of V2O3 the ability to induce chromosomal damage. First, the effect of V2O3 on the proliferation and chromosomal damage was evaluated by means of the sister chromatid exchange’s test, the following parameters were obtaining: the frequency of sister chromatid exchange (SCE), the premature chromatid separation (PCS), the mitotic and replicative index (MI and RI). At the same time, the cellular viability was evaluated at the end of the culture period. In the results, no change was observed in either the viability or the frequency of SCE; however, a significant increase was observed in the incidence of PCS, and a decrease was observed in both the MI and RI. Therefore, it can be suggested that V2O3 induces a genotoxic effect at the centromere level, indicating that it is a cause of aneuploidy that is capable of altering cell cycle progression. On the other hand, also was determined in which phase of the cell cycle the cells were arrested by the vanadium oxides, evaluating the DNA content by flow cytometry, and then the levels of the proteins p21, p53 and CDC25C were determined by the Western blot technique. The results, shown no change was in the DNA content in 4 anything phase of the cell cycle compared treatment versus control, however, an Increment in the levels of the protein p21, p53 and CDC25C were observed only in the high concentrations. Although, in cytogenetic test the vanadium oxides induced delay in the proliferation, the analysis of DNA does not show that this occurred in a specific phase of the cell cycle; however, the increment in the levels of protein p21 and p53 might be responsible for the delay, since they are not specific of a phase, besides that there are other involved molecules and for other one that in turn of the signal on the part of CDC25C to that they proliferate and this causes that does not see clear response in the phases. 5 3. Introducción Los metales han contribuido en el incremento de la contaminación ambiental, ya sea por sucesos naturales, como las erupciones volcánicas, o de manera antropogénica, por la quema de combustibles fósiles o los procesos industriales, entre otros, lo que ha inducido efectos negativos para el ambiente, así como para la salud humana, ya que estudios epidemiológicos han demostrado que la exposición a ciertos compuestos metálicos (por ejemplo: los del cromo, níquel, vanadio) incrementan el riesgo de desarrollar enfermedades crónico-degenerativas, tales como el cáncer, y es que a diferencia de los compuestos orgánicos, los metales no son degradados por los organismos vivos por lo que tienden a acumularse en los tejidos y órganos del cuerpo. Una característica especial de los metales es el hecho de que siendo esenciales para la vida (tal como el hierro y el cobre) pueden ser tóxicos para la misma, esto dependerá del estado de oxidación en que se encuentren, la forma del complejo, la dosis y el modo de exposición a ellos. Lo anterior ha llevado a desarrollar estudios que evalúen la interacción de éstos con las moléculas biológicas o en los procesos metabólicos y genéticos, así como en las vías de transducción de señales. 3.1. Vanadio El vanadio(V) es un metal que está ampliamente distribuido en la Tierra y dado que se encuentra en más de 50 minerales se le considera como el vigésimo segundo elemento más abundante en la corteza terrestre con una concentración promedio de 150 g/tonelada (Moskalyk y Alfantazi, 2003). Es clasificado como el primer elemento del grupo 5 (junto con el niobio, el tantalio, y el dubnio) de la tabla periódica de los elementos, cuenta con número atómico 23, peso atómico 50.95 g/mol y puntos de fusión y ebullición de 1,950°C y 3,600°C, respectivamente (IUPAC, 2007). Puede manifestar diferentes estados de oxidación que van desde 1- hasta 5+, y en presencia de agentes oxidantes predomina el estado 5+ mientras que con agentes reductores es el estado 4+. En los fluidos extracelulares del cuerpo humano la forma que predomina es la 5+, mientras que la 4+ lo hace en los fluidos intracelulares. Los compuestos de V 6 ingresan a las células utilizando los canales aniónicos o atravesando la membrana celular (Barceloux, 1999; WHO, 2001; IARC, 2006; Rodríguez-Mercado y Altamirano- Lozano, 2006). Las concentraciones de V registradas en el suelo varían desde los 3 hasta los 310 µg/g, no obstante, estos valores se pueden incrementar a más de 400 µg/g en las áreas contaminadas; con respecto a la cantidad que está presente en el agua, la concentración depende mucho de la localización geográfica, observándose que en aguas continentales va desde 0.2 a más de 100 µg/L y en los océanos de 0.2 a 29 µg/L, siendo el fondo del océano el principal depósito de V. De igual manera, la concentración en los combustibles fósiles va desde 1 hasta 1500 mg/Kg (WHO, 2000). Se ha observado que el V contribuye al incremento de la contaminación ambiental ya sea de forma natural, originada por las erupciones volcánicas o de manera antropogénica, por procesos industriales y la quema de combustibles donde este metal está presente (Barceloux, 1999; Huang et al., 2015). Fortoul et al., (2002), observaron en autopsias realizadas a personas que vivieron en la Ciudad de México en la década de los noventa que la concentración de V presente en el pulmón aumentó en comparación con los que vivieron en la década de los sesenta, lo que es un indicador de que las concentraciones de V en el ambiente se incrementaron en función del incremento de la contaminación ambiental. Los óxidos de V presentes en las partículas de menos de 10 µm de diámetro de las cenizas y polvos, que se encuentran en el ambiente, están asociados con efectos adversos a la salud humana, ya que se ha demostrado que la exposición crónica por inhalación en ambientes laborales induce cambios en los órganos respiratorios y el desarrollo de enfermedades como bronquitis, rinitis, laringitis, faringitis, y en algunos casos produce alteraciones del ritmo cardiaco (WHO, 2000; Rodríguez-Mercado y Altamirano-Lozano, 2006; Ehrlich et al., 2008). Sin embargo, una de las fuentes de V a la cual la población en general está expuesta son los alimentos, estimándose que la ingesta promedio dentro de la dieta es de 13 a 15 μg de V por día, aunque algunos 7 autores mencionan que alcanza valores de 60 μg/día (Rodríguez-Mercado y Altamirano- Lozano, 2006; ATSDR, 2012). En ambientes laborales la principal vía por la cual se está expuesto es la aérea (ATSDR, 2012). Con base en lo anterior, se ha demostrado que las principales vías por las cuales el V ingresa al organismo es por inhalación, vía oral y epidermis (sólo si son compuestos orgánicos). Una vez dentro del organismo, se distribuye a través de la sangre por proteínas (albumina y transferrina) hasta los órganos y tejidos, observándose que en el caso de los huesos, los riñones, el cerebro, el hígado, los testículos, los pulmones y el corazón, el V tiende a acumularse, lo que puede incrementar el desarrollo de enfermedades crónico degenerativas tales como el cáncer (Sabbioni et al., 1980; Barceloux, 1999; Mukherjee et al., 2004; Rodríguez-Mercado y Altamirano-Lozano, 2006; Rehder, 2013). La distribución del V en el interior de las células de estos órganos muestra que el núcleo es el organelo que retiene la mayor cantidad de V en cualquiera de sus tres estados de oxidación (3+, 4+ o 5+), seguido de la mitocondria (Sabbioni et al., 1978, 1991; Sakurai, 1994), por lo que es capaz de interactuar con las diferentes moléculas biológicas como el ácido desoxirribonucleico (ADN), las proteínas, los aminoácidos, los nucleótidos y los azúcares y de esta forma ejercer efectos citotóxicos y genotóxicos (Macara 1980; Rodríguez-Mercado y Altamirano-Lozano 2006). En el organismo, el V puede comportarse de dos maneras, ya sea como inhibidor o estimulador de diversas enzimas, entre las que se encuentran: las cinasas, las ribonucleasas y las fosfatasas, entre otras; las cuales controlan la proliferación celular. Por ejemplo, los metavanadatos, se comportan como inhibidores selectivos de las proteínas fosfotirosil fosfatasas, específicamente de las fosfotirosinas de la membrana celular en células A-431 (Swarup et al., 1982), también inhibe la actividad de la Na+-K+ ATPasas en fibroblastos uniéndose al sitio de hidrólisis en el lado citoplasmático de la enzima (Macara et al., 1980), además los compuestos orgánicos de V han demostrado que inhiben la Ca2+-ATPasa en el retículo sarcoplásmico del músculo esquelético 8 (Aureliano et al., 2008). Por otra parte, el V puede ejercer efectos sinérgicos con algunas moléculas tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) lo que lleva al incremento de la actividad mitogénica de este factor estimulando la síntesis de ADN, así como de nucleótidos y proteínas (Carpenter, 1981; Smith, 1983; Tojo et al., 1987). En estudios in vitro e in vivo se ha demostrado que los compuestos de V tienen efectos genotóxicos que son evidentes por la generación de rompimientos de cadena sencilla del ADN (Rojas et al., 1996; Ivancsits et al., 2002; Rodríguez-Mercado et al., 2011), el incremento en la frecuencia de intercambio de cromátidas hermanas (Rodríguez-Mercado et al., 2003), la inducción de aberraciones cromosómicas numéricas (Owusu-Yaw et al., 1990; Roldán y Altamirano 1990; Migliore et al., 1993; Mailhes et al., 2003; Attia et al., 2005) y la formación de micronúcleos (Migliore et al., 1993; Zhong et al., 1994; Ciranni et al., 1995; Ehrlich et al., 2008). Asimismo, los óxidos de V pueden afectar el proceso normal de división celular, esto evidenciado por la disminución en los índices mitótico (IM) y de replicación (IR) (Roldán y Altamirano, 1990). Sin embargo, los mecanismos por los cuales ejerce estos efectos todavía no han sido bien comprendidos. 3.2. Ciclo celular Los organismos multicelulares requieren un apropiado control de la división y la diferenciación celular para coordinar las múltiples funciones que desarrollan los tejidos, esto supone la adecuada regulación de la transducción de señales mitógenas a la maquinaria bioquímica que controla la duplicación de la molécula del ácido desoxirribonucleico (ADN) y su apropiada segregación (Malumbres y Barbacid, 2001; Malumbres, 2011), incluso modular la senescencia y la muerte celular programada (Hershko, 1997; Burhans y Heintz, 2009). De tal manera que el ciclo de división celular es el proceso por el cual las células monitorean las condiciones para poder llevarlo a cabo, activando la maquinaria bioquímica para la replicación del ADN y la correcta segregación de los cromosomas, 9 además de regular los pasos para generar dos células hijas genómicamente estables (Malumbres, 2011). El ciclo celular está formado por cuatro fases: G1, S, G2 y M. En la fase G1 (o Gap 1) los cromosomas están constituidos por una sola cromátida, es un período de actividad química intensa en donde aumenta el tamaño de la célula y seda la síntesis de ácido ribonucleico (ARN) y proteínas, las mitocondrias y los centriolos se duplican, mientras que el retículo endoplásmico incrementa su tamaño; en la fase de S (Síntesis) se lleva a cabo la duplicación del ADN, se sintetizan las histonas y las proteínas asociadas a él, al término de la misma el núcleo contiene el doble de proteínas nucleares y de ADN; después de esto las células entran a la fase G2, donde continúan su crecimiento y se prepara para la mitosis, al mismo tiempo que se revisa que la replicación se haya completado; finalmente la fase de M (Mitosis) en la cual se da la división nuclear, los cromosomas replicados son segregados equitativamente en núcleos separados y ocurre la citocinesis para formar dos nuevas células (Blomen y Boonstra, 2007; Malumbres, 2011). 3.3. Control del ciclo La progresión del ciclo celular está controlada por la constitución secuencial de complejos de proteínas, los cuales se encuentran conformados por subunidades reguladoras y catalíticas conocidas como ciclinas y cinasas dependientes de ciclina (Cdk por sus siglas en inglés), respectivamente. Las ciclinas se sintetizan y degradan durante las fases del ciclo, estas activan a las Cdk de manera específica, estableciendo los complejos ciclina/Cdk (Johnson y Walker, 1999; Burhans y Heintz, 2009). Todas las ciclinas contienen una región común llamada caja de ciclinas, que es usada para unirse y activar a las Cdk, cuya secuencia de aminoácidos, la mayoría hidrofóbicos, tiene cierto grado de conservación entre ellas (Matsushime et al., 1994; Fu et al., 2004; Möröy y Geisen, 2004). 10 En células de mamífero se han identificado nueve Cdk y por lo menos 16 ciclinas, sin embargo, no todas actúan en el control del ciclo, otras de sus funciones incluyen la regulación de la transcripción, la reparación del ADN, la diferenciación celular y la apoptosis (Morgan, 1997; Johnson y Walker, 1999; Shackelford et al., 1999; Malumbres y Barbacid, 2001 y 2005, Malumbres, 2011). 3.3.1. Fase G1 De manera normal en las células de mamífero las ciclinas D y E forman complejos con las Cdk 2, 4 y 6, que son requeridas para la progresión a través de la fase G1 a la S, existe evidencia de que el complejo ciclina A/Cdk2 puede tener un papel en la progresión G1/S aunque esto todavía no es concluyente (Bertoli et al., 2013). Las ciclinas D son las primeras en ser sintetizadas (en la fase G1) y pueden estimular a las células que se encuentran en G0 a reiniciar el ciclo celular; a diferencia de muchas otras ciclinas, las D no oscilan durante el ciclo, más bien, sus niveles son controlados por la presencia de factores de crecimiento (mitógenos) las cuales a su vez se asocian para activar a las Cdk4 y Cdk6 (Johnson y Walker, 1999; Bertoli et al., 2013). La función de estos complejos es de fosforilar diferentes moléculas, principalmente proteínas, en intervalos de tiempo preciso para que la división celular se lleve a cabo de manera ordenada. Un sustrato muy importante para ellos es la proteína del retinoblastoma (pRB), que participa en el mecanismo que mantiene la división celular en G1 si es que existe una lesión en el ADN. La pRB hipofosforilada se une al factor de transcripción E2F, y mientras se mantienen unidos el E2F no puede promover la transcripción de los genes necesarios para la síntesis de ADN (los de la ADN polimerasa, la ribonucleótido reductasa y otras proteínas) así como de la ciclina E. En este estado el ciclo celular no puede pasar de G1 a S, sin embargo, éste mecanismo de bloqueo se elimina cuando la pRB es fosforilada primero por el complejo ciclina D/Cdk4/Cdk6 y posteriormente por ciclina E/Cdk2, lo que ocurre como respuesta a una señal para que el ciclo celular continúe (Johnson y Walker, 1999; Shackelford et al., 2000; Bertoli et al., 2013). 11 A través de la liberación del E2F, la ciclina E es la siguiente que se induce durante la progresión de la fase G1, ésta se asocia y activa la Cdk2 ambas se requieren para la transición de las células de la fase G1 a la S, también participan en mantener el estado fosforilado de la pRB y de esta manera mantiene activo el E2F. Al igual que otros complejos, la ciclina E/Cdk2 fosforila la histona H1, que tiene una actividad importante durante la replicación del genoma (Johnson y Walker, 1999). Asimismo, la familia de factores de transcripción E2F regula los genes de la ciclina A que forma un complejo con la Cdk2, el cual es esencial para la progresión del ciclo celular durante la fase S (Assoian, 1997; Möröy y Geisen, 2004). 3.3.2. Fase S En esta etapa se da la síntesis de la información genética nuclear en las células somáticas eucariotas. La fase está controlada por el complejo ciclina A/Cdk2 que se encarga de que la progresión se lleve a cabo de manera ordenada (Mateo et al., 2010). Como se mencionó anteriormente, el factor E2F induce la expresión de la ciclina A la cual se comienza a acumular durante la fase S y es degradada por el proteosoma durante la mitosis antes de la metafase. Dentro de las funciones que tiene esta ciclina es la de promover la replicación del ADN y al mismo tiempo asegurar que solo se dé una vez por cada ciclo celular, esto lo hace principalmente inactivando, mediante fosforilación, el complejo E2F-1/DP (Yam et al., 2002; Mateo et al., 2010). Fallas en la inactivación da como resultado una actividad persistente de E2F e induce a la apoptosis vía p19arf y p53 (Miele, 2004). 3.3.3. Fase G2/M Durante la fase G2, las células revisan la estructura del ADN y se preparan para la mitosis, si se detecta algún daño o que no se ha replicado correctamente entonces se desencadena una cascada de proteínas cinasas (Chk1 y Chk2) que realizan la 12 inactivación de las Cdk requeridas para la siguiente fase, lo que resulta en un retraso en G2 (Miyazaki y Arai, 2007; Neganova et al., 2014). El complejo ciclina B/Cdk1 es el encargado de realizar la progresión de la fase G2 hasta la metafase mitótica en las células eucariotas y al igual que los otros complejos está regulada por procesos de fosforilación, ya sea para activarlo o inhibirlo. De manera específica la fosforilación de Cdk1 por Wee1 o de Myt1 inhibe su función haciendo que se acumule ciclina B/Cdk1 en esta fase, por otra parte, la desfosforilación realizada por la proteína fosfatasa CDC25C lo activa, una vez que sucede esto el complejo por sí mismo inactiva a Wee1 y Myt1 y estimula a CDC25C, y así la célula puede avanzar a la fase M (Hoffmann, 2000; Boutros et al., 2007; Kiyokawa y Ray, 2008). El complejo ciclinaB/Cdk1 activado tiene diferentes sustratos que promueven la entrada y progresión a través de la mitosis, entre éstos se incluyen a las láminas nucleares, las proteínas cinésinas y las de unión a microtúbulos, las condensinas y las de la matriz de Golgi, todas éstas son importantes para el rompimiento de la envoltura nuclear, la separación del centrosoma, el huso mitótico, la condensación de los cromosomas y la fragmentación del aparato de Golgi, respectivamente (Nigg, 2001; Miele, 2004; Brown et al., 2007; Wang et al., 2014). 3.4. Inhibidores del ciclo Bajo condiciones normales el ciclo celular procede sin interrupciones, sin embargo, si la célula recibe un daño en la información genética, ésta es capaz de detenerse en determinadas fases del ciclo, reparar el daño y continuar, esto lo hace gracias a los censos que se llevan a cabo en los diferentes puntos de control (del inglés “checkpoints”), los cuales existen a través de todo el ciclo (Shackelford et al., 2000). El “checkpoint” en la fase G1 depende del incremento en la expresión y activación de los productos del gen p53, considerado un gen supresor de tumores ya que se ha observado que en más del 50% de los tumoreshumanos se encuentra con mutaciones 13 (Shackelford et al., 2000). Cuando las proteínas cinasas ATM y ATR detectan lesiones en el ADN activan a p53 para que actúe como factor de transcripción que estimule la síntesis de la proteína p21 (Cip1/Waf1), la cual se une directamente a los complejos ciclina/Cdk inhibiendo a las Cdk. Al parecer se necesitan dos o más moléculas de p21 para inhibir la actividad cinasa de los complejos ciclina E/Cdk2, ciclina D1/Cdk4/6 o ciclina A/Cdk2 (Cistulli y Kaufmann, 1998; Shackelford et al., 2000; Moore, 2013). En presencia de p21, pRB permanece hipofosforilada y unida a E2F bloqueando la actividad de este factor de transcripción, haciendo que el ciclo celular se detenga en G1, esto da tiempo a la célula para que repare el ADN antes de entrar a la fase S evitando así la transferencia del genoma defectuoso a una o a ambas células hijas (Foster et al., 2010). Si bien p21 es un efector de p53 no quiere decir que sea dependiente de éste, ya que además de asociarse con los complejos ciclina/Cdk, p21 también se asocia con el antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA por sus siglas en inglés) y es un mecanismo adicional que puede inhibir la síntesis del ADN (Vidal y Koff, 2000). Además de p21 existen otras proteínas inhibidoras de Cdk (CKI, por sus siglas en inglés). De las cuales, en células de mamíferos se han identificado dos tipos, las familias Cip/Kip e Ink 4, que tienen un mecanismo específico para cada tejido por el cual la progresión del ciclo celular puede ser detenido en respuesta a señales intracelulares y extracelulares. La familia Cip/Kip incluye a las proteínas p21, p27 y p57, que inhiben principalmente a los complejos ciclina-Cdk2, -Cdk4 y -Cdk6 involucrados en el control de la fase G1 y la transición a S (G1/S). La familia Ink 4 contiene cuatro miembros (p15, p16, p18 y p19) los cuales inhiben de manera específica a los complejos ciclina D/Cdk4, ciclina D/Cdk6 (Morgan, 1997; Vidal y Koff, 2000; Malumbres, 2011). Por otra parte, el control de las cinasas (Cdk 2, 4, y 6) también es afectado por otras vías: la acumulación de las ciclinas, la manera en la cual está ensamblado el complejo ciclina/Cdk, o por eventos específicos de fosforilación y desfosforilación (Moore, 2013). 14 Como se mencionó anteriormente cuando existe daño en el ADN, la proteína p53 coordina la respuesta celular que lleva a la reparación del mismo o a la eliminación de las células con lesiones potencialmente mutagénicas u oncogénicas ya sea por la detención del ciclo celular o por medio de la apoptosis, por lo que se le considera una de las proteínas más importantes supresora de tumores (Blattner, 2008). Esta proteína es un factor de transcripción con una secuencia especifica que se une al ADN y de esta manera activa o reprime un gran número de genes los cuales se categorizan de acuerdo a su función: aquellos que detienen el ciclo celular, los que reparan el ADN y los que regulan la respuesta apoptótica (Woods y Vousden, 2001). En células normales, es poco abundante y se encuentra en estado latente, para su activación requiere del incremento en sus niveles y de la modificación post- transcripcional de las moléculas existentes ya sea por acetilación, fosforilación, metilación, ubiquitinación o sumoilación. Ambos eventos, el incremento y la modificación, son procesos independientes (Woods y Vousden, 2001; Blattner, 2008). Una vez que p53 está activada se une al ADN para lo cual requiere de zinc, lo que hace que la proteína sea especialmente susceptible a la inactivación por metales de transición ya que se ha observado por ejemplo en el caso del cadmio, que éstos pueden sustituir al zinc (Méplan et al., 1999; Joerger y Fersht, 2008). Además de que compuestos de arsénico, cadmio, cobalto, cromo, hierro, níquel y vanadio, entre otros, pueden influir en la expresión y activación de p53 generalmente por la inducción de especies reactivas de oxígeno (ERO). Esta interacción metal-p53 depende de la composición química y el estado de oxidación del metal (Harris y Shi, 2003; Leonard et al., 2004). 3.5. Efectos de los compuestos de vanadio sobre el ciclo celular La interacción de los compuestos de V con las proteínas que controlan el ciclo celular tiene un comportamiento antagónico, por una parte, puede detener la progresión 15 del ciclo y por otra favorecerla. En estudios realizados en líneas celulares de la epidermis de ratón JB6 P+ (C141), se observó que la administración de metavanadato de sodio (NaVO3 en estado de oxidación 5+) promueve la entrada de las células a la fase S debido a la activación de la proteína cinasa Akt la cual fosforiló a la proteína pRB provocando la liberación del factor de transcripción E2F y de esta manera se incrementaron los niveles de las ciclinas E y A, necesarias para la entrada y progresión de la fase S (Zhang et al., 2004). Por otra parte, algunos compuestos de V pueden detener la progresión del ciclo celular de una manera dosis y tiempo dependiente. En líneas celulares de epitelio de pulmón humano A549, la administración de NaVO3 aumentó la formación de peróxido de hidrógeno (H2O2) lo que provocó que las células se detuvieran en la fase G2/M debido a que se incrementaron los niveles de la proteína p21 y Chk1, así como la inactivación del complejo ciclina B/Cdc 2; de igual manera en líneas celulares C141, se elevaron los niveles de p53 y p21 lo cual hizo que las células se detuvieran en la fase S. En células JB6 la generación de H2O2 por parte del V llevó a la activación de p53 lo que originó la muerte de las células por medio de apoptosis (Huang et al., 2000; Zhang et al., 2001 y 2002). Si bien se ha relacionado que la detención del ciclo celular por parte de los compuestos de V se debe a la generación de H2O2, Fu et al., (2008), observaron que al administrar bisacetilacetonato de vanadilo (estado de oxidación 4+) a células de hepatoma humano HepG2, este fue capaz de detenerlas en la fase G1/S sin que hubiera aumento en la formación de H2O2 por lo que proponen que el V por sí solo es capaz de interactuar con las moléculas encargadas de la progresión del ciclo celular. Con respecto al estado de oxidación 3+ existen pocos estudios acerca de su efecto sobre las moléculas que controlan el ciclo celular, la administración de 0.1 mM de cloruro de V (VCl3) a cultivos lifocitos T colaboradores (Jurkat) modificó la proliferación lo cual está relacionado con la inducción de daño al ADN y apoptosis (Caicedo et al., 2008). 16 3.6. Separación e identificación de proteínas Para aislar una proteína en particular de todas las que están en la célula se requiere el uso de métodos combinados para primero separarlas del conjunto de moléculas presentes, y posteriormente, detectar la proteína en específico. Una de las técnicas empleadas para realizar la separación y análisis de estas macromoléculas, así como de los ácidos nucleicos es la electroforesis, la cual se puede definir como la migración de iones cargados en un campo eléctrico (Stewart y Ebel, 2000; Lodish et al., 2004). La separación electroforética de proteínas es desarrollada normalmente en geles de poliacrilamida (PAGE por sus siglas en inglés “polyacrylamide gel electrophoresis”), debido a que es un método sencillo y sensible para analizarlas, ya que reúne una serie de propiedades idóneas, como son: trasparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de compuestos químicos (Lomonte, 2007). Entre las diferentes técnicas de PAGE la más empleada es aquella en la cual las proteínas son expuestas al detergente iónico duodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) para formar complejos desnaturalizados, cargados negativamente. En estos complejos la cadena proteica es distendida y solubilizadapor el detergente y su relación final carga/masa queda constante para las distintas proteínas, de esta manera van a ser separadas en el gel poroso fundamentalmente con base en sus diferencias de peso molecular (PM) a menor tamaño, mayor movilidad de la proteína, caso contrario en aquellas que tienen un mayor tamaño, lo que va a ser reflejado en las diversas bandas que se observan en el gel (García-Pérez, 2000; Lodish et al., 2004, Lomonte, 2007). Sin embargo, la purificación de una proteína, o cualquier otra molécula, requiere de un ensayo específico que pueda detectar la molécula de interés en las bandas del gel, basándose en sus características distintivas: la habilidad de unirse a un ligando en particular, a catalizar una reacción, o a ser reconocida por un anticuerpo específico. El método más empleado ya que combina el poder de separación de la electroforesis en gel, la especificidad de los anticuerpos, y la sensibilidad de un ensayo enzimológico, es el de Western Blotting también conocido como inmunobloting. Éste permite la 17 transferencia de las proteínas separadas en SDS-PAGE a una membrana adsorbente, lo que forma una réplica exacta de las bandas del gel, y con ayuda de anticuerpos específicos, se puede detectar y caracterizar una proteína específica, en especial aquellas que son poco abundantes (Lodish et al., 2004; Kurien y Scofield, 2006) 4. Planteamiento del problema Si bien en diversos estudios se ha demostrado que el V y sus compuestos son genotóxicos y alteran la proliferación celular, se conoce poco acerca de sus interacciones con el ADN y sus mecanismos de acción, en donde se han empleado líneas celulares y muy poco los cultivos primarios, por lo que resulta interesante el uso de métodos combinados para determinar los posibles mecanismo por los cuales los óxidos de este metal modifican la proliferación celular de cultivos de linfocitos humanos. 18 5. Hipótesis En líneas celulares se ha observado que los compuestos de vanadio pueden inducir algún tipo de daño al ADN y alterar la proliferación celular, por lo tanto, si se administra trióxido, tetraóxido ó pentóxido de vanadio a cultivos de linfocitos humanos, éstos serán capaces de modificar los niveles de las proteínas que controlan el ciclo celular lo cual llevaría a la detención del mismo. 6. Objetivos 6.1. General Identificar el o los mecanismos por los cuales los óxidos de vanadio modifican la proliferación celular de linfocitos humanos tratados in vitro. 6.2. Particulares -Evaluar si la administración de trióxido, tetraóxido ó pentóxido de vanadio a cultivos de linfocitos humanos modifica la viabilidad celular. -Evaluar el efecto del trióxido, tetraóxido ó pentóxido de vanadio sobre la proliferación celular, a diferentes concentraciones en linfocitos humanos tratados in vitro. -Analizar el efecto de la administración de trióxido, tetraóxido o pentóxido de vanadio sobre las fases del ciclo celular de linfocitos humanos. -Estudiar la expresión de las proteínas p21, p53 en los cultivos de linfocitos humanos después de la administración del trióxido, tetraóxido ó pentóxido de vanadio. -Analizar el nivel de la proteína CDC25C en los cultivos de linfocitos tratados con trióxido, tetraóxido o pentóxido de vanadio, como una posible vía alterna de detención del ciclo celular. 19 7. Materiales y métodos 7.1. Separación de linfocitos de sangre periférica Para llevar a cabo los diferentes protocolos lo primero que se realizó fue obtener los linfocitos humanos a partir de sangre de tres donadores sanos por medio de punción venosa con jeringas previamente heparinizadas, la sangre se colocó en tubos de centrífuga cónicos que contenían 5 mL de Histopaque®-1077 (Sigma-Aldrich, Inc. S. Louis MO EUA) y se centrifugaron 30 min a 2000 rpm, al final se obtuvieron los linfocitos y se lavaron con solución amortiguadora de fosfatos salina (PBS por sus siglas en inglés, GIBCO, Invitrogen Corporation, NY EUA) y posteriormente se determinó la densidad celular empleando la cámara de Neubauer. 7.2. Tratamientos Una vez obtenido el número de células se sembraron alrededor de 3x106 en 5 mL de medio de cultivo PB-MAX Karyotyping de GIBCO, el cual contiene fitohemaglutinina, veinticuatro horas después se les administró una de las diferentes concentraciones (2, 4, 8 ó 16 μg/mL) ya sea de trióxido (V2O3 CAS No. 1314-34-7, 99.99% de pureza), tetraóxido (V2O4 CAS No. 12036-21-4, 99% de pureza), o pentóxido de vanadio (V2O5 CAS No. 1314-62-1, 99.99% de pureza) de Sigma-Aldrich, y se incubaron por 48 h. 7.3. Viabilidad La viabilidad celular fue evaluada al inicio y final de cada tiempo de exposición, siguiendo el método de Strauss (1991), se colocaron 10 μL de muestra con 10 μL de solución de mezcla de colorantes (0.025 μg/μL de carboxifluoroesceína y 0.125 μg/μL de bromuro de etidio 1:1 ambos de Sigma-Aldrich) y se incubaron a 37 °C por 10 min, luego se realizaron tres lavados con PBS centrifugándolos a 4000 rpm por 4 min, el botón celular fue transferido a un portaobjetos para evaluarse en microscopio de fluorescencia con filtro de excitación de 515-560 nm clasificando 100 células en total tomando en cuenta el número de viables, las cuales presentan fluorescencia de color verde y el de no viables que presentan el núcleo de color rojo. 20 7.4. Análisis de la proliferación celular Para llevar a cabo esta parte se realizó la técnica de tinción diferencial de cromátidas hermanas, la cual se basa principalmente en la incorporación de un análogo de base en la nueva cadena de ADN durante dos ciclos de replicación y su posterior revelado que permite conocer como está progresando el ciclo mediante el análisis de los patrones de coloración de las cromátidas en los cromosomas de células detenidas en metafase (Perry y Wolff, 1974; Rodríguez-Mercado et al., 2003). Por lo que a todos los cultivos además de los tratamientos con V se les agregó 5-bromo-2-desoxiuridina de Sigma- Aldrich (que sustituye a la timina y permite realizar la tinción diferencial), en este ensayo también se tuvo un grupo tratado con mitomicina C (MMC, 0.02 µg/mL) como testigo positivo, 46.5 h después se les administró 0.1 μg/mL de colcemida de GIBCO y se incubaron por 1.5 h más, a continuación se cosecharon centrifugándolos a 1000 rpm por 5 min, e incubaron en 5 mL de solución hipotónica (KCl 0.075M) por 20 min a 37 °C y posteriormente fueron fijados con metanol-ácido acético en proporción 3:1 (ambos de J.T.Baker, Avantor Performance Materials, PA EUA), repitiendo este paso en tres ocasiones, dejando reposar 15, 10 y 5 min en cada uno. Al botón celular se le adiciono 0.5 mL de fijador y se realizaron las preparaciones por goteo en portaobjetos. Veinticuatro horas después las preparaciones se sumergieron en solución doble citrato salina (2XSSC, 0.03M citrato de sodio y 0.3 M cloruro de sodio de J.T.Baker) irradiándolas con luz ultravioleta por 20 min, después en 2XSSC a 55°C por 20 min más y finalmente se tiñeron con solución de Giemsa al 5% y se evaluaron en microscopio de campo claro a 1000X clasificando 100 células en metafase por cada tratamiento de acuerdo al número de ciclos por los que hayan pasado, conforme al patrón de tinción que presentan las cromátidas de los cromosomas: de primer ciclo aquellas metafases que tienen cromosomas con ambas cromátidas fuertemente teñidas (M1); de segundo cuando una cromátida está fuertemente teñida y la otra débilmente (M2); en el caso de metafases de tercer ciclo se encuentran cromosomas con ambas cromátidas débilmente teñidas y otros con tinción similar a las de segundo ciclo (M3). 21 Con la proporción del número de células en los diferentes ciclos se obtuvieron el índice dereplicación (IR) y el tiempo promedio de crecimiento celular (TPC), empleando las siguientes formulas: IR BrdU de presenciaen Horas TPC N M3(3) M2(2) M1(1) IR Horas M3(3)M2(2)M1(1) En estas mismas preparaciones se evaluó el índice mitótico (IM) considerando el número de células que están en metafase de 4000 en total por cada tratamiento, utilizando la siguiente fórmula: totalescélulas 4000 metafases de Número IM Número 7.5. Evaluación del contenido de ADN en el ciclo celular Para analizar en cual fase del ciclo celular en particular los óxidos de vanadio detienen a las células se determinó el contenido de ADN por medio de citometría de flujo (CF) utilizando la técnica de tinción con ioduro de propidio. Al finalizar el tiempo de incubación, las células fueron fijadas con alcohol etílico al 70% frío por 24 h, el cual se retiró para después incubarlas en la solución de tinción (0.1% de Tritón X-100 en PBS más 200 μg/mL de RNasa y 50 μg/mL de ioduro de propidio) por 30 min en obscuridad. El análisis se realizó adquiriendo 10000 núcleos por muestra en el citómetro BD FACSAria™ II (Becton Dickinson and Company, San José CA EUA). Con los datos obtenidos se realizaron los respectivos histogramas en el programa para computadora WinMDI versión 2.9 desarrollado por Joseph Trotter y el porcentaje de células en cada fase se determinó con el programa Cylchred de la Cadiff University. 7.6. Extracción y análisis de las proteínas p21, p53 y CDC25C Esto se llevó a cabo obteniendo sangre por punción venosa de tres donadores de la cual se separaron los linfocitos y se realizó su conteo para conocer la densidad por mL. Se sembraron alrededor de 1 X 107 células por cada cultivo y se incubaron por 48 h. a 22 las 24 h después de haber iniciado los cultivos se dieron los tratamientos por separado con V2O3, V2O4 o V2O5 en cada una de las siguientes concentraciones 2, 4, 8 o 16 µg/mL ya sea de. Al finalizar el tiempo de incubación, el medio de cultivo fue retirado y se les agregó 100 µL de solución amortiguadora de lisis RIPA (150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 0.1% SDS, 1 mM DTT, 1 mM NaVO4, 5 mM Na2HPO4, 10 mM NaH2PO4) para obtener las proteínas de las células, a esta solución se le adicionaron inhibidores de proteasas (1 μg/mL aprotinina, 1 μg/mL leupeptina,10 μg/mL PMSF) y se dejaron 1.5 h en refrigeración. A continuación, se agitó ligeramente el lisado procurando no incrementar su temperatura y se centrifugó 12 min a 12,000 rpm. El sobrenadante, el cual contiene a las proteínas extraídas de los linfocitos, se transfirió a otro tubo. La concentración de proteínas por microlitro (μL) presente en los lisados fue determinada por el método propuesto por Bradford (1976), con la ayuda del reactivo “Proteín Assay” de la marca Bio-Rad. Para esta metodología se realizó una curva estándar utilizando la solución de 1 mg/mL de Albumina de Suero Bovino (BSA por sus siglas en inglés). Para identificar las proteínas p21, p53 y CDC25C se realizó la separación de las mismas por medio de la electroforesis en geles de poliacrilamida al 12% en condiciones desnaturalizantes. Se mezclaron 50 μg del extracto de proteínas con solución amortiguadora para electroforesis 2x en proporción 1:2, esto se hizo para cada tratamiento, a continuación se colocaron en los pozos formados en el gel y se le aplicó voltaje constante de 80 Volts, posteriormente las proteínas del gel fueron transferidas a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF por sus siglas en inglés) de Bio-Rad por electroblotting con una corriente constante de 140 mA por 1.5 h. La membrana se incubó en solución de bloqueo (7% de leche sin grasa con amortiguador tris salino más 0.5% de Tween-20 (TTBS)), por 1.5 h a temperatura ambiente, para posteriormente lavarla tres veces con TTBS durante 10 min cada uno e 23 incubarla con su respectivo anticuerpo primario (anti-p53, anti-p21 o anti-CDC25C 1:2500) o el marcador de carga actina (1:3500) (Santa Cruz Biotechnology) dejándola toda la noche a 4 °C y en agitación constante. Transcurrido este tiempo se realizaron tres lavados con TTBS de 10 min cada uno, después se incubó a temperatura ambiente durante 1.5 h con el anticuerpo secundario goat anti-mouse IgG-HRP (0.3:10000). Finalmente la membrana se lavó cuatro veces con TTBS por 10 min cada lavado. La detección y determinación de las bandas se realizó mediante quimioluminiscencia utilizando el substrato luminol, el cual reacciona con la enzima peroxidasa de rábano (HRP) y produce una señal de luz que puede ser capturada en una placa autoradiográfica. De esta manera se visualiza la proteína de interés como una banda, la intensidad relativa de las mismas fue evaluada utilizando el programa para computadora ImageJ 1.45s del National Institutes of Health, de Estados Unidos de América que es de libre acceso (http://rsb.info.nih.gov/ij), normalizando los valores de las intensidades de cada una de las bandas de los tratamientos con respecto al marcador de carga actina y se comparan contra el grupo sin tratamiento. 7.7. Análisis estadístico Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar (DE). En el caso de las evaluaciones de la viabilidad, IR, TPC, SCE y SPC, se realizó la prueba t de Student para comprobar si existe alguna diferencia significativa de cada grupo tratado contra el grupo sin tratamiento, de igual manera para la evaluación del contenido de ADN y los niveles de proteínas y para el IM la prueba Z de proporciones, considerando que son diferentes significativamente cuando se presente P < 0.05. 24 8. Resultados 8.1. Efecto de los óxidos de vanadio sobre la viabilidad La viabilidad celular de los linfocitos no se vio modificada por la administración de los óxidos de V (V2O3, V2O4 y V2O5). El porcentaje en todos los tratamientos estuvo con valores mayores a 92%, Cuadro 1. Cuadro 1. Porcentaje de viabilidad de linfocitos humanos tratados con V2O3, V2O4 o V2O5 por 24 h. Tratamiento V2O3 V2O4 V2O5 Experimento A 0 97.5 ± 2.1 94.5 ± 4.9 98.5 ± 0.7 2 96.0 ± 0.0 96.5 ± 0.7 98.0 ± 1.4 4 95.5 ± 0.7 95.5 ± 0.7 96.5 ± 0.7 8 97.0 ± 2.8 96.5 ± 0.7 97.5 ± 0.7 16 94.5 ± 4.9 97.5 ± 2.1 97.0 ± 1.4 Experimento B 0 98.0 ± 1.4 94.5 ± 0.7 99.0 ± 1.4 2 99.5 ± 0.7 96.5 ± 0.7 98.5 ± 2.1 4 98.0 ± 1.4 96.5 ± 0.7 99.5 ± 0.7 8 98.5 ± 0.7 98.0 ± 1.4 98.0 ± 0.0 16 97.0 ± 1.4 98.0 ± 0.0 97.5 ± 0.7 Experimento C 0 97.0 ± 1.0 97.0 ± 0.0 94.0 ± 3.5 2 96.3 ± 0.6 96.0 ± 1.4 92.0 ± 1.7 4 94.7 ± 1.5 95.5 ± 0.7 95.0 ± 2.0 8 93.3 ± 1.5 94.5 ± 2.1 96.0 ± 1.0 16 93.3 ± 0.6 95.0 ± 1.4 96.3 ± 3.8 Promedio 0 97.7 ± 1.5 95.3 ± 2.6 96.7 ± 3.3 2 97.7 ± 2.0 96.3 ± 0.8 95.6 ± 3.6 4 96.7 ± 1.7 95.8 ± 0.8 96.7 ± 2.4 8 97.7 ± 1.9 96.3 ± 2.0 97.0 ± 1.2 16 95.7 ± 3.3 96.8 ± 1.8 96.9 ± 2.3 8.2. Efecto del trióxido de vanadio sobre la proliferación celular Con respecto al IM en la Figura 1 se muestra que la administración de V2O3 a los cultivos de linfocitos induce la reducción significativa en todas las concentraciones cuando se comparó con el grupo sin tratamiento (P<0.05). De igual manera, el V2O3 25 disminuyó significativamente el IR e incremento el TPC (Figuras 2 y 3). Estos últimos dos parámetros indican cuantas veces se replica la población de células y en cuanto tiempo lo hace, respectivamente (Crossen y Morgan, 1977; Rojas et al., 1992), permitiendo medir la inhibición de la replicación celular por algún agente físico, químico o biológico (Kram et al., 1979; Latt et al., 1981). Figura 1. Índice mitótico (IM) en relación a los tratamientos con V2O3 en los cultivos de linfocitos humanos. Se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes con su duplicado. *: P < 0.05 vs. grupo sin tratamiento (Z de proporciones).26 Figura 2. Índice de replicación (IR) de los cultivos de linfocitos humanos tratados con V2O3, se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes cada uno con su repetición. *: P < 0.05 vs. grupo sin tratamiento (t de Student). Figura 3. Tiempo promedio de proliferación celular (TPC) estimado en los cultivos de linfocitos humanos tratados con V2O3, se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes con su repetición. *: P < 0.05 vs. grupo sin tratamiento (t de Student). 27 Cuando se realizó el análisis de los ICH para conocer la genotoxicidad de este compuesto, los resultados muestran que la frecuencia no se modificó con la administración del V2O3 en relación al grupo sin tratamiento (Figura 4) mientras que, como era de esperarse, en los tratamientos realizados con MMC se observó diferencias significativas en todos los parámetros anteriores con respecto al grupo sin tratamiento, donde el IM fue de 2.89 ± 0.37 sin tratamiento vs 1.89 ± 0.38 de MMC; ICH 4.59 ± 2.22 vs 12.92 ± 4.96; excepto para IR 2.20 ± 0.22 vs 2.02 ± 0.25, respectivamente (estos datos no se muestran en las figuras). En el caso de los cultivos tratados con V2O3 al analizar las metafases, se observó que el porcentaje de células que presentan SPC se incrementó de manera significativa en los tratamientos en comparación con el grupo testigo (Figuras 5 y 6). Figura 4. Frecuencia de los intercambios de cromátidas hermanas (ICH) de los cultivos de linfocitos humanos tratados con V2O3, se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes cada uno con su repetición. 28 a) b) c) Figura 5. Análisis de las metafases de cultivos de linfocitos humanos tratados con V2O3 por 48 h. En a) célula que ha pasado por dos ciclos de replicación, en b) separación prematura de las cromátidas en una célula de segundo ciclo y en c) separación de las cromátidas hermanas en una célula de primer ciclo. 29 Figura 6. Porcentaje de células que presentan separación prematura de las cromátidas (SPC) en los diferentes tratamientos con V2O3 de los cultivos de linfocitos humanos, se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes cada uno con su repetición. *: P < 0.05 vs. grupo sin tratamiento (t de Student). 8.3. Efecto del trióxido de vanadio sobre el contenido de ADN en las diferentes fases del ciclo celular Con respecto al análisis del contenido de ADN en los linfocitos humanos tratados con V2O3 in vitro por 24 h, no muestra cambios que sean significativos con respecto al grupo sin tratamiento (Figuras 7, 8 y 9). 30 Figura 7. Porcentaje de núcleos que se encuentran en la fase G0/G1 de los cultivos de linfocitos humanos tratados con V2O3 por 24 h. Se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes, cada experimento con su repetición. Figura 8. Porcentaje de núcleos que se encuentran en la fase S del ciclo celular de los cultivos de linfocitos tratados con V2O3 por 24 h. Se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes, cada experimento con su repetición. 31 Figura 9. Porcentaje de núcleos que se encuentran en la fase G2/M de los cultivos de linfocitos humanos tratados con V2O3 por 24 h. Se presenta la media ± D. E. de tres experimentos independientes, cada experimento con su repetición. 8.4. Efecto del tetraóxido de vanadio sobre el contenido de ADN en las diferentes fases del ciclo celular La administración de V2O4 a cultivos de linfocitos humanos no modificó el porcentaje de células presentes en las diferentes fases del ciclo celular con respecto al grupo sin tratamiento (Figuras 10, 11 y 12). 32 Figura 10. Porcentaje de núcleos que se encuentran en la fase G0/G1 de los cultivos tratados con V2O4 por 24 h. Se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes con su repetición. Figura 11. Porcentaje de núcleos que se encuentran en la fase S de los cultivos tratados con V2O4 por 24 h. Se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes con su repetición. 33 Figura 12. Porcentaje de núcleos que se encuentran en la fase G2/M de los cultivos tratados con V2O4 por 24 h. Se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes con su repetición. 8.5. Efecto del pentóxido de vanadio sobre el contenido de ADN en las diferentes fases del ciclo celular En estudios previos evaluando la cinética de proliferación celular de cultivos de linfocitos humanos, mediante la tinción diferencial de las cromátidas hermanas, tratados con V2O5 empleando las mismas concentraciones, se observó que este compuesto induce la detención de la proliferación evidenciado por la disminución del IM, el IR y el incremento del TPC, sin alterar la viabilidad (Mateos-Nava, 2012). Por lo que se procedió a realizar la determinación del contenido de ADN en las diferentes fases del ciclo de los linfocitos tratados con 2, 4, 8 o 16 µg/mL por 24 h mediante CF. Los resultados mostraron que los diferentes tratamientos no inducen cambios en el porcentaje de células que están en la fase G0/G1 (Figura 13) mientras que en la fase S hay una disminución en todas las concentraciones, no obstante, no son significativas (Figura 14). En el caso de la fase G2/M se observó incremento, el cual es significativo en la concentración de 16 µg/mL con respecto al grupo sin tratamiento (Figura 15). 34 Figura 13. Porcentaje de núcleos que se encuentran en la fase G0/G1 de los tratamientos con V2O5 por 24 h. Se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes con su repetición. Figura 14. Porcentaje de núcleos que se encuentran en la fase S de los tratamientos con V2O5 por 24 h. Se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes con su repetición. 35 Figura 15. Porcentaje de núcleos que se encuentran en la fase G2/M de los cultivos de linfocitos tratados con V2O5 por 24 h. Se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes, cada experimento con su repetición. *: P < 0.05 vs. grupo sin tratamiento (t de Student). 8.6. Efecto de los óxidos de vanadio sobre los niveles de las proteínas p21, p53 y CDC25C 8.6.1. Efecto del trióxido de vanadio En la Figura 16 se presentan las fotografías de las bandas de proteínas p21, p53, CDC25C y actina (como marcador de carga), de cada tratamiento. Cuando se obtienen la intensidad de las mismas se observa incremento en la proteína p21 en todos los tratamientos con V2O3 siendo significativo en la concentración de 8 µg/mL con respecto al grupo sin tratamiento (Figura 17). Por otra parte, los niveles de la proteína p53 disminuyen siendo significativo en el tratamiento con 2 µg/mL para este óxido (Figura 18). En lo que respecta a los niveles de la proteína CDC25C se observó que en todos los tratamientos son superiores en comparación con el grupo sin tratamiento, aunque presentan tendencia a disminuir a partir de la concentración de 2 µg/mL sin alcanzar los valores del grupo testigo (Figura 19). 36 Figura 16. Imágenes representativas de las bandas de proteínas presentes en los diferentes tratamientos con V2O3 de los cultivos de linfocitos humanos, actina sirve como marcador de carga y es utilizada para obtener la intensidad relativa de cada proteína. Figura 17. Intensidad relativa de la proteína p21 presente en los cultivos de linfocitos tratados con V2O3 por 24 h, se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes, cada experimento con su repetición. *: P < 0.05 vs. grupo sin tratamiento (t de Student). CDC25C p53 p21 actina 0 2 4 8 16 µg/mL 37 Figura 18. Intensidad relativa de la proteína p53 presente enlos cultivos de linfocitos tratados con V2O3 por 24 h, de presenta la media ± DE de tres experimentos independientes, cada experimento con su repetición. *: P < 0.05 vs. grupo sin tratamiento (t de Student). Figura 19. Intensidad relativa de la proteína CDC25C presente en los cultivos de linfocitos humanos tratados con V2O3 por 24 h, se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes, cada experimento con su repetición. 38 8.6.2. Efecto del tetraóxido de vanadio En la Figura 20 se presentan las fotografías de las bandas de proteínas p21, p53 y CDC25C, de cada tratamiento con V2O4, siendo representativas de los seis experimentos, de donde se obtuvo la intensidad relativa de cada una. Con respecto a los niveles de p21, se observa incremento en las concentraciones de 4 y 16 µg/mL aunque no es estadísticamente significativo (Figura 21). Figura 20. Imágenes representativas de las bandas de proteínas presentes en los diferentes tratamientos con V2O4 de los cultivos de linfocitos humanos, actina sirve como marcador de carga y es utilizada para obtener la intensidad relativa de cada proteína. En el caso de los niveles de p53 el aumento observado es a partir de la concentración de 4 siendo significativo en los tratamientos con 8 y 16 µg/mL (Figura 22). De manera similar, la proteína CDC25C se incrementó en los tratamientos de 2, 8 y 16 µg/mL resultando significativo en esta última (Figura 23). 0 2 4 8 16 µg/mL CDC25C p53 p21 actina 39 Figura 21. Intensidad relativa de la proteína p21 presente en los cultivos de linfocitos humanos tratados con V2O4 por 24 h, se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes, cada experimento con su repetición. Figura 22. Intensidad relativa de la proteína p53 de los cultivos de linfocitos humanos tratados con V2O4 por 24 h, se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes, cada experimento con su repetición. *: P < 0.05 vs. grupo sin tratamiento (t de Student). 40 Figura 23. Intensidad relativa de la proteína CDC25C presente en los cultivos de linfocitos humanos tratados con V2O4 por 24 h, se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes, cada experimento con su repetición. *: P < 0.05 vs. grupo sin tratamiento (t de Student). 8.6.3. Efecto del pentóxido de vanadio En la Figura 24 se muestran la intensidad de las bandas de proteínas obtenidas del tratamiento con V2O5 por medio de la técnica de Western Blot. Como puede observarse en la Figura 25 la intensidad relativa de la proteína p21 de los linfocitos humanos tratados con V2O5 aumento en los diferentes tratamientos, no obstante, este incremento no fue significativo. En cuanto a los niveles de la proteína p53, la administración de V2O5 indujo un incremento en todas las concentraciones (Figura 26). El tratamiento con V2O5 a los cultivos de linfocitos humanos también aumento los niveles de la proteína CDC25C siendo significativo en la concentración de 16 µg/mL (Figura 27). 41 Figura 24. Imágenes representativas de las bandas de proteínas presentes en los diferentes tratamientos con V2O5 de los cultivos de linfocitos humanos, actina sirve como marcador de carga y es utilizada para obtener la intensidad relativa de cada proteína. Figura 25. Intensidad relativa de la proteína p21 presente en los cultivos de linfocitos humanos tratados por 24 con V2O5, se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes, cada experimento con su repetición. CDC25C p53 p21 actina 0 2 4 8 16 µg/mL 42 Figura 26. Intensidad relativa de la proteína p53, se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes, cada experimento con su repetición. *: P < 0.05 vs. grupo sin tratamiento (t de Student). Figura 27. Intensidad relativa de la proteína CDC25C se presenta la media ± DE de tres experimentos independientes, cada experimento con su repetición. *: P < 0.05 vs. grupo sin tratamiento (t de Student). 43 9. Discusión En este trabajo se observó que la administración de los óxidos de V (V2O3, V2O4 y V2O5) no modifican la viabilidad celular, pero sí la proliferación, que se hizo evidente por la disminución del índice mitótico y del índice de replicación. Tampoco se observaron cambios en alguna fase del ciclo en específico, aunque los niveles de las proteínas p21 y p53 que lo regulan se incrementaron al mismo tiempo que hubo un aumento de CDC25C, lo cual indica que estas moléculas están influyendo en el retraso observado. 9.1. Viabilidad celular Los compuestos de V, principalmente en estados de oxidación V4+ y V5+, tienen efectos en las funciones de las células lo que puede llevar a inhibir el crecimiento, detener la proliferación e inducir la muerte celular, aunque estos mecanismos de toxicidad celular se siguen investigando (Klein et al., 2008; Di Virgilio et al., 2011; Abudalleh et al., 2013; Zwolak, 2013). Se tienen pocos estudios acerca de la citotoxicidad de los compuestos en estado de oxidación V3+, y en estos se ha observado que la toxicidad varía dependiendo del modelo biológico utilizado (Yamamoto et al., 1999) y de la concentración, donde concentraciones tanto no citotóxicas como citotóxicas, de 1 µM a 1 mM, no alteran la expresión de algunos genes (Sun et al., 1997). Los resultados demuestran que la administración de V2O3, V2O4 o V2O5 a los cultivos de linfocitos humanos no modifica la viabilidad. Este comportamiento ha sido observado en estudios previos con la administración de V2O5 a cultivos de linfocitos humanos por 48 h en concentraciones de 2, 4, 8, o 16 μg/mL (Roldán y Altamirano, 1990; Mateos- Nava, 2012), mientras que el tratamiento con V2O3, V2O4, o V2O5 utilizando las mismas concentraciones en tratamientos por 2, 4 y 6 h no indujo toxicidad celular en este mismo modelo (Rodríguez-Mercado et al., 2011). Algo similar observaron Rojas et al., (1996) cuando administraron V2O5 a cultivos de leucocitos por 2 h y de linfocitos por 24 h en donde la viabilidad fue superior al 95%. 44 9.2. Efecto del trióxido de vanadio sobre la proliferación celular de linfocitos humanos Tanto el IM como el IR son buenos indicadores del efecto que ejercen los xenobióticos sobre la tasa de proliferación, ya que si éstos disminuyen puede deberse a que las células pierden la capacidad para proliferar por algún motivo (Rojas et al., 1993; Rodríguez-Mercado et al., 2010). Los resultados muestran una reducción de ambos parámetros en todas las concentraciones y un incremento en el TPC los cuales son estadísticamente significativos. Rodríguez-Mercado et al., (2003, 2010) cuando trataron cultivos de leucocitos humanos con V2O3, V2O4 o V2O5 en concentraciones similares a las utilizadas en este estudio, observaron que los tres compuestos detienen la proliferación celular de manera dependiente de la concentración. Algo parecido sucede cuando se administra metavanadato de sodio (NaVO3), ortovanadato de sodio (Na3VO4), metavanadato de amonio (NH4VO3) o sulfato de vanadilo (SOVO4) a cultivos de linfocitos humanos (Migliore et al., 1993). Con base en los resultados logrados en este trabajo es posible suponer que probablemente el V2O3 está afectando la proliferación de los linfocitos humanos por la interacción con diferentes moléculas que intervienen en el control de la división celular, entre ellas las proteínas cinasas y fosfatasas, como ha sido demostrado en sistemas in vivo e in vitro (Macara, 1980; Evangelou, 2002; Beyersmann y Hartwig, 2008; Bishayee et al., 2010). En diferentes líneas celulares esta interacción lleva a la detención de la síntesis de ADN (Yan y Wenner,2001), a la disminución de los niveles de ciclina D, ciclina E, ciclina A (Fu et al., 2008; Markopoulou et al., 2009), al incremento de p21, p27 y p53, los cuales son inhibidores del ciclo celular (Huang et al., 2000; Zhang et al., 2002; Gonçalves et al., 2011) y a la inhibición de CDC25 y PCNA, además de que se estimula la fosforilación de ERK y p38 (Yan y Wenner, 2001; Zhang et al., 2003; Chakraborty et al., 2006; Li et al., 2008). La prueba de intercambio de cromátidas hermanas (ICH) se utiliza para la detección de intercambios recíprocos de ADN, aparentemente en loci homólogos, entre dos cromátidas hermanas de un cromosoma duplicado. Esta prueba se emplea para evaluar la capacidad que tienen agentes físicos, químicos o biológicos de dañar al ADN, 45 además se ha demostrado que es más sensible que el ensayo de AC ya que existe alta correlación entre el incremento en la frecuencia de ICH y la inducción de genotoxicidad (Gómez-Arroyo et al., 1981; Roldán y Altamirano, 1990; Tucker y Preston, 1996; Albertini et al., 2000; Rodríguez-Reyes y Morales-Ramírez, 2003). En los experimentos el V2O3 no modificó la frecuencia de ICH con respecto al grupo sin tratamiento, sin embargo, Owusu-Yaw et al., (1990) observaron que la administración de V2O3, VOSO4 o NH4VO3 (estados de oxidación 3+, 4+, 5+, respectivamente) a cultivos de células de ovario de criceto chino (CHO-K1-BH4) incrementan la frecuencia de ICH, por lo que algunos autores consideran al V un agente genotóxico débil (Roldan y Altamirano, 1990; Léonard y Gerber, 1994; Leopardi et al., 2005). En este estudio se observó que el V2O3 induce la separación prematura de las cromátidas (SPC) en todas las concentraciones administradas. La SPC consiste en la separación de las cromátidas, perfectamente extendidas sin orientación polar y con el centrómero discernible de todos o en la mayoría de los cromosomas de una metafase (Kajii e Ikeuchi, 2004). Esta inducción predispone a una mala segregación de los cromosomas y propicia la generación de aneuploidías en las divisiones subsecuentes (Fitzgerald y McEwan, 1977), ya que es generalmente aceptado que la no disyunción y las SPC representan eventos citogenéticos que llevan a las células a contener un número anormal de cromosomas (Mailhes, 2008; Pfau y Amon, 2012). En el 40% de los individuos normales se ha encontrado que la frecuencia de SPC es del 2%. Sin embargo, esta frecuencia se incrementa en personas que presentan una mutación heterocigótica en el gen BUB1B encargado de las proteínas del punto de control mitótico (OMIM, entry #176430), lo que puede ocasionar diversos tipos de alteraciones en la salud humana, así como defectos de nacimiento, abortos espontáneos, infertilidad, o el desarrollo de tumores en células somáticas (Decordier et al., 2008; Holland y Cleveland, 2012). Este parámetro también se ha determinado en cultivos de linfocitos de sangre periférica de personas ocupacionalmente expuestas a diferentes compuestos químicos 46 genotóxicos: petróleo crudo, acrilonitrilo, benceno, tetracloruro de carbono, mezcla de disolventes orgánicos, fármacos citostáticos, entre otros; observándose mayor incremento en las personas expuestas al petróleo crudo, mezcla de sustancias químicas y al personal de hospitales que preparan los fármacos citostáticos (Major et al., 1999). En este mismo estudio se observó que la frecuencia de AC totales (AC numéricas y estructurales) se incrementó, sin embargo, no se encontró correlación entre las AC y la SPC, por lo que la formación de SPC se debe a la interacción de los compuestos con las proteínas encargadas de la unión de las cromátidas y no necesariamente por daño directo sobre la molécula de ADN. En el presente estudio, el hecho de que haya incremento en la frecuencia de SPC puede deberse a la interacción del V con las proteínas encargadas de mantener unidas las cromátidas en la metafase, así como con las que controlan la transición a la anafase, lo cual llevaría a la mala segregación equitativa de los cromosomas en las nuevas células, formando aneuploidías o poliploidías (Michel et al., 2001). Por ejemplo, se ha observado que cuando la cinasa dependiente de ciclina 11 (Cdk11p58), la cual se encarga de la cohesión entre las cromátidas hermanas de los cromosomas en la fase G2/M, de la maduración del centrosoma y el ensamble del huso mitótico, disminuyen sus niveles, induce a la separación de las cromátidas hermanas además de alterar la función y localización de las proteínas Bub1 y Sgo1 encargadas del ensamble de los cinetocoros y el huso mitótico, y de la cohesión del centrómero (Hu et al., 2007; Malumbres, 2011; Rakkaa et al., 2014). Esta separación ocurre en la transición de la prometafase a la metafase (Hu et al., 2007; Rakkaa et al., 2014), por lo que puede inducir arrestos mitóticos. Con respecto al V5+ solamente Mailhes et al., (2003) han observado que la administración de Na3VO4 a ratones hembra ICR por 24 h, induce la SPC en células somáticas y germinales, proponiendo que este sea uno de los mecanismos por los cuales el V induzca sus efectos aneuploidógenos, además, estudios como los de Migliore et al., 1993 y Ciranni et al., 1995 muestran a los compuestos de V como aneuploidógenos, ya que incrementan la frecuencia de AC numéricas y micronúcleos. 47 De acuerdo con lo anterior y a los resultados obtenidos en este trabajo se considera que el V2O3 puede ser sumado a la lista de compuestos con actividad aneuploidógena. 9.3. Efecto de los óxidos de vanadio sobre el ciclo celular Las células somáticas eucariotas pasan por un proceso de crecimiento y división llamado ciclo celular y el análisis del contenido de ADN mediante CF permite conocer en cual fase en específico se encuentran, utilizando un colorante que se una de manera estequiométrica a la molécula y teniendo en cuenta que las células que permanecen en la fase G1 son diploides (2n), cuando se replica esta información genética nuclear, ahora es el doble, es decir son tetraploides (4n) están en G2. En este trabajo se observó que la administración de V2O3, V2O4 o V2O5 a los cultivos de linfocitos humanos no indujo cambios en alguna de las fases con respecto al grupo sin tratamiento, a pesar de que en la evaluación citogenética los óxidos inducen retraso en la proliferación. De manera similar, Rodríguez-Mercado (2006) administró 8 µg/mL de cada uno de los tres compuestos a cultivos de leucocitos humanos y tampoco observó diferencias con respecto a los no tratados en alguna de las fases. Este mismo efecto se presenta en la línea celular de carcinoma esofágico de células escamosas humanas EC109 tratadas con 0.1 a 50 µM NaVO3 (V5+) por 24 h, sin embargo, en concentraciones de 100 y 200 µM hay un retraso en la fase S originado por la disminución de la proteína ciclina D y la inducción de apoptosis (Yang et al., 2016). Por otra parte, en líneas celulares de carcinoma hepatocelular humano HepG2, Hep3B y Sk-Hep-1 se ha demostrado que hay retraso del ciclo en la fase G2/M cuando son tratadas con 15 y 30 µM de Na3VO4 debido al incremento de ciclina B y cdc2 fosforilada (Wu et al., 2014). Asimismo, células de cáncer pancreático humano AsPC-1 se detienen en G2/M al exponerlas a 100 µM de NaVO3 o bis(acetilacetonato)- oxidovanadio(IV) (VO(aca)2), compuestos con propiedades antidiabética, lo cual está relacionado con el incremento de p21, CDC25C y cdc2 fosforilada (Wu et al., 2016). 48 Con base en los estudios anteriores se puede mencionar que los compuestos de V inducen retraso en diferentes fases del ciclo dependiendo del tipo de célula, de la especie química y de la concentración y lo hacen interactuando con las moléculas encargadas de las señales de la proliferación por lo que en este trabajo se continuó con la evaluación
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