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23/7/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA
DE MÉXICO

FACULTAD DE CIENCIAS

Estudio de lisozimas en el vector Triatoma (Meccus)
pallidipennis transmisor de la enfermedad de Chagas

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL TÍTULODE:
BIÓLOGO
P R E S E N T A :
EDGAR QUEZADA RUIZ

DIRECTOR DE TESIS:
DRA. BERTHA JOSEFINA ESPINOZA
GUTIÉRREZ.
CIUDAD DE MÉXICO, 2018

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

Agradecimientos académicos

Agradezco a la Dra. Bertha Espinoza Gutiérrez por permitirme realizar la presente tesis de
licenciatura en el laboratorio de Tripanosomiasis Americana en el Departamento de
Inmunología del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la Universidad Nacional
Autónoma de México.

Agradezco la colaboración del M. en C. Ignacio Martínez por su apoyo técnico en la
infección de ratones con Trypanosoma cruzi, los cuales fueron empleados en este trabajo.

Agradezco a la Biól. Paulina Díaz por la enseñanza y asesoría técnica en los ensayos de
electroforesis y zimogramas utilizados en el presente trabajo.

Se agradece la enseñanza y asesoría del Dr. Daniel Sánchez en los alineamientos de
secuencias y construcción filogenética.

Y por último, a la Sra. Martha Ramírez por su apoyo como auxiliar de laboratorio y al Sr.
Osvaldo Martínez por su apoyo como laboratorista.

ÍNDICE

ABREVIATURAS ................................................................................................................ 5
RESUMEN ............................................................................................................................ 6
1. Introducción .................................................................................................................... 7
1.1. Trypanosoma cruzi ......................................................................................................... 7
1.2. Ciclo de vida de T. cruzi ................................................................................................ 8
1.3. Insectos vectores de la enfermedad de Chagas ........................................................... 9
1.3.1 Sistemática y taxonomía ............................................................................................ 10
1.3.2. Distribución geográfica. ........................................................................................... 11
1.3.3. Triatoma (Meccus) pallidipennis .............................................................................. 13
1.3.4. Ciclo de vida de los triatominos............................................................................... 14
1.4. Morfología y fisiología ................................................................................................. 15
1.4.1. Alimentación y nutrición ......................................................................................... 16
1.4.2. Tracto digestivo: digestión y excreción ................................................................... 17
1.4.3. Sistema circulatorio: cuerpo graso y hemolinfa .................................................... 20
1.5. Respuesta inmune ........................................................................................................ 22
1.5.1. Péptidos antimicrobianos (AMPs) .......................................................................... 24
1.5.2. Lisozimas ................................................................................................................... 25
2. Antecedentes ................................................................................................................... 30
3. Justificación. .................................................................................................................... 31
4. Hipótesis .......................................................................................................................... 31
5. Objetivos .......................................................................................................................... 32
6. Diseño experimental ....................................................................................................... 33
7. Materiales y Métodos ..................................................................................................... 34
7.1. Insectos ......................................................................................................................... 34
7.2. Ratones e infección ...................................................................................................... 34
7.3. Disección de órganos y extracción de proteínas ........................................................ 35
7.4. Electroforesis de proteínas .......................................................................................... 36
7.5 Ensayo de actividad enzimática (zimograma)............................................................ 37
7.7. Ensayo de actividad enzimática a diferentes pH ...................................................... 39
7.7. Ensayo de inhibición de actividad enzimática .......................................................... 38
7.8. Análisis filogenético ..................................................................................................... 39
8. Resultados ...................................................................................................................... 41
8.1. Actividad de tipo lisozima en tracto digestivo de vectores sin alimentar .............. 41
8.2. Actividad de tipo lisozima en insectos alimentados e infectados con T. cruzi ........ 42
8.3. Inhibición de la actividad enzimática de lisozima de hemolinfa y tracto digestivo
.......................................................................................................................................... 46
8.4. Actividad de lisozima a diferentes pH. ...................................................................... 51
8.5. Construcción filogenética ............................................................................................ 52
9. Discusión. ......................................................................................................................... 57
10. Conclusiones .................................................................................................................. 65
11. Perspectivas .................................................................................................................. 66
12. Referencias ................................................................................................................... 67

Página
5

ABREVIATURAS

AMPs: Péptidos antimicrobianos.
BLAST: Herramienta Básica de Búsquedas de Alineamientos Locales
BSA: Albumina de suero bovina
cDNA: Ácido desoxirribonucleico complementario obtenido por retrotranscripción
DNA: Ácido desoxirribonucleico
NAC: N-acetilglucosamina
NAM: N-acetilmurámico
NO: Óxido Nítrico
PAGE:Electroforesis en geles de poliacrilamida
PAMPs: Patrones moleculares asociados a patógenos.
PBS: Amortiguador de fosfato de sodio
PRPs: Patrones de reconocimiento de proteínas/receptor
RNA: Ácido ribonucleico
ROS: Especies reactivas de oxígeno
RT: Transcriptasa Reversa

RESUMEN

Las lisozimas son enzimas de tipo muramidasas, participan en la protección contra agentes
patógenos y también desempeñan un papel en algunas funciones digestivas. En insectos
existen diferentes tipos, la enzima más conocida es la lisozima tipo “c”, que tiene una
actividad lítica principalmente contra bacterias de tipo gram “+”. El objetivo de este estudio
fue caracterizar lisozimas de hemolinfa y tracto digestivo en el vector Triatoma
pallidipennis, observando su acción mediante la técnica de zimograma, utilizando como
sustrato a Micrococcus luteus y su estudio filogenético a partir de una secuencia parcial
obtenida a partir de mRNA de cuerpo graso. Las lisozimas se caracterizaron
bioquímicamente con pruebas de inhibición y actividad a diferentes pH. Se realizó una
cinética de infección con T. cruzi para observar los cambios ocasionados por el parásito.
Como control positivo se utilizó una lisozima pura de pollo de tipo “c”, observando
actividad en la misma región (14.5 kDa) con los extractos proteícos de hemolinfa e
intestino anterior y posterior. En la cinética de infección se observó una mayor producción
de lisozimas en las ninfas infectadas respecto a las ninfas al día siete y al día tres en
intestino anterior y posterior respectivamente. Se observó otra banda lítica en intestino
posterior de aproximadamente 18 kDa. Se obtuvo una inhibición de la actividad enzimática
con imidazol del 80% para la enzima de hemolinfa y 50% para la molécula de intestino.
Las moléculas actuaron a un pH neutro y alcalino y fueron inhibidas a un pH ácido. Con
estos resultados podemos decir que las lisozimas en intestino y hemolinfa son de tipo “c”
por peso molecular y acción sobre el mismo sustrato, aunque poseen características
particulares en cuanto a inhibición. Se observó una mayor actividad en los extractos de
intestino, posiblemente debido a su papel en la digestión. La comparación de secuencias y
la construcción filogenética nos indica una estrecha relación con las lisozimas de las
especies sudamericanas T. infestans y T. brasiliensis con un posible papel inmunológico.

1. Introducción

Trypanosoma cruzi es un protozoario hemoflagelado causante de la enfermedad de Chagas,
también conocida como Tripanosomiasis Americana. Se trata de una zoonosis endémica de
América Latina donde se registran 21 países afectados, y abarca desde el sur de los
Estados Unidos hasta el sur de Argentina y Chile. Sin embargo, también ha sido detectada
en regiones no endémicos donde el vector no existe, como el norte de Estados Unidos,
Canadá, Australia, Japón y países europeos. (WHO, 2007; De Maio, 2013).

Hoy en día esta enfermedad sigue siendo un problema de salud en la mayoría de países de
América Latina, siendo una enfermedad parasitaria muy importante por su alto grado de
morbilidad (WHO, 2010) y se estima, que afecta aproximadamente ocho millones de
personas, reportándose al año 38 000 casos y 12,500 muertes al año (WHO, 2012; Pérez-
Molina y Molina, 2018).

1.1. Trypanosoma cruzi

La morfología de T.cruzi se compone por una célula con un núcleo, que contiene el
material genético, el DNA se encuentra en una sola unidad, una mitocondria, aparato de
Golgi, retículo endoplásmico, un flagelo, y un organelo con material extranuclear llamado
cinetoplasto, el cual posee genoma mitocondrial. El arreglo del citoesqueleto es peculiar ya
que predominan los microtúbulos y no hay evidencia de microfilamentos o filamentos
intermedios. (Tyler et al. 2003). Aunque T. cruzi carece de reproducción sexual, se trata de
un parásito muy heterogéneo, con un alto grado de variación molecular, por lo que sus
características biológicas pueden variar, por ejemplo virulencia y patogenicidad. (Miles et
al. 1978; Espinoza et al. 2010). Las cepas de T. cruzi se han dividido en seis unidades
discretas de tipificación (DTU, por sus siglas en inglés Discrete Typing Units), de T. cruzi I
al T.cruzi VI. (Zingales et al. 1999).

El parásito se transmite principalmente por las heces de algunas especies de insectos
hematófagos pertenecientes a la familia Reduviidae: subfamilia Triatominae. La segunda
causa de infección es por transfusiones sanguíneas de sangre infectada o donaciones de
órganos, la tercera causa es vía congénita por parte de la madre infectada, y recientemente
8

se han reportado infecciones por ingerir comida contaminada con vectores infectados con el
parásito. Aunque en su mayoría no son reportados, existen casos de infección por
accidentes en laboratorios de investigación donde se trabaja con este patógeno humano.
(Strosberg et al. 2007; Dias et al. 2013).

1.2. Ciclo de vida de T. cruzi

El ciclo de vida se desarrolla en dos hospederos, un hospedero invertebrado (vector) y en
un vertebrado mamífero (gran número de reservorios silvestres, domésticos y el ser
humano) (de Souza et al. 2010). El parásito en el vertebrado se encuentra en fase de
tripomastigote sanguíneo (18-21 m), infectando cualquier célula nucleada, aunque tiene
tropismo por las células cardiacas y del intestino. En la célula se transforman en la forma
replicativa llamados amastigotes (estructura aflagelar, redondos y miden de 2-4 m), éstos
se multiplican intracelularmente por fisión binaria, hasta lisar la célula infectada
liberándose en el torrente sanguíneo de nuevo como tripomastigotes sanguíneos para
infectar nuevas células. Al alimentarse el vector de un reservorio infectado, ingerirá a T.
cruzi, el cual sufrirá cambios de estadio a lo largo del tracto digestivo del insecto. Durante
su viaje empieza la transformación a la fase de epimastigote (el cinetoplasto se encuentra
entre el núcleo y el flagelo libre, mide de 18-20 m), su diferenciación se realiza durante la
porción media del intestino sufriendo morfogénesis de nuevo en la parte posterior del
tracto, específicamente en el recto. Esta forma es el estadio infectivo el cual es llamado
tripomastigote metacíclico. Al infectar a un nuevo reservorio vertebrado infectándolo por
medio de las heces a través de mucosas o laceraciones en la piel cambia de forma a
tripomastigote sanguíneo y así se repite el ciclo de vida (Figura 1). (Tyler et al. 2003;
Strosberg et al. 2007; WHO, 2007)
9

Figura 1. Ciclo de vida de Trypanosoma cruzi. El insecto ingiere al tripomastigote sanguíneo a
través de la sangre de un mamífero infectado (1). Una vez dentro del vector sufre dos
transformaciones: al inicio del tracto digestivo el parásito se convierte en epimastigote (2), este es el
estadio replicativo en el hospedero invertebrado, al llegar al intestino posterior, por estrés
nutricional y cambios en el ambiente el parásito vuelve a sufrir una transformación al tripomastigote
metacíclico (3), el cual es el estadio infectivo para el mamífero infectándolo a través de las heces
(4). Dentro del mamífero, el parásito invade cualquier tipo celular. Una vez invadida la célula, se
transforma en un estadio replicativo llamado amastigote, éste se replica hasta romper las células y
liberar a los tripomastigotes sanguíneos, repitiéndose el ciclo. Imagen tomada y modificada de
Strosberg et al.2007.

1.3. Insectos vectores de la enfermedad de Chagas

Los vectores de la enfermedad de Chagas, son insectos hematófagos pertenecientes a la
subfamilia Triatominae (son llamados triatominos por su clasificación y popularmente
conocidos como chinches besuconas en Norteamérica y vinchuca en los países
sudamericanos (WHO, 2010). Alrededorde 140 especies han sido reportadas como
potenciales vectores de la enfermedad (Strosberg et al. 2007). Se pueden alimentar de
cualquier mamífero reservorio de la enfermedad, y también de algunos grupos refractarios
como aves, anfibios y reptiles (Rassi et al., 2012). Visto desde un aspecto epidemiológico,
los géneros más importantes de triatominos son Triatoma, Rhodnius y Panstrongylus
10

(WHO, 1991), aunque esto puede variar dependiendo del país y de las zonas en las que se
encuentre al vector, ya que las especies de triatominos presentan una amplia diversidad de
biotipos, alimentándose de poblaciones humanas (ciclo doméstico), especies sinántropicas
(ciclo peridómestico) o especies selváticas (ciclo selvático) (Noierau et al., 2009; Carabin-
Lima et al., 2013).

1.3.1 Sistemática y taxonomía

Los miembros de la subfamilia Triatominae se encuentran clasificados en cinco tribus con
15 géneros y 151 especies (Justi y Galvão, 2017). A continuación se muestra la
clasificación desglosada:

Figura 2. Clasificación taxonómica de los vectores de la enfermedad de Chagas.

La mayoría de las clasificaciones existentes dentro de la subfamilia Triatominae se han
basado en la comparación de sus características morfológicas (Schofield y Galvão, 2009), y
por estas características, sus hábitos alimenticios, y ser uno de los tres grupos de hemípteros
hematófagos (Cimicidae y Polyctenidae), se consideró en un inicio a los triatominos como
un grupo monofilético. Sin embargo, debido al amplio rango de lugares donde pueden
habitar las especies de esta subfamilia, su alta variabilidad fenotípica y el parentesco que
tienen algunas especies con otros redúvidos, se propuso como un grupo parafilético o
polifilético (Justi y Galvão, 2017).
Subphyllum: Hexapoda
Clase: Insecta
Orden: Hemiptera
Suborden: Heteroptera
Familia: Reduviidae
Subfamilia: Triatominae
Tribus: Alberproseniini:
Género: Alberprosenia
Bolboderini
Género(s): Belminus, Bolbodera, Microtriatoma, Parabelminus
Cavernicolini
Género: Cavernicola
Rhodniini:
Género(s): Psammolestes, Rhodnius
Triatomini:
Género(s): Dipetalogaster, Eratyrus, Hermanlentia, Linshcosteus,
Panstrongylus, Paratriatoma, Triatoma
Encyclopedia of Life:
Integrated Taxonomic Information
System (ITIS), disponible en:
https://www.itis.gov/
Géneros de
triatominos, tomado de
Schofield y Galvão,
2009
11

Utilizando herramientas moleculares para la construcción de filogenias que puedan resolver
la clasificación y entender la diversidad de los triatominos, se presentaron diferencias en la
clasificación con respecto a las clasificaciones construidas a partir de características
morfológicas (García y Powell, 1998). Se ha explorado el uso de nuevos marcadores como
son los genes mitocondriales como la Citocromo Oxidasa Subunidad I (COI), Citocromo
Oxidasa Subunidad II (COII), y nucleares como la subunidad ribosomal 28S (Justi et al.
2014), conluyendo que se trata de un grupo parafilético.

1.3.2. Distribución geográfica.

La mayoría de las especies de los triatominos se distribuyen desde los grandes lagos de
Norteamérica hasta el sur de la Patagonia en Argentina, (aproximadamente entre las
latitudes 42N y 46S). La distribución de estos vectores es principalmente en zonas
tropicales, aunque hay registros zonas templadas o frías, la riqueza de especies, incrementa
desde los polos hacia el ecuador (Rodriguero y Gorla, 2004).

Dentro de la tribu Triatomini, existen especies en el nuevo y viejo mundo, siendo el género
Linshcosteus el único reportado en el viejo mundo, ubicado en la India (Galvão y Justi.
2015).

Los géneros que tienen mayor importancia en Sudamérica son Triatoma, Panstrongylus y
Rhodnius, debido a su alta tasa de natalidad, sus hábitos intradomésticos, y su alta
capacidad vectorial (Noierau et al. 2009). En particular, en los países del cono sur,
Triatoma infestans, Triatoma brasilensis y Panstrongylus megistus son los vectores más
reportados, mientras que en los países andinos y partes de Centroamérica son Rhodnius
prolixus y Triatoma dimidiata (Rassi et al. 2010).

En Norteamérica, los principales vectores en el sur de Estados Unidos son Triatoma
sanguisuga y Triatoma gerstaeckeri (Rassi et al. 2010). En México, existen 31 especies
autóctonas distribuidas a lo largo del país siendo siete géneros reportados: Belminus,
Dipetalogaster, Eratyrus, Paratriatoma, Panstrongylus, Rhodnius, y Triatoma, de las
12

cuales 21 especies han sido reportadas infectadas con T. cruzi (Cruz-Reyes y Pickering-
López, 2006; Ramsey et al. 2015). No obstante, son nueve las especies de importancia
médica por su amplía distribución, alto porcentaje de prevalencia intradoméstica, además
de tener una alta capacidad vectorial para transmitir el parásito, la mayoría siendo parte del
complejo Phyllosoma (Fig. 3.). Nuestro modelo de estudio forma parte de estas nueve
especies (Martínez-Ibarra et al. 2004; Cruz-Reyes y Pickering-López, 2006; Martínez et al,
2006; Martínez-Ibarra et al. 2011; Ramsey et al. 2012)

Figura 3. Distribución de los triatominos más importantes de México. En el mapa se muestran las
nueve especies más importantes en el país. La mayoría de las especies son del complejo Phyllosoma
(T. pallidipennis, T. phyllosoma, T. picturata, T. mazzotti,T. longipennisy T. mexicana) con
distribución mayoritaria en el centro del país. T. dimidiata presenta una distribución en casi toda la
costa del golfo de México, mientras que T. gerstaeckeri y T. barberi se distribuyen en el norte de
país, en los estados de Nuevo León y Tamaulipas. Tomado y modificado de Cruz-Reyes y
Pickering-López, 2006.

1.3.3. Triatoma (Meccus) pallidipennis

T. palldipennis es una especie endémica de México (Fig. 4), se encuentra principalmente en
el centro del país y pertenece junto con otras especies al complejo Phyllosoma (Justi et
al.2014). Este vector se encuentra en 10 de los 31 estados, los cuales son Colima, Guerrero,
Jalisco, Estado de México, Michoacán, Morelos, Puebla, Querétaro, Veracruz y Zacatecas
(Ramsey et al. 2012). Se considera una especie intradoméstica ya que la mayoría de los
especímenes se han colectado dentro o alrededor de las viviendas (Rodríguez-Bataz et al.
2011; Olguin-Salgado et al. 2016).

Figura 4. Espécimen adulto de T. pallidipennis. Imagen tomada de “Triatominos de la Colección
Nacional de Insectos”, Instituto de Biología. 2009

El porcentaje de infestación del insecto en las viviendas humanas y prevalencia del parásito
en el vector varía de acuerdo a la localidad: en Guerrero se tienen reportes con un
porcentaje de infestación del 88.1% y una infección natural del 21.5% (Olguin-Salgado et
al. 2016), Michoacán con un porcentaje de 77.6% de hexápodos colectados en el
intradomicilio y un porcentaje de infección del 51.4% (Martínez-Ibarra et al. 2011). Para el
Estado de México se tienen datos del 91.3% y 28% de porcentaje de infestación en las
viviendas e infección respectivamente (Medina-Torres et al. 2010). T. pallidipennises la
única especie intradoméstica colectada cerca de la ciudad de Cuernavaca. Los estudios
indican una prevalencia del parásito en los vectores del más del 50%, esto es importante de
14

considerar puesto que esta ciudad posee una población de casi un millón de habitantes
(Ramsey et al. 2005)., además de acuerdo al CENAPRECE en el 2012, el estado con mayor
número de pacientes crónicos fue Morelos.
Genéticamente, se sabe que su variación genética en sus poblaciones es relativamente baja.
(Espinoza-Gutiérrez et al. 2013), al estar estrechamente relacionado con las otras especies
del complejo Phyllosoma (Justi et al. 2014) se considera que su especiación es simpátrica.
Existe una discusión acerca de la revalidación del género Meccus ya que algunos autores
consideran a los individuos del complejo Phyllosoma dentro del género Meccus, incluso
como subespecies de la especie M. phyllosomus, sin embargo aunque se tienen evidencias
que las especies del complejo pueden generar hibridos fértiles (Martínez-Ibarra et al. 2011),
utilizando marcadores moleculares se generan las seis especies en ramas independientes
(Justi y Galvao, 2017)

Este hemíptero ha sido estudiado en condiciones de laboratorio, montando colonias y
estudiando su ciclo biológico bajo parámetros controlados (Martínez-Ibarra y Katthain-
Duchateau G. 1999; Tay-Zavala et al. 2008). También ha funcionado como modelo para
estudiar procesos fisiológicos de los triatominos, como las proteínas secretadas en su saliva
(Hernández-Vargas et al. 2017), la glicosilación de proteínas en el intestino y su interacción
con T. cruzi (Gutiérrez-Cabrera et al. 2018) entre otros, sin embargo se tienen pocos
estudios acerca de su respuesta inmune.

1.3.4. Ciclo de vida de los triatominos

Los triatominos presentan un ciclo de vida paurometábolo, es decir, los estadios ninfales
son morfológicamente similares a los adultos. Iniciando desde la puesta de huevos, estos
son de forma ovalada, operculados y de un color blanco perlado, cambiando a un tono
rojizo cuando van madurando antes de la eclosión. Antes de llegar al estadio adulto,
presentan cinco estadios juveniles enumerados del I al V, son inmaduros sexualmente, el
tamaño corporal va incrementando de forma gradual, además de desarrollar por completo
las alas de tipo hemiélitro y el conexivo en el estadio adulto (Fig. 5). El tiempo que tardan
estos insectos para completar su crecimiento varía de acuerdo a la especie estudiada, puede
ir entre los cuatro y seis meses. (Noierau et al., 2009). Tanto los estadios ninfales como los
15

adultos presentan los mismos hábitos alimenticios, son hematófagos, recurrentemente
nocturnos. Las ninfas llegan a presentar hábitos coprófagos con los cuales se puede
transmitir el parásito entre interacciones intraespecificas de las poblaciones, por lo que son
desde el primer estadio potencialmente vectores de la enfermedad. (Beaty y Marquardt,
1996; Noierau, et al., 2009).

Figura 5. Ciclo de vida subfamilia Triatominae. Especie: T. pallidipennis. Consta de cinco estadios
juveniles hasta llegar al estado adulto. Morfológicamente, las hembras se pueden diferenciar de los
machos por la forma de la terminación del abdomen, donde resalta una figura puntiaguda, la cual es
el ovopositor. Tomado del Manual del Diagnóstico y Tratamiento de la Enfermedad de Chagas.
CENAPRECE. 2015.

1.4. Morfología y fisiología

Los insectos hemípteros presentan características morfológicas que comparten todos los
miembros de este orden. Los hempiteros se alimentan de sustancias orgánicas líquidas de
origen animal o vegetal (Carcavallo et al. 2000), por lo que presentan modificaciones en su
aparato bucal, siendo de tipo picador-succionador. En la subfamilia Triatominae, el rostrum
es alargado, la probóscide está dividida en tres segmentos, ubicándose debajo de la cabeza
del insecto, plegándose y desplegándose al alimentarse. Los ojos se encuentran
generalmente bien desarrollados y presentan un par de antenas con cuatro segmentos. El
tórax es bastante característico en los triatominos; visto desde arriba, se observa una forma
triangular característica del pronoto, con 2 pares de alas. El par delantero (hemélitros)
tienen la porción basal endurecida y las porciones distales membranosas, mientras que el
segundo par de alas son únicamente membranosas, ambos pares cubren la mayor parte del
abdomen del insecto. El abdomen es cóncavo cuando el insecto no se encuentra alimentado
y puede aumentar hasta 12 veces su tamaño al alimentarse. Algo característico de los
I
II
III
IV
V
(I-V) Estadios
ninfales
16

triatominos, es la presencia de unas franjas de color amarillo o naranja alrededor del
abdomen, llamado conexivo. La talla de los insectos varía dependiendo de la especie, desde
los 0.5cm de largo en Alberprosenia goyovargasi hasta los casi 5cm en Dipetalogaster
máxima. (Beaty y Marquardt, 1996; Lehane, 2005).

La fisiología de estos insectos está relacionada a los hábitos alimenticios adquiridos en su
historia de vida. La aparación de de la hemofagia dentro de los redúvidos se cree fue
inicialmente facultativa, surgieron adaptaciones muy importantes para llegar a ser obligada,
como es la secreción de moléculas anestésicas y la capacidad de hemólisis (Carcavallo et
al. 1999; 2000). Ser estrictamente hematófagos está estrechamente relacionado con la
morfología que presentan los insectos con estos hábitos alimenticios, desde su probóscide,
hasta las modificaciones dadas en los diferentes órganos que están involucrados en la
alimentación, digestión y excreción (Lehane, 2005).

1.4.1. Alimentación y nutrición

El canal alimenticio de los insectos es un tubo, que se extiende desde la apertura oral hasta
el ano (porción posterior). La parte más importante de este canal es el tracto digestivo,
donde se lleva a cabo el procesamiento del alimento, la absorción de nutriente y el
establecimiento del parásito. (Beaty y Marquardt, 1996; Guarneri y Lorenzo, 2017). Al ser
un órgano tan importante, se explicará a detalle más adelante.

El tiempo para digerir la sangre depende de la cantidad ingerida, la temperatura del
ambiente, la edad, la fuente de alimento, etc. (Beaty y Marquardt, 1996). La absorción de
nutrientes a partir de la sangre es muy importante para los insectos hematófagos, debido a
que les permite llevar a cabo múltiples proceso fisiológicos como: la vitelogénesis para la
puesta de huevos, el crecimiento y desarrollo durante el estadio ninfal para llegar al estadio
adulto, y es una fuente de energía para la movilidad y el mantenimiento a lo largo de su
vida. Para procesar la sangre consumida, el proceso se resume en 4 grandes pasos: 1)
remover el exceso de agua de la sangre, 2) la hemolisis del alimento, 3) la degradación
hidrolítica de macromoléculas (digestión) y 4) la absorción de micromoléculas producto de
la digestión.
17

Alrededor del 95% de la sangre contiene muchas proteínas, por las proteasas que actúan
tienen un papel fundamental en la digestión, a partir de su actividad se obtienen
aminoácidos que necesita el insecto para su existencia. A partir de las proteínas del
alimento se utilizan para la biosíntesis de lípidos, y son almacenados principalmente en el
cuerpo graso.

La sangre está lejos de ser una fuente de alimento que cumpla todos los requerimientos de
la dieta del insecto, por lo que existe una asociación con diferentes microorganismos que
forman parte de una compleja relación simbiótica para obtener algunos elementos
esenciales en su dieta. Particularmente, la vitamina B es esencial para los triatominos, pero
que no pueden obtener a través de su única fuente de alimento, por lo que requieren
microorganismos mutualistas que produzca esta vitamina (tiamina, ácido pantoténico,
pyridoxina, ácido fólico y biotina) como es el caso de Rhodococcus rhodniien Rhodnius.
prolixus (Beaty y Marquardt, 1996; Lehane, 2005; Otálora-Luna et al. 2015). Éstos
simbiontes habitan de forma libre en el lumen del intestino, en los triatominos se tienen
caracterizado algunos géneros como son Streptococcus, Staphylococcus, Corynebacterum,
Mycobacterium, Pseudomonas y Escherichia (Douglas y Beard, 1996).

1.4.2. Tracto digestivo: digestión y excreción

El tracto digestivo de los triatominos consta de 3 principales regiones: el estomodeo
(también conocido como tracto superior), el tracto digestivo medio o mesenterón y el tracto
digestivo posterior o proctodeo (Fig. 6). El primero y el último provienen de un origen
ectodérmico, mientras que el intestino medio es de un origen embrionario mesodérmico,
esto es importante de mencionar, ya que los tejidos ectodérmicos forman principalmente el
tejido del tegumento, por lo que presentan en su composición una capa quitinosa, por lo que
la porción media no tiene quitina en su composición. (Beaty y Marquardt, 1996; Nation,
2005).

Figura 6. Regiones del tracto digestivo en triatominos. I. Estomodeo. II. Mesenterón, divido en
intestino anterior (II) e intestino posterior (II). IV. Proctodeo. Al final del intestino posterior se
observan unas estructuras tubulares llamadas Túbulos de Malpighi. Imagen tomada y modificada de
Kollien y Schaub, 2000.

Cada región está especializada en una función específica, el tracto superior tiene la tarea de
ingerir, conducir y llevar el alimento al intestino anterior. (Lehane, 2005). El tracto
digestivo medio se encuentra dividido en dos regiones principales: la parte anterior
(estómago) y la parte posterior (Fig. 6) (Nation, 2005). En el estómago es donde se
almacena la mayor cantidad de sangre y se lleva a cabo principalmente el procesamiento de
proteínas, lípidos y carbohidratos, las enzimas encargadas son aminopeptidasas, lipasas,
enzimas digestivas, y algunas fosfatasas. (Beaty y Marquardt, 1996; Kollien y Schaub,
2000; Nation, 2005). Para la eliminación del exceso de agua se liberan hormonas diuréticas
mediante unas estructuras especializadas de secreción llamados túbulos de Malpighi
ubicados en la porción final del intestino posterior (Fig.6). Siendo un órgano especializado
en la excreción de sustancias en la regulación osmótica e iónica del vector (Kollien y
Schaub, 2000; Aparecida-Pacheco et al. 2014).

El intestino posterior puede considerarse la parte más activa del tracto digestivo ya que es
donde se lleva a cabo la absorción de nutrientes. El intestino posterior de los insectos
hemípteros presenta una membrana llamada membrana peromicrovilar (PMM), la cual
desaparece cuando el insecto se encuentra en largos tiempos de inanición. En los
triatominos está asociada a la colonización del parásito en el tracto digestivo, se ha
observado que si no se desarrolla esta membrana, se pierde la infección del parásito en la
chinche (Albuquerque-Cunha et al., 2009; Gútierrez-Cabrera et al. 2014). En su
composición celular, el intestino posterior presenta columnas celulares y células cuboidales,
que poseen microvellosidades en la región apical, donde se lleva a cabo la absorción de
I II III IV
19

nutrientes. Para la digestión de éstos se secretan enzimas llamadas cathepsinas B y C (las
cuales funcionan junto con un pH ácido), aminopeptidasas y carboxipeptidasas, entre otras
enzimas. (Kollien y Schaub, 2000; Nation, 2005).

En la región media del intestino se encuentra la mayor cantidad de microorganismos, y
también es donde se lleva a cabo el establecimiento del parásito. Debe de existir una
regulación en las poblaciones de estos organismos, y la forma de regularla es a través de la
respuesta inmune, por lo que podemos decir que el intestino anterior y posterior son muy
activos inmunológicamente (Azambuja et al. 2017). Específicamente las lisozimas en
combinación con otros componentes de la respuesta inmune tienen un papel fundamental en
el control de la microbiota en éstos insectos (Kollien et al. 2004). Las lisozimas funcionan
controlando la carga bacteriana del intestino, y también impidiendo la colonización de los
patógenos en el hemocele (Garcia et al. 2010). La expresión de las lisozimas en el tracto
digestivo también puede ser inducida por la alimentación (Kollien et al. 2003), y de
acuerdo a Araújo y colaboradores (2006) hay una mayor producción de lisozimas en el
estómago comparándolo con el intestino posterior. En insectos se pueden encontrar
isoformas de lisozimas en el tracto digestivo, por ejemplo, en Drosophila y Anopheles es
conocido que existen múltiples genes que expresan lisozimas (Herreweghe y Michiels,
2012). En Rhodnius prolixus se sabe que existen diferentes isoformas de lisozimas
posiblemente teniendo diferentes funciones (Ursic-Bedoya et al. 2008), observándose un
aumento en su expresión al alimentarse y en insectos infectados con T. cruzi.

Por último, la región posterior del tracto digestivo es completamente quitinoso. El recto
tiene un papel fundamental en la reabsorción de agua, iones y substancias disueltas (Nation,
2005). Los elementos no utilizados en la digestión se secretan a través de las heces, como
son los restos de nitrógeno que fueron producidos a partir de la digestión de las proteínas en
forma de ácido úrico, proteínas, péptidos e iones de sulfato y fosfato (Kollien y Schaub,
2000).

En las tres regiones del tracto digestivo se puede encontrar al parásito, teniendo una
preferencia de establecerse en el recto (Kollien y Shaub, 2000), específicamente en la pared
del recto es donde el parásito se adhiere y es donde se lleva a cabo la metaciclogénesis. El
20

parásito al establecerse a lo largo del intestino, afecta la homeostasis del insecto, afectando
en su crecimiento, disminuyendo la puesta de huevos y teniendo menos longevidad
(Azambuja et al. 2017; Guarneri y Lorenzo, 2017).

1.4.3. Sistema circulatorio: cuerpo graso y hemolinfa

El sistema circulatorio de los insectos es de tipo abierto, es decir, el fluido que circula no lo
hace en un complejo de conexiones a través de vasos como es el caso de los vertebrados, si
no que fluye libremente a través del cuerpo y los órganos. (Gillot, 2005). El órgano
principal en el sistema circulatorio en insectos es un vaso tubular que atraviesa todo el
cuerpo del insecto por la parte dorsal. (Nation, 2005). Como consecuencia, los insectos
únicamente tienen un fluido extracelular, llamado hemolinfa, la cual se mueve a través del
vaso dorsal, el cual tiene una serie de órganos accesorios pulsátiles. En la parte anterior, el
vaso atraviesa dos órganos importantes en la regulación hormonal en los insectos: la
corpora allata y la corpora cardiaca, los cuales están comunicados con el cerebro. En la
parte posterior del vaso se encuentra una válvula llamada ostia o corazón, mientras que a la
porción cefalotorácica puede terminar en una región llamada aorta. Dependiendo del grupo
del insecto, pueden ser contráctiles estos órganos o simplemente fluir y retenerse en alguna
de estas válvulas. (Miller, 1985; Gillot, 2005). El vaso dorsal se mantiene en su posición
mediante tejido conectivo, el cual se encuentra adjunto al integumento dorsal, traqueolas,
intestino y otros órganos (Fig 7.) (Beaty y Marquardt, 1996).

Figura 7. Diagrama del vaso dorsal en los insectos, y sus estructuras asociadas.. Imagen tomada y
modificada de Gillot, 2005.

A través de la contracción de los músculos abdominales y los órganos accesorios del vaso
dorsal es como fluye la hemolinfa a través del cuerpo del insecto. En ella viajan diferentes
compuestos, como son nutrientes y componentes de la respuesta inmune, los cuales se
diseminan a través de los órganos cuando se libera este fluido (Gillot, 2005). La hemolinfa
es el mayor tejido de almacenaje de agua en los insectos,con un pH que puede ir de 6 a
8.2. En la hemolinfa también se transportan aminoácidos, péptidos, proteínas, carbohidratos
y lípidos (Beaty y Marquardt, 1996). También transporta diferentes tipos celulares los
cuales son llamados hemocitos, clasificándose de acuerdo a su morfología, histoquímica y
características funcionales en prohemocitos, granulocitos, plasmatocitos, esferulocitos y
oenocitoides (Lavine y Strand, 2002). El número de hemocitos que puede haber es variable,
y cada tipo de hemocito tiene una función singular como es promover la coagulación o la
fagocitosis de agentes extraños, el almacenaje y la distribución de los nutrientes, la síntesis
de proteínas, etcétera

El cuerpo graso es el principal tejido para el metabolismo intermediario en los insectos. Se
trata de un tejido irregular el cuál abarca la mayor parte del hemocele. Compuesto por
diferentes tipos celulares, clasificados en trofocitos y micetocitos, con una morfología muy
similar a los hemocitos. Los trofocitos (también llamados adipocitos) son las células más
importantes del cuerpo graso. Al irse desarrollando los insectos, empiezan a desarrollarse
22

vacuolas en el interior celular, lugar donde se almacenan grasas, proteínas y carbohidratos.
En este órgano también se da la síntesis de proteínas, lípidos y carbohidratos (Beaty y
Marquardt, 1996; Gillot, 2005). Existe una comunicación entre la hemolinfa y el cuerpo
graso, dándose un intercambio de metabolitos, principalmente del cuerpo graso hacia el
primero, ya que representa la mayor fuente y síntesis de proteínas para ésta. La mayor
proteína sintetizada en el cuerpo graso es la vitelogenina, representando del 70-90% de la
proteína secretada en un adulto, la cual es vital para el desarrollo de los huevos (Gillot,
2005).

Junto con la hemolinfa y los hemocitos, el cuerpo graso es uno de los mayores sitios donde
se da la producción y secreción de péptidos antimicrobianos (Hoffmann, 2003). Una
función independiente a su importancia fisiológica es la defensa contra agentes patógenos.

1.5. Respuesta inmune

Los insectos son el grupo de animales más diverso en el planeta, se pueden encontrar en
todos los ambientes y eso es debido a su gran capacidad de adaptación ante los constantes
cambios. Como otros organismos, existe un amplio espectro de patógenos que pueden
infectar a los insectos, como son bacterias, virus, hongos y parásitos (Vallet-Gely et al.
2008; Vilcinskas, 2013). Para poder defenderse de estos agentes, los insectos se basan
principalmente en su sistema inmune (Viljakainen, 2015).

El sistema inmune de los insectos es de tipo innato. Los componentes que lo conforman se
pueden dividir en una respuesta de tipo humoral o celular, actuando en conjunto para la
eliminación del patógeno. (Lanz-Mendoza et al. 1996; Tsuzuki et al. 2014).

La protección contra los patógenos comienza con una serie de barreras físicas, como es la
cutícula del insecto y otras barreras internas como son es el hemocele y el intestino (Tsakas
y Marmaras, 2010). Al ser superadas las barreras físicas, los microorganismos son
reconocidos mediante un sistema de receptores de reconocimiento de patrones (PRRs por
sus siglas en inglés) los cuales se unen a dominios conservados ubicados en la superficie
del invasor, denominados patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs por sus
siglas en inglés) (Buchon et al. 2014).
23

Algunos ejemplos de PAMPs son las proteínas de superficie de membrana de parásitos, el
lipopolisacárido bacteriano, el peptidoglicano de bacterias de tipo gram + y de hongos
(Nappi y Ottaviani, 2000). La respuesta inmune en los insectos, es inducible a partir de dos
vías de señalización, la vía Toll e Imd. (Lehane et al. 2005). De manera general, los
receptores de la vía Toll reconocen a las bacterias de tipo gram + y a los hongos, mientras
que la vía Imd regula la respuesta a bacterias de tipo gram – (Azambuja et al. 2017).

En la respuesta celular, los hemocitos actúan en la defensa del insecto mediante la
fagocitosis, nodulación y encapsulación de los patógenos. La respuesta de tipo celular
ocurre principalmente en el hemocele, y no es excluyente a la respuesta de tipo humoral, ya
que las 2 actúan en conjunto para la eliminación de los patógenos, los hemocitos pueden
reconocer al patógeno, y posteriormente desencadenar la síntesis de los productos de la
respuesta inmune humoral (Viljakainen, 2015).

En la respuesta humoral se liberan diferentes compuestos. Su síntesis esta mediada en los
hemocitos, en las capas epiteliales del integumento del intesto y en el cuerpo graso (Vallet-
Gely et al, 2008). La respuesta humoral incluye la activación de cascadas enzimáticas que
regulan la coagulación de la hemolinfa y melanización del patógeno, la producción de
compuestos citotóxicos como especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (NO) y la
producción de péptidos antimicrobianos (Fig. 8) (AMPs) (Hoffmann y Reichhart. 2003).

Figura 8. Esquema general de la respuesta inmune en insectos. En la activación de la respuesta
celular, existe una multiplicación de los hemocitos, los cuales mediarán la defensa del insecto
fagocitando, encapsulando o nodulando a los patógenos. En el cuerpo graso también se da una
proliferación celular, junto con las células del epitelio intestinal se dará la producción de los
componentes de la respuesta inmune de tipo humoral. A. La producción de ROS mediante la
proteína dDuox, las cuales oxidarán las membranas de los patógenos produciendo su muerte. B. La
producción de AMPs. Primero existe un reconocimiento de los PAMPs, desencadenando la vía Imd,
aunque también se pueden producir por la vía Toll. Éstos se unirán por afinidad de cargas a los
componentes de superficie de los patógenos, produciendo su lisis y posterior muerte. Imagen
tomada y modificada de: Vallet-Gely et al. 2008.

1.5.1. Péptidos antimicrobianos (AMPs)

Existen alrededor de 150 peptidos antimicrobianos que ya han sido caracterizados en
insectos (Tsakas y Marmaras, 2010). Estas moléculas son pequeñas, normalmente con
menos de 100 aminoácidos, con la presencia de aminoácidos catiónicos confiriéndoles una
carga positiva con la que probablemente se unen a la membrana de los microorganismos
por afinidad (Sitaram y Nagaraj, 1999). Sin embargo, la composición de los aminoácidos,
su actividad biológica y la conformación estructural varía a lo largo de los diferentes grupos
de AMPs, aunque en todos el mecanismo de acción es similar, formando poros en la
membrana o interrumpiéndola, ocasionando la muerte de los organismos (Skorupa-Parachin
et al. 2012).

La producción de los AMPs se da principalmente en el cuerpo graso (Hoffman y Reichhart,
1997). Esto ocurre cuando hay una herida en el tegumento o cuando se presenta una
infección, desencadenando las vías de señalización requeridas para su producción,
transportándose mediante la hemolinfa a lo largo del cuerpo del insecto. En el intestino de
los insectos también se da una producción y secreción local de AMPs, una respuesta la cuál
le confiere resistencia ante los parásitos intestinales (Ganz, 2003; Ravi et al. 2011).
Muchos de estos péptidos se han aislado de diferentes especies de insectos y categorizados
de acuerdo a su homología en diferentes familias: Las cecropinas, attacinas, diptericinas y
defensinas, cada una teniendo diferente estructura y una actividad antibiótica contra
hongos, protozoarios, y bacterias gram + y - (Ravi et al. 2011; Azambuja et al. 2017). En
triatominos los péptidos antimicrobianos que actúan en la respuesta inmune están poco
caracterizados. De manera general, podemos mencionar diferentes isoformas de defensinas
(Lopez et al. 2003), la prolixicina y a las lisozimas (Ursic-Bedoya et al. 2011; Azambuja et
al. 2017). Sin seguir el concepto tradicional de péptido antimicrobianoen cuanto a tamaño,
las lisozimas forman parte de estas últimas proteínas con efecto antimicrobiano. (Smith y
Dyrynda, 2015).

1.5.2. Lisozimas

Las lisozimas son enzimas de tipo de las muramidasas debido a la capacidad de hidrolizar
el enlace β-1-4-glucosídico entre el ácido N-acetilmurámico (NAM) y los residuos de
Nacetilglucosamina (NAC) del peptidoglicano presente de las bacterias Gram +,
debilitando la pared celular de las bacterias, causando la lisis celular (Fig. 9) (Callewaert y
Michiels, 2010).

La función más importante de las lisozimas en la mayoría de los organismos es en la
protección contra agentes patógenos. Al actuar directamente sobre los enlaces que unen al
peptidoglicano, la lisozima es casi inactiva contra bacterias gram – por la dificultad de
acceder a éste por la cubierta de lipopolisacaridos que poseen. Algunos otras funciones se
han propuesto, como es la acción sinérgica de las lisozimas con otros AMPs siendo
efectivas contra las bacterias gram – o en funciones digestivas. Algunas lisozimas pueden
26

formar dímeros aumentando su actividad o surgiendo actividades biológicas diferentes
como la digestión del alimento (Callewaert y Michiels, 2010; Carrillo, 2014).

Figura 9. Estructura del peptidoglicano de la pared celular de las bacterias gram +. Se muestra el
sitio de acción de las lisozimas. Imagen tomada de Carrillo, 2014.

La conformación estructural de las lisozimas consiste principalmente en dos dominios: el
dominio “α” conformado únicamente por α-hélices (de uno a 40 y de 90-129 residuos de
aminoácidos) conectado al β dominio, el cuál es un dominio estructural que consiste en al
menos tres cadenas antiparalelas formando una estructura secundaria β-plegada (41-89
residuos de aminoácidos) (Carrillo, 2014). La enzima posee ocho cisteínas y cuatro enlaces
disulfuro, dos en el dominio alfa y dos en el dominio beta, lo cual le confiere una gran
estabilidad térmica, además al tener las regiones no polares al interior de la molécula
también es muy estable en soluciones ácidas (Matusmara et al. 1989; Lesnierowski et al.
2007). La conexión entre ambos dominios es una α-helice muy larga donde se encuentra el
sitio activo. En este sitio se encuentran conservados dos grupos catalíticos donde se da la
unión al substrato, el ácido glutámico (en la posición 35-Glu35) y el ácido aspártico (en la
posición 52-Asp52), siendo esenciales para la actividad catalítica de la enzima (Fig. 10.). El
sitio activo de la lisozima consiste en seis zonas: A, B, C, D, E y F, que a su vez se unen a
seis residuos de azucares. (Callewaert y Michiels, 2010).

Figura 10. Estructura tridimensional de la lisozima de huevo de tipo “c”. Con dos dominios: el
dominio alfa se compone únicamente de estructuras hélice unido al dominio el cual está
conformado por tres cadenas antiparalelas conformando una estructura plegada. La unión de estos
dominios está dada por una helice muy larga donde se encuentra el sitio activo (los cilindros
representan cinco de las seis zonas del sitio activo). Imagen tomada y modificada de Carrillo, 2014.

De acuerdo a las diferencias en la secuencia de aminoácidos, sus propiedades bioquímicas y
enzimáticas, las lisozimas se han clasificado en 4 tipos: de tipo “c” o convencional, de tipo
“g” (tipo ganso), de tipo “i” (tipo invertebrado), y tipo “ch” (tipo Chalaropsis)
(Herreweghe y Michiels, 2012). El sitio catálitico de la enzima es muy consevardo y es
invariable entre las familias de las lisozimas, sin embargo puede cambiar la posición de los
residuos catalíticos, como en las de tipo “i”, el ácido glútamico en la posición 18 y el ácido
aspártico en la posición 30, incluso pueden tener un solo residuo como el caso de las
lisozimas de tipo “g” (Fig. 11). El parentesco de los aminoácidos entre tipos de lisozimas es
relativamente bajo, con un 24% de parentesco entre la tipo “c” y la “i”, 19% entre las tipo
“c” y “g” y con un 16% entre las tipo “i” y “g”. La masa molecular de las lisozimas de tipo
“c” e “i” es de 11-14kDa mientras que las tipo “g” son más pesadas, entre 20-22kDa. El
punto isoeléctrico, número de cisteínas, y el número de aminoácidos varía entre cada grupo
de estas enzimas (Callewaert y Michiels, 2010), en la siguiente tabla se encuentra un
resumen acerca de sus diferencias:

Dominio β
Dominio α
Sitio activo
de la enzima
28

Tabla 1. Diferencias más importantes entre las lisozimas.

Fig. 11. Estructura de las lisozimas: de tipo "c" o convencional (A), de tipo "g" (B) y de tipo "i" (C).
Los residuos cataliticos (Glu/Asp) se encuentran señalados. La interacción de las enzimas de tipo
"i" pueden formar dimeros (C). Imagen tomada de Callewaert y Michiels, 2010.

Las lisozimas de tipo “c” se han encontrado tanto en vertebrados como en invertebrados,
reportándose en al menos seis grupos de insectos (Herreweghe et al. 2010). En cuanto a las
lisozimas de tipo “i” son exclusivas de los invertebrados (en nematodos, artrópodos,
poríferos y equinodermos entre otros), aunque en triatominos no se han hallado genes que
expresen este tipo de enzimas. Las lisozimas “g” podría decirse que son el grupo de
lisozimas con más peculiaridades, restringiéndose a vertebrados y algunos grupos de
invertebrados pero no en insectos (Callewaert y Michiels, 2010). Pueden existir más de un
tipo en un organismo por lo que son muy interesantes desde un aspecto evolutivo
(Callewaert y Michiels, 2010). Liu en el 2006 a partir de un estudio filogenético de tres de
los cuatro tipos de lisozimas determinó que las de tipo "i" y "g" se encuentran más
Lisozima Aminoácidos
(proteína
madura)
Péptido
señal
Masa
molecular
(kDa)
Punto
isoeléctrico
predictivo
Número
de
cisteínas
Posición
Glu
Posición
Asp
Tipo c 129 18 14.3 9.32 8 35 52
Tipo i 123 11+2 13.7 9.03 14 30 18
Tipo g 185 - 20.37 9.53 4 73 -
29

relacionadas entre sí, mientras que las de tipo "c" eran más antiguas, proponiendo a las
lisozimas de tipo “c” como las más antiguas.

Su estudio puede ser complicado ya que existen duplicaciones que expresan esta enzima.
Por ejemplo en Drosophila se conocen 12 genes funcionales (Daffre et al .1994) Esto
permite al organismo diversificar más de un tipo de lisozima, proporcionandoles una
función especialista, variando su expresión y actividad en diferentes tejidos sin perder su
función original. Un ejemplo de esto es producción en el estómago de los insectos para la
digestión (Irwin, 1996).

En los insectos se ha demostrado que la producción de las lisozimas puede ser inducida,
observando n aumento de actividad de lisozima en la hemolinfa de diversos ordenes
(Azambuja et al. 1987; Hernandez et al. 2003; Gandhe et al. 2006). Los hexápodos
degradan tejidos durante su metamorfosis como barreras físicas, teniendo un periodo
vulnerable contra patógenos, por lo que la producción de péptidos antimicrobianos es
crucial para su supervivencia, especialmente en las células del intestino donde se
almacenan en granulos que son liberados al lumen intestinal antes de la metamorfosis
(Callewaert y Michiels, 2010).

Es importante realizar estudios de su función biológica, bioquímica y aspectos evolutivos
que nos sirvan para entender otros procesos en los organismos. Incluso en la industria son
utilizadas para la esterilización de alimentos, en la industria farmacéutica, y en la medicina
(Carrillo, 2014).

2. Antecedentes

En diferentes especies de triatominos se han identificado genes codificantes para las
lisozimas. Para Rhodnius prolixus se han identificado dos genes que codifican lisozimas:
RpLys-A y RpLys-B, en el intestino y en el cuerpo graso respectivamente. En el estudio se
midió la expresión relativa por q-PCR de ninfas V infectadas con Trypanosoma.cruzi cepa
Y(con alta virulencia en ratones Balb/c, con un 100% de mortalidad al día 40, de acuerdo a
Suárez y colaboradores en 2009) encontrando una mayor expresión de RpLysA en el tracto
digestivo (Ursic-Bedoya et al. 2008).

En Triatoma infestans se aisló un gen codificante para lisozima a partir del intestino
(nombrada Lys1). Por la técnica de Northern bot se estudió su expresión diferencial en el
intestino anterior, posterior y hemocele, siendo mayor en intestino anterior y hemocele al
día 15 post-alimentación (Kollien et al. 2004). En la misma especie, se caracterizó otra
lisozima a partir de cDNA también del tracto digestivo, nombrándola como Lys2. (Balczun
et al. 2008).

Para T. brasiliensis también se tiene caracterizado un gen codificante para lisozima aislada
de tracto digestivo. En este trabajo, utilizando PCR en tiempo real se midió la expresión de
la lisozima en diferentes tejidos del vector y a diferentes días, observando una expresión
muy baja de ésta en intestino posterior y cuerpo graso, teniendo únicamente una alta
expresión en intestino anterior al día 5 post-alimentación (Araújo et al. 2006).

En nuestro laboratorio, en la especie T. pallidipennis se obtuvo una secuencia parcial de
una lisozima a partir de cDNA de cuerpo graso. También se determinó si existía una
expresión del gen en diferentes tejidos del insecto ante una infección con T. cruzi cepa
Ninoa. Mediante RT-PCR se amplificó el gen de la lisozima en cuerpo graso, intestino
anterior y posterior al día 10 y 15 post-alimentación/infección, obteniendo un amplificado
en todos los órganos, excepto en cuerpo graso de vectores sin infectar al día 10 post-
alimentación (Espinosa-De Aquino, 2012). De acuerdo al estudio realizado podemos
determinar que podría existir la presencia de lisozimas en el tracto digestivo y cuerpo graso
de T. pallidipennis. La causa de la ausencia del gen al día 10 post-alimentación podría
31

indicar que en cuerpo únicamente existe una expresión de lisozimas bajo una infección con
el parásito.

Existen pocos estudios sobre la proteína y de la actividad enzimática de las lisozimas en
los triatominos. Existe un reporte en la especie R. prolixus, demostrando una actividad
enzimática en la hemolinfa, la cual fue inducible mediante una infección bacteriana
(Azambuja y Garcia, 1987). Y antecedentes en nuestro laboratorio han mostrado actividad
de lisozima en la hemolinfa de T. pallidipennis (Díaz-Garrido, 2013). Sin embargo, la
funcionalidad de esta enzima aún no se ha estudiado en el grupo de los triatominos, además
que a nivel proteína, no se sabe la interacción que pueda tener en una infección con T.
cruzi.

3. Justificación.

Las lisozimas son un componente muy importante en la respuesta inmune de los insectos,
además de tener otras funciones en el organismo como es en la digestión del alimento. A
nivel proteína, se conoce muy poco por lo que el presente trabajo aportará nueva
información acerca de la fisiología de la enzima además de proveer conocimiento básico
para este grupo de organismos. Conocer acerca de la interacción parásito-vector y el papel
de los componentes que pueden estar regulando al parásito en el tracto digestivo nos
ayudará a conocer más acerca de la biología de la enfermedad.

4. Hipótesis

Si pueden existir diferentes tipos de lisozimas en los insectos es posible que se encuentren
también diferentes lisozimas en los órganos del vector Triatoma pallidipennis con una
diferencia de su actividad biológica afectada por el órgano en donde se encuentren,
condición fisiológica del insecto o ante un estímulo inmunológico.

5. Objetivos

Objetivo general:

 Caracterizar lisozimas en el vector Triatoma pallidipennis, además estudiar el cambio
de expresión de las lisozimas en vectores infectados con T. cruzi.
Objetivos particulares:

- Identificar actividad de tipo lisozima en diferentes órganos del vector.
- Determinar si existe un aumento o disminución de la actividad enzimática de la
lisozima ante una infección con T.cruzi.
- Caracterizar bioquímicamente a las lisozimas por pruebas de inhibición de la
enzima y pruebas de actividad a diferentes pH.
- Comparar las diferencias en secuencia de la lisozima del cuerpo graso de T.
pallidipennis con otras lisozimas de insectos.
-

6. Diseño experimental

7. Materiales y Métodos

7.1. Insectos

Los triatominos utilizados para los ensayos de este estudio fueron obtenidos a partir de una
colonia de la especie Triatoma pallidipennis establecida en el laboratorio. Antes de su uso
los insectos fueron mantenidos en una incubadora a 25-28°C, con humedad relativa, siendo
alimentados cada mes con sangre de conejo sano hasta alcanzar el estadio de ninfas V.
Estas ninfas se alimentaron y fueron utilizadas en los experimentos posteriores 15 días
post-alimentación.

7.2. Ratones e infección

Se utilizaron ratones hembra de la cepa BALB/c de 8 semanas, los cuales fueron
proporcionados por el bioterio del Instituto de Investigaciones Biomédicas. Para la
infección se utilizó la cepa Ninoa (MHOM/MX/1994/Ninoa), la cual fue aislada de un caso
humano de Oaxaca (Monteón et al. 1996). Los ratones fueron inoculados vía intraperitoneal
con 300, 000 tripomastigotes sanguíneos de la cepa Ninoa recuperados de un ratón
infectado con esta cepa y utilizando como vehículo un buffer de fosfatos (PBS) (Fosfato de
sodio dibásico 10 mM, fosfato de sodio monobásico 10 mM, NaCl2 al 137 mM, pH 7.4).
Como grupo control, se utilizaron ratones inoculados con PBS.

Se formaron dos grupos de vectores ninfas V, el grupo control y el grupo experimental,
cada uno con al menos 7 vectores. Al grupo control se les alimentó con los ratones
inoculados con PBS. Para la infección de los triatominos, se utilizaron los ratones
infectados con Trypanosoma cruzi a 21 días post-infección (11 semanas), calculando la
parasitemia mediante el conteo de parásitos con hemocitometro, utilizando únicamente a
los ratones con una parasitemia promedio de 1x10
6
± .5x10
6
/ml de sangre.

Previo a la alimentación, cada insecto fue pesado. Los vectores fueron alimentados con los
ratones sanos o infectados durante 3 horas. Una vez concluido el tiempo de alimentación,
cada insecto se pesó nuevamente para tener un estimado de la cantidad de sangre ingerida y
poder hacer grupos de insectos que hubieran tomado una cantidad de sangre similar. La
35

cinética de infección se siguió a lo largo de un mes, teniendo diferentes puntos en la
cinética: 1, 3, 7, 14, 21 y 28 días post-alimentación/infección. En cada uno de los puntos se
sacrificó una ninfa V de cada uno de los grupos. Se realizaron 3 cinéticas independientes
con las condiciones explicadas anteriormente.

7.3. Disección de órganos y extracción de proteínas

La extracción de la hemolinfa se realizó 14 días post-alimentación/infección, con una
punción entre el trocánter y la coxa de las patas posteriores, recuperando la hemolinfa con
ayuda de una micropipeta, mezclándose con PBS en una proporción volumen –volumen
1:1. Las muestras se mantuvieron en congelación a -20°C hasta el momento de su uso.

Para la extracción de las proteínas, se realizó la disección de las ninfas 5° estadio infectadas
y no infectadas en los días arriba mencionados.

Los hexápodos se sacrificaron por congelación, Posteriormente se colocaron en cajas petri
sobre una cama de hielo para mantener una temperatura baja y evitar la degradación de
proteínas. Además los insectos se mantuvieron sumergidos en un buffer de fosfatos (PBS).
(Gutiérrez-Cabrera et al., 2014).

Para la disección de los órganos se colocó al insecto en posición ventral, se le cortó el
conexivo a la altura del tórax para retirar el tegumento abdominal y poder extraer el tracto
digestivo integro;el cuerpo graso se recuperó de la cavidad hemocélica. El tracto digestivo
se dividió en dos secciones: intestino anterior e intestino posterior. Los órganos fueron
lavados 3 veces con PBS hasta quitar los residuos de alimento del intestino, se procedió
igual con el cuerpo graso y posteriormente se colocaron en tubos limpios para la extracción
proteica.

A los órganos se les añadió un buffer de lisis conformado por Urea 7 M, Tiourea 2 M,
Chaps al 4% y Tris al 10 mM en una proporción volumen-masa 3:1 con inhibidores de
proteasas (EDTA 0.5 M, PMSF 200 mM, Leupeptin 10 mM y Pepstatin 1 mM). Con ayuda
de micropistilos se disgregaron los órganos y posteriormente se utilizó un vortex para
36

mezclar el buffer con el tejido durante 3 minutos. Las muestras se centrifugaron durante 10
minutos a 10 000g para separar el tejido, recuperando el sobrenadante y colocándolo en
nuevos viales, manteniéndolos en congelación a -20°C hasta el momento de su uso.

Para la cuantificación de proteínas de la hemolinfa se utilizó el método de Lowry, usando el
kit DC Protein Assay de Biorad, utilizando una curva estándar con concentraciones
conocidas de albúmina de suero bovino (BSA). La absorbancia se leyó a 655nm.

Al tener altas concentraciones de urea, las muestras de órganos fueron cuantificados con un
kit especial llamado 2-D Quant Kit de GE Healthcare de acuerdo a las instrucciones del
fabricante. También se utilizó una curva estándar con concentraciones conocidas de BSA.
La absorbancia se leyó a 595 nm.

7.4. Electroforesis de proteínas

Para la separación de proteínas y observar su integridad, además de funcionar como control
de carga, se realizó electroforesis de proteínas en geles de acrilamida en presencia de
Dodecil Sulfato de Sodio(SDS/PAGE). Se realizaron geles con una dimensión de 8.6 x 6.8
cm con un grosor de 0.75mm. Para el gel separador se utilizó acrilamida al 15% en una
solución amortiguadora Tris-HCl al 0.5M pH 8.8 con SDS al 0.1%. (Sambrook y Russell,
2001). Para el gel concentrador se utilizó acrilamida al 4% en una solución amortiguadora
Tris-HCl al 0.5M pH 6.8 y agua bidestilada. La acrilamida utilizada fue a partir de una
solución de acrilamida 30%/ 0.8% bisacrilamida en agua bidestilada. Para la reacción de
polimerización se utilizó una solución de persulfato de amonio al 10% y N, N, N, N -
tetrametilen-diamina (TEMED, Sigma T9281).

Se emplearon 10 µg de proteína, calentándolas durante 5 min en agua hirviendo en
presencia del amortiguador de carga (1%SDS, con azul de bromofenol al 0.005% con β-
mercaptol al 2.5%). Para la electroforesis, se utilizó un amortiguador de electroforesis (Tris
0.125 M, Glicina 0.96 M y SDS al 0.5 M concentraciones finales), los geles se corrieron a
150 V durante una hora. Se utilizaron marcadores de peso preteñidos, para bajos pesos
moleculares (Dual Xtra Standar, BioRad 161-0377). Finalmente, los geles se tiñeron en
37

una solución Coomasie blue (0.025% Coomasie blue R-250, 10% ácido acético, 30%
etanol) y se fotografiaron con ayuda de un fotodocumentador GEL LOGIC (KODAK)

7.5 Ensayo de actividad enzimática (zimograma)

Para realizar las pruebas de actividad enzimática se realizaron electroforesis SDS/PAGE
explicadas anteriormente con las siguientes modificaciones. Para el gel separador del
zimograma se utilizó acrilamida al 15% con el sustrato (Micrococcus luteus desactivado al
0.2% m/v desactivados por autoclave 15 minutos 16psi 121°C) (Audy P. et al. 1989) en una
solución amortiguadora Tris-HCl al 0.5M pH 6.8 con SDS al .1%.

Las muestras problema fueron preparadas con 15µg de extracto de proteínas y fueron
calentadas durante 2 minutos en presencia del amortiguador de carga (1% SDS, con azul de
bromofenol sin presencia de β-mercaptol) en una proporción V: V 1:1 (Audy P. et al.
1989). Como control positivo se utilizaron 10µg de lisozima pura de huevo tipo “c”
(Sigma L-7651). Para la electroforesis, se utilizó un amortiguador de electroforesis (Tris
0.125 M, Glicina 0.96 M y SDS al 0.5 M concentraciones finales) previamente filtrado con
un poro de .45 µm, los geles se corrieron a 150 V durante una hora y media.

Los geles se lavaron con agua Milli-Q durante 30 minutos para eliminar el SDS que quede
en el gel, posteriormente se agregó el amortiguador renaturalizante (25mM Tris-HCl pH 7,
con 10 mM MgCl2, 0.1% Triton x-100), y se dejó incubando 18 horas a temperatura
ambiente. Al siguiente día, se realizó la tinción con la solución de azul de metileno al 0.2%
durante 3 horas, y luego se lavaron los geles con agua desionizada. Las bandas donde hubo
proteólisis fueron visualizadas como bandas más transparentes en el fondo azul del gel, esta
técnica permite un mayor contraste para poder tomar registro fotográfico. Con ayuda de un
fotodocumentador GEL LOGIC se tomaron las fotografías con iluminación de luz clara en
un fondo negro (Strating y Clarke, 2000).

Para determinar la existencia de actividad lítica de tipo lisozima en la hemolinfa de T.
pallidipennis se realizó la técnica de prueba de actividad explicada anteriormente. Para este
ensayo se utilizaron las proteínas extraídas a partir de ninfas de V° estadio 15 días post-
38

alimentación y 14 días post-infección. La hemolinfa utilizada fue un pool obtenido partir de
la extracción de 10 ninfas para cada condición experimental.

También se utilizaron extractos proteicos de diferentes tejidos (tracto digestivo, cuerpo
graso, tejido muscular y glándulas salivales) para determinar si existía una actividad
enzimática en tiempos prolongados de ayuno se emplearon ninfas de estadio V con 3
meses sin alimentar.

Para observar si existía un cambio en la actividad lítica de la enzima que fuera ocasionado
por la presencia del parásito, se observó la actividad enzimática en una cinética de
infección por la técnica de zimograma. Se evaluaron los días 1, 3, 7, 14, 21 y 30 post-
infección/alimentación. Se realizaron 3 experimentos independientes.

7.7. Ensayo de inhibición de actividad enzimática

Las muestras evaluadas fueron preparadas con el amortiguador de carga, añadiendo el
reactivo inhibidor Imidazol que es un inhibidor de la actividad de las lisozimas (Imidazol
Sigma I5513-25G) a diferentes concentraciones (2 M, 4 M y 6 M) (Shinitzky et al. 1966).
Se realizó una modificación en el método ya que el protocolo original consistía en medir
por absorbancia a M. luteus en suspensión, nosotros al observar la actividad en el gel
aumentamos la concentración molar del imidazol. Para llegar a las concentraciones
empleadas, se realizó una previa estandarizaron. Como control negativo se cargó una
muestra sin el inhibidor. A la par, se realizó una misma cinética de concentración utilizando
5 µg de proteína de lisozima pura de huevo tipo “c” (Sigma L-7651) y 10 µg de las
muestras problema (Shinitzky et al. 1966). Se realizó una prueba de actividad enzimática
por duplicado para el intestino anterior y posterior, utilizando los días de la cinética de
infección con mayor actividad enzimática. También se realizó un triplicado utilizando
hemolinfa 15 días post-alimentación. Se cuantificó la inhibición de la actividad enzimática
midiendo por densitometría la zona de actividad proteolítica mediante el software IMAGEJ.

Para normalizar los datos se utilizaron los valores densitométricos de las muestras sin el
imidazol, considerando una actividad del 100% y dividiéndolo con el valor densitométrico
de las muestras a las que se les añadió el Imidazol.

7.7. Ensayo de actividad enzimática a diferentes pH

Para determinar el pH óptimo de la actividad de la lisozima se utilizó una prueba de
actividad enzimática (zimograma) incubando los geles en una solución renaturalizante a
diferentes pH. Al incubar los geles en el amortiguador (25 mM Tris-HCl) se ajustó el pH a
4, 6.8 y 8.9, teniendo asíun medio ácido, otro neutro y uno básico. Las muestras se dejaron
incubando durante 18 horas, y como control positivo se utilizaron 10µg lisozima pura de
huevo tipo “c”. Se realizó el ensayo por duplicado. También se utilizó hemolinfa de ninfas
15 días post-alimentación. Para cuantificar la actividad enzimática se midió la
densitometría de la zona de acción lítica mediante el software IMAGEJ.

7.8. Análisis filogenético

Para realizar los análisis filogenéticos se descargaron las secuencias de las lisozimas del
Centro Nacional de Información y Biotecnlogía (NCBI): https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
disponible en línea. Únicamente se utilizaron secuencias homologas para la secuencia de la
lisozima. Para determinar su homología se realizaron comparaciones de secuencias con el
algoritmo BLAST: www.blast.ncbi.nlm.nih.gov disponible en línea. También se realizó un
alineamiento múltiple de secuencias utilizando nuestra secuencia parcial de T.
pallidipennis, y las secuencias de lisozimas de T. brasiliensis y T. infestans a partir del
algoritmo de alineamiento múltiple T-COFFEE (Disponible en línea:
http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/index.html). Con el mismo algoritmo se realizaron los
alineamientos a partir de la traducción a aminoácidos.

De acuerdo a Callewaer y Michiels, 2010, se descartaron las secuencias que no tuvieran un
score de identidad mayor a 40. Para la construcción del árbol filogenético de la lisozima se
utilizaron 24 secuencias de lisozimas tipo “c” de invertebrados, orden Hemiptera: Triatoma
brasiliensis (AY692463), Triatoma infestans lisozima 1 (AY253830) y lisozima 2
(DQ888712), Rhodnius prolixus lisozima A (EU250274) y lisozima B (EU250275),
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/
http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/index.html
40

Panstrongylus megistus (GBGD01003454), Riptortus pedestris (AK416888) y
Pristhesancus plagipennis (KY031017). Orden Diptera: Aedes albopictus (AY089957),
Aedes aegypti (AY693973), Anopheles gambiae lisozima c-1 (DQ007317), Anopheles dirus
lisozima c-1 (EU622903), Anopheles stephensi (AB104688), Drosophila melanogaster
precursor lisozima c (Z22226), lisozima E (NM57479), lisozima S (NM057479), lisozima
A (Z22223), lisozima D (NM057475), lisozima P (NM057480) y orden Lepidoptera: Samia
ricini (AB048258), Antheraea pernyi (DQ353869), Ostrinia nubilalis (HQ260967) y
Agrius convolvuli (AY164482). Como grupo externo se utilizó una lisozima tipo “g” de
molusco (Haliotis diversicolor; KU886541).

La secuencia para realizar el análisis filogenético de la lisozima de T. pallidipennis fue
obtenida por la Biól. Paulina Díaz a partir de cuerpo graso., Se realizó la extracción de
RNA total de cuerpo graso por el método de Trizol, posteriormente se amplificó mRNA
por RT-PCR. Las condiciones utilizadas para la mezcla de reacción fueron las siguientes:
2.5mM de MgCl2 (Invitrogen), 0.2 mM de dNTPs (Invitrogen), 1.25 U/L de Taq
polimerasa (Invitrogen), amortiguador Taq 1x y los primers diseñados a partir de la
secuencia de lisozima de T. brasiliensis (F- F-ACTATGCCTTGTTGCCCTGC; R- R-
TTTGTTCTGCCAACCGTACC) a una concentración final de 100nM. La reacción se llevó
a un volumen final de 30 μl. Los parámetros de amplificación fueron los siguientes: Un
ciclo de 95°C por dos minutos, seguido de 30 ciclos de 94°C por un minuto, temperatura de
alineamiento de 57°C por 1 minuto, 72°C por un minuto y una extensión final a 72°C por
10 minutos. La PCR se realizó en el termociclador PTC-100 Programmable Thermal
Controller (MJ research Inc). El tamaño esperado del amplificado fue de 361 pb, el cual se
mandó a secuenciar por el método Sanger. La secuencia ya se encuentra disponible en línea
con el número de acceso MH005839.

Al realizar el alineamiento de los nucleótidos, éstos se recortaron a la longitud de la
secuencia parcial de T. pallidipennis. Los análisis filogenéticos y moleculares para la
construcción del árbol filogenético se realizaron por estimación de máxima verosimilitud
mediante máxima parsimonia y fueron llevados a cabo utilizando el software MEGA 7
(Tamura, Stecher, Peterson, Filipski, y Kumar 2016). El número de réplicas de Bootstrap
41

utilizado para este trabajo fue de 10 000, considerando los gaps como una deleción parcial.
El tamaño del alineamiento final fue de 345 nucleótidos.

Para elegir el modelo de sustitución se realizó una búsqueda del modelo que más se
adecuará a nuestro alineamiento en el mismo programa, resultando el modelo Kimura-2-
parámetros (K2+I+G), con sitios invariables +I y distribución Gamma +G de 1.02, con el
score BIC más bajo de 12823.17.

8. Resultados

8.1. Actividad de tipo lisozima en tracto digestivo de vectores sin alimentar

Para observar si existía una actividad constitutiva de tipo lisozima en diferentes órganos y
tejidos de T. pallidipennis se utilizó un pool de 3 ninfas 5° estadio con 3 meses sin
alimentar. Al realizar la electroforesis de proteína se observaron múltiples bandas de
proteínas entre un peso de 15-250 kDa, una de ellas de aproximadamente 14.5 kDa presente
en todos los órganos (Fig. 12A). Al realizar la prueba de actividad enzimática, se encontró
una actividad en un peso de 14.5 kDa en las dos porciones del tracto digestivo (intestino
anterior e intestino posterior). La banda de actividad en el intestino anterior se observó con
una intensidad mayor respecto al posterior (Fig. 12B). Anteriormente se realizó un ensayo
de actividad enzimática de ninfas con 1 mes sin alimentar y se observó mayor actividad en
intestino anterior respecto al intestino posterior (no se muestra la imagen). En los otros
órganos evaluados (cuerpo graso, músculo torácico y glándulas salivarías) no se observó
una actividad lítica evidente (Fig12B). No se evaluó la actividad de lisozima en recto al
carecer de material suficiente para el ensayo.

Figura 12. Actividad de lisozima en vectores sin alimentar. Se realizó una electroforesis de
proteínas en geles de acrilamida al 15% en presencia de b-mercaptoetanol y la prueba de actividad
enzimática con electroforesis en geles de acrilamida al 15% con el sustrato de M. luteus (0.2%) en
condiciones nativas. A. Perfil proteico por órgano que también sirvió de control de carga. B. Prueba
de actividad enzimática por órgano, como control positivo lisozima pura de huevo tipo “c” (Lis c).
MP: marcador de peso molecular. 10 µg de proteína por muestra.

8.2. Actividad de tipo lisozima en insectos alimentados e infectados con T. cruzi

Para la infección de los vectores se utilizaron ratones infectados con una parasitemia
promedio de 1x10
6
± 0.5 en sangre. Para determinar el número de parásitos ingeridos por
las ninfas de 5° estadio, se realizó un estimado del número de parásitos ingeridos de la
siguiente manera: al pesar 1ml de sangre obtuvimos un peso de 1 g, entonces se consideró
la diferencia del peso inicial y el peso después de alimentarse de las ninfas, esta diferencia
se multiplicó por la parasitemia de los ratones en 1ml de sangre y así se determinó al
número de parásitos ingeridos por el vector.

En la tabla 2 se muestran los pesos de las ninfas pre/post-alimentación utilizados para la
infección y el cálculo del estimado de parásitos ingeridos por los vectores. También se
muestra el peso de las ninfas sin infectar antes y después de la alimentación.

A B
A B
43

Tabla 2. Parásitos ingeridos por ninfas estadio V

NINFAS
ALIMENTADAS
SIN INFECTAR
Antes de
alimentarse
(gramos)
Después de
alimentarse
(gramos)
NINFAS
ALIMENTADAS
INFECTADAS
Antes de
alimentarse
(gramos)
Después de
alimentarse
(gramos)
No.
Aproximado
de parásitos
ingeridos
Primera cinética de infección
1 0.15 0.37 1 0.11 0.24 200,250
2 0.15 0.15 2 0.13 0.38 367,500
3 0.14 0.38 3 0.09 0.25 238,350