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1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS (INMUNOLOGÍA) Efecto del antígeno secretado/excretado de alto peso molecular por Taenia crassiceps en el desarrollo de la encefalomielitis autoinmune experimental. TESIS Que para optar por el grado de DOCTOR en CIENCIAS BIOMÉDICAS presenta: ALBERTO NAVARRETE PEÓN Asesor: Dr. Luis I. Terrazas Valdés (Facultad de Estudios Superiores Iztacala). Tutores: Dra. Edda L. Sciutto Conde (Instituto de Investigaciones Biomédicas), Dr. Abraham Landa Piedra (Facultad de Medicina). (Unidad Académica de Posgrado, Ciudad de México Junio 2017) UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 2. Índice Dedicatoria…………………………………………………………………………3 Agradecimientos…………………...…………………………...…………………4 Resumen……………………………………………………………………………5 Introducción………………………………………………………………………...7 Justificación……………………………………………………………………….26 Hipótesis…………………………………………………………….…………….26 Objetivo general……………………………………………………….…………26 Objetivos particulares……………………………………………………………26 Materiales y método………………………………………………...……………27 Resultados………………………………………………………………..………31 Discusión y conclusión…………………………………………………………..54 Anexos…………………………………………………………………………….59 Referencias……………………………………………………….………………64 3 3. Dedicatoria La gente suele felicitar a quien triunfa y sólo a quien triunfa, como si fuera un asunto dependiente de esa única persona y de nadie más. En ello estriba uno de nuestros más crasos errores, pues se nos olvida que el triunfante no llegó hasta donde está solo. En realidad, la felicitación debe ser para todos los involucrados en el triunfo, pues es una cadena de triunfos. En este tenor, felicito a mi madre Lorena Peón Casanova. Te agradezco por traerme al mundo y enseñarme buena parte de lo que he necesitado para vivir en él. Te agradezco por poner en mi corazón el amor a la vida y a mis semejantes, y por enseñarme cuál es la meta última de la vida: ser feliz. Sin esas enseñanzas, el conocimiento que he adquirido en toda mi trayectoria académica no tendría rumbo alguno. Felicito al Dr. Luis I. Terrazas Valdés; en un país con tantas carencias, me asombra el nivel científico del laboratorio y los proyectos que en él desarrollamos. Pocas veces me he sentido tan cautivado por un conjunto de ideas, mil gracias por compartirlas. Sé que es difícil sobrellevar con tanta elegancia a un alumno tan latoso como yo, y más aún si contamos los años que llevo dando lata en el laboratorio. Mil gracias por tu paciencia y buen humor. A mí estimada Gizmo (también conocida como Dra. Yadira Ledesma Soto) le agradezco infinitamente el haberme prestado tantas veces sus manos y cerebro en la realización de este proyecto. No hubiera podido sin ti. Mil gracias por no sólo ser mi compañera, sino también mi amiga. Espero que continuemos así muchos años más. A mí ánima, Penélope Vidal Romero, le agradezco profundamente por encontrarme. En verdad has sido la inspiración que yo necesitaba para terminar todo este proceso de forma óptima y oportuna. Más aún, agradezco que marcaras el rumbo del resto de mi vida. Yo no hubiera sabido qué hacer ni a dónde ir, si no fuera por ti. Si éste desenlace es feliz y yo tengo esperanzas, es por ti. Gracias y felicidades a todos los miembros del Laboratorio de Inmunoparasitología, me ayudaron muchísimo en todas las cuestiones técnicas y prácticas referentes al desarrollo de mi proyecto. No hubiera podido sin el continuo apoyo de todos ustedes. Agradezco y felicito a los miembros de mi comité tutor: a la Dra. Edda Sciutto Conde, por todos los amables y acertados comentarios que me permitieron hacer un mejor trabajo y ser un mejor alumno. Fue un gusto colaborar con usted y su equipo. Les tengo muchísimo afecto. Al Dr. Abraham Landa, por darse cuenta de los errores que yo no notaba. Mil gracias por su paciencia. Finalmente, debo reconocer la invaluable participación de los miembros de mi jurado: Dra. Anahí Chavarría, Dr. José Carlos Crispín, Dra. Gladis Fragoso y Dr. Luis B. Tovar y Romo. Con sus comentarios me ayudaron a escribir una tesis más completa y rigurosa. Este triunfo es tan mío como de todos ustedes, ¡felicidades! 4 4. Agradecimientos Alberto Navarrete Peón fue estudiante del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas (PDCB), Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) y recibió una beca de manutención completa por parte del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) #289777. El presente trabajo fue patrocinado por los proyectos #167799 y #271685 de CONACYT y el IN220316 de PAPIIT. La citometría de flujo fue realizada en el Laboratorio Nacional en Salud, FES-I. Por lo anterior, se extiende un profundo agradecimiento a dichas instituciones. 5 5. Resumen En los últimos 30 años se ha observado un aumento en la prevalencia de enfermedades autoinmunes únicamente en los países desarrollados, mientras que en los mismos ha disminuido el contagio por infecciones con hemintos parásitos. Dicha correlación negativa señala el posible papel de las últimas en la regulación de enfermedades autoinmunes con carácter inflamatorio, sugiriendo posibles vías para el desarrollo de nuevos tratamientos para dicho grupo de enfermedades. Pese a esto, pocos inmunomoduladores derivados de helmintos han demostrado tener un papel supresor en el desarrollo de la encefalomielitis autoinmune experimental, la cual es un modelo murino de la enfermedad humana esclerosis múltiple. El presente estudio muestra el papel regulador de antígenos inmunomoduladores derivados de Taenia crassiceps en el desarrollo de la patología asociada a dicho modelo. Para esto, se inocularon los antígenos secretados/excretados de alto peso molecular producidos por el parásito ya sea de manera temprana o tardía. La potencia del tratamiento fue comparada con la de la dexametasona. El análisis de células y citocinas mostró que el tratamiento con el TcES es capaz de inducir un ambiente de tipo Th2, con pobre producción de citocinas pro-inflamatorias, donde la proliferación de los linfocitos frente a estímulos policlonales o antígeno-específicos se vio severamente afectada. El tratamiento pudo inhibir la infiltración inflamatoria del sistema nervioso central, como se demuestra mediante histología y citometría de flujo. En conjunto, dichos cambios fueron eficaces en la supresión de la patología. Abstract: A negative correlation between the geographical distribution of autoimmune diseases and helminth infections has been largely associated in the last few years with a possible role for such type of parasites in the regulation of inflammatory diseases, suggesting new pathways for drug development. However, few helminth-derived immunomodulators have been tested in experimental autoimmune encephalomyelitis, an animal model of the human disease multiple sclerosis. Here we sought for immunomodulatory activities of Taenia crassiceps excreted/secreted products (TcES) that may suppress EAE development. We found that TcES was able to suppress with more potency than dexamethasone the main signs of EAE; moreover, TcES treatment was still effective at disease dampeningeven when inoculated at later stages after the onset of EAE. Importantly, the TcES treatment was able to induce a range of Th2-type cytokines, while suppressing Th1 and Th17 responses. Both the polyclonal and the antigen specific proliferative responses of lymphocytes were also inhibited in EAE-ill mice receiving TcES, in association with a strong recruitment of suppressor cell populations. Peritoneal inoculation of TcES was able to direct the normal inflammatory cell traffic to the site of injection thus avoiding CNS infiltration, which may work along with Th2 immune polarization and lymphocyte-activation impairment to down-regulate EAE development. 6 Palabras clave: Encefalomielitis autoimmune experimental, esclerosis múltiple, helmintos, antígenos secretados/excretados, infiltración del SNC, Taenia crassiceps. 7 6. Introducción La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoimmune mediada por células T antígeno-específicas que reaccionan frente a autoantígenos presentes en la vaina de mielina de las neuronas; siendo el principal mecanismo fisiopatológico asociado a ella la desmielinización. En ausencia de mielina, la transmisión del impulso saltatorio se pierde por lo que la velocidad sináptica se reduce, dificultando la conexión neuronal (1). Esto resulta en perturbaciones neurológicas diversas que incluyen una parálisis flácida progresiva, visión borrosa, disfunción auditiva, pérdida de la coordinación, incontinencia urinaria, dolor, temblores y espasmos musculares, afectando en conjunto a los individuos a un plano psicológico, social y económico (2). Aunque no se considera que la enfermedad acorte la expectativa de vida, los pacientes requieren costosa ayuda profesional y un amplio rango de drogas para paliar la enfermedad y sus manifestaciones. De igual manera, la EM inflige pérdidas económicas importantes pues suele empezar en la etapa productiva (20 a 40 años de edad), causando el retiro temprano de los trabajadores (3). En conjunto, estos factores causan una carga económica de 28,000,000,000 dólares al año sólo en Estados Unidos de América, pues el costo de la enfermedad por paciente ronda los 18,000 a 39,000 USD al año (4). Se estima que la prevalencia mundial de la EM oscila entre 2.3 y 2.5 millones, siendo el sexo femenino el más afectado, ya que dos terceras partes de los pacientes con EM son mujeres (5). En México, sólo hay 1.6 pacientes de EM por cada 100,000 personas (6), pese a que el número de pacientes con esta patología ha aumentado en los últimos 40 años (7). Numerosos estudios evidencian la naturaleza compleja de la EM, ya que hay un fuerte componente genético para heredar los factores de riesgos, aunque también hay diversos factores ambientales que inducen o regulan su aparición. En principio, hay una baja tasa de concordancia entre gemelos homocigotos, lo cual sugiere que no sólo la susceptibilidad genética es necesaria para padecer la enfermedad, si no que el ambiente es igual de importante (8). Pese a esto, los factores ambientales tampoco son los únicos disparadores de la EM pues los hijos adoptados en familias que padecen de ésta no suelen presentar síntomas (9). Entre los factores genéticos que se ha sugerido inducen la susceptibilidad a la EM se encuentran polimorfismos en el antígeno leucocitario humano-DR (HLA-DR) y HLA-DQ (10, 11), así como en el receptor-α de interleucina-2 (IL-2Rα) y el IL-7Rα (12); todos asociados a la activación y proliferación de linfocitos. De igual modo, la deficiencia de muerte celular programada-ligando 1 (PD-L1) (13) e IL-10 (14) se han relacionado al desarrollo de la enfermedad; siendo que estos genes suprimen la proliferación y activación de células T. Adicionalmente, infecciones virales con neurotropismo como aquellas inducidas por el herpesvirus humano, varicela o Epstein-Barr se correlacionan al desarrollo de EM (15, 16), en conjunto con infecciones bacterianas diversas tales como Mycobacterium tuberculosis y Borrelia burgdorferi (2, 17). En cambio, diversas 8 infecciones por helmintos parásitos se relacionan a la supresión de la enfermedad aún en pacientes con una posible susceptibilidad genética (18), sugiriendo una fuerte participación de estos factores ambientales en el desarrollo de EM. El curso clínico de la EM es muy heterogéneo entre pacientes, probablemente reflejando la vastedad de factores genéticos y ambientales que influyen en su aparición. Así, se han descrito principalmente dos formas de la enfermedad, la recurrente-remitente (EM-RR), que afecta del 85 al 90% de los pacientes, y la forma primaria-progresiva (EM-PP), que ocurre en 10 a 15% de los casos. Incluso, 50% de los pacientes con EM-RR desarrollan una forma secundaria-progresiva (EM-SP) al cabo de ± 10 años de padecer la forma RR, ésta es similar a la forma PP en su transcurso clínico y fisiopatología (19). La principal diferencia entre las formas progresivas y la forma RR es que en esta última la intensidad de los signos y síntomas oscila en el tiempo, mientras que en las primeras aumenta de forma estable y concomitante (Fig. 1) (20). Notablemente, los pacientes con EM-SP progresan de forma similar a aquellos que sufren EM-PP una vez que ocurre el cambio hacia la forma progresiva, aunque su cuidado suele ser más complejo debido a que el aumento en edad suele conllevar más comorbilidades. Inclusive, cuando ocurre el cambio hacia la forma SP la patología ya tiene un mayor grado de avance (21). 9 Fig. 1. Diversidad clínica de la EM. (a) La EM tiene principalmente tres formas de presentación, 85 a 90% de los pacientes presentan la forma recurrente-remitente (EM-RR), donde la intensidad de la escala de estatus de discapacidad expandida (EEDE) fluctúa a lo largo del tiempo. Después de ± 10 años el 50% de éstos pacientes evolucionan hacia una forma secundaria-progresiva (EM-SP), donde la intensidad de la patología crece de manera estable y concomitante. 10-15% de los pacientes comienzan con una forma primaria- progresiva (EM-PP), donde la evolución de la enfermedad no presenta mayores fluctuaciones mientras progresa continuamente. (b) La EEDE es una rúbrica que para evaluar el progreso de la EM considera la progresión de la pérdida de movilidad junto con las disfunciones sensoriales y de coordinación. Evalúa 10 puntos, que van desde la discapacidad nula acompañada de signos y síntomas suaves hasta la discapacidad completa y la muerte. 6.1 Encefalomielitis autoinmune experimental: un modelo animal para el estudio de la EM. El estudio de la EM requiere la obtención de muestras de sangre, bazo y tejido nervioso, en donde se analiza el papel de numerosos genes y moléculas. Igualmente, es necesario observar el desarrollo de la enfermedad desde la etapa preclínica y en condiciones controladas, así como poder manipular el genoma de los individuos afectados. Por esto, el desarrollo de modelos animales ha sido de prima importancia para el entendimiento de los factores fisiopatológicos de la EM, así como para el desarrollo de tratamientos útiles en su control. Entre los modelos que se han usado para estudiar ésta enfermedad se encuentran los de desmielinización inducida por toxinas como la cuprizona y la isolecitina, ya que éstas generan una patología similar a la EM debido a la inducción de daño químico a la mielina. Sin embargo, estas toxinas inducen daño de manera independiente al sistema inmune, por lo que no mimetizan con precisión la enfermedad humana (22). Adicionalmente, el virus de encefalomielitis murina de Theiler se ha ocupado para estudiar fenómenos de desmielinización en presencia de una respuesta inflamatoria, sin embargo, éste modelo descarta aspectos fundamentales de la EM tales como la especificidad de la respuesta inmune adaptativa y los mecanismos moleculares de neurodegeneración inducidos por el sistema inmune innato (23).La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), en cambio, se considera el mejor modelo animal para el estudio de la EM debido a que comparte muchos aspectos fisiopatológicos y clínicos con la enfermedad. En principio, la participación del sistema inmune en la desmielinización es innegable en este modelo, ya que se ha observado una gran activación de células innatas y linfoides en dicho fenómeno (24). Consistentemente, la especificidad de la respuesta inmune adaptativa, en muchos casos, es igual a aquella que se presenta en la EM (los antígenos que detonan la respuesta autoinmune son los mismos) (25). De igual modo, hay modelos que semejan el transcurso clínico de las formas RR y progresivas de la enfermedad. 10 Pese a esto, no hay ningún modelo que sirva para estudiar el cambio de una EM- RR temprana hacia una EM-SP tardía, y la especificidad de la respuesta autoinmune, así como la localización de los infiltrados inflamatorios dentro del sistema nervioso central (SNC) están supeditados al antígeno que se utilice para inducir el modelo. La EAE puede ser inducida activamente mediante la vacunación de cepas de ratones susceptibles con una emulsión de epítopes dominantes de la mielina en adyuvante de Freund completo (AFC) (26). Debido a la disponibilidad de numerosos autoantígenos (27, 28) y cepas de ratones silvestres (WT) o modificados genéticamente (29) útiles para este proceso, la diversidad clínica de la enfermedad puede ser emulada, permitiendo el estudio de los distintos tipos de EM. En este proceso, la fagocitosis del antígeno emulsificado en AFC provocará la activación de las células presentadoras de antígeno (APCs) y su diferenciación hacia perfiles pro-inflamatorios. Posteriormente, éstas presentarán el antígeno a linfocitos T, activando su respuesta proliferativa e induciendo su diferenciación a perfiles Th1/17, los cuales son necesarios para provocar inflamación a nivel neurológico. Adicionalmente, los ratones deben ser inyectados intraperitonealmente (IP) con toxina Pertussis, la cual inhibe la expresión de moléculas de unión estrecha presentes en la barrera hematoencefálica, incrementando así su permeabilidad y favoreciendo la migración de leucocitos al SNC (30). La toxina reduce el número de células T reguladoras (Tregs) CD4+CD25+FoxP3+, así como su actividad supresora, ayudando a la inducción de la respuesta inflamatoria necesaria (31). Por otra parte, la EAE puede ser inducida pasivamente mediante la transferencia adoptiva de células CD4+ y/o CD8+ previamente generadas por inducción activa en otro ratón, facilitando el estudio de la participación de los diversos linajes linfocitarios, aunque tiene como desventaja la carencia de fenómenos de presentación antigénica (32), por lo que la inducción activa de EAE sigue siendo el mejor modelo para estudiar fenómenos de presentación antigénica y participación de las células presentadoras de antígeno (CPA) en el fenómeno inflamatorio. Aunque no hay un modelo que mimetice el cambio de una patología EM-RR temprana a una EM-SP tardía, ni la duración de los relapsos y remisiones sea equivalente a aquella que ocurre en humanos, hay numerosos modelos que imitan la EM-RR (conocidos como modelos de EAE típica) o a la EM-progresiva (conocidos como EAE atípica), por lo cual los distintos cuadros clínicos pueden ser estudiados con un aceptable grado de analogía (28). La EAE, por tanto, ha sido de importancia en la generación del conocimiento que ha sido de utilidad en la comprensión de la enfermedad y el desarrollo de medicamentos para tratarla. 6.2 Participación de linfocitos y perfiles T-cooperadores en el desarrollo de EM Desde los inicios del estudio de la EM se describió el papel fundamental que tienen los linfocitos T en el desarrollo de la enfermedad, ya que dichas células se encontraron fuertemente asociadas a las placas de desmielinización en el SNC de 11 los pacientes (20, 33). Consistentemente, durante el desarrollo de modelos animales capaces de emular la patología humana, se descubrió que la enfermedad puede ser inducida en ratones receptores de células T reactivas a antígenos presentes en la mielina, ya sea que éstas células fueran CD4+ (32) o CD8+ (34). De igual manera, cuando las células CD4+ o CD8+ son genética u ontogenéticamente depletadas, se trunca la capacidad de los ratones para enfermarse (35). Más aún, ratones transgénicos que expresan receptores humanos a la proteína básica de la mielina (PBM) desarrollan EAE de forma espontánea (36). De manera específica, las células CD8+ se han correlacionado con la inducción de EAE atípica (37), mientras que la transferencia de células CD4+ genera una EAE típica (38) (Fig. 2). Estos datos, en conjunto sugieren que la reactividad de estas células frente a antígenos presentes en la mielina es el principal requisito para el desarrollo de la enfermedad, y que en su diversidad dictan el tipo de patología a desarrollar. Mucho se ha discutido la importancia de la diferenciación de las células CD4+ hacia los perfiles Th1 o Th17 para la inducción y progresión de la patología. Sin embargo, ratones deficientes de T-bet (el factor de transcripción asociado al compromiso hacia el linaje Th1 en linfocitos) (39, 40), o RORɣT (el factor de transcripción asociado al compromiso hacia el linaje Th17), comparten el mismo grado de incidencia y severidad a EAE que su contraparte WT (41). De igual manera, la eliminación de IFN-ɣ (42) o IL-17A/F (43), que son citocinas típicas de las respuestas Th1 o Th17, respectivamente, tampoco demostró disminuir la incidencia o severidad de la enfermedad. Por el contrario, al eliminar las citocinas asociadas a respuestas tipo Th1 y Th17 IL-6 (44), IL-23 (45) y GM-CSF (46) la enfermedad no puede ser inducida. Sugiriendo, en conjunto, que la diferenciación hacia uno u otro perfil T-cooperador no es crítica para el desarrollo de EAE, aunque sí es necesaria la actividad inflamatoria de los linfocitos y células innatas. Adicionalmente, los perfiles T-cooperadores pueden tener funciones concomitantes en el desarrollo de la patología, e incluso pueden ser prioritarios para determinar los aspectos más particulares de la misma. Se ha descrito que células CD4+ estimuladas in vitro para diferenciarse a un perfil Th17 tienden a infiltrar mayormente el cerebelo y los lóbulos temporales y parietales del encéfalo, produciendo EAE atípica. Las mismas células, al recibir estímulos que las diferencian a perfiles Th1, en cambio, infiltran principalmente a la médula espinal, produciendo una EAE típica (47, 48). Más aún, la inducción de EAE con el antígeno proteína proteolipídica (PLP), produce infiltrado cerebral en conjunto con EAE atípica (49) (Fig. 2), sugiriendo así que el tipo de linfocitos, así como su diferenciación, son factores determinantes del tipo de patología neurodegenerativa. Inicialmente se pensaba que las células Tregs podían suprimir la activación de linfocitos Th1 y Th17 encefalitogénicos, disminuyendo así la inducción de neuroinflamación autoinmune. Esta línea de pensamiento surgió de las observaciones de que estas células se encuentran aumentadas en pacientes con EM (50), y que sus citocinas clave son determinantes en la protección contra EAE. Pese a esto, un número creciente de reportes describe que las células T efectoras en pacientes con EM son resistentes a la supresión mediante Tregs (51-54), sugiriendo que éstas no son críticas en la regulación de la autoinmunidad. 12 Adicionalmente, un meta-análisis realizado por Zozluya y Wiendl (54) señala que múltiples grupos de investigación han detectado números menores o iguales de Tregs en la sangre o líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con EM que en pacientes sin dicha patología. Otra posibilidad es que el número de Tregs sea insuficiente para contrarrestar el de células T efectoras. Incluso, se ha propuesto que aunque haya una expansión de Tregs, la proliferación está dominada porlas Tregs de memoria, en vez de que se generen nuevas Tregs naturales, que son más potentes (55). Las citocinas IL-10 (14), TGF-β (56) e IL-4 (57, 58) son importantes en la supresión de la inflamación autoinmune en EAE y EM, y pueden ser secretadas por linfocitos Th2 o células de linaje mieloide. Por esto se piensa que mientras un balance en la diferenciación de linfocitos hacia los perfiles Th1/Th17 es importante para inducir EAE y EM, una mayor inducción de linfocitos y citocinas de tipo Th2 puede resultar útil en la terapia anti-EM. Fig. 2. Diversidad patológica de la EM. Las células Th17 tienden a dirigir el infiltrado inflamatorio hacia el cerebro, reclutando ahí a neutrófilos y produciendo Esclerosis Múltiple Progresiva (EM-P). En cambio, los linfocitos Th1 generan inflamación en la médula espinal, donde los monocitos/macrófagos generan daño neurológico a través de la secreción de óxido nítrico (NO). Las células T CD8+ pueden infiltrarse al cerebro o médula espinal indistintamente, generando daño neurológico a través de la eliminación de oligodendrocitos. 6.3 Mecanismos efectores de neurodegeneración: la importancia de la inmunidad innata. 13 Las enfermedades autoinmunes tejido-específicas, como la EM, tienen como característica en común la invasión del parénquima cerebral por leucocitos. De manera interesante, la importancia de la fracción innata de dichos infiltrados ha sido subestimada durante años, pero avances recientes muestran que la mayor parte de los mecanismos efectores y buena parte de los inductores/reguladores de este grupo de enfermedades provienen de dichas células (59). En principio, las células dendríticas (CDs) (60) y los macrófagos (61) son capaces de activar a los linfocitos en la periferia y de inducir su entrada al SNC. Y más aún, el papel de las células T CD4+ en el tejido nervioso pareciera el de reclutar y activar a más células innatas (62). Consistentemente, células CD4+ estimuladas con IL-12p70 son capaces de reclutar macrófagos productores de NO al SNC, mientras que células similares estimuladas con IL-23 son capaces de reclutar neutrófilos y activar su estallido respiratorio. Esto en correlación con la secreción de quimiocinas monocito-atrayentes como CXCL9, CXCL10 y CXCL11 por parte de las células Th1 o con la secreción de quimiocinas neutrófilo-atrayentes CXCL1 y CXCL2 por parte de las células Th17 (63), sugiriendo que las células innatas también son importantes en la determinación del tipo patológico (Fig. 2). Adicionalmente, las células mieloides están implicadas en la inducción de daño neurológico durante la enfermedad. En principio, las células T pueden ser detectadas de manera consistente en el LCR de pacientes con EM, independientemente a la fase en la que éstos se encuentren. Sin embargo, los picos de detección de neutrófilos coinciden con los relapsos únicamente (64), sugiriendo que éstas células son capaces de inducir neurodegeneración (62) mientras los linfocitos están ahí para reclutarlos y coadyuvar en su funcionamiento patogénico. Igualmente, la transferencia de linfocitos mielina-específicos en ratones que han sufrido de depleción de macrófagos no es capaz de inducir daño neurológico ni signos de neurodegeneración. Esto en correlación con el bloqueo del reclutamiento de células F4/80+Mac1+ en el SNC, pese a la presencia de células CD4+ T y linfocitos B CD220+ en el mismo (65). De igual modo, ratones deficientes en CCR2, el receptor de la proteína quimioatrayente de macrófagos-1 (MCP-1), son resistentes a la inducción de EAE y al daño histopatológico del SNC asociado a ésta. El efecto es independiente de una respuesta adaptativa intacta y rica en IFN- ɣ e IL-2, ya que linfocitos mielina-específicos transferidos en ratones WT son perfectamente capaces de inducir la enfermedad, mientras que los receptores CCR2-/- de células T WT fallan al inducirla. En conjunto, estos datos sugieren que la neuropatología asociada a EM/EAE es imposible de inducir sin el infiltrado del parénquima nervioso por parte de monocitos/macrófagos y neutrófilos, aunque los linfocitos estén presentes (Fig. 2). De manera importante, cuando la producción de NO o el anión súper óxido por parte de monocitos y neutrófilos es interrumpida mediante el uso de fármacos, el desarrollo de la EAE se ve completamente abatido, pudiendo también observase un decremento considerable en el daño histopatológico y la inflamación local (66- 68), por lo que cada vez es más aceptada la idea de que el mecanismo efector de 14 inducción de daño que poseen los monocitos/macrófagos y neutrófilos es a través de la secreción local de NO (Fig. 2). 6.4 Mecanismos de daño locales en SNC En adición a la potente y compleja respuesta inmune que ocurre en la periferia y que termina induciendo daños en el SNC una vez que los leucocitos se infiltran en éste, también hay cambios neuroinmunológicos que no se reflejan en la respuesta periférica. Éstos afectan a las neuronas y sus capacidades sinápticas, en adición a las glías, que son básicas para el correcto funcionamiento nervioso. Particularmente, el número de mitocondrias aumenta en las neuronas que sufren procesos de desmielinización (69), con lo cual aumenta la secreción local de ROS, acelerando así el proceso general de neurodegeneración (70). Más aún, citocinas como la IL-1β inducen fallas en la sinapsis neuronal al reducir la expresión del transportador glial de glutamato-aspartato, por lo cual se afecta una de las principales vías neuro-exitatorias, y por lo tanto la función nerviosa en general. Además, la elevada concentración de glutamato en el medio extracelular del cerebelo induce una gran neurotoxicidad (71), lo cual contribuye al proceso general de neurodegeneración. En una enfermedad autoinmune desmielinizante como lo es la EM, el potencial de regeneración de la mielina es de prima importancia para restaurar la sinapsis nerviosa. Dicha tarea, normalmente está a cargo de los oligodendrocitos, quienes sintetizan la mielina (y las proteínas que ésta contiene) para formar una vaina alrededor de los axones (72, 73). No obstante, se ha observado que en etapas crónicas de la enfermedad, los precursores de oligodendrocitos pierden la capacidad de diferenciarse en oligodendrocitos maduros, por lo cual se pierde éste potencial de neuroregeneración (74). Pese a esto, recientemente se describió que en la etapa de remisión de la enfermedad, algunos astrocitos tienden a diferenciarse en oligodendrocitos, amortiguando parcialmente la falta de éstos y promoviendo la regeneración de las funciones fisiológicas que es evidente en dicha etapa (75). Más aún, se sabe que la cercanía de astrocitos con oligodendrocitos promueve en éstos últimos la producción de mielina (76), en un efecto inducido por la secreción de múltiples factores de activación por parte de los astrocitos (77). Contradictoriamente, se ha descrito un papel patológico para los astrocitos durante el desarrollo de la neuroinflamación, ya que dichas células, al ser agredidas por los altos niveles de NO, responden secretando más NO (78). Además, los astrocitos son una importante fuente de CCL2, una quimiocina que potentemente recluta monocitos inflamatorios (79) y también producen IL-12 e IL-15 (80), responsables de la diferenciación de linfocitos hacia el perfil Th1, así como de la actividad citotóxica de los linfocitos CD8+, que tienen su parte en la destrucción de los oligodendrocitos. Por esto, se piensa que el papel de los astrocitos en la neuroinflamación es una espada de doble filo, como se revisó en (77). La microglía, por su parte, es otra población celular con papeles contradictorios dentro de la EAE/EM, ya que es capaz de presentar auto-antígenos de forma local a los linfocitos, además de producir altos niveles de NO (81) y mediadores inflamatorios diversos (82), con los cuales daña la mielina y a los 15 oligodendrocitos. Incluso, tienden a acumularseen las placas de desmielinización, presumiblemente para inducirla (77). Sin embargo, en los últimos años se ha descrito que también pueden disminuir la activación de linfocitos (83) y activar a los oligodendrocitos (84), induciendo neuroprotección y neuroregeneración. Un aspecto importante de la participación de la microglía en la EAE se da por la limpieza de los detritos de mielina por parte de estas células. Al iniciar una fase patológica, la microglía suele responder a los estímulos proinflamatorios del entorno, activándose clásicamente, al igual que un macrófago; así, la microglía contribuye a la degradación de la vaina de mielina a través de la producción de NO y de la potenciación de la respuesta inmune. No obstante, cuando muchos detritos de mielina se acumulan en el espacio extracelular, la microglía tiende a fagocitarlos. Una vez dentro de las células, los residuos de fosfatidilserina presentes en éstos, activan la vía PPAR-ɣ, induciendo un perfil alternativo en la microglía, lo cual la vuelve capaz de disminuir la inflamación patológica, con lo cual participan en la inducción de las remisiones (85) y pueden activar la remielinización dependiente de oligodendrocitos (86). Muchas citocinas han demostrado tener papeles patogénicos en el desarrollo de la inflamación local durante la EAE/EM, aunque se han detectado papeles benéficos para algunas otras. La mayor parte de éstas provienen de células inflamatorias infiltradas en el parénquima nervioso, pero otras son producidas por las neuronas y la glía. En primer lugar, las neuronas, microglía y astrocitos son capaces de producir TNF-α cuando se encuentran bajo estrés inflamatorio, y dicha citocina ha demostrado tener papeles diversos en la respuesta inmune local característica de la patología. En primer lugar, se ha detectado que puede inducir la apoptosis de oligodendrocitos (87), además de reclutar y activar a los monocitos/macrófagos durante la patología y disminuir la activación de linfocitos Treg (88). En contraste, experimentos utilizando ratones deficientes en TNF-R2 han demostrado que el TNF-α tiene un efecto inhibidor en la microglía, llevándolas a producir menores cantidades de NO, con lo cual se reduce el daño a la vaina de mielina neuronal (89). Así mismo, estos tres linajes celulares, además de los oligodendrocitos son capaces de producir IL-6 en respuesta al daño por exitotoxicidad (90), con lo que pueden inducir la diferenciación de respuestas Th17. Más aún, los astrocitos, oligodendrocitos y la microglía pueden producir GM- CSF y MCP1, con lo cual aumentan el reclutamiento y la activación de monocitos/macrófagos hacia el SNC (91), pero también producen (ecepto los oligodendrocitos) las citocinas IL-10 y TGF-β, con las cuales pueden disminuir la activación de linfocitos y macrófagos, controlando la neuropatología (92). En conjunto, ésta información nos señala que el sistema nervioso interacciona de manera diversa y compleja con el sistema inmune, no sólo para reducir el daño durante la EAE/EM, sino también para aumentarlo, en algunas ocasiones. Aunque algunas poblaciones neurogliales como la microglía y la astroglía tienen papeles aparentemente contradictorios, esto probablemente se deba al carácter bifásico de la enfermedad; de modo que en un estudio más profundo de los fenómenos asociados a éstas, tal vez sea posible discernir que durante los relapsos las glías contribuyen a la inducción de daño, mientras que durante las remisiones éstas contribuyan a la neuroregeneración. De cualquier forma, estudios más profundos son necesarios para clarificar dichas cuestiones. 16 6.5 Hipótesis de la higiene: el enemigo de mi enemigo es mi amigo. Como se mencionó anteriormente, numerosas infecciones bacterianas y virales se asocian a la inducción de la EM, aun cuando varios factores genéticos deben estar a su vez involucrados para volver susceptibles a los individuos. Esto sugiere que si bien es importante contar con una susceptibilidad a nivel genético, los factores ambientales suelen ser críticos en la regulación de la enfermedad (2). De manera interesante, los factores ambientales infecciosos no sólo se han asociado a la aparición de la patología, sino también a su supresión; una de las líneas de pensamiento más útiles para describir dicho fenómeno es la hipótesis de la higiene. En la última mitad del siglo XX, un aumento en la prevalencia del asma y las alergias se ha observado en países altamente industrializados, mientras que un decremento en las infecciones virales y bacterianas (principalmente debido a un aumento en las condiciones higiénicas) también ha ocurrido. La correlación negativa en la distribución geográfica de éstas dos patologías sirvió a Strachan para proponer la hipótesis de la higiene en 1989 (93). Tal hipótesis sugiere que en ausencia de infecciones intensas que modulen la inmunidad hacia ambientes tipo Th1, la inmunidad Th2 puede exacerbarse deviniendo en enfermedades mediadas por este tipo de inflamación, tales como las alergias y el asma. Pocos años después, una serie de observaciones inversas llevó a Yazdanbakhsh a proponer una hipótesis de la higiene alternativa. Aparentemente, el incremento en la higiene en países altamente industrializados también ha conducido a una pérdida en la biodiversidad de helmintos parásitos y en la incidencia de infecciones debidas éstos, por lo que en dichos países la prevalencia de enfermedades inflamatorias mediadas por respuestas de tipo Th1 y/o Th17 ha aumentado, en relación a la falta de estímulos que polaricen la inmunidad hacia perfiles Th2 (94). Así, se considera que la EM probablemente sea regulada por la presencia de helmintos infecciosos en nuestro ambiente (95, 96), ya que la alta prevalencia de esta enfermedad se ha asociado al bajo número de infecciones por helmintos globalmente (Fig. 3) (97-99). Adicionalmente, la observación de que los países cercanos al ecuador son los que tienen menor prevalencia de esta enfermedad, ha servido para proponer la hipótesis de que la luz ultravioleta puede inducir tolerancia frente a antígenos al incidir sobre la piel, y por lo mismo reducir la incidencia de EM en dichos países (100). 17 Fig. 3. Hipótesis de la higiene y EM. En los últimos 30 años se ha observado un incremento en la prevalencia de la EM en países donde la higiene ha disminuido el contagio de infecciones por helmintos. Esta correlación negativa ha servido para proponer la hipótesis de la higiene, la cual dicta que la ausencia de infecciones intensas que modulen la inmunidad hacia ambientes Th2, probablemente favorece la aparición de enfermedades mediadas por respuestas de tipo Th1/Th17. En las áreas coloreadas se muestran los países con alta prevalencia de EM, mientras que las áreas con líneas muestran los países donde las infecciones con helmintos son muy comunes. Como sucede con los sistemas holísticos y complejos, la hipótesis de la higiene es difícil de probar. No obstante, numerosos experimentos realizados con modelos animales y pacientes han servido para reunir datos que apoyan las observaciones epidemiológicas. Así, los helmintos son reconocidos actualmente como potentes reguladores de la EM, entre otras enfermedades autoinmunes (101, 102). De entre todos los factores ambientales que pudiesen influir en la inducción y/o supresión de la EM, se cree que las infecciones son las que poseen una mayor influencia pues inciden sobre la activación del sistema inmune directamente. Además, al ser los parásitos componentes constantes en el ambiente de nuestros ancestros evolutivos, es probable que nuestro sistema inmune evolucionara en torno a ellos. Específicamente, los protostomados se originaron hace aproximadamente 550 millones de años, mientras que los humanos vieron su origen hace cerca de 150,000 años atrás (103). Así, los helmintos y humanos han formado parte de los mismos ecosistemas durante un tiempo muy largo, lo que aumenta la probabilidadde que sus historias naturales se hayan entrelazado profundamente a 18 modo de permitir un alto grado de coevolución. Más aún, previo al origen del Homo sapiens, los parásitos ya habían coevolucionado con nuestros ancestros homínidos y primates, permitiendo la herencia de parasitosis ya adaptadas (104). Así, la genética humana se ha moldeado en torno a los helmintos parásitos, generando adaptaciones morfofisiológicas profundas para funcionar correctamente en un ambiente rico en vermes. En la misma línea de pensamiento, la hipótesis del viejo amigo sugiere que los organismos saprófitos de nuestro ambiente necesitaban ser tolerados por el sistema inmune pues son componentes inocuos de la comida y el agua, y atacarlos podría generar daño inmunológico innecesario, así que la coadaptación ocurrió, permitiendo su tolerancia por parte de nuestro sistema inmune (105). Del mismo modo, aunque los helmintos parásitos raramente son inocuos, atacarlos una vez que están establecidos en su hospedero representa una probabilidad de inducir daño a los tejidos propios. Un ejemplo claro de esto es que una respuesta inmune exacerbada ante los huevecillos de Schistosoma spp conduce a un daño intestinal y hepático letal, volviendo la tolerancia hacia la infección una mejor estrategia para sobrevivir (106). Por esto, los helmintos parásitos son conocidos por generar infecciones duraderas que son generalmente bien toleradas por sus huéspedes. Esto en parte como una estrategia de los parásitos para mantener a sus hospederos con vida el tiempo suficiente como para completar sus ciclos de vida (107), y por otra parte, porque el sistema inmune se ha adaptado a evitar la inducción de inflamación excesiva, mientras se aboca a inducir reparación de los tejidos dañados por la parasitosis (108). De este modo, se habla de la inducción de una respuesta inmune estereotípica por parte de los helmintos, que se caracteriza por la secreción de altos niveles de citocinas anti-inflamatorias como IL-9, IL-10, IL-25, IL-33, TGF-β, y principalmente IL-4 e IL-13 en roedores (109). Estas citocinas inducen cambios en la respuesta inmune tales como la diferenciación a Th2/Tregs de las células CD4+, la activación de linfocitos B productores de IL-4/13, inmunoglobulina G1 (IgG1) e IgE, eosinofilia, basofilia y mastocitosis (109, 110). Parte importante de esta respuesta es la alteración fenotípica de las CPAs, pues se desarrollan células dendríticas inmaduras (iDCs) que tienen la habilidad de inducir la diferenciación de linfocitos hacia el perfil Th2/Tregs, así como macrófagos alternativamente activados (MAAs) capaces de suprimir la proliferación de linfocitos y la respuesta inflamatoria (110- 112). Así, una característica diacrítica de la respuesta estereotípica anti-helmíntica es la supresión de respuestas a antígenos testigo (113), lo cual puede alterar el devenir de respuestas inmunes no relacionadas. Es comúnmente aceptado que la mayor parte de estos cambios son dependientes de la habilidad de los parásitos para secretar o excretar antígenos con propiedades inmunoreguladoras (114-118), así, en muchos equipos de investigación (119-121), incluido el nuestro (122-124) se han usado las respuestas Th2 supresoras inducidas por parásitos y sus antígenos para modular la autoimunidad y alterar el devenir de infecciones no relacionadas (125). 19 6.6 Inmunoregulación por Taenia crassiceps Taenia crassiceps (Zeder, 1800) es un helminto parásito de la clase Cestoda, familia Taeniidae (126) que en su forma adulta infecta el intestino delgado de canidos, mientras su forma larvaria (metacéstodo o cisticerco) puede ser encontrado en los músculos y cavidades peritoneales y pleurales de roedores. Sus metacéstodos pueden parasitar a humanos inmunocomprometidos por cáncer (127), virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y hepatitis C (128). Adicionalmente, se reportó una infección en un paciente completamente sano que se encontró restringida en un área de tolerancia inmunológica (ojo) (129); lo cual en conjunto sugiere que el parásito no puede infectar a humanos sanos a menos que el metacéstodo se localice en un sitio de tolerancia inmunológica, pero es capaz de infectar a humanos inmunológicamente comprometidos. Esto habla de la escasa adaptación del parásito hacia el hospedero humano, pero muestra que aun así es capaz de modular parte de su respuesta inmune. Una característica que facilita el estudio del parásito, es la capacidad de sus metacéstodos para reproducirse asexualmente a través de la gemación. Esto nos permite mantener fácilmente la cepa en el laboratorio, ya que después de la inoculación intraperitoneal (IP) de 10 metacéstodos, los hospederos pueden producir cientos de cisticercos al cabo de 8 semanas (130). De manera importante, el parásito no mata a sus hospederos en dicho proceso, lo cual nos permite estudiar la cisticercosis murina en un sistema muy conveniente y altamente reproducible (131). Los primeros estudios acerca de las estrategias de regulación inmunológica inducidos por T. crassiceps para colonizar a sus hospederos, coincidieron en que la etapa aguda de la infección murina por cisticercos de este parásito está dominada por una respuesta transitoria de tipo Th1, donde abundan altos niveles de IFN-ɣ, NO e IgG2a. Dicha etapa dura aproximadamente 2-3 semanas. Posteriormente es reemplazada por una respuesta crónica de tipo Th2, rica en IL-4/IL-13, IgG1 e IgE, que dura por lo menos dos meses. Mientras que la carga parasitaria se mantiene baja durante la primera fase de la respuesta inmune, esta crece cuando la respuesta de tipo Th2 se vuelve dominante (Fig. 4) (132), sugiriendo que la respuesta Th1 inicial frente a la infección puede detener el desarrollo de la parasitosis, mientras que la respuesta Th2 tardía se relaciona a la inducción de susceptibilidad frente a la misma. Posteriormente se describió que los esplenocitos de ratones infectados con el parásito son resistentes a estímulos policlonales como la Concanavalina A y el anti-CD3 (133), sugiriendo que la respuesta inmune inducida por T. crassiceps en su hospedero es supresora. Posteriormente, una serie de estudios con ratones knock out confirmó que la susceptibilidad del hospedero murino frente al metacéstodo de T. crassiceps es dependiente de la señalización mediante el transductor de señales y activador de la transcripción-6 (STAT6), un factor de transcripción clave para el desarrollo de respuestas Th2 y para la activación alternativa de los macrófagos (134). En cambio, la resistencia frente al parásito parece ser dependiente del eje IL-12/STAT4, que es 20 clave en la inducción de respuestas de tipo Th1 (135, 136) (Fig 4). Al comparar las respuestas inmunes de ratones de la cepa susceptible (BALB/c), con aquellas de ratones resistentes (C57BL/6), se encontró que la inmunidad Th1 es más fuerte en los ratones resistentes al parásito, mientras que la respuesta Th2 es más fuerte en ratones susceptibles (137), sosteniendo dicha noción. No obstante, la inoculación con una mayor cantidad de metacéstodos (40 en lugar de 10) es capaz de vencer la resistencia natural de la cepa, induciendo los cambios en la respuesta inmune necesarios para permitir la infección (122). Fig. 4. Cinética de la respuesta inmunológica durante la infección con T. crassiceps. Las primeras 2-3 semanas de la infección murina experimental con cisticercos de T. crassiceps están dominadas por una respuesta de tipo Th1, donde abundan los macrófagos clásicamente activados (MCA), dicha respuesta es reemplazada aproximadamente en la cuarta semana por una respuesta Th2 rica inducida por macrófagos alternativamente activados (MAA). El mayor crecimiento de la carga parasitaria se da a partir del cambio hacia una respuesta inmune de tipo Th2, sugiriendo que ésta genera susceptibilidad frente a la infección. Por otra parte, se ha observado que las células del sistema inmune innato respondende forma secuencial a los cambios en la respuesta inmune sistémica, ya que en paralelo al cambio hacia una respuesta inmune tardía de tipo Th2, emerge una gran población de MAAs, los cuales presentan una baja secreción de IL-1β, IL- 12 y NO, pero producen altos niveles de arginasa-1 (Arg1), receptor de manosa (MMR), receptor-α de IL-4 (IL-4Rα), PD-L1, PD-L2 e IL-10 (138). De igual modo, esta población tiene la habilidad de suprimir la proliferación de linfocitos, induciendo un estado general de hipo-respuesta y puede fortalecer la polarización hacia el perfil 21 Th2 de los linfocitos, mientras reducen la diferenciación de dichas células hacia perfiles Th1/17 (139). De manera interesante, los MAAs se han encontrado presentes en la mayoría de las infecciones por helmintos parásitos y se considera que su potencial inmunoregulador influye de manera importante en la inducción de ambientes tolerogénicos necesarios para la supervivencia de los hospederos y parásitos durante la infección (111, 112), desempeñando papeles tan diversos como la disminución de la inflamación patológica y el daño tisular que ésta conlleva (108), la resistencia al crecimiento excesivo de la carga parasitaria (140), o como parte fundamental del sistema de regeneración tisular (108) (Fig. 5). Fig. 5: Inmunoregulación por T. crassiceps y sus antígenos. Los metacéstodos de T. crassiceps producen antígenos (TcES) con la capacidad de inhibir la maduración de las células dendríticas (CDs), las cuales permanecen en un estado inmaduro (CDi), volviéndolas capaces de inducir la diferenciación hacia Th2 en linfocitos T vírgenes y de inducir respuestas proliferativas bajas en éstos. De igual manera, pueden reclutar macrófagos alternativamente activados (MAAs) con la capacidad de reforzar la diferenciación hacia Th2 de los linfocitos, así como de inhibir la proliferación de dichas células. Igualmente, recluta células mieloides supresoras (CMSs) capaces de regular fuertemente la proliferación de linfocitos. En conjunto, estos cambios en el microambiente celular inducen una respuesta Th2 potente y duradera. Dicha población es diametralmente opuesta a los macrófagos clásicamente activados (MCAs), que se desarrollan típicamente durante las infecciones virales y bacterianas, así como durante la etapa aguda de la respuesta a T. crassiceps. Los MCAs tienden a secretar altos niveles de IL-1β, IL-12, IL-23 y TNF-α, con lo cual fortalecen las respuestas de tipo Th1/Th17, y además expresan la enzima óxido 22 nítrico sintasa inducible (iNOS), con la cual producen NO (141), el cual parece ser importante para controlar la proliferación de T. crassiceps (142). En conjunto, T. crassiceps regula la inflamación de manera potente y prolongada para evadir el ataque inmunológico de su hospedero y así poder completar su ciclo de vida dentro de éste. Más aún, los cambios en la respuesta inmune que induce el parásito parecen ser idóneos para suprimir respuestas inflamatorias no deseadas (131), concordando con la hipótesis de la higiene. Por esto, miembros de nuestro equipo investigaron el potencial anti-inflamatorio de la infección con T. crassiceps para combatir la inflamación en modelos murinos de autoinmunidad, encontrando que la pre-infección de ratones con su metacéstodo es capaz de reducir la incidencia de la diabetes tipo 1 inducida por estreptozotocina hasta en un 50%, principalmente al reducir el infiltrado inflamatorio del páncreas, reduciendo así la insulitis y por lo tanto manteniendo los niveles de glucosa por debajo de los 200 mg/dL. Dicha modulación dura por lo menos 6 semanas post-inducción. En asociación a los efectos protectores de la infección se encontraron altos niveles sistémicos de IL-4, la reducción de los niveles de TNF-α y la inducción de MAAs (123). De igual modo, la pre-infección de ratones con T. crassiceps es capaz de modular negativamente la colitis inducida por dextrán sulfato sódico al controlar la pérdida de peso, el acortamiento del colon y el índice de actividad de la enfermedad, en relación con un microambiente pro-inflamatorio reducido y altos niveles de IL-4 e IL-10, así como un alto reclutamiento de MAAs al colon (143). De manera importante, la pre-infección con cisticercos del parásito también puede reducir la incidencia (en un 35%) y severidad de la EAE, en relación a un ambiente Th2 con altos niveles de IL-4, IL-10, IgG1 e IgE y bajos niveles de IFN-γ, TNF-α, IL-17 e IgG2a, así como la ausencia de infiltrado inflamatorio en el SNC y grandes poblaciones de MAAs (Fig. 6) (122). En ninguno de estos estudios se encontró una exacerbación de linfocitos Tregs, por lo que pensamos que los efectos de la infección sobre las células innatas deben ser clave para la supresión de estas patologías. 23 Fig. 6. La inmunoregulación por T. crassiceps induce cambios que suprimen patologías autoinmunes. Los metacéstodos de T. crassiceps secretan/excretan antígenos (TcES) capaces de impedir la maduración de las células dendríticas inmaduras (CDi) y la activación clásica de macrófagos (MCAs); facilitando la activación alternativa de los macrófagos (MAAs), induciendo la diferenciación de linfocitos hacia el perfil Th2 y bloqueando la proliferación de linfocitos autoreactivos. Así, los cambios en la respuesta inmune inducidos por el parásito disminuyen los parámetros patológicos de la diabetes tipo 1 (DT1), la colitis autoinmune y la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Pese a la información generada, ninguno de estos estudios responde las siguientes preguntas: i) ¿Es posible modular las enfermedades autoinmunes como EM/EAE usando moléculas derivadas de los cisticercos de T. crassiceps? ii) ¿Es posible modular la enfermedad una vez que sus signos comienzan a manifestarse? iii) ¿Es necesaria la presencia constante del parásito para modular la enfermedad? 6.7 Inmunoregulación por antígenos de Taenia crassiceps La idea de que la inhibición de las respuestas pro-inflamatorias y la inducción de respuestas Th2 durante las respuestas inmunes frente a helmintos es dependiente de la secreción o excreción de antígenos con capacidades inmunoreguladoras cada vez se acepta más, debido a evidencias cada vez más numerosas. Se ha observado que dichos antígenos tienen la habilidad de reclutar a numerosos leucocitos, tales como las células mieloides supresoras (CMSs), eosinófilos y basófilos. Igualmente, pueden impedir la maduración de las CD, transformándolas en células capaces de polarizar a los linfocitos T vírgenes hacia perfiles Th2/Tregs, induciendo en ellos 24 respuestas proliferativas bajas (114-118, 144, 145). Más aún, muchos antígenos inmunoreguladores derivados de helmintos han demostrado tener la capacidad de inducir la activación alternativa de macrófagos de forma independiente a IL-4 (115- 117, 146). Las primeras líneas de evidencia que sugieren dicha idea son que el tratamiento antiparasitario de pacientes infectados suele derivar en la inducción de respuestas pro-inflamatorias tras la muerte del helminto (147) y que la inoculación de los antígenos parasitarios en ratones sanos, mimetiza el efecto de las infecciones con gusanos vivos (118, 145). Más aún, se ha identificado que los carbohidratos provenientes de los antígenos solubles del huevo (ASH) de Schistosoma mansonii son responsables por la actividad inmunoreguladora de dichos antígenos (148), sugiriendo que las glicoproteínas son esenciales para la inducción de respuestas Th2 durante las parasitosis por helmintos. Este hallazgo se corroboró en otros modelos de infección murina, tales como Brugia spp, Echinococcus spp, Ascaris spp, Caenorabditis spp, Hymenolepis spp y T. crassiceps (Como se revisó en (149)) En esta área, nuestro equipo ha evaluado los efectos de la inoculación in vivo de antígenos derivados de T. crassiceps, encontrando que la inyección de un extracto soluble total (TcSol) de sus metacéstodos es capaz de reclutar a una poblaciónde CMSs CD11b+F4/80+Gr1+, la cual está compuesta por monocitos y neutrófilos dotados de la habilidad de inducir bajas respuestas proliferativas en linfocitos (150). Dichas células se reclutan tan pronto como 18 horas después de la inyección IP del TcSol, de modo que podrían ser importantes para la inhibición de la respuesta Th1 inicial frente al parásito, así como de la inducción del ambiente tolerogénico de tipo Th2 que viene después (151). De manera interesante, el tratamiento de dichos antígenos con metaperiodato de sodio para destruir a sus glicanos, altera la habilidad del antígeno para reclutar a las CMSs, indicando que los azúcares son importantes para los efectos inmunológicos de estas moléculas (152) (Fig. 5). Más aún, ensayos in vivo han demostrado que la presencia de carbohidratos en antígenos derivados de helmintos es esencial para la inducción de respuestas Th2 frente a antígenos no relacionados, ya que el ASH de S. mansoni o el TcSol, al ser co-inyectados con ovoalbúmina o albúmina sérica de bovino en ratones vírgenes, inducen una respuesta inmune de tipo Th2 frente a dichas proteínas mientras sus carbohidratos estén intactos, pero al ser éstos alterados mediante oxidación con metaperiodato de sodio, pierden esa capacidad (114, 148). Por otra parte, el TcSol posee demasiadas moléculas, de las cuales no todas tienen efectos inmunoreguladores, por lo que la concentración de sus principios activos es baja. Además, las moléculas no relacionadas al efecto inmunológico del extracto complican el estudio de aquellas que sí se involucran en sus efectos reguladores. Además, se cree que los helmintos regulan la inmunidad no solamente por contacto directo con leucocitos, sino también de forma remota mediante la secreción o excreción de antígenos inmunoreguladores. Así, la más reciente tendencia en el campo de la inmunidad frente a helmintos es el estudio de los antígenos de secreción/excreción, los cuales resultan de interés por ser menos diversos, con lo cual concentran mayoritariamente moléculas activas y resultan más fáciles de estudiar; además, representan una herramienta de regulación 25 inmunológica a distancia para los helmintos, mediante la cual podrían regular la respuesta inmune del hospedero de forma previa al contacto. Siguiendo esta línea de pensamiento, se han estudiado los antígenos de secreción/excreción de T. crassiceps (TcES), los cuales son obtenidos a través del cultivo in vitro de metacéstodos del parásito, recolectando su sobrenadante y centrifugándolo en separadores de peso molecular para obtener la fracción ≥ 50 kDa, la cual fue añadida a cultivos de CDs para estudiar su impacto en la maduración de las mismas (152), como se detalla a continuación. Por otra parte, la maduración de las CDs está dada por la expresión de moléculas co-estimuladoras involucradas en la presentación de antígenos y la activación de células T, tales como CD40, CD80, CD86 y el complejo de mayor histocompatibilidad II (CMHII), así como la secreción de citocinas pro-inflamatorias como IL-12 e IL-18. Así, una CD madura es capaz de inducir una alta respuesta proliferativa en células T, además de ser capaz de diferenciar a dichas células hacia perfiles Th1/17, mientras que una CD inmadura, al carecer de la alta expresión de dichos marcadores, induce bajas respuestas proliferativas en células T y las diferencia hacia perfiles tolerogénicos como Th2 y Treg (153). Recientemente fue descrito que la exposición in vitro de CDs murinas (152) o humanas (154) a la fracción de alto peso peso molecular del antígeno, pero no a la de bajo peso, inhibe la maduración de dichas células, las cuales además se vuelven resistentes a la estimulación con ligandos de receptores tipo Toll (TLRs), produciendo bajos niveles de citocinas pro-inflamatorias como IL-12, IL-15 y TNF- α. De manera importante, cuando las CDs expuestas al TcES son usadas como APCs, son capaces de inducir la diferenciación de células CD4+ vírgenes a perfiles Th2 (152). Estos efectos son dependientes de la presencia de glicoconjugados en el TcES, ya que al oxidar los carbohidratos presentes en éste, dichos efectos se pierden (Fig. 5). De manera interesante, otros equipos de investigación han hecho observaciones similares en respuesta a glicoproteínas provenientes de Echinococcus granulosus, E. multilocularis (155, 156), ASH de S. mansoni (157) o carbohidratos de la larva de Trichostrongyloides spp (158). Así, es claro que los helmintos alteran la respuesta immune de sus hospederos mediante la secreción o excreción de antígenos, y que gran parte de la actividad inmunomoduladora de éstos es dependiente del reconocimiento de sus glicanos. Es importante considerar que la composición de los antígenos solubles totales o los secretados/excretados varía mucho entre especies, sin embargo, los tipos más comunes son proteasas, inhibidores de proteasas, homólogos de citocinas y quimiocinas, enzimas antioxidantes, lectinas y otros carbohidratos (consultar anexo 13.3 para más detalles), los cuales son reconocidos principalmente por receptores a lectinas tipo 1 (118). De esta forma, la inoculación in vivo del TcES podría emular los efectos de la infección, induciendo un ambiente Th2 que regule la capacidad proliferativa de los linfocitos y anule la migración de leucocitos hacia el SNC, lo cual podría también regular la sintomatología asociada a EAE. 26 7. Justificación Como se menciona en la introducción, la EM tiene una gran diversidad de cuadros clínicos, y la inmunopatogénesis detrás de cada uno es compleja. Así mismo, pese a la diversidad de medicamentos disponibles para el tratamiento de la misma, faltan drogas capaces de modular los distintos rasgos de la enfermedad de forma integral, con alta efectividad y baja toxicidad (159). En dicho tenor, los antígenos inmunoregulatorios derivados de T. crassiceps (TcES) han demostrado tener la capacidad de regular la respuesta inflamatoria de macrófagos (160), DCs (152), MDSCs (161) y linfocitos (114, 139), por lo cual podrían ser capaces de contrarrestar la inflamación producida durante la EAE. Más aún, se ha observado que la preinfección de ratones con el metacéstodo de T. crassiceps es capaz de regular no sólo la diabetes tipo 1 (123), la colitis (143) y el cáncer de colon asociado a colitis (162), sino también ha demostrado ser capaz de reducir la histopatología y el cuadro clínico de la EAE (122), en asociación con mecanismos inmunoregulatorios similares a los observados para el TcES. Así, creemos que el TcES será capaz de modular el desarrollo de la EAE actuando para inhibir la inflamación en múltiples niveles, logrando una supresión integral del desarrollo de la patología. 8. Hipótesis La administración intraperitoneal del TcES reducirá la severidad de la EAE al inducir un ambiente Th2 capaz de regular la proliferación de linfocitos y el infiltrado de leucocitos en el SNC. 9. Objetivo general Estudiar los mecanismos de regulación de la neuroinflamación y autoinmunidad por la administración del TcES en el modelo de EAE. 10. Objetivos particulares a) Determinar la relación dosis-respuesta del TcES para inducir citocinas y poblaciones reguladoras en ratones C57BL/6. b) Determinar la capacidad del TcES para regular la incidencia y severidad de la EAE en ratones C57BL/6, de manera temprana, tardía y en comparación con la dexametasona. c) Estudiar las características del microambiente inmunológico inducido por la administración del TcES, así como su capacidad para regular la proliferación de linfocitos durante la EAE. d) Estudiar alteraciones de la migración de leucocitos hacia el SNC durante el desarrollo de EAE, en relación al tratamiento. 27 11. Materiales y método Ratones, parásitos y producción del TcES. Ratones hembra de la cepa BALB/c con 6-8 semanas de edad fueron comprados a Harlan Laboratories (México, CDMX) y mantenidos en condicioneslibres de patógenos en el bioterio de la FES-Iztacala, UNAM de acuerdo con las guías éticas institucionales y nacionales. Metacéstodos de T. crassiceps la cepa ORF fueron cultivados en condiciones estériles de la cavidad peritoneal de ratones similares, infectados ocho semanas antes, y lavados cuatro veces con buffer salino de fosfatos (PBS; 0.15 M NaCl, 0.01 M fosfato de sodio, pH 7.2) previo a la infección de ratones BALB/c frescos para mantener la cepa, o fueron cultivados en PBS estéril a 37°C por 24h. El TcES fue producido al recoger el sobrenadante de dichos cultivos y centrifugarlo a 1000g por 20 min dentro de separadores Amicon Ultra Filter (Millipore, México) de 50 kDa. La fracción ≥50kDa fue recuperada y almacenada a -70°C. Inducción de EAE. El modelo fue inducido y evaluado de acuerdo al protocolo de Stromnes & Goverman, 2006 (163). Brevemente, se preparó una emulsión 1:1 de 125 µg de glicoproteína mielina de los oligodendrocitos (MOG35-55)/ 100 µl de PBS estéril y adyuvante de Freund completo (AFC) conteniendo 5mg de Mycobacterium tuberculosis H37RA/ ml (Difco Laboratories, MI, USA) y esta fue inyectada en cuatro puntos de los flancos traseros en ratones hembra de la cepa C57BL/6 con 10-12 semanas de edad. Posteriormente, se les inyectó toxina de Pertussis (600 ng/200 µl PBS esteril) (List Biological Laboratories Inc., CA, USA) de manera IP (intraperitoneal) el mismo día de la inducción y dos días después. La progresión de la enfermedad fue evaluada cada dos días siguiendo la siguiente escala: 0, sin signos de enfermedad; 0.5, parálisis en la punta de la cola; 1, flacidez en la cola; 1.5, debilidad en una pata trasera; 2, parálisis en una pata trasera; 2.5, parálisis en una pata trasera y debilidad en la otra; 3, parálisis en las dos patas traseras; 3.5, parálisis en las dos patas traseras y debilidad o parálisis en una pata delantera; 4, parálisis de los cuatro miembros; y 5, moribundo o muerto. Esquemas de tratamiento. Ratones hembra de la cepa C57BL/6 fueron repartidos en cinco grupos (n=6) y tratados de la siguiente manera: el grupo EAE+TcES recibió una inyección IP de 250µg TcES/ 200 µl PBS cada tercer día, dos días después de la aparición de los primeros signos (día 12 ± 2) y hasta dos días antes del sacrificio al pico de la enfermedad (día 21 ± 2), recibiendo un total de 7 inyecciones. El grupo EAE+BSA recibió un tratamiento similar pero sustituyendo al TcES por una concentración igual de BSA. El grupo EAE+TcES-L empezó a recibir el tratamiento seis días después del tratamiento normal con TcES (día 18 ± 2), y se les administró una dosis de tratamiento cada tercer día hasta dos días antes del sacrificio. De esta forma, el grupo EAE+TcES-L recibió tres inyecciones menos que el grupo EAE+TcES al inicio del ciclo experimental. Los ratones EAE+TcES-W recibieron el mismo esquema de tratamiento que los ratones del grupo EAE+TcES, pero la inoculación del antígeno fue suspendida del día 19 ± 1 hasta el sacrificio, de modo que recibieron tres inyecciones menos que el grupo TcES, siendo los últimos 28 días del relapso aquellos donde no se administró el tratamiento. Otro grupo de ratones recibió inyecciones IP de 0.3 mg/kg de dexametasona (164) (Farmacias del ahorro, México) cada tercer día, hasta el día del sacrificio. En todos los casos el sacrificio se realizó cuando los ratones control alcanzaron el grado 3.5, lo cual generalmente ocurrió el día 26 PI, a menos que se indique otra cosa. Tabla 1. Tratamientos Grupo Inicio Término Tipo Cantidad Frecuencia EAE+BSA 12 ± 2 21 ± 2 BSA 250 µg Cada tercer día EAE+TcES 12 ± 2 21 ± 2 TcES 250 µg Cada tercer día EAE+TcES-L 18 ±2 21 ± 2 TcES 250 µg Cada tercer día EAE+TcES-W 12 ± 2 19 ± 1 TcES 250 µg Cada tercer día EAE + Dex 12 ± 2 21 ± 2 Dexametasona 0.3 mg/kg Cada tercer día Evaluación histopatológica. En el pico de la enfermedad (día 26 ± 2) los ratones fueron sacrificados y la médula espinal fue extraída y fijada en alcohol absoluto por una semana. Las muestras de tejido fueron embebidas en parafina y se cortaron secciones de 10 µm en un microtomo para ser teñidas con hematoxilina y eosina. El análisis de los infiltrados se realizó mediante el programa AxioVision LE (Carl Zeiss (Jena, Alemania)), seleccionando al azar 5 secciones de la región lumbar de la médula espinal y contando el número de lesiones por sección, así como cuantificando los pixeles totales de todas las regiones infiltradas. Ensayos de proliferación celular. Durante el sacrificio de los animales, los bazos fueron asépticamente removidos para realizar suspensiones de una sola célula mediante perfusión con medio RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, 100 U de penicillina/estreptomicina, 2 mM glutamina, 25 mM HEPES y 1% aminoácidos no esenciales (todos de GIBCO, USA). Los esplenocitos fueron centrifugados a 1000 x g y los eritrocitos fueron lisados mediante suspensión en solución de Boyle (0.17 M Tris y 0.16 M cloruro de amonio). Después de dos lavados con PBS estéril, las 29 células viables se contaron mediante exclusión con azul tripano y los esplenocitos se ajustaron a 3x106 células/ml en el mismo medio. Las células (100 µl por pozo) fueron sembradas en placas de 96 pozos de fondo plano (Costar, USA) para ser estimuladas con 10 µg/ml MOG35–55. Adicionalmente, los esplenocitos se sembraron en placas previamente sensibilizadas con anti-CD3 (10 µg/ml por dos horas a 37 ºC). La proliferación fue medida cinco días después de la incubación a 37 ºC y 5% CO2 pulsando a las células por 24 h con 0.5 mCu [3H] timidina (Amersham Biosciences, USA). Las células se recolectaron en un cosechador de 96 pozos (Tomtec, Finlandia) y se cuantificaron usando un µ-contador de placas 1450 (Trilux, Finlandia). Los valores son representados en cuentas por minuto (CPM) de pozos triplicados. Sobrenadantes de cultivos similares, sin timidina, fueron guardados a -70 ºC hasta ser usados para detección de las citocinas detalladas en la sección de ELISA. Obtención de células. Las células del exudado peritoneal fueron obtenidas mediante el lavado retroperitoneal con 15 mL de solución de Hank estéril, posteriormente fueron lavadas por centrifugación, resuspensión y reemplazo de sobrenadante en 2 ocasiones. Los CLNs fueron extraídos de la región cervical y macerados gentilmente en mayas de 20 µm usando el émbolo de una jeringa. Posteriormente, fueron lavados dos veces para descartar las partes de tejido sólido remanentes. Esplenocitos totales fueron extraídos por perfusión esplénica con 10 mL de la misma solución usando agujas 25G en una caja Petri; las muestras fueron hemolizadas mediante la resuspensión en solución de Boyle (0.17 M Tris y 0.16 cloruro de amonio) y fueron lavadas como ya se describió. Se extrajo sangre da la base de la cola y 800 µl de la misma fueron incubados en tubos sensibilizados con EDTA (Becton Dickinson, USA) en agitación durante 20 min, tras lo cual se eliminó a los eritrocitos de la forma ya descrita. Todas las muestras fueron manejadas en esterilidad. Aislado de células extravasadas en el SNC. Los ratones fueron anestesiados usando una mezcla de ketamina y xylazina 3:1 para realizar una perfusión transcardial con solución gPBS estéril (0.002% glucosa en PBS 1x). Posteriormente se sacrificó a los ratones y los encéfalos y médulas espinales fueron obtenidos y lavados en la misma solución. El tejido nervioso fue disgregado y centrifugado a 400G por 10 min a 23 ºC para concentrar la fracción celular. Las células se resuspendieron y digirieron en 5 mL de PBS con 500U de DNAsa y 15 U de colagenasa por 1hr a 37 ºC. El tejido nervioso digerido fue lavado en 45 mL de gPBS y resuspendido en 4 mL de percoll al 30%, que fue añadido sobre otros dos gradientes conteniendo 37% (capa medial) y 70% (capa de fondo) de percoll para ser centrifugados a 500 x g por 20 min a 23 ºC. La capa media de percoll conteniendo las células del infiltradoinflamatorio (densidad de 1.046 g/ml) fue obtenida y lavada en 45 mL de gPBS y la pastilla resultante fue preparada para medir marcadores de superficie mediante citometría de flujo. ELISA sandwich. Los niveles de IL-4, IL-10, IL-17, TNF-α e IFN-ɣ fueron cuantificados en el suero sanguíneo o cultivos de esplenocitos en los tiempos indicados. Los kits de ELISA se usaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Peprotech, México; o Biolegend, USA para IL-17). 30 Análisis de marcadores de superficie. La expresión de marcadores de linaje o activación fue medida usando citometría de flujo multicolor. Células del exudado peritoneal (PECs), esplenocitos, células de nódulos linfáticos cervicales (NLCs), sangre y SNC fueron extraídas, lavadas y suspendidas en buffer de FACS (PBS/FBS 0.5%/0.05% NaN3). Posteriormente, se bloquearon los receptores Fc para evitar las uniones no específicas usando 1μg/μl de anti-CD16/32 por 30 min a 4°C. Las células se lavaron y tiñeron con anticuerpos contra CD11c, Ly6C, Ly6G, F4/80, PD-L1, PD-L2, CD4 y CD8 (todos los anticuerpos de Biolegend, USA). La adquisición de datos se realizó en citómetros FACsCalibur o FACsAria fusion usando Cell Quest Software (Beckton Dickinson, USA) y el análisis de los mismos se realizó en Flowing Software 2 (Perttu Terho, Finlandia). Tinción intracelular de citocinas. Esplenocitos libres de eritrocitos fueron lavados en medio RPMI y ajustados a 3×106 células/mL. Dos mL de la suspensión fueron incubados en pozos de placas de 24 pozos y estimulados con 5 ng/mL de forbol 12- miristato 13-acetato (PMA) (Sigma, México) más 500 ng/mL de ionomicina y 10 μg/mL brefeldina-A (Biolegend, USA) a 37°C, 5% CO2 por 4 horas. Las células fueron recuperadas en tubos de FACS con 1 mL de buffer de FACS y centrifugadas a 1500 rpm por 5 min. Después de la tinción de marcadores de superficie, las células fueron lavadas y fijadas usando paraformaldehido al 2% en PBS por 10 min; después se les trató con buffer de permeabilización (PBS, 1% FCS, y 0.025% saponina) y fueron resuspendidas en 100 μL del mismo buffer conteniendo los anticuerpos indicados (todos de Becton Dickinson, México) anti-citocina por 10 min. Las células fueron lavas nuevamente y resuspendidas en 500 μL de FACS buffer, y analizadas en un citómetro FACSAria Fusion (Becton Dickinson, México). Análisis estadístico. Todos los datos son presentados como media ± error estándar. La significancia de las diferencias entre grupos fue calculada usando la prueba t de Student de dos factores. La significancia en la progresión de EAE entre grupos fue medida por ANOVA de dos factores del índice cumulativo de la enfermedad (CDI) y el área bajo la curva (AUC), de manera independiente. CDI es la suma de todos los grados de la enfermedad evaluados por ratón en cada grupo. Las diferencias fueron consideradas significativas siguiendo los siguientes criterios: *** P ˂ 0.001,** P ˂ 0.01 y * P ˂ 0.05. 31 12. Resultados 12.1 La administración repetida de TcES (dosis de 250 µg) induce un perfil Th2 en ratones C57BL/6. En el presente trabajo investigamos la capacidad de los productos secretados/excretados por T. crassiceps para regular la enfermedad. Para esto, el primer paso fue cultivar los metacéstodos del parásito en PBS estéril y concentrar la fracción ≥50 kDa para obtener el TcES. Se prepararon dos lotes para realizar todos los experimentos, y para comprobar la integridad molecular y consistencia entre éstos se realizó una comparación de bandeo en un gel de poliacrilamida. Dicho experimento revela un bandeo claro y definido del antígeno, signo de la integridad molecular; igualmente, los patrones de bandeo de los dos lotes son comparables, por lo cual se asume la consistencia en el proceso de producción del TcES (Fig. 7). Fig. 7: Constancia entre lotes de TcES e integridad molecular. Dos lotes de TcES obtenidos en días diferentes y a partir de distintos cultivos de metacéstodos producen patrones moleculares similares en geles de SDS-PAGE, confirmando la constancia en el proceso de producción del antígeno, así como la integridad de sus componentes. Tres cantidades diferentes de TcES (125, 250 y 500 µg) fueron inoculadas intraperitonealmente en ratones hembra de la cepa C57BL/6, en un régimen que consistió en una inyección IP cada tercer día por 16 días. Antes de la primera inyección, a mitad del tratamiento y un día después de la última inyección se extrajo suero sanguíneo de la base de la cola para medir citocinas y comparar entre grupos y con los grupos control, que fueron: un grupo de ratones sanos tratados con solución salina estéril (SSS), como control del vehículo y otro grupo tratado con 250 µg de albúmina sérica de bovino (BSA) como un control de proteína irrelevante. En el suero sanguíneo se midieron las citocinas IL-4, IL-10 e IFN-ɣ, revelando que sólo las dosis de 250 y 500 µg fueron capaces de inducir altos niveles de IL-10 desde el punto medio del régimen hasta su final, mientras que ninguna dosis fue capaz de modificar los niveles de IL-4. En cambio, la secreción de IFN-ɣ se elevó en relación al tratamiento con 500 µg de TcES (Fig. 8). Del mismo modo, la dosis 32 intermedia de TcES indujo un potente reclutamiento de CMS (definidas como CD11b+ Ly6C+ Ly6G+) (Fig. 9 a, d), así como de MAAs (definidos como células F4/80+ PD-L1+ PD-L2+ o F4/80+ MMR+ IL-4Rα+) (Fig. 9 b, c, e). Por su gran capacidad para inducir citocinas y células reguladoras, sin elevar la producción de IFN-ɣ, seleccionamos la dosis de 250µg de TcES como un esquema de tratamiento viable para el resto del estudio. Fig. 8: Curva dosis respuesta para inducción de citocinas con TcES. Ratones hembra C57BL/6 sanas recibieron una inyección IP de los tratamientos señalados cada tercer día durante 16 días (en los días señalados por flechas azules) y el suero sanguíneo fue colectado en los días uno (antes de la inoculación), ocho y 16. Se determinaron los niveles de IL-10 (a), IL-4 (b) e IFN-ɣ (c) mediante ELISA. Los datos mostrados son representativos de dos experimentos independientes con media y SEM calculadas a partir de grupos con n=4. La diferencia estadística se determinó por la prueba t de Student de dos factores y fue descrita mediante los siguientes criterios: ** P ˂ 0.01 y * P ˂ 0.05. 33 u VI VI u VI ~ FSC a) S.S.S. b) e) • 10+/ - 3 % u Vl ~ 250 ¡.tg BSA 26 +/- 2 % h'( " ... CDllb 250 ug BSA o 00 ~ 13+/-2 % FSC 8.8+/ -2 % 150 ¡.tg leES 38 +/- 4 % IL-4Ra 125 ug leES 250 ug leES 500 ug leES 29 +/ -6 % I 57 +/ -3 % ly6G 23 +/ - 1.2 % 35+/ - 3 % 34+/-2% PD-ll 250 ¡.tg leES 52 +/- 6 % u V> ~ - CDllb ~ a) S.S.S. 250 ug BSA 125 ug leES 250 ug leES 500 ug leES 10+/ -3 % 13+/-2 % 29+/-6% I 57+/-3 % Ly6G b) FSC 8.8+/-2 % 23 +/- 1.2 % 35+/-3 % 34+/- 2 % PD-Ll e) u ~ SSC F4/BO 250 ~g BSA 150 ~g leES 250 ~g leES • 26 +/- 2 % 38 +/- 4 % 52 +/- 6 % • IL-4Ra 34 Fig. 9: La dosis de 250 µg de TcES recluta una mayor cantidad de CMSs y MAAs. Ratones hembra C57BL/6 sanas fueron tratadas de las formas indicadas cada tercer día por 16 días y al final de dicho periodo fueron sacrificados para obtener PECs, las cuales fueron teñidas para la detección de la frecuencia (a) y número total (d) de CMSs, así como de MAAs F4/80+ PD-L1+ PD-L2+ (b, e), respectivamente y la frecuencia de MAAs MMR+ IL-4Rα+ (c). Los datos mostrados son representativos de dos experimentos independientes con media y SEM calculadas a partir de grupos con n=4. La diferencia estadística se determinó por la prueba t de Student de dos factores y fue descrita mediante los siguientes criterios: *** P ˂ 0.001,** P ˂ 0.01 y * P ˂ 0.05. Las células fueron analizadas a partir de una región grande CD11b+ (para las MDSCs) o una región grande F4/80+ (para los macrófagos), que se derivó de una región grande y granular. 12.2
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