Expresión de DMI3 en arroz mejora colonización por micorrizas

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
PROGRAMA DE DOCTORADO DE CIENCIAS BIOMEDICAS 
CENTRO DE CIENCIAS GENÓMICAS 
 
 
La expresión en arroz de una variante autoactivada de la cinasa dependiente 
de Ca+2/calmodulina de la vía simbiótica común, DMI3 de Medicago truncatula, 
modifica el transcriptoma de la raíz y mejora la colonización por micorrizas 
 
TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
DOCTORA EN CIENCIAS 
 
PRESENTA: 
BIÓL. EXP. MARLENE ORTIZ BERROCAL 
 
TUTORA PRINCIPAL: 
DRA. GEORGINA HERNÁNDEZ DELGADO 
CENTRO DE CIENCIAS GENÓMICAS, UNAM 
 
COMITÉ TUTORAL: 
DR. PALLAVOLU MAHESWARA REDDY 
CENTRO DE CIENCIAS GENÓMICAS, UNAM 
DR. MIGUEL LARA FLORES 
 
 
Cuernavaca, México, Enero 2018 
Veronica
Texto escrito a máquina
PROGRAMA DE DOCTORADO DE CIENCIAS BIOMEDICAS 
Veronica
Texto escrito a máquina
Veronica
Texto escrito a máquina
 
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
CENTRO DE CIENCIAS GENÓMICAS 
 
Tesis Doctoral: 
“La expresión en arroz de una variante autoactivada de la cinasa dependiente 
de Ca+2/calmodulina de la vía simbiótica común, DMI3 de Medicago truncatula, 
modifica el transcriptoma de la raíz y mejora la colonización por micorrizas” 
que para obtener el grado de Doctora en Ciencias presenta: 
 
Marlene Ortiz Berrocal 
 
Este trabajo fue realizado en el laboratorio de la Dra. Georgina Hernández 
Delgado, del programa de Genómica Funcional de Eucariontes del Centro de 
Ciencias Genómicas/UNAM. 
 
El comité tutoral que evaluó el avance del presente proyecto de investigación 
se compuso por los Dres. Federico Sánchez Rodríguez, Pallavolu Maheswara 
Reddy y Miguel Lara Flores. Además de la Dra. Georgina Hernández Delgado, 
quien se incorporó a este comité en el año 2016. 
 
MOB recibió una beca para estudios de doctorado otorgada por CONACyT 
(390781). El trabajo experimental fue financiado por donativos de CONACyT 
(128135) y el Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación 
Tecnológica (PAPIIT IN206208) de la Dirección General de Asuntos del 
Personal Académico (DGAPA) de la UNAM. 
	 
	 3 
RESUMEN 
El arroz (Oryza sativa) es el principal alimento para más de la mitad de los 
seres humanos y el nitrógeno (N) es el nutriente más importante requerido para 
su producción. Esta demanda de nitrógeno es satisfecha con la creciente 
aplicación de fertilizante químico nitrogenado. Una objetivo primordial en la 
investigación de la fijación biológica de nitrógeno (BNF) ha sido extender esta 
capacidad a cereales como el arroz para liberarlos de la dependencia de 
utilizar un fertilizante químico. Si un sistema de BNF, i.e. el de la simbiosis 
rhizobia – leguminosa, pudiera ser ensamblado en el arroz, se optimizaría su 
cultivo, evitando el gasto excesivo y la contaminación por fertilizantes. La 
simbiosis arroz – micorriza arbuscular (AM) es regulada por genes que son 
ortólogos de genes de leguminosas conocidos por ser componentes esenciales 
de la vía simbiótica común (CSP) que facilita el establecimiento de las 
simbiosis de las leguminosas con rhizobia (BNF) y con AM. Como parte de 
nuestros esfuerzos de investigación para entender la predisposición genética 
que pudiera influir en la habilidad del arroz para establecer simbiosis fijadora de 
N con rhizobia, generamos arroz transgénico expresando el gen de Medicago 
truncatula gofMtDMI3. Este gene codifica para una serina/treonina cinasa 
dependiente de Ca2 / calmodulina (CCaMK) con una ganancia de función 
(DMI3T271D) que consiste en una forma autoactiva, resultando en eventos de 
nodulación espontánea en raíces de leguminosas en la ausencia de rhizobia. 
Confirmamos que la expresión ectópica de gofMtDMI3 en frijol común produjo 
nodulación espontánea en las raíces en ausencia de bacterias rhizobiales, pero 
en plantas de arroz no indujo la formación de nódulos. Sin embargo, la 
expresión de gofMtDMI3 actuó elevando la colonización por micorrizas en 
raíces de arroz, lo que podría mejorar la nutrición/crecimiento de las plantas. 
Además, la expresión de gofDMI3 indujo mayores niveles de los transcritos de 
tres ortólogos de la CSP: OsDMI3, OsIPD3 y OsNSP1 y otros cambios en la 
expresión – principalmente represión – de diversos genes involucrados en las 
respuestas a estrés biótico y abiótico. Nuestros resultados con gofDMI3 son 
importantes para el desarrollo potencial de un enfoque biotecnológico hacia el 
mejoramiento de la producción de arroz. 
	 4 
ABSTRACT 
 
Rice (Oryza sativa) is the main food for more than half of humankind and 
nitrogen (N) is the most important nutrient input required for its production. This 
demand for nitrogen requirement is increasingly met by the application of 
chemical nitrogen fertilizer. A major goal of biological nitrogen fixation (BNF) 
research has been to extend the nitrogen-fixing capacity to cereal plants such 
as rice, to render them free from dependence on chemical fertilizer. If a BNF 
system, i.e. the legume-rhizobia simbiosis, could be assembled in the rice plant, 
it would optimize its production, avoiding excessive expenditure and pollution 
from fertilizer. The rice-arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis is mediated by 
genes that are orthologous to legume-genes known to be essential constituents 
of the common symbiotic pathway (CSP) that facilitates the establishment of 
both rhizobial N-fixing and AM-symbioses in legumes. As part of our over all 
research efforts to understand the genetic predisposition and determine the 
ability of rice to enter into N-fixing symbiosis with rhizobia, we generated 
transgenic rice expressing Medicago truncatula gofMtDMI3. This gene encodes 
a Ca+2 / calmodulin-dependent serine/threonine protein kinase (CCaMK) with 
gain-of-function activity (DMI3T271D), which confers an autoactive form to this 
protein producing spontaneous nodulation events in legume roots in absence of 
rhizobia. We confirmed that ectopic expression of gofMtDMI3 in common bean 
induced spontaneous nodulation in the roots in the absence of rhizobia, but in 
rice plants it did not produce any such legume-like nodular manifestations. 
However, the expression of gofMtDMI3 supported elevated AM colonization in 
rice roots that could improve plant nutrition / growth. In addition, gofMtDMI3 
expression induced higher transcript levels of the CSP orthologues OsDMI3, 
OsIPD3 and OsNSP1, as well as triggered changes in the expression – mostly 
down-regulation – of several genes involved in biotic and abiotic stress 
responses. Our results with gofMtDMI3 lay the basis for the potential 
development of a biotechnological approach towards improvement of rice 
production. 
	
	 5 
ÍNDICE: 
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN .......................................................................... 6 
I.1 La importancia del arroz ..................................................................................... 6 
I.2 El problema de la limitación del nitrógeno ....................................................... 7 
I.3 La fijación biológica de nitrógeno en cereales: una alternativa ..................... 8 
I.4 La simbiosis leguminosa-rhizobium como modelo para desarrollar la 
fijación de nitrógeno en arroz ...............................................................................10 
I.4.1 Etapas tempranas de la nodulación ............................................................. 11 
I.4.2 Ensayos de complementación ...................................................................... 18 
I.4.3 Importancia de la CCaMK/DMI3 ................................................................... 19 
I.5 El papel de las fito-hormonas en la nodulación ............................................. 21 
I.5.1 Citocininas .................................................................................................... 23 
I.5.2 Etileno ........................................................................................................... 25 
I.5.3 Ácido Abscisico (ABA) .................................................................................. 26 
CAPÍTULO II. OBJETIVOS ............................................................................... 28 
II.1 OBJETIVO GENERAL ....................................................................................... 28 
II.2 OBJETIVOS PARTICULARES .......................................................................... 28 
CAPÍTULO III. RESULTADOS ......................................................................... 30 
III. 1 Ortiz-Berrocal M, Lozano L, Sanchez-Flores A, Nava N, Hernández G, Reddy 
PM. (2017). Expression in rice of an autoactive variant of Medicago truncatula 
DMI3, the Ca+2/calmodulin-dependent protein kinase from the common symbiotic 
pathway modifies root transcriptome and improves mycorrhizal colonization. Plant 
Biotechnology Reports. 1-17. https://doi.org/10.1007/s11816-017-0449-4 .............. 30 
CAPÍTULO IV. Resultados preliminares del análisis de plantas de arroz 
transformadas con gofMtDMI3, gofLHK1, etr1-1 y abi1-1 en diferentes 
combinaciones ................................................................................................ 63 
IV.1 El gen Lhk1L266F induce nodulación espontánea en frijol común ....................... 65 
IV.2 Generación de plantas de arroz transgénicas .................................................. 66 
IV.3 Análisis de transcriptoma en las raíces de plantas de arroz transformadas ..... 67 
CAPÍTULO V. DISCUSIÓN GENERAL Y PERSPECTIVAS ........................... 75 
CAPÍTULO VI. REFERENCIAS ....................................................................... 80 
CAPÍTULO VII. ANEXOS ................................................................................. 94 
VII.1 ANEXO 1. Reddy PM, Altúzar-Molina AR, Ortiz- Berrocal M, Medina-Andrés R, 
López-Sámano M, Martínez-Aguilar L and Velázquez-Hernández MDL. 2013. 
Predisposition and redesigning of genetic networks of rice for accommodating 
nitrogen-fixing rhizobial symbiosis. In: Muralidharan K and Siddiq EA, eds. 2013. 
International Dialogue on Perception and Prospects of Designer Rice. Society for 
Advancement of Rice Research, Directorate of Rice Research, Hyderabad 500030, 
India, pp 245-257. ..................................................................................................... 94 
VII.2 ANEXO 2. Generación de plantas de arroz transgénicas mediante cultivo de 
tejidos ..................................................................................................................... 108 
	
Veronica
Texto escrito a máquina
	 6 
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN 
I.1 La importancia del arroz 
	
El arroz es una gramínea anual semi-acuática que se cultiva en casi todos los 
continentes excepto en la Antártida, incluye aproximadamente 22 especies del 
género Oryza, de los cuales 20 son silvestres. Hay dos especies de arroz que 
son importantes para el consumo humano: O. sativa y O. glaberrima (Muthayya 
et al. 2014). O. sativa es la que más se utiliza en Asia, Norte y Sud-América, la 
Unión Europea, el Medio Este y África (Figura 1) mientras que O. glaberrima 
está limitada a África, donde está siendo reemplazada rápidamente por O. 
sativa. (Muthayya et al. 2014). O. sativa fue cultivada primero en el sureste 
de Asia, en algunas partes de India, Myanmar, Tailandia, Vietnam del norte o 
China, hace 8,000 – 15,000 años (Normile 1997). Se cree que O. glaberrima 
fue domesticada a partir de su ancestro silvestre Oryza barthii por pobladores 
de las llanuras en donde ocurría la inundación del Río Níger en África hace 
unos 3000 años (Muthayya et al. 2014). 
A partir de este momento, cada vez que hablemos del arroz estaremos 
refiriéndonos a la especie Oryza sativa L. El arroz es el alimento básico de dos 
tercios de la población mundial, su uso global para consumo humano es de 408 
millones de toneladas métricas (MMT) (FAO, 2013); predomina en quince 
países de Asia y el Pacífico, diez países en Latinoamérica y el Caribe, un país 
en África del Norte y siete países en África Sub-Sahariana (IRC, 2002). En el 
sentido nutricional, en los países en desarrollo, el arroz proporciona el 27 por 
ciento de la energía, 20 por ciento de proteína y 3 por ciento de grasa en la 
	 7 
dieta (FAO, 2003). Además de la gran importancia alimenticia de este cereal, 
también es el modelo que los científicos usan para estudiar a otros cereales, 
que, junto con el arroz, proveen alrededor del 90% de nuestras calorías (Dey 
and Datta 2002). 
 
 
Figura 1. Mapa global de consumo, importación y exportación de arroz blanco en 
2009-2010. Imagen modificada de Muthayya et al. 2014. 
 
I.2 El problema de la limitación del nitrógeno. 
En general, la productividad de los cultivos es afectada por numerosas 
variables incluyendo el clima, el tipo de suelo, la humedad y los nutrientes. 
Siendo el nitrógeno (N) el nutriente clave que limita la productividad de los 
cultivos, ha sido necesario usar fertilizantes nitrogenados sintéticos para 
incrementar los rendimientos. 
	 8 
Al mismo tiempo, el crecimiento de la población mundial y los cambios en la 
dieta están incrementando la necesidad de alimento (World population 
prospects: the 2006 revision). Para alimentar a la población, se ha calculado 
que en las siguientes tres décadas, el mundo necesitará producir alrededor de 
un 60% más de arroz que la producción actual. Notablemente, el N es el 
principal nutriente que se requiere para su producción, sin embargo, éste es al 
mismo tiempo un factor limitante (Sofi and Wani 2007). Entonces, para suplir 
las necesidades de los cultivos, será necesario incrementar el uso de 
fertilizantes nitrogenados, los cuales son producidos utilizando energía que 
proviene de combustibles fósiles. Se estima que el doble de N fijado será 
requerido para incrementar la producción de arroz en el año 2020 para suplir 
los requisitos de alimentos para la población creciente (Ladha and Reddy 2003; 
Gutiérrez 2012). 
 
Por otro lado, el arroz sufre de un problema con relación a su demanda de N y 
el N provisto a través de fertilizantes, ya que se presentan pérdidas de entre 50 
y 70% del fertilizante nitrogenado aplicado – ya sea en forma de óxidos 
nitrosos, que son potenciales gases de invernadero o como nitratos solubles 
que se filtran hacia sistemas acuáticos – lo que contribuye a la degradación 
del ambiente (Ladha and Reddy 2000). 
 
I.3 La fijación biológica de nitrógeno en cereales: una alternativa 
	
Con el propósito de poder atender las demandas de este cereal en los 
próximos años y gracias al enorme avance tecnológico, ahora es posible 
	 9 
buscar fuentes alternativas de nitrógeno para el arroz, con el propósito de 
poder atender las demandas de este cereal en los próximos años. La 
investigación en agricultura ha estado dirigiendo esfuerzos encaminados a 
encontrar la manera para reducir la dependencia de fertilizantes a través de la 
ingeniería de plantas cultivadas que fijen nitrógeno por sí mismas para 
mantener su crecimiento y rendimiento (Beatty and Good 2011). 
 
La fijación biológica de nitrógeno es una alternativa muy atractiva que podría 
fungir como fuente de nitrógeno en la producción de arroz. El ensamblajede 
un sistema de fijación de nitrógeno es un reto enorme y podría ayudar a reducir 
la necesidad de fertilizante nitrogenado para la producción de éste – y otros – 
alimentos básicos (Markmann et al. 2008; Stokstad 2016). Tal sistema también 
podría ser benéfico para la conservación y seguridad ambientales, y además, 
los agricultores disminuirían sus gastos de producción, haciéndolo más 
consistente con el desarrollo de la agricultura sustentable (Reddy et al. 2002). 
 
Los avances recientes indican que sí existen opciones viables para lograr la 
meta de extender la FBN a los cereales cultivados (Beatty and Good 2011). 
Tres enfoques parecen prometedores actualmente: Uno de ellos involucra la 
introducción de los genes que codifican para la nitrogenasa de las bacterias en 
las plantas, de tal manera que éstas puedan fijar su propio N atmosférico, lo 
cual requerirá la incorporación de genes bacterianos de la nitrogenasa en el 
genoma de la planta y entonces, se habilitaría a la planta para producir su 
propia enzima fijadora de nitrógeno y fijar el nitrógeno atmosférico. (Curatti et 
	 10 
al. 2007; Rubio and Ludden 2008). Recientemente, las primeras etapas de la 
transferencia de los componentes de la nitrogenasa han generado resultados 
prometedores (Ivleva et al. 2016; Lopez-Torrejon et al. 2016). El segundo 
enfoque toma en cuenta la existencia de algunas bacterias endófitas que 
podrían tener un efecto positivo sobre los cultivos (Beatty and Good 2011; 
Stokstad 2016), y explora la posibilidad de introducir y/o mejorar la ruta de 
fijación de nitrógeno en dichas bacterias independientemente de la formación 
de nódulos (de Vrieze 2015). El tercer enfoque se describe en el siguiente 
apartado. 
 
I.4 La simbiosis leguminosa-rhizobium como modelo para desarrollar la 
fijación de nitrógeno en arroz. 
	
En cuanto al tercer enfoque (que se enmarca en los objetivo de esta tesis), se 
está trabajando para desarrollar simbiosis tipo nódulo en las raíces de plantas 
no leguminosas (Beatty and Good 2011). La simbiosis de nódulos en la raíz es 
uno de los sistemas fijadores de nitrógeno más eficientes, pero está restringido 
solamente a un grupo de plantas denominado “clado fijador de nitrógeno”, que 
incluye a las leguminosas (Werner et al. 2014). Sin embargo, la mayoría de las 
plantas terrestres, incluyendo a las monocotiledóneas como el arroz, son 
capaces de establecer asociaciones endosimbióticas con hongos 
endomicorrízicos, para formar micorrizas arbusculares (AM) que pueden 
adquirir fosfatos. Por otro lado, las leguminosas no solo son capaces de 
establecer este tipo de endosimbiosis con este tipo de hongos para formar MA 
y obtener fosfato sino que también tienen la capacidad de asociarse 
	 11 
simbióticamente con diversas bacterias diazótrofas para formar nódulos 
fijadores de nitrógeno. 
 
La simbiosis de nódulos en raíz (RNS por sus siglas en inglés Root Nodule 
Symbiosis) entre las leguminosas y las bacterias, que de forma colectiva son 
llamadas rhizobia, se logra a través de dos programas altamente 
sincronizados: (i) la infección bacteriana (entrada) y (ii) el desarrollo de un 
órgano nuevo llamado nódulo, el cual sirve para hospedar a rhizobia (Oldroyd 
and Downie 2008; Kouchi et al. 2010; Popp and Ott 2011). En los nódulos, 
rhizobia fija el nitrógeno atmosférico y se lo proporciona a la planta hospedera, 
haciendo que la leguminosa hospedera sea independiente de provisiones 
exógenas de nitrógeno. 
 
I.4.1 Etapas tempranas de la nodulación. 
	
Interacciones iniciales entre leguminosa y rhizobia. 
	
El desarrollo de los nódulos en las leguminosas se desencadena debido al 
diálogo molecular entre la planta hospedera y rhizobia. La interacción de éstas 
bacterias con las leguminosas comienza con la secreción de flavonoides en las 
raíces y la consiguiente expresión de genes nod en la bacteria, la cual lleva a la 
producción de moléculas señal de la nodulación, los lipoquitooligosacáridos, 
conocidos como factores Nod (NF) (Dénarié et al. 1996). Estos NF juegan un 
papel esencial en el desarrollo de la RNS. 
 
	 12 
Percepción de las señales. 
	
Mediante estudios sistemáticos en las leguminosas modelo Lotus japonicus y 
Medicago truncatula se han descubierto y ordenado los genes de las plantas 
responsables de la percepción de los NF y la transducción de señales inicial. 
En las raíces de las leguminosas se expresan los genes que codifican para las 
proteínas responsables de la percepción de los NF. Estos genes codifican 
para proteínas cinasas de tipo receptor (RLKs) que tienen motivos LysM en sus 
dominios extracelulares (LysM-RLKs). Estos receptores de NF recibieron el 
nombre de NFR5/NFR1 en L. japonicus (Madsen et al. 2003; Radutoiu et al. 
2003) y LYK3/NFP en M. truncatula (Limpens et al. 2003; Arrighi et al. 2006). 
 
La percepción de los NF por éstas LysM-RLKs desencadena una cascada de 
eventos que inician la activación transcripcional de genes relacionados con la 
simbiosis. Éstos, a su vez, inician cambios fisiológicos y de desarrollo en la 
raíz, tales como aumento en los flujos y oscilaciones de calcio, la deformación y 
encorvamiento de los pelos radicales, la formación de hilos de infección y la 
división de las células corticales, para permitir la infección rizobiana y la 
organogénesis nodular (Kouchi et al. 2010; Oldroyd et al. 2011). Las LysM-
RLKs son específicas para los NF que perciben y que son producidos por las 
rhizobia que las nodulan, y juegan un papel crucial en la generación de la 
señalización para el desarrollo de la RNS. 
 
La Vía Simbiótica Común (CSP) río abajo de los receptores de NF 
	
	 13 
Los elementos genéticos que regulan el desarrollo de la simbiosis con 
micorrizas arbusculares (AMS) en leguminosas también resultan ser cruciales 
para la formación de AMS en arroz (Gutjahr et al. 2008). En las leguminosas, 
estos mismos elementos genéticos, además de promover la AMS, participan 
regulando el desarrollo de la RNS (Markmann and Parniske 2009). Debido a lo 
anterior, a esta vía de señalización se le ha denominado vía simbiótica común 
(CSP) (Oldroyd and Downie 2004). 
 
Estudios con las leguminosas modelo L. japonicus y M. truncatula ya mostraron 
que este grupo de genes CSP codifican para el receptor de membrana 
plasmática LjSYMRK [MtDMI2 en M. truncatula] (Endre et al. 2002; Stracke et 
al. 2002), dos canales catiónicos LjCASTOR y LjPOLLUX [MtDMI1] (Ané et al. 
2004; Imaizumi-Anraku et al. 2005), tres proteínas del poro nuclear LjNUP85 
(Saito et al. 2007), LjNUP133 (Kanamori et al. 2006) y LjNENA (Groth et al. 
2010), la cinasa dependiente de calcio y calmodulina LjCCaMK [MtDMI3] (Levy 
et al. 2004; Mitra et al. 2004) y una proteína localizada en el núcleo con un 
motivo súper enrollado (MtIPD3 [LjCYCLOPS]) (Messinese et al. 2007; Yano et 
al. 2008). 
 
El proceso de desarrollo del nódulo en las leguminosas se desencadena 
debido a las interacciones entre la planta hospedera y las bacterias rizobiales 
después del reconocimiento de los NF (Dénarié et al. 1996). Enseguida, la 
transducción de la señal por medio de la CSP es estrictamente necesaria para 
promover el desarrollo coordinado de la infección y la organogénesis del 
	 14 
nódulo en la RNS (Kouchi et al. 2010). De manera más detallada (Figura 2), 
después de la percepción de NF por LysM-RLKs, se induce la señalización por 
calcio (un rápido aumento en el influjo de Ca+2 seguido por oscilaciones 
periódicas de Ca+2 citosólico en la región perinuclear (Kosuta et al. 2008)) en 
las células de la epidermis gracias a SYMRK, CASTOR & POLLUX, NUP85, 
NUP133 y NENA (Oldroyd 2013). Las oscilaciones de Ca+2 son críticas tanto 
para la AMS como para la RNS. Las proteínas CCaMK y CYCLOPS actúan 
después de las oscilaciones de Ca+2, ya que no se encontró que estén 
asociadas con la generación de las oscilaciones de Ca+2. Por elcontrario, la 
proteína CCaMK es un candidato fundamental para la decodificación de las 
firmas de calcio y provocar una cascada de eventos que encaminan la 
iniciación de, ya sea la AMS o la RNS (Kosuta et al. 2008). CYCLOPS es una 
proteína que posee un dominio súper enrollado y forma un complejo con 
CCaMK lo cual permite la transducción de la señal que promueve la infección 
fúngica o bacteriana en la AMS y la RNS, respectivamente (Yano et al. 2008). 
 
La activación de la CCaMK es esencial para disparar la cascada de eventos de 
nodulación vía la actividad de citocininas a través de una histidina cinasa 
(LHK1/ MtCRE1) y la activación de genes río abajo por la acción de factores 
transcripcionales específicos de la nodulación como son NSP1, NSP2, ERN1 y 
NIN (Murray 2011). Todo lo anterior lleva al rizado del pelo radical, la 
formación del hilo de infección y las divisiones de las células corticales que 
resultan en el desarrollo del nódulo (Reddy et al. 2013). 
 
	 15 
 
 
Figura 2. Representación esquemática de los componentes genéticos 
requeridos para la señalización simbiótica de la nodulación y la micorrización 
en leguminosas. Los NF son percibidos por los receptores de los NF, como 
LjNFR5/MtNFP y LjNFR1/MtLYK3. En Lotus, NFR1 y NFR5 forman un heterodímero 
para transmitir la señal y activar a SYMRK, un receptor tipo cinasa localizado en la 
membrana plasmática. En Medicago, LYK3 (homólogo de NFR1) sirve como receptor 
de entrada, y no regula las respuestas de señalización inducidas por NF. MtNFP actúa 
como receptor de señalización. Se cree que los Factores Myc se perciben por 
receptores tipo LysM, que transmiten la señal para activar a los genes de la CSP. 
Además, se han identificado proteínas que interactúan con los receptores de NF y 
SYMRK, quienes podrían jugar un papel en la regulación del complejo regulatorio en la 
membrana plasmática. Por otro lado, estas proteínas pueden estar involucradas en la 
transducción de señales desde la membrana plasmática hacia la envoltura nuclear, 
donde se encuentran las proteínas requeridas para las oscilaciones nucleares de 
calcio, como DMI1, la bomba de calcio MCA8, las nucleoporinas y canales de calcio 
que no se han identificado aún. Después, estas señales de calcio son percibidas y 
decodificadas por la proteína cinasa dependiente de calcio/calmodulina, DMI3, que 
actúa como un elemento crucial en la señalización por NF/MF y coordina la expresión 
	 16 
de genes simbióticos, incluyendo genes de nodulinas tempranas. DMI3, junto con su 
proteína interactora IPD3, activa un grupo de reguladores transcripcionales (NSP1, 
NSP2, RAM1, ER1 y NIN) en el núcleo que, a su vez, regulan la expresión de genes 
asociados con la RNS y AMS. (Imagen modificada de Venkateshwaran et al. 2013). 
 
El proceso de infección y la organogénesis del nódulo 
	
La infección rhizobial a través de los pelos radicales es un modo de entrada 
considerado sofisticado, y sobre todo, altamente regulado. Para facilitar la 
entrada de las bacterias, muchas leguminosas han desarrollado una estructura 
a la que se le llama hilo de infección (Sprent 2007). El inicio de los hilos de 
infección requiere que las bacterias se adhieran a los pelos radicales y que 
éstos se encorven para atrapar a las mismas. Dicho encorvamiento 
proporciona un recinto para las bacterias adheridas en el foco de infección, 
donde las bacterias proliferan, colonizan y producen enzimas que degradan la 
pared celular y así penetran hasta alcanzar la membrana plasmática del pelo 
radical y formar el hilo de infección, que es una estructura tubular que crece 
hacia el interior (Murray 2011; Popp and Ott 2011). Aunque el método de 
entrada arriba descrito es la forma de infección que predomina en la mayoría 
de las leguminosas, en un porcentaje menor de plantas, las infecciones 
bacterianas ocurren a través de heridas en la epidermis. Ambos procesos de 
infección dependen de la presencia de NF y por lo tanto, son dependientes de 
la participación de los LysM-RLKs. Hay otros estudios que han mostrado un 
mecanismo de invasión bacteriana por infección intracelular, aún en ausencia 
de receptores funcionales de NF, lo cual indica que existe un modo de entrada 
independiente de NF (Madsen et al. 2010). 
	 17 
 
En paralelo con la formación del hilo de infección en el pelo radical, las células 
en el córtex de la raíz comienzan a dividirse para iniciar el desarrollo de un 
meristemo de nódulo. 
 
Se ha dicho que la organogénesis nodular sincronizada con la formación del 
hilo de infección es crucial para que la formación del nódulo fijador de nitrógeno 
sea exitosa (Oldroyd and Downie 2008). Entonces, es necesario que las 
bacterias rhizobiales entren a la raíz de la planta para promover la RNS ya que 
su reconocimiento dispara el desarrollo del hilo de infección y su avance hacia 
los primordios nodulares. Ambos procesos se llevan a cabo de manera 
coordinada, estrictamente después de la transducción de señales a través de la 
CSP después del reconocimiento de los NF (Kouchi et al. 2010; Oldroyd et al. 
2011). 
 
Aparte de los componentes de la CSP, se sabe que los genes esenciales para 
que se formen las microcolonias rizobianas e inicie y avance el hilo de infección 
en las leguminosas incluyen a: (i) los factores transcripcionales NSP1, NSP2 y 
NIN para la formación de las microcolonias; (ii) CYCLOPS [IPD3] (proteína 
súper enrollada), ERN1 (factor de transcripción), FLOT2, FLOT4 (proteínas 
asociadas con balsas lipídicas) y CERBERUS [LIN] (una ubiquitina ligasa tipo 
E3) para el inicio del hilo de infección; y (iii) PIR/NAP (dos miembros del 
complejo SCAR/WAVE involucrado en el re-arreglo de los filamentos de 
actina), RPG (proteína nuclear súper enrollada), VAPYRIN (una proteína 
	 18 
citoplasmática con dominios de ankirina), SYMREM1 (remorina), nsRING y 
PUB (dos ubiquitina ligasas tipo E3) son también necesarias para el avance del 
hilo de infección. Además, se ha mostrado que LHK1/CRE1 (receptor de 
citocininas) y EIN2 (regulador de la respuesta al etileno) participan también en 
los procesos infectivos (revisado en Reddy et al. 2013). 
 
I.4.2 Ensayos de complementación. 
	
Diferentes trabajos han descrito que la complementación genética de los 
ortólogos de arroz SYMRK, CASTOR, CCaMK y CYCLOPS en las leguminosas 
mutantes correspondientes restauran la formación de AM (Chen et al. 2007, 
2009; Banba et al. 2008; Markmann et al. 2008; Yano et al. 2008). De un modo 
similar, los ortólogos OsCASTOR, OsCCAMK y OsCYCLOPS también son 
capaces de complementar por completo la RNS y de restaurar nódulos 
funcionales cuando se transforman en las leguminosas mutantes en los 
respectivos genes (Banba et al. 2008; Yano et al. 2008). 
 
Con estos datos, se ha hipotetizado que, puesto que cierta parte del programa 
genético se comparte entre la RNS y la AMS y que esta última tiene un origen 
más antiguo (~ 400 Ma) que la RNS (~ 70 Ma), durante la evolución varios de 
los componentes genéticos que participan en la formación de la AMS se 
adoptaron para el desarrollo de la RNS. Por consiguiente, existe un marco 
genético común conservado para el desarrollo de ambos tipos de simbiosis 
radical. Además, no solamente se reclutaron genes de la CSP, sino también 
componentes de la maquinaria infectiva, como VAPYRIN, el cual juega un 
	 19 
papel en la infección rhizobial y la colonización por micorrizas en leguminosas 
(Pumplin et al. 2010; Murray et al. 2011). 
En cuanto al arroz se refiere, hay ortólogos de algunos de los genes de la CSP, 
en esta planta que están conservados funcionalmente por completo, que son 
adecuados para promover la RNS y que podrían funcionar como potenciales 
bloques de construcción para extender las redes simbióticas y lograr la RNS en 
arroz (Reddy et al. 2013). 
 
I.4.3 Importancia de la CCaMK/DMI3 
	
La cinasa dependientede calcio y calmodulina (CCaMK) es una proteína 
compuesta por un dominio cinasa, un dominio regulatorio de unión a 
calmodulina (CaMBD) y un dominio de mano EF que sirve como sensor de los 
cambios en los flujos de calcio generados por la cascada de señalización 
simbiótica de la CSP (Singh and Parniske 2012; Takeda et al. 2012). 
 
La activación de la CCaMK es suficiente para disparar procesos simbióticos 
subsecuentes, ya que hay estudios donde se muestra que la regulación de esta 
proteína está controlada por un dominio autoinhibitorio, que regula 
negativamente su actividad de cinasa. Por otro lado, se ha demostrado que la 
remoción del dominio de autoinhibición de CCaMK en M. truncatula produce la 
autoactivación de la vía de señalización y la expresión de genes específicos de 
la nodulación en la ausencia de infección por las bacterias rizobiales (Gleason 
et al. 2006). Se realizó algo muy parecido con la CCaMK de Lotus japonicus, 
en donde la sustitución de un aminoácido de dicha cinasa, fue suficiente para 
	 20 
que células del córtex de la raíz se convirtieran en células meristemáticas 
fundadoras de primordios nodulares (Tirichine et al. 2006). El mismo año, otro 
grupo demostró que, al mutar un residuo de treonina en MtDMI3 a aspartato 
(T271D) se produce una proteína auto-activada o, con una ganancia de 
función, la cual induce nodulación espontánea en M. truncatula en ausencia de 
bacterias rizobianas (Gleason et al. 2006) (Figura 3). Posteriormente, se mostró 
que una CCaMK autoactiva (CCaMKT265D) de Lotus japonicus demostró no 
necesitar a los genes de la CSP (generadores de oscilaciones de calcio) que 
actúan antes de ella (Hayashi et al. 2010). Resumiendo, estos trabajos 
relacionados con la compensación de la pérdida de los genes CSP (SYMRK, 
CASTOR, POLLUX and NUP85) involucrados en la generación de oscilaciones 
de calcio, y que disparan el desarrollo de nódulos en la raíz en ausencia de 
rhizobia, enfatizan el hecho de que la DMI3/CCaMK actúa como un regulador 
central del programa de desarrollo nodular en las leguminosas (Gleason et al. 
2006; Tirichine et al. 2006; Hayashi et al. 2010). 
 
 
A 
Expresión de 
ENOD11-GUS 
 
 
Complementación 
(nódulos infectados) 
	 -(5/58) 
 
+(39/60) 
	
	 	
 
+(15/25) 
 
+(10/16) 
B 
 
 
	 21 
Figura 3. (A) DMI3 codifica para una CCaMK con un dominio serina/treonina cinasa 
(gris), un dominio autoinhibitorio que sobrelapa con un dominio de unión a CaM 
(negro) y tres motivos de mano EF (blanco). Los números entre paréntesis indican el 
número de plantas (M. truncatula) que fueron positivas para la tinción de ENOD11-
GUS en ausencia de factores Nod o el número de plantas con nódulos infectados con 
bacterias en ensayos de complementación con dmi3-1, con respecto al número total 
de plantas analizadas. (B) DMI3T271D activa ENOD11-GUS en ausencia de factores 
Nod o de Sinorhizobium meliloti (el simbionte rhizobial de M. truncatula por 
excelencia), indicando actividades de ganancia de función. (Modificado de Gleason et 
al. 2006). 
 
En el presente trabajo consideramos el papel clave de la DMI3/CCaMK 
promoviendo procesos de nodulación en leguminosas y nos planteamos el 
objetivo de estudiar el efecto de la introducción y expresión del gen MtDMI3 de 
M. truncatula con una ganancia de función (MtDMI3T271D, al que llamamos 
gofMtDMI3) en el arroz. Investigaremos la habilidad de dicho transgene para 
promover respuestas simbióticas similares a las de las leguminosas en las 
raíces de este cereal. 
 
I.5 El papel de las fito-hormonas en la nodulación. 
	
La ontogenia de la nodulación coexiste con otros procesos de desarrollo 
vegetal (Beveridge et al. 2003; Ferguson and Mathesius 2003) y por lo tanto 
con procesos vegetales regulatorios, tales como aquellos facilitados por fito-
hormonas las que juegan papeles importantes. Los efectos fisiológicos y de 
desarrollo de las fito-hormonas sobre la nodulación han sido estudiados y 
descritos extensamente (Lohar et al. 2009). 
 
	 22 
Hay diversas hormonas vegetales que regulan positiva o negativamente a la 
nodulación. Las citocininas juegan un papel muy importante, en la regulación 
positiva del desarrollo de los nódulos (Oldroyd 2007; Tirichine et al. 2007). Por 
otro lado, las hormonas que participan en la defensa contra agentes externos y 
estrés, tales como etileno, ácido salicílico (SA), ácido jasmónico (JA) y ácido 
abscísico (ABA) juegan papeles decisivos en el control de las respuestas de la 
epidermis durante el proceso de nodulación. Entonces, a grandes rasgos, las 
fito-hormonas funcionan en diferentes etapas en dicho proceso y pueden 
contribuir en la coordinación de los programas de desarrollo en la epidermis y 
el córtex de las raíces, necesarios para permitir la infección bacteriana hacia el 
nódulo en formación (Ding and Oldroyd 2009) (Figura 4). 
 
Figura. 4. En la epidermis, las hormonas de 
defensa y respuesta al estrés como el etileno, 
JA y SA así como el ABA regulan negativamente 
los procesos que se inducen por NF: 
oscilaciones de Ca+2, expresión de nodulinas 
tempranas y el inicio del hilo de infección. Por 
otro lado, en la corteza y en las células del 
periciclo, el balance de citocininas, ABA y 
auxinas dictan si se iniciarán raíces laterales o 
nódulos. Además, el ABA tiene una dualidad de 
papeles, ya que regula los procesos epidérmicos y los procesos corticales de 
nodulación, de tal manera que facilita la coordinación de los programas epidérmicos y 
corticales. rhc, célula de pelo radical; ep, epidermis; cc, célula cortical; en, endodermis; 
pc, célula de periciclo; ph, floema; xy, xilema; JA, ácido jasmónico; SA, ácido salicílico; 
ABA, ácido abscísico; GA, ácido giberélico; BR, brasinosteroides. (Imagen modificada 
de Ding and Oldroyd 2009). 
 
	 23 
I.5.1 Citocininas 
	
Se sabe que la producción y percepción de las citocininas son elementos clave 
para el desarrollo de la nodulación (Ding and Oldroyd 2009). 
 
De manera breve, y como ya se explicó anteriormente, para que la nodulación 
se lleve a cabo es necesario que haya ciertas respuestas en la epidermis de 
las raíces, las cuales están asociadas con la percepción de los NF bacterianos. 
Esto lleva a la activación de una vía de señalización dependiente de 
oscilaciones de calcio y a la deformación de las raíces a través de una ruta de 
señalización independiente de dichas oscilaciones. Las respuestas en el 
córtex están asociadas con un incremento en la producción de citocininas, las 
cuales son percibidas por una histidina cinasa (HK1) (Oldroyd and Downie 
2008). Esto a su vez activa la expresión de ciertos factores de transcripción y 
otros genes, lo que desemboca en la reactivación de la división celular en el 
córtex, para la formación de primordios nodulares (Oldroyd 2007) que después 
son invadidos por rhizobia. 
 
Los estudios que han examinado mutaciones de ganancia y pérdida de función 
en un receptor de citocininas resaltan el papel esencial de estas hormonas en 
la activación del primordio nodular (Gonzalez-Rizzo et al. 2006; Murray et al. 
2007; Tirichine et al. 2007). Una mutación de ganancia de función en el 
receptor de citocininas “histidina cinasa” de L. japonicus (Lhk1), provocada por 
la transición de un solo nucleótido (C a T L266F), conlleva al desarrollo 
espontáneo de nódulos en la ausencia de rhizobia o de moléculas señal de 
	 24 
rhizobia (Tirichine et al. 2007). La pérdida de función en Lhk1 de L. japonicus, 
anula la formación de nódulos, pero no afectan la invasión de la raíz por 
rhizobia (Murray et al. 2007) lo cual es un indicio de que la activación de Lhk1 
es necesaria y suficiente para la organogénesis nodular, no así para la 
infección bacteriana de las raíces. 
 
Además, evidencias del papel central de las citocininas y su percepción río 
abajo de la transducción de señales de NF, vienen del efectoaditivo de las 
mutaciones snf1-1 y snf2 en L. japonicus. Las mutantes snf1-1 sintetizan una 
CCaMK que está permanentemente autofosforilada y, por lo tanto, 
autoactivada – similar a la MtDMI3T271D – (Tirichine et al. 2006) y desarrollan 
nódulos espontáneos (7 ± 0.9). Por otro lado, las mutantes snf2 corresponden 
al alelo monogénico dominante Lhk1L266Fy también desarrollan nódulos 
espontáneos, aunque con menos frecuencia que snf1-1 (3 ± 0.5). De manera 
interesante, las dobles mutantes snf1-1 snf2 presentan un efecto aditivo, pues 
generan más nódulos espontáneos que cualquiera de las dos mutantes 
individualmente (17 ± 0.9). Los autores de este trabajo propusieron que la 
desregulación de la señalización en snf1 provoca un incremento en los niveles 
de citocininas que, a su vez, activan transcripcionalmente a snf2, amplificando 
la nodulación espontánea (Tirichine et al. 2007). 
 
Además de las citocininas, varias otras hormonas tales como auxinas, 
giberelinas y brasinosteroides también tienen funciones positivas en la 
	 25 
formación del nódulo (Mathesius et al. 1998; Ferguson et al. 2005; Prayitno et 
al. 2006). Sin embargo, no me enfocaré en ellas. 
 
En contraste con estas hormonas con funciones positivas en el desarrollo del 
nódulo, se ha descubierto que un número de hormonas vegetales regulan 
negativamente a la nodulación como son el etileno, el JA, el SA y el ABA. 
 
I.5.2 Etileno. 
	
El etileno es la hormona gaseosa que está mejor caracterizada entre los 
reguladores negativos, aunque se ha visto que el JA, el SA y el ABA también 
tienen funciones de regulación negativa en la nodulación. (Cho and Harper 
1993; Penmetsa and Cook 1997; Suzuki et al. 2004; Nakagawa and Kawaguchi 
2006; Sun et al. 2006). El estudio de mutantes ha ayudado a establecer el 
papel del etileno en la nodulación; tal es el caso de skl que es una mutante 
insensible a etileno de M. truncatula que tiene un fenotipo hipernodulante 
(Penmetsa and Cook 1997). Por otro lado, la utilización de ácido 1-
aminociclopropano–1-carboxílico (ACC), precursor inmediato del etileno y de 
un inhibidor de la respuesta al etileno: aminoetoxivinilglicina (AVG), (Lohar et 
al. 2009) han demostrado que el etileno inhibe respuestas al estímulo de 
rhizobia, tales como la deformación de pelos radicales, las oscilaciones de 
calcio, la expresión de nodulinas tempranas y la frecuencia de formación de los 
hilos de infección (Ding and Oldroyd 2009) disminuyendo, de esta manera, la 
infección por rhizobia. 
 
	 26 
Por otro lado, uno de los receptores de etileno, Atetr1, fue clonado en A. 
thaliana y se encontró que codifica para una histidina cinasa de dos 
componentes (Gamble et al. 2002). En este trabajo se vio que, una sola 
mutación en el residuo 65 (que cambia un aminoácido de cisteína a uno de 
tirosina) provocó una mutación dominante (etr1-1) causando la insensibilidad al 
etileno en estas mutantes (Chang et al. 1993). Además, en experimentos 
realizados en L. japonicus transformado con el receptor mutado de etileno etr1-
1 (ethylene response) de A. thaliana, (Lohar et al. 2009) se obtuvieron plantas 
que son insensibles a la hormona etileno, con un incremento considerable en la 
nodulación, y con un mayor número de bacteroides por nódulo con respecto al 
tipo silvestre. 
 
I.5.3 Ácido Abscísico (ABA). 
	
Ahora se sabe que el ABA regula el estado hídrico de la planta, y que participa, 
entr otras cosas, en la germinación, la maduración del embrión, la senescencia 
de hojas, y la apertura y cierre de estomas (Bari and Jones 2009; Umezawa et 
al. 2009), entre otras cosas. En la nodulación, el ABA parece tener un efecto 
similar al del etileno, ya que inhibe el número de hilos de infección, las 
oscilaciones de calcio inducidas por el reconocimiento de NF y la inducción de 
nodulinas tempranas (ENODs) (Lohar et al. 2009). 
 
En estudios con L. japonicus se descubrieron plantas mutantes a las que se 
denominó enf1 (enhanced nitrogen fixation 1), que presentaron un mayor 
	 27 
número de nódulos, un aumento en la fijación de nitrógeno y cuyas cantidades 
de ABA endógeno eran menores (Tominaga et al. 2009). 
 
Para estudiar el efecto de la insensibilidad al ABA en la nodulación, se 
sobreexpresó en M. truncatula el alelo dominante abi1-1 de Arabidopsis –el 
cual suprime la señalización de ABA – (Wu et al. 2003). Las raíces 
transformadas de dichas plantas desarrollaron un fenotipo hipernodulante con 
nódulos e infectados por rhizobia de manera natural. 
 
 
	 28 
CAPÍTULO II. OBJETIVOS 
	
Como ya se planteó anteriormente, el arroz es muy importante a nivel 
alimenticio en el mundo y, para satisfacer las demandas de este alimento 
durante los próximos años, se ha estimado que se necesitará casi el doble de 
nitrógeno para su producción. Debido a este problema, se ha establecido el 
ambicioso objetivo de extender la capacidad de la fijación biológica de N a los 
cereales como el arroz. Si lo anterior se lograra, el potencial de suministro de 
nitrógeno se incrementaría, ya que el N fijado estaría disponible directamente 
para la planta, con muy pocas pérdidas. Además esto permitiría que se 
redujera el costo en fertilizantes así como la contaminación que estos 
conllevan. 
 
II.1 OBJETIVO GENERAL 
	
Expresar en arroz genes ortólogos que son cruciales para la nodulación en 
leguminosas para desencadenar eventos de señalización semejantes a los que 
se presentan en las mismas. Por otro lado, se desea evaluar el efecto de esta 
expresión ectópica en la interacción simbiótica con hongos micorrízicos. 
 
II.2 OBJETIVOS PARTICULARES 
	
1. Expresión en el arroz de una variante autoactivada de la cinasa 
dependiente de Ca+2/calmodulina (DMI3 de M. truncatula) de la vía 
simbiótica común. 
 
	 29 
• Generación de plantas de arroz transgénicas con el gen gofMtDMI3, y 
su descendencia para estudios posteriores. 
• Analizar la expresión del transgene de interés en el arroz. 
• Analizar el nivel de colonización por Rhizophagus irregularis en raíces 
de plantas de arroz transformadas con gofMtDMI3. 
• Analizar el perfil transcripcional de las raíces de arroz transformado con 
gofMtDMI3, en condiciones deficientes de N. 
• Validar la expresión diferencial de genes en diferentes condiciones 
nutrimentales y en presencia de una cepa rhizobial. Estos genes se 
seleccionarán a partir del perfil transcripcional. 
 
2. Expresión de los genes gofDMI3, gofLHK1, Atetr1-1 y Atabi1-1, en 
diferentes combinaciones para explorar su potencial para generar 
respuestas de tipo simbiótico en raíces de arroz. 
 
 
 
 
	 30 
CAPÍTULO III. RESULTADOS 
 
III. 1 Ortiz-Berrocal M, Lozano L, Sanchez-Flores A, Nava N, Hernández G, 
Reddy PM. (2017). Expression in rice of an autoactive variant of Medicago 
truncatula DMI3, the Ca+2/calmodulin-dependent protein kinase from the 
common symbiotic pathway modifies root transcriptome and improves 
mycorrhizal colonization. Plant Biotechnology Reports: 11 (5): 271–287. 
https://doi.org/10.1007/s11816-017-0449-4 
	 31 
 
ORIGINAL ARTICLE
Expression in rice of an autoactive variant of Medicago truncatula
DMI3, the Ca+2/calmodulin-dependent protein kinase
from the common symbiotic pathway modifies root transcriptome
and improves mycorrhizal colonization
Marlene Ortiz-Berrocal1 • Luis Lozano1 • Alejandro Sanchez-Flores2 •
Noreide Nava3 • Georgina Hernández1 • Pallavolu M. Reddy1,4
Received: 29 May 2017 / Accepted: 30 August 2017
! Korean Society for Plant Biotechnology and Springer Japan KK 2017
Abstract Rice is the principle staple food for more than
half of humankind. Frequently, productivity of rice is
affected by low nitrogen in the soil and hence, for
enhanced rice production it heavily relies on synthetic
nitrogen fertilizers that beget economic and ecological
costs. In this context, the interest in transferring legume-
like biological nitrogenfixation capability to rice has
increased lately. The rice-arbuscular mycorrhizal (AM)
symbiosis is mediated by genes that are orthologous to
legume-genes known to be essential constituents of the
common symbiotic pathway (CSP) that facilitates the
establishment of both rhizobial nitrogen fixation- and AM-
symbioses in legumes. Particularly, DMI3 (Ca?2/-
calmodulin-dependent serine/threonine protein kinase,
CCaMK), a component of the CSP, was found to play a
paramount role in promoting the development of both types
of symbioses. In fact, expression of autoactive version of
DMI3 was shown to be sufficient to trigger downstream
developmental processes leading to the induction of
spontaneous nodulation in the absence of rhizobia. Hence,
in the present investigation, we expressed in transgenic rice
a gain-of-function Medicago truncatula DMI3T271D gene
(gofMtDMI3) and assessed if legume-like symbiotic
responses can be mimicked in rice roots. Ectopic expres-
sion of gofMtDMI3 in common bean induced spontaneous
nodulation in the roots in the absence of rhizobia, but in
rice plants it did not produce any such legume-like nodular
manifestations. Conversely, the expression of gofMtDMI3
supported elevated AM colonization in rice roots that could
improve plant nutrition/growth. In addition, gofMtDMI3
expression induced higher transcript levels of the CSP
orthologues OsDMI3, OsIPD3 and OsNSP1, as well as
triggered changes in the expression of several genes
involved in biotic and abiotic stress responses. Our results
with gofMtDMI3 lay the basis for the potential develop-
ment of a biotechnological approach towards improvement
of rice production.
Keywords Rice ! Legumes ! Common symbiotic pathway
(CSP) ! Medicago truncatula DMI3 (CCaMK) ! AM
symbiosis ! Transcriptome analysis
Introduction
Rice is one of the most important cereal crops worldwide;
it is the basic staple food for nearly half of humankind.
Crop productivity is influenced by numerous variables
including weather, soil type, moisture and nutrients.
Electronic supplementary material The online version of this
article (doi:10.1007/s11816-017-0449-4) contains supplementary
material, which is available to authorized users.
& Marlene Ortiz-Berrocal
mortiz@ccg.unam.mx
& Pallavolu M. Reddy
Pallavolu.Reddy@teri.res.in
1 Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional
Autónoma de México (UNAM), Av. Universidad 1001,
Cuernavaca, MOR 62209, Mexico
2 Unidad Universitaria de Secuenciación Masiva y
Bioinformática, Instituto de Biotecnologı́a, Universidad
Nacional Autónoma de México (UNAM), Av. Universidad
1001, Cuernavaca 62209, MOR, México
3 Departamento de Biologı́a Molecular de Plantas, Instituto de
Biotecnologı́a, Universidad Nacional Autónoma de México
(UNAM), Av. Universidad 1001, Cuernavaca, MOR 62209,
México
4 Present Address: The Energy and Resources Institute, IHC,
Lodi Road, New Delhi 110003, India
123
Plant Biotechnol Rep Online ISSN 1863-5474
DOI 10.1007/s11816-017-0449-4 Print ISSN 1863-5466
	 32 
 
Nitrogen (N) being the key nutrient that limits crop pro-
ductivity, it has become necessary to use synthetic N fer-
tilizers to boost rice yields. It is estimated that twice as
much fixed N will be required to raise rice production by
2020 to supplement the food requirements of the increasing
human population (Ladha and Reddy 2003; Gutiérrez
2012).
Though fertilizer production, through the Haber–Bosch
process for industrial N fixation is needed to meet the
demand for food production, the excessive use of such
chemical fertilizers entails ecological risks and high eco-
nomical costs. Nearly 70% of applied fertilizers are lost and
these eventually contribute to environment degradation
through ground water pollution and nitrous oxide emissions,
among others (Reddy et al. 2002; Stokstad 2016). In this
context, current research for sustainable agriculture is
assessing ways to reduce dependence on chemical N fertil-
izers, and for this the alternative of increasing agricultural
use of biological nitrogen fixation (BNF) is gaining impor-
tance (Stokstad 2016). Extending BNF to cereal crops has
been a long cherished goal, but yet unachieved. Neverthe-
less, the current state of the art in the biochemistry/physiol-
ogy/genetics/genomics of N-fixing bacteria and of the plants
these microbes associate with, has opened up new avenues
and resulted in the recent revision of viable options aiming at
achieving this goal (Beatty and Good 2011).
In general, three approaches are considered as promising
for bringing about the goal of BNF in cereals (Ladha and
Reddy 1995; Beatty and Good 2011), and these are being
explored in research megaprojects throughout the world.
One approach considers achieving a functional nitrogenase
in plants through the introduction of nitrogenase-encoding
bacterial genes (Ivleva et al. 2016; López-Torrejón et al.
2016). A second approach takes into account the current
knowledge of endophytic bacteria that associate with plants
to develop nodule-independent N-fixing systems for cereals
(de Vrieze 2015). A third approach considers the develop-
ment of root-nodule symbiosis in non-legume crops (Reddy
et al. 2013; Rogers andOldroyd 2014). The latter approach is
based on the current knowledge of the endosymbiotic asso-
ciations of most land plants, including cereals and legumes,
with endomycorrhizal fungi to form phosphate-acquiring
arbuscular mycorrhizae (AM) and the symbiotic association
of legumes with diverse diazotrophic bacteria, commonly
known as rhizobia, to form nitrogen-fixing nodules (Werner
et al. 2014). Genetic elements that are central to mediate AM
symbiosis (AMS) development are similar in legumes and in
rice (Gutjahr et al. 2008). Furthermore, in legumes, these
same genetic elements participate in mediating initial stages
of the root-nodule symbiosis (RNS) and constitute the so-
called ‘‘common symbiosis pathway’’ (CSP) (Markmann
and Parniske 2009). Current research approaches are taking
advantage of functionally conserved genetic elements from
the CSP to add on new genetic circuits to promote legume-
like RNS in cereals (Reddy et al. 2013; Rogers and Oldroyd
2014; Delaux et al. 2015; Mus et al. 2016). Our work is
framed in this third approach aiming for BNF in rice.
Extensive analyses of the CSP for RNS and AMS have
been performed mainly in the model legume species Med-
icago truncatula and Lotus japonicus. Genetic elements of
the CSP are similar and functionally conserved in these and
other legumes though they have been assigned different
names; for the ease of description of the early signaling
processes here we will summarize the CSP from the model
legume plantM. truncatula. RNS and AMS are triggered by
the perception of signal molecules—lipochitoligosaccha-
rides known as Nod- or Myc- factors, respectively, synthe-
sized and secreted by rhizobia or AM fungi—by specific
receptors (LysM-RLKs) present in root epidermal cells/root
hairs (Dénarié et al. 1996; Maillet et al. 2011). Following
Nod factor (NF) perception, Ca?2 spiking is induced at the
perinuclear region of epidermal cells with the transmission
of signal via a set of upstream signaling components com-
prising of the receptor kinase MtDMI2, three nuclear pore
protein components, and the cation channel MtDMI1. The
Ca?2 spiking activates the Ca?2/calmodulin dependent
kinaseMtDMI3 that interacts and phosphorylates the coiled-
coil nuclear-localized protein MtIPD3. Activation of
MtDMI3 is essential for triggering the cascade of nodulation
events via the activation of downstream nodulation-specific
transcription factors that induce the expression of early
nodulin genes resulting in root hair curling, infection thread
formation and cortical cell divisions leading to nodule
development (reviewed by Oldroyd 2013). Notably, it has
been demonstrated that the rice genes orthologous to legume
CSP genes such asMtDMI1, MtDMI2 andMtDMI3 are able
to fully complement legumemutants affected in AMS or
RNS processes (Godfroy et al. 2006; Chen et al. 2007, 2009;
Banba et al. 2008; Markmann et al. 2008), something that
supports the use of such native genes as potential building
blocks for extending symbiotic networks to accommodate
RNS in rice (Reddy et al. 2013).
In this work, we aim to analyze the effects in rice of the
expression of a functional CSP gene: the Ca?2/calmodulin-
dependent serine/threonine protein kinase DMI3 also
known as CCaMK (Madsen et al. 2010). This protein is
composed of a kinase domain, and the regulatory
calmodulin binding domain (CaMBD) and an EF-hand
domain that function as sensors for changes in Ca?2 fluxes
generated by upstream symbiosis signaling cascade in
legumes (Singh and Parniske 2012; Takeda et al. 2012).
The activation of this protein is sufficient to trigger
downstream symbiotic processes, as Gleason et al. (2006)
showed that mutating a threonine residue in MtDMI3 to
aspartate (T271D) results in a gain-of-function or autoac-
tivated protein that induces spontaneous nodulation in M.
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truncatula in the absence of rhizobia. Indeed autoactive
CCaMK was also shown to dispense with the requirement
of the upstream CSP genes for calcium-spike generation in
Lotus japonicus (Hayashi et al. 2010). Thus, both the above
results related to compensating for the need for the loss of
upstream CSP (SYMRK, CASTOR, POLLUX and NUP85)
genes involved in generation of calcium spiking, and the
triggering of the development of root nodules in the
absence of rhizobia emphasize the fact that the DMI3/
CCaMK acts as a central regulator of nodule develop-
mental program in legumes (Gleason et al. 2006; Tirichine
et al. 2006; Hayashi et al. 2010). Considering the key role
of DMI3/CCaMK in promoting nodulation processes in
legumes, we generated transgenic rice lines expressing a
gain-of-function MtDMI3 (gofMtDMI3) gene and assessed
the ability of the transgene to promote legume-like sym-
biotic responses in rice roots. Our results showed that the
ectopic expression of autoactive MtDMI3 (gofMtDMI3)
increased the level of mycorrhizal colonization and
induced root transcriptome changes, including enhanced
expression of the native symbiosis-related OsDMI3,
OsIPD3 and OsNSP1 genes in transgenic rice plants. The
observed positive effect of DMI3 on AMS development
indicates its potential for biotechnological improvement of
rice production.
Materials and methods
Plasmid construction
For the construction of plant transformation vectors we
have utilized pSAT—RCS2-HPT vector platform devel-
oped by Dr. T. Tzfira and coworkers (Chung et al. 2005) to
assemble the gene expression cassettes needed for the
generation of transgenic rice plants. Initially, we modified
the pSAT vectors by deleting Nos promoter from pSAT2A
and RbcS promoter from pSAT6A and replacing them with
Age1-BglII adaptor, thus generating pS2AWoP-NosT and
pS6AWoP-RbcST auxiliary vectors amenable for cloning
desired promoter and gene combinations. pS6AWoP-
RbcST was further altered by replacing the terminator
RbcST with 35ST derived from pSAT4A to generate
pS6AWoP-35ST.
All PCR amplified promoter/gene products were ini-
tially captured into pGEM-T Easy vector (pGEMTE; Pro-
mega, USA) and sequence verified to confirm their fidelity,
prior to cloning/assembling them into modified SAT vec-
tors for developing expression cassettes. Restriction sites
were embedded into the PCR primers (underlined) for
facilitating cloning of the amplified DNA products.
Development of MtENODP:GUS reporter fusion To
achieve this, first, the HindIII/EcoICR1 fragment having
gusA CDS derived from pBI101 (Jefferson et al. 1986) was
cloned into HindIII/Sma1 digested pS2AWoP-NosT to get
pS2AWoP-GUS-NosT. A 2.3-Kb MtENOD11
(Medtr3g415670) promoter, PCR amplified from the
Medicago truncatula (A17) genomic DNA using high
fidelity Advantage-2 polymerase (Clontech, USA) and the
promoter sequence specific forward (50-AGA-
GAAGCTTGTTTACTTGCATTACCCCCGC-30) and
reverse (50-AGAG CCCGGGTTTAGGTAGTGATTT
TAGTGTGC-30) primers, was digested with HindIII/Xma1
and ligated to the similarly digested pS2AWoP-GUS-NosT
to obtain pS2A-MtENOD11P-GUS-NosT. Subsequently,
the vector pS2AWoP- MtENOD11P-GUS-NosT was
restricted with EcoICR1/Hpa1 to eliminate the distal por-
tion of MtENOD11 promoter and re-ligated to give rise to
pS2A-E787P-GUS-NosT; this vector contained only
787 bp of the proximal region of the MtENOD11 promoter
fused to GUS:NosT. Earlier studies with the MtENOD11
promoter demonstrated that the 411-bp MtENOD11 pro-
moter sequence immediately upstream from the start codon
is sufficient for Nod Factor elicited as well as microsym-
biont-mediated, infection-related expression in M. trun-
catula roots (Boisson-Dernier et al. 2005).
Development of pS6A-OsCC1P-gofMtDMI3-35T auxil-
iary vector carrying the autoactive MtDMI3T271D gene
driven by OsCC1 promoter In this study, we have made use
of the constitutive OsCC1 promoter (Jang et al. 2002) to
drive the expression of gofMtDMI3 in rice. The promoter
region, 1635 bp upstream of the ATG codon, of OsCC1
gene (LOC_Os05g34770) was PCR amplified from the
genomic DNA isolated from Oryza sativa L. (cv. Murasaki
R86) using Advantage-2 polymerase and the promoter
specific forward (50-CGACAGATCTGCGCCAGGTAC
TCCGACC-30) and reverse (50-TTAATGAGCTCCGCCG
CCGCCGCGAGAA-30) primers, and cloned into
pGEMTE vector to generate pGEMTE-OsCC1P. For gen-
erating autoactive MtDMI3, first, the 1575-bp CDS of
MtDMI3 (Lévy et al. 2004) was PCR amplified from root
cDNA isolated fromM. truncatula (A17), using advantage-
2 polymerase and the gene specific forward (50-GGA
AGATCTATGGGATATGGAACAAGAAAAC-30) and
reverse (50-CTACCCGGGCTATTATGGACGAATAGAA
GAG-30) primers, and cloned into pGEMTE vector. Thus,
generated plasmid pGEMTE-MtDMI3 was verified for
sequence fidelity of MtDMI3, and utilized to perform site-
directed mutagenesis in MtDMI3 gene to convert it into a
gain-of-function variant previously reported (Gleason et al.
2006). For this, the Stratagene Quick Change II Site
Directed Mutagenesis Kit was used along with sense (50-
GGGAATTTTAGTTTTTATGAGAAGGATTGGAAGG
GAATTTCACAACCAGC-30) and antisense (50-GCTGG
TTGTGAAATTCCCTTCCAATCCTTCTCATAAAAAC
TAAAATTCCC-30) primers according to the
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	 34 
 
manufacturer’s instructions, to create the gain-of-function
variant with the T271D mutation in MtDMI3 (Fig. 1a), to
generate pGEMTE-gofMtDMI3. Subsequently, the OsCC1
promoter released by digesting with BglII/Sac1 from the
pGEMTE-OsCC1, and the gofMtDMI3 CDS derived by
digestion with SacII/XmaI from the pGEMTE-gofMtDMI3
were sequentially cloned into the auxiliary vector pS6A-
WoP-35ST at BglII/SacI and SacII/XmaI sites to generate
pS6A-OsCC1P-gofMtDMI3-35ST.
Development of binary plant transformation vectors
pRCS2-E787P:GUS:NosT-OsCC1P:gofMtDMI3:35ST:
First, the expression E787P:GUS:NosT cassette was
released from pS2A-E787P-GUS-NosT by digesting with
I-Ppo1/Asc1 and cloned into similarly digested pRCS2-
HPT vector generating pRM-eG. The digestion of
pRCS2-HPT with Asc1 excised out the OcsP:HPT:OcsT
cassette from the vector, and hence, it was re-cloned into
the Asc1 digested pRM-eG, in the same orientation, to
achieve the plant transformation vector pRCS2-HPT-
E787P-GUS, which is re-designated as pEG for brevity
(Fig. 1b). This vector was used for transformation of rice
to generate vector control plants. The OsCC1P:-
gofMtDMI3:35ST expression cassette from pS6A-
OsCC1P-gofMtDMI3-35T was excised by restriction
digestion with PI-PspI and ligated into the correspond-
ingly digested pEG to generate pRCS2-HPT-E787P-
GUS-gofMtDMI3 plant transformation vector. This
composite plant transformation vector harboring linked
gene expression cassettes of OcsP:HPT:OcsT,
E787P:GUS:NosT and OsCC1P:gofMtDMI3:35ST is re-
designated for brevity as p-gofDMI3 (Fig. 1c).
Development of pRCS-RIG-gofMtDMI3 vectorTo verify
if the newly generated autoactive MtDMI3 variant
(gofMtDMI3) is functioning well as expected and able to
induce spontaneous nodulation, a new plant transformation
vector was constructed with gofMtDMI3 driven by 35S
promoter for testing on a legume. For realizing this, ini-
tially we developed a plant transformation vector suit-
able for hairy root transformation containing
2X35SP:gjRFP:35S polyA gene cassette derived from
pGJ1425 (Jach et al. 2001) and 35SP:IntGUS:NosT
obtained from pIG121Hm (Ohta et al. 1990) as reporter
genes. This was achieved through a series of steps. To
develop this vector, first, the Sph1 liberated
2X35SP:gjRFP:35S polyA gene cassette from pGJ1425
(Jach et al. 2001) was ligated into similarly digested
pUC19 to get pUC-gjRFP-SH. Subsequently,
2X35SP:gjRFP:35S polyA cassette was re-excised out from
pUC-gjRFP-SH by digesting with Sal1/HindIII and then
ligated to HindIII-Kpn1 adapter, re-digested with Sal1/
Kpn1 and cloned into similarly digested pRCS2-HPT to get
pRCS-HPT-RED. To this pRCS-HPT-RED, another
Fig. 1 a Site-directed mutagenesis of M. truncatula DMI3 gene to an
autoactivated (gain-of-function) variant, the DNA and coded protein
sequences of mutagenized MtDMI3 are shown. Numbers correspond
to nucleotides and amino acids from the MtDMI3 coding region.
asterisk Indicates the nucleotides modified to generate the T271D
mutation that results in gain-of-function (gof) DMI3 (Gleason et al.
2006). b The M. truncatula MtENOD11 (E787P) promoter fused to
GUS and Nos terminator was cloned into pRCS2-HPT, resulting in
EG plasmid that was used as the control (empty) vector for rice
transformation. cThe p-gofDMI3 plasmid was generated after cloning
the gofMtDMI3 gene fused to OsCC1 promoter and 35S terminator
into EG plasmid
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reporter gene 35SP:IntGUS:NosT (obtained from
pIG121Hm; Ohta et al. 1990) routed through pS2AWoP,
was added at I-Ppo1/Asc1, to generate pRCS2-RIG.
Finally, gofMtDMI3 derived from pGEMTE-gofMtDMI3
was cloned into pSAT4A to generate pSAT4A-
gofMtDMI3 having the expression cassette
2X35SP:gofMtDMI3:35ST. The 2X35SP:gofMtDMI3:35ST
cassette was released by digesting with I-Sce1 and
assembled into pRCS2-RIG vector to obtain pRCS-RIG-
gofDMI3, suitable for hairy root transformation (Fig. 2a).
Generation of transgenic rice lines
The Japonica rice (Oryza sativa L.) cultivar Murasaki
R86 was used for this study. To generate rice
stable transgenic plants, embryogenic calli derived from
mature seeds were transformed with Agrobacterium
tumefaciens AGL-1 (recA-) harboring pEG or
p-gofDMI3, following the protocol from Sreevidya et al.
(2005), using REIII medium (Toki et al. 2006) with
0.1 mg/L NAA and 2 mg/L kinetin. Putative transformed
plantlets were transferred for acclimatization for
15 days. The presence of transgenes in putative trans-
formed plants was initially validated by PCR amplifi-
cation from extracted plant DNA using Extract-N-
AmpTM Plant Tissue PCR Kit (Sigma-Aldrich, USA) and
specific primers for each transgene (Supplemental
Table S1). Plants that showed the presence of transgenes
were transferred to soil and grown in the greenhouse to
obtain T1 seeds and the seeds of further generations. The
presence and copy number of transgenes were further
confirmed by Southern analysis from DNA isolated from
young leaves as reported (Dellaporta et al. 1983; Sree-
vidya et al. 2005). Genomic DNA samples (30 lg) were
digested with HindIII, ran on an agarose gel, transferred
to Hybond-N? nylon membrane (Amersham Bioscience,
UK) and hybridized with digoxigenin-11-dUTP (Roche
Life Science, USA) labeled probes specific for HPT gene
at 48 !C for 24 h. Probe preparation, hybridization,
stringent washes, blocking and chemiluminiscent detec-
tion were executed following manufacturer’s instructions
(Roche Applied Science, USA).
Fig. 2 a Schematic representation of T-DNA of the binary vector
pRCS-RIG-gofDMI3 used for hairy root transformation in Phaseolus
vulgaris. The plasmid bears GUS and DsRed reporter genes and
gofMtDMI3. b Common bean transgenic hairy roots transformed by
A. rhizogenes/pRCS-RIG-gofDMI3, showing spontaneous nodulation
in the absence of rhizobia. Transgenic hairy roots (with spontaneous
nodulation) expressing DsRed were visualized on a Discovery V8
Zeiss stereoscopic microscope; fluorescence was obtained according
to the DsRed emission spectrum (543 nm) with a helium laser (b1,
b2). The transgenic hairy roots with spontaneous nodules pho-
tographed under bright field (b3, b4)
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	 36 
 
The T2 and T3 offsprings from representative T0 plants
derived from independent gofDMI3 lines bearing single
copy of the transgenes were used for further analyses and
compared to the EG vector-transformed rice plants.
Rice growth conditions and plant tissue collection
for RNA-seq and RT-qPCR analyses
Transgenic EG and gofDMI3 plants used for RNA-seq
analysis were grown in individual culture tubes with sterile
Yoshida nutrient solution (Yoshida et al. 1976) in growth
chambers with controlled experimental conditions (28 !C;
16 h light, 8 h darkness); roots were covered with alu-
minum foil to protect them from light. After 2 months, the
plants were transferred to N-deprived culture solution
(Yoshida medium without N) for 2 days when roots were
collected in liquid nitrogen and immediately frozen
(-80 !C) until used for RNA extraction.
For RT-qPCR analysis, transgenic EG and gofDMI3
plants were grown under the conditions described above for
2 months, and were divided into three batches and sub-
jected to different treatments: (a) complete Yoshida solu-
tion (?N), (b) N-deprived solution (-N) and (c) plants in
-N were inoculated with Bradyrhizobium sp. strain
ORS278 (Molouba et al. 1999; Chaintreuil et al. 2000)
previously cultured in a modified YM medium (Giraud
et al. 2000).
RNA isolation, high throughput sequencing and data
analysis
Total RNA was isolated from 50 mg of frozen roots from
EG and gofDMI3 transgenic lines using Spectrum Plant
Total RNA Kit (Sigma, USA) following the manufacturer’s
instructions. Quality of RNA samples was evaluated using
a Nanodrop 2000 Spectrophotometer (Thermo Scientific,
USA). RNA samples (&20 lg) with OD260/280 values of
2.13–2.16 and OD260/230 values 2.19–2.22 were sent to
BGI Americas for Illumina HiSeq 2000 high throughput
sequencing. The raw reads were mapped to the O. sativa
CDS collection, using the short read aligner Bowtie
(Langmead et al. 2009), with the following parameters:
bowtie -aS -X 800—offrate 1 transcripts -1. Differential
expression was assessed by DEseq statistics package v.
1.24.0 (Anders et al. 2010) with a significance p value of
0.05, which uses a method based on the negative binomial
distribution to detect differentially expressed genes
(DEGs). Enrichment analysis of Gene Ontology terms was
based on the TopGO v. 3.0.2. (Alexa and Rahnenführer
2016), and a p value of 0.05 was used define the most
significant GO terms. DEGs were also analyzed with
MapMan software v. 10.0 (Thimm et al. 2004).
RT-qPCR analysis
For the quantification of transcript levels of selected rice
genes, cDNAs of various samples were synthesized from
1 lg of total RNA using the RevertAid H Minus First
Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, USA).
Resulting cDNAs were then diluted and used to perform
RT-qPCR assays using SYBR Green/ROX qPCR Master
Mix (Thermo Scientific, USA) following the manufac-
turer’s instructions. The sequences of oligonucleotide pri-
mers used for RT-qPCR amplification of each gene are
provided in Supplemental Table S1. Reactions were ana-
lyzed in a real-time thermocycler (Applied Biosystems
7300, USA) with settings of 50 !C incubation for 2 min,
95 !C of initial denaturation for 10 min, followed by 40
cycles of 95 !C for 15 s and 57 !C for 60 s. Two technical
replicates and three biological replicates were performed
for each reaction. Relative expression for eachsample was
calculated with the comparative Ct method. The Ct value
obtained after each reaction was normalized with the
geometrical mean of levels of three genes encoding a
nucleic acid binding protein (LOC_Os06g11170.1), an
expressed protein (LOC_Os07g02340.1) and a protein
kinase 1(LOC_Os06g48970.1) (Narsai et al. 2010). Sta-
tistical analyses of gene expression were performed using
one-way multiple paired Student’s t test (p\ 0.05).
Quantification of AM colonization
Rice seeds derived from EG and gofDMI3 transgenic
plants were surface-sterilized and germinated in magenta
boxes with sterile vermiculite. Two weeks after the plants
emerged, they were transferred to bigger pots containing a
biofertilizer matrix having 6 week-old-culture of 40 Rhi-
zophagus irregularis inoculum propagules per gram (INI-
FAP biofertilizer, produced at Campo Experimental
Rosario Izapa, Chiapas, México). Rice plants were irri-
gated twice weekly with half-strength B&D solution
(Broughton and Dilworth 1971) containing a low concen-
tration of potassium phosphate (10 lM, K2HPO4). Infected
roots were excised from plants after 7 weeks and stained
with trypan blue, to visualize AM infections for histo-
chemical analysis. The fungal structures were observed
under an inverted light microscope (Nikon Eclipse TE300,
Japan) to determine the number of arbuscules per root
centimeter (McGonigle et al. 1990). A set of plants grown
separately under identical conditions but without R.
irregularis inoculation served as controls. Statistical anal-
ysis was performed using a distribution-free non-paramet-
ric test (Moses test) of the difference between two
independent groups in the extremity of scores.
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	 37 
 
Common bean transformation
The common bean (Phaseolus vulgaris cv Negro Jamapa),
was transformed via Agrobacterium rhizogenes to generate
composite plants, with transformed root system and
untransformed aerial system, as reported (Estrada-Navar-
rete et al. 2007; Aparicio-Fabre et al. 2013). Common bean
plantlets were infected with A. rhizogenes K599 strain
bearing the RCS-RIG or RCS-RIG-gofDMI3 plasmids.
Plant growth for hairy root formation and confirmation of
the expression of the DsRed reporter gene were done as
described (Aparicio-Fabre et al. 2013). Selected composite
plants were grown under controlled environmental condi-
tions in pots with vermiculite and watered with N-free
B&D nutrient solution (Broughton and Dilworth 1971). To
check for spontaneous nodule formation, roots were
observed after 21 days under a Discovery.V8 Zeiss
stereoscopic microscope (Oberkochen, Germany).
Results and discussion
The mutagenized MtDMI3T271D gene induces
spontaneous nodulation in common bean
Site-directed mutagenesis was performed on MtDMI3 CDS
to generate the deregulated version of MtDMI3T271D gene
(Fig. 1a) to code for the protein previously reported as an
autoactive variant that results in a gain-of-function nodu-
lation phenotype in M. truncatula (Gleason et al. 2006). To
validate if this newly generated MtDMI3T271D mutant gene
functions as expected, we expressed it in the transgenic
hairy roots of the legume Phaseolus vulgaris (common
bean), transformed with the binary vector pRCS-RIG-
gofDMI3 (Fig. 2a). Composite common bean plants,
identified by the constitutive expression of DsRed in the
transformed roots, were grown in controlled environmental
conditions and watered with N-deprived nutrient solution
for 21 days. At the end of 3 weeks, nodule-like structures
could be observed in gofDMI3 expressing transgenic roots
even in the absence of rhizobial inoculation (Fig. 2b),
while such structures were absent in the control roots
transformed with the empty vector pRCS2-RIG. These
results showed that in the absence of rhizobia, the newly
developed MtDMI3T271D was able to appropriately activate
the signaling pathway leading to spontaneous determinate-
nodule formation, even in an alien species such as common
bean, thus validating its gain-of-function activity.
Expression of gofMtDMI3 in transgenic rice
Encouraged with the results with P. vulgaris (Fig. 2b), we
proceeded to express gofDMI3 in rice. The binary vector
used (p-gofDMI3) for rice transformation bears the
hygromycin resistance gene as selection marker (Chung
et al. 2005), the E787P:GUS:NosT reporter gene (proximal
portion of MtENOD11-promoter sequence fused to gusA)
and the OsCC1P:gofMtDMI3:35ST cassette. The maps of
pEG (empty vector) and p-gofDMI3 binary vectors used in
A. tumefaciens-mediated rice transformation are depicted
in Fig. 1b, c.
The plantlets regenerated from hygromycin-resistant
transformed calli were analyzed for the presence of theHPT,
GUS, and/or gofMtDMI3 transgenes, through PCR gene
amplification. The transformation frequencies for EG or
gofDMI3 were 8.3 or 32%, respectively. Southern blot
analysis revealed that the EG plants contained between 1 and
5 copies of transgenes, while gofDMI3 lines had 1–3 copies
and were derived from eight transformation events (Fig. 3a,
b).
Most of the gofDMI3 transformed plants, grown under
greenhouse conditions in pots with sterile soil, showed
similar normal root and shoot growth and development,
akin to EG (vector control) plants (Fig. 3c, d). About 88%
gofDMI3 plants produced up to 100 seeds per plant, while
100% of the EG plants produced up to 300 seeds each.
However, 1000 grain weight in both these transgenic lines
remained more or less similar with gofDMI3 plants
showing 22.44 g while it was 21.44 g in EG plants. In an
analogous study with coyote tobacco (Nicotiana attenu-
ata), Groten et al. (2015) also showed that altering the
expression of CCaMK does not have major non-target
effects on important ecological parameters such as plant
growth.
Table 1 shows the expression level of gofMtDMI3 in
the roots from a representative transgenic line (MD63).
The GUS expression driven by ENOD11 promoter
(E787P), included in the pEG and p-gofDMI3 vectors,
was also analyzed. The rational for this was based on
previously reported evidence: In M. truncatula, Nod fac-
tor-induced ENOD11 promoter is activated through the
action of DMI3-promoted activation of the complex of
NSP1/2 transcriptional regulators that directly associate
with this promoter (Hirsch et al. 2009; also see Oldroyd
2013). In addition, the rice orthologues of the NSP1/2
GRAS-domain transcription factor genes are functionally
conserved in rice, since they are able to fully rescue the
root nodule symbiosis-defective phenotype in Lotus
japonicus NSP-defective mutants (Yokota et al. 2010).
Thus, we desired to assess if the constitutively expressed
gofMtDMI3 gene is able to trigger a symbiosis-like sig-
naling cascade in transgenic rice plants similar to that in
M. truncatula. However, we were not able to detect GUS
expression in any tissue (root or leaf) from gofDMI3 N-
deprived plants.
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Ectopic expression of gofMtDMI3 promotes
enhanced AM symbiosis in rice
In the present study, we observed that the ectopic expres-
sion of gofMtDMI3 promoted the upregulation of native
OsDMI3 gene in transgenic rice plants (Table 1). It is
known that DMI3 is necessary for the development of
arbuscular mycorrhizal symbiosis in legumes and rice
(Chen et al. 2007; Lévy et al. 2004). To this end, we
analyzed if the expression of autoactive DMI3 in any way
influences colonization by R. irregularis and the develop-
ment of mycorrhizae in the transgenic rice plants. To assess
this we quantified the number of arbuscules formed per
root centimeter, and found greater colonization in the roots
of the plants expressing gofDMI3 as compared to those in
the roots of control EG plants (Fig. 4a).
It is known that in RN symbiosis of M. truncatula,
DMI3 along with its interacting protein IPD3 regulate the
activity of transcription factors such as NSP1 and NSP2
(Venkateshwaran et al. 2013), which govern the down-
stream gene expression leading