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i UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA ANÁLISIS DEL EFECTO DE LA VASOINHIBINAS SOBRE LA PERMEABILIDAD DE LA BARRERA HEMATO-RETINIANA Y EL ESTRÉS OXIDATIVO EN LA RETINA TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: DOCTOR EN CIENCIAS BIOMÉDICAS PRESENTA: M.C. DAVID ARREDONDO ZAMARRIPA TUTOR DRA. STÉPHANIE THEBAULT INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA, UNAM. MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR DR. ROGELIO ARELLANO OSTOA INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA, UNAM. DR. ROGELIO VÁZQUEZ PRADO DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS JURIQUILLA, QUERÉTARO. ENERO 2015 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. ii Este trabajo se realizó en el Departamento de Neurobiología Celular y Molecular del Instituto de Neurobiología de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), bajo la dirección de la Dra. Stéphanie Thebault. iii Agradecimientos Agradezco a la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) por brindarme la oportunidad de realizar mis estudios en el programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas con sede en el Instituto de Neurobiología (No. de cuenta 509003120). Asimismo, al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT; Beca No. 269268). También agradezco el apoyo proporcionado por los financiamientos del CONACYT (No. 176393) y de la DGAPA-PAPIIT IN201814. Agradezco a la Dra. Stéphanie Thebault por su tutoría a lo largo del proyecto y a la Dra. Carmen Clapp por la oportunidad de incorporarme a su equipo de trabajo. Extiendo mi gratitud al comité tutoral integrado por el Dr. Rogelio Arellano Ostoa y Dr. José Vázquez Prado por su asesoría en el proyecto. Agradezco el apoyo técnico al Nutr. Fernando López Barrera y al M.C Gabriel Nava, a los laboratoristas Antonio Prado Galán y Daniel Mondragón Huerta. Agradezco a los miembros del bioterio el MVZ. Martín García Servín y la Dra. Alejandra Castilla por su apoyo con los animales experimentales. Finalmente agradezco a la Ing. Nydia Hernández Ríos por su ayuda en la unidad de microscopia y a la Lic. Lourdes Lara Ayala por su colaboración en la unidad de videoconferencia. iv A mi hermana Nohemí, la guerrera v Abstract Vasoinhibins are prolactin fragments present in the retina, where they have been shown to prevent the hypervasopermeability associated with diabetes. Enhanced bradykinin (BK) production contributes to the increased transport through the blood-retina barrier (BRB) in diabetes. Here, we studied if vasoinhibins regulate BRB permeability by targeting the vascular endothelium and retinal pigment epithelium (RPE) components of this barrier. Intravitreal injection of BK in male rats increased BRB permeability. Vasoinhibins prevented this effect, as did the B2 receptor antagonist Hoe-140. BK induced a transient decrease in mouse retinal and brain capillary endothelial monolayer resistance that was blocked by vasoinhibins. Both vasoinhibins and the nitric oxide (NO) synthase inhibitor L- NAME, but not the antioxidant N-acetyl cysteine (NAC), blocked the transient decrease in bovine umbilical vein endothelial cell (BUVEC) monolayer resistance induced by BK; this block was reversed by the NO donor DETANONOate. Vasoinhibins also prevented the BK-induced actin cytoskeleton redistribution, as did L-NAME. BK transiently decreased human RPE (ARPE-19) cell monolayer resistance, and this effect was blocked by vasoinhibins, L-NAME, and NAC. DETANONOate reverted the blocking effect of vasoinhibins. Similar to BK, the radical initiator Luperox induced a reduction in ARPE-19 cell monolayer resistance, which was prevented by vasoinhibins. These effects on RPE resistance coincided with actin cytoskeleton redistribution. Intravitreal injection of vasoinhibins reduced the levels of reactive oxygen species (ROS) in retinas of streptozotocin-induced diabetic rats, particularly in the RPE and capillary-containing layers. Thus, vasoinhibins reduce BRB permeability by targeting both its main inner and outer components through NO- and ROS-dependent pathways, offering potential treatment strategies against diabetic retinopathies. vi Resumen Las vasoinhibinas (Vi) son fragmentos N-terminales de la prolactina que se encuentran en la retina donde se ha demostrado que previenen el incremento de la permeabilidad vascular asociado a la diabetes. El transporte de solutos entre la retina y la circulación está estrictamente regulado por la barrera hemato-retiniana (BHR), la cual consta de un componente interno endotelial y un componente externo representado por el epitelio pigmentario retiniano (EPR). En condiciones de diabetes el aumento en la producción de bradicinina (BK) contribuye al incremento de la permeabilidad de la BHR. En este trabajo, investigamos si las Vi regulan la permeabilidad de la BHR a través de actuar directamente sobre su componente interno y externo. Asimismo, determinamos si el óxido nítrico (NO) y las especies reactivas de oxígeno (ROS) median este efecto. Utilizando ratas macho Wistar encontramos que la inyección intravitreal de BK incrementa la permeabilidad de la BHR. Este efecto fue prevenido por las Vi de igual manera que por el antagonista del receptor B2 de la BK (Hoe-140). Se determinó la resistencia eléctrica (TER) en monocapas de células endoteliales y ARPE-19 como modelos respectivos del componente endotelial y epitelial de la BHR. Tanto las Vi como un inhibidor de la síntesis de NO (L-NAME), bloquearon el decremento de la TER en el endotelio inducido por la BK; efecto que es prevenido por un donador de NO (DETANONOato). Por otro lado, la BK disminuyó la TER en monocapas de ARPE-19 y las Vi, L-NAME y NAC bloquearon este efecto. Similar a la BK, el iniciador de la producción de ROS Luperox, redujo la TER, efecto que fue prevenido por las Vi. Consistentemente, la inyección intravitreal de Vi redujo los niveles elevados de ROS en la retina de ratas diabéticas (modelo de estreptozotocina), particularmente en la capa del EPR y en capas retinianas donde se localizan capilares. En conclusión, las Vi reducen el incremento de la permeabilidad de la BHR tanto en el componente interno como externo, a través de bloquear al NO y ROS, reafirmando su potencial terapéutico en la retinopatías relacionadas con estrés oxidativo. vii Abreviaturas ARNm Ácido ribonucleico mensajero ATP Adenosín trifosfato BHR Barrera hemato-retiniana BK Bradicinina CG Células ganglionares CNE Capa nuclear externa CNI Capa nuclear interna COX Cicloxigenasa CPE Capa plexiforme externa CPI Capa plexiforme interna C1INH Inhibidor C1 DAG Diacilglicerol ECA Enzima convertidora de angiotensina eNOS Sintetasa endotelial de óxido nítrico EP Epitelio pigmentario EPR Epitelio pigmentario retiniano GTPasa Guanosina trifosfatasa H2O2 Peróxido de hidrógeno iNOS Sintetasa inducible de óxido nítrico JAMs Junctionaladhesion molecules L-NAME NG-nitro-L-arginina metil éster MAPK Mitogen activated protein kinase MLCK Myosin light-chain kinase Na Sodio NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NO Óxido nítrico LPS Lipopolisacarido LOX Lipoxigenasa PEDF Factor derivado del epitelio pigmentario PKG Proteína cinasa G PP Proteína fosfatasa PRL Prolactina ROS Especies reactivas de oxígeno SE Segmentos externos SCC Sistema calicreína-cinina TER Resistancia eléctrica trans-endotelial/epitelial uPAR Receptores del activador de plasminógeno tipo uroquinasa VEGF Factor de crecimiento endotelial vascular Vi Vasoinhibinas ZO Zona occludens viii Índice Agradecimientos i Abstract iii Resumen iv Abreviaturas v I. Introducción 1 II. Barrera hemato-retiniana 2 II.1. Retina y su aporte sanguíneo 2 II.2. Barrera hemato-retina interna/externa 4 II.3. Permeabilidad a través de la BHR 6 II.3.1. El transporte transcelular 6 II.3.2. El transporte paracelular 7 II.3.2.1. Uniones de tipo GAP 8 II.3.2.2. Uniones adherentes 8 II.4. Uniones estrechas 9 II.4.1. Regulación de las uniones estrechas por fosforilación/desfosforilación 11 II.4.2. Regulación de las uniones estrechas por el NO y las ROS 12 III. Sistema calicreína-cinina 14 III.1. Receptores del SCC 14 III.2. Regulación del SCC 15 III.3. Funciones del SCC 16 III.4. El SCC y el ojo 17 III.4.1. SCC en la regulación de la BHR 19 IV. Vasoinhibinas 20 IV.1. Distribución de las vasoinhibinas en el organismo 21 IV.2. Efectos de las vasoinhibinas en la retina 22 IV.3. Vasoinhibinas y la retinopatía diabética 23 IV.3.1. Retinopatía diabética 23 IV.3.2. Vasoinhibinas como reguladores de la hiper-permeabilidad en la retina 23 IV.4. Vasoinhibinas y sus efectos moleculares 24 V. Planteamiento del problema 25 VI. Hipótesis 26 VII. Objetivo general 26 ix VIII. Objetivos específicos 26 IX. Materiales y métodos 28 IX.1 Reactivos 28 IX.2. Declaración ética 28 IX.3. Animales 29 IX.4. Inducción de diabetes 29 IX.5. Inyecciones intravitreales 29 IX.6. Cultivos celulares 29 IX.7. Cuantificación de la permeabilidad de la BHR 30 IX.8. Cuantificación de la expresión génica por RT-PCR tiempo real 31 IX.9. Análisis de la expresión proteica por Western-blot 32 IX.10. Tinción de los filamentos de actina 32 IX.11. Medición de la resistencia eléctrica trans-endotelial/epitelial (TER) 32 IX.12. Medición de la producción de ROS mitocondrial y del ión superóxido in vitro 33 IX.13. Detección de los niveles retinianos de ROS 33 IX.14. Análisis estadístico 34 X. Resultados 35 X.1. Las Vi previenen el incremento de la permeabilidad de la BHR inducido por la BK en la rata de manera similar a un antagonista del receptor B2 35 X.2. Las Vi bloquean la reducción de la resistencia eléctrica trans-endotelial de monocapas de MRMEC, MBMEC y BUVEC inducida por la BK 37 X.3. El efecto inhibitorio de las Vi sobre el decremento de la resistencia eléctrica y la redistribución de los filamentos de actina inducido por la BK implica al NO en células endoteliales 41 X.4. El efecto inhibitorio de las Vi sobre la reducción de la TER y la redistribución de la F-actina inducido por la BK en células endoteliales es independiente de la producción intracelular de ROS 43 X.5. La BK induce la reducción transitoria de la TER y la redistribución de los filamentos de actina en monocapa de células ARPE-19, efectos que además de involucrar al NO, son prevenidos por las Vi 46 X.6. El efecto inhibitorio de las Vi sobre la disminución de la TER y redistribución de los filamentos de actina inducido por la BK en células ARPE-19 involucra la reducción de los niveles citoplasmáticos de ROS 48 X.7. Las Vi reducen los niveles de ROS en la retina de ratas diabéticas 51 x XI. Discusión 54 XII. Consideraciones finales y conclusiones 58 XIII. Biblografía 62 1 I. Introducción Las vasoinhibinas (Vi) son una familia de péptidos formados a partir de la proteólisis de la hormona prolactina (PRL) por enzimas como la catepsina D, las metaloproteasas de matriz y la proteína morfogénica de hueso 1 (Clapp et al. 2006). La importancia fisiológica de las Vi radica en su capacidad anti-angiogénica, es decir, previenen la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes. Notablemente, sus efectos vasculares han sido estudiados en la retina, tejido donde se exhiben como reguladores endógenos de la angiogénesis (Aranda et al. 2005) y como inhibidores del incremento de la permeabilidad de los vasos sanguíneos de la retina asociado a la diabetes (Garcia et al. 2008). El transporte de solutos provenientes la circulación hacía la retina, y viceversa, es estrictamente regulado por la barrera hemato-retiniana (BHR). La BHR se divide en un componente interno conformado principalmente por el endotelio vascular y un componente externo conformado por el epitelio pigmentario retiniano (EPR) (Klaassen et al. 2013). Diversas condiciones incluyendo la retinopatía diabética se asocian con un incremento en la permeabilidad de la BHR (Gardner et al. 2002; Klaassen et al. 2013). En este sentido, la bradicinina (BK) péptido hipotensor perteneciente al sistema calicreína-cinina (SCC) (Leeb-Lundberg et al. 2005), se encuentra sobre producido en el vítreo de pacientes con retinopatía diabética y se asocia con el incremento de la permeabilidad de la BHR (Gao et al. 2007). De igual manera la inyección intravitreal de BK o de la enzima que la produce (precalicreína) induce un transporte excesivo a través de la BHR generando edema retiniano en ratas (Phipps et al. 2009; Clermont et al. 2011). Adicionalmente, antagonistas contra los receptores del SCC previenen el incremento de la permeabilidad vascular retiniana inducido por la diabetes en ratas (Abdouh et al. 2008). Al respecto, cabe mencionar que existen dos receptores pertenecientes al SCC, el receptor B2 expresado constitutivamente (Sainz et al. 2007) y el receptor B1 ausente en condiciones fisiológicas, salvo algunas excepciones, y que es rápidamente inducido en condiciones de inflamación (Marceau and Regoli 2004; Leeb-Lundberg et al. 2005). La BK se une preferencialmente al receptor B2 (Charest-Morin et al. 2014) cuya expresión ha sido reportada en la retina humana (Takeda et al. 1999). También existe evidencia de la presencia funcional del receptor B2 en células endoteliales de capilares de la retina (Abdouh et al. 2003), así como en el EPR de roedores (Ma et al. 1996; Lim 2 et al. 2008; Lim et al. 2009). Por otro lado, la estimulación del receptor B2 promueve el incremento de la permeabilidad de la barrera hemato-encefálica (Revest et al. 1991; Doctrow et al. 1994; Easton and Abbott 2002; Raslan et al. 2010) a través de la producción de óxido nítrico (NO) (Cai et al. 2008) y de especies reactivas de oxígeno (ROS, del inglés Reactive Oxygen Species) (Easton and Abbott, 2002)(Enciu et al. 2013). Tanto el NO como las ROS promueven la redistribución de las proteínas de uniones estrechas que en conjunto con las uniones adherentes y el citoesqueleto regulan la permeabilidad endotelial (De Bock et al. 2013). Asimismo, el NO y las ROS promueven el incremento de la permeabilidada través del EPR (Miura and Roider 2009; Qin and Rodrigues 2010; Kim et al. 2012; Rosales et al. 2014). Dada la contribución de la BK en el incremento de la permeabilidad de la BHR, resulta de interés identificar y caracterizar moléculas capaces de regular sus efectos. En particular, en el laboratorio se ha demostrado que las Vi antagonizan distintos efectos de la BK incluyendo la vasorelajación (Gonzalez et al. 2004), la producción de NO y la proliferación endotelial (Thebault 2011). En este proyecto se investigó si las Vi reducen el incremento de la permeabilidad de la BHR inducido por la BK a través de actuar directamente sobre el componente endotelial y epitelial de la misma. Además se determinó la contribución del NO y de las ROS en estos efectos. II. Barrera hemato-retiniana II.1. Retina y su aporte sanguíneo La retina es un tejido translucido formado por neuronas incluyendo fotorreceptores, neuronas secundarias (bipolares, amacrinas y horizontales) y ganglionares, así mismo, por las células gliales de Müller, astrocitos y microgliocitos (Klaassen et al. 2013). Dichas células y sus conexiones se organizan en diferentes capas como se detalla a continuación: 1) Capa limitante interna, límite físico entre el vítreo y la retina. 2) Capa de células ganglionares (CG) que corresponde a los núcleos de las neuronas ganglionares, cuyos axones forman el nervio óptico. 3) Capa plexiforme interna (CPI), formada por las conexiones entre las células ganglionares y neuronas secundarias. 4) Capa nuclear interna (CNI) que corresponde a los núcleos de las neuronas secundarias. 5) Capa plexiforme externa (CPE), representa las conexiones entre neuronas secundarias y los fotorreceptores. 6) Capa nuclear externa (CNE), 3 formada por los núcleos de los fotorreceptores. 7) Capa de los segmentos externos (SE) de los fotorreceptores. 8) Capa del epitelio pigmentario (EP) que está en contacto íntimo con la coroides (Klaassen et al. 2013) (Fig. 1B). La retina, tejido con una alta tasa metabólica, demanda una gran cantidad de oxígeno el cual es provisto por un doble sistema vascular que la flanquea (Ruskell 1997), (Hughes et al. 2000). Por un lado la arteria retiniana viaja junto con el nervio óptico, ingresa al globo ocular y se ramifica en cuatro ramas principales que se distribuyen a lo largo de la cara interna de la retina (Kur et al. 2012). Dichos vasos a su vez se ramifican y dan lugar a la microvasculatura retiniana que penetra a las capas internas de la retina para abastecer la red capilar organizada en cuatro niveles: dos en cada uno de los bordes de la CNI y otros dos en los límites de la capa de CG (Oystyer 1999; Kur et al. 2012) (Fig. 1A, B). El segundo sistema vascular que nutre a la retina es la coroides (Fig. 1A, B). La coroides, que no pertenece per se a la retina, deriva de las arterias ciliares y está formada por cuatro capas: 1) Haller, capa más externa formada por vasos de gran calibre. 2) Sattler, estroma de la coroides que contiene vasos sanguíneos de calibre medio. 3) Coriocapilares, formada por una capa sencilla de capilares fenestrados interconectados en un sistema de irrigación redundante. 4) Membrana de Bruch, lámina basal de los coriocapilares (Nickla and Wallman 2010; Baltmr et al. 2014). La coroides aporta oxígeno y nutrientes por difusión a la zona avascular de la retina que abarca aproximadamente dos tercios externos e incluye a los fotorreceptores (Kur et al. 2012). Si bien la inervación simpática contrarresta cualquier incremento en el flujo sanguíneo de la coroides mediante vasoconstricción (Nickla and Wallman 2010), la regulación más estricta sobre el aporte sanguíneo a la retina, tanto de los coriocapilares como de la microvasculatura retiniana, se lleva a cabo por la BHR. Coroides Arteria retiniana A 4 Figura 1. Aporte sanguíneo de la retina. En A) se muestra el sistema vascular de la retina conformado por la arteria retiniana y la coroides. B) Corte transversal de retina humana teñida con hematoxilina/eosina donde se aprecia la distribución de las distintas capas que la conforman (CG, células ganglionares; CPI, capa plexiforme interna; CNI, capa nuclear interna; CPE, capa plexiforme externa; CNE, capa nuclear externa; SE, segmentos externos; EP, epitelio pigmentario). El panel C) corresponde a una tinción para vasos sanguíneos en un corte transversal de retina humana. II.2. Barrera hemato-retiniana interna y externa El concepto de barreras que compartementalizan distintos órganos fue introducido por primera vez por Paul Ehrlinch en 1885 y continuado por su discípulo Edwin Golman en 1913. Ellos observaron que al inyectar colorantes (anilina y azul de tripano) en la circulación sistémica, prácticamente todos los tejidos se coloreaban exceptuando el cerebro. Complementariamente, la inyección de azul de tripano en el líquido cerebroespinal que rodea al cerebro lo teñía por completo, pero no así al resto de los tejidos (Goncalves et al. 2013), demostrándose así por primera vez la existencia de la barrera hemato-encefálica. Décadas después se encontró que los capilares de la retina, al igual que los del cerebro, mostraban una resistencia extremadamente alta al paso de ciertas moléculas (Ashton and Cunha-Vaz 1965). Una de las moléculas utilizadas en estos experimentos fue la fluoresceína, se observó que al inyectarse sistémicamente no se incorporaba a la retina ni al vítreo. Sin embargo, cuando la fluoresceína se inyectó CG CNI EPCoriocapilar Capilar B C 5 dentro del vítreo, ésta se distribuyó en toda la retina (Cunha-Vaz and Maurice 1967). En este mismo trabajo se postuló que la fluoresceína depositada en el vítreo se transportaba a la retina a través de la microvasculatura, pero que además existía un transporte propio en la retina siendo el candidato el EPR (Cunha-Vaz and Maurice 1967). Estudios subsecuentes confirmaron la existencia de la BHR y establecieron un paralelo con la barrera hemato-encefálica ya que ambas contribuyen a la regulación de la concentración de iones y agua, la disponibilidad de aminoácidos, glucosa y limitan la exposición a factores circulantes como anticuerpos o células inmunes, entre otros (Antonetti et al. 1999). No obstante, la BHR a diferencia de la hemato-encefálica, se considera anatómicamente como una doble entidad que actúan conjuntamente, a saber la BHR interna y BHR externa. La BHR interna comprende a la capa de células endoteliales de la microvasculatura retiniana, los pericitos y las células gliales (astrocitos y células de Müller) que la recubren (Sagaties et al. 1987). La monocapa de células endoteliales conforma una barrera física que limita y regula el paso de solutos, esto gracias a las propiedades moleculares particulares generadas por el contacto con los pericitos y células gliales (Kim et al. 2006; Daneman et al. 2010). Al respecto, cultivos de células endoteliales de retina de bovino o de rata que son expuestas a astrocitos de cerebro o medio condicionado de células de Müller, incrementan su resistencia al paso de moléculas (Tout et al. 1993; Gardner et al. 1997; Abukawa et al. 2009). Adicionalmente los pericitos, células con propiedades contráctiles que regulan el flujo sanguíneo, se comunican directamente con las células endoteliales mediante uniones de hendidura o comúnmente llamadas uniones GAP favoreciendo la integridad de la barrera (Bandopadhyay et al. 2001; Kim et al. 2009). Por otro lado, la BHR externa que limita el paso de solutos provenientes de los coriocapilares, está formada por el EPR y la membrana de Bruch (Bunt-Milam et al. 1986). El EPR está formado por una monocapa de células unidas estrechamente mediante proteínas intercelulares. Dichas proteínas le confieren polaridad, es decir, separan a la membrana en membranaapical que está en contacto directo con los segmentos externos de los fotorreceptores y membrana basolateral en contacto con la membrana de Bruch. El transporte a través de este epitelio es bidireccional, por un lado transporta glucosa, oxígeno y otros nutrientes de la circulación a los fotorreceptores y por otro lado agua, electrolitos, entre otros, del espacio subretiniano a la coroides. También el EPR lleva a cabo otras funciones fundamentales que incluyen: 1) Absorción del exceso de luz y protección contra la fotoxidación. 2) Reisomerización del trans- 6 retinol en 11-cis-retinal, molécula clave en el ciclo visual. 3) Fagocitosis de los segmentos externos de los fotorreceptores. 4) Secreción de factores esenciales para la integridad de la retina, entre otros. II.3. Permeabilidad a través de la BHR El paso de solutos a través de las monocapas formadas por los endotelios y epitelios depende de dos sistemas de regulación que determinan la ruta paracelular y transcelular (Fig. 2). II.3.1. El transporte transcelular El transporte transcelular se refiere al paso de moléculas a través de las células. Esto incluye el paso libre a través de las membranas como lo hacen moléculas altamente lipofílicas, el paso de iones a través de canales y transportadores (por ejemplo bomba Na+/K+ ATPasa y sensible a ouabaina) y la transcitosis. La transcitosis involucra la endocitosis de macromoléculas (radio > 3 nm) que son acarreadas por medio de vesículas a través de la célula y exocitadas en el extremo opuesto (Predescu et al. 2007). Ésta se lleva a cabo por vesículas individuales que viajan fluidamente (fase fluida) a través de la célula o por vesículas interconectadas que forman una estructura de tipo canal (canal transendotelial) (Kohn et al. 1992; Dvorak et al. 1996) (Fig. 2B). Asimismo, el transporte a través de vesículas puede ser mediado por receptores, tal es el caso de la insulina (King and Johnson 1985; Bendayan and Rasio 1996) y de la albúmina al unirse a su receptor gp60 (glicoproteína de 60 kDa) (Schnitzer 1992) (Fig. 2B). ParacelularTranscelularLumen A 7 ParacelularTranscelular Albumina Receptor Acuaporina Agua Glucosa Urea Moléculas < 3 nm radio Moléculas > 3 nm radio Canal Transendotelial Fase fluida Mediación por receptor Agua Lumen Figura 2. Transporte transcelular y paracelular. A) Micrografía electrónica de células endoteliales cardiacas organizadas en monocapa donde se puede observar las vesículas que permiten el transporte transcelular así como el espacio intercelular a través del cual ocurre el transporte paracelular. B) Esquema representativo de la vía transcelular y paracelular. La endocitosis y exocitosis de las vesículas son regulados por caveolas que son estructuras definidas como microdominios de balsas lipídicas que forman invaginaciones en la membrana plásmica (Simons and Ikonen 1997). Interesantemente, el endotelio del cerebro y de la retina se caracterizan por un número bajo de caveolas, las cuales están distribuidas preferencialmente en el lado basal, es decir, la tasa de transporte de macromoléculas provenientes de la circulación por la vía transcelular es baja. II.3.2. El transporte paracelular El transporte paracelular ocurre a través del espacio intercelular formado entre las células endoteliales/epiteliales adyacentes y permite el paso de solutos con un radio < 3 nm (Pappenheimer et al. 1951) (Fig. 2). El transporte paracelular se regula mediante uniones intercelulares las cuales son complejos proteicos que están conformados por uniones de tipo GAP, uniones adherentes y uniones estrechas, éstas últimas siendo B 8 consideradas como la unidad molecular fundamental de la BHR. En el endotelio de la microvasculatura retiniana se observa una alta resistencia al transporte paracelular, de igual manera en el EPR donde la resistencia al transporte paracelular es diez veces más alta que la resistencia al transporte transcelular (Miller and Steinberg 1977). Debido a lo anterior, describimos en mayor detalle la regulación de la vía paracelular y en particular a las uniones estrechas. II.3.2.1. Uniones de tipo GAP Las uniones GAP son hemi-canales (o conexones) alineados entre células adyacentes que hacen contacto y favorecen el paso libre de pequeñas moléculas (< 1 kDa) de una célula a otra (Madara 1998). En la BHR interna, las uniones GAP se encuentran principalmente comunicando a los astrocitos pero también se pueden encontrar en la configuración célula endotelial-pericito y célula endotelial-célula endotelial (Klaassen et al. 2013; Gaete et al. 2014). Su papel en la BHR ha sido poco estudiado pero se sugiere que contribuyen a la expresión y correcta configuración de las proteínas de las uniones estrechas (Claude 1978; Madara 1998; Klaassen et al. 2013). II.3.2.2 Uniones adherentes Las uniones adherentes se distribuyen ubicuamente en la membrana plasmática de los endotelios y epitelios limitando el paso de macromoléculas con un radio mayor de 3 nm o ~60 kDa, por ejemplo la albúmina (3.6 nm de radio, 69 kDa). La VE- cadherina se considera como la principal proteína que constituye a las uniones adherentes. Esta proteína es un receptor transmembranal cuyo domino extracelular se une al dominio extracelular de otras VE-cadherinas en las células adyacentes, formando un enlace homotípico (Rudini and Dejana 2008). La VE-cadherina interactúa intracelularmente con numerosas moléculas incluyendo proteínas del citoesqueleto, en particular con los filamentos de actina a través de las cateninas β, γ, α y p120 (Mehta and Malik 2006). Otra función importante de la VE-cadherina es regular la expresión de proteínas presentes en las uniones estrechas (Taddei et al. 2008) las cuales se considera proveen la característica de barrera en el organismo. 9 II.4. Uniones estrechas Las uniones estrechas son la unidad molecular fundamental de la BHR ya que restringen el paso de moléculas pequeñas (hasta de 1 kDa) incluyendo pequeños iones como el sodio (Yuan and Rigor 2010). En las células epiteliales, las uniones estrechas se concentran en los límites apicales de la membrana plasmática confiriendo así la polaridad característica de los epitelios. Mientras que en las células endoteliales, las uniones estrechas se distribuyen homogéneamente a lo largo del espacio intercelular y se intercalan con las uniones adherentes (Klaassen et al. 2013). Las uniones estrechas están compuestas por múltiples proteínas incluyendo proteínas transmembranales que forman puentes en el espacio intercelular, proteínas de andamiaje y de señalización. Las proteínas transmembranales presentes en las uniones estrechas son las ocludinas, claudinas y JAMs (del inglés “junctional adhesion molecules”). A continuación se exponen brevemente algunos aspectos de éstas proteínas. Las ocludinas son proteínas integrales de membrana que poseen cuatro dominios transmembranales y dos dominios extracelulares a partir de los cuales forman enlaces homotípico, es decir con las ocludinas de las células adyacentes. Las ocludinas se expresan en células endoteliales y epiteliales de manera ubicua, notablemente en tejidos con propiedad de barrera existe una mayor cantidad de ocludinas (Hirase et al., 1997; Kevil et al., 1998). Sin embargo, ratones en los que se abate la expresión de ocludinas mediante técnicas moleculares, presentan aún la formación de barreras (Saitou et al., 1998). Esto sugiere que la función de las ocludinas es compensada por otras proteínas. En ese sentido, el mismo año que se reportó este hallazgo se identificó por primera vez a las claudinas 1 y 2. Las claudinas (familia de 27 miembros) no poseen homología a nivel de su secuencia nucleotídica con las ocludinas pero poseen cuatro dominios extracelulares tipo ocludinay son capaces de polimerizar homo-típicamente con otras claudinas y hetero-típicamente con ocludinas (Furuse et al., 1998; Tsukita and Furuse., 1999), sugiriendo así un efecto compensatorio de las claudinas en ausencia de ocludinas. Se considera que tanto las ocludinas como las claudinas juegan un papel fundamental en la formación de la BHR (Klaassen et al. 2013). Por otro lado, las JAMs son una familia de moléculas tipo inmunoglobulinas de las cuales poco se conoce en el contexto de la BHR. Estructuralmente las ocludinas, claudinas y JAMs se asocian a las proteínas zona occludens (ZO) de la cuales existen tres isoformas (ZO-1, ZO-2 y ZO-3). La proteína 10 ZO-1 fue la primera proteína exclusivamente asociada a las proteínas de uniones estrechas (Stevenson et al., 1986). Posteriormente se describieron las isoformas ZO-2 y ZO-3 (Gumbiner et al., 1991; Haskins et al., 1998). La ZO-1 y ZO-2 anclan las ocludinas, las claudinas y las JAMs a la actina del citoesqueleto con ayuda de proteínas accesorias que incluyen a la cingulina y proteínas de entrecruzamientos como la espectrina, entre otras (Shen et al. 2009). Además de anclar dichas proteínas al citoesqueleto de actina, las proteínas ZO fungen como moléculas de señalización en el proceso de regulación de la permeabilidad. En parte, funcionan como proteínas de andamiaje en el reclutamiento de moléculas con dominios PDZ y SH3 (Nomme et al. 2011). Asimismo, las ZO pueden desanclarse del complejo de la uniones estrechas y participar como moléculas de señalización en otro procesos celulares incluyendo el inicio del ciclo celular (Gonzalez-Mariscal et al. 2009). El correcto ensamblaje del complejo proteína transmembranal-proteína de andamiaje-citoesqueleto determina el limitado transporte paracelular que se observa en la BHR. De manera general, diversos estímulos aumentan el transporte paracelular al promover la internalización de las proteínas transmembranales lo que por ende, incrementa el tamaño del espacio intercelular. Antes de exponer los mecanismos principales de regulación de las uniones estrechas se mencionará brevemente cómo es que se evalúa la permeabilidad de un epitelio/endotelio. Ésta se estima usualmente mediante el paso de trazadores a través de una monocapa de células en cultivo. El paso de estos trazadores hidrofílicos a través de los espacios intercelulares depende su tamaño, forma y carga. Éstos se adicionan en la parte superior de una cámara que es dividida por un filtro sobre el cual se coloca la monocopa de células a evaluar. La cantidad de trazador se mide en la cámara inferior por distintos métodos de detección que incluyen a reacciones enzimáticas, fluorescencia o radioactividad. Otro método ampliamente utilizado es la medición de la resistencia eléctrica trans-endotelial/epitelial (TER por sus siglas en inglés). La TER de una monocapa celular representa la suma de la resistencia paracelular (resistencia dada por las uniones y el espacio intercelular) y la resistencia transcelular (resistencia dada por las membranas en la porción apical y basolateral) (Claude 1978). En monocapas con una TER baja, la resistencia transcelular es varios ordenes de magnitud mayor que la resistencia paracelular; Dado que las dos vías se acoplan en paralelo (1/TER = (1/R transcelular) + (1/R paracelular)) cambios en la TER asociados con una condición particular deberían corresponder a cambios en la resistencia paracelular (Claude 1978; 11 Matter and Balda 2003). Sin embargo, es importante considerar que cambios en el transporte iónico por canales y transportadores membranales también regulan la TER (Madara 1998; Matter and Balda 2003). Ambas técnicas han sido de gran ayuda para elucidar algunos de los mecanismos de regulación de las uniones estrechas y por ende, de la permeabilidad paracelular. II.4.1. Regulación de las uniones estrechas por fosforilación/desfosforilación El ensamblaje, mantenimiento y desensamble de las uniones estrechas depende de su estado de fosforilación, el cual es regulado por numerosas vías de señalización que activan cinasas y fosfatasas (Phipps and Feener 2008; Wang et al. 2014). Utilizando una amplia batería de fármacos y técnicas moleculares se ha logrado identificar las vías más relevantes, como es el caso de la vía de la guanosina trifosfatasa (GTPasa) pequeña Rho-A y su blanco la cinasa ROCK. Ésta cinasa promueve la fosforilación de las proteínas de las uniones estrechas incluyendo las ocludinas y claudinas en residuos de serina y treonina, induciendo su internalización y disminución de la TER (Pun et al. 2009). Además, ROCK fosforila directamente a las cadenas ligeras de miosina promoviendo la redistribución y la formación de fibras de estrés de actina, tal como ocurre en el EPR tras el tratamiento con trombina (Lee et al. 2004). Por otro lado, se encuentra la familia de la proteína cinasa C (PKC, por su abreviación en inglés) que consta de alrededor 12 isoformas, las cuales requieren de Ca2+ y/o diacilglicerol (DAG) para su activación, con algunas excepciones (tres isoformas atípicas). Una vez que se activa la PKC fosforila residuos de serina y treonina de múltiples proteínas incluyendo proteínas de uniones estrechas (ocludinas, claudinas y ZO-1). Por ejemplo, la PKC-δ y PCK-λ se han relacionado al desensamble de la uniones estrechas y disminución de la TER inducido por un agente oxidante (peróxido de hidrogeno, H2O2) (Frey and Antonetti 2011). La vía de las MAP cinasas (MAPK, del inglés Mitogen-Activated Protein Kinases), al igual que las anteriores, promueve la fosforilación y regulan la expresión de las ocludinas, claudinas, ZO-1 y ZO-2. Adicionalmente, las MAPK activan a la cinasa de cadenas ligeras de miosina (MLCK) la cual ha sido ampliamente descrita como reguladora directa del citoesqueleto y de la TER (Cunningham and Turner 2012). Consistente con esto, el incremento en la expresión solo del dominio catalítico de la MLCK en células epiteliales de intestino, incrementa la fosforilación de las cadenas 12 ligeras de miosina lo que promueve una reorganización de las proteínas de uniones estrechas (ocludinas y ZO-1) (Shen et al. 2006). La fosforilación en residuos de serina y treonina es reversible gracias a la acción de distintas fosfatasas incluyendo a la proteína fosfatasa (PP)-2A, PP2B y PP1, las cuales per se regulan el ensamble de las uniones estrechas (Nakanishi-Ueda et al. 2013). Adicionalmente, las proteínas de uniones estrechas pueden ser fosforiladas en residuos de tirosina a través de la familia de la cinasa de tirosina Src regulando su ensamblaje y desensamble (Paris et al. 2008) y por la proteína cinasa G (PKG). Esta cinasa es activada por el guanosín monofosfato cíclico (GMPc), cuya formación depende de NO (Liu and Feener 2013). Dado que el NO se asocia con el metabolismo de las ROS y que ambas moléculas tienen un papel particular en la regulación de la permeabilidad epitelial y que están involucradas en la vía de señalización de la BK, se presentarán algunos aspectos relevantes sobre el rol del NO y de las ROS en la regulación de las uniones estrechas. II.4.2. Regulación de las uniones estrechas por el NO y las ROS Distintos factores hiper-permeabilizantes incluyendo al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y la BK inducen la formación de NO a través de la activación de la sintetasa endotelial de NO (eNOS, por sus siglas en inglés) (Fukumura et al. 2001; Kuhr et al. 2010). El NO estimula a la guanilil ciclasa soluble, la cual produce GMPc y la resultante activación de la PKG se asocia al aumento en la permeabilidad de la barrera hemato-encefálica y de la BHR por el mecanismo de fosforilación anteriormente descrito (Fukumura et al. 2001; Kaur et al. 2008; Gaete et al. 2014). Adicionalmente, el NO al unirse directamente al grupo tiol de las cisteínas(R- SH) por nitrosilación, promueve la internalización de proteínas de uniones estrechas simulando una señal de foforilación (Rosales et al. 2014). En particular, en el EPR concentraciones altas de glucosa activan la producción de NO. Éste nitrosila a la caveolina-1 e incrementa su interacción con claudinas y ocludinas derivando en el incremento de la permeabilidad. De manera similar a la nitrosilación existe la nitración que consiste en la unión del NO a residuos de tirosina (Clements et al. 2003). En relación con las proteínas de uniones estrechas, se ha reportado la nitración de ocludinas en los túbulos proximales del riñón lo que promueve un desensamble de las mismas y alteraciones en el citoesqueleto (Clements et al. 2003; Bajou et al. 2014). En ese 13 contexto, es relevante señalar que la nitración de proteínas se asocia íntimamente al estrés oxidativo, condición en que existe un aumento en los niveles de ROS debido a su sobre producción y/o una baja de las defensas antioxidantes. Las fuentes endógenas principales de las ROS son la cadena respiratoria mitocondrial, las enzimas NADPH oxidasa y la xantina oxidasa (Maron and Michel 2012). Por otro lado, en condiciones de disfunción vascular la eNOS también produce ROS. Esto debido a que su a activación requiere del cofactor nicotina adenina dinucleótido (NADPH), el cual lleva a cabo la oxidación de electrones necesaria para la producción de NO (Thorin et al. 1998; Hayashi et al. 2006). La sobre activación de eNOS aunado a bajos niveles de NADPH, genera la acumulación de electrones libres que finalmente forman el ión superóxido (Kalinowski and Malinski 2004). El superóxido a su vez puede reaccionar con el NO y formar peroxinitrito o formar H2O2, siendo éstas tres moléculas (ión superóxido, peroxinitrito y H2O2) de las principales ROS (Radi 2004). Es ampliamente reconocido que las ROS regulan las uniones estrechas (Pun et al. 2009). Por ejemplo, el peroxinitrito disminuye la expresión de claudina-5 en células endoteliales de cerebro (Haorah et al. 2005). Asimismo, niveles elevados de ROS modifican al citoesqueleto y promueven la re-distribución de claudina-5 y ocludina al activar la vía de RhoA en células endoteliales (Schreibelt et al. 2007). También las ROS promueven la re-distribución de ZO-1 y la consiguiente disminución de TER en células endoteliales de cerebro (Lee et al. 2004). El papel de las ROS modificando las uniones estrechas ha sido mayormente reportado en condiciones de estrés oxidativo. Éste ocurre en situaciones de disfunción endotelial provocada por diversas causas, siendo la hiperglucemia una de las principales. Durante la diabetes, existe una formación excesiva de ROS a través de distintas vías, las cuales afectan directamente a las uniones estrechas pero también inducen la expresión de factores que las desestabilizan incluyendo las citocinas pro- inflamatorias y al VEGF (Frey and Antonetti 2011). En efecto, el bloqueo del VEGF a través del uso de anticuerpos revierte el incremento de la permeabilidad de la BHR asociado a la diabetes (Wang et al. 2009). Así mismo, se ha demostrado que el bloqueo de la BK revierte el incremento de la permeabilidad de la BHR asociado a la diabetes (Abdouh et al. 2003). Esa observación en conjunto con otras detalladas a continuación llevó a plantear la contribución del SCC en la regulación de BHR. 14 III. Sistema calicreína-cinina A continuación se presenta un relato histórico acerca del descubrimiento del SCC, seguido por una descripción de sus receptores, su regulación y finalmente su papel en la regulación de la BHR. A principios de los 90´s Frey, Kraut, y Werle reportaron una sustancia hipotensora presente en la orina, posteriormente la encontraron en altas concentraciones en el páncreas y la nombraron calicreína, derivación de kallikréas que en griego significa páncreas (Bhoola et al. 1992). Años más tarde, Werle encontró que el responsable del efecto hipotensor de la calicreína era un péptido que se producía cuando ésta estaba en contacto con el plasma sanguíneo y lo llamó calidina (Bhoola et al. 1992). Por otro lado, Rocha e Silva y colaboradores encontraron que la tripsina y proteasas presentes en el veneno de serpiente (Bothrops jararaca) producen una sustancia similar a la calidina capaz de disminuir la presión arterial e inducir la contractibilidad del estómago, a esta sustancia se le llamó BK. La calidina (Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-PheSer- Pro-Phe-Arg) difiere de la BK solo por un residuo de lisina extra en el extremo N- terminal. Por otro lado, la arginina en el extremo C-terminal de ambos péptidos puede ser removida por acción de las carboxipeptidasas N y M generando des-Arg9-calidina y des-Arg9-BK (Marceau and Regoli 2004). Estos cuatro péptidos conocidos como cininas son los efectores del SCC siendo la BK la más ampliamente estudiada. La BK se genera a partir del cininógeno de alto peso molecular (120 kDa), proteína secretada por el hígado, la cual posee seis dominios siendo el sexto un sitio de unión para el zimógeno pre-calicreína y para al factor de coagulación XII (Tait and Fujikawa 1987). El dominio 5 posee una región enriquecida en histidinas que propicia su unión a superficies con cargas negativas lo que dispara la activación del SCC (en plasma), capacidad por la que también se le conoce como sistema de contacto. La activación del factor de coagulación XII promueve el corte de la pre-calicreína en calicreína plasmática. Esta proteasa de serina a su vez corta el dominio 4 del cininógeno de alto peso molecular liberando así a la BK. El gen que codifica para el cininógeno de alto peso molecular (KNG1) es susceptible a procesamiento alternativo dando lugar al cininógeno de bajo peso molecular (60 kDa) (Muller-Esterl et al. 1982). Adicionalmente a la diferencia en el peso molecular, el cininógeno de bajo peso molecular carece del dominio 5 (unión a cargas negativas) y del dominio 6 (unión a pre-calicreína). La enzima encargada de su procesamiento es la calicreína tisular, cuya actividad da lugar a 15 la liberación de calidina (Muller-Esterl et al. 1982). La calicreína tisular se expresa en múltiples tejidos en el organismo incluyendo al páncreas, vasos sanguíneos, riñones, sistema nervioso central, intestino delgado, glándula adrenal, glándula salival, bazo, epidermis, retina, entre otros, a diferencia de la calicreína plasmática que se expresa solo en el hígado (Bhoola et al. 1992). La amplia distribución de las calicreínas correlata con la distribución ubica de los receptores del SCC. III.1. Receptores del sistema calicreína-cinina El SCC lleva a cabo sus efectos a través de dos receptores acopados a proteínas G conocidos como receptores B1 (35 kDa) y B2 (40 kDa). La BK y la calidina son los ligandos naturales del receptor B2, mientras que sus metabolitos des-Arg9-BK y des- Arg9-calidina son los ligandos naturales del receptor B1 (Leeb-Lundberg et al. 2005). El receptor B1 fue el primero en haber sido caracterizado farmacológicamente, de ahí la nomenclatura. Sin embargo, el receptor B2 parece haber aparecido primero evolutivamente esto debido a que los peces poseen solo un receptor a cininas, el cual presenta mayor homología a nivel proteico con el receptor B2 (35 %) que con el receptor B1 (30%) (Sugita et al. 1998; Leeb-Lundberg et al. 2005). Los genes que codifican para estos receptores se encuentran en el cromosoma 14 (14q32.1 – q32.2) separados por tan solo 20 kb. El gen que codifica para el receptor B1 posee varios sitios responsivos a factores de transcripción como AP-1, NF-kB y PEA-3, brindándole su característica inducible. El gen para del receptor B2 posee sitios de unión para factores de transcripción como CREB, p53, STAT-3, entre otros (Baptista et al. 2002). Sin embargo, su regulación depende principalmente de su disponibilidaden la membrana plasmática. El receptor B2 se expresa de manera constitutiva en numerosas células incluyendo endoteliales, de músculo liso, mesangiales, neuronas, astrocitos, adipocitos, hepatocitos, neutrófilos, entre otros. Mientras que el receptor B1 está ausente en condiciones fisiológicas pero es rápidamente inducido en condiciones de inflamación y estrés oxidativo (Leeb-Lundberg et al. 2005; Phagoo et al. 2005; Abdouh et al. 2008). Cabe precisar que se ha demostrado la expresión constitutiva del receptor B1 en algunos tejidos incluyendo médula espinal y tejido adiposo (Pesquero et al. 2000; Mori et al. 2012). La estimulación del receptor B2 se asocia a la activación de la fosfolipasa A2 que libera ácido araquidónico de la membrana plasmática que a su vez genera la 16 formación prostaglandinas a partir de la enzima ciclooxigenasa 2. Asimismo, activa la vía de las cinasas MAPK/ERK (del inglés extracellular signal-regulated kinases). Al ser un receptor acoplado a proteína G del tipo q su estimulación activa a la fosfolipasa C produciendo DAG e inositol trifosfato. Ambos promueven el incremento de los niveles de Ca2+ libre citosólico necesarios para la activación de la eNOS (Cockcroft et al. 1994). La estimulación del receptor B1 deriva en la activación de las mismas vías de señalización relacionadas al receptor B2, complementariamente se ha reportado la expresión de la sintetasa inducible de NO (iNOS) (Zhang et al. 2007). La inducción de iNOS y el incremento sostenido en los niveles de Ca2+ libre citosólico que conllevan la estimulación del receptor B1, ayudan a explicar los mayores niveles de producción de NO en comparación con los alcanzados por la estimulación del receptor B2 (Kuhr et al. 2010). III.2. Regulación del sistema calicreína-cinina La regulación del SCC ocurre a tres niveles: 1) la actividad de las calicreínas, 2) la degradación de las cininas y 3) la disponibilidad de sus receptores. La actividad de las calicreínas depende de la acción de inhibidores de proteasas endógenos, siendo la aprotinina y calistatina los reguladores de la calicreína tisular (Chao et al. 2001). El principal regulador de la calicreína plasmática es el inhibidor de proteasa C1 (C1INH). Una actividad deficiente de C1INH genera una sobreproducción de BK como se observa en el angioedema hederitario (Cugno et al. 1993; Sardana and Craig 2011). Una vez producidas, las cininas son degradadas rápidamente. Por ejemplo, el tiempo de vida media de la BK es alrededor de 30 segundos (Nussberger et al. 1999). La principal enzima que degrada a la BK es la cininasa II (Jaspard et al. 1993) conocida también como enzima convertidora de angiotensina (ECA) ya que convierte a la angiotensina I en angiotensina II (potente agente hipertensor). Numerosos fármacos utilizados en el tratamiento de la hipertensión tienen como blanco la inhibición de la ECA ya que por un lado disminuyen los niveles de la angiotensina II y por otro lado evitan la degradación de la BK generando hipotensión (Linz and Scholkens 1992; Phagoo et al. 2005). Finalmente, la acción de las cininas depende de la disponibilidad de sus receptores. En el caso del receptor B2, su estimulación se acompaña de una rápida 17 desensibilización por internalización mediada por la fosforilación del extremo C- terminal (Blaukat et al. 1996). Por otro lado, la mayoría de las evidencias experimentales apuntan a que la regulación de receptor B1 ocurre a nivel transcripcional. Distintas citocinas proinflamatorias como la interleucina 1β, el factor de necrosis tumoral α, entre otros, activan vías de señalización incluyendo la MAPK/p38. Esto deriva en la translocación nuclear de factores de transcripción como NF-κB iniciando la síntesis del ARNm del recepetor B1 (Nakano et al. 1996; Phagoo et al. 2005). A nivel post-traduccional se sabe poco sobre su regulación. Esto incluye que a diferencia del receptor B2, el receptor B1 es resistente a la desensibilización por internalización debido a que carece de sitios de fosforilación en el extremo C-terminal (Marceau and Regoli 2004). Esta condición se asocia a la peculiaridad de poseer actividad independiente de ligando (Leeb-Lundberg et al. 2001), característica que le brinda funciones diferentes a las relacionadas al receptor B2 como se muestra a continuación. III.3. Funciones del sistema calicreína-cinina La primera función fisiológica relacionada al SCC fue la inducción de hipotensión, esto se demostró utilizando extractos pancreáticos los cuales son ricos en calicreína (Bhoola et al. 1992). Los estudios ulteriores se realizaron mediante la evaluación del efecto de las cininas purificadas y de antagonistas farmacológicos de sus receptores. Asimismo, en los últimos años, distintas técnicas de biología molecular han sido de gran ayuda elucidando la relevancia fisiología de este sistema. En este sentido la el incremento en la expresión del receptor B2 en un ratón transgénico genera hipotensión e hipersensibilidad a la BK exógena (Pun et al. 2009). El ratón knock-out para el receptor B2 es normotenso, sin embrago, cuando este ratón es sometido a una dieta alta en sodio, presenta una forma de hipertensión maligna (Alfie et al. 1997). Esto sugirió que los efectos del SCC sobre la presión arterial involucran también la absorción de sales a nivel renal. Estudios posteriores han corroborado los efectos nefroprotectores del SCC (Zhang et al. 2004). Elliott y colaboradores demostraron que la aplicación tópica de BK en humanos y en tejidos aislados de animales produce efectos locales incluyendo enrojecimiento, incremento de la temperatura, edema y dolor, eventos característicos de la inflamación (Elliott et al. 1960). El papel del SCC en la inflamación queda claramente expuesto en los casos de angioedema hederitario. Esta enfermedad se 18 caracteriza por la aparición repentina y recurrente de edemas en la piel, en orofaringe y la mucosa gastrointestinal, esto debido a una actividad disminuida del inhibidor de la calicreína C1INHH (Sardana and Craig 2011). Ese hecho se corrobora en el ratón deficiente para el inhibidor C1INHH ya que presenta un incremento en la permeabilidad vascular en distintos órganos que se restablece tras la administración de un antagonista farmacológico o la ablación genética del receptor B2 (Han et al. 2002). Con respecto al receptor B1, se ha demostrado un aumento en sus niveles de expresión en ratones a los que se les inyecta sistémicamente lipopolisacarido (LPS) bacteriano, los cuales presentan un cuadro de sepsis. Interesantemente, cuando el ratón knock-out para B1 es inyectado con LPS, los síntomas de sepsis como la hipotensión, infiltración de leucocitos, entre otros, no se presentan (Pesquero et al. 2000). Este ratón knock-out para B1 también presenta hipoalgesia en pruebas de nocicepción química y térmica (Pesquero et al. 2000). Este hallazgo aunado al hecho de que el receptor B1 se expresa de manera constitutiva en la espina dorsal, señala su contribución fisiológica en la nocicepción (Talbot et al. 2009). Por otro lado, como se mencionó anteriormente, el receptor B1 se expresa de manera basal en el tejido adiposo modulando la acción de la insulina y sugiriendo así que el SCC tiene acciones metabólicas (Mori et al. 2012). Otra función del SCC que es de nuestro interés es la regulación de flujo sanguíneo a nivel ocular, es por ello que en la siguiente sección es detallada. III.4. El sistema calicreína-cinina y el ojo En 1985 se sugirió por primera vez la contribución del SCC en la regulación del flujo sanguíneo del ojo (Igic 1985), pero no fue sino hasta 1996 que su presencia el ojo humano fue evaluada. Utilizando la técnica de hibridación in situ, se localizó la expresión de la calicreína tisular y del cininogeno de bajo peso molecular en los cuerpos ciliares, en la coroidesy en la retina (Ma et al. 1996). Recientemente, se corroboró mediante otras técnicas (PCR, inmunodetección) la presencia de la calicreína tisular y del cininógeno de bajo peso molecular en los cuerpos ciliares y en la red trabecular (responsable de drenar el humor acuoso) (Webb et al. 2009). Si bien la expresión de la calicreína plásmatica y el cininógeno de alto peso molecular en tejidos oculares no ha sido reportada, se ha detectado a nivel proteico en la retina de la rata (Phipps et al. 2009). Por otro lado, como ya se había mencionado anteriormente, el análisis proteico 19 del vítreo humano muestra la presencia de todos los componentes del SCC (Pinna et al. 2004; Gao et al. 2007; Gao et al. 2008). La expresión de los receptores B1 y B2 se demostró por primera vez en los cuerpos ciliares, coroides y retina de ojos humanos mediante hibridación in situ (Ma et al. 1996). Posteriormente, se detectó el receptor B1 en extractos totales de retina de rata (Abdouh et al. 2008; Pouliot et al. 2011) y en cultivos de EPR (Lim et al. 2009) mediante Western-blot y PCR. Sin embargo, su localización a lo largo de las distintas capas de la retina no es clara al día de hoy. En cuanto al receptor B2, se ha reportado en todas las capas de la retina (Yasuyoshi et al. 2000) así como en cultivos primarios de células del EPR (Lim et al. 2009) y de la red trabecular (Webb et al. 2006; Sharif et al. 2014). Los efectos vasculares conocidos del SCC aunados a la presencia de ambos receptores en la retina incluyendo al EPR y en capas que contienen microvasculatura (para el caso el receptor B2), sugieren una contribución del SCC en la regulación de la BHR. III.4.1. El sistema calicreína-cinina en la regulación de la BHR La primera evidencia sobre la capacidad del SCC en regular la BHR se obtuvo por Elliott y colaboradores. Ellos demostraron que la inyección sistémica del análogo de la BK RMP-7 incrementaba el transporte del ganciclovir radiomarcado a la retina (Elliott et al. 1995; Elliot et al. 1997). Posteriormente, se demostró que la inyección intravitreal de precalicreína o BK en ratas sanas resulta en un aumento en la permeabilidad de la BHR y en edema retiniano (Phipps et al. 2009; Clermont et al. 2011). En contraste, la administración intravitreal o sistémica de des-Arg9-BK (ligando del receptor B1) no modifica al trasporte basal de la BHR (Abdouh et al. 2008). Más recientemente, se obtuvieron evidencias de la participación del SCC en el incremento en la permeabilidad de la BHR asociado con la diabetes. En el 2007, en el vítreo de pacientes con retinopatía diabética se encontró un incremento en los niveles de la enzima anhidrasa carbónica-1, un novedoso activador del SCC (Gao et al. 2007; Gao et al. 2008). La inyección intravitreal de dicha enzima en ratas promueve la alcalinización del vítreo activando al SCC e incrementa la permeabilidad de la BHR. Este efecto es bloqueado con un antagonista del receptor B2 (Gao et al. 2007). Además, el incremento en la permeabilidad de la BHR que se observa en ratas diabéticas es revertido por el tratamiento sistémico (R-715) (Lawson et al. 20 2005) o tópico (LF22-054) (Pouliot et al. 2011) con antagonistas farmacológicos del receptor B1. Consistentemente, la inyección intravitreal de des-Arg9-BK (ligando del receptor B1) exacerba el elevado transporte a través de la BHR en ratas diabéticas (Clermont et al. 2011), no así cuando se administra en ratas sanas. Esto es debido a que el estrés oxidativo retiniano en respuesta a la diabetes induce la expresión del receptor B1 en la retina (Abdouh et al. 2008; Pouliot et al. 2011). Por lo anterior, queda claro que el SCC es capaz de promover la apertura de la BHR. Sin embargo, las células y los mecanismos involucrados quedan por identificar. El efecto del SCC promoviendo la apertura de la barrera-hemato encefálica ha sido más ampliamente estudiado. La administración sistémica de BK, de su análogo RPM-7 o de des-Arg9-BK causa la apertura de la BHR (Borlongan and Emerich 2003; Cote et al. 2010; Liu et al. 2010). En células endoteliales de la microvasculatura de cerebro, la BK induce la disminución de la TER y el aumento de la permeabilidad de macromoléculas (peroxidasa de rábano). Este efecto se debe a la movilización de Ca2+ intracelular (Easton and Abbott 2002) y la activación de la vía de las pequeñas GTPasas RhoA/ROCK (Ma et al. 2012), lo que deriva en la internalización de ocludinas y claudina-5 y la subsecuente formación de fibras de estrés de actina (Ma et al. 2012; Zhou et al. 2014). Además, se ha demostrado que el NO participa en el efecto de la BK abriendo la barrera hemato-encefálica ya que un donador de NO abre la barrera hemato- encefálica de manera similar a la BK (Sugita et al. 1998), efecto que es prevenido por el inhibidor de la síntesis de NO L-NAME (Nakano et al. 1996). Dada la similitud entre la barrera hemato-encefálica y la BHR es de suponer que el NO esté involucrado en la apertura de la BHR inducida por la BK. Hecho que es apoyado por las observaciones de que el NO contribuye en aproximadamente 90 % de los efectos de la BK (Kuhr et al. 2010). De manera llamativa, resultados del laboratorio han mostrado que la proliferación endotelial inducida por la BK es abolida totalmente por el L-NAME, pero también por las Vi. Esto sugiere que las Vi podrían regular los efectos de la BK sobre la BHR. IV. Vasoinhibinas Las Vi se generan por el corte proteolítico de la hormona PRL, de la hormona de crecimiento y del lactógeno placentario (Clapp et al. 2006; Clapp et al. 2008). Dado que sólo un estudio ha reportado las acciones de las Vi derivadas de la hormona de 21 crecimiento (Struman et al. 1999), la información sobre dichos péptidos proviene esencialmente de las derivadas de la PRL. La proteólisis de la PRL humana por la catepsina D produce Vi de 15 kDa, 16.8 kDa y 17.2 kDa (corte en los residuos 132, 147 y 150, respectivamente) (Piwnica et al. 2004). La proteína morfogénica de hueso tipo 1 genera Vi de 18 kDa (corte en el residuo 159) (Ge et al. 2007), mientras que las metaloproteasas de matriz (1, 2, 3, 8, 9 y 13) generan Vi de 17.6 kDa (corte en el residuo 155), que a su vez puede sufrir un segundo corte que da lugar a péptidos de 16 y 14 kDa (Fig. 3) (Macotela et al. 2006). Figura 3. Esquema representativo de la estructura tridimensional de la PRL humana y las Vi generadas por la catepsina D, metaloproteasas de matriz (MPM) y la proteína morfogénica de hueso 1 (PMH-1). IV.1. Distribución de las vasoinhibinas en el organismo Las Vi están presentes en distintas células incluyendo los fibroblastos de pulmón y células endoteliales, en fluidos corporales como el plasma sanguíneo, el líquido amniótico y en tejidos que incluyen la glándula pituitaria y varios componentes del ojo (Corbacho et al. 2000; Duenas et al. 2004). En particular, tanto la PRL como las Vi se han detectado en el humor acuoso, en el vítreo y la retina (Duenas et al. 2004; Rivera et 22 al. 2008). Ambas proteínas podrían venir de la circulación sistémica ya que se ha reportado que PRL marcada con iodo radioactivo se incorpora en la retina, coroides y cuerpo ciliares una vez que es administrada sistémicamente (O'Steen and Sundberg 1982). Sin embargo, la PRL y las Vi también pueden ser sintetizadas intraocularmente. El ARNm de la PRL se expresa en los fotorreceptores, células de Müller, células ganglionares y astrocitos de retinas de rata y de mono (Rivera et al. 2008). Asimismo, células endoteliales aisladas capilares de retina de rata sintetizan y secretan PRL (Ochoa et al. 2001). De manera notable, observaciones sin publicar de nuestro laboratorio señalan esta misma capacidad en la línea de células humanas de epitelio pigmentario ARPE-19. Finalmente, se ha descritola presencia de enzimas proteolíticas capaces de cortar a la PRL y así generar Vi en fluidos oculares y en la retina (Hayasaka 1983; Duenas et al. 2004; De Groef et al. 2014). IV.2. Efectos de las vasoinhibinas en la retina El efecto antiangiogénico de las Vi se ha demostrado en distintos modelos siendo el ojo uno de los más explorados (Pan et al. 2004; Aranda et al. 2005; Clapp et al. 2008). En 2005 en el laboratorio se demostró que la inyección intravitreal de anticuerpos que reconocen y neutralizan a las Vi promueve el crecimiento de vasos sanguíneos en la retina (Aranda et al. 2005). Asimismo, la vasculatura intra-retiniana sufrió una regresión al reducir la producción de Vi mediante pequeños ARN de interferencia dirigidos en contra de la PRL (Aranda et al. 2005). Con estos experimentos se demostró que las Vi contribuyen de manera fisiológica al mantenimiento de la muy baja densidad vascular de la retina. Esta característica permite a los fotones excitar a los fotorreceptores con una mínima interferencia a lo largo de su trayectoria y contribuir al procesamiento óptimo de la información luminosa. Distintas patologías retinianas se acompañan de una angiogénesis aberrante, tal es el caso de la retinopatía diabética y la retinopatía del prematuro. En pacientes con retinopatía del prematuro, se observa un incremento en los niveles de PRL circulantes así como en fluidos oculares (humor acuoso, fluido sub-retiniano), que participa en la regresión de los vasos sanguíneos (Duenas et al. 2004). Consistentemente, la expresión transgénica de Vi en la retina mediante adenovirus, inhibe la neovascularización inducida por isquemia (modelo de retinopatía del prematuro) al inducir apoptosis en el endotelio vascular (Pan et al. 2004). Por otro lado, el papel de las Vi en la retinopatía 23 diabética ha sido abordado intensamente en los últimos años en el laboratorio y se expone en los siguientes apartados. IV.3. Vasoinhibinas y la retinopatía diabética IV.3.1. Retinopatía diabética La retinopatía diabética es la principal causa de ceguera en adultos laboralmente activos. Su prevalencia es alrededor de 70 % en pacientes con diabetes tipo 1 y 40 % en pacientes con diabetes tipo 2 (Gariano and Gardner 2005; Mohamed et al. 2007; Porta et al. 2011). Se estima que prácticamente todos los pacientes diagnosticados con diabetes tipo 1 desarrollarán retinopatía después de 20 años (Porta et al. 2011). La desregulación metabólica que sufren los pacientes diabéticos promueve alteraciones en la vasculatura de la retina como es la formación de microaneurismas y exudados, incremento de la permeabilidad vascular y hemorragias (Crawford et al. 2009). Estas alteraciones contribuyen a la oclusión de los vasos sanguíneos, generando zonas de isquemia e hipoxia, condiciones que promueven la expresión de factores pro-angiogénicos (Duenas et al. 2004; Dhanabal and Sethuraman 2006; Wang et al. 2009). El incremento en los niveles de distintos factores pro-angiogénicos potencia el incremento de la permeabilidad vascular y en etapas avanzadas, promueve la formación de nuevos vasos sanguíneos que pueden sangrar dentro del vítreo y por ende, afectar la visión (Hammes 2005; Crawford et al. 2009). IV.3.2. Vasoinhibinas como reguladores de la hiper-permeabilidad en la retina Unas de las principales y más tempranas alteraciones en la retinopatía diabética es el incremento en la permeabilidad de la BHR (Do carmo et al. 1998; Fujii et al. 1998; Arnold et al. 2010). Esto condiciona el paso descontrolado por la vía paracelular de agua, proteínas, lípidos, células, etcétera, provenientes de la circulación hacia la retina. Un modelo para estudiar este fenómeno es a partir de ratas a las que se les induce diabetes de tipo 1 mediante la inyección de estreptozotocina (fármaco que destruye selectivamente las células beta-pancreáticas) (Szkudelski 2001). Estos animales presentan hiperglucemia crónica irreversible que resulta en el incremento de la permeabilidad vascular de la retina a partir del octavo día (Do carmo et al. 1998). En 24 este modelo se observó que la inyección intravitreal de Vi o de virus adenoasociados que las transducen en la retina, revierte totalmente el incremento de la permeabilidad (Garcia et al. 2008; Ramirez et al. 2011). De igual forma, ratas a las que se les inyectó intravitrealmente el vítreo proveniente de pacientes con retinopatía diabética, presentan un incremento de la permeabilidad vascular de la retinia (Gao et al. 2007). Interesantemente ese efecto es prevenido si el vítreo es co-inyectado con Vi (Garcia et al. 2008). El vítreo, además de proporcionar forma y soporte a la retina, es un depósito de factores anti-angiogénicos que limitan su vascularización (Walia et al. 2010; de Smet et al. 2013) e incluyen al factor derivado el epitelio pigmentario (PEDF), la somatostatina, trombospondina, entre otros. Interesantemente, el vítreo de pacientes con retinopatía diabética muestra una disminución en los niveles de dichos factores y un incremento en los niveles de factores pro-angiogénicos (Gao et al. 2008; Wang et al. 2009; Walia et al. 2010), siendo el VEGF uno de los más sobresalientes. Al respecto, la inyección intravitreal de VEGF en ratas sanas induce un incremento en la permeabilidad de la BHR de magnitud similar a la observada en las ratas diabéticas (Garcia et al. 2008). Notablemente, cuando el VEGF se co-inyecta con la Vi el efecto del VEGF se ve antagonizado (Garcia et al. 2008; Ramirez et al. 2011). El hecho de que las Vi prevengan el incremento de la permeabilidad inducido por la diabetes y el VEGF las perfila como moléculas con potencial terapéutico en la retinopatía diabética. Sin embargo, queda por elucidar los mecanismos finos por los cuales las Vi regulan el transporte de moléculas a la retina. IV.4. Vasoinhibinas y sus efectos moleculares Hace un poco más de dos decadas se demostró que las Vi ejercen sus efectos al unirse a un sitio de alta afinidad en la membrana plasmática que es distinto al receptor de la PRL (Clapp and Weiner 1992). Un estudio reciente demostró la capacidad de las Vi de interactuar con el receptor del activador del plasminógeno tipo uroquinasa, proyectándolo como su posible receptor (Bajou et al. 2014). Cabe precisar que ese estudio no descarta la posibilidad de que componentes adicionales, todavía no identificados, formen parte del receptor de Vi. En cuanto a las vías de señalización, se sabe que las Vi previenen la activación de las MAPK inhibiendo la proliferación endotelial inducida por VEGF (D'Angelo et al. 1995; D'Angelo et al. 1999; Lee et al. 25 2005; Garcia et al. 2008). Las Vi también modulan sus efectos sobre la proliferación endotelial de manera independiente a la activación por VEGF bloqueando las transiciones G0-G1 y G2-M del ciclo celular al interferir con las ciclinas D1 y B1, y al sobreactivar a los inhibidores p21 cip1 y p27 Kip1 (Tabruyn et al. 2005). Además, las Vi estimulan la apoptosis de las células endoteliales al promover la conversión de Bcl- XL a su forma proapoptótica Bcl-Xs (Martini et al. 2000) y al activar el factor nuclear Kappa β resultando en la activación de las caspasas 8, 9 y 13 (Tabruyn et al. 2003). Asimismo, las Vi inhiben al activador de plasminógeno de tipo urocinasa, proteasa requerida para la migración de células endoteliales (Han et al. 2002). Con respecto a los efectos de las Vi sobre los efectos vasculares de la BK, se sabe que las Vi previenen la vasodilatación en arterias de cobayos inducida por la BK (Gonzalez et al. 2004). Asimismo, las Vi inhiben la movilización de Ca2+ intracelular y la producción de NO inducida por la BK en células endoteliales (Gonzalez et al. 2004). Más recientemente, encontramos que las Vi bloquean la proliferación de células endoteliales a través de la vía delNO, esto debido a que las Vi inactivan a la eNOS a través de inhibir a la fosfolipasa C y de desfosforilar a la eNOS en la serina 1179 (Thebault 2011). Este último efecto podría ser al activar a la fosfolipasa 2A como se ha descrito anteriormente (Garcia et al. 2008). V. Planteamiento del problema Si bien se sabe que la BK contribuye al aumento en la permeabilidad de la BHR asociado con la diabetes, queda por evaluar si el EPR es blanco de ese peptido y si el NO y las ROS determinan su efecto, tanto en el compartimento vascular como epitelial de la BHR. Así mismo, se sabe que las Vi previenen el aumento en la permeabilidad de la BHR asociado con la diabetes pero se desconoce si su acción involucra la inhibición de la vía de la BK y tampoco si sabe si las Vi actúan sobre el EPR. Por lo anterior, en este trabajo pretendemos dilucidar las blancos celulares que subyacen el efecto inhibitorio de las Vi sobre el aumento de la permeabilidad a través de la BHR inducido por la BK, así como las bases moleculares de este efecto, las cuales podrían involucrar una disminución en los niveles de NO y de ROS. 26 VI. Hipótesis El efecto inhibitorio de las Vi sobre el incremento en la permeabilidad de la BHR inducido por la BK se lleva a cabo mediante una acción directa sobre el componente endotelial y epitelial de dicha barrera, y a la regulación a la baja de la producción de NO y ROS. VII. Objetivo general Evaluar si las Vi bloquean el efecto estimulatorio de la BK sobre la permeabilidad de la BHR y de monocapas de células endoteliales. Determinar si la BK promueve un incremento en la permeabilidad de monocapas de EPR y en caso de ser así, si las Vi inhiben ese efecto. Además de determinar si las Vi ejercen esos efectos a través de reducir la producción de NO y de ROS. VIII. Objetivos específicos 1. Determinar si las Vi inhiben el incremento de la permeabilidad de la BHR inducido por la inyección intravitreal de BK mediante el ensayo de azul de Evans en ratas sanas. En caso de ser así, evaluar si el efecto inhibitorio de las Vi se compara al de un antagonista del receptor B2. 2. Evaluar si el efecto inhibitorio de las Vi involucra la regulación de los niveles de expresión retiniana de los receptores del SCC. 3. Determinar si las Vi bloquean el efecto de la BK sobre la TER en monocapas de las células endoteliales de la microvasculatura retiniana, de cerebro y de la vena umbilical. 4. Demostrar que los efectos de la BK y de las Vi sobre la TER en monocapas endoteliales se acompañan de una redistribución de los filamentos de actina. 5. Explorar la contribución del NO y de las ROS en el efecto inhibitorio de las Vi sobre la disminución de la TER inducida por la BK en células endoteliales. 6. Elucidar si la BK reduce la TER y por ende, provoca la redistribución de los filamentos de actina en monocapas de células ARPE-19 y si las Vi previenen esos efectos. En caso de ser así, determinar la contribución del NO y de las ROS en el efecto inhibitorio de las Vi sobre la disminución de la TER inducida por la BK en células ARPE-19. 27 7. Investigar si la inyección intravitreal de Vi revierte el incremento de la producción de ROS en ratas inyectadas intraperitonealmente con estreptozotocina (modelo de diabetes tipo 1). 28 IX. Materiales y métodos IX.1 Reactivos Las Vi utilizadas en los ensayos in vivo corresponden al fragmento de 16 kDa. Para su producción, se realizó el corte proteolítico de la PRL de rata a partir de un extracto de glándula mamaria de dicha especie (Clapp 1987). Los fragmentos generados se purificaron por filtración en gel, se redujeron y se carbamidometilaron para evitar la formación de aglomerados de acuerdo al método descrito por Clapp y colaboradores (Clapp 1987). Para los ensayos in vitro, se utilizaron Vi recombinantes humanas (correspondientes a los fragmentos de 14 y 16 kDa) producidas por mutagénesis dirigida utilizando un baculovirus como sistema de expresión (Galfione et al. 2003). Otros reactivos incluyendo la BK, el inhibidor de las NOS (L-NAME, Nω-Nitro-L- arginina metil éster), el donador de NO DETANONOato (Z‐1‐[2‐(2‐aminoetil)-N-(2- amonio-etil)amino]diazen-1-ium-1,2-diolato), el antioxidante NAC (N-acetilcisteína), el iniciador de radicales libres Luperox (peróxido de tert-butilo), el fluoróforo dihidroetidio (DHE), el antagonista para el receptor B2 Hoe-140 y el colorante azul Evans fueron comprados a Sigma-Aldrich (St Louis, MO). La sonda JC-1 se obtuvo de Molecular Probes (Eugene, OR). Los anticuerpos se compraron a los siguientes proveedores: anti-receptor B2 monoclonal de BD Biosciences (610451 (Franklin Lake, NJ)), anti-receptor B1 monoclonal de Santa Cruz Biotechnology (sc-15048 (Santa Cruz, CA)), anti-β-tubulina policlonal de ZYMED (22833 (Eugene, OT)) y los anticuerpos secundarios acoplados a fosfatasa alcalina de Bio-Rad (Hercules, CA). IX.2. Declaración ética Los lineamientos sobre el cuidado y la experimentación de los animales utilizados en este proyecto fueron aprobados por el Comité de Bioética del Instituto de Neurobiología aceptado con el número 74 de la Universidad Nacional Autónoma de México. Esto, bajo los criterios dictados en la Norma Oficial Mexicana de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA) clave NOM-062-ZOO-1999. Asimismo, cumplen con lo establecido por las políticas sobre el uso de animales y humanos en la experimentación en neurociencias de la “Society for Neuroscience”. 29 IX.3. Animales Se utilizaron ratas macho Wistar (250-350 g) que fueron alimentadas ad libitum y mantenidas en un ciclo normal de luz/obscuridad (12 horas/12 horas). Un grupo de ratas fue tratado con L-NAME (1.8 mM) en el agua de beber por 15 días. Un grupo de ratas Sprague-Dawley (250-350 g) fueron inmunizadas con el complejo adyuvante de Freund (Adan et al. 2013). Para todos los procedimientos las ratas fueron anestesiadas con una mezcla Ketamina/Xilacina (7/3) a una dosis inicial de 1 µl/g y se realizaron subsecuentes aplicaciones en caso de que el procedimiento lo requiriera. IX.4. Inducción de diabetes Se indujo diabetes en las ratas Wistar mediante la inyección de estreptozotocina (60 mg/kg) vía intraperitoneal utilizando un amortiguador de citratos (10 mM, pH 3.5) como vehículo. La estreptozotocina destruye selectivamente las células beta pancreáticas generando hiperglucemia (Szkudelski 2001). Pasadas 48 horas de la inyección se determinó la glucemia mediante un glucómetro comercial a partir de una muestra de sangre obtenida de la cola. Aquellas ratas con un valor mayor a 250 mg/dl se utilizaron para los ensayos (Garcia et al. 2008). IX.5. Inyecciones intravitreales Las ratas Wistar fueron inyectadas intravitrealmente conforme a lo descrito previamente (Aranda et al. 2005), siendo el volumen final inyectado de 5 µl. Uno de los ojos fue inyectado con BK (60 pg, correspondiente a 1 nM teniendo en cuenta un volumen estimado de 60 µl para el vítreo (Guo et al. 2007)) y el ojo contra-lateral con BK combinada con Vi (1µg, 1 µM) o con el antagonista del receptor B2 Hoe-140 (235 ng, 3 µM). Los grupos controles consistieron en la inyección con vehículo (PBS) y el ojo contra-lateral con Vi (1 µM) o Hoe-140 (3 µM). IX.6. Cultivos celulares Los cultivos celulares incluyen al cultivo primario de células BUVEC, de células endoteliales de capilares de retina (MRCEC) y cerebro (MBCEC) de ratón y al 30 cultivo de la línea ARPE-19. El cultivo primario de células BUVEC fue obtenido conforme la descrito anteriormente (Cajero-Juarez et al. 2002). Las células fueron crecidas en medio de cultivo F12 K suplementado con 10 % de suero fetal bovino,
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