Estudio-sobre-la-produccion-e-identificacion-de-sustancias-prebioticas-en-el-pozol

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MÉXICO, D. F. 18 DE ABRIL DEL 2010 
 
 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
“ESTUDIO SOBRE LA PRODUCCIÓN E 
IDENTIFICACIÓN DE SUSTANCIAS 
PREBIOTICAS EN EL POZOL” 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
 
QUIMICA EN ALIMENTOS 
 
 
PRESENTA: 
 
PAOLA USCANGA CASTILLO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
JURADO ASIGNADO 
 
 
PRESIDENTE Profesor Amelia Farrés González Saravia 
 
VOCAL Profesor Maricarmen Quirasco Baruch 
 
SECRETARIO Profesor Agustín López Munguía 
 
1er SUPLENTE Profesor Martha Giles Gómez 
 
2º SUPLENTE Profesor María del Carmen Wacher Rodarte 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA Departamento de 
Microbiología y Biotecnología de Alimentos de la Facultad de 
Química; y Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis 
Enzimática del Instituto de Biotecnología, Cuernavaca, Morelos. 
 
 
ASESOR DEL TEMA________________________________ 
 
SUPERVISOR TÉCNICO_____________________________ 
 
SUSTENTANTE____________________________________ 
 
 
 
 
 
 
Dedico este trabajo a mis padres, por ser el mejor ejemplo a seguir. 
A mis hermanas, Ale y Adri, por su apoyo incondicional. 
A todos mis amigos, familiares y profesores que formaron parte de 
este proyecto. 
 
 
 
 
…a la Universidad Nacional Autónoma de México, mi Máxima Casa 
de Estudios. 
 
…a la Facultad de Química y al Instituto de Biotecnología. 
 
…al Dr. Agustín López-Munguía y a la Dra. Carmen Wacher Rodarte, 
por haberme concedido el gusto y el orgullo de realizar este trabajo 
bajo su asesoría. 
 
…a Fernando González, por compartirme sus conocimientos, apoyo 
y colaboración. 
 
…a todos los miembros revisores de esta tesis, por sus sugerencias. 
 
 
 
“Por mi Raza Hablará el Espíritu” 
Índice de Contenido 
 
 
1 Índice de Figuras y Tablas 
 
2 Resumen 
 
3 Introducción 1 
 
4 Generalidades 5 
4.1 Prebióticos 5 
 Oligosacáridos Prebióticos 8 
 Aspectos Estructurales de Oligasacáridos 9 
4.2 Fructanas 11 
 Inulina 13 
 Levana 14 
 Aplicaciones de Fructanas 15 
 Fructosiltransferasas (FTF) 16 
4.3 Glucanas 18 
 Dextrana 18 
 Glucosiltransferasas 20 
4.4 Diferencias y Similitudes entre FTFs y GTFs 22 
4.5 Alimentos Fermentados 24 
 Alimentos Fermentados como Fuente de Prebióticos 25 
 Alimentos Fermentados Tradicionales en México 28 
4.6 Pozol 29 
 Microbiología del Pozol 30 
 Leuconostoc citreum 32 
 
5 Justificación 35 
 
6 Objetivos 36 
 
7 Hipótesis 37 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8 Material y Métodos 38 
8.1 Muestreo 39 
8.2 Cuantificación de Sacarosa 40 
8.3 Determinación de la Actividad Glicosiltransferasa 41 
8.4 Caracterización enzimática 42 
8.5 Identificación por Hidrólisis Enzimática de Polímeros 44 
8.6 Fermentación de Masa Fresca 45 
 Determinación de pH 45 
 Determinación de Azúcares Reductores 45 
8.7 Identificación por CCF y HPLC de Polímeros Extraídos 46 
 Cromatografía en Capa Fina (CCF) 46 
 Cromatografía Líquida de alta Resolución (HPLC) 47 
 
9 Resultados y Discusión 48 
9.1 Cuantificación de Sacarosa 48 
9.2 Determinación de Actividad Glicosiltransferasa 50 
9.3 Caracterización Enzimática 52 
9.4 Identificación de Polímeros por Enzimas en el Pozol 56 
9.5 Elaboración de Pozol en el Laboratorio 63 
 Determinación de Azúcares Reductores 65 
9.6 Identificación de Polímeros Extraídos por CCF y HPLC 68 
 Cromatografía en Capa Fina (CCF) 69 
 Cromatografía Líquida de alto Presión (HPLC) 71 
9.7 Poder Reductor del Pozol de Ixtepec 75 
 
10 Conclusiones 77 
 
11 Perspectivas 78 
 
12 Referencias 79 
 
 
 
1. ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS 
 
 
TABLA 1. Oligosacáridos prebióticos de naturaleza glicosídica 
 
TABLA 2. Estructura primaria de los oligosacáridos de la leche 
materna 
 
TABLA 3. Contenido de inulina en algunas plantas comestibles 
 
TABLA 4. Clasificación de las glucosiltransferasas 
 
TABLA 5. Principales grupos microbianos encontrados en el pozol 
 
TABLA 6. Características de las diferentes muestras de masa de pozol 
 
TABLA 7. Condiciones para el ensayo de las enzimas hidrolasas 
 
TABLA 8. Concentración de sacarosa en maíz nixtamalizado y en pozol 
 
TABLA 9. Actividad GTF presente en la masa de pozol 
 
TABLA 10. Equivalentes de glucosa y fructosa a partir de la curva 
estándar de dextrana e inulina hidrolizadas con sus enzimas específicas 
 
TABLA 11. Equivalentes de glucosa en las diferentes muestras de 
pozol 
 
TABLA 12. Determinación de dextrana existente de manera natural en 
el pozol y de la sintetizada a partir de sacarosa mediante hidrólisis con 
dextranasa 
 
TABLA 13. Determinación de inulina existente de manera natural en el 
pozol y de la sintetizada a partir de sacarosa mediante hidrólisis con 
dextranasa 
 
TABLA 14. Poder reductor expresado en concentración de glucosa o 
fructosa del pozol de Ixtepec 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FIGURA 1. Estructura de la Inulina 
 
FIGURA 2. Estructura de la Levana 
 
FIGURA 3. Reacciones catalizadas por las FTFs 
 
FIGURA 4. Representación de las diferentes estructuras de Dextranas 
sintetizadas por GTF’s de diferentes cepas de L. mesenteroides y por S. 
mutans. 
 
FIGURA 5. Reacciones catalizadas por las GTFs 
 
FIGURA 6. Estrategia Metodológica 
 
FIGURA 7. Evolución promedio del PR en muestra de pozol con y sin 
sacarosa 
 
FIGURA 8. Evolución promedio de la hidrólisis de dextrana con 
dextranasa a 6 horas de incubación a 40 ºC 
 
FIGURA 9. Evolución promedio de la hidrólisis de inulina con inulinasa 
a 6 horas de incubación a 60 ºC 
 
FIGURA 10. Evolución del pH de la masa fresca fermentada durante la 
elaboración de pozol en el laboratorio 
 
FIGURA 11. Evolución del PR durante la fermentación natural de la 
masa de nixtamal incubada a 30 ºC 
 
FIGURA 12. Hidrólisis enzimática con dextranasa del pozol elaborado 
en el laboratorio 
 
FIGURA 13. Cromatografía en capa fina de las muestras de polímeros 
obtenidas del pozol de Ixtepec 
 
FIGURA 14. Cromatograma del HPLC de las diluciones con 
concentraciones conocidas de dextrana e inulina 
 
FIGURA 15. Cromatograma del HPLC de los polímeros extraídos del 
pozol de Ixtepec 
 
2. RESUMEN 
 
El pozol es una bebida fermentada de origen maya elaborada a base 
de maíz nixtamalizado. Durante su producción diversos organismos 
contribuyen al sabor, aroma y textura característico de este 
alimento tradicional, así como al beneficio de la salud humana. Es 
posible que durante la fermentación de algunos carbohidratos se 
produzcan homo-exopolisacáridos de naturaleza prebiótica, como la 
inulina, y carbohidratos con aplicaciones en la industria de 
alimentos, como la dextrana. 
 
La inulina y algunos oligosacáridos son considerados fibra dietética, 
pues son solubles en agua pero no digeribles por el intestino 
humano. Éstos son fermentados por bacterias colónicas, 
estimulando el desarrollo de bacterias, como bifidobacterias y 
lactobacilos, por lo que se consideran prebióticos. 
 
La dextrana representa un problema en la industria refinadora de 
azúcar por su alta viscosidad; sin embargo tiene aplicaciones en 
medicina, química, y alimentos (como aditivos) y forma parte de 
algunos alimentos fermentados, como el pozol y el pulque. 
 
Tanto la inulina como la dextranatienen como origen la síntesis 
enzimática a partir de la sacarosa llevada a cabo por las enzimas 
transferasas (inulosacarasa y dextransacarasa respectivamente) 
producidas por bacterias lácticas. 
 
En el presente trabajo se llevó a cabo una búsqueda de los 
polisacáridos en el pozol (antes y después de la fermentación) y de 
las enzimas que los sintetizan, para definir el papel de éste como 
una fuente potencial de sustancias prebióticas. El proyecto consistió 
en la cuantificación de sacarosa, la determinación de actividad 
transferasa y la determinación de homo-polisacáridos presentes en 
el pozol, así como de la identificación de los carbohidratos y la 
síntesis de éstos a partir de las enzimas específicas presentes en el 
alimento. 
 
Finalmente se realizó un experimento basado en la promoción de la 
síntesis de exopolisacáridos en presencia de sacarosa (5% en 
función del volumen) a 30ºC por 24 horas. Al final de la incubación, 
se cuantificó indirectamente la cantidad de inulina y la de dextrana, 
encontrándose que de 100 g de masa de pozol, 1.63 g corresponde 
a los carbohidratos sintetizados. 
 
 
 
3. INTRODUCCIÓN 
La utilización de organismos vivos y sus componentes para producir y 
mejorar productos y procesos específicos se conoce como 
biotecnología (United Nations, 1992). Fue en 1982, con el 
lanzamiento comercial de la insulina recombinante para humanos, la 
fecha que marcó el nacimiento de la biotecnología moderna. Sin 
embargo, esta rama científica ha sido utilizada por el hombre de 
manera empírica desde los comienzos de la historia, en actividades 
tales como la preparación del pan y de bebidas alcohólicas o el 
mejoramiento de cultivos y de animales domésticos. Procesos como 
la producción de cerveza, vino, queso y yogurt implican el uso de 
bacterias o levaduras con el fin de convertir un producto natural, 
como la leche, en un producto de fermentación más apetecible, como 
el yogurt, y sobre todo, con mayor vida de anaquel. 
La biotecnología moderna está compuesta por una variedad de 
técnicas derivadas de la investigación en biología celular, biología 
molecular y microbiología; la primera generación de productos está 
asociada con la industria farmacéutica, mientras que la segunda ha 
tenido un gran impacto sobre todo en alimentos (plantas 
transgénicas). 
Hoy en día la biotecnología permite solucionar problemas importantes 
a nivel internacional. En México se han realizado grandes avances en 
este rubro, como la diversificación de las aplicaciones del azúcar de 
caña, el cuidado del medio ambiente, la generación de nuevos 
antibióticos, de nuevos productos de interés comercial, e incluso, 
incidir en que tengamos tortillas mejor conservadas y leche sin 
lactosa para una mejor digestión (López-Munguía, 2001). 
 
Por otro lado, dentro de los nuevos productos de la industria 
alimentaria de gran impacto comercial, encontramos a los alimentos 
funcionales, los cuales se definen como aquéllos que pueden 
proporcionar un beneficio para la salud además de contribuir a la 
nutrición básica (International Food Information Council, 2009). 
Los componentes biológicamente activos que están presentes en los 
alimentos funcionales proporcionan beneficios a la salud o efectos 
fisiológicos deseables. Un ejemplo de éstos son los llamados 
prebióticos. 
Los prebióticos son ingredientes no digeribles de los alimentos que 
benefician al huésped por una estimulación selectiva del crecimiento 
y/o actividad de uno o de un grupo limitado de bacterias en el colon -
probióticos- (Gibson G y Roberfroid M 1995). Esta selectividad ha 
sido demostrada para las bifidobacterias, cuyo desarrollo puede ser 
promovido por la ingestión de prebióticos, dentro de los cuales 
destacan los fructo-oligosacáridos y fructanas (como la inulina). 
 
El efecto del crecimiento de los probióticos usando oligosacáridos e 
inulina como sustratos, inhibe microorganismos patógenos y 
promueve una serie de funciones fisiológicas adicionales de gran 
importancia para la salud, como el tener una mejor digestión y mejor 
absorción de minerales; así mismo se ha demostrado que los 
prebióticos (oligosacáridos e inulina) pueden contribuir a la salud 
humana por su actividad antitumoral, inmunoestimuladora y el 
control del colesterol (Welman A y Madox I 2003; Topping D. 2003). 
 
 
 
 
Aunado a estas propiedades, se ha demostrado desde hace décadas 
que la dextrana y la inulina tienen interés para la industria 
alimentaria por sus propiedades tecnológicas. Pueden emplearse 
como sustitutos de grasa, agentes emulsificantes, agentes que 
incrementan la viscosidad y suavizantes, entre otros (Ibarburu y col., 
2007). 
La inulina se encuentra en forma natural en una gran diversidad de 
productos, particularmente en hierbas, hortalizas y cereales, y 
pueden ser sintetizadas por la acción de algunas bacterias y hongos, 
por medio de un grupo de enzimas ubicadas dentro del conjunto de 
las enzimas glicosiltransferasas. De igual forma, las dextranas son 
sintetizadas por microorganismos en algunos productos fermentados. 
Estas enzimas transfieren el residuo glicosilo (glucosa o fructosa) de 
la sacarosa que utilizan como sustrato, a una cadena en crecimiento 
o a otra molécula aceptora, formando así polímeros u oligosacáridos 
(de menor peso molecular que el polímero) que difieren en su tamaño 
de acuerdo con la especificidad de las enzimas y las condiciones de 
síntesis. 
Debido a la gran importancia de estas sustancias prebióticas, en el 
laboratorio de Ingeniería y Biocatálisis del Instituto de Biotecnología, 
UNAM, el grupo del Dr. Agustín López-Munguía ha realizado diversos 
estudios sobre las enzimas que sintetizan estos exopolisacáridos, su 
origen, estructura y propiedades bioquímicas. Uno de los estudios de 
mayor relevancia se refiere a la identificación de una enzima 
fructosiltransferasa, con propiedades estructurales de 
glucosiltransferasa, proveniente de Leuconostoc citreum, bacteria 
aislada del pozol (Olivares I 2003). 
 
El pozol, bebida refrescante de origen maya, elaborada a base de 
maíz nixtamalizado fermentado, es producida en el sureste de 
México, y es considerado un alimento de gran importancia no sólo por 
su impacto en la cultura alimentaria maya, sino también por su alto 
contenido calórico y valor nutricional, y por ser una forma de 
transformación y conservación del maíz a través de un proceso de 
fermentación tradicional espontáneo. 
Este producto tradicional ha sido investigado desde hace ya varios 
años por el equipo de la Dra. Carmen Wacher, en la Facultad de 
Química de la UNAM. Dentro de la microbiota aislada de este 
producto se han encontrado algunas bacterias lácticas con capacidad 
de sintetizar exopolisacáridos en presencia de sacarosa (Ampe y col., 
1999), incluyendo la cepa de Leuconostoc citreum antes mencionada. 
Estos antecedentes permiten suponer que durante la elaboración de 
pozol estos microorganismos podrían sintetizar polisacáridos del tipo 
de la inulina y de la dextrana. Sin embargo la concentración de 
sacarosa en la masa de nixtamal es baja, por lo que se piensa que la 
adición de este carbohidrato al pozol (lo que se acostumbra a hacer 
previo a su consumo) podría traer como consecuencia cambios 
benéficos en la composición desde el punto de vista nutricional, como 
la síntesis de oligofructanos y/o oligodextranos, que hasta la fecha no 
han sido considerados. Por esta razón en este proyecto se pretende 
contestar las siguientes preguntas: ¿Existe inulina o dextrana en el 
pozol? ¿Existen las enzimas para sintetizar estos homopolisacáridos? 
¿Es posible favorecer su síntesis? 
 
 
 
 
 
3. INTRODUCCIÓN 
La utilización de organismos vivos y sus componentes para producir y 
mejorar productos y procesos específicos se conoce como 
biotecnología (United Nations, 1992). Fue en 1982, con el 
lanzamiento comercial de lainsulina recombinante para humanos, la 
fecha que marcó el nacimiento de la biotecnología moderna. Sin 
embargo, esta rama científica ha sido utilizada por el hombre de 
manera empírica desde los comienzos de la historia, en actividades 
tales como la preparación del pan y de bebidas alcohólicas o el 
mejoramiento de cultivos y de animales domésticos. Procesos como 
la producción de cerveza, vino, queso y yogurt implican el uso de 
bacterias o levaduras con el fin de convertir un producto natural, 
como la leche, en un producto de fermentación más apetecible, como 
el yogurt, y sobre todo, con mayor vida de anaquel. 
La biotecnología moderna está compuesta por una variedad de 
técnicas derivadas de la investigación en biología celular, biología 
molecular y microbiología; la primera generación de productos está 
asociada con la industria farmacéutica, mientras que la segunda ha 
tenido un gran impacto sobre todo en alimentos (plantas 
transgénicas). 
Hoy en día la biotecnología permite solucionar problemas importantes 
a nivel internacional. En México se han realizado grandes avances en 
este rubro, como la diversificación de las aplicaciones del azúcar de 
caña, el cuidado del medio ambiente, la generación de nuevos 
antibióticos, de nuevos productos de interés comercial, e incluso, 
incidir en que tengamos tortillas mejor conservadas y leche sin 
lactosa para una mejor digestión (López-Munguía, 2001). 
 
Por otro lado, dentro de los nuevos productos de la industria 
alimentaria de gran impacto comercial, encontramos a los alimentos 
funcionales, los cuales se definen como aquéllos que pueden 
proporcionar un beneficio para la salud además de contribuir a la 
nutrición básica (International Food Information Council, 2009). 
Los componentes biológicamente activos que están presentes en los 
alimentos funcionales proporcionan beneficios a la salud o efectos 
fisiológicos deseables. Un ejemplo de éstos son los llamados 
prebióticos. 
Los prebióticos son ingredientes no digeribles de los alimentos que 
benefician al huésped por una estimulación selectiva del crecimiento 
y/o actividad de uno o de un grupo limitado de bacterias en el colon -
probióticos- (Gibson G y Roberfroid M 1995). Esta selectividad ha 
sido demostrada para las bifidobacterias, cuyo desarrollo puede ser 
promovido por la ingestión de prebióticos, dentro de los cuales 
destacan los fructo-oligosacáridos y fructanas (como la inulina). 
 
El efecto del crecimiento de los probióticos usando oligosacáridos e 
inulina como sustratos, inhibe microorganismos patógenos y 
promueve una serie de funciones fisiológicas adicionales de gran 
importancia para la salud, como el tener una mejor digestión y mejor 
absorción de minerales; así mismo se ha demostrado que los 
prebióticos (oligosacáridos e inulina) pueden contribuir a la salud 
humana por su actividad antitumoral, inmunoestimuladora y el 
control del colesterol (Welman A y Madox I 2003; Topping D. 2003). 
 
 
 
 
 
Aunado a estas propiedades, se ha demostrado desde hace décadas 
que la dextrana y la inulina tienen interés para la industria 
alimentaria por sus propiedades tecnológicas. Pueden emplearse 
como sustitutos de grasa, agentes emulsificantes, agentes que 
incrementan la viscosidad y suavizantes, entre otros (Ibarburu y col., 
2007). 
La inulina se encuentra en forma natural en una gran diversidad de 
productos, particularmente en hierbas, hortalizas y cereales, y 
pueden ser sintetizadas por la acción de algunas bacterias y hongos, 
por medio de un grupo de enzimas ubicadas dentro del conjunto de 
las enzimas glicosiltransferasas. De igual forma, las dextranas son 
sintetizadas por microorganismos en algunos productos fermentados. 
Estas enzimas transfieren el residuo glicosilo (glucosa o fructosa) de 
la sacarosa que utilizan como sustrato, a una cadena en crecimiento 
o a otra molécula aceptora, formando así polímeros u oligosacáridos 
(de menor peso molecular que el polímero) que difieren en su tamaño 
de acuerdo con la especificidad de las enzimas y las condiciones de 
síntesis. 
Debido a la gran importancia de estas sustancias prebióticas, en el 
laboratorio de Ingeniería y Biocatálisis del Instituto de Biotecnología, 
UNAM, el grupo del Dr. Agustín López-Munguía ha realizado diversos 
estudios sobre las enzimas que sintetizan estos exopolisacáridos, su 
origen, estructura y propiedades bioquímicas. Uno de los estudios de 
mayor relevancia se refiere a la identificación de una enzima 
fructosiltransferasa, con propiedades estructurales de 
glucosiltransferasa, proveniente de Leuconostoc citreum, bacteria 
aislada del pozol (Olivares I 2003). 
 
El pozol, bebida refrescante de origen maya, elaborada a base de 
maíz nixtamalizado fermentado, es producida en el sureste de 
México, y es considerado un alimento de gran importancia no sólo por 
su impacto en la cultura alimentaria maya, sino también por su alto 
contenido calórico y valor nutricional, y por ser una forma de 
transformación y conservación del maíz a través de un proceso de 
fermentación tradicional espontáneo. 
Este producto tradicional ha sido investigado desde hace ya varios 
años por el equipo de la Dra. Carmen Wacher, en la Facultad de 
Química de la UNAM. Dentro de la microbiota aislada de este 
producto se han encontrado algunas bacterias lácticas con capacidad 
de sintetizar exopolisacáridos en presencia de sacarosa (Ampe y col., 
1999), incluyendo la cepa de Leuconostoc citreum antes mencionada. 
Estos antecedentes permiten suponer que durante la elaboración de 
pozol estos microorganismos podrían sintetizar polisacáridos del tipo 
de la inulina y de la dextrana. Sin embargo la concentración de 
sacarosa en la masa de nixtamal es baja, por lo que se piensa que la 
adición de este carbohidrato al pozol (lo que se acostumbra a hacer 
previo a su consumo) podría traer como consecuencia cambios 
benéficos en la composición desde el punto de vista nutricional, como 
la síntesis de oligofructanos y/o oligodextranos, que hasta la fecha no 
han sido considerados. Por esta razón en este proyecto se pretende 
contestar las siguientes preguntas: ¿Existe inulina o dextrana en el 
pozol? ¿Existen las enzimas para sintetizar estos homopolisacáridos? 
¿Es posible favorecer su síntesis? 
 
 
 
 
 
 
 
4. GENERALIDADES 
 
4.1 Prebióticos 
 
Los prebióticos se definen como ingredientes no digeribles de los 
alimentos, generalmente azúcares, que llegan hasta el colon durante 
la actividad gastrointestinal y pueden ser fermentados por bacterias 
probióticas. La fermentación de estas sustancias provoca, entre otras 
consecuencias, la inhibición de microorganismos patógenos (Gibson y 
Roberfroid, 1995). 
 
El aparato digestivo humano no contiene enzimas capaces de 
hidrolizar enlaces β–glicosídicos, con la excepción de la lactosa, lo 
que hace a los oligosacáridos con enlaces β–glicosídicos no digeribles 
(Rivero-Urgell y Santa-María O , 2000; Roberfroid y Delzenne, 1998). 
 
A diferencia de los productos probióticos, a través de los cuales se 
introducen bacterias exógenas hacia el lumen del intestino, los 
prebióticos estimulan el crecimiento preferencial de un número 
limitado de bacterias, especialmente de los géneros Lactobacillus y 
Bifidobacterium (Moro G y col., 2002). 
 
El éxito de esta estrategia depende de la concentración inicial de la 
especie probiótica y del pH intraluminal. Los oligosacáridos de la 
leche materna son considerados el prototipo de los prebióticos, ya 
que se ha demostrado que estimulan el crecimiento preferencial de 
los microorganismos arriba mencionados en el colon de neonatos que 
son alimentados exclusivamente con leche materna. 
 
 
 
 
En la Tabla 1 se presentan algunos compuestos cuya capacidad como 
prebióticos ha sido demostrada. 
 
Tabla 1. Algunos oligosacáridos prebióticos de naturaleza 
glicosídica (Quera, etal. 2005). 
 
Fructo-oligosacáridos 
Galacto-oligosacáridos 
Gentio-oligosacáridos 
Inulina 
Isomalto-oligosacáridos 
Lactosa 
Lactulosa 
Lactosacarosa 
Oliosacáridos de soya 
Xilo-oligosacáridos 
 
 
 
Dentro de los prebióticos disponibles, las fructanas de tipo inulina y 
los fructooligosacáridos (FOS) son los más estudiados y de los que 
más evidencias se tienen como alimentos funcionales. 
 
 
 
 
 
Estos prebióticos se encuentran presentes en el trigo, maíz, vegetales 
y frutas (cebolla, achicoria, ajo, poro, alcachofas y plátanos), y en 
numerosos alimentos fermentados tradicionales, que posteriormente 
serán objeto de estudio en esta tesis. Debido a su estructura, son 
transformados durante la fermentación en sustratos metabólicos y 
energéticos. Algunos autores (Quera, 2005) han sugerido una dosis 
de 4-20 g/día, más no existe una dosis recomendada específica en 
función de la edad, la población, la dieta u otros parámetros. 
 
Dado que los FOS estimulan de manera más efectiva el crecimiento 
de Bifidobacterium y Lactobacillus, y la inulina induce mayores 
niveles de butirato, es probable que la combinación de prebióticos 
pueda tener un efecto adicional dado los diferentes mecanismos de 
acción. 
 
Un área muy promisoria en el desarrollo de estos ingredientes 
alimenticios son los productos simbióticos, los cuales pueden ser 
definidos como aquellos que combinan probióticos y prebióticos. 
Gmeiner M y col. (2000) han sugerido que la mezcla de L. acidophilus 
y FOS resulta en un aumento en el nivel de Lactobacillus. Este 
acoplamiento sugirió la disminución en el riesgo de cáncer colorrectal 
(Gallaher D y Khil J, 2000). Existen estudios posteriores en donde se 
confirma que los simbióticos parecen tener un efecto en contra de 
fases iniciales de cáncer colorectal. El consumo de Lactobacillus 
plantarum asociado con los prebióticos inulina y fructooligosacáridos 
(raftilina y raftilosa) ha sido efectivo para aumentar la resistencia 
celular a la genotoxicidad de la contaminación con materia fecal 
(Burns A 2004). 
 
 
 
 
Oligosacáridos Prebióticos 
 
Los oligosacáridos son carbohidratos cuyo grado de polimerización o 
largo de cadena es pequeño (de 3 a 11). Existe una alta proporción 
de oligosacáridos libres de manera natural en la leche de los 
mamíferos, pero pueden encontrarse también en productos 
fermentados por bacterias, hongos, así como en una gran variedad 
de plantas. Algunos oligosacáridos son derivados de la hidrólisis de 
los polímeros ingeridos en la dieta durante la digestión. 
Tecnológicamente, pueden ser extraídos de fuentes naturales y ser 
sintetizados a partir de azúcares de menor tamaño o bien obtenidos 
por la hidrólisis química o enzimática de polisacáridos (G. Boehm y B. 
Stahl. 2003). 
 
Se clasifican como oligosacáridos de leche humana (OLH o HMOS, 
human milk oligosaccharides), oligosacáridos de leche animal OLA y 
oligosacáridos de origen no lácteo OS (Boehm y Moro G. 2008). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Aspectos estructurales de los Oligosacáridos. 
 
Un componente importante de la leche humana son los 
oligosacáridos, presentes en una concentración entre 0.7-1.2g L-1 
(Thurl y col., 1996; Kunz y col., 2000). Los OLH están compuestos 
por una combinación variable de D-glucosa, D-galactosa, ácido siálico 
(N-acetilneuroamínico), L-fucosa y N-acetilglucosamina con una gran 
diversidad de enlaces químicos (tipo β) entre ellos, lo que explica su 
amplio número y funcionalidad. Las cadenas de oligosacáridos tienen 
una longitud de 3-11 residuos de monosacáridos. Hasta el momento 
se han aislado y caracterizado 130 diferentes OLH, la mayoría de 
ellos con una unidad de lactosa en el extremo reductor, mientras que 
la fucosa y el ácido siálico son los residuos más frecuentes situados 
en el extremo no reductor. 
En la clasificación más sencilla, se considera que existen 3 principales 
categorías: oligosacáridos neutros, que incluye a los oligosacáridos 
fucosilados; oligosacáridos ácidos, con predominio en el contenido de 
ácido siálico y que a pH neutro se presentan en forma aniónica; y 
sialil fucosil-oligosacáridos, que contienen fucosa y ácido siálico. 
Los oligosacáridos se sintetizan en el aparato de Golgi de las células 
secretoras de los alvéolos de la glándula mamaria. La α-
lactoalbúmina regula la enzima galactosiltransferasa, que cataliza la 
reacción entre uridin-5’-difosfato-galactosa y glucosa para producir 
lactosa. Posteriormente, otra transferasa (galactosil, N-
acetilglucosaminil, fucosil o silaliltransferasa) adiciona monosacáridos 
sobre la lactosa para formar los oligosacáridos, lo cual origina un 
elevado número de estructuras primarias (core oligosaccharides) 
como se muestra en la Tabla 2. 
 
Sobre estas estructuras tiene lugar la elongación debida a la acción 
de fucosiltransfersas y sialiltransfereasas, que da lugar a los más de 
130 oligosacáridos caracterizados. 
Tabla 2. Estructura primaria de algunos oligosacáridos de la 
leche materna. Adaptado de Kunz y Rudloff (Gudiel-Urbano, 
Montzerrat. 2001) 
Nombre Estructura 
Lactosa 
Lacto-N-tetrosa 
Lacto-N-neo-tetrosa 
Lacto-N-hexosa 
Galb 1-4Glu 
Galb 1-3N-AcGlucb 1-3 Galb 1-4Glu 
Galß1-4N-AcGlucb 1-3 Galb 1-4Glu 
Galb 1-4N-AcGlucb 1-6Galb 3-1N-AcGlucb 3-1Galb 
1-4Glu 
para-Lacto-N-hexosa 
para-Lacto-N-neo-hexosa 
Galb 1-3 N-AcGlucb 1-3 Galb 1-4 N-AcGlucb 1-3 
Galb 1-4 Glu 
Galb 1-4 N-AcGlucb 1-3 Galb 1-4 N-AcGlucb 1-3 
Galb 1-4 Glu 
 
 
Se sabe que los OLH contribuyen de manera positiva en diferentes 
funciones del cuerpo humano, como el establecimiento inicial de una 
microbiota particular intestinal (dominada por bifidobacterias), la 
estimulación del sistema inmune postnatal contra infecciones de 
bacterias y virus, y la biodisponibilidad de minerales. 
 
 
 
Dada su disponibilidad limitada desde el punto de vista industrial, los 
oligosacáridos lácteos, tanto de leche humana como de leche animal 
(que tienen características y efectos similares) no representan una 
alternativa viable para su aplicación masiva, fuera del contexto de su 
consumo con los productos tradicionales de la industria láctea. 
 
En este sentido, las investigaciones más importantes sobre 
oligosacáridos industrializables han sido en fructanas de origen 
vegetal, y en galactooligosacáridos de síntesis enzimática (van Loo y 
col., 1999), los cuales han sido utilizados como ingredientes activos 
en muchos productos alimenticios, buscando inducir como se 
mencionó, los mismos efectos que los oligosacáridos de la leche 
humana (Gibson y Roberfroid, 1995). 
 
Las fructanas y glucanas son sintetizados por bacterias y hongos; 
están asociadas a la pared celular en forma de cápsulas, o son 
secretados al exterior en forma de limo (di Cagno R y col., 2006). La 
hidrólisis enzimática de estos exopolisacáridos genera oligosacáridos 
de menor grado de polimerización, que son los verdaderos 
prebióticos. 
 
4.2 Fructanas 
 
Las fructanas son homopolisacáridos hidro-solubles de β–D-
fructofuranosa, que poseen una unidad terminal de D-glucosilo 
cuando la sacarosa es el primer aceptor. Son cadenas lineares o 
cadenas ramificadas, unidas por un enlace β2-1 (inulina) o β2-6 
(levana). Las fructanas son abundantes y fácilmente extraídas de 
plantas (como espárragos, ajo, cebolla, alcachofa, escarola, raíces, 
etc.) por lo que han sido usadas ampliamente como ingredientes en 
algunas dietas. Su grado de polimerización depende de las moléculas 
aceptoras involucradas y de la fuente de las enzimas 
fructosiltransferasas (FTF’s), que son las responsables de su síntesis. 
 
Muchas bacterias presentan actividad FTF y por lo tanto son capaces 
de producir fructanas. Dentro de las Gram positivas se encuentran las 
bacterias ácido-lácticas mayoritariamente, y dentro de las Gram 
negativas, las enterobacterias. Se producen tambiénen un 15% 
aproximadamente de las plantas superiores, en donde se almacenan 
como polímeros de reserva (Vijn, 1999). En la tabla 3 se muestra el 
contenido de inulina en algunas plantas. 
 
 
Tabla 3. Contenido de Inulina en algunas plantas comestibles. 
(Moshfegh y col., 1995) 
 
Alimento Contenido de Inulina 
(% en peso húmedo) 
Bardana o Lampazo 
Agave 
Achicoria (raíz) 
Alcachofa 
Ajo 
Poro 
Cebolla 
Espárrago 
Plátano 
27 – 45 
16 – 25 
10 – 15 
16 – 20 
9 – 16 
3 – 10 
2 – 6 
2 – 3 
0.3 – 0.7 
 
 
 
Inulina 
 
La inulina (Figura 1) contiene unidades de fructosa unidas por enlaces 
β2-1 en la cadena principal. Su grado de polimerización es variable y 
va de 20 a 60 monómeros dependiendo del origen. Cuando el grado 
de polimerización es menor a 10 unidades, a estas cadenas se les 
denomina fructooligosacáridos (FOS). Las enzimas responsables de 
sus síntesis en bacterias son las inulosacarasas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Estructura de la Inulina 
 
Levana 
 
Las levanas están constituidas por moléculas de fructofuranosa 
unidas por enlaces β2-6 con ramificaciones en β2-1 
aproximadamente cada 9 o 10 residuos (Han, 1990), como se ilustra 
en la figura 2. Las levanas de origen microbiano pueden tener un 
elevado número de residuos de fructosa (alrededor de diez mil) en la 
cadena principal. Los principales microorganismos productores son 
Bacillus, Aerobacter, Streptococcus, Pseudomonas, 
Corynebacyterium, Acetobacter, Serratia, entre otras. En todos estos 
casos la síntesis enzimática se lleva a cabo a través de las enzimas 
fructosiltransferasas (FTFs), que en este caso reciben el nombre de 
levansacarasas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Estructura de la Levana 
Aplicaciones de Fructanas 
 
La levana se utiliza como sustituto de plasma sanguíneo, como 
vehículo de medicamentos, agente antitumoral y antiinmunitario. Los 
biopolímeros de levana tienen efectos colaterales al ser administrados 
en humanos; activan la liberación de citotoxinas inhibidoras del 
crecimiento celular. 
 
Industrialmente se emplea como alternativa a las gomas vegetales, 
como estabilizador por sus características reológicas, espesante y 
encapsulante de sabores y aromas. 
 
La inulina y los FOS son considerados nutracéuticos, y se emplean en 
alimentos funcionales ofreciendo importantes beneficios nutricionales 
y tecnológicos (Franck, 2002). Los dos son funcionan como fibra 
dietética por su resistencia al tracto gastrointestinal, y por lo mismo, 
son considerados prebióticos. 
 
La ingesta de inulina genera varios efectos favorables al humano, 
entre estos facilita la absorción de minerales, principalmente Ca2+ 
(Roberfroid, 2000); disminuye los niveles de triglicéridos, fosfolípidos 
y lipoproteínas de baja densidad en suero sanguíneo. Se ha reportado 
una posible inhibición del crecimiento de tumores cancerígenos en 
colon (Welman y Madox, 2003; Topping, 2007). 
 
Desde el punto de vista tecnológico, en la industria de alimentos, la 
inulina y los FOS se utilizan como sustitutos de azúcar, texturizantes 
y estabilizantes. También mejoran la sensación al paladar de 
productos lácteos fermentados, de postres como gelatinas y helados, 
y de algunos productos horneados como galletas y pasteles (Ibarburu 
y col., 2007). 
 
Fructosiltransferasas (FTF’s) 
 
Las fructosiltransferasas (FTF) son enzimas que catalizan la 
transferencia del grupo fructosilo de la sacarosa (donador) a una 
molécula aceptora (polímero en crecimiento), liberando el residuo 
glucosilo del disacárido, como se muestra en la figura 3. Esta 
transferencia no requiere de cofactores ni compuestos fosforilados de 
alta energía para formar el polímero, dado que el enlace glicosídico 
proporciona la energía necesaria (Monsan y col., 2001). 
 
Existen tres principales fuentes de fructanas: en las plantas 
superiores, que utilizan el polímero como reserva de carbohidratos 
contra la desecación y el frío; las que son producidas por hongos, en 
las que no es evidente la función fisiológica de las fructanas, y las 
FTF’s bacterianas, formadas por varios géneros como Bacillus, 
Pseudomonas y Streptococcus principalmente. En estos últimos se ha 
demostrado la importancia de las fructanas en la formación de 
biopelículas que les dan soporte. En el caso de las plantas la síntesis 
se lleva a cabo por varias FTFs, mientras que en los microorganismos 
una sola enzima es responsable de la síntesis. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
(M. Ortiz. 2004) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Reacciones catalizadas por las FTF’s 
microbiana (ejemplificadas con inulosacarasa) 
4.3 Glucanas 
 
Las glucanas son polímeros de glucosa con un residuo de fructosa en 
el extremo, cuyo largo de cadena y tipo de enlace depende, como en 
el caso de las fructanas, de su origen. Los polímeros más estudiados 
de este tipo son las dextranas. 
 
Dextranas 
 
Es el nombre que se le asigna al grupo de homo-polisacáridos 
bacterianos extracelulares compuestos en su mayoría por unidades 
de α–D-glucopiranosa, unidas principalmente por enlaces α1-6. 
 
Representan un problema grave en la industria refinadora de azúcar 
cuando los microorganismos contaminan los jugos de caña por la alta 
viscosidad que le confieren; sin embargo, se han desarrollado 
aplicaciones comerciales basadas en su inocuidad y su 
comportamiento reológico (como en el caso de las levanas) para 
usarse como sustituto de plasma sanguíneo; en la elaboración de 
Sephadex, un material muy empleado en columnas de cromatografía, 
entre otras. 
 
La producción de dextrana es catalizada por glucosiltransferasas, 
enzimas producidas por bacterias lácticas como Leuconostoc y 
Streptococcus principalmente. 
 
 
 
 
 
 
La aplicación de las dextranas estaba basada fundamentalmente en 
sus propiedades fisicoquímicas, y su estructura ha sido estudiada con 
detalle con el uso de la resonancia magnética nuclear de carbono 13 
(13C-RMN) y mediante estudios enzimáticos. Con esto se ha podido 
dilucidar, entre otras cosas que una sola cepa microbiana es capaz de 
formar más de un tipo de dextrana con diferentes estructuras. 
 
 
 
 
Figura 4. Representación de las diferentes estructuras de 
Glucanas sintetizadas por GTF’s de diferentes cepas de L. 
mesenteroides y por S. mutans. 
 
 
 
 
Glucositransferasas (GTF’s) 
 
Las GTFs son enzimas responsables de catalizar la conversión de 
sacarosa en glucanas de alto grado de polimerización conocidas como 
dextranas. Sin embargo, las moléculas de glucosa pueden ser 
transferidas a carbohidratos de bajo peso molecular formando 
oligosacáridos, y como sus homólogas las FTF’s, transfieren también 
el residuo glucosilo al agua, provocando hidrólisis de la sacarosa, 
como se ilustra en la figura 5. 
 
Dependiendo del microorganismo productor y del polímero 
sintetizado, se clasifican en dextransacarasa, alternansacarasa o 
mutansacarasa, entre otras. La estructura de los polímeros 
sintetizados por éstas y otras GTFs se ilustra en la Figura 4 y las 
enzimas se resumen en la tabla 4. 
 
 
Tabla 4. Clasificación de las glucosiltransferasas. 
 
Organismo 
Productor 
Cepa 
NRRL 
GTF Polímero Enlaces Ramificaciones 
 
Leuconostoc 
mesenteroides 
β- 
512 
β- 
1299 
β- 
1355 
Dextransacarasa 
Dextransacarasa 
Alternansacarasa 
Dextrana 
Dextrana 
Alternana 
α1-6 
α1-6 
α1-3 
α1-3 
α1-2 
α1-6 
Streptococcus 
mutans 
downei 
 
GS5 
Mfe28 
 
Mutansacarasa 
Glucosiltransferasa 
 
Mutana 
Glucana 
 
α1-3 
α1-6 
 
α1-6 
α1-3 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Reacciones catalizadas por las GTFs 
(ejemplificadas con la dextransacarasa). 
(S. Guillermina. 2006) 
4.4 Diferencias y Similitudes entre FTF’s y GTF’s 
 
Las FTFs y las GTFs comparten diversas características que es 
interesantemencionar, ya que ambas son glicosiltransferasas y 
utilizan el mismo sustrato (sacarosa) transfiriendo un residuo glicosilo 
de este disacárido a la cadena o polímero en crecimiento: fructosa 
para FTFs y glucosa para GTFs, liberando el otro azúcar al medio de 
reacción. Ambas tienen la capacidad de transferir un monómero al 
agua (hidrólisis) y de sintetizar oligosacáridos en presencia de 
azúcares de menor tamaño (reacción de aceptor). 
 
Las FTF sintetizadas por bacterias han sido muy estudiadas y muchos 
son los microorganismos reportados como productores. Sin embargo 
hay algunos casos en los que sorprendentemente algunos géneros 
presentan las dos enzimas. Leuconostoc tiene la capacidad de 
producir GTFs y en menor proporción FTFs (Miller y col., 1986). 
Sterptococcus es otro género en el que se presentan ambas enzimas. 
De la misma forma, en Lactobacillus reuteri se observó la síntesis y 
los genes que codifican para la producción de fructanas y dextranas 
(van Gell-Schuten, 1999). Hasta la fecha no se ha explicado la razón 
de este comportamiento. 
Las FTF’s y las GTF’s difieren en su estructura primaria y tipo de 
plegamiento, aunque como ya se señaló, hay ciertas analogías en el 
mecanismos de reacción. 
 
 
 
La cadena de las FTFs se encuentra plegada en forma de β-propela 
mientras que las GTFs tienen un dominio catalítico plegado en forma 
de barril (α/β) (Monchois, 1999), pero integradas por otros dos 
dominios: el N-terminal, que contiene al péptido señal conservado, 
seguido de una región de alta variabilidad, así como un dominio C-
terminal denominado de unión al polímero (GBD). 
Las GTFs presentan un peso molecular de 150-200 kDa (Olivares, 
2003) mientras que las FTFs tienen un peso molecular menor, entre 
50-80 kDa. Un caso excepcional reportado en el 2003 es el de la 
levansacarasa de S. salivarius de 140 kDa. Sin embargo en ese 
mismo año se reportó también una inulosacarasa de Leuconostoc 
citreum CW28 cepa aislada del pozol, de 165 kDa, el peso molecular 
más alto reportado hasta la fecha para una inulosacarasa. Más tarde 
se encontró que alcanzaba este tamaño porque si bien tenía el 
dominio catalítico típico de las FTFs, también tenía dominios 
adicionales (Olivares, 2003 y Wacher, 2003). Esta FTF es una enzima 
asociada a la pared de las células y es altamente específica para la 
síntesis de polímero, a diferencia de las FTFs comunes que hidrolizan 
una proporción importante del sustrato. Su secuenciación evidencia 
tres dominios: el primero (N-terminal) es un dominio variable que 
presenta homología con una GTF de L. mesenteroides NRRL B-1355 
que produce alternana; el C-terminal presenta gran similitud con el 
dominio de unión a polímero (GBD) de esta misma cepa; y finalmente 
el dominio catalítico, presenta similitudes con la FTF de Bacillus 
subtilis, Clostridium acetobutylicum, Erwinia amylovora y Ranhella 
aquatilis. 
 
Estas características indican que se trata de una quimera natural, 
resultado de la inclusión de una FTF dentro de una GTF, la 
alternansacarasa (Centeno, 2007). Es sorprendente que esta enzima 
se haya aislado de un microorganismo del pozol, donde no tiene una 
función específica. 
 
 
 
 
 
 
4.5 Alimentos fermentados 
 
Los alimentos fermentados son aquéllos en cuyo proceso de 
manufactura intervienen los microorganismos. Estos alimentos han 
existido desde hace varios miles de años, se asocian con las primeras 
culturas y surgieron de manera espontánea. La producción de 
alimentos fermentados que se consideran más antiguos, como 
algunas bebidas alcohólicas de origen chino, se estima que iniciaron 
hace 6000 o 7000 años, cuando el hombre empezó a usar los granos 
como alimento (Wacher y col., 1993). 
 
El papel más importante que juega la fermentación en los alimentos 
es el de mejorar las características sensoriales del sustrato; aunado 
al factor de mayor tiempo de conservación del alimento. 
 
 
Alimentos Fermentados como fuente de Prebióticos. 
 
Una ventaja de los alimentos tradicionales fermentados que empieza 
a ser reconocida, deriva principalmente de la presencia de prebióticos 
en éstos. Como ya se señaló, los prebióticos resultan ser sustratos 
para las bacterias de la microflora intestinal, principalmente de los 
lactobacilos y de las bifidobacterias, siendo responsables de estimular 
su crecimiento. 
Las bacterias que predominan en los alimentos fermentados son 
bacterias ácido-lácticas, muchas de las cuales tienen la capacidad de 
sintetizar exopolisacáridos de naturaleza prebiótica. Varios de estos 
procesos de fermentación se han tecnificado y en la actualidad 
numerosas empresas los controlan y los producen industrialmente, tal 
es el caso de yogurts, leche fermentada tipo yakult, soya, quesos, 
panes, etc. Sin embargo, existe una gran diversidad de 
fermentaciones que siguen siendo producidas de una manera 
artesanal. 
Dado que su elaboración es regional, es común que numerosos de 
estos productos no se conozcan fuera de su lugar de origen, y por lo 
tanto, su consumo sea muy limitado. Algunos grupos étnicos de 
diversas partes del mundo han encontrado en los alimentos 
fermentados no sólo una fuente de nutrientes, sino también una 
referencia específica de su cultura. 
Uno de los alimentos fermentados más antiguos que data de tiempos 
prehistóricos es el vino de miel, la primera bebida alcohólica de la que 
se tiene conocimiento. Es elaborado por la fermentación espontánea 
de los azúcares de la miel de la abeja. Otros productos que datan de 
estos tiempos son los vinos de frutas, que fueron descubiertos 
cuando el hombre recolectó frutos y bayas y los conservó en 
recipientes cerrados (Lappe y Ulloa, 1987; Dudley y Robert, 2004). 
De acuerdo con registros arqueológicos, otro de los productos más 
antiguos es el chu, originario de China, un alimento fermentado que 
se elabora a partir de granos enmohecidos. 
Existe actualmente en Colombia un pan acidificado mediante 
fermentación microbiana ácido láctica y alcohólica, con propiedades 
sensoriales, fisicoquímicas, y reológicas, diferentes a las de los panes 
no acidificados. Su desarrollo y comercialización constituyen una 
alternativa para el consumidor colombiano. Las masas ácidas se 
fabrican con harina y agua, teniendo como catalizador mezclas 
heterogéneas de bacterias ácido lácticas (BAL) y levaduras. Dichas 
masas se acidifican hasta un pH de 4 aproximadamente (León y col., 
2006). 
 
Las masas ácidas (Fermented Dough: FD) se fermentan durante 4 o 
24 horas (Long Time Fermented Dough: LFD), alcanzando un pH de 
3.5. Durante este proceso, las BAL realizan una hidrólisis moderada 
del almidón y acidificación, lo que se traduce en una miga suave y 
palatable, aumento del volumen y de la biodisponibilidad mineral 
mediante la degradación del fitato, y una fuerte inhibición de 
microorganismos que deterioran el proceso, como Bacillus subtilis, 
proveniente de la harina de trigo (León y col., 2006). 
 
El deterioro en la calidad sensorial de los panes se asocia con la 
pérdida del sabor, de la crujencia en la corteza, el aumento en el 
desmoronamiento de la miga y de su firmeza. La firmeza es 
considerada una de las principales características del envejecimiento 
del pan, y su incremento rápido es causa de pérdidas en la industria 
panificadora mundial, las cuales se han calculado entre un 8-10% de 
la producción total. 
 
Se ha estudiado la velocidad de retrogradación mediante la 
combinación binaria de levadura panadera con L. plantarum, L. 
amylophilus, L. brevis, L. sake y L. acetotolerans, obteniéndose como 
resultado el retraso de la retrogradación en panes, comparados con 
aquellos donde sólo se emplea la levadura panadera. Lo anterior se 
debe a la síntesis de un exopolisacárido retenedor de agua, lo que 
puede ser aprovechado como alternativa para reemplazar aquellos 
aditivos industriales retenedoresde humedad, tales como el almidón, 
la goma arábiga y la carragenina (León y col., 2006). 
 
 
Los exopolisacáridos tipo fructano, sintetizados por L. 
sanfransciscensis y L. reuteri, también sirven como prebiótico para 
otros microorganismos probióticos, permitiendo la optimización de las 
propiedades tecnológicas y nutricionales de la masa ácida y del pan. 
 
Paralelamente, se han hecho estudios en Italia (di Cagno, y col. 
2006), que evidencian que durante la fermentación de masa ácida 
con bacterias lácticas, principalmente Weisella cibaria, Lactobacillus 
plantarum y Pediococcus pentosaceus, se generan exopolisacáridos 
del tipo glucanas y fructanas, que provocan que aumente la 
viscosidad de la masa, haciendo del producto final un pan con mayor 
volumen específico y menor dureza. Al igual que los estudios 
publicados en Colombia, esto demuestra que los polímeros 
bacterianos pueden ser considerados como una herramienta esencial 
para reemplazar aditivos alimentarios, además de las ventajas 
mencionadas del efecto prebiótico. 
 
 
 
Alimentos Fermentados Tradicionales de México 
En México existen más de 200 alimentos y bebidas fermentadas, de 
los cuales se han estudiado a profundidad alrededor de una docena. 
Dentro de los alimentos tradicionales indígenas destacan el tejuino, 
tepache, tibicos, pulque, tuba, colonche, y el pozol, entre otros. 
La palabra tesgüino es de origen náhuatl. Viene de tecuin que puede 
traducirse como latir. El tesgüino es una bebida fermentada hecha de 
maíz, agua y piloncillo. Es muy semejante a la cerveza y es 
consumida por grupos étnicos del norte y noroeste de México. 
 
El tepache es de las bebidas fermentadas más consumidas y famosas 
de México. La palabra tepache procede del náhuatl tepiatl, que 
significa bebida de maíz, pues originalmente era elaborada con este 
cereal, aunque hoy su versión más conocida es producida a partir de 
la mezcla de piña y azúcar. 
La palabra pulque también tiene una raíz náhuatl que es poliuhqui, 
que quiere decir descompuesto. Es una bebida alcohólica que se 
obtiene por la fermentación del aguamiel, la savia azucarada de 
varias especies de magueyes pulqueros. 
El pozol viene del náhuatl pozolli, que quiere decir espumoso. Es un 
producto alimenticio de origen maya, preparado a partir de la 
fermentación de la masa de maíz nixtamalizado, que disuelta en 
agua, es consumida cruda por varios grupos étnicos del sur y sureste 
de México. Esta bebida es ingerida durante las jornadas de trabajo, a 
la hora de comida, o a cualquier hora del día como una bebida 
refrescante; constituye también un alimento básico, en especial para 
aquéllos que lo consumen como alimento principal. 
 
4.6 Pozol 
La elaboración del pozol (Cañas y col., 1993) inicia con la limpieza del 
maíz, se adiciona agua al maíz crudo para eliminar impurezas: maíz 
picado, podrido, cascarillas o piedras pequeñas. El siguiente paso es 
la nixtamalización, en la que el maíz se cuece en agua con cal para 
facilitar el desprendimiento de la cascarilla; se lava el nixtamal para 
eliminar impurezas y exceso de cal, etapa que se debe hacer antes de 
las 4 siguientes horas para evitar que el maíz se impregna de cal y 
adquiera una tonalidad verde-azulosa y que el sabor del pozol se 
haga picante; se realiza entonces una segunda cocción o “reventado” 
(llevado a cabo por productores mestizos) que consiste en cocer el 
nixtamal en agua hasta que el maíz reviente o floree. El tiempo de 
cocción varía entre 3 y 8 horas. Se remoja el maíz durante 12 horas 
aproximadamente evitando que se seque durante la molienda, 
operación que se lleva a cabo a la mañana siguiente de la 
nixtamalización o del reventado. Este paso representa un punto 
crítico de control ya que en los molinos se observan focos potenciales 
de contaminación microbiana (los molinos de mano jamás se 
desarman para su limpieza). 
 
Posteriormente se elabora la bola, generalmente se hace a mano y en 
mesas de madera. Esta manipulación, junto con la del agua y 
molienda, son fuentes importantes de inóculo para la fermentación. 
Se envuelve la bola en hojas de plátano y la fermentación se lleva a 
cabo a temperatura ambiente y en estado semisólido, con la 
intervención de una microbiota natural compleja (no añadida 
intencionalmente) compuesta por diferentes grupos de bacterias, 
mohos y levaduras. 
 
El consumo del pozol se realiza disgregando la masa con la mano, 
suspendiéndola en agua, y adicionando azúcar y hielo principalmente, 
entre otros ingredientes, que dependen del productor y zona de 
venta. 
 
Microbiología del Pozol 
 
La etapa más crítica en la elaboración del pozol es la fermentación, 
ya que durante la misma el valor de pH de las bolas de masa decrece 
de 7 a 5 en 12 horas aproximadamente, y alcanza valores de 4 
después de tres o cuatro días. Estos valores ácidos de pH son indicio 
de que la microbiota dominante son las bacterias ácido lácticas (BAL), 
representando el 90-97% del total, además de bacterias mesófilas 
aerobias, enterobacterias, levaduras y hongos (Wacher y col., 1993). 
Debido al tratamiento de nixtamalización y lavado de los granos de 
maíz se reducen los azúcares simples, mono y disacáridos. La 
concentración de sacarosa en el maíz es de 2g por 100g de maíz (en 
peso seco) una vez lavado, y se reduce hasta 0.1-0.7g por cada 100g 
de masa nixtamalizada. La principal fuente de carbono para la 
fermentación por lo tanto es el almidón. Parece extraño entonces que 
a tan bajas concentraciones de azúcares simples haya tal variedad de 
microbiota. 
 
Del grupo dominante que son las bacterias ácido-lácticas, existe un 
subgrupo que tienen actividad amilolítica, lo que permite que estas 
bacterias hidrolicen el almidón por acción de las amilasas en los 
inicios de la fermentación, dejando disponibles oligosacáridos y 
lactato para otros grupos microbianos, como las levaduras y hongos. 
 
 
De acuerdo con Ampe y col. (1999), dentro de las bacterias ácido-
lácticas, los géneros más sobresalientes son Lactobacillus fermentum, 
L. plantarum, Leuconostoc y Weissella. En la periferia de la bola están 
presentes un grupo importante de levaduras y hongos filamentosos. 
De estos microorganismos, alrededor del 70% producen el aroma 
característico del pozol fresco. Un ejemplo claro es el hongo 
Geotrichum candidum (Wacher, 1999). 
 
En la tabla 5 se muestras los principales grupos microbianos 
participantes en la fermentación del pozol. 
 
 
 
 
 
Tabla 5. Principales grupos microbianos encontrados en el 
pozol (Jean –Pierre Guyot. 1999). 
 
 
 
Bacterias Levaduras Mohos 
Achromobacter pozolis Candida guillermondii 
(var.) guillermondi 
Aspergilus flavus 
Aerobacter aerogenes Candida krusei Aerobasidium 
pullulans 
Agrobacterium azotophilum Candida parapsilosis Clodosporium 
herbarum 
Bacillus cereus Candida tropicalis 
(Cast.) 
Fusarium sp. 
Escherichia coli (var.) 
neapolitana 
Hansenula fabiani Geotrichum 
candidum 
Paracolobactrum 
aerogenoides 
Kluyveromyces 
fragilis 
Mucor rouxianus 
Psuedomonas mexicana Saccaromyces 
cerevisiae 
Penicillium 
claviforme 
 Penicillium 
cyclopium 
 Penicillium 
expansum 
 Rhizopus nigricans 
 Trichoderma viride 
 
 
 
Resulta interesante del pozol, que debido a su tratamiento de 
fermentación, además de alargar la vida de anaquel y mejorar las 
características organolépticas del sustrato, tenga mayor contenido de 
proteína, niacina, riboflavina, lisina, triptofano y otros nutrimentos, 
en comparación con los granos de maíz que se utilizan en su 
preparación (Cravioto y col., 1995). Una explicación de este suceso 
es la presencia de dos grupos de bacterias, Agrobacterium 
azotophilium y Klebsiella pneumoniae, cuyo metabolismo incluye la 
fijación del nitrógeno atmosférico (Taboada y col., 1975). 
 
Bolaños (2004) y López (2006) estudiaron la variabilidad 
microbiológicade muestras de pozol de diversos productores. 
Leuconostoc citreum se detectó frecuentemente en las masas de 
pozol. 
 
 
Leuconostoc citreum 
 
L. citreum fue descrita por Farrow y col. (1989), seguida de 
Leuconostoc amelibiosum por Schillinger y col. (1989). En 1992, 
Takashi concluyó que L. amelibiosum es un sinónimo de L. citreum, y 
propuso que el nombre Leuconostoc citreum se mantuviera. 
 
Leuconostoc es un género de bacterias Gram-positivo que pertenece 
al grupo de bacterias ácido-lácticas junto con los géneros 
Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Carnobacterium, Weissella 
y Pediococcus; son generalmente cocos de forma ovoide formando en 
su mayoría cadenas. Leuconostoc sp. es intrínsicamente resistente a 
vancomicina y son catalasa-negativo (lo que hace la distinción con los 
estafilococos). 
 
Todas las especies dentro de este género son heterofermentativas, es 
decir, fermentan carbohidratos para producir en su mayoría ácido 
láctico y cantidades considerables de ácido acético, alcohol etílico, 
dióxido de carbono y de manera ocasional, ácido fórmico. Por esta 
razón estos organismos se han utilizado desde la antigüedad como 
agentes para la preservación de alimentos, entre los que se 
encuentran una gran variedad de productos lácteos, cárnicos y 
vegetales fermentados. Son también productoras de dextrana a partir 
de la sacarosa. 
 
Actualmente, todas las bacterias pertenecientes a estos géneros 
tienen una condición GRAS (por sus siglas en inglés: Generally 
Recognized as Safe) lo cual permite su libre uso en la producción de 
alimentos de consumo humano. 
 
Los microorganismos pertenecientes a este género son capaces de 
producir enzimas llamadas transferasas (glucosiltransferasas y 
fructosiltransferasas), las cuales al crecer en sacarosa como sustrato, 
participan en la síntesis de exopolisacáridos (EPS) derivados de la 
glucosa y fructosa, denominados dextrana e inulina, respectivamente. 
 
Como se señaló anteriormente, Olivares y col. (2003) identificaron 
por análisis de 16S RNA a la cepa Leuconostoc citreum CW28 aislada 
del pozol por Carmen Wacher, demostrando que produce grandes 
cantidades de fructosiltransferasa asociada a la célula, en presencia 
de sacarosa. De hecho, la actividad transferasa se determinó en 
catorce cepas aisladas del pozol, midiendo los azúcares reductores 
totales, glucosa y fructosa, liberados en el medio de reacción. 
 
 
 
Seis de las 14 cepas presentaron actividad extracelular 
dextransacarasa, dos con asociación a las células con actividad 
dextransacarasa, y sólo la cepa antes mencionada asociada a la 
pared celular, presentó actividad fructosiltransferasa (FTF) de tipo 
inulosacarasa; ésta se registró como CW28. La cepa se incubó en 
presencia de sacarosa para sintetizar el polímero, y posteriormente 
éste fue tratado con inulinasa, lo cual proporcionó información 
adicional del polímero producido por L. citreum CW28, identificado de 
tipo inulina. 
Resulta muy interesante el haber encontrado enzimas con estas 
características estructurales y funcionales, ya que pueden aportar 
beneficios en la composición del pozol, como la síntesis de 
oligofructanos de interés comercial y nutricional, que hasta la fecha 
no han sido considerados. De igual forma otras cepas de Leuconostoc 
sp. podrían dar lugar a la síntesis de dextranas, que como ya se ha 
señalado, al igual que las fructanas pueden considerarse como 
sustancias prebióticas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5. Justificación. 
 
El pozol es una bebida cuyo valor nutricional es mejor que el del 
maíz. Se consume prácticamente en el sur de México, en poblaciones 
rurales y campesinas de bajos recursos económicos. Se consume 
tanto por infantes como por trabajadores siendo un elemento 
importante en su nutrición ya que les proporciona energía suficiente 
para sus actividades diarias, y puede evitar infecciones y diarreas. 
 
Dado que se ha determinado la capacidad de producir oligofructanos 
y oligodextranos por cepas aisladas del pozol, como Leuconostoc 
citreum (López-Munguía, 2004), es de gran interés determinar si 
estas sustancias prebióticas se encuentran en la masa de pozol, o si 
es posible promover su síntesis. De esta manera se estaría 
demostrando un beneficio importante tanto en el consumo de este 
alimento tradicional, como en la industria alimentaria por el uso de 
estos oligofructanos u oligodextranos, como aditivos alimentarios. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6. Objetivos. 
 
General: 
Identificar y cuantificar la presencia de sustancias prebióticas de tipo 
fructanas y glucanas en el pozol tradicional, y analizar la posibilidad 
de promover su producción en pozol adicionando sacarosa a la 
microbiota producida en la fermentación. 
 
Particulares: 
 
• Montar y validar metodologías para la medición de sacarosa, 
fructanas y glucanas en la masa, utilizando como métodos la 
degradación enzimática y la medición del poder reductor así 
como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). 
 
• Cuantificar sacarosa en la masa de nixtamal usada para 
elaborar pozol, para establecer la posibilidad de que se 
sinteticen enzimas inducibles durante la fermentación y de 
encontrar glicanos en el producto. 
 
• Medir la actividad glicosiltransferasa en el pozol. 
 
• Explorar la posibilidad de sintetizar sustancias prebióticas 
adicionando sacarosa a un pozol con actividad transferasa. 
 
• Identificar las sustancias prebióticas de naturaleza microbiana, 
específicamente inulina y dextrana, sintetizadas como 
consecuencia de la actividad transferasa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
7. Hipótesis. 
 
Dado que la sacarosa es el sustrato para la producción de fructanas y 
glucanas en algunas bacterias lácticas (L. citreum), así como inductor 
de las enzimas correspondientes, si su concentración en la masa de 
nixtamal es suficiente en el pozol, se detectarán tanto la actividad 
glucosiltransferasa (GTFs) o fructosiltransferasas (FTFs), como los 
exopolisacáridos que sintetizan; en caso contrario, sería posible 
promover su síntesis mediante la adición de sacarosa al final de la 
fermentación. 
 
 
8. Materiales y Métodos 
 
 
Figura 6A. Estrategia metodológica de la fermentación de masa 
fresca para la determinación de actividad transferasa y 
polímeros sintetizados. 
 
 
 
Figura 6B. Estrategia metodológica de la masa de pozol para la 
determinación de actividad transferasa y polímeros 
sintetizados. 
 
 
 
Masa fresca
                                control
Cuantificación de sacarosa
Determinación de actividad 
transferasa
Fermentación                
(48h ‐ 30ºC)
Determinación de los 
polímeros sintetizados con 
esta actividad
Determinación de pH y de 
actividad transferasa por 
medio de poder reductor
Pozol
                               control
Cuantificación de sacarosa
Determinación de actividad 
transferasa
Síntesis con 5% de sacarosa 
de homopolisacáridos
Determinación de los 
polímeros sintetizados con 
esta actividad
Identificación de homo‐
polímeros por medio 
dehidrólsis enzimática, CCF 
y HPLC
Identificación de los 
polímeros sintetizados 
naturalmente
8.1 Muestreo 
 
Se trabajó con diferentes muestras de masa de pozol, adquirida cada 
una en regiones típicamente productoras del mismo, como: Ixtepec y 
Juchitán, Oaxaca; Mérida, Yucatán; Villahermosa, Tabasco; y Tuxtla 
Gutiérrez, Chiapas (Tabla 6). 
La masa de pozol se obtuvo en mercados municipales el mismo día 
de su producción; se depositó en bolsas de plástico con cierre 
hermético y se mantuvo en refrigeración hasta su procesamiento en 
el laboratorio. 
 
 
Tabla 6. Características de las diferentes muestras de masa de 
pozol usadas en el proyecto. 
 
CIUDAD ESTADO ADQUISICIÓN TIEMPO DE 
FERMENTACIÓN 
Ixtepec Oaxaca Abril 2007 1 día 
Tuxtla Gutiérrez Chiapas Octubre 2007 < 1 día 
Juchitán Oaxaca Diciembre 2006 5-7 díasVillahermosa Tabasco Mayo 2006 2 días 
Mérida Yucatán Noviembre 
2005 
---- 
 
Para la identificación de sustancias prebióticas se llevó a cabo una 
metodología que se basa en tres mediciones: cuantificación de 
sacarosa, determinación de actividad glicosiltransferasa y 
cuantificación de exopolisacáridos, específicamente, inulina y 
dextrana. 
 
 
8.2 Cuantificación de sacarosa 
 
Se mezcló 5 g de cada masa de pozol con 20 mL de H2O destilada a 
60 ºC; se homogenizó a 5000 rpm por 3 minutos (Glas-COL Rotator) 
y se centrifugó a 10000 rpm por 15 minutos (Beckman J2-21M/E 
Centrifuge). El sobrenadante se aforó a 25 mL con agua destilada y 
se congeló la muestra por 4 días (Wacher, 1999). Este procedimiento 
elimina la mayor cantidad de almidón presente en las muestras al 
acelerar su retrogradación. Al término establecido, se descongeló la 
muestra y se realizó la cuantificación indirecta de la sacarosa por 
medio de un ensayo en el que los productos de su hidrólisis son 
detectados espectrofotométricamente tras su conversión en derivados 
coloridos. Dado que la sacarosa es un azúcar no reductor, es 
necesario tratar las muestras con enzima Invertasa para medir el 
poder reductor (PR) por el método del ácido 3,5-dinitrosalisílico 
(DNS) antes y después de su hidrólisis. Éste se basa en la reducción 
del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azúcar reductor, al 
ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo ladrillo) (Chaplin, 1986). 
Su presencia se detecta a 540nm. 
 
La reacción se llevó a cabo mezclando 1 mL de la disolución de pozol 
con 1 mL de invertasa (0.1%) resuspendida en 10 mL de buffer de 
acetatos 0.05 M a pH 4.6, y permitiendo la reacción durante 30 
minutos a 37 ºC. 
 
 
 
 
 
 
 
 
8.3 Determinación de la Actividad Glicosiltransferasa (GTF) 
 
Para medir la actividad GTF en las muestras de pozol, la bola de 
masa se separó en dos lotes; a uno al que se adicionó 5% de 
sacarosa para promover la síntesis de polímero, y el otro sin sacarosa 
fue utilizado como blanco (control). 
 
La adición del 5% de sacarosa cristalina a las muestras de pozol se 
llevó a cabo con una homegenización de 5 minutos (Glas-COL 
Rotatoer) a temperatura ambiente. 
 
De cada lote se tomaron 10 g de masa y se mezclaron con 25 mL de 
buffer de acetatos 0.05 M pH 5.5. El lote adicionado con sacarosa se 
incubó 24 horas a temperatura ambiente antes de su centrifugación, 
mientras que el control se centrifugó inmediatamente a 10000 rpm 
por 15 minutos a 4 ºC. En ambos casos se registró el valor obtenido 
de PR después de la centrifugación. 
 
El aumento en el PR de las muestras después de las 24 horas de 
incubación, sería un indicativo de la actividad transferasa. 
 
Para la recuperación del producto se adicionaron 2 volúmenes de 
etanol industrial por cada volumen de muestra, y se dejó reposar por 
12 horas a 4 ºC. Después del tiempo establecido, se centrifugó en 
una segunda ocasión a 5000 rpm para la recuperación del 
polisacárido y la eliminación de carbohidratos más pequeños, como la 
sacarosa, que permanecen en la solución. El precipitado que se 
obtuvo se disolvió nuevamente en 25 mL de agua destilada para 
identificar el tipo de polímeros formados ya sea durante la 
fermentación o existentes en el pozol. 
 
 
8.4 Caracterización Enzimática 
 
Se llevó a cabo una caracterización de las enzimas hidrolíticas de 
dextranas y fructanas que se utilizaron para la identificación y 
cuantificación de los polímeros extraídos. De esta forma se determinó 
el tiempo óptimo y la cantidad de sustrato adecuada para la 
hidrólisis, y a su vez se establecieron las condiciones con las que la 
dextranasa e inulinasa trabajarían. 
Las condiciones se reportan en la tabla 7. 
 
Tabla 7. Condiciones para el ensayo de las enzimas hidrolasas 
utilizadas para identificar los polímeros extraídos del pozol 
 Dextranasa Inulinasa 
Nombre comercial Dextranasa SIGMA 
D-5884 
Fructozyme L 
Actividad 12.91 (U/mg) 25,3232 (U/ml) 
Dosis3 (mg/ml) 0.1 0.1 
Temp. Hidrólisis (ºC) 40 60 
Sustrato Dextrana Inulina 
Conc. Sustrato 
(mg/mL) 
10 10 
pH 5.5 5.5 
 
 
 
 
 
1 1 Unidad= 1 µmol de isomaltosa (medido como maltosa) por minuto a pH 6, 37 ºC, usando dextrana 
como sustrato 
2 1 Unidad= 1 µmol de fructosa por minuto a pH 4.5, 60 ºC usando sacarosa como sustrato 
3 Dosis se refiere a la cantidad o concentración conocida de una sustancia (en este caso de las enzimas) 
adicionadas a la mezcla de reacción. 
Se estableció el tiempo óptimo de hidrólisis por medio de un ensayo 
en el que se utilizó una solución con 0.1 mg/mL de dextranasa y una 
solución con 0.1 mg/mL de inulinasa, ambos en buffer de acetatos a 
pH 5.5. Al medio de reacción se le adicionó 10 mg/mL de dextrana y 
10 mg/mL de inulina, respectivamente. Las muestras se incubaron 
por 10 horas aproximadamente a 40 y 60 ºC de acuerdo a la enzima 
utilizada. 
Para determinar el tiempo óptimo de actividad enzimática, se 
cuantificó el poder reductor liberado por la hidrólisis enzimática cada 
tres horas. 
Posteriormente se realizó una curva estándar de dextrana y una de 
inulina. En ambos casos se sometieron diferentes concentraciones de 
sustrato (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 10 mg/mL) a una reacción de 
hidrólisis con su respectiva enzima (dextranasa e inulinasa) por 6 
horas aproximadamente, tiempo en el que se obtuvo la mayor 
concentración de equivalentes de monómero. Las condiciones son las 
mismas citadas en la tabla 7. 
 
Para determinar la concentración óptima de actividad enzimática, se 
hidrolizó el sustrato y se cuantificó el poder reductor liberado antes y 
después de 6 horas aproximadamente de reacción. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8.5 Identificación de los Polímeros Sintetizados mediante 
Hidrólisis Enzimática Específica. 
 
Se llevó a cabo una hidrólisis enzimática con la finalidad de distinguir 
si el producto extraído estaba constituido de glucosa o de fructosa. El 
ensayo de la inulosacarasa y dextransacarasa, enzimas específicas 
para la síntesis de inulina y dextrana, se realizó midiendo la velocidad 
de consumo de sacarosa por medio de los azúcares reductores 
liberados en un ensayo anterior (8.4). Una unidad de actividad es 
igual a la cantidad de enzima que libera un μmol de glucosa o 
fructosa en un minuto. 
 
Una vez sintetizados los polímeros, la reacción de hidrólisis se realizó 
con 990 µL de la solución de los homo-polisacáridos extraídos y 10 µl 
de la enzima dextranasa ó inulinasa (0.1% v/v) a 40 ºC y 60 ºC, 
respectivamente. 
 
El PR se determinó por el método de DNS reportado por Miller 
(1959). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8.6 Fermentación de Masa Fresca 
 
Se realizó también una fermentación de masa fresca con la finalidad 
de reproducir el proceso de elaboración de pozol de manera 
controlada en el laboratorio. La masa fresca se obtuvo en Tuxtla 
Gutiérrez, Chiapas, posterior a su molienda y previo a la 
fermentación. El transporte se llevó a cabo de la misma manera que 
las muestras de masa de pozol. 
 
La masa fresca se separó en porciones de 200 g. Cada una se 
envolvió en hoja de plátano previamente flameada y se incubó (NWR 
Scientific Inc. 1550) a 30 ºC por tres días. Se tomaron muestras a los 
tiempos: 0, 3, 6, 9, 12, 24, 48 y 72 horas de fermentación. Se retiró 
una bola en cada tiempo y se tomó muestra en el centro para 
determinar pH, azúcares reductores, actividad glicosiltransferasa y 
polímeros sintetizados. El ensayo se realizó por duplicado. 
 
Determinación de pH 
 
El pH se determinó con un potenciómetro digital (Jenway 3020 pH 
Meter) mezclando 2 g de masa con 18 mL de agua destilada 
previamente neutralizada a pH 7 con NaOH. 
 
Determinación de Azúcares Reductores o Poder Reductor (PR) 
 
Se tomó una alícuota de aproximadamente 2 mL de la mezcla 
anterior (previa neutralización),se centrifugó (Hermle Z 160M) por 5 
minutos a 10000 rpm. La cuantificación se condujo de la misma 
manera que para la masa de pozol, así como la determinación de 
actividad GTF y la identificación de polímeros. El valor de poder 
reductor obtenido se refirió a la masa de pozol usada para realizar el 
ensayo. 
8.7 Identificación de los Polímeros extraídos por CCF y HPLC 
 
El método de azúcares reductores proporciona información sobre la 
actividad transferasa, así como de los monómeros producidos por la 
ruptura específica de la dextrana e inulina. Sin embargo, la 
cromatografía en capa fina (CCF) y la cromatografía líquida de alto 
rendimiento (HPLC) proveen información más específica al respecto, 
es decir, la identidad de los monómeros. 
 
De las diferentes muestras de masa de pozol de acuerdo al origen, se 
tomó una de las que presentaron resultados más altos (mayor 
concentración) en cuanto a la concentración de polímeros 
sintetizados, así como mayo frescura, y se empleó para realizar un 
análisis en CCF, que determina cualitativamente la formación de 
polímeros y la producción de monómeros. También se realizó un 
análisis en HPLC para definir el tamaño de los polímeros formados, 
así como de las fructanas, glucanas y oligosacáridos producidos por la 
hidrólisis. 
 
Cromatografía en Capa Fina 
 
En una placa de sílica se colocó 1 μL de muestra en cada carril 
previamente marcado. Se introdujo la placa en una cámara de vidrio 
con 15 mL etanol, 9 mL de butanol y 6 mL agua destilada, como fase 
móvil. Después de 30 minutos, se retiró la placa del solvente, se 
roció la placa con α-naftol y se reveló en una estufa a 360 ºC. 
 
 
 
 
 
 
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) 
 
Los polímeros se analizaron en un equipo Waters, con un detector de 
IR a 32 Inyección Rehodyne y una bomba controladora de 600E. Se 
utilizó una columna Ultrahidrogel (Pharmacia). Como fase móvil se 
utilizó una solución de nitrato de sodio 0.1 M con un flujo de 0.8 
mL/min a 35 °C. 
 
Los hidrolizados fueron analizados en una columna aminada, 
Carbohydrate High Performance de 4.6 x 250 mm. Se utilizó un 
detector de IR con sensibilidad de 64, a una temperatura de 35 ºC. 
La fase móvil consistió de acetonitrilo-agua en una proporción de 
80:20 y con un flujo de 1 mL/min. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9. Resultados y Discusión 
 
9.1 Cuantificación de Sacarosa 
 
Se buscó la presencia de sacarosa en el pozol ya que ésta induce las 
enzimas transferasas y es el sustrato para la síntesis de fructanas o 
glucanas. 
 
Para determinar la presencia de sacarosa se agregó invertasa (0.1%) 
a soluciones preparadas a partir de extractos de pozol y de nixtamal. 
Como los resultados de la hidrólisis, se obtuvo una concentración 
baja de sacarosa en el pozol comparada con la del maíz 
nixtamalizado (tabla 8). Resulta interesante notar que la 
concentración de sacarosa en el nixtamal, es también menor 
comparada con el maíz crudo, en donde se reporta un 2% de 
sacarosa en peso seco aproximadamente (Wacher, 1999). 
 
Tabla 8. Concentración de sacarosa en maíz nixtamalizado y 
en pozol (mg/100mg de producto fresco). 
 
 Maíz Crudo Nixtamal Pozol 
% sacarosa 2 
(Moreiras.1996) 
0.49 ± 0.058 0.028 ± 0.01 
Se analizaron 6 muestras de nixtamal y 6 muestras de pozol. El 
resultado está expresado en base húmeda. 
 
 
 
La razón por la que en el nixtamal hay menor cantidad de sacarosa 
en comparación con el maíz crudo, se debe sin duda a que el 
tratamiento de nixtamalización arrastra los azúcares solubles y de 
bajo peso molecular del maíz. Una vez que el nixtamal se expone a la 
fermentación, los microorganismos presentes en la masa consumen 
los carbohidratos restantes para su desarrollo y metabolismo. De aquí 
que en el pozol (masa fermentada) haya cantidades insignificantes de 
sacarosa. 
 
No obstante, las enzimas transferasas microbianas requieren de 
sacarosa para realizar la transferencia de monómeros a moléculas 
aceptoras. Dependerá de la concentración de sacarosa el que se lleve 
a cabo la transferencia, o se realicen funciones alternas como la 
hidrólisis y la polimerización. Ortiz Soto (2004) determinó la 
concentración a la cual las enzimas asociadas a células tienen una 
actividad mayor de transferencia sobre la hidrólisis. Esta 
concentración resultó ser de 250 g de sacarosa/L, que es muy 
superior incluso a la que tiene el maíz antes de nixtamalizar. 
 
Se consideraron dos posibilidades a partir de estos resultados para la 
formación de polímeros en la masa de pozol: la primera consiste en 
adicionar sacarosa al pozol ya fermentado para promover la síntesis 
de exopolisacáridos; esto, suponiendo que se produzcan las enzimas, 
pero que la sacarosa no sea suficiente para sintetizar polímeros. La 
segunda posibilidad radica en que durante la fermentación de la masa 
para producir pozol, se sintetizan glicanos a pesar de la baja 
concentración de sacarosa al final de la fermentación. 
 
Ambas hipótesis se exploraron como ensayos experimentales, en los 
que se determinó la actividad glicosiltransferasa, y se cuantificaron e 
identificaron los polímeros. 
 
 
 
 
9.2 Determinación de la Actividad Glicosiltransferasa 
 
Se siguió una metodología para determinar la actividad GTF que se 
basa en la adición de sacarosa a una solución de pozol, así como en 
la cuantificación de la velocidad de aparición de poder reductor 
(Figura 7). Para este experimento, las muestras de las masas de 
pozol se dividieron en dos: en una parte se llevó a cabo la medición 
sin adición de sacarosa para determinar el poder reductor y los 
polímeros preexistentes (control), y en la otra se adicionó 5% de 
sacarosa (con respecto al volumen total) con el fin dejar que las 
enzimas actuasen y se produjera el polímero. Se llevó a cabo una 
incubación a 30 ºC para promover la síntesis de polímeros. 
 
Gráficamente se puede evidenciar con la figura 7 el aumento en el 
poder reductor (PR) durante la incubación. Esto sugiere que la adición 
de sacarosa a la masa de pozol promueve a las enzimas transferasas 
presentes en éste. 
 
 
Figura 7. Evolución promedio del poder reductor en muestras 
de pozol con y sin sacarosa. 
 
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0.350
0 5 10 15 20 25 30 35
tiempo (min)
G
/F
 (g
/L
)
Pozol sin sacarosa (Control) Pozol con sacarosa
La actividad GTF se determinó por medio de la diferencia de PR antes 
y después de la incubación (Tabla 9), es decir, esta actividad 
corresponde a la pendiente de las rectas de la figura 7. El resultado 
es el promedio de las muestras de los pozoles. 
 
Muestra con sacarosa 0.387 U/mL ± 0.053 
Muestra sin sacarosa (control) 0.119 U/mL ± 0.039 
Actividad GiTF 0.268 U/mL ± 0.013 
Tabla 9. Actividad GTF presente en el pozol. 
 
Para determinar la actividad GTF se utilizaron muestras de pozol 
provenientes de Ixtepec, Tuxtla Gutiérrez, Juchitán, Villahermosa y 
Mérida bajo condiciones de incubación controladas: 30 ºC por 24 
horas. 
 
Se obtuvo un valor promedio de 0.27 UmL-1, equivalentes a 0.68 Ug-1 
de pozol de actividad transferasa. 
 
La actividad obtenida en las muestras sin sacarosa (0.119 U/mL) 
puede ser atribuida a otro tipo de actividades enzimáticas presentes 
en el pozol, incluso actuando sobre otros sustratos (por ejemplo, 
almidón). 
 
Si bien esta es la primera evidencia de la existencia de actividad 
transferasa, es necesario demostrar que el poder reductor obtenido 
no proviene de la hidrólisis de sacarosa y que durante esta incubación 
se forman polisacáridos. 
 
 
 
Debido a que en el pozol se han encontrado microorganismos (como 
Leuconostoc citreum) con actividad tanto gluco- como 
fructosiltansferasa (Olivares. 2003), identificar el tipo de actividad y 
el polímero producido no es factible a partir de estos experimentos. 
No obstante, lo que se puede