Evaluacion-de-la-toxicidad-celular-de-tres-sales-de-talio-en-linfocitos-humanos-tratados-in-vitro

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EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD CELULAR DE TRES 
SALES DE TALIO EN LINFOCITOS HUMANOS TRATADOS 
IN VITRO 
CARRERA DE BIOLOGÍA 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
T E S I S 
Que para obtener el título de: 
B I Ó L O G A 
 
 P R E S E N T A 
 Jocelyn Dafne Rodríguez Espitia 
DIRECTOR DE TESIS 
Dr. Juan José Rodríguez Mercado 
Ciudad de México Marzo 2017 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tesis realizada bajo la dirección del Dr. Juan José Rodriguez Mercado, en la Unidad de 
Investigación en Genética y Toxicología Ambiental (UIGTA) L5PA, UMIE-Zaragoza, cuyo 
responsable de la unidad es el Dr. Mario Agustín Altamirano Lozano. Unidad ubicada en la FES 
Zaragoza Campo II, UNAM. Durante el desarrollo de esta investigación se contó con el apoyo 
DGAPA-UNAM, proyecto PAPIIT – IN225216. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES 
VNIVEk'lDAD NAqOl'i.AL 
AVl\"{OhA. DI 
M IX lC'p 
"ZARAGOZA" 
DIRECCIÓN 
JEFE DE LA UNIDAD DE ADMINISTRACiÓN ESCOLAR 
P R E S E N T E. 
Comunico a usted que la alumna RODRíGUEZ ESPITIA JOCEL YN DAFNE, 
con número de cuenta 305118330 , de la carrera de Biología, se le ha fijado el 
día 28 de marzo de 2017 a las 09:00 hrs., para presentar examen profesional, 
el cual tendrá lugar en esta Facultad con el siguiente jurado: 
PRESIDENTE M. en C. LUIS SÁNCHEZ SÁNCHEZ 
VOCAL Dr. JUAN JOSÉ RODRíGUEZ MERCADO 
SECRETARIO Dra. LUCI LA ÁLVAREZ BARRERA IllvotPl. f2a r/¿¡tt lu,+ 
SUPLENTE Dr. HUGO LÓPEZ MUÑOZ ~ ---
M. en C. RODRIGO ANIBAL MATEOS NAVA / / ~ 
El título de la tesis que presenta es: Evaluación de la toxicidad celular de 
SUPLENTE 
tres sales de ta lio en linfocitos humanos tratados in vitro. 
Opción de titulación: Tesis. 
Agradeceré por anticipado su aceptación y hago propia la ocasión para 
saludarle. 
RECIBí 
A T E N T A M E N T E 111 DS 1IB'I'UDIOS '" 
"POR MI RAZA HABLAR ' Es-Pí ; 
Ciudad de Méxic rzo Se ;: 
... o ., 
'" '" '~-~~~~ ... DR. víS2! MENDOZA NÚJ!íHBJ!.;OZA 
DIRECTOR O 1 R E e e ION 
~, ~ 
. VO. BO. 
OFICINA DE EXÁMENES 
PROFESIONALES Y DE GRADO 
M. en C. ARMANDO CERVANTES SANDOVAL 
JEFE DE CARRERA 
 
 
 
 
 
 
 
 
No te rindas que la vida es eso, 
continuar el viaje, perseguir tus sueños, 
destrabar el tiempo, correr los escombros 
y destapar el cielo. 
 
Mario Benedetti. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
Al Dr. Mario Agustín Altamirano Lozano, por permitirme trabajar en la Unidad de 
Investigación en Genética y Toxicología Ambiental (UIGTA) de la FES Zaragoza y por 
abrirme las puertas de su laboratorio. 
 
Mi eterno agradecimiento al Dr. Juan José Rodriguez Mercado por haberme aceptado 
como alumna y tesista, por sus enseñanzas, paciencia, comprensión y sobre todo por el 
apoyo que me dio en estos años trabajando con usted, es difícil escribir en un párrafo 
cuanto me ha aguantado y ayudado así que solo diré, MUCHAS GRACIAS POR TODO. 
 
A la Dra. Lucila Álvarez Barrera por sus observaciones, por el apoyo y el ánimo que siempre 
me dio para que saliera adelante. 
 
Al M. en C. y C. a Dr. Rodrigo Anibal Mateos Nava por toda la ayuda prestada en la 
elaboración de este trabajo, gracias por todas las pláticas, por todos los consejos, por 
siempre tener las palabras correctas para que yo saliera adelante, pero sobre todo gracias 
por la enorme amistad que me llevo de ti, gracias. 
 
A mis sinodales, M. en C. Luis Sánchez Sánchez, Dr. Hugo López Muñoz por el tiempo 
dedicado a la revisión de este trabajo. 
 
A todo el Laboratorio 5-PA de la UMIEZ, pero en especial a la Maestra Verónica, Julio, 
Adriana, Yazmin, Lilia, Yamile, Heriberto, Adolfo, Esaú, Víctor, Angélica, por hacer que las 
risas, los buenos momentos y la buena amistad fueran algo que se vivía día a día en el 
laboratorio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
A mis padres Francisco Rodriguez Tavares y Ana Guadalupe Espitia Aguilar, gracias por 
siempre hacer que saliera adelante, gracias por ser mi ejemplo, por ser el pepe grillo de 
mi cabeza, pero sobre todo gracias mamá por todas las pláticas, los abrazos, los regaños 
sé que sin ti no hubiera podido llegar hasta aquí, tu eres mi mayor modelo a seguir. Espero 
que algún día se sientan orgullosos de mí, así como yo lo soy de que sean mis padres, los 
amo. 
 
A mis hermanos Francisco Adrián Rodriguez Espitia y Ana Sarahy Rodriguez Espitia, gracias 
por las risas, los buenos y malos momentos y aunque hemos sido como perros y gatos, 
siempre estamos juntos, espero que no solo lleguen hasta donde estoy yo, sino que sean 
algo mejor que yo. 
 
A mis amigos de la FES Zaragoza, Sole Yered Ruiz García, Alejandra Liliana Gómez Paz, 
Alejandra Elizabeth Morales Rivera, Gabriela Islas López y Luis Felipe San Marino Cid 
Aguilar. Gracias por toda una carrera de alegrías, de frustraciones, gracias de experiencias 
que nos han llevado hasta aquí y gracias por los recuerdos que siempre estarán en mi 
memoria. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para: 
 
Margarito Espitia Aragón y Ana Aguilar Paredes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE 
1. Resumen ……………………………………………………………………………………………………………………… v 
2. Introducción ………………………………………………………………………………………………………………. 6 
3. Marco teórico ………………………………………………………………………………………………………………. 6 
3.1 Toxicidad celular……………………………………………………………………………………………… 7 
3.1.1 Viabilidad celular……………………………………………………………………..…… 9 
3.1.2 Apoptosis……………………………………………………………………………………. 11 
3.1.3 MTT…………………………………………………………………………………………….. 13 
3.1.4 Índice mitótico………………………………………………………………............... 15 
3.2 Metales…………………………………………………………………………………………………………. 16 
3.3 Talio………………………………………………………………………………………………………………. 17 
3.3.1 Toxicidad celular del Tl……………………………………………………………….. 19 
3.4 Componentes sanguíneos y linfocitos como modelo de prueba……………………. 20 
4. Planteamiento del problema………………………………………………………………………………………. 23 
5. Hipótesis…………………………………………………………………………………………………………………….. 23 
6. Objetivos…………………………………………………………………………………………………………………….. 24 
6.1 General…………………………………………………………………………………………………………. 24 
6.2 Particulares…………………………………………………………………………………………………… 24 
7. Material y métodos……………………………………………………………………………………………………. 25 
7.1 Reactivos………………………………………………………………………………………………………. 25 
7.2 Obtención de muestra………………………………………………………………………………….. 25 
7.3 Separación de linfocitos………………………………………………………………………………… 25 
7.4 Cultivos y tratamientos…………………………………………………………………………………. 25 
7.5 Viabilidad celular con CFDA/BrEt…………………………………………………………………… 26 
7.6 Prueba de apoptosis con NA/BrEt…………………………………………………………………. 27 
7.7 Viabilidad por MTT………………………………………………………………………………………… 28 
 
7.8 Proliferación celular mediante IM………………………………………………………............ 29 
7.9 Análisis estadístico………………………………………………………………………………………… 31 
8. Resultados………………………………………………………………………………………………………………….. 33 
8.1 Viabilidad celular con CFDA/BrEt……………………………………………………………………33 
8.2 Apoptosis con NA/BrEt………………………………………………………………………………….. 36 
8.3 Viabilidad por MTT………………………………………………………………………………………… 50 
8.4 Índice mitótico………………………………………………………………………………………………. 53 
9. Discusión …………………………………………………………………………………………………………………. 56 
9.1 Efecto sobre la viabilidad celular evaluada con CFDA/BrEt….………………………… 56 
9.2 Efecto de muerte celular por apoptosis con NA/BrEt…………………………………….. 59 
9.3 Efecto sobre la viabilidad celular evaluada con MTT……………………………………… 61 
9.4 Efecto sobre la proliferación celular evaluando el IM……………………………………. 62 
10. Conclusiones...…………………………………………………………………………………………………………. 66 
11. Referencias bibliográficas…………………………………………………………………………………………. 68 
12. Anexos……………………………………………………………………………………………………………………… 76 
12.1 Anexo A. Viabilidad celular con la técnica de CFDA/BrEt.....…..……………………... 76 
12.2 Anexo B. Apoptosis con la técnica de NA/BrEt………………………………………………. 77 
12.3 Anexo C. Índice de muerte con la técnica de NA/BrEt………………..…………………. 80 
12.4 Anexo D. Viabilidad celular con la técnica de MTT…………………………………….….. 82 
12.5 Anexo E. Índice mitótico………………………………………………………………….……………. 84 
 
 
 
 
 
i 
FIGURAS 
 Pág. 
Figura 1. Diagrama de la célula que ilustra los parámetros usados para medir la citotoxicidad y el 
correspondiente orgánulo afectado. LDH es lactato deshidrogenasa, MTT es 3-(4,5-
dimetiltiazo 1-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio. 
 
8 
Figura 2. 
 
Estructura química de diacetato carboxifluoresceina, un compuesto que al entrar en la 
célula el diacetato (DA) es hidrolizado por esterasas intracelulares, mientras que la 
carboxifluoreceina (CF) se agrupa dentro de la célula lo que permite que emita una 
fluorescencia de color verde. 
 
10 
Figura 3. En A se muestra la estructura química del bromuro de etidio y en B se observa una cadena 
doble de ADN que al estar en contacto con el bromuro de etidio (BrEt) se une mediante 
un proceso de intercalación en las pares de bases. 
 
10 
Figura 4. Comparación entre el proceso de apoptosis y necrosis en la célula, en la necrosis hay 
inflamación de la célula y cambios en la morfología mitocondrial y desintegración celular, 
mientras que en la apoptosis hay condensación de la cromatina y fragmentación de la 
célula en cuerpos apoptóticos. 
 
11 
Figura 5. Estructura química de naranja de acridina (NA), el cual al estar en contacto con cadenas 
sencillas de ADN y ARN se unen a los grupos fosfatos formando agregados que emiten 
coloración roja; cuando la NA entra en contacto con la doble cadena de ADN se une 
mediante enlaces iónicos con los pares de bases emitiendo fluorescencia de color verde. 
 
12 
Figura 6. Reacción de reducción de MTT a formazán. Cuando el MTT entra en las células el NADH 
se oxida para formar NAD+ liberando electrones que son tomados por el MTT el cual se 
reduce para formar cristales de formazán. 
 
14 
Figura 7. Microfotografía de leucocitos humanos cultivados in vitro donde se pueden observar 
células que se encuentran en interfase y células que se encuentran en metafase las cuales 
se distinguen por la presencia de los cromosomas condensados. 
 
15 
Figura 8. Microfotografía que muestra células de linfocitos humanos con la técnica de CFDA/BrEt, 
observadas al microscopio de fluorescencia a 40X. Las células viables se distinguen de las 
no viables por su coloración, donde las primeras tiñen de verde y células no viables de 
rojo. 
 
27 
Figura 9. Microfotografía de células de linfocitos humanos con la técnica de NA/BrEt. 
 
28 
Figura 10. Microfotografía de una microplaca de 96 pozos donde se observa el sobrenadante de los 
cultivos celulares tratados con compuestos de Tl, después de haber sido incubados 
durante 4 h con MTT. 
 
29 
Figura 11. Microfotografía de linfocitos humanos cultivados y cosechados para obtener células en 
metafase. 
 
30 
Figura 12. Diagrama de flujo donde se muestra las metodologías empleadas para evaluar toxicidad 
celular. 
 
32 
 
ii 
Figura 13. Viabilidad celular de linfocitos humanos tratados con distintas concentraciones de acetato 
de talio(I) y la técnica de CFDA/BrEt. 
 
33 
Figura 14. Viabilidad celular de linfocitos humanos tratados con distintas concentraciones de sulfato 
de talio(I) y la técnica de CFDA/BrEt. 
 
34 
Figura 15. Viabilidad celular de linfocitos humanos tratados con distintas concentraciones de 
tricloruro de talio(III) y la técnica de CFDA/BrEt. 
 
35 
Figura 16. Viabilidad celular, células en apoptosis temprana o apoptosis tardía y células necróticas 
de linfocitos humanos tratados con distintas concentraciones de acetato de talio(I) y la 
técnica de NA/BrEt. 
 
37 
Figura 17. Viabilidad celular, células en apoptosis temprana o tardía y células necróticas tratadas con 
distintas concentraciones de acetato de talio(I) y la técnica de NA/BrEt, durante 2 h de 
exposición. 
 
38 
Figura 18. Viabilidad celular, células en apoptosis temprana o tardía y células necróticas tratadas con 
distintas concentraciones de acetato de talio(I) y la técnica de NA/BrEt, durante 4 h de 
exposición. 
 
38 
Figura 19. Viabilidad celular, células en apoptosis temprana o tardía y células necróticas tratadas con 
distintas concentraciones de acetato de talio(I) y la técnica de NA/BrEt, durante 8 h de 
exposición. 
 
39 
Figura 20. Viabilidad celular, células en apoptosis temprana o tardía y células necróticas tratadas con 
distintas concentraciones de acetato de talio(I) y la técnica de NA/BrEt, durante 24 h de 
exposición. 
 
39 
Figura 21. Viabilidad celular, células en apoptosis temprana o tardía y células necróticas de linfocitos 
humanos tratadas con distintas concentraciones de sulfato de talio(I) y la técnica de 
NA/BrEt. 
 
41 
Figura 22. Viabilidad celular, células en apoptosis temprana o tardía y células necróticas tratadas con 
distintas concentraciones de sulfato de talio(I) y la técnica de NA/BrEt, durante 2 h de 
exposición. 
 
41 
Figura 23. Viabilidad celular, células en apoptosis temprana o tardía y células necróticas tratadas con 
distintas concentraciones de sulfato de talio(I) y la técnica de NA/BrEt, durante 4 h de 
exposición. 
 
42 
Figura 24. Viabilidad celular, células en apoptosis temprana o tardía y células necróticas tratadas con 
distintas concentraciones de sulfato de talio(I) y la técnica de NA/BrEt, durante 8 h de 
exposición. 
 
42 
Figura 25. Viabilidad celular, células en apoptosis temprana o tardía y células necróticas tratadas con 
distintas concentraciones de sulfato de talio(I) y la técnica de NA/BrEt, durante 24 h de 
exposición. 
 
43 
Figura 26. Viabilidad celular, células en apoptosis temprana o tardía y células necróticas de linfocitos 
humanos tratadas con distintas concentraciones de tricloruro de talio(III) y la técnica de 
NA/BrEt. 
44 
 
iii 
 
Figura 27. Viabilidad celular, células en apoptosis temprana o tardía y células necróticas tratadas con 
distintas concentraciones de tricloruro de talio(III) y la técnica de NA/BrEt, durante 2 h de 
exposición. 
 
45 
Figura 28. Viabilidad celular, células en apoptosis temprana o tardía y células necróticas tratadas con 
distintas concentraciones de tricloruro de talio(III) y la técnica de NA/BrEt, durante 4 h de 
exposición. 
 
45 
Figura 29. Viabilidad celular, células en apoptosis temprana o tardía y células necróticas tratadas con 
distintas concentraciones de tricloruro de talio(III) y la técnica de NA/BrEt, durante 8 h de 
exposición. 
 
46 
Figura 30. Viabilidad celular, células en apoptosis temprana o tardía y células necróticas tratadas con 
distintas concentraciones de tricloruro de talio(III) y la técnica de NA/BrEt, durante 24 h 
de exposición. 
 
46 
Figura 31. Índice de muerte de linfocitos humanos tratados con distintas concentraciones de acetato 
de talio(I) y la técnica de NA/BrEt. 
 
48 
Figura 32.- Índice de muerte de linfocitos humanos tratados con distintas concentraciones de sulfato 
de talio(I) y la técnica de NA/BrEt. 
 
49 
Figura 33. Índicede muerte de linfocitos humanos tratados con distintas concentraciones de 
tricloruro de talio(III) y la técnica de NA/BrEt. 
 
49 
Figura 34. Índice de muerte de linfocitos humanos tratados con distintas concentraciones de acetato 
de talio(I), sulfato de talio(I) y tricloruro de talio(III) y la técnica de NA/BrEt. 
 
50 
Figura 35. Viabilidad celular de linfocitos humanos tratados con distintas concentraciones de acetato 
de talio(I) y la técnica de MTT. 
 
51 
Figura 36. Viabilidad celular de linfocitos humanos tratados con distintas concentraciones de sulfato 
de talio(I) y la técnica de MTT. 
 
52 
Figura 37. Viabilidad celular de linfocitos humanos tratados con distintas concentraciones de 
tricloruro de talio(III) y la técnica de MTT. 
 
52 
Figura 38. Índice mitótico en cultivos de linfocitos humanos tratados durante 24 h con acetato de 
talio(I); y puestos a proliferar durante 72 h. 
 
54 
Figura 39. Índice mitótico de cultivos de linfocitos humanos tratados durante 24 h con sulfato de 
talio(I) e incubados durante 72 h. 
 
54 
Figura 40 Índice mitótico en cultivos de linfocitos humanos tratados durante 24 h con tricloruro de 
talio(III); y puestos a proliferar durante 72 h. 
 
55 
 
 
 
 
iv 
 
CUADROS 
 Pág. 
 
Cuadro I. Cantidad de iones de talio(I) y talio (III) en los compuestos evaluados 
 
58 
Cuadro II. Sensibilidad de los ensayos citotóxicos utilizados para evaluar los compuestos de Tl 
a diferentes tiempos de exposición. 
 
65 
Cuadro A-I. Evaluación de la viabilidad celular en cultivos de linfocitos humanos tratados con 
acetato de talio(I), sulfato de talio(I) o tricloruro de talio(III), usando tinción dual de 
CFDA/BrEt. 
 
76 
Cuadro B-I. Evaluación de células viables, células en apoptosis temprana (Apo-tem) o apoptosis 
tardía (Apo-tar) y células necróticas en cultivos de linfocitos humanos tratados con 
acetato de talio(I) usando tinción dual de NA/BrEt. 
 
77 
Cuadro B-II. Evaluación de células viables, células en apoptosis temprana (Apo-tem) o apoptosis 
tardía (Apo-tar) y células necróticas en cultivos de linfocitos humanos tratados con 
sulfato de talio(I) usando tinción dual de NA/BrEt. 
 
78 
Cuadro B-III. Evaluación de células viables, células en apoptosis temprana (Apo-tem) o apoptosis 
tardía (Apo-tar) y células necróticas en cultivos de linfocitos humanos tratados con 
tricloruro de talio(III) usando tinción dual de NA/BrEt. 
 
79 
Cuadro C-I. Evaluación del índice de muerte en cultivos de linfocitos humanos tratados con 
acetato de talio(I) usando tinción dual de NA/BrEt. 
 
80 
Cuadro C-II. Evaluación del índice de muerte en cultivos de linfocitos humanos tratados con 
sulfato de talio(I) usando tinción dual de NA/BrEt. 
 
80 
Cuadro C-III. Evaluación del índice de muerte en cultivos de linfocitos humanos tratados con 
tricloruro de talio(III) usando tinción dual de NA/BrEt. 
 
81 
Cuadro D-I. Evaluación de la viabilidad celular en cultivos de linfocitos humanos tratados con 
acetato de talio(I) con la técnica de MTT. 
 
82 
Cuadro D-II. Evaluación de la viabilidad celular en cultivos de linfocitos humanos tratados con 
sulfato de talio(I) con la técnica de MTT. 
 
82 
Cuadro D-III. Evaluación de la viabilidad celular en cultivos de linfocitos humanos tratados con 
tricloruro de talio(III) con la técnica de MTT. 
 
83 
Cuadro E-I. Evaluación del índice mitótico (IM) en cultivos de linfocitos humanos tratados con 
sales de talio durante 24 h de exposición. 
 
84 
 
 
 
v 
1. RESUMEN 
En la actualidad hay diversas técnicas que permiten conocer los efectos adversos en las células 
producidos por substancias que se sospeche tengan potencial citotóxico. Estas técnicas evalúan 
cambios en la morfología o bien en la función celular. Los ensayos de viabilidad evalúan lesiones 
en la membrana celular, alteraciones en el funcionamiento mitocondrial o de otros organelos, 
hasta la muerte de la célula. Algunos metales que no son esenciales para la vida tienen efectos 
tóxicos sobre las células y los seres vivos. El talio (Tl) es un metal pesado, con dos estados de 
oxidación (I y III), considerado no esencial que al contacto con los mamíferos es rápidamente 
absorbido y compite con cationes esenciales. Debido a lo anterior el objetivo de la presente 
investigación fue evaluar la toxicidad celular del acetato de talio(I), sulfato de talio(I) y tricloruro 
de talio(III) en linfocitos humanos tratados in vitro utilizando diferentes pruebas de citotoxicidad: 
viabilidad, proliferación y apoptosis. Por lo que, se utilizaron cuatro protocolos: para viabilidad 
celular la combinación de dos fluorocromos (CFDA/BrEt) y el método colorimétrico bromuro de 
3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT), para muerte celular el análisis con naranja de 
acridina/BrEt y para conocer efectos sobre la proliferación la evaluación del índice mitótico. Se 
obtuvieron muestras de sangre de donadores sanos, se separaron los linfocitos y se dieron 
tratamientos de 0.5, 1, 5, 10, 50 y 100 µg/mL con acetato de talio(I), sulfato de talio(I) o tricloruro 
de talio(III); en todos los casos se contó con un testigo negativo (sin tratamiento) y un testigo 
positivo (tratado con 228.36 µg/mL de cloruro de cadmio). Las células estuvieron expuestas 
durante 0, 2, 4, 8 o 24 h a las diferentes concentraciones de los compuestos de Tl. Los resultados 
muestran que los tres compuestos reducen la viabilidad desde las 2 h y en todas las 
concentraciones a partir de las 4 h de exposición (P < 0.05) con la prueba de CFDA/BrEt, NA/BrEt 
y MTT; además, el análisis de muerte celular muestra un incremento de células con apoptosis y 
necrosis, la cual depende de la concentración, del tiempo de exposición y el estado de oxidación 
del metal. Los datos del IM indican que las tres sales reducen el IM y disminuyen la capacidad de 
las células para poder entrar en proliferación. Esto demuestra que el Tl puede afectar el 
metabolismo de la célula, inducir daño en la membrana celular y muerte celular (por apoptosis o 
necrosis), además de afectar el proceso de división celular; todo lo anterior a bajas 
concentraciones y tiempos cortos de exposición. De lo anterior se puede concluir que el Tl induce 
un efecto citotóxico en sus dos principales estados de oxidación (I y III), con un comportamiento 
dependiente de la concentración y del tiempo de exposición. 
 
 
6 
2. INTRODUCCIÓN 
La palabra toxicología se puede definir como aquella ciencia que se encarga del estudio, 
identificación y cuantificación del efecto de agentes químicos de origen natural o sintético, que 
tengan la propiedad de reaccionar con la biología de los seres vivos y en particular con la del ser 
humano. Estos agentes tóxicos al entrar en contacto con los sistemas biológicos en 
concentraciones no habituales o altas, pueden llegar a ocasionar daños en la salud, el desarrollo, 
la reproducción, y a nivel celular en los organelos, así como en las rutas metabólicas o sobre las 
moléculas (Repetto y Repetto 2009, Guitart y Giménez 2012). 
Una rama de la toxicología que ha tomado importancia es la toxicología ambiental, debido al 
aumento de agentes tóxicos a los que se encuentran expuestos cualquier forma de vida. Esta se 
encarga de estudiar los efectos adversos de diversos agentes, siendo estos indicadores 
importantes que se toman en cuenta para las guías de la salud ambiental y la salud en el trabajo 
(Guerrero-Lucio 2011). De esta manera se establecen niveles de exposición que sean seguros 
para los trabajadores y la población en general, no obstante, es necesario el uso de pruebas 
novedosas que brinden información acerca de las propiedades tóxicas y su efecto a distintos 
niveles incluyendo el celular y así predecir los riesgos que estos agentes representan (NRC 2006). 
De manera tradicional se ha seguido el uso de modelos experimentales in vivo para el análisis de 
ciertos agentes, los cuales son administrados en animales conla finalidad de buscar reacciones 
que puedan ser extrapoladas al humano. Sin embargo, los usos de estos modelos de estudio han 
tenido argumentos en contra; ejemplo es que existen muchas diferencias metabólicas entre los 
animales y los humanos, lo cual resulta en cambios sustanciales en los efectos tóxicos, otro 
argumento es que los modelos animales han sido altamente estandarizados mientras que los 
humanos poseen fuertes diferencias interindividuales (Ferro y Doyle 2001). Por la razón anterior, 
el uso de células humanas cultivadas es una de las alternativas más recurrentes y confiables. 
3. MARCO TEÓRICO 
En las últimas décadas se han desarrollado nuevas tecnologías como los cultivos de diversos tipos 
celulares. Algunas de las ventajas en la utilización de estas pruebas es que son económicas, se 
reducen las limitantes en la relación entre especies y se evita el uso de animales de 
experimentación. En los cultivos celulares se efectúan amplios estudios toxicológicos como son 
las pruebas de biotransformación de xenobióticos, genotoxicidad, citotoxicidad, muerte celular 
por necrosis o apoptosis, efectos inducidos por estrés oxidante y radicales libres, por mencionar 
algunos (Wilson 1986, Ferro y Doyle 2001). 
Los ensayos de toxicidad in vitro permiten realizar el seguimiento de los cambios en la 
homeostasis celular provocada por los agentes de interés, mediante la estimación de la toxicidad 
celular con pruebas que incluyan cambios en la estructura y la función, tal como evaluaciones de 
 
7 
la viabilidad celular, la integridad de la membrana plasmática o la actividad metabólica (Pooga et 
al 2002). 
El término de toxicidad celular indica procesos complejos que abarca desde la alteración y el mal 
funcionamiento de una población celular hasta la muerte de la célula (Pooga et al 2002), de 
manera general este concepto se aplica cuando la célula es afectada por un agente sea químico, 
físico o biológico, este proceso puede ser evaluado con ensayos que son llamados generalmente 
pruebas de citotoxicidad. 
3.1. Toxicidad celular 
Las pruebas de citotoxicidad in vitro han tenido mayor reconocimiento como un indicador 
efectivo de perjuicios sobre los tejidos, los órganos, los sistemas hasta el organismo completo. 
Se aplican en la evaluación de nuevos químicos, medicamentos, anticuerpos, contaminantes 
ambientales, metales y compuestos metálicos, en donde la evaluación de la proliferación, la 
viabilidad y la muerte celular son de los parámetros más empleados. Lo anterior debido a que 
son importantes para comprender los efectos que sean capaces de producir los agentes que se 
sospeche tengan actividad tóxica. Las pruebas in vitro se pueden llevar a cabo en diferentes 
modelos de prueba como bacterias, levaduras, vegetales, líneas celulares y células provenientes 
de órganos completos; permitiendo analizar el comportamiento de las células en un ambiente 
más controlado (Burton 2005, Freshney 2011, Acevedo-Fernández et al 2013). 
Algunos tipos frecuentes de daño morfológico y bioquímico en la célula que constituyen una 
respuesta toxica son: 
 La inflamación como una respuesta local frecuente a productos químicos o una lesión 
tisular sistémica. 
 La necrosis usada para describir procesos de muerte en tejidos o células que puede 
resultar en varios procesos patológicos como daño a la membrana, unión de metabolitos 
reactivos, inhibición de las síntesis de proteínas y daño en el material genético. 
 La inhibición de enzimas, que puede alterar las vías biológicas vitales produciendo una 
deficiencia en la función normal de las células. 
 Desacoplamiento bioquímico el cual tiene que ver con la síntesis de moléculas fosfato de 
alta energía. 
 La síntesis de substancias letales, las cuales poseen estructura similar a la de los 
substratos biológicos normales que son incorporados dentro de las vías bioquímicas y 
metabolizadas a productos tóxicos. 
 La peroxidación lipídica en las membranas biológicas por radicales libres generando 
eventos que causan disfunción y muerte celular; como la oxidación de ácidos grasos a 
hidroperóxidos lipídicos pasando por la degradación a diversos productos incluidos 
aldehídos tóxicos. 
 
8 
 La interacción con los receptores a nivel celular o macromolecular con estructuras 
químicas específicas que pueden modular efectos biológicos normales los cuales pueden 
ser estimulante o inhibitorio como los efectos en los canales de calcio. 
 Neoplasia, que conducen a alteraciones del tejido y que están relacionadas con el control 
en los mecanismos de división, de proliferación y del crecimiento celular (Ballantyne et al 
1993, Repetto 1997). 
La toxicidad celular se puede evaluar a diferentes tiempos, una de las pruebas recomendadas es 
a corto plazo; en ésta usualmente se examinan los efectos sobre los orgánulos celulares, tal 
como, la liberación de sus constituyentes hacia el medio, la absorción de colorantes dentro de la 
célula y la formación de abultamientos en la superficie de las mismas (Figura 1). Por otro lado, a 
mediano y largo plazo, nos permite evaluar tanto el crecimiento, el correcto avance en el ciclo 
celular y la proliferación, la muerte por apoptosis y necrosis, la incorporación de precursores 
radioactivos hacia los constituyentes esenciales de la célula como el ARN y el ADN o la medición 
de proteínas con función específica (Wilson 1986, Hodgson et al 2004). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ciertos ensayos permiten una observación detallada utilizando marcadores fluorescentes y 
microscopios con epifluorescencia, las imágenes al microscopio no requieren de ardua lectura y 
permiten además la interpretación instantánea. Dependiendo del marcador utilizado, se puede 
evaluar el estado oxidante, la función de la mitocondria, la absorción de un colorante por las 
células muertas o la emisión de fluoresceína de células pre-marcadas. La integridad de la 
membrana es uno de los parámetros comúnmente analizados y la viabilidad de las células es de 
Figura 1. Diagrama de la célula que ilustra los parámetros usados para medir la citotoxicidad y el 
correspondiente orgánulo afectado. LDH es lactato deshidrogenasa, MTT es 3-(4,5-dimetiltiazo 1-2-yl)-
2,5-difeniltetrazolio (tomado y modificado de Hodgson et al 2004). 
 
9 
los más recurridos, el cual permite estimar el daño a corto plazo o el daño progresivo, en 
diferentes tiempos de exposición distinguiendo entre las células vivas, aquellas que están en 
proceso de muerte o bien las muertas (Hodgson et al 2004, Wu 2010, Rodríguez-Mercado et al 
2011). Los ensayos de viabilidad celular han tenido extensas aplicaciones en la evaluación de la 
toxicidad de ciertos tratamientos médicos, la toxicidad de pesticidas e insecticidas y en la 
evaluación de daños ambientales por agentes químicos en los organismos. 
3.1.1. Viabilidad celular 
La utilización de diferentes marcadores fluorescentes es de las técnicas comúnmente usadas para 
evaluar la viabilidad celular; estos ensayos se basan en el uso de una tinción con substratos 
fluorescentes o con la combinación de dos substratos que difieren en su permeabilidad a la 
membrana celular, lo que permite la evaluación de la integridad de la membrana y la actividad 
enzimática intracelular (Boyd et al 2008). La visualización de diferentes tipos de células con estos 
substratos provee una amplia variedad de información acerca de la actividad de la célula y su 
estructura, los cuales son el principal objetivo de estudio. Un ejemplo de substratos fluorescentes 
es el uso de la tinción dual de diacetato de carboxifluoresceina (CFDA) y bromuro de etidio (BrEt). 
El CFDA es un substrato fluorogénico esterificado que se ha utilizado para evaluar la viabilidad de 
diferentes líneas celulares. Es un compuesto hidrofóbico que se difunde a través de la superficie 
de la membrana celular hacia el citoplasma, donde el diacetato (DA) es hidrolizado por esterasas 
intracelularesno específicas, mientras que la carboxifluoresceina fluorescente (CF) se agrupa 
dentro de la célula (Figura 2); la CF al ser hidrófila y tener una carga negativa hacen que 
permanezca dentro de la célula por lo tanto mientras tenga la membrana celular intacta y 
actividad esterasa intracelular mostrará retención de CF y tendrá color verde fluorescente 
(Hoefel et al 2003, Morono et al 2004). 
El bromuro de etidio (BrEt) es un compuesto aromático con grupos amino de carga positiva que 
se une al ADN de manera intercalante entre los pares de bases, en la estructura de la doble 
cadena (Figura 3). La carga positiva parcial de las aminas exocíclicas del etidio intervienen en las 
interacciones de unión del hidrógeno con los grupos fosfatos del ADN. La unión al ADN de estos 
pigmentos mejora la intensidad de la fluorescencia y tiene una mejor vida útil. Es un compuesto 
impermeable a la membrana por lo que no cruza al interior de la célula, pero si ésta tiene fisuras 
en la estructura, el colorante será capaz de entrar y unirse al ADN (Nafasi et al 2007, McLennan 
et al 2013), por lo cual, es un indicador fluorescente de células que tienen comprometida su 
membrana; situación que las puede conducir a la muerte. 
 
 
 
 
10 
Bromuro de 
etidio 
Bromuro de etidio apilado 
entre los pares de bases 
Figura 3. En A se muestra la estructura química del bromuro de etidio y en B se observa 
una cadena doble de ADN que al estar en contacto con el bromuro de etidio (BrEt) se 
une mediante un proceso de intercalación en los pares de bases (tomado y modificado 
de McLennan et al 2013). 
A B 
Figura 2. Estructura química de diacetato de carboxifluoreceina, un compuesto que al 
entrar en la célula el diacetato (DA) es hidrolizado por esterasas intracelulares, mientras 
que la carboxifluoresceina (CF) se agrupa dentro de la célula lo que permite que emita 
una fluorescencia de color verde (tomado y modificado de Hoefel et al 2003). 
Esterasas 
intracelulares no 
especificas 
5- (6- ) CFDA 5- (6- ) CF 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
La combinación de ambos colorantes nos permite conocer la integridad de la membrana celular, 
el CFDA fluoresce a 494 nm de excitación y 521 nm de emisión con una tonalidad verde 
fluorescente, por otro lado, el BrEt fluoresce a 545 nm de excitación y 605 nm de emisión dando 
una coloración roja al núcleo de la célula. De esta manera, bajo el microscopio y el uso de ambos 
colorantes, se puede cuantificar la viabilidad de una población, separando el número de células 
 
11 
Figura 4. Comparación entre el proceso de apoptosis y necrosis en la célula, en la necrosis hay inflamación de 
la célula y cambios en la morfología mitocondrial y una desintegración celular, mientras que en la apoptosis 
hay condensación de la cromatina y la fragmentación de la célula en cuerpos apoptóticos (tomado de Angosto 
2003). 
viables que tiñen de color verde de aquellas que tiñen de color rojo consideradas no viables 
(Heller y Greenstock 1994, Yang et al 1998, Johnson et al 2013). 
3.1.2. Apoptosis 
La muerte celular programada o apoptosis es un proceso celular fundamental que es esencial 
para el desarrollo y el mantenimiento del organismo, su función es la de eliminar aquellas células 
que no son necesarias, que se encuentran dañadas o transformadas mediante su 
autodestrucción sin desencadenar reacciones de inflamación. Este proceso se caracteriza por el 
mantenimiento de las membranas celulares intactas para permitir su eliminación por fagocitosis. 
Cabe mencionar que las células pueden morir por apoptosis o necrosis. Al microscopio, se 
observa que las células que sufren apoptosis exhiben una morfología característica que incluye 
condensación citoplasmática y nuclear, la rotura especifica de proteínas celulares, la 
fragmentación de la célula en cuerpos apoptóticos y la rotura del ADN en fragmentos; mientras 
que las que sufren necrosis son caracterizadas porque las células y sus orgánulos se hinchan 
debido a una alteración en la membrana plasmática para controlar el paso de los iones y el agua, 
éstas se rompen liberando su contenido en el espacio intracelular originando una inflamación a 
tejidos adyacentes (Figura 4) (Angosto 2003, Jordán 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12 
Figura 5. Estructura química de naranja de acridina (NA), el cual al estar en contacto con cadenas 
sencillas de ADN y ARN se unen a los grupos fosfatos formando agregados que emiten coloración roja; 
cuando la NA entra en contacto con la doble cadena de ADN se une mediante enlaces iónicos con los 
pares de bases emitiendo una fluorescencia color verde (modificado de Bacstain 2013). 
Agregado de fluorescencia roja 
de ARN-NA y ADN-NA 
NA 
ARN, ADN de cadena 
sencilla 
Algunas de las características que presentan aquellas células que sufren apoptosis son el 
aumento de la densidad intracelular, las mitocondrias pierden la integridad de la membrana 
liberando citocromo C, hay un incremento en las concentraciones de calcio que se encuentra 
libremente en el citoplasma, aparecen abultamientos en la superficie celular, la cromatina del 
núcleo se degrada, la fosfatidilserina un fosfolípido que se encuentra en la cara interna de la 
membrana se expone a la superficie y la célula se rompe en fragmentos rodeados de membrana 
(cuerpos apoptóticos) (Angosto 2003, Jordán 2003). 
El estudio de la muerte celular, por apoptosis o necrosis, es otro de los parámetros utilizados 
para evaluar la citotoxicidad de algunos agentes químicos. Existen pruebas de exclusión de 
colorante con fluorocromos que, además de darnos información de la viabilidad celular, también 
nos ayudan a diferenciar células que mueren por apoptosis de las que mueren por necrosis 
(McGahon et al 1995). Las células apoptóticas son morfológicamente distintas y fácilmente 
distinguibles en una población celular. La cuantificación de la viabilidad celular y el índice de 
muerte utilizando fluorocromos como naranja de acridina (NA) y BrEt nos permite diferenciar 
células viables de aquellas que sufren muerte por apoptosis o necrosis basándose en la 
morfología y la integridad de la membrana (García-Rodriguez et al 2014). 
 
El NA es un colorante permeable a la membrana, al entrar a la célula se une con la doble cadena 
de ADN intercalándose mediante enlaces iónicos con pares de bases emitiendo una fluorescencia 
de color verde a la longitud de onda de 520 nm; por otra parte, al interactuar con los grupos 
fosfato de la cadena sencilla de ADN o ARN forman un agregado que emite coloración roja que 
puede ser detectada a una longitud de onda de 650 nm (Figura 5). Este tipo de colorante ha sido 
usado para la tinción celular del ADN en estudios de apoptosis (Nafasi et al 2007). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
Como se mencionó anteriormente, debido a que el BrEt al ser un colorante impermeable a la 
membrana nos permite analizar la integridad de la misma y debido a que es un compuesto 
aromático con carga positiva se une al ADN de manera intercalante entre los pares de bases 
(McLennan et al 2013). 
La combinación de ambos colorantes nos permite distinguir las células viables que tiñen de color 
verde uniforme y cuya característica es que presentan una membrana intacta, de las células con 
apoptosis temprana, las cuales siguen manteniendo su membrana celular; sin embargo, 
comienza la condensación de la cromatina por lo que se observan con tonalidad verde y parches 
de color verde intenso. El proceso de apoptosis hace que las células pierdan la integridad de su 
membrana formando burbujas o protuberancias permitiendo la entrada del BrEt. Debido a esto 
las células con apoptosis tardía se observan de color anaranjado con parches de cromatina 
condensada de color naranja intenso distinguiéndolas de las células necróticas que tienen una 
tonalidad roja uniforme (McGahon et al 1995). 
3.1.3. MTT 
La citotoxicidadde ciertos agentes se puede estimar con pruebas de actividad metabólica de la 
célula y de sus orgánulos. Un blanco primario de los agentes tóxicos es la mitocondria, lo anterior 
es debido a la complejidad y los diversos procesos que lleva acabo, entre los que se encuentra el 
transporte y la permeabilidad de la membrana mitocondrial, la proliferación de las mitocondrias, 
así como la fosforilación oxidativa, el ciclo de Krebs y el estrés oxidante, entre otros (O’Brien y 
Haskins 2007). Una de las técnicas empleadas para determinar la citotoxicidad por efectos en 
mitocondria es utilizando sales de tetrazolio como la 3-(4,5-dimetiltiazo 1-2-yl)-2,5-
difeniltetrazolio, conocida como MTT. 
El ensayo colorimétrico de sales de tetrazolio fue descrito inicialmente por Mosmann en 1983. 
Para medir la proliferación y supervivencia de células de mamíferos, este ensayo se basa en la 
reducción celular de las sales de tetrazolio por las enzimas deshidrogenasas de las células activas 
metabólicamente en productos de formazán altamente coloreados, estos productos son 
detectados por la medición de la absorbancia a una longitud de onda de 570 a 590 nm en un 
espectrofotómetro de placas (citado en Verma et al 2010). 
Una de las características de las sales de tetrazolio es que dependen del núcleo del anillo 
cuaternario de tetrazol que tiene una carga positiva debido a la presencia de cuatro átomos de 
nitrógeno, esta unidad está rodeada por tres grupos aromáticos que usualmente son fracciones 
de fenilo. Cuando el MTT entra a la célula se rompe uno de los enlaces de nitrógeno, la enzima 
NADH (nicotinamida adenina dinucleótido en su forma reducida) se oxida liberando uno de sus 
electrones formando NAD+ (nicotinamida adenina dinucleótido en su forma oxidada), este 
electrón se une a la molécula de MTT reduciéndose para formar cristales de formazán (Figura 6). 
La carga positiva del anillo de tetrazolio facilita la trasferencia a través de la membrana 
 
14 
Figura 6. Reacción de reducción de MTT a formazán. Cundo el MTT entra en las células el 
NADH se oxida para formar NAD+ liberando electrones que son tomados por el MTT el cual 
se reduce para formar cristales de formazán (tomado de Riss et al 2013). 
plasmática de las células viables mediante el potencial de membrana y si este no se reduce en el 
citoplasma llega a la membrana interna mitocondrial (Berridge et al 2005, Riss et al 2013). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Estudios realizados en células de mamíferos indican que la enzima NADH está relacionada con la 
reducción del MTT, por lo cual esta reacción no solo muestra información sobre la actividad 
mitocondrial, sino que también nos proporciona información acerca de la actividad metabólica 
de la célula a nivel de citoplasma, lisosoma, endosoma y membrana plasmática; debido a que las 
células vivas o aquellas que presenten un metabolismo celular activo son capaces de producir 
esta enzima. Esta prueba puede ser tomada en cuenta como un indicador que es capaz de 
proveer información sobre la viabilidad celular y la proliferación celular después de una 
exposición a xenobióticos (Berridge et al 2005; Mwanza et al 2009). La sensibilidad que pueden 
tener las células hacia este tipo de agentes es medida comparando un aumento o disminución 
de la actividad metabólica de células que han sido expuestas contra aquellas que no presentan 
ningún tipo de exposición (Van-Meerloo et al 2011). 
Cuando se emplean cultivos en suspensión, de manera general, la prueba de MTT es un ensayo 
colorimétrico a corto plazo cuya función es medir la actividad metabólica de las células vivas, 
donde un incremento o disminución en la actividad de las células resulta en un cambio en la 
cantidad de formazán formado el cual es inversamente proporcional al grado de citotoxicidad 
causado (Summan et al 2006). 
 
 
 
 
15 
Células en metafase 
Células en interfase 
Figura 7. Microfotografía de leucocitos humanos cultivados in vitro donde se pueden observar 
células que se encuentran en interfase y células que se encuentran en metafase las cuales se 
distinguen por la presencia de los cromosomas condensados. 
3.1.4. Índice mitótico 
La citogenética se dedica al estudio de los cromosomas englobando su estructura, organización, 
morfología y fisiología, entre otros aspectos genético-celulares. El índice mitótico (IM) es una de 
las pruebas en citogenética utilizada para evaluar toxicidad celular tanto en sistemas in vivo como 
in vitro. Dicho índice permite conocer la proliferación de un tejido o un cultivo celular. 
El grado de condensación y compactación de los cromosomas en metafase, permite identificar al 
microscopio las células que se encuentran en proceso de división, de esta manera se pueden 
distinguir fácilmente las células que se encuentran en metafase con respecto al total de células 
de una determinada población (Figura 7). 
El IM es usado como biomarcador ya que ha demostrado ser un parámetro eficiente y factible 
para evaluar y comparar el porcentaje de células que ciclan y entran en división celular en 
relación a las que no se dividen. De esta manera, se identifican agentes que modifican la 
progresión mitótica, debido a que bajo condiciones favorables el tiempo del ciclo celular es 
constante y la presencia de agentes tóxicos puede extender la fase de G1 o causar que las células 
entren en G0 temporalmente e incrementar la longitud del ciclo celular (Dean y Danford 1984, 
Alakoç y Eroğlu 2011, Crubelati-Bulla et al 2014). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
16 
La progresión normal del ciclo celular puede ser afectada por la exposición a agentes químicos, 
físicos o biológicos, produciendo alteraciones en la síntesis de ADN y de proteínas, alteraciones 
en los microtúbulos y otros microfilamentos, cambios sobre la función de los orgánelos y 
complejos proteícos, por mencionar algunas, que inducen cambios en el proceso de proliferación 
y de esta manera afectan el porcentaje células en metafase, entre otros aspectos (Garza-Jinich 
et al 1991). 
Algunos compuestos químicos que en su estructura tienen metales alteran el ciclo celular 
retrasando o inhibiendo el proceso de división, afectando la morfología y el metabolismo 
originando daños que ocasionan una baja actividad o la muerte por apoptosis o necrosis (Rossi 
et al 1991). 
3.2. Metales 
Los metales han contribuido en los avances rápidos de algunas industrias como la construcción, 
telecomunicaciones, el cuidado de la salud. Sin embargo, ciertos metales con potencial tóxico, 
por su uso intensivo y su amplia distribución en el ambiente, ocasionan problemas crónicos y 
peligrosos para la salud (Flora 2014). 
Algunos metales de la tabla periódica son considerados metales pesados. Este término es 
referido a un grupo de elementos que presentan una densidad igual o mayor a 5 g/cm3 y varios 
de ellos debido a sus amplios usos y su liberación al ambiente son causantes de problemas 
ecológicos y sobre la salud. Estos se pueden clasificar en dos grupos: 
a) Los micronutrientes: aquellos que son necesarios en pequeñas cantidades para los 
organismos, pero tóxicos después de un límite, como el cobre (Cu), cromo (Cr), magnesio 
(Mn), selenio (Se) y zinc (Zn). 
b) Los no esenciales que son metales sin función biológica reconocida. Dentro de estos 
últimos, se encuentran el cadmio (Cd), mercurio (Hg), plomo (Pb) arsénico (As) y talio (Tl), 
los cuales son además considerados altamente peligrosos por sus diferentes efectos 
tóxicos (Nava-Ruíz y Méndez-Armenta 2011). 
La mayoría de los metales arriba mencionados, se distribuyen de manera natural en el ambiente 
a través de los ciclos geológicos y biológicos. En cuanto a los ciclos geológicos, las rocas y 
minerales que contienen los metales son erosionadas por el viento y el agua de lluvia 
transportando las partículas a ríos y arroyos donde una parte es depositada en el suelo cercano 
o bien llevadas al océanopara convertirse en sedimento marino, otra parte de partículas puede 
ser recolectada en agua de lluvia; los ciclos biológicos incluyen la bio-concentración en las plantas 
y animales lo que permite su incorporación en las cadenas tróficas (Navarro-Aviñón et al 2007, 
Bánfalvi 2011). 
 
17 
Ciertos metales pesados no esenciales, en los sistemas biológicos, pueden mimetizar la función 
de los esenciales y de este modo tener acceso a importantes objetivos moleculares; activando o 
inactivando procesos celulares, procesos bioquímicos específicos y/o receptores en la membrana 
celular y organelos (Rana 2008). Los metales se pueden involucrar mediante la interacción de los 
iones libres metálicos y las células (Goyer y Clarkson 2001). Algunas interacciones producen 
efectos antagónicos, sinérgicos o aditivos que pueden ser manifestados como una toxicidad 
celular directa mediante la presencia de necrosis o apoptosis o producir carcinogenicidad. 
Durante varias décadas las interacciones físicas y químicas de estos con la biología de los seres 
vivos han sido estudiados empleando sistemas experimentales in vivo e in vitro (Nordberg et al 
2007). 
Uno de los metales que ha llamado la atención debido a su elevada toxicidad es el Tl. El modo en 
que el Tl actúa en los organismos no ha sido descrito completamente, pero se conoce que por su 
similitud con el potasio (K+) es rápidamente absorbido y puede interferir en procesos biológicos 
que son dependientes de este ion (Rodríguez-Mercado y Altamirano-Lozano 2013, Flora 2014). 
3.3. Talio 
De acuerdo con la IUPAC (del inglés International Union of Pure and Applied Chemistry) el Tl se 
encuentra ubicado en el grupo 13 de la tabla periódica junto con elementos como el boro (Br), 
aluminio (Al), galio (Ga) e indio (In). Es de color blanco-azulado, suave e insoluble en agua (EPA 
2009). Su número atómico es 81, masa atómica 204.383 g/mol, punto de fusión de 303.5°C, 
punto de ebullición de 1457°C y densidad de 11.85 g/cm3, no se considera esencial para la vida 
ya que no tiene ningún papel en el metabolismo humano, animal o vegetal. El Tl se puede 
encontrar en dos estados de oxidación el Tl+ y Tl+3 [talio(I) y talio(III), respectivamente], siendo el 
Tl+ más estable que el Tl+3. La electronegatividad para Tl es de 2.04, su radio atómico es de 171 
pm y el radio iónico para Tl+ es de 150 pm en tanto que para el Tl+3 es de 89 pm. En la naturaleza 
se puede encontrar el Tl como una mezcla de 29.46 % de isotopo 203Tl y 70.54% de isotopo 205Tl, 
aunque se conocen alrededor de 26 isotopos radioactivos entre los cuales el 201Tl es uno de los 
que se emplean en la medicina (Schoer 1984, Léonard y Gerber 1997, Rodríguez-Mercado y 
Altamirano-Lozano 2013). 
Ambos estados de oxidación pueden formar compuestos orgánicos e inorgánicos que se 
consideren tóxicos para la salud, en el caso del catión taloso (Tl+) lo podemos encontrar 
combinado con acetatos, carbonatos, sulfatos, cloruros, nitratos, ioduros y selenitos. En el caso 
del catión talíco (Tl+3) existen compuestos como acetatos, óxidos, cloruros y nitratos, por 
mencionar algunos (Frattini 2005, Rodríguez-Mercado y Altamirano-Lozano 2013). 
El Tl se encuentra de manera natural a bajas concentraciones en el ambiente, debido 
principalmente a la erosión de minerales que lo contienen, entre los que se encuentran minerales 
de sulfuro de Zn, Pb y Cu como la crookesita y lorandita los cuales contienen aproximadamente 
 
18 
60% de Tl, también se puede encontrar con minerales que contengan potasio como rohaita y 
fangita con 28% y 75% de Tl, respectivamente (Madejón 2013). 
Se estima que en la corteza terrestre las concentraciones van de 0.3 a 0.7 mg/Kg, mientras que 
en la corteza oceánica es de 0.013 mg/Kg (Bannon 2015). En el aire las concentraciones de Tl son 
menores a 1 ng/m3, en aguas continentales es menor a 1 µg/L y aproximadamente de 10-20 µg/L 
en aguas oceánicas. En los sedimentos de ríos se han encontrado concentraciones menores a 
0.07 mg/Kg mientras que en sedimentos de origen marino va de 0.14 a 1.13 mg/Kg de peso seco 
(Wedepohl 2004, Rodríguez-Mercado y Altamirano-Lozano 2013). La concentración máxima 
permisible de Tl en agua potable es de 0.002 mg/L (EPA 2009). 
La producción mundial de Tl es de 10 a 15 toneladas al año. Sin embargo, la principal fuente de 
liberación al ambiente es como desecho en la extracción de otros minerales y metales, por 
ejemplo, en minerales de Zn se estima que se liberan 17 mil toneladas de Tl al año la mayoría 
producidas en Canadá, Europa y EUA. Otra de las fuentes de liberación es como desecho por 
humos en la producción y extracción de carbón donde son liberadas aproximadamente 630 mil 
toneladas. Se estima que el consumo de Tl en EUA en el 2015 fue de 280 Kg con precio de 7400 
dólares por Kg; siendo Alemania y Rusia los principales importadores con el 53 y 45 %, 
respectivamente. En 2011 compañías de exploración descubrieron un gran depósito de Tl puro 
en el noreste de la bahía de Brasil, donde se espera que construya una planta para la extracción 
y producción de este metal (Guberman 2016). 
El Tl ha sido utilizado en la medicina como un agente en el tratamiento de la sífilis, tuberculosis, 
malaria y enfermedades de la piel (Léonard y Gerber 1997). Actualmente el isotopo 201Tl es 
utilizado como agente de contraste para obtener imágenes del miocardio y de otros tejidos. En 
1930 el acetato de Tl fue usado como un agente depilatorio en la crema “koremlu cream” la cual 
fue descontinuada por causar envenenamiento en las personas. En 1972 el sulfato de talio(I) fue 
utilizado como rodenticida e insecticida. Actualmente compuestos de Tl son usados en la 
fabricación de celdas fotoeléctricas, lentes de alta y baja reflectividad, en interruptores 
eléctricos, en la elaboración de termómetros de baja temperatura, en la fabricación de joyería 
de fantasía, también es utilizado en la producción de aleaciones de plomo y plata como 
anticorrosivo y en la fabricación de pirotecnia específicamente en el color verde (Kazantzis 2000, 
Ramsden 2007, Bannon 2015). 
Los organismos, en especial los mamíferos, están expuestos al Tl a través del agua, el aire, el 
suelo y los alimentos contaminados. El ser humano también se encuentra expuesto de manera 
laboral por contacto a polvos, humos y partículas con Tl en los sitios de trabajo. De lo anterior se 
desprende que el Tl puede entrar al organismo por la piel, el tracto digestivo y el sistema 
respiratorio donde tiene una absorción del 80-100% por medio de las mucosas. 
Independientemente de la ruta de exposición el metal es transportado por el torrente sanguíneo 
 
19 
y distribuido a prácticamente todos los tejidos y órganos del cuerpo. En el organismo, afecta el 
hígado, gónadas, médula ósea, corazón, músculo, riñones, bazo, pulmones, estomago, y de 
forma particular tiene efectos perjudiciales sobre el sistema nervioso central y periférico. Es 
capaz de cruzar la barrera placentaria afectando el desarrollo del feto, también puede cruzar la 
barrera hematoencefálica, se deposita en el cerebro donde causa neurodegeneración, 
desmielinización y oxidación lipídica (Cvjetko et al 2010, Rodríguez-Mercado y Altamirano-
Lozano 2013, Thompson 2015). 
Tanto el Tl(I) como el Tl(III) parecen distribuirse de igual manera, en mamíferos no se conoce 
algún proceso metabólico que pueda transformar T(I) a T(III) y viceversa. Este metal es eliminado 
a través de la orina y las heces, también se ha observado que puede eliminarse por el cabello, las 
uñas, la leche materna, las lágrimas y la saliva. Se estima que la vida media de este metal en 
humanos es de 10 días, sin embargo, esto depende del nivel de intoxicación del organismo 
(Cvjetko et al 2010, Rodríguez-Mercado y Altamirano-Lozano 2013, Thompson 2015). 
3.3.1. Toxicidad celular del Tl 
Existen varios mecanismos acerca de la acción tóxica del Tl. Pero, no se conoce un mecanismo 
exactode toxicidad dentro de las células. En el interior del organismo, el Tl puede imitar al ion 
potasio (K+) en la mayoría de los procesos biológicos debido a la similitud del radio iónico (K+, 
radio iónico de 138 pm) y a la incapacidad de la membrana celular para diferenciar estos dos 
cationes; además el Tl sigue las vías de distribución del K+ alterando muchos de los procesos; por 
ejemplo, en la activación de la bomba de (Na+/K+)ATPasa, donde el Tl tiene la capacidad de 
sustituir al K+, ya que tiene una afinidad 10 veces mayor resultando en la disminución en la 
actividad de esta enzima (Britten y Black 1968). A su vez el Tl puede inhibir la entrada y salida del 
K+ en la mitocondria sin afectar al Na+ perturbando así la función mitocondrial. 
Se ha observado que el Tl es capaz de incrementar los niveles de peróxido de hidrógeno y 
aumentar la peroxidación lipídica y estrés oxidante. Los radicales libres inducen peroxidación 
lipídica, altera los lípidos de la membrana celular generando productos reactivos que pueden 
reaccionar con las proteínas y el ADN. Además, el Tl interfiere con la respiración celular por la 
unión a los grupos sulfhídrilos de las enzimas mitocondriales como la piruvato deshidrogenasa, 
succinato deshidrogenasa y lactato deshidrogenasa, permitiendo la permeabilidad de la 
membrana mitocondrial, llevando a las células a presentar edema y vacuolización mitocondrial e 
interfiriendo en procesos metabólicos vitales, alterando el equilibrio de las células. Además, el Tl 
puede actuar como un ácido de Lewis con una afinidad por compuestos orgánicos de azufre, 
causando la pérdida de cabello; la unión de la cisteína por acción del Tl inhibe la queratinización 
del cabello impidiendo el entrecruzamiento de proteínas (Thompson 2015). 
Otro posible mecanismo de toxicidad del Tl es su capacidad de interactuar con el calcio, 
provocando la despolarización de las membranas celulares y afectando la distribución de la 
 
20 
homeostasis del calcio. También interactua con la riboflavina y cofactores a base de riboflavina 
formando un complejo insoluble, disminuyendo la disponibilidad de nucleótidos y por tanto de 
energía, lo que incrementa la peroxidación lipídica con destrucción de neurotransmisores como 
la dopamina, serotonina y el ácido glutámico (Soria et al 1995, Bertram y Bertram 2004), 
mecanismo que se piensa que es el que actúa para producir neuropatía periférica. 
Cuando el Tl se une a la membrana de fosfolípidos cambia la forma de la membrana celular, el 
empaquetamiento de los lípidos, el orden en la bicapa de la membrana y la hidratación de los 
grupos polares. Puede desacoplar la fosforilación oxidativa induciendo la pérdida del potencial 
de membrana de la mitocondria liberando citocromo C, activando caspasas 9 y 3, y provocando 
apoptosis (Cvjetko et al 2010, Flora 2014). 
De acuerdo con Schoer en 1984 otros efectos que son causados por el Tl incluyen la influencia en 
la producción de enzimas y la síntesis de aminoácidos, efectos en los mecanismos de transporte 
y la reducción de la mitosis. 
Estudios en los que utilizan líneas celulares (PC12) de rata, han demostrado que los compuestos 
de Tl(I) y Tl(III) afectan la actividad mitocondrial, aumentan la producción de especies reactivas 
de oxígeno e inducir muerte celular (Hanzel y Verstraeten 2006, Hanzel y Verstraeten 2009), así 
como, alterar la membrana plasmática de hepatocitos e inducir alteraciones citotóxicas, por 
inactivación de la metiltransferasa (Pourahmad et al 2010). 
En cuanto a estudios de citogenética se ha observado, en personas intoxicadas con venenos a 
base de sulfato de talio(I), que el Tl tiene la capacidad de inducir aberraciones cromosómicas 
estructurales (Nikiforov et al 1999), intercambio de cromátidas (Yildirim et al 2005) e induce 
células con micronúcleos (Hantson et al 1997). Existen estudios in vitro que respaldan las 
investigaciones realizadas donde se determina que el talio(I) tiene capacidad clastógena y 
citotóxica ya que es capaz de reducir el índice mitótico y el índice de replicación los cuales son 
parámetros de proliferación (Rodríguez-Mercado et al 2015). 
A pesar de que hay estudios tanto in vivo como in vitro del potencial tóxico del Tl, en la actualidad 
hay poca información sobre el efecto citotóxico que puede ejercer el Tl y sus compuestos. 
Uno de los modelos recurridos para elucidar el mecanismo de acción por el cual actúan los 
agentes químicos y en particular los compuestos metálicos son los cultivos de células sanguíneas 
de humano. 
3.4. Componentes sanguíneos y linfocitos como modelo de prueba 
La sangre es un tejido que se encarga de varias funciones fisiológicas vitales, como lo son el 
transporte y distribución de las substancias esenciales para la vida, como nutrientes, electrolitos, 
hormonas, vitaminas, anticuerpos, oxígeno, dióxido de carbono. La sangre, está formada por una 
 
21 
parte líquida conocida como plasma y por una parte sólida formada por eritrocitos, leucocitos y 
plaquetas, las cuales forman aproximadamente el 60 y 40% del volumen total de la sangre, 
respectivamente (Cabezuelo et al 2009). Los componentes de la sangre humana son el plasma 
donde se encuentran suspendidas las células sanguíneas, los componentes orgánicos como la 
glucosa, albumina, anticuerpos, aminoácidos, lípidos, y los componentes inorgánicos como el 
Na+, K+, Ca++ y otros iones. 
Las células sanguíneas y las plaquetas se forman en la medula ósea por medio del proceso 
hematopoyético, donde los precursores de los linfocitos se originan en la medula ósea, pero 
maduran en el timo (linfocitos T) o en el bazo (linfocitos B). Los eritrocitos son células que carecen 
de núcleo, cuya función es el transporte de gases, poseen altas cantidades de hemoglobina y 
tienen una vida media aproximada de 120 días. Los leucocitos son células nucleadas que se 
pueden dividir en granulocitos como neutrófilos, eosinófilos y basófilos o agranulocitos como 
linfocitos y monocitos. Las funciones que presentan los glóbulos blancos son diversas, los 
neutrófilos combaten la destrucción del tejido por bacterias, los eosinófilos actúan en procesos 
alérgicos y en infecciones por parásitos, los basófilos participan en reacciones alérgicas e 
inflamatorias, los monocitos también llamados macrófagos fagocitan microbios y restos celulares 
después de una infección y los linfocitos tienen una función inmunológica (Meri 2005). 
Los linfocitos son células mononucleadas que miden aproximadamente de 4 a 15 µm, se dividen 
en linfocitos T y linfocitos B los cuales abarcan 70 y 30%, respectivamente. Son una pieza clave 
del sistema inmune, los linfocitos B son los encargados de la producción de inmunoglobulinas o 
anticuerpos, mientras que los linfocitos T son importantes en el mantenimiento del sistema 
inmunológico del cuerpo, además son fundamentales en la lucha contra las sustancias invasoras 
dañinas; se dividen en linfocitos T colaboradores y linfocitos T citotóxicos (García-Tamayo 1997). 
Los linfocitos colaboradores son células que reconocen un antígeno y expresan una respuesta 
que libera substancias como las citocinas que actúan estimulando o suprimiendo la proliferación 
y la diferenciación de otros linfocitos, mientras que los linfocitos T citotóxicos reconocen 
antígenos extraños que están presentes en la membrana celular de otras células y les inducen 
muerte celular por apoptosis (Stevens y lowe 2001). 
El uso de células de sangre periférica humana como los linfocitos han sido usados en las últimas 
décadas para detectar alteraciones cromosómicas inducidas por gran variedad de agentes, 
además estas células se han utilizado en muchos estudios para identificar cambios numéricos y 
estructurales en pacientes que padecen síndromes de inestabilidad cromosómica y observar el 
daño a nivel celular de trabajadores expuestos a substancias potencialmente genotóxicas (Dean 
y Danford 1984, Fenech y Morley1985), también han sido utilizadas en estudios de muerte 
celular por apoptosis o necrosis (Vermes et al 1995), y en la identificación de antígenos (Gros et 
al 2015). 
 
22 
Por su fácil obtención, manejo y abundancia (1 mL de sangre contiene aproximadamente de 2 a 
3 millones de células), los linfocitos de sangre periférica se han usado como sistema de prueba 
para la detección de toxicidad de agentes químicos, físicos y biológicos (Blum y Pabst 2007). Estas 
células se encuentran inicialmente en fase G0 del ciclo celular y la síntesis de ADN comienza entre 
las 12 y 24 h después de la estimulación con un mitógeno como lo es la fitohemaglutinina, lo que 
los hace un buen modelo para conocer el efecto que puedan ejercer substancias químicas que 
en su estructura contengan metales, como lo son los compuestos de Tl. 
 
 
23 
4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
El Tl es un metal tóxico, no esencial, que se libera al ambiente debido a que es utilizado en la 
fabricación de diversos productos que derivan de la industria cementera, metalúrgica y química, 
entre otras. Esto ha provocado que los organismos se encuentren expuestos de manera 
constante al Tl, además el ser humano está en contacto por causas accidentales, maliciosas, 
médica y ocupacional. 
Existen diversos estudios que reportan que este metal es capaz de entrar a las células por 
mecanismos utilizados por cationes esenciales como el potasio, e interfiere con diversos 
procesos celulares. Se conoce que el Tl aumenta los niveles de peróxido de hidrogeno, la 
peroxidación lipídica y causa estrés oxidante, también interrumpe el metabolismo del glutatión 
por su afinidad por los grupos sulfhídrilos, así como de afectar la permeabilidad de la membrana 
celular y mitocondrial, entre otros efectos. No obstante, los datos en la literatura son limitados y 
están enfocados al estado de oxidación I. 
Debido a lo anterior, en este estudio se busca evaluar en cultivos de linfocitos humanos los 
efectos citotóxicos que pueden ejercer ciertos compuestos de Tl utilizando distintas pruebas que 
nos permitan medir alteraciones en la integridad de la membrana, cambios en la actividad 
metabólica y la capacidad proliferativa de las células, después de la exposición a Tl en sus dos 
principales estados de oxidación (I y III). 
 
5. HIPÓTESIS 
El Tl es un metal que puede cruzar las membranas biológicas y alterar la función de los 
componentes celulares, no obstante, la intensidad del efecto tóxico puede intensificarse con el 
estado de oxidación del metal. Por lo tanto, si se aplican sales tal como acetato de talio(I), sulfato 
de talio(I) o tricloruro de talio(III) a cultivos de linfocitos humanos, se producirán efectos 
citotóxicos los cuales estarán relacionados con daño en la membrana, alteración en la actividad 
mitocondrial, cambios en la proliferación e inducción de muerte celular. 
 
 
 
24 
 
6. OBJETIVOS 
6.1. General 
 Evaluar la toxicidad celular del acetato de talio(I), sulfato de talio(I) y tricloruro de talio(III) 
en linfocitos humanos tratados in vitro utilizando diferentes pruebas citotóxicas: viabilidad, 
proliferación y apoptosis. 
 
 
6.2. Particulares 
 Evaluar la viabilidad de los linfocitos humanos tratados con sales de Tl utilizando la prueba 
de tinción dual de diacetato de carboxifluoresceina y bromuro de etidio (CFDA/BrEt). 
 
 Evaluar y estimar la inducción de muerte celular por apoptosis y necrosis utilizando la 
técnica de tinción de naranja de acridina y bromuro de etidio (NA/BrEt). 
 
 Evaluar la viabilidad de los linfocitos humanos después del tratamiento con sales de talio 
utilizando la técnica de MTT. 
 
 Mediante un análisis citogenético, determinar el índice mitótico de los linfocitos humanos 
en proliferación después de haber sido tratados con los compuestos de Tl. 
 
 
 
 
 
 
 
 
25 
7. MATERIAL Y MÉTODOS 
7.1 Reactivos 
Para la separación y cultivo de linfocitos, así como las pruebas de viabilidad, apoptosis, MTT e IM 
se utilizaron medios de cultivo RPMI-1640 y PB-MAX Karyotyping de GIBCO, Invitrogen 
Corporation, NY EUA. La solución amortiguadora de fosfatos salina (PBS por sus siglas en inglés), 
cloruro de potasio (KCl), Histopaque®-1077, bromuro de etidio (BrEt), diacetato de 
carboxifluoreceina (CFDA), naranja de acridina (NA), 3-(4,5-dimetiltiazo 1-2-yl)-2,5-
difeniltetrazolio (MTT), acetato de talio(I) (CH3OOTl, CAS 563-68-8 y 99% de pureza) sulfato de 
talio(I) (Tl2SO4, CAS 7446-18-6 y 99.95% de pureza), tricloruro de talio(III) (TlCl3, CAS 13453-33-3 
de 98% de pureza) y cloruro de cadmio hemi(pentahidratado) (CdCl2·2.5 H2O, CAS 7790-78-5 de 
79.5-81% de pureza) fueron surtidos por Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis MO EUA. La heparina sódica 
fue de la farmacéutica Inhepar® Pisa Mx; metanol y ácido acético glacial fueron surtidos por JT 
Baker. 
7.2 Obtención de la muestra 
Se seleccionaron dos donadores no fumadores, sin antecedentes de algún tratamiento médico o 
exposición a algún agente tóxico. A cada donador se extrajeron 10 mL de sangre periférica por 
venopunción con una jeringa previamente heparinizada. 
7.3 Separación de linfocitos 
En tubos cónicos Corning de polipropileno para centrifuga de 15 mL se colocaron 5 mL de 
Histopaque® y se agregaron 5 mL de sangre lentamente para obtener dos fases, estos fueron 
centrifugados a 1800 rpm durante 30 min. Después de la centrifugación en cada tubo se 
obtuvieron cuatro fases, en la parte inferior se observó la fracción roja, seguido por el 
Histopaque®, después una fase opaca donde se localizaron los linfocitos y por último el plasma. 
Con una pipeta se recolectaron los linfocitos y fueron trasferidos a un tubo limpio donde se les 
realizaron 3 lavados con medio RPMI-1640, el primero con 10 mL y los siguientes con 5 y 3 mL, 
entre cada lavado se centrifugó a 1500 rpm; por último, el botón celular fue re-suspendido en 
0.5 mL de medio, de la suspensión celular se tomaron 15 µL para contar las células en un 
hemocitómetro. 
7.4 Cultivos y tratamientos 
Se utilizaron tres compuestos de Tl: acetato de talio(I), sulfato de talio(I) y tricloruro de talio(III). 
Las concentraciones a evaluar fueron 0.5, 1, 5, 10, 50 y 100 µg/mL, en todos los casos se contó 
con un grupo control al cual no se aplicó ningún tratamiento y un grupo positivo que fue tratado 
con cloruro de cadmio (CdCl2) a una concentración de 228.36 µg/mL. El CdCl2 se utilizó porque es 
 
26 
un compuesto metálico de elevada citotoxicidad (Gateva et al 2013). Los tiempos a los cuales se 
expusieron las células fueron de 0, 2, 4, 8 y 24 h. 
Para todas las pruebas de manera general se realizaron cultivos de dos millones de células en un 
mililitro de medio, los cuales fueron realizados por triplicado y estuvieron divididos en 8 grupos 
diferentes, los cultivos se hicieron en tubos eppendorf, los cuales contenían medio de cultivo 
RPMI-1640, la concentración del compuesto a evaluar y los linfocitos. Los grupos quedaron 
distribuidos de la siguiente manera: 
 Grupo control: Medio de cultivo más linfocitos. 
 Grupo de 0.5: Medio de cultivo con 0.5 µg/mL de acetato de talio(I), tricloruro de talio(III) 
o sulfato de talio(I) más linfocitos. 
 Grupo de 1: Medio de cultivo con 1 µg/mL de acetato de talio(I), tricloruro de talio(III) o 
sulfato de talio(I) más linfocitos. 
 Grupo de 5: Medio de cultivo con 5 µg/mL de acetato de talio(I), tricloruro de talio(III) o 
sulfato de talio(I) más linfocitos. 
 Grupo de 10: Medio de cultivo con 10 µg/mL de acetato de talio(I), tricloruro de talio(III) 
o sulfato de talio(I) más linfocitos. 
 Grupo de 50: Medio de cultivo con 50 µg/mL de acetato de talio(I), tricloruro de talio(III) 
o sulfato de talio(I) más linfocitos. 
 Grupo de 100: Medio de cultivo con 100 µg/mL de acetato de talio(I), tricloruro de talio(III) 
o sulfato de talio(I) más linfocitos. 
 Grupo testigo positivo: Medio de cultivo con 228.36 µg/mLde CdCl2 más linfocitos. 
 
 
7.5 Viabilidad celular con CFDA/BrEt 
La prueba de viabilidad celular se analizó usando una tinción dual de CFDA (0.125 µg/µl) y BrEt 
(0.025 µg/µl) en proporción 1:1 de acuerdo con la técnica descrita por Strauss en 1991. A las 0, 
2, 4, 8 y 24 h después de haber aplicado el compuesto de Tl, se tomaron alícuotas de 200 µL las 
cuales fueron centrifugadas a 6000 rpm durante 5 min para extraer sobrenadante y obtener el 
botón celular al cual se agregó 20 µL de la solución de CFDA/BrEt dejando en incubación por 15 
min a 37°C protegidos de la luz. Transcurrido este tiempo se realizaron tres lavados con 1 mL de 
PBS para eliminar el exceso de colorante. 
La viabilidad se evaluó en al microscopio de fluorescencia con un filtro de excitación de 515-560 
nm a 400 aumentos, para lo cual, se tomaron 20 µL de cada muestra y se colocaron en 
portaobjetos limpios, donde se contaron 100 células por muestra de cada tratamiento. En esta 
prueba las células viables tiñen de color verde y las células no viables presentan coloración roja 
(Figura 8). 
 
27 
Figura 8. Microfotografía que muestra células de linfocitos humanos con la técnica de CFDA/BrEt, observadas 
al microscopio de fluorescencia a 40X. Las células viables se distinguen de las no viables por su coloración, 
donde las primeras tiñen de verde y células no viables de rojo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7.6. Prueba de apoptosis con NA/BrEt. 
Esta técnica se realizó de acuerdo a lo descrito por McGahon en 1995. Se elaboró una solución 
dual de NA (100 µg/mL) y BrEt (100 µg/mL) en PBS. A las 0, 2, 4, 8 y 24 h de haber aplicado el 
compuesto de Tl, se tomaron alícuotas de 200 µL de cada cultivo estas fueron centrifugadas a 
6000 rpm durante 5 min para extraer el sobrenadante y obtener el botón celular, por cada 25 µL 
de suspensión celular se agregó 1 µL de la solución dual. 
La evaluación de las muestras se realizó en un microscopio de fluorescencia con filtro de 
excitación de 515-560 nm a 400 aumentos y se hizo el conteo de 200 células las cuales se 
dividieron en cuatro categorías: 
a) Células viables: aquellas que presentaban integra su membrana y una coloración verde 
uniforme (Figura 9-A). 
b) Células con apoptosis temprana: las que se observaban de color verde con fragmentos de 
cromatina de color verde intenso (Figura 9-B). 
c) Células con apoptosis tardía: aquellas que tenían color rojo con fragmentos de cromatina 
en color rojo intenso (Figura 9-C). 
d) Células necróticas: las cuales mostraban una coloración roja uniforme (Figura 9-A, 9-B). 
 
 
28 
Figura 9. Microfotografía de células de linfocitos humanos con la técnica de NA/BrEt. En A se observan células 
viables que presentan un color verde uniforme y una célula necrótica con una coloración roja uniforme. En B 
se observa una célula en apoptosis temprana, la cual se muetra de color verde con puntos de cromatina 
condensada de color verde intenso y una célula necrótica con una coloración roja uniforme, y en C una célula 
en apoptosis tardía, la cual muestra una coloración roja con puntos condensados de cromatina en color rojo 
brillante. 
A 
B C
B
De los datos obtenidos las células viables fueron convertidas a porcentaje para obtener la 
viabilidad celular; para calcular el porcentaje general de células que sufrieron muerte celular se 
utilizó el índice de muerte, el cual se calculó con la siguiente fórmula: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7.7 Viabilidad por MTT 
Para realizar el ensayo de MTT se siguió la técnica utilizada por Mosmann en 1983 con algunas 
modificaciones. Se disolvió 3-(4,5-dimetiltiazo 1-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) en PBS 
a una concentración de 5 mg/mL. De los cultivos expuestos y no expuestos a las sales de Tl, se 
tomaron alícuotas de 200 µL y fueron colocadas en tubos eppendorf nuevos, a cada tubo se 
agregó 10 µL de la solución de MTT para posteriormente incubarlos durante 4 h a 37°C. 
 
29 
Figura 10. Microfotografía de una microplaca de 96 pozos donde se observa el sobrenadante de los 
cultivos celulares tratados con compuestos de Tl, después de haber sido incubados durante 4 h con 
MTT y los cristales de formazán fueron disueltos con DMSO dando una tonalidad morada, lo cual 
indica que las células metabólicamente activas redujeron el MTT a formazán. 
Pasado el tiempo de incubación, se obtuvo el botón celular por centrifugación (6000 rpm durante 
5 min), se eliminó el excedente de medio de cultivo y MTT y las células fueron re-suspendidas 
vigorosamente durante 15 min con 100 µL de dimetil sulfoxido (DMSO), lo anterior para obtener 
una correcta disolución de los cristales de formazán. Las muestras fueron centrifugadas 
nuevamente, el sobrenadante se colocó en una placa de 96 pozos para inmediatamente medirlo 
en el espectrofotómetro (Epoch BioTek, EUA) a una longitud de onda de 550 nm y una longitud 
de referencia de 630 nm (Figura 10). 
Las lecturas obtenidas se analizaron para obtener el porcentaje de viabilidad celular mediante la 
siguiente formula: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7.8 Proliferación celular mediante el IM 
Para determinar los efectos de las sales de Tl sobre la proliferación celular se utilizó la técnica 
citogenética de aberraciones cromosómicas para obtener metafases de cariotipos humanos. Se 
seleccionaron tres concentraciones de las sales de Tl que fueran representativas por lo que se 
 
30 
Figura 11. Microfotografía de linfocitos humanos cultivados y cosechados para obtener células en 
metafase. 
trabajó con 1, 10 y 100 µg/mL con el propósito de conocer si los linfocitos tienen la capacidad de 
proliferar después de una exposición durante 24 h a los compuestos metálicos. Se realizaron 
cultivos celulares en tubos cónicos de polipropileno para centrifuga de 15 mL (Corning), se 
sembraron dos millones de células por tubo con 3 mL de medio RPMI-1640 el cual contenía las 
concentraciones de cada compuesto de Tl esto realizado por duplicado. En todos los casos el 
tiempo de tratamiento fue de 24 h. Pasado el tiempo de exposición se realizó un lavado con 5 mL 
de medio RPMI-1640 (centrifugando a 1500 rpm durante 7 min) para eliminar el tratamiento 
químico. El botón celular fue re-suspendido en 5 mL de medio PB-MAX Karyotyping 
suplementado con fitohemaglutinina e incubado durante 72 h a 37°C. Dos h antes de cumplir las 
72 h se agregó colcemida (0.2 µg/mL) para interrumpir la mitosis y obtener células en metafase. 
Pasadas las 2 h los cultivos fueron centrifugados y puestos a incubar con 5 mL de solución 
hipotónica (0.075 M de KCl) durante 20 min a 37°C; al termino fueron centrifugados y las células 
fijadas con 5 mL de solución metanol-ácido acético (en proporción 3:1) a 4°C, se realizaron tres 
cambios de fijador dejando reposar 15, 10 y 5 min, respectivamente. El botón celular de cada 
cultivo se re-suspendió en 0.5 mL de fijador, se dejó caer por goteo en cuatro portaobjetos 
limpios, para después dejarlos secar 24 h a temperatura ambiente. Posteriormente las laminillas 
se tiñeron en solución de Giemsa al 5% durante 25 min. 
Las evaluaciones del IM se determinaron contabilizando 4000 células por cultivo de cada 
tratamiento distinguiendo las células en interfase con respecto a las que se encontraban en 
metafase (Figura 11), para el cálculo del IM y el % de inhibición del IM (%IIM) se aplicaron las 
siguientes fórmulas: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
31 
La figura 12 muestra el diagrama de flujo de las metodologías empleadas para evaluar la toxicidad 
celular de los compuestos de talio sobre los linfocitos humanos. 
7.9. Análisis estadístico. 
Los resultados obtenidos se muestran en porcentaje, representados por la media ± desviación 
estándar (DE). Para el análisis de viabilidad celular con la técnica de CFDA/BrEt, apoptosis e índice 
de muerte con la técnica de NA/BrEt se realizó una ji-cuadrada con una