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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS INSTITUTO DE BIOLOGÍA BIOLOGÍA EVOLUTIVA FLUJO GENÉTICO ENTRE LAS POBLACIONES DE IGUANAS INSULARES Y CONTINENTALES EN EL GOLFO DE CALIFORNIA TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS PRESENTA: NOHELIA GUADALUPE PACHECO HOYOS TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: DR. VÍCTOR HUGO REYNOSO ROSALES INSTITUTO DE BIOLOGÍA, UNAM COMITÉ TUTOR: DRA. ELLA VÁZQUEZ DOMÍNGUEZ INSTITUTO DE ECOLOGÍA, UNAM DR. JUAN CERVANDO NÚÑEZ FARFÁN INSTITUTO DE ECOLOGÍA, UNAM MÉXICO, Cd. Mx. OCTUBRE, 2016 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. AGRADECIMIENTOS Agradezco en primer lugar a la Universidad Nacional Autónoma de México, al Instituto de Biología y al Posgrado en Ciencias Biológicas por permitir la realización de mis estudios de maestría a través de su sistema educativo. Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por el apoyo económico brindado para la realización de mis estudios. Agradezco al Dr. Víctor Hugo Reynoso Rosales, director del presente proyecto quien sentó las bases para el desarrollo de esta investigación. Por su paciencia y enseñanzas durante estos años. Se agradece al comité tutoral de tesis compuesto por la Dra. Ella Vázquez Domínguez y el Dr. Juan Núñez Farfán quienes con sus comentarios y aportaciones permitieron la realización de la presente investigación. Este trabajo es resultado de los proyectos de investigación "Las iguanas del golfo de California y sus islas. Fases 1 y 2” PAPIIT, UNAM, Convenios IN206911-3 y IN210315. Las muestras fueron colectadas con los permisos especiales de colecta: SGPA/DGVS/02999/11 del 4 de mayo de 2011, SGPA/DGVS/02200/12 del 13 de marzo de 2012, SGPA/DGVS/04234/13 del 29 de mayo de 2013 y SGPA/DGVS/06363/15 del 05 de junio de 2015, al Dr. Víctor Hugo Reynoso. AGRADECIMIENTOS A TÍTULO PERSONAL Agradezco al Dr. Juan Núñez Farfán, por sus enseñanzas sobre genética poblacional y por cada ocasión que me recibió para evaluar mi trabajo brindando siempre su consejo y experiencia. Un especial agradecimiento a la Dra. Ella Vázquez Domínguez; por sus clases, comentarios, consejos y paciencia. También por recibirme para aclarar mis dudas y revisar mis avances siempre con total disposición y amabilidad. Agradezco al Dr. Francisco Molina Freaner quien participó como miembro del jurado revisor de este trabajo. Por sus enseñanzas en mi formación desde que yo era estudiante de licenciatura hasta hoy, gracias por su paciencia y asertividad. Un especial agradecimiento al Dr. Jaime Gasca Pineda por todas las enseñanzas, comentarios y observaciones como jurado revisor de mi trabajo. Además, agradezco su paciencia y la disposición con la que siempre me ha recibido desde que era su estudiante en los cursos de genética de poblaciones. Jaime, gracias por enseñarme tantas cosas y por la amistad que se ha cultivado con el paso de los años. Al Dr. Alejandro Saldivar quien siempre ha tenido la disposición para revisar mi trabajo de investigación. Su experiencia y comentarios han sido para mí parte fundamental en este recorrido. Agradezco a la Dra. María Auxilio González por sus comentarios y consejos en la elaboración de este trabajo. Le agradezco su tiempo y disposición con la que siempre me ha recibido. Extiendo un agradecimiento especial al Dr. Luis Eguiarte Fruns del Instituto de Ecología de la UNAM por haberme introducido al estudio de la genética de poblaciones y la evolución de las poblaciones naturales. Expreso mi total gratitud por sus enseñanzas, comentarios, paciencia y por recibirme en cada uno de sus cursos hasta el día de hoy. Doy gracias a mis compañeros y amigos de posgrado: Carolina Piña, Patricia Velez, Nancy Gálvez, Ana Silva, Valeria Salinas, Alejandro Villegas, Reina Ortíz, Rafael Hintze, Alberto Cruz y Gabriela Díaz. Les doy las gracias por la hermandad brindada, por recibirme en sus hogares y por el apoyo recibido para mi crecimiento personal. Doy gracias a todos mis profesores de asignatura especialmente a los especialistas Dr. Luis Eguiarte Fruns, Dr. Daniel Piñero Dalmau, Dra. Valeria Souza Saldivar, Dra. Tania Escalante, Dr. Jaime Gasca Pineda y Dra. Gabriela Castellanos por todas las enseñanzas recibidas durante mi formación. También agradezco al personal administrativo del Instituto de Biología e Instituto de Ecología así como a la maestra Laura Márquez, encargada del secuenciador del Instituto de Biología por recibirme en su laboratorio siempre con total disposición. Agradezco el apoyo institucional de CICIMAR a través del Dr. José Luis Ortíz Galindo y de Prescott College, Kino Bay Center por medio de su directora Lorayne Meltzer por las facilidades brindadas durante la colecta de ejemplares en el golfo de California. Agradecemos el apoyo del Capitán del “CICIMAR XV”, Ciro Aristas de la Rosa (CICIMAR, IPN) y al capitán del “Lobo de Mar” Cosme Demian Becerra (Prescott College Kino Bay Center) por su apoyo y logística en Isla Cerralvo, Isla San Esteban e Isla Cholludo. Las muestras fueron colectadas por Víctor Hugo Reynoso, Nohelia Pacheco Hoyos, Georgina González Monfil, José Luis Ortíz Galindo, Melissa Plasman, Yssel Gadar Aguayo, Evelynne Barten, Yoshiyuki Yamamoto y José Aberto Cruz Silva. Agradezco la colaboración del Centro Ecológico del Estado de Sonora y de la Universidad de Sonora por permitir la colecta para fotografía de iguanas en sus instalaciones ubicadas en la región continental del estado de Sonora. También se agradece al personal del Rancho “Trincheras” y el rancho “el papalote” ubicados en la localidad de San Carlos, Sonora por su colaboración en el muestreo de ejemplares continentales. Las muestras fueron colectadas por Nohelia Pacheco, Ibor Leonardo Ortiz, Javier Verdugo, y Víctor Hugo Reynoso. Gracias a todos los que contribuyeron en los muestreos de esta investigación. Por último, extiendo un agradecimiento especial a mis padres y hermanos por su apoyo y dedicación durante los años que estuve fuera de mi hogar. Nothing in biology makes sense except in the light of evolution Theodosius Dobzhansky Nothing in evolution makes sense except in the light of population genetics Michael Lynch Dedicado a mis padres y hermanos ÍNDICE RESUMEN ..................................................................................................................................1 ABSTRACT .................................................................................................................................3 INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................4 OBJETIVOS ................................................................................................................................9HIPÓTESIS CIENTÍFICA ..........................................................................................................10 PLANTEAMIENTOS Y PREDICCIONES ................................................................................11 ANTECEDENTES ......................................................................................................................13 Variación genética y fuerzas evolutivas ...................................................................................13 Estructura poblacional y flujo genético ....................................................................................14 Las iguanas del golfo de California ..........................................................................................16 Genética de poblaciones e iguanas ...........................................................................................18 Origen y geología del golfo de California ...............................................................................20 MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................................23 Descripción del área de estudio y colecta de datos ...................................................................23 Colecta de individuos y tejido...................................................................................................24 Trabajo de laboratorio ………………………………………………………………………. 25 Extracción de ADN ...................................................................................................................25 Amplificación de genes mitocondriales y microsatélites..........................................................25 Análisis de datos ..........................................................................................................................26 Visualización, edición y lectura de marcadores .......................................................................26 Dversidad genética ...................................................................................................................27 Diferenciación poblacional y flujo genético ............................................................................28 Estructura poblacional .............................................................................................................31 Aislamiento por distancia .......................................................................................................33 Análisis filogeográfico ..............................................................................................................34 Inferencia bayesiana..............................................................................................................34 Red de haplotipos ..................................................................................................................35 RESULTADOS............................................................................................................................37 Diversidad genética ..................................................................................................................37 Flujo genético y estructura poblacional ...................................................................................41 Flujo genético inferido a partir de microsatélites ..............................................................48 Aislamiento por distancia ...................................................................................................51 Relaciones filogeográficas ........................................................................................................54 Inferencia con métodos bayesianos ....................................................................................54 Red de haplotipos ................................................................................................................58 DISCUSIÓN ................................................................................................................................62 DIVERSIDAD GENÉTICA ....................................................................................................62 FLUJO GENÉTICO.................................................................................................................66 Estructura poblacional .............................................................................................................70 Relaciones filogenéticas y filogeográficas ...............................................................................73 Filogenia ...........................................................................................................................73 Análisis de red y distribución de haplotipos ......................................................................76 Aspectos filogenéticos y de estructura poblacional ...........................................................77 CONCLUSIONES .......................................................................................................................80 LITERATURA CITADA ............................................................................................................82 APÉNDICES................................................................................................................................99 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Ubicación de las poblaciones de muestreo. ..................................................................23 Figura 2. Asignación bayesiana de genotipos encontrada con STRUCTURE para las poblaciones de iguanas del golfo de California. ..........................................................51 Figura 3. Correlación entre el índice de diferenciación Fst para las poblaciones pareadas y la distancia geográfica entre poblaciones para el gen ND4. ........................................51 Figura 4. Correlación entre el índice de diferenciación Fst para las poblaciones pareadas y la distancia geográfica entre poblaciones para el gen COIII. ......................................52 Figura 5. Correlación entre la distancia geográfica y el estadístico Fst utilizando marcadores microsatélites ...........................................................................................53 Figura 6. Correlación entre la distancia geográfica y el estadístico Rst utilizando marcadores microsatélites. ..........................................................................................53 Figura 7. Barreras geográficas encontradas en Barrier v.2.2 entre las poblaciones de iguanas en el golfo de California. ................................................................................54 Figura 8. Inferencia bayesiana del complejo Ctenosaura hemilopha-macrolopha utilizando el gen ND4. .................................................................................................56 Figura 9. Inferencia bayesiana del complejo Ctenosaura hemilopha-macrolopha utilizando el gen COIII. ...............................................................................................57 Figura 10. Cronograma de las especies de Ctenosaura del golfo de California obtenido en BEAST con análisis de cadenas de Montecarlo. .........................................................58 Figura 11. Distribución de los haplotipos del gen mitocondrial ND4 en las distintas poblaciones del iguanas en el golfo de California. ......................................................59 Figura 12. Distribución de los haplotipos del gen mitocondrial COIII en las distintas poblaciones del iguanas en el golfo de California. ......................................................60 Figura 13. Red de haplotipos del gen ND4 para los distintos linajes de iguanas enel golfo de California. ...............................................................................................................61 Figura 14. Red de haplotipos del gen COIII para los distintos linajes de iguanas en el golfo de California. ......................................................................................................61 LISTA DE CUADROS Cuadro 1. Iguanas que habitan en el golfo de California, grado de endemismo y estado de conservación en México. .............................................................................................18 Cuadro 2. Datos geográficos y ubicación de las poblaciones analizadas. ...................................24 Cuadro 3. Número de ejemplares amplificados por población para genes y microsatélites. .......26 Cuadro 4. Haplotipos utilizados como grupos externos para los análisis filogenéticos. .............35 Cuadro 5. Medidas generales de variación genética para secuencias. .........................................39 Cuadro 6. Valores de heterocigosis observada y esperada para los loci de microsatélites. .........40 Cuadro 7. Valores de heterocigosis observada y esperada por población. .................................40 Cuadro 8. Medidas de flujo genético y diferenciación génica en el gen ND4. ............................42 Cuadro 9. Medidas de flujo genético y diferenciación génica en el gen COIII. ..........................43 Cuadro 10. Valores de Nm para las poblaciones pareadas en el gen ND4 a partir de distintos índices de diferenciación genética. ...............................................................43 Cuadro 11. Valores de Nm para las poblaciones pareadas en el gen COIII a partir de distintos índices de diferenciación genética. ...............................................................44 Cuadro 12. Valores totales de Fst, Gst y Nm para secuencias. ....................................................44 Cuadro 13. Número de grupos y valores de Fct encontrados en SAMOVA. ..............................45 Cuadro 14. Análisis AMOVA para el gen ND4. .........................................................................46 Cuadro 15. Análisis AMOVA para el gen COIII. ......................................................................47 Cuadro 16. Valores pareados de Fst generados a partir de microsatélites. ..................................48 Cuadro 17. Valores pareados de Rst generados a partir de microsatélites. .................................48 Cuadro 18. Valores de Nm para las poblaciones pareadas de iguanas basadas en los estadísticos Fst y Rst. .................................................................................................48 Cuadro 19. Valores del índice Fis para las poblaciones de iguanas por locus de microsatélites. ..............................................................................................................49 Cuadro 20. Análisis AMOVA utilizando loci de microsatélites. .................................................50 1 RESUMEN El golfo de California representa el núcleo de riqueza de especies de iguanas más elevado en el mundo. Sin embargo, a pesar del elevado número de estudios taxonómicos, los análisis de las especies a nivel nivel genético son insuficientes tanto para las poblaciones continentales como las insulares. Este trabajo, describe la diversidad, flujo y estructura genética del complejo de iguanas del género Ctenosaura en el golfo de California, México. Para ello se utilizaron dos marcadores moleculares de ADN mitocondrial (mt) (ND4 y COIII) y seis loci de microsatélites para analizar tres poblaciones insulares y dos poblaciones continentales. Se observó alta diversidad haplotípica entre poblaciones (ND4, Hd=0.80; COIII, Hd=0.929) y baja diversidad nucleotídica (ND4, π=0.023; ND4, θ=0.024; COIII, π=0.024; COIII, θ=0.023). Las poblaciones de San Pedro Nolasco y Hermosillo mostraron alta diversidad genética para ADNmt y microsatélites. Además, el análisis de inferencia bayesiana con marcadores mt mostró concordancia con la clasificación taxonómica actual del género Ctenosaura en la región, en la que se considera a las poblaciones insulares de isla Nolasco e isla San Esteban como unidades evolutivas independientes correspondientes asignadas a C.nolascensis y C. conspicuosa respectivamente. Se encontró estructura geográfica para ambos marcadores, donde existen barreras geográficas que coinciden con la subdivisión genética de las poblaciones en el golfo de California y el desierto sonorense. El análisis bayesiano de grupos para microsatélites indica que la población de Hermosillo presenta introgresión génica proveniente de San Pedro Nolasco e intercambia migrantes con la población de San Carlos. La baja diferenciación genética entre las poblaciones de Hermosillo y San Pedro Nolasco sugiere flujo genético reciente entre ellas, lo cual está apoyado por una deficiencia de heterocigosis para algunos loci, lo que sugiere hibridación reciente. Los resultados encontrados aportan evidencia para distinguir a las poblaciones insulares como linajes con una historia evolutiva independiente, donde la alta diversidad genética observada para el desierto 2 sonorense y golfo de California tiene implicaciones para la conservación de estas especies amenazadas. Palabras clave: Ctenosaura, flujo genético, estructura poblacional, golfo de California. 3 ABSTRACT The Gulf of California or Sea of Cortés has a high number of iguanas species. Nevertheless, despite the high number of taxonomic studies, there is insufficient analysis of the species at genetic level on both continental and insular populations. In this work, we studied the genetic diversity, gene flow and population structure of Ctenosaura hemilopha complex in the Gulf of California, México. Two mitochondrial DNA molecular markers (ND4 and COIII) and six microsatellites loci (Cthe 12, Cthe 26, Cthe 19, Cthe 21, Pec 16 y Pec 21) were used to analyze three insular populations and two continental populations. Among these populations we found high haplotype diversity (ND4, Hd=0.80; COIII, Hd=0.929 ) and low nucleotide diversity (ND4, π=0.023; ND4, θ=0.024; COIII, π=0.024; COIII, θ=0.023). In addition, high mtDNA and microsatellite genetic diversity was observed for populations on San Pedro Nolasco and Hermosillo. The bayesian trees analysis based on ND4 and COIII support the current classification of Ctenosaura within the study area, in which we consider the insular populations as independent evolutive units (Ctenosaura nolascensis y Ctenosaura conspicuosa). Geographic structure was evident for both markers, with geographic barriers that shows agreement between the populations of the Gulf of California and the Sonoran Desert. Bayesian cluster analysis of six microsatellite loci indicates the existence of five distinct genetic clusters, one per each population. We found that continental populations receive migrants from San Pedro Nolasco and exchange migrants with one another. Low genetic differentiation among Hermosillo and San Pedro Nolasco populations suggests recent gene flow betweeen them. This admixture results in significant heterozygote deficiencies at numerous loci, suggesting recent hibridization. We detected high genetic diversity areas in Sonoran Desert and Gulf of California and these findings have implications for the conservation of this threatened species. Keywords: Ctenosaura, genetic flow, population structure, gulf of California. 4 INTRODUCCIÓN La genética de poblaciones es una disciplina que trata de explicar los niveles de variación genética dentro y entre las poblaciones naturales; explicando los patrones de esta variación en términos de las fuerzas evolutivas (Eguiarte et al., 2013). Esta disciplina tiene un origen relativamente reciente y sus principales ideas fueron descritasen sus inicios por R. A. Fisher, S. Wright y J. B. S. Haldane, quienes la colocaron como la herramienta más poderosa para el estudio de la evolución. El principio básico de la genética de poblaciones es que las fuerzas evolutivas actúan sobre la variación genética por tiempos prolongados ocasionando diversidad y adaptación (Hedrick, 2011; Eguiarte et al., 2013). Cuando la variación genética en las poblaciones es muy alta existe la posibilidad de que esto sea consecuencia de flujo genético y que además existan tamaños efectivos elevados (Gillespie, 1998). El flujo genético entre poblaciones es una condición para sospechar que dos o más poblaciones podrían pertenecer a una misma especie. Por lo contrario, la ausencia de migración produce una estructura y una diferenciación entre las poblaciones naturales (Hedrick, 2011). Dicha estructura depende de la distribución de los individuos dentro de las poblaciones y de la distancia que se presente entre éstas. Las poblaciones presentan barreras generalmente geográficas que impiden el flujo genético; sin embargo, las construcciones antropogénicas como los caminos, carreteras, áreas urbanas, así como las condiciones climáticas, vegetación y las características de los cuerpos oceánicos también tienen un papel importante que influye en la estructura poblacional (Garrido-Garduño y Vázquez-Domínguez, 2013). Además, las poblaciones que generalmente no entran en contacto de forma natural, pueden cohabitar como 5 consecuencia de una translocación y, en caso de no existir aislamiento reproductivo puede existir flujo genético entre ellas. Las islas representan un sistema ideal para estudiar los procesos evolutivos poblacionales (Beheregaray, 2008), que incluyen análisis de colonización, selección natural, flujo genético, estructura poblacional y radiación adaptativa de las especies (Gutsche y Kohler, 2008; Steinfartz et al., 2009; Floyd et al., 2010; Davy et al., 2011). Al encontrarse en condiciones aisladas, los estudios evolutivos entre poblaciones isleñas se pueden analizar bajo los modelos y supuestos clásicos de la genética de poblaciones; por ejemplo, con el modelo isla-continente (Wright, 1943). La razón por la cual se reporta alta endemicidad de especies en las islas es que éstas representan sistemas complejos donde nuevos inmigrantes o poblaciones vicariantes evolucionan de manera independiente de las especies parentales. En otras palabras, el equilibrio entre selección y deriva genética propicia la formación de nuevos linajes (Woolfit y Bromham, 2005; Hedrick, 2011). El efecto fundador es común en las islas donde se establecen poblaciones con pocos individuos. En estos casos, las frecuencias génicas difieren entre los colonizadores y las poblaciones de las que proceden. Por lo tanto, los efectos de la evolución suelen ser lentos y las poblaciones de las primeras generaciones son pequeñas. Con relación a lo anterior, los nuevos linajes son muy endebles y muchas de las extinciones de flora y fauna actuales ocurren en islas (Ricketts et al., 2005). Así, el estudio de las poblaciones isleñas es de gran interés para la conservación biológica (Parent et al., 2008). Entre las principales razones de extinción en islas se encuentra la introducción de especies o linajes evolutivos distintos pero que están evolutivamente relacionados. En 6 una isla, estos linajes pueden promover un flujo genético entre poblaciones que antes no existía, aumentando la posibilidad de presentar hibridación y como consecuencia la desaparición de los linajes originales (Olden et al., 2004; Pasachnik et al., 2009 González-Porter et al., 2011). La introgresión genética puede acelerar la pérdida de adaptaciones locales y por lo tanto, pone en peligro la existencia de las poblaciones parentales (Rhymer y Simberloff, 1996). Se ha demostrado que algunos vertebrados inclusive con bajos niveles de introgresión, pueden reducir de manera significativa la contribución que tienen los individuos parentales en la variación genética (Schlaepfer et al., 2005; Shaddick et al., 2011). Incluso, en ausencia de selección natural contra los híbridos, su presencia puede causar cambios en la adaptación de las poblaciones o incluso la extinción de uno o ambos linajes parentales (Arnold, 1997; Charlesworth, 2011). La importancia del estudio de estos fenómenos tiene repercusiones considerables en la conservación de especies o complejos evolutivos (Smith, 1992). Las iguanas son un componente conspicuo de la diversidad del territorio mexicano; y como tal, resulta interesante entender sus patrones de diversificación. En la región del norte de México se encuentra la zona protegida de las islas del golfo de California, en donde la diversidad de especies de iguanas es considerable (Reynoso, 2010). A pesar de los numerosos estudios ecológicos y fisiológicos sobre estos reptiles, la identidad taxonómica de las poblaciones de iguanas del complejo Ctenosaura hemilopha (Cope, 1864); Ctenosaura macrolopha (Smith, 1972), Ctenosaura conspicuosa (Dickerson, 1919) y Ctenosaura nolascensis (Smith, 1972) en la península de Baja 7 California, Sonora y las islas del golfo no ha sido resuelta plenamente (Reynoso et al., 2010). Se ha dicho que los grupos indígenas de Sonora, específicamente los Comcáac (seris), pudieron tener un rol importante en el origen de la diversidad de iguanas en varias islas del golfo de California. Este efecto fue generado como consecuencia de la translocación de ejemplares provenientes del continente a las islas o entre islas (Nabhan, 2002; 2003). Sin embargo, se ha demostrado que el origen de los linajes es anterior a la presencia de las poblaciones humanas en la región (Davy et al., 2011). También se ha postulado que algunas de las islas del golfo de California pueden representar zonas de flujo genético con posibilidad de hibridación entre las especies de iguanas, en donde los grupos indígenas de la región han jugado un papel importante en el movimiento de nuevos individuos, afectando la estructura genética de poblaciones ya establecidas (Reynoso, 2010; Reynoso et al., 2010; Santos-Hernández, 2015). A la fecha, se reconocen cuatro especies dentro del complejo C. hemilopha: C. hemilopha, C. macrolopha, C. conspicuosa y C. nolascensis (Enderson et al., 2009), que se han considerado como especies o subespecies en la literatura (Smith, 1972; Grismer, 2002; Enderson et al., 2009). Además C. insulana (Dickerson, 1919) fue sinonimizada con C. hemilopha (Schmidt, 1922). Una de las hipótesis evolutivas menciona que lo más probable es que C. hemilopha se extendió hacia el norte del estado de Sonora a partir de un ancestro común con C. peticnata y posteriormente pasó hacia la península de Baja California (Reynoso et al. 2010). De esta manera se generaron dos componentes, uno peninsular y uno continental, los cuales difieren claramente en morfología (Smith, 1972; Grismer, 2002). En lo que respecta a las especies insulares C. conspicuosa y C. 8 nolascensis, Smith (1972) las reconoció como subespecies de C. hemilopha; sin embargo, Grismer (2002) las consideró como linajes evolutivos independientes y elevó los taxones a nivel de especie. Estas poblaciones pudieran ser consecuencia de procesos de vicarianza y posterior adaptación y diversificación. El presente trabajo tiene como objetivos principales conocer la estructura, composición genética y flujo genético entre las poblaciones de las iguanas insulares y continentales del género Ctenosaura en el golfo de California. Para ello, se analizaron los patrones de diversidad genética y filogeográficos de tres poblaciones insulares comparándose con dos poblaciones continentales con base en análisis históricos y genéticos previos (Nabhan, 2002; 2003; Blázquez et al., 2006; Zarza et al., 2009; Reynoso et al., 2010; Davy et al., 2010). Los resultados del análisisaportarán nueva información que ayudará a descifrar la problemática taxonómica de las especies del género Ctenosaura en el golfo de California y describirá los procesos evolutivos de las poblaciones que habitan en esa región. 9 OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Determinar la estructura genética poblacional y flujo genético de los linajes del género Ctenosaura en el golfo de California. OBJETIVOS PARTICULARES 1) Describir la diversidad y diferenciación genética de los linajes del género Ctenosaura en el golfo de California utilizando marcadores mitocondriales y microsatélites. 2) Evaluar el flujo genético e hibridación entre los linajes de las especies de iguanas del género Ctenosaura. 3) Evaluar la estructura genética de las especies de iguanas del género Ctenosaura en el golfo de California 4) Establecer las relaciones filogeográficas existente entre las especies insulares y continentales de iguanas del género Ctenosaura en el golfo de California con base en los genes mitocondriales ND4 y COIII. 10 HIPÓTESIS CIENTÍFICA La distancia que existe entre las islas del golfo de California y el continente representa un impedimento para la dispersión de las iguanas. En caso de existir una barrera entre poblaciones, se espera encontrar haplotipos únicos causados por el aislamiento reproductivo y la endogamia. En caso de haber flujo genético, se esperaría que las poblaciones de las islas sean suficientemente grandes para contrarrestar los efectos de fuerzas evolutivas como la deriva genética. 11 PLANTEAMIENTOS Y PREDICCIONES HIPOTÉTICAS La teoría de la genética de poblaciones indica que la deriva puede ser contrarrestada por la migración efectiva. Sin embargo, una introgresión génica grande puede tener un efecto de disminución de los alelos locales, lo que repercutiría en la conservación de los linajes originales de las islas y el continente. Con base en esos fundamentos y según los objetivos de la investigación se plantean las siguientes preguntas de investigación y predicciones hipotéticas: 1) ¿Existe diferenciación genética considerable entre las poblaciones insulares y continentales de iguanas del género Ctenosaura en el golfo de California y la plataforma continental? a. Predicción: Existirán diferencias en la composición genética y en los estimadores genéticos de diversidad entre las poblaciones de iguanas insulares y continentales. 2) ¿Existe flujo genético entre las poblaciones insulares y continentales de las iguanas del género Ctenosaura en el golfo de California? a. Predicción: Se espera encontrar flujo genético moderado entre las poblaciones cuya dirección será de isla a continente. 3) ¿Existe hibridación en la población de C. nolascensis que habita en la isla San Pedro Nolasco? En caso de existir genomas híbridos, ¿Cuál es el origen de los elementos genéticos que constituyen el genoma de esa población? a. Predicción: Los genomas continentales presentarán introgresión de alelos provenientes de los genomas isleños, específicamente de los que provienen de isla San Pedro Nolasco. 12 4) ¿Existe estructura genética entre las poblaciones de Ctenosaura presentes en la región? a. Predicción: Existirá estructura poblacional entre los linajes de iguanas estudiados, separando a los linajes continentales de los peninsulares dado que las barreras geográficas que existen entre poblaciones propician el aislamiento reproductivo de las especies. 5) ¿Existe correlación entre la distancia geográfica presente en las poblaciones y la variación genética reportada? a. Predicción: Debido a la presencia de barreras geográficas y aislamiento, la distancia geográfica entre poblaciones estará directamente relacionada a la diferenciación genética que existe entre ellas. Sin embargo, esta relación puede resultar no significativa debido a que la barrera geográfica que representan las islas es muy fuerte. 6) ¿Existen barreras geográficas asociadas que tengan efectos significativos en la variabilidad genética entre las poblaciones de iguanas y que ocasionen estructura poblacional? a. Predicción: Se espera encontrar la presencia de barreras geográficas significativas donde las más rigurosas estarán presentes entre continente e isla y no entre los demes continentales. 7) ¿Cuáles son las relaciones filogenéticas y filogeográficas de las iguanas Ctenosaura en con base en el gen ND4 y gen COIII? a. Predicción: Las inferencias filogenéticas mostrarán relaciones evolutivas independientes entre los linajes insulares y los continentales. 13 ANTECEDENTES Variación genética y fuerzas evolutivas La diversidad de la vida en la tierra podría ser el resultado de la transformación de la variabilidad genética dentro y entre poblaciones. Esta variabilidad es esencial para el cambio evolutivo ya que muchos de los rasgos observables (fenotipos) en las especies están influenciados por la interacción entre la composición genética y el ambiente. Por lo tanto, para mantener esta variabilidad se requiere que todo cambio evolutivo en una especie sea heredado (Dobzhansky et al., 1977; Eguiarte et al., 2013). El estudio de la variación en los genes es el objetivo de la genética de poblaciones, disciplina cuyo desarrollo se ha incrementado en los últimos años (Lewontin, 1991; Hedrick, 2011). Las bases de la genética de poblaciones fueron propuestas en los años 20 y 30 por Ronald A. Fisher, J.B.S. Haldane y Sewall Wright, quienes adoptaron las ideas iniciales de Darwin de la evolución por medio de selección natural. En sus postulados, se establece que el patrón de equilibrio de la variabilidad para una población estructuradamente estable es determinado por la interacción de la selección, deriva genética, migración y mutación (Charlesworth y Charlesworth, 2010; Eguiarte et al., 2013). La genética de poblaciones tiene su fundamento principal en un modelo propuesto por el matemático inglés G. H. Hardy (1908) y el médico alemán W. Weinberg (1908), quienes establecieron el principio de Hardy-Weinberg; el cual, describe el patrón genético de poblaciones diploides en términos de sus frecuencias alélicas y genotípicas (Hedrick, 2011). El principio menciona que después de una generación de apareamientos aleatorios, las frecuencias alélicas de un locus simple pueden ser representadas por una función binomial (dos alelos) o de alelos múltiples. En este modelo las frecuencias 14 alélicas esperadas están dadas por p 2 + 2pq + q 2 = 1. En la ecuación, p 2 representa la frecuencia del alelo p en los homocigos dominantes A1A1; la frecuencia de los heterocigotos A1A2 está dada por 2pq mientras que la frecuencia del homocigo recesivo A2A2 se representa por q 2 . La ley de Hardy-Weinberg sirve como modelo nulo en análisis genéticos y se cumple si las poblaciones son “ideales”. La población ideal es aquella de tamaño infinito, donde los organismos tienen la misma probabilidad de reproducirse entre sí, no hay mutación y no existe el flujo genético (Gillespie, 1998; Hedrick, 2011). En ese modelo, las fuerzas evolutivas no actúan sobre las poblaciones. Por lo tanto, cuando la igualdad de la ecuación es un valor menor o mayor a “uno” significa que alguna o varias fuerzas evolutivas actúan sobre el locus que se analice. Estructura poblacional y flujo genético En la mayoría de las especies, las poblaciones están subdivididas en unidades más pequeñas debido a factores geográficos, ecológicos o de comportamiento (Hedrick, 2011). Cuando las poblaciones están subdivididas, el grado de conexión genética entre ellas puede diferir. Por lo tanto, las relaciones genéticas dependerán entonces de la migración efectiva entre las distintas poblaciones o subpoblaciones. Dicho de otra manera, el flujo genético es el encargado de homogenizar la variación en una población (Gillespie, 1998; Hedrick,2011). En genética de poblaciones se utiliza el concepto de “deme” (del griego δῆμος, pueblo). Un deme se define como una subpoblación separada que presenta cierto grado de migración o donde los individuos se distribuyen de forma continua bajo el rango de 15 distribución de la especie pero se dispersan en distancias cortas (Charlesworth y Charlesworth, 2010). El conjunto de demes se conoce como metapoblación; en la cual, los alelos se pueden mover por migración de individuos y de gametos o se pueden mover si existe la extinción o colonización de demes. Dos demes se diferenciarán uno del otro dependiendo de la fuerza de selección (s) y de la migración (m). Haldane (1930) y Wright (1931) proponen que los alelos nuevos que entran en un deme por migración se encuentran en cierta desventaja selectiva. Además, el patrón de equilibrio de la variabilidad genética neutral de una población estructuralmente estable está determinado por la integración de la deriva génica, la migración y los eventos de extinción/colonización que afectan a las poblaciones locales así como el efecto de las mutaciones genéticas (Charlesworth y Charlesworth, 2010). El grado de diferenciación entre demes es un indicador de la estructura de una metapoblación donde el modelo más simple para representarlo fue propuesto por Sewall Wright (1943) y se conoce como “modelo de islas”. En este modelo, los demes son idénticos en tamaño y tienen la misma probabilidad de que existan migrantes entre ellos. Por lo tanto, la estructura espacial de las poblaciones reduce la probabilidad de fijación de mutaciones deletéreas o parcialmente deletéreas. Finalmente, el flujo o intercambio genético entre especies diferentes puede resultar en poblaciones híbridas; las cuales, son de interés biológico ya que representan el límite entre dos especies o linajes y pueden experimentar un cambio genético relativamente rápido (Charlesworth y Charlesworth, 2010). De acuerdo a la teoría neutral de Kimura (1968), altos niveles de heterocigosis pueden ser causados por elevadas tasas de mutación o tamaños efectivos grandes lo que 16 puede generar una diferenciación a nivel poblacional (Small et al., 2007). Lo anterior contrasta con el efecto de la migración efectiva la cual genera homogeneidad genética en las poblaciones (Hedrick, 2008). De manera general, un hábitat de distribución grande y continua facilita el mantenimiento de altos niveles de diversidad genética (Nassar et al., 2003). Este tipo de variabilidad es la que se esperaría encontrar en poblaciones naturales que habitan islas siempre y cuando cumplan con la característica anterior o poseean una alta capacidad de carga. Las iguanas del golfo de California La biodiversidad de México se hace evidente en el grupo de las iguanas, ya que no existe otro país con mayor número de especies de este grupo (Reynoso et al., 2010). Estudios morfológicos y moleculares han demostrado que estos reptiles son un grupo monofilético (Conrad, 2008; Townsend, 2004; Vidal y Hedges, 2005) que surgió hace aproximadamente 120 Ma. Sin embargo, las iguanas verdaderas existen desde hace aproximadamente 56.5 Ma. (Shulte y Moreno-Roark, 2009; Townsend et al., 2011). En la naturaleza, la mayoría de los grupos biológicos tienen en cierta medida un grado de diversificación adaptativa. Sin embargo, el término radiación adaptativa se utiliza sólo en clados con una diversidad excepcional, tanto en la variedad de hábitats como en las adaptaciones morfológicas (Schluter, 2000). Los iguánidos representan el 18% de todos los escamados; lo cual, es resultado de la radiación adaptativa y éxito evolutivo del grupo (Losos, 2002; Uetz, 2013). Shulte y Moreno-Roark (2009) sugieren que las familias de iguanas pleurodontas (Iguanidae, Phrynosomatidae Crotaphytidae, entre otras) se encuentran de manera predominante en norte y centro América, de tal 17 manera que los taxones anidados a dicho clado se asocian a América del Sur y América Central meridional sugieriendo que el origen de estos grupos ocurrió en el Hemisferio Norte y posteriormente se expandió hacia el Hemisferio Sur. Una de las regiones más importantes de México debido a su alta diversidad, patrones evolutivos y geológicos es el golfo de California. Esta región es la que cuenta con más endemismos y especies de iguanas (Reynoso, 2010). En las islas del golfo de California existen ocho especies endémicas (Cuadro 1) de tres géneros: Sauromalus (Dúmeril, 1856), Dipsosaurus (Baird y Girard, 1852) y Ctenosaura. Dentro del género Ctenosaura, la especie C. hemilopha ha estado sujeta de confusiones taxonómicas. Por un lado, se ha argumentado que C. hemilopha está compuesta de cuatro subespecies: C. h. hemilopha en Baja Californa Sur, C. h. macrolopha en Sonora, C. h. conspicuosa en islas Cholludo y San Esteban y, C. h. nolascensis en isla San Pedro Nolasco (Enderson et al., 2009). No obstante, Grismer (2002) elevó a cada uno de los taxones a nivel de especie como C. hemilopha, C. conspicuosa, C. macrolopha y C. nolascensis. Otras clasificaciones, como Smith (1972), propusieron la existencia de cinco subespecies donde además de los taxones mencionados anteriormente se incluye a C. h. insulana para isla Cerralvo en Baja California Sur. El golfo de California y sus islas son áreas protegidas al igual que muchas especies de reptiles que las habitan, incluyendo a las iguanas. En esta región, las especies introducidas afectan las poblaciones locales de iguanas debido a que consumen huevos y crías. Por tal motivo, los expertos catalogaron a la mayoría de las poblaciones de iguanas de la costa e islas de golfo de California como amenazadas o en peligro de extinción en la NOM ECOL-059-SEMARNAT 2010 (Cuadro 1). 18 Cuadro 1. Iguanas que habitan en el golfo de California, grado de endemismo y estado de conservación en México. Modificado de Reynoso et al. (2010). Especie Distribución Grado de endemismo Estado de conservación según la NOM-ECOL- 059 SEMARNAT, 2010 Ctenosaura conspicuosa Dickerson, 1919 Islas Cholludo y San Esteban Insular Ctenosaura hemilopha Cope 1864 Baja California sur, isla Cerralvo Baja California Sur Protección especial Ctenosaura nolascensis Smith, 1972 Isla San Pedro Nolasco Insular Ctenosaura macrolopha Smith, 1972 Sonora y Sinaloa México Dipsosaurus catalinensis Van Denburgh, 1922 Isla Santa Catalina Insular Dipsosaurus dorsalis Baird y Girard, 1852 Isla Santa Catalina Norte América Iguana iguana Linnaeus, 1758 Norte de México hasta Sudamérica América Protección especial Sauromalus ater Dúmeril, 1856 Noroeste de México (Sonora, Baja California, islas Tiburón y Alcatraz) México Protección especial Sauromalus hispidus Stejneger, 1891 Islas Ángel de la guarda y San Lorenzo Insular Amenazada Sauromalus klauveri Shaw, 1941 Isla Santa Catalina Insular Amenazada Sauromalus sleveni Van Denburgh, 1922 Islas Carmen, Coronados y Monserrat Insular Amenazada Sauromalus varius Dickerson, 1919 Islas Roca Lobos y San Esteban Insular Amenazada Genética de poblaciones e iguanas Para las islas del golfo de California existen estudios de herpetología acerca de la evolución del gigantismo insular (Case, 1978), la variabilidad anatómica y genética (Soule et al., 1973), la composición de especies (Murphy, 1983), así como modelos de 19 colonización, extinción y su relación con la tectónica de placas (Murphy, 1983; Davy et al., 2011). Sin embargo, en iguanas no se han realizado investigaciones adecuadas que evalúen la variabilidad genética, el flujo genético entre poblaciones, la especiación o fuerzas evolutivas como la deriva génica y la selección natural. La idea de que las iguanas del golfo de California han sido translocadas por el hombre hasido propuesta y evaluada anteriormente (Cryder, 1999; Reynoso et al., 2010; Davy et al., 2011). En el golfo de California las iguanas han sido utilizadas como un recurso alimenticio por los pescadores y la comunidad indígena Comcáac (Seri); la cual se cree ha tenido un impacto fundamental en la distribución, patrones de especiación y en la merma de algunas poblaciones naturales en dicha región (Nabhan, 2002; 2003). Los pueblos indígenas del estado de Sonora aún las consumen como parte de su dieta lo que ha generado que el movimiento de especies provoque problemas de interacciones y de hibridación no deseadas, como sucede con Sauromalus en la isla de Alcatraz (Nabhan, 2002; Grismer, 2002; Reynoso et al., 2010). La evidencia molecular ayuda a confirmar el papel que jugaron los Comcaác en la translocación de Sauromalus hacia isla San Esteban y luego a isla Roca Lobos (Lovich y Mahrdt, 2008). Por otro lado, para el género Ctenosaura la información genética es inadecuada. Reynoso et al. (2010) basados en el gen ND4 proponen la existencia de linajes mitocondriales insulares y continentales distintos en isla San Pedro Nolasco para las iguanas del género Ctenosaura. Por otro lado, Davy et al. (2011) demostraron que los pueblos indígenas de Sonora no son responsables de la fundación de los distintos linajes de iguanas en el golfo de California, ya que la divergencia evolutiva de esos linajes ocurrió mucho antes de la colonización de América. No obstante, estudios antropológicos 20 indican que pueblos semi-nomadas como los Comcáac han tenido influencia en la distribución de las especies en el golfo de California, translocando ejemplares de iguanas entre islas (Nabhan, 2002; 2003). Todas estas hipótesis deben ponerse a prueba con estudios genéticos más detallados a lo que se ha hecho anteriormente. Entre los marcadores moleculares que han sido probados para C. hemilopha están el ND4 (Reynoso et al., 2010), el gen alfa enolasa (Zarza et al., 2008), el gen citocromo b y el complejo oxidasa subunidad III (Cryder, 1999; Davy et al., 2011). Para microsatélites, Blazquez et al. (2006) diseñó 10 loci para C. hemilopha en isla Cerralvo, mientras que Zarza et al. (2009) diseñó 10 microsatelites polimórficos para C. pectinata y fueron probados en C. hemilopha, C. similis y C. oaxacana. Es necesario replantear un proyecto de investigación para las poblaciones de iguanas en el golfo de California que se apoye en distintos marcadores moleculares y muestreos poblacionales adecuados para resolver las incógnitas taxonómicas y evolutivas de estas poblaciones. Origen y geología del golfo de California La riqueza natural y la gran diversidad biológica que presenta el golfo de California es una de las más importantes a nivel mundial. El golfo de California se localiza en la unión de dos placas tectónicas, la placa del Pacífico (incluye Baja California) y la de Norte América (incluye Sonora y Sinaloa) que han tenido movimientos de separación de escala regional en los últimos 6 millones de años (Antonelis et al., 1999; Dixon et al., 2000). Estudios geológicos en Baja California, Sonora y Sinaloa indican que el golfo de California comenzó a formarse hace aproximadamente 12 millones de años (Karig y Jensky 1972; Oskin et al., 2001). Sin embargo, la evidencia actual muestra que la 21 extensión del golfo comenzó antes del Mioceno tardío; lo cual se reflejó en la composición del vulcanismo en la zona durante los últimos 30 millones de años (Ferrari et al., 2013). Durante el Mioceno medio, la península de Baja California se encontraba unida al continente (Carreño y Helenes, 2002). Por lo tanto, las más de 100 islas e islotes que existen en el golfo se formaron recientemente durante el Pleistoceno y el Holoceno (Carreño y Helenes, 2002). Las islas más grandes se encuentran en la parte central del golfo de California, entre las que están isla San Esteban e isla San Pedro Nolasco (Sonora). Por otro lado, isla Cerralvo (Baja California Sur) pertenece a la parte baja del golfo. Los orígenes de las islas San Pedro Nolasco y Cerralvo datan del Pleistoceno (Gastil et al., 1983). Sus características difieren en el tipo de rocas principales que hay en cada isla. Por ejemplo, San Pedro Nolasco se caracteriza por tener rocas granodioríticas y es probable que el origen de la isla fuera causado por fallamientos, mientras que isla Cerralvo posiblemente se originó por elevaciones de la corteza y presenta rocas de tipo basamento, rocas de origen volcánico del Mioceno y marinas del Pleistoceno (Gastil et al., 1983; Hausback, 1984; Londsdale, 1991). Por último, isla San Esteban se formó en el límite entre el Pleistoceno-Holoceno con un origen por fallamiento, erosión y elevación de la corteza. Además, se caracteriza por tener rocas de tipo basamento, volcánicas del Mioceno y marinas del Mioceno y Plioceno (Gastil et al., 1983; Desonie, 1992; Gastil et al., 1999). La presencia de rocas marinas del Mioceno, Plioceno y Pleistoceno en las islas mencionadas, indican la entrada de agua y la reciente formación de estas estructura en los 22 últimos 5 millones de años. Esta información es importante para entender los procesos de colonización, migración y distribución de muchos grupos de vida terrestre que habitan en la región de las islas del golfo de California. 23 MATERIALES Y MÉTODO Descripción del área de estudio y colecta de datos Se seleccionaron cinco poblaciones de iguanas del género Ctenosaura ubicadas en el desierto sonorense y las islas del golfo de California. Debido a la historia que presentan los distintos linajes de iguanas, se centró interés en las poblaciones de isla San Esteban, isla San Pedro Nolasco e isla Cerralvo que se compararon con demes continentales en Hermosillo y San Carlos, Sonora (Figura 1). Figura 1. Ubicación geográfica de las poblaciones de muestreo donde: A) isla San Esteban, B) isla San Pedro Nolasco, C) isla Cerralvo, D) Hermosillo y E) San Carlos. En el desierto sonorense y golfo de California el clima es árido, con lluvias principalmente en verano, entre los meses de julio y agosto. La precipitación anual oscila entre los 400 y 450 mm, en tanto que la temperatura máxima promedio es de 38 °C con un promedio anual de 22 °C y una temperatura mínima promedio de 5 °C (Dimmitt, 2000). En las islas estudiadas los puntos más altos van de 300 a 700 msnm; mientras que 24 las zonas peninsulares y continentales presentan altitudes entre 40 a 200 msnm (Cuadro 2). Las dos poblaciones continentales analizadas fueron Hermosillo y San Carlos en el estado de Sonora, México. En esta región se distribuye Ctenosaura macrolopha Smith, 1972, especie descrita recientemente (Grismer, 2002). Se eligieron estas dos poblaciones debido a que son las poblaciones más cercanas geográficamente con las islas San Esteban y San Pedro Nolasco respectivamente y pueden jugar un papel importante en la historia evolutiva y migraciones de los linajes de iguanas de la región. Para todas las localidades estudiadas se colectaron 30 individuos en cada una. Colecta de individuos y tejido Las iguanas de las poblaciones isleñas fueron colectadas con garrochas-lazo o de manera manual y para las poblaciones continentales fue mejor la captura por medio de trampas Tomahawk. De cada ejemplar se colectaron 0.3 ml de tejido sanguíneo depositado en tubos de 2 ml con alcohol al 96%. Las extracciones de ADN genómico se conservan en la Colección Nacional de Anfibios y Reptiles del Instituto de Biología de la UNAM a una temperatura de -40 °C. Cuadro 2. Datos geográficos y ubicación de las poblaciones analizadas. Población Ubicación Posición geográfica Altitud (m snm) Isla San Pedro Nolasco Mar de Cortés, Sonora, México 27° 58’ 24.09’’ N 111° 22’ 38.22’’ O 362 Isla San Esteban Mar de Cortés, Sonora, México 28° 41’ 21.7’’N 112° 33’ 2.6’’ O 755 Isla Cerralvo Mar de Cortés, Baja California sur, México 24° 9’ 33’’ N 109° 51’ 48’’ O 460 25 Hermosillo Sonora, México 29° 1’ 7’’ N 110° 55’ 9’’ O 216 San Carlos Sonora, México 27° 58’ 4.3’’ N 111° 1’ 17.9’’ O 40 Trabajo de laboratorio Extracción de ADN. Se realizó la extracción de ADN genómico por medio del método de extracción salina propuesto por Aljanabi y Martínez (1997). Para obtener una mayor concentración de material genético se realizaron algunas modificaciones en la cantidad de sustancias utilizadas en el método original (Apéndice 1). La calidad y concentración del ADN se observaron en geles de agarosa al 1%. Los geles fueron teñidos con red gel 1µL/mL y se corrieron en buffer TAE 0.5X utilizando un marcador de peso molecular de 100pb (Invitrogen; Ciudad de México). Amplificación de genes mitocondriales y microsatélites. Para los genes mitocondriales y microsatélites se prepararon reacciones de PCR con un volumen final de 25 µL. Las concentraciones finales de la reacción fueron: 50 ng de ADN genómico, 1 U de Taq polimerasa (Invitrogen), 1X de buffer para PCR, 0.2 mM de dNTP (invitrogen), 0.2 µM de cada primer y 1.5 mM de MgCl2. El gen ND4 se amplificó siguiendo los criterios de Zarza et al. (2008). El gen COIII se amplificó bajo el protocolo de Davy et al. (2011) y los loci de microsatélites se amplificaron según los protocolos mostrados en Blazquez (2006) y Zarza (2009) con algunas modificaciones según se muestra en el apéndice 2. Los microsatélites amplificados fueron los locus: Cthe 12, Cthe 26, Cthe 19, Cthe 21, Pec 16 y Pec 21 propuestos por Blazquez (2006) y Zarza (2009). Las amplificaciones de microsatélites se realizaron entre 16 y 30 iguanas por cada una de las poblaciones mientras que se 26 amplificaron entre 10 y 20 individuos para los genes mitocondriales según el grado de dificultad de los marcadores (Cuadro 3). Cuadro 3. Número de ejemplares amplificados por población para genes mitocondriales y microsatélites. Marcador Hermosillo San Carlos Isla Cerralvo Isla San Pedro Nolasco Isla San Esteban Gen ND4 12 16 19 20 7 Gen COIII 19 20 17 20 9 6 Loci de microsatélites 16 23 24 30 28 Los productos de PCR fueron visualizados en geles de agarosa al 1.5 % teñidos con red gel 1 µL/mL. Los geles se corrieron en buffer TAE 0.5 X utilizando un marcador de peso molecular de 100 pb (Invitrogen). Los fragmentos del genoma mitocondrial y microsatélites se analizaron en el secuenciador del Instituto de Biología de la UNAM. Para la secuenciación de microsatélites se prepararon reacciones de PCR de 10 µl que contenían 8.9 µl de formamida, 0.1 µl de ROX 500 (Applied Biosystems) y 1 µl de reacción de amplificación de PCR. Análisis de datos Visualización, edición y lectura de marcadores. Las secuencias mitocondriales fueron visualizadas y editadas con el programa CromasPro v.2.4 (Technelysium, 2012). Para el alineamiento, se utilizó el algoritmo de MUSCLE (Edgar, 2004) en el programa MEGA 7.0.14 (Tamura et al., 2011). Del mismo modo, se corroboró la edición y alineamiento de las secuencias de forma manual utilizando BioEdit v.7.2.5 (Hall, 1999). Para la lectura de los outputs que contenían los alelos de microsatélites obtenidos del secuenciador fueron importados al programa GeneMarker v.2.6.4 (SoftGenetics, State 27 College, USA). Posteriormente, se generó una matriz de alelos en GenAlex v.6.5 (Peakall y Smouse, 2012) y fueron analizados con Micro-Checker v.2.2.3. (Oosterhout et al., 2004). El análisis de Micro-Checker mostró que no existe evidencia de pérdida de alelos. Sin embargo, en algunos loci se puede presentar alelos nulos, lo cual es sugerido debido al exceso de homocigotos presente en la mayoría de los loci analizados. Los stutters presentes de manera normal en microsatélites son el resultado de errores en el puntaje de secuenciación o por la escasez de genotipos heterocigotos. Estos stutters no se presentaron en las muestras analizadas. En los seis locus analizados los valores anteriores fueron significativos. Diversidad genética. Para estimar la diversidad genética mitocondrial se calculó el número de sitios segregantes (s), número de haplotipos, número de sitios polimórficos, la diversidad haplotípica (Hd), el promedio de heterócigos en las subpoblaciones (Hs), la diversidad nucleotídica () y la tasa de mutación poblacional (Theta de Watterson, 1975), utilizando las fórmulas de Nei (1987), con el programa DNAsp v.5.10 (Librado y Rozas, 2009), de acuerdo a: Hd = 2𝑛(1 − Σ𝑃𝑖2) (2𝑛 − 1) Donde: Hd= diversidad haplotípica. n= número de individuos en la muestra. pi= frecuencia del i-ésimo haplotipo. = 𝑛 𝑛 − 1 𝛴 𝑝𝑖𝑝𝑗 𝑖𝑗 Donde: 28 π=Diversidad nucleotídica n= número de secuencia examinadas. pi= frecuencia de la secuencia i. pj= frecuencia de la secuencia j. Ɵ𝑠 = 𝑃𝑛 𝐴 Donde: ϴs=Tasa de mutación poblacional. Pn= número de sitios segregantes en las secuencias examinadas. A= 1+1+1/2+…+ (n-1)-1 donde n es el número de secuencias examinadas. Con la información microsatelital se realizó un test de equilibrio Hardy-Weinberg por locus utilizando 100,000 pasos de cadenas de Markov con el programa Arlequin v.3.5.1.2 (Excoffier y Lischer, 2010). La heterocigosis microsatelital esperada se calculó con la fórmula de Nei (1987) también con Arlequin, de acuerdo a: 𝐻𝑒 = 𝑛 𝑛 − 1 (1 − ∑ 𝑝𝑖2 𝑘 𝑖=1 ) Donde: n= número de individuos en la muestra total. k= número de alélos. pi= frecuencia en la muestra del i-ésimo haplotipo. Diferenciación poblacional y flujo genético. Para ADN mitocondrial se utilizó el programa DNAsp v.5.10.1 (Librado y Rozas, 2009) para calcular el grado de 29 diferenciación entre poblaciones divididas por medio del estadístico Fst con la fórmula de Hudson et al. (1992) que se utiliza en secuencias nucleotídicas: 𝐹𝑠𝑡 = 1 − 𝐻𝑤 𝐻𝑏 Donde: Hw= diferencias pareadas promedio entre distintas secuencias para una misma población. Hb= diferencias pareadas promedio entre distintas secuencias de dos poblaciones. Asumiendo que las poblaciones se encuentran en equilibrio entre selección y deriva (Wright, 1951), se calculó por medio de la Fst el número de migrantes efectivos (Nm) para poblaciones haploides con la fórmula: 𝐹𝑠𝑡 = 1 (1 + 2 𝑁𝑚) Donde: N= valor del tamaño poblacional. m= tasa de migrantes efectivos. También se calculó el coeficiente de diferenciación genética Gst, un estadístico equivalente a la Fst de Wright (1951). Este estimador se utiliza principalmente en secuencias nucleares y mitocondriales y se basa en las formulas propuestas por Nei (1987). Gst funciona de la misma manera que Fst, cuando la diversidad genética de la población es baja, la diferenciación entre poblaciones es muy alta. Para calcularlo se utilizó: 𝐺𝑠𝑡 = 𝐷𝑠𝑡 𝐻𝑇 Donde: Dst= diversidad genética promedio entre subpoblaciones. 30 HT= diversidad genética en la población total. Con DNAsp v.5.10.1 también se calculó el Nst (Lynch y Crease, 1990). Otro estimador equivalente al Fst que se utiliza para secuencias y que es similar a la Fst de Hudson et al. (1992). Sin embargo, Nst utiliza la corrección de Jukes y Cantor (1969) cuyo modelo asume una única tasa de sustitución para cada nucleótido de una secuencia. Con los valores de Nst se analizó la relación entre el promedio de la distancia genética entre distintas poblaciones con relación a la población total. Un valor de Nst de cero indica que no existe subdivisión poblacional. 𝑁𝑠𝑡 = 𝜐𝑏 𝜐𝑤 + 𝜐𝑏 Donde: ʋb= número promedio de sustituciones por sitio nucleotídico entre todas las poblaciones. ʋw= grado de diferenciación de cada población representado por el número promedio de sustituciones por sitio nucleotídico. Para microsatélitesse calculó el índice de diferenciación Fst que representa una correlación de alelos tomados al azar dentro de una subpoblación relativa al resto de la población. Este cálculo se realizó con el programa GenePop v.4.5.1 (Raymond y Rousset, 1995). Del mismo modo se calculó el índice de fijación Fis y se evaluó la desviación del equilibrio Hardy-Weinberg con el índice Fit (Cockerham, 1973; Weir y Cockerham, 1984) evaluando el nivel de significancia de cada uno de ellos. Los índices se establecieron de acuerdo a: 1 − 𝐹𝑖𝑡 = (1 − 𝐹𝑠𝑡)(1 − 𝐹𝑖𝑠) 𝐹𝑠𝑡 = 𝐹𝑖𝑡 − 𝐹𝑖𝑠 1 − 𝐹𝑖𝑠 31 Además del índice Fst se calculó el estadístico Rst (Goodman, 1997) con el programa Gene Pop. Rst es un análogo a Fst y es equivalente a la fracción del total de la varianza en el tamaño de los alelos en términos de unidades repetidas. Rst es representado por: 𝑅𝑠𝑡 = Ã − 𝐴𝑤 Ã Donde: Ã= Varianza en el tamaño de los alelos en d poblaciones. Aw= Varianza promedio de los alelos dentro de una población. Los valores de Nm se calcularon con la fórmula propuesta para secuencias considerando que Fst= 1/ (1+ 4 Nm) en microsatélites. Los valores de Nm a partir del Rst se calcularon de la misma manera, tomando en cuenta que Rst= 1/ (1+ 4 Nm). También con GenePop v.4.5.1 se calculó el número de migrantes efectivos Nm para las poblaciones en total. El cálculo de Nm se basa en los análisis de regresión de Barton y Slatkin (1986) que consideran el método de alelos privados. Para realizar el método de alelos privados se consideró el tamaño de los alelos (Rst) en lugar de la identidad del alelo (Fst). Lo anterior se realizó con el fin de ajustar los resultados al modelo de mutación que presentan los marcadores microsatélites. Estructura poblacional. Para ADN mitocondrial se calculó el número de migrantes efectivos para la Nst total de todas las poblaciones con el programa DNAsp v.5.10.1, utilizando la misma fórmula de Fst para poblaciones haploides. También se utilizó el programa SAMOVA 2.0 (Análisis Espacial de la Variación Molecular por sus siglas en inglés; Excoffier et al., 1992; Dupanloup et al., 2002) para definir los grupos o 32 poblaciones que son geográficamente homogéneos basándose en el grado de diferenciación genética. El programa SAMOVA identifica los grupos genéticamente similares y las barreras genéticas que existen entre esos grupos. El método tiene como objetivo maximizar la proporción de la varianza genética total según las diferencias entre las poblaciones. Para lograrlo, se estimó el valor de Fct que mide la proporción de la varianza genética entre poblaciones. El análisis espacial de variación molecular permite escoger un valor de grupos k y estimar las posibles barreras para los grupos conformados. De entre todos los valores de k, el programa elige el que tenga el valor de Fct más alto y explique un mayor porcentaje de variación genética. Para realizar el análisis se consideraron tres grupos o valores de k: 2, 3 y 4 utilizando 100 estados iniciales para cada corrida durante 10 000 interacciones. Por último, con el programa Arlequín v.3.5.1.2 se realizó un AMOVA (Análisis de Varianza Molecular, por sus siglas en inglés) que permite determinar el porcentaje de variación dentro y entre grupos. Este análisis se realizó para los datos de los genes mitocondriales y para los microsatélites y se corrieron 10,000 permutaciones que corroboran la significancia estadística del análisis. Para determinar si la variación depende de la distribución geográfica de las poblaciones, se dividió el análisis en tres AMOVAs. El primer AMOVA incluye como un grupo a las poblaciones del continente e isla Cerralvo y como un segundo grupo a las poblaciones isleñas. El segundo AMOVA separa a cada una de las islas como grupos independientes y deja dentro de un solo grupo a las poblaciones continentales de Hermosillo y San Carlos. El último AMOVA considera a las poblaciones continentales y la isla Cerralvo como un grupo, isla San Pedro Nolasco como un segundo grupo y a isla San Esteban como un tercer grupo. 33 Para evaluar la estructura de las poblaciones se utilizó el programa STRUCTURE v.2.3.4 (Pritchard et al., 2000). Dicho programa utiliza un método bayesiano de Clusters (Pritchard et al., 2000) para inferir la estructura de las poblaciones. En este método se infiere un número posible de poblaciones las cuales se nombran “k” donde a cada población se le asigna valores en sus genotipos. En el caso de microsatélites los valores de los genotipos son representados por el tamaño de los alelos. Por medio de un análisis de probabilidad, STRUCTURE asigna a los distintos individuos de la muestra total “N” hacia una de las poblaciones “k”. El método asume que las poblaciones se encuentran en equilibrio Hardy-Weinberg y en equilibrio de ligamiento. Como parámetros de análisis se utilizó un L.B.P (Length of Burnin Period) de 30,000 y 150,000 repeticiones de MCMC después del burnin. Además, se utilizó un modelo de ancestría mezclado (Admixture Model) y un modelo de frecuencias alélicas correlacionado. Para evaluar el número de “k” se utilizaron los métodos de Evanno, Delta K, tasa de cambio de la distribución de la verosimilitud y probabilidad de verosimilitud (Pritchard y Wen, 2004; Evanno et al., 2005; Cegelski et al., 2006). Aislamiento por distancia. Para ADN mitocondrial se calcularon las distancias genéticas de Nei (1987) con el programa Arlequin v.3.5.1.2 (Excoffier et al., 1992). Con las distancias obtenidas se calculó un árbol de distancias en el programa MEGA 7.0.14 (Tamura et al., 2005) utilizando el algoritmo Neighbour-Joining. Del mismo modo se realizó una prueba Mantel (1967) con MEGA para analizar si existe aislamiento por distancia entre las poblaciones estudiadas. Para la prueba Mantel se analizó la significancia en la correlación de matrices que consistieron en los datos obtenidos de la 34 Fst y las distancias geográficas pareadas obtenidas con Google Earth. Del mismo modo, se realizó una prueba Mantel para los loci de microsatélities utilizando los valores de Fst y Rst para las poblaciones pareadas con 10,000 permutaciones; analizando la significancia en la correlación de matrices de los datos de los índices Fst y Rst junto con las distancias geográficas pareadas obtenidas de Google Earth. Para identificar las barreras geográficas que impiden el flujo entre demes se realizó una prueba de autocorrelación espacial con el programa Barrier v.2.2 (Manni et al., 2004). El programa utiliza un método de regresión para medir la relación entre las distancias genéticas a partir de las Fst linealizadas y las coordenadas geográficas de los demes. En el análisis, se utiliza el algoritmo de diferenciación máxima de Monmonier (1973) donde la correlación falla si existen barreras geográficas conocidas. Las barreras generadas a partir del análisis representan las zonas de cambio abrupto en los patrones de variación genética. Generalmente, existirán muchas barreras geográficas cuando la asociación entre distancias genéticas y geográficas son bajas y viceversa. Para el análisis se utilizaron las Fst linealizadas obtenidas de Arlequín v.3.5.1.2 y las coordenadas geográficas pareadas obtenidas a partir de Google Earth. Análisis filogeográfico Inferencia bayesiana. Se utilizó el programa JModelTest v.2.1.7 (Posada, 2008) para buscar el modelo de sustitución nucleotídica que mejor se ajusta a los datos del gen ND4 y del COIII. Para el gen ND4 se escogió el modelo GTR mientras que para el COIII se trabajó con el modelo HKY. Para ambos genes se utilizaron como grupos externos secuencias de C. pectinata, I. iguana, S. klauberi, S. varius y S. ater (Cuadro 4). Las 35 secuencias de los grupos externos fueron obtenidas del GenBank y se alinearon con el algoritmo MUSCLE en el programa MEGA 7.0.14 (Tamura et al.,2011). Del mismo modo, se corroboró la edición y alineamiento de las secuencias de forma manual utilizando BioEdit v.7.2.5 (Hall, 1999). Para generar el cronograma de divergencia e inferencia bayesiana se utilizó el programa BEAST v.1.8.2 (Drummont et al., 2007). Se trabajó con el modelo de reloj log normal relajado por recomendación de Drummont et al., (2007) así como la tasa de sustitución molecular propuesta por Zarza et al. (2008) para el gen ND4. Para estimar la longitud de las ramas se utilizó un previo coalescente (tamaño constante) aplicando los modelos evolutivos reportados (GTR y HKY). Este modelo se corrió por 100,000,000 generaciones de cadenas de Montecarlo para ambos genes muestreando cada 1000 generaciones. Los resultados y la calidad del análisis fueron evaluados con Tracer v.1.6 (Rambaut y Drummond, 2007). Por último, se generó un árbol de máxima credibilidad a con TreeAnnotetor v.1.8.2 (Drummont et al., 2007) muestreando cada 1000 árboles al azar y bajo una probabilidad posterior de 0.01. Cuadro 4. Haplotipos utilizados como grupos externos para los análisis filogenéticos. Organismo Clave de acceso a Genbank Referencia ND4 Ctenosaura pectinata EU246780.1 Zarza et al., 2008 C. pectinata EU246779.1 Zarza et al., 2008 C. pectinata EU246778.1 Zarza et al., 2008 C. pectinata EU246777.1 Zarza et al., 2008 Sauromalus klauberi HM352519.1 Stephen et al., 2013 Sauromalus varius U66233.1 Sites et al., 1996 Iguana iguana JQ340914.1 Stephen et al., 2013 I. iguana JQ340913.1 Stephen et al., 2013 COIII C. pectinata HQ141222.1 Davy et al., 2011 C. pectinata HQ141221.1 Davy et al., 2011 C. pectinata HQ141218.1 Davy et al., 2011 C. pectinata HQ141217.1 Davy et al., 2011 C. pectinata HQ141216.1 Davy et al., 2011 Sauromalus ater HQ141197.1 Davy et al., 2011 36 S. ater HQ141196.1 Davy et al., 2011 S. ater HQ141195.1 Davy et al., 2011 I. iguana AJ278511.2 Janke et al., 2001 Red de haplotipos. Con el programa DNAsp v.5.10.1 (Librado y Rozas, 2009) se obtuvo el número de haplotipos encontrados para ambos genes y la diversidad haplotípica de cada población. Con esos datos se construyeron dos redes de haplotipos para el gen ND4 y COIII con el programa Network v.5 (Bandelt et al., 1999). También se elaboró un mapa de la distribución de haplotipos a nivel geográfico. 37 RESULTADOS Diversidad genética Se analizaron 688 pares de base en 72 secuencias del gen ND4 para las iguanas de las cinco poblaciones. Se encontraron 35 sitios polimórficos y 36 mutaciones en la muestra total. El valor promedio de la tasa de mutación θW fue de 0.0378 por sitio. Además, se encontraron 10 haplotipos en todas las muestras donde la mayor diversidad haplotípica se presenta en las poblaciones de iguanas insulares de isla San Esteban e isla San Pedro Nolasco (Cuadro 5). En las muestras, los valores de diversidad haplotípica fluctúan entre 0 y 0.5277. Para el gen COIII se analizaron 672 pares de bases en 75 secuencias donde se observaron niveles de variación molecular más altos que con el gen ND4. Se encontraron 53 sitios polimórficos y 58 mutaciones (Cuadro 5). La diversidad nucleotídica total fue alta para los genes ND4 y COIII (ND4, Hd=0.8024 y COIII, Hd=0.9290). Sin embargo, esta diversidad no se reflejó a nivel poblacional ya que está sesgada por la diversidad encontrada en las poblaciones continentales y en la población de San Pedro Nolasco. La diversidad nucleotídica de las poblaciones varía entre 0.0001 y 0.0181 para ambos genes mientras que el valor promedio de la tasa de mutación θW fue de 0.0243 por sitio. Veintitrés haplotipos se encuentran distribuidos entre las cinco poblaciones donde la mayor diversidad haplotípica se presentó en la población de Hermosillo (Hd= 0.9454). Casi todas las poblaciones de iguanas presentan haplotipos únicos en ambos genes. Solamente San Carlos y Hermosillo, ambas poblaciones continentales, comparten un haplotipo del gen ND4 y otro del gen COIII. Históricamente, estas poblaciones pertenecen a un solo linaje o especie conocido como C. macrolopha. 38 Los resultados demuestran que el gen COIII es más informativo que el gen ND4 en el estudio de las poblaciones de iguanas. Considerando ambas regiones del genoma mitocondrial hay una alta diversidad genética en las poblaciones continentales (Hermosillo + San Carlos) y sobre todo isla San Pedro Nolasco. Además, Isla San Pedro Nolasco presenta el mayor número de mutaciones encontradas en los haplotipos con 40 y 23 mutaciones para los genes COIII y ND4 respectivamente. Por el contrario, las poblaciones de isla Cerralvo e isla San Esteban muestran baja diversidad en ambas regiones mitocondriales. Dichas poblaciones resultaron ser monomórficas para el gen ND4 y se encontraron dos y tres haplotipos respectivamente para el COIII. En San Esteban y Cerralvo, el número de haplotipos encontrados en el gen COIII es bajo en comparación con la alta diversidad del continente y San Pedro Nolasco. En el análisis de microsatélites la heterocigosis reportada para el conjunto de loci fue de 0.7697. Sin embargo, cada uno de los locus presenta un déficit de heterocigosis de manera significativa (Cuadro 6), donde el valor observado de heterocigosis se encuentra muy por debajo de los valores esperados bajo condiciones de equilibrio Hardy-Weinberg. Lo anterior ocurre a nivel de locus para todas las poblaciones en promedio y puede deberse a efectos de endogamia, subdivisión poblacional o a los alelos nulos que se reportaron en el análisis con Microchecker. Los valores de reportados en Arlequin muestran que de manera general ninguna de las cinco poblaciones se encuentra en equilibrio Hardy-Weinberg y presentan déficit de heterocigosis (Cuadro 7). En el análisis general realizado con Micro-Checker también se identificaron valores bajos de heterocigosis debido a la presencia de alelos nulos. 39 En Hermosillo, San Carlos y Cerralvo se presentan cuatro loci fuera de equilibrio Hardy-Weinberg, mientras que en Nolasco y San Esteban la mitad de los loci presentan desviación de equilibrio (Cuadro 7). Para este tipo de marcadores una baja en la heterocigosis se interpreta como una consecuencia de la estructura poblacional, efectos producidos por deriva génica o presencia de alelos nulos (Hedrick, 2010). Cuadro 5. Medidas generales de variación genética para secuencias. Donde: S = número de sitios segregantes, P = número de sitios polimórficos, H = número de haplotipos, Hd = diversidad haplotípica, K = número promedio de diferencias nucleotídicas, π = diversidad nucleotídica y θW = tasa de mutación por sitio o Theta de Watterson. Población Número de individuos Mutaciones S P H Hd K π θW Gen ND4 Isla San Esteban 9 4 0 3 1 0 0 0.0064 0.0091 Isla Cerralvo 19 0 0 0 1 0 0 0.0008 0.0016 Isla San Pedro Nolasco 30 23 15 23 5 0.5839 6.0275 0.0208 0.0139 Hermosillo 12 3 0 3 1 0 0 0.0007 0.0015 San Carlos 17 20 12 20 3 0.2279 1.4117 0.0060 0.0132 Valor total 87 31 31 31 10 0.8024 7.2456 0.0236 0.0248 Gen COIII Isla San Esteban 8 1 1 1 2 0.5857 0.5357 0.0008 0.0005 Isla Cerralvo 18 3 3 3 3 0.2156 0.3333 0.0005 0.0013 Isla San Pedro Nolasco 18 40 29 37 13 0.9607 12.1241 0.0237 0.0187 Hermosillo 11 23 18 20 8 0.9454 4.3818 0.0129 0.0165 San Carlos 20 22 15 22 9 0.8157 2.0105 0.0056 0.0128 Valor total 75 63 55 83 33 0.9290 12.8832 0.0235 0.0247 40 Cuadro 6. Valores de heterocigosis observada (Ho), heterocigosis esperada (He) y grado de significancia (P) para los loci de microsatélites. Locus Ho He P Cthe12 0.5185 0.6954 0.00000 Cthe26 0.1626 0.4642 0.00000 Cthe19 0.4453 0.8345 0.00000 Cthe21 0.5409 0.8154 0.00000 Pec16 0.2672 0.9023 0.00014 Pec21 0.2695 0.9063 0.00000 Total 0.7697 Cuadro 7. Valores de heterocigosis
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