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Estudiando Biologia

28/7/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA
DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

“Identificación de los serotipos A, B, y C del
lipooligosacaridos (LOS) de Moraxella catarrhalis en aislados
clínicos de población mexicana”

T E S I S

QUE PARA OBTNER EL TÍTULO DE
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIOLOGA

PRESENTA
YOLANDA IBARRA ORTEGA

ASESOR: Dra. CAROLINA MARIA ANTONIETA ROMO
GONZÁLEZ
CO-ASESOR: M.C. ANDREA ANGELA BECERRIL OSNAYA

CUAUTITLÁN IZCALLI, ESTADO DE MÉXICO 2015

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

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respectivo titular de los Derechos de Autor.

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN
UNIDAD DE ADMINISTRACIÓN ESCOLAR
DEPART AMENTO DE EXÁMENES PROFESIONALES
U.N .• M.
r..eL ~ 't'..J )t _ :;n..."u.,
ASUNT<W~~ATORlO
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!'<~"1I".."rP
ATN: M. EN A.ISMAELHE MAURlCIO
Jefe del Departamento de
EXA
Con base en el Reglamento General de Exámenes, y la Dirección de la Facultad, nos permitimos
comunicar a usted que revisamos el : Trabajo de Tesis
Identificación de los serotipos A, B Y e de lipooligosacáridos (LOS) de Moxarella cataffhalís en aislados clínicos de
población mexicana
Que presenta la pasante: Yolanda Ibarra Ortega
Con número de cuenta: 305047160 para obtener el Titulo de: Química Faffnacéutica Bióloga
.."
Considerando que dicho trabajo reúne los requisitos necesarios para ser discutido en el EXAMEN PROFESIONAL
correspondiente, otorgamos nuestro VOTO APROBATORIO.
ATENTAMENTE
"POR MI RAZA HABLARA EL EspíRITU"
Cuautitlán Izcalli , Méx. a 06 de Octubre de 2014.
PROFESORES QUE INTEGRAN EL JURADO
NOMBRE
PRESro ENTE M. en C. Andrea A. Becerril Osnaya
VOCAL Q.F.B. Dulce María Ru\'alcaba Sil
Sr.CRr.TARIO M. en C. Nydia Berenice González Angeles
ler. SUPLENTE Q.F.B. Verónica Ruiz Solorio
2do. S[PLENTE Q.F.B. Jonalhan Pablo Paredes Juárez
NafA: los slnCldales suplentes están obligados a presentarse el día V hora del Examen Profesional (art.I27).
IHM/mmgm
FIRMA

Soy de los que piensan que la ciencia tiene una gran belleza. Un científico en su laboratorio no
es sólo un técnico: es también un niño colocado ante fenómenos naturales que le impresionan
como un cuento de hadas.
Marie Curie

AGRADECIMIENTOS

Primeramente a Dios por haberme dado la fuerza y fe para creer en lo que me parecía imposible de
terminar, por nunca dejarme sola y darme ese rayo de luz en medio de toda la oscuridad que en
ocasiones se presentaba, por haberme dado esta misión la cual afronto y llevare acabo de la mejor
manera posible.
A mis padres porque además de darme la vida me ofrecieron uno de los mejores regalos mis estudios,
gracias por su apoyo, paciencia pero sobretodo amor. Mamá todas las aventuras en las que estuviste
conmigo valieron la pena, papá tu sueño se hizo realidad y ahora tienes la Química que alguna vez
pediste.
A mis hermanos gracias por estar en todo momento conmigo, a ti Yadi por las desveladas que te
ocasione cuando esta tesis estaba en proceso, Paco porque a pesar de que no te veía tan seguido sabía
muy bien que estabas conmigo y siempre me presionabas diciendo para cuando, hoy puedo decirles lo
logramos.
A mis sobrinos: Mi motor por que más que mis sobrinos puedo decirles que son como mis hijos,
gracias ya que con cada una de sus ocurrencias hacían que me estresara menos porque de ustedes
aprendí que la vida es simple y no hay porque complicarla simplemente se debe disfrutar. Siempre
tengan presente que los Amo.
A mi Familia tíos, tías, primos, primas, sobrinos: Aun cuando la distancia de muchos es un poco
lejana siempre estuvieron presentes, dándome ánimos y diciéndome que si se podía. Y que creen que si
se pudo. Ahora solo puedo decirles Gracias prefiero no mencionar nombres ya que cada uno lo sabe,
además de que corro el riesgo de olvidarme de alguno y no quiero que pase eso.
Edgar Martínez S. Gracias por todo el apoyo que me brindaste en todos mis estudios, pero sobretodo
en la investigación la cual dio como resultado esta tesis, sorry por todas las veces que llegaste tarde a tu
trabajo por pasar a dejarme al Instituto recuerda que todo fue por una buena causa ;).
José Antonio Torrijos D. Porque desde clases de cálculo, física, desmañanadas y un sinfín de cosas
usted ya era parte de todo esto. Hoy simplemente me queda decirle GRACIAS por todas y cada una de
las cosas en las que dio su aportación para que esta tesis ahora sea una realidad.
Club de los masajes: Omar Pacheco, Isabel, Roxana Pastrana, Julio César Venegas, Renni,
Jessica Arredondo, Nayely. Gracias no solo por el apoyo que me brindaron en todo este proceso, sino
también porque me hicieron disfrutar aún más de los últimos semestres de la carrera, porque cada
aventura a su lado fue increíble. Y lo mejor ustedes más que mis mejores amigos son una parte
importante en mí, puedo decir que son unos hermanos más que la Facultad me regalo, saben que
siempre podrán contar conmigo y que aún nos faltan vivir muchas locuras juntos.
Eziel Hernández C: Mi niño porque aunque no estuviste desde un principio llegaste en el momento que
más frustrada estaba donde mis ideas estaban revueltas, pero que sin embargo siempre me diste una
palabra de aliento y me recordabas cada día que esto valdría la pena, gracias por estar ahí aun cuando
algunos kilómetros nos separaban no siendo estos una limitante al contrario todas las mañanas, tardes
y noches estuviste cerca, por desvelarte sin importar que tu debías trabajar al día siguiente, porque con
tus locuras hacías que los días fueran más leves, simplemente porque además de ser parte de esta
tesis, eres ahora parte de un nuevo proyecto tú y yo. Ich Liebe Dich!
Amigos: Adrián Téllez, David Ladislao, Olivia Carreón, Jorge Urban, Fany Ramírez, por mencionar
solo algunos ya que tengo la dicha de decir que la lista es Grande, sin embargo sé que aunque no
escriba el nombre de todos cada uno sabe que este agradecimiento es para ustedes quienes siempre
han estado conmigo apoyándome, haciendo que este camino que muchas veces es un poco complicado
sea más ligero y placentero. Por haberme dado el mejor regalo que cualquier ser humano pueda tener
su “amistad”. Gracias a ustedes esta tesis quedo lista.
Dr. Paris S. Córdoba, Dr. José Luis Sánchez, Dr. José Alberto Atristain: Gracias porque además de
ser unos grandes médicos y estar ahí cada que el estrés me consumía, fueron importantes en cada una
de todas las etapas que viví, porque cuando les platique de mi tesis además de apoyarme se vieron
interesados haciéndome ver que realmente todo lo que podía sufrir al realizarla iba a tener una
aportación importante por mínima que esta fuera. Ahora ustedes también son parte de ella de verdad
GRACIAS!
Dra. Carolina Romo: Porque siendo mi asesora titular de esta tesis, me ha ayudado y corregido en mi
labor científica con un interés y una entrega que han sobrepasado por mucho las expectativas que como
alumna deposite en su persona, después de todos estos años tenemos un pequeño resultado de toda
esta investigación pero el mejor resultado que obtuve fue haber conocido a la gran persona que es usted
infinitas GRACIAS por el apoyo, confianza y dedicación que siempreme brindo.
Maestra Andrea Becerril: Porque además de haber sido mi maestra y haberme compartido sus
conocimientos y ahora ser mi co-asesora es una de las personas que me enseño que siempre debo dar
mi mejor esfuerzo en cada una de las cosas que realice, que la disciplina y las llamadas de atención son
la base de resultados satisfactorios. Gracias por estar siempre apoyándome y ser una pieza fundamental
de esta tesis.
Profesores: Gracias a todos sin importar si son buenos o malos en lo que hacen de todos aprendí y me
llevo varias cosas, muchos me hicieron ver lo maravillosa y fantástica que puede ser tanto su materia
impartida, la carrera, la vida y los maravillosos seres humanos que hay escondidos detrás de lo que
llamamos “Maestros”, de otros aprendí que el coraje, envidia y frustración siempre estarán presentes y
que en lugar de amar esa profesión y ver como una misión para trasmitir el conocimiento a los demás
solo están encaprichados en ser pequeños obstáculos en el camino, obstáculos que supere y que
además me hicieron crecer como ser humano y como profesionista.
Personal del INP: Gracias a todo el personal de los distintos laboratorios a los cuales acudí en algún
momento para que yo pudiera realizar esta investigación, gracias principalmente a todo el personal del
laboratorio de bacteriología ya que me acogieron con calidez durante todo el tiempo en el que se
desarrolló la parte práctica de esta tesis, por hacerme sentir como otra más del personal, por
compartirme sus conocimientos y experiencias, pero sobretodo porque ahora me llevo grandes
amistades.
QBP. Pablo Domínguez Trejo, UMF 64: Muchas gracias por habernos permitido que esta investigación
tuviera esa materia indispensable para que pudiera desarrollarse, por todas las atenciones brindadas a
lo largo del año que estuvimos trabajando, por hacerme sentir un colaboradora más en su equipo de
trabajo.
Noel Schajris: Te preguntaras como es que formas parte de esta tesis, la respuesta es simple desde
que comencé a estudiar la carrera has estado ahí días y noches haciéndote presente con todas esas
letras que conocemos como canciones, porque además me has ayudado a ver la vida de diferente
manera y ver que todos somos ciudadanos del mundo y por lo tanto estamos aquí para cumplir una
misión. Gracias porque no solo eres un gran ser humano, compositor, padre y cantante, ahora también
formas parte de esta investigación porque bien lo dijiste UNO no es UNO. Te quiero infinitamente.
Raúl y José Luis Roma: Los hermanos Roma porque ustedes también merecen ser mencionados ya
que aunque no lo sabían fueron quienes me acompañaron durante el recorrido de mi casa al lugar de
investigación y viceversa, en las miles de horas que pase en el laboratorio, quienes a través de sus
canciones me devolvían un poco de paz y así escapaba del estrés del que todos somos víctimas.
Gracias por estar ahí y hacerme OIR AMOR.

GRACIAS A TODOS Y CADA UNO DE LOS ANTES MENCIONADOS por que fueron como ladrillos que
le dieron forma a esta construcción, ladrillos llenos de apoyo, paciencia, conocimientos, interés pero
sobre todo amor hacia mí, para que al concretar este proceso Yo fuera mejor persona y profesionista y
espero así sea porque aquí concluimos otro piso más del edificio, pero comenzamos con la etapa de la
obra que puede llevarnos a construir el edificio más alto. Infinitas y eternas Gracias por acompañarme
en este camino llamado vida, siempre tengan presentes que podrán contar conmigo.

Los quiere y ama:
YOLA

INDICE

I.- RESUMEN .............................................................................................................................. 11
II.- INTRODUCCION ...................................................................................................................... 2
II.I CLASIFICACION TAXONOMICA. ........................................................................................... 3
II.II CARACTERISTICAS GENERALES ....................................................................................... 4
II.II.I Características microbiológicas ............................................................................................. 4
II.III FACTORES DE VIRULENCIA ............................................................................................... 5
II.III.I Peptidoglucano: .................................................................................................................. 5
II.III.II. Proteínas de membrana externa: ......................................................................................... 5
II.III.III. Fimbrias .......................................................................................................................... 6
II.III.IV. Proteínas reguladoras del hierro ........................................................................................ 7
II.III.V. Lipooligosacarido .............................................................................................................. 7
II.IV. GENERALIDADES DE LOS LIPOPOLISACARIDOS Y LIPOOLIGOSACARIDOS .............. 7
II.IV.I El lipooligosacarido de M.cartarrhalis .................................................................................... 8
II.IV.II Estructura del lipooligosacarido .......................................................................................... 8
II.IV.III. Función del lipooligosacarido de Moraxella .......................................................................... 9
II.IV.III.I. Características del serotipo A ....................................................................................... 9
II.IV.III.II. Características del serotipo B ...................................................................................... 9
II.IV.III.III. Características del serotipo C ..................................................................................... 9
II.V. ENFERMEDADES ASOCIADAS ......................................................................................... 10
II.V.I Otitis media ....................................................................................................................... 10
II.V.II Sinusitis ........................................................................................................................... 10
II.V. III. Infecciones del tracto respiratorio inferior y de otras localizaciones ....................................... 10
II.V. IV. Exacerbaciones en pacientes con EPOC .......................................................................... 11
II.V.V. Neumonía en ancianos ..................................................................................................... 11
II.V. VI. Infección nosocomial ...................................................................................................... 11
II.V. VII. Otras infecciones en adultos ........................................................................................... 12
II.VI. RESPUESTA INMUNE A LA INFECCION DE M. catarrahalis .......................................... 12
II.VI.I. La respuesta inmune específica o adquirida ................................................................................. 12
II.VI.II. Estrategias de evasión inmune de M. catarrhalis ......................................................................... 13
III. JUSTIFICACION ................................................................................................................... 14
IV. HIPOTESIS ........................................................................................................................... 14
V. OBJETIVO GENERAL .......................................................................................................... 14
V.I. OBJETIVOS ESPECIFICOS ..............................................................................................................14
VI.- MATERIAL Y MÉTODOS ..................................................................................................... 15
VI.I Material biológico .................................................................................................................... 17
VI.II Colección de muestra biológica ................................................................................................ 17
VI.III Aislamiento e identificación de M. catarrhalis ............................................................................ 17
VI.IV Extracción y cuantificación de DNA de las colonias de M. catarrhalis .......................................... 17
VI.V Determinación de los lipooligosacáridos mediante reacción en cadena de la polimerasa(PCR) ..... 18
VI.VI. Preparación de la mezcla de PCR .......................................................................................... 19
VI.VII Condiciones de amplificación ................................................................................................. 19
VII.- RESULTADOS .................................................................................................................... 21
VII.I. Resultados por paciente: ........................................................................................................ 23
VII.II. Resultados de acuerdo a las colonias de M. catarrhalis de cada paciente ................................... 25
VIII.- ANÁLISIS DE RESULTADOS ............................................................................................ 28
IX.- CONCLUSIONES ................................................................................................................. 31
X.- ANEXO 1 MATERIAL Y REACTIVOS .................................................................................. 33
XI.- ANEXO 2 PREPARACIÓN DE REACTIVOS ....................................................................... 36
XII.- ANEXO 3 INICIADORES DE PCR ...................................................................................... 40
XIII.- ANEXO 4 CARTAS DE CONSENTIMIENTO ..................................................................... 42
XIV. - REFERENCIAS ................................................................................................................. 47

I.- RESUMEN
1

El presente trabajo consistió en la identificación de los serotipos A B y C de M. catarrhalis. Esta bacteria
es un diplococo Gram-negativo, aerobio, oxidasa positivo, que crece de 24 a 48 h en medios como agar
sangre, agar chocolate y AST. En los últimos 20 años, M. catarrhalis ha emergido como un importante
patógeno causante de infecciones en el tracto respiratorio superior de niños y ancianos, e infecciones
del tracto respiratorio inferior en adultos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC).
Aproximadamente, el 90% de las cepas son productoras de beta lactamasas. En México no existen
reportes sobre su caracterización genotípica así como de los serotipos prevalentes en nuestra población,
ya que ha sido hasta la fecha un microorganismo de la flora bacteriana normal del tracto respiratorio a
diferencia de otros países donde es considerada como un patógeno.

El estudio consistió en aislar M. catarrhalis de exudados faríngeos de pacientes adultos y niños, los
cuales eran remitidos por el médico a las UMF del IMSS 64. De los exudados faríngeos se aíslo
mediante medios de cultivo específicos y una vez teniendo colonias características, se realizaron las
pruebas bioquímicas primarias y secundarias para confirmar el género y especie. De cada paciente se
aislaron 5 colonias del crecimiento masivo, cada colonia (clona) se propago y congelo para su posterior
extracción de DNA y así llevar a cabo la identificación del serotipo. La identificación de los serotipos A, B
y C se realizó mediante la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en punto final,
cuya identificación del serotipo se refiere al tamaño de producto que presenta la amplificación de cada
uno.
Los resultados obtenidos fueron los siguientes: De un total de 151colonias (clonas) la prevalencia del
serotipo A y B fue 29.13% y 33.11% respectivamente, no presentándose ningún caso el serotipo C y un
47.01% no presento ninguno de los tres serotipos reportados. Al tener 5 colonias por cada paciente,
pudimos identificar que dentro de un mismo paciente puede haber más de un serotipo es decir, puede
encontrarse una infección mixta y hasta el momento este tipo de estudios mostrando infección mixta en
un mismo paciente no se han reportado para M. catarrhalis. El serotipo que predominó en adultos fue
el B y en el caso de niños en igual proporción el A y B resultando esto interesante, ya que de acuerdo a
lo reportado en la población infantil el serotipo que predomina es el A.
De tal forma que con esta investigación se ha obtenido información importante respecto a la
identificación de los serotipos reportados para M. catarrhalis por lo que se pretende que en poco tiempo
se logre conocer más acerca de esta bacteria la cual ha sido considerada por muchos años como flora
normal y no un patógeno en nuestra población.

II.- INTRODUCCION

II.I CLASIFICACION TAXONOMICA.
Durante la mayor parte del siglo pasado, M. catarrhalis fue considerado como un organismo comensal
del tracto respiratorio superior. Sin embargo, desde finales de 1970, ha sido evidente que es un
patógeno del tracto respiratorio humano.
M. catarrhalis tiene una interesante historia taxonómica, originalmente en Alemania en 1896 como
Micrococcus catarrhalis por Pfeiffer, para después en la década de 1950 recibir el nombre de Neisseria
catarrhalis, debido a sus similitudes en el fenotipo y nicho ecológico para las especies de Neisseria
comensales. Sin embargo, en 1963, Berger Mostró que este género puede llegar a contener dos
especies distintas Neisseria cinerea y Neisseria catarrhalis), que podrían ser separadas por bioquímicas
debido su capacidad para reducir el nitrato y el nitrito. Con la introducción de la tecnología de DNA,
estudios filogenéticos indicaron una falta de homología entre el DNA cromosómico, de Neisseria spp . y
N. catarrhalis , por lo que en 1970 la especie fue renombrada Branhamella catarrhalis y se trasladó al
nuevo género de Branhamella en honor a la famosa microbióloga Sarah E. Branham que había dirigido
anteriormente la investigación sobre Neisseria. Catorce años más tarde, Bovre sugiere cambiar el
nombre de Branhamella catarrhalis y se reasigno al género Moraxella, debido a la relación fisiológica y
genética distinta entre Branhamella catarrhalis y miembros del género Moraxella. (Fig 1)
Actualmente M. catarrhalis puede llegar a representar a dos diferentes sub -especies o incluso distintas
porque lo que su taxonomía seguirá siendo un estudio continuo. (Philip J, et al., 2006)

(Esparcia, et al)
4

II.II CARACTERISTICAS GENERALES
M. catarrhalis es un diplococo Gram negativo, cuya pared presenta una pequeña capa de
peptidoglicanos, bicapa externa, capa interna de fosfolípidos y capa externa de lipopolisacaridos
siendo esta ultima la diferencia con lo que respecta a la mayoría de las bacterias Gram (-) .
Esta bacteria crece de 24 a 48 h en medios comunes, como agar sangre, agar chocolate y AST
M. catarrhalis causa infecciones de las vías respiratorias superiores, principalmente otitis media, en
niños, mientras que en los adultos causa infecciones del tracto respiratorio bajo especialmente
exacerbación aguda de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica por sus siglas mejor conocida como
EPOC. (Philip J.et al.:2006)

II.II.I Características microbiológicas
M. catarrhalis presenta un aspecto redondo, gris, opaco y convexo y se puede empujar fácilmentedejando intacto el agar a lo largo de la superficie. Este fenómeno es el llamado “signo disco de hockey”,
además en agar sangre presenta una ausencia de pigmentación lo que la hace una bacteria no
hemolítica. (fig 2)

Este diplococo Gram negativo es difícil de distinguir de Neisseria spp. en una tinción de Gram típica por
lo que existen diferentes pruebas bioquímicas para distinguirla como la falta de fermentación de la
glucosa, lactosa, sacarosa, fructuosa y maltosa; también es capaz de llevar a cabo la reacción positiva a
la oxidasa así como la catalasa (fig. 3 y 4), lleva a cabo la reducción de nitrato y nitrito; realiza la
hidrólisis de tributirina (un éster de glicerilo isomérica de ácido butírico) y no utiliza 5% de sacarosa para
formar polisacárido y por último y no menos importante positiva la prueba DNAasa (fig 5)(Philip J.et
al.:2006; Manolov.T.et. al.:2009)
Fig.2 Colonias de Moraxella Catarrhalis en agar AST. (FESC:
2012)
5

II.III FACTORES DE VIRULENCIA
M. catarrhalis presenta diferentes factores de virulencia los cuales se mencionan a continuación:
II.III.I Peptidoglucano:

M. catarrhalis posee capas de peptidoglucano en su pared celular. Se ha demostrado que este
compuesto es el responsable de la activación de varias funciones de los macrófagos, por lo que estaría
implicado en un tipo de actividad suicida que explicaría la baja virulencia de esta bacteria. Parece como
si peptidoglicano estuviera involucrado en algún tipo de actividad suicida, y más estudios sobre los
mecanismos básicos de este fenómeno son sin duda necesarios. (Cees M et al:2002)

II.III.II. Proteínas de membrana externa:

Las proteínas de membrana externa (OMPs) de M. catarrhalis se clasificaron inicialmente en ocho tipos
principales de la A hasta la H, según la movilidad en geles SDS-PAGE, existiendo un alto grado de
similitud entre ellas, lo que las convierte en interesantes candidatos para vacunas. (Espacia O. Et al)

 CopB: esta proteína, llamada inicialmente OMP B2, de la cual no se conoce su función, aunque
parece estar implicada en la adquisición de hierro o la utilización de lactoferrina y transferrina
humana. También parece ser importante en la respuesta inmune frente a M.catarrhalis. Aunque
Fig. 3 Prueba positiva de catalasa
(FESC: 2012)
Fig. 4 Prueba positiva de la oxidasa
(FESC: 2012)

Fig. 5 Prueba positiva de la
DNA’asa (FESC: 2012)

la proteína CopB es un buen candidato para la vacuna, presenta el problema de variabilidad
serológica.

 Proteína CD: se ha demostrado que las OMPs inicialmente llamadas C y D son dos formas
estables de la misma proteína, ahora llamada CD. Aunque ésta parece ser una purina, por su
similitud con la proteína purinF del género Pseudomonas, su única función conocida es la unión a
la mucina humana. Esta unión es específica en la mucina del oído medio y nasofaringe, pero no
en la de saliva, ni de la secreción traqueo bronquial Aunque la secreción de mucina
generalmente se ha considerado como un mecanismo de defensa del huésped, la unión de M.
catarrhalis a la mucina le sirve de adherencia a modo de promover la invasión de la bacteria. La
alta capacidad inmunogénica de la proteína CD y su secuencia altamente conservada entre
distintas cepas, hace de ella un prometedor candidato para la investigación de vacunas.

 Proteína E: aunque su función es desconocida, se piensa que está implicada en la captación de
nutrientes para la bacteria, como el transporte de ácidos grasos. Además, recientemente se le ha
relacionado con el mecanismo de defensa mediado por el sistema de complemento. A pesar de
ser una proteína altamente conservada, su inmunogenicidad es baja, y por el momento no se
considera un buen candidato para la vacuna.

 UspA: además de las OMPs A a H, se ha descrito una nueva OMP, llamada HMW-OMP o
proteína de superficie ubicua (UspA), que recientemente se ha visto que son dos proteínas
diferentes UspA-1 y UspA-2. Se han propuesto diferentes funciones a estas dos proteínas. UspA-
1 está asociada con la capacidad adherente de la bacteria a las células epiteliales del
hospedador, mientras que a UspA-2 se le ha relacionado con la resistencia de M. catarrhalis a la
actividad bactericida del suero humano, al tener la capacidad de unirse a la vitronectina, un
regulador del sistema de complemento. Ambas proteínas purificadas son inmunogénicas y con
una potencial capacidad protectora, lo que las convierte en candidatas para vacunas.

 MID/Hag: Es una proteína de 200kDa también referida como Hag se ha encontrado que es
responsable de la unión de M. catarrhalis con IgD para la estimulación de linfocitos B. MID
también es un estimulante mitogeno de linfocito B que inicia la producción de Ig D (Gjorloff
Wingren, et al., 2002). Básicamente MID/Hag es una proteína multifuncional que juega un papel
importante en la patogénesis de M. catarrhalis por ejemplo, los aislados que expresan MID
aglutinan eritrocitos humanos y se adhieren a células A549 (Forsgren, et al., 2003). Hag puede
unirse a células epiteliales de oído (Bullard, et al., 2005; Holm, et al., 2003) células epiteliales
de pulmon NCIH292 (Bullard, et al., 2007) y células Cheng (Bullard, et al., 2007; Perason, et
al., 2002). Se ha observado que si no está presente esta proteína en las cepas la adherencia es
baja aunque estén otras adhesinas. Esta proteína también es clasificada como un
autotransportador con un dominio traslocador y un dominio común N terminal del cual depende
la actividad de adhesión y unión a la IgD

II.III.III. Fimbrias

Los pilli o fimbrias son filamentos de subunidades proteicas polimerizadas llamadas pilina se extienden a
lo largo de la superficie de la bacteria y permiten la adherencia a las células de la mucosa del
hospedador. Esta adherencia es el primer escalón en la patogenia de la infección de esta bacteria. Se
han encontrado fimbrias en algunas cepas de M. catarrhalis, pero no en todas, observando que las
bacterias que poseen fimbrias se unen de forma más efectiva a las células epiteliales inferiores que las
bacterias que carecen de ellas. Una posibilidad para inhibir la unión de M. catarrhalisa la superficie de la
mucosa, y prevenir así su colonización, es el estudio e identificación del receptor específico que media
7

esta adherencia, del que hasta ahora sólo se sabe que está formado por glucoesfingolípidos. (Ahmed A.
et al.:2006)

II.III.IV. Proteínas reguladoras del hierro

Los patógenos humanos requieren hierro para su crecimiento y diferenciación, por lo que un mecanismo
de defensa del hospedador consiste en secuestrar este ion que se trasporta unido a proteínas, como la
transferrina (en sangre) y la lactoferrina (en mucosas). M. catarrhalis expresa receptores de transferrina
y lactoferrina en su superficie, llamados proteínas de unión a transferrina A y B (TbpA y TbpB) y
proteínas de unión a lactoferrina A y B (LbpA y LbpB). Estos receptores proteicos proporcionan a la
bacteria la capacidad de adquirir hierro, rompiendo la unión entre el ion y la proteína transportadora
humana. Estas proteínas son parcialmente homólogas genéticamente y también son inmunogénicas, lo
que las convierte en potenciales antígenos vacunales.

II.III.V. Lipooligosacarido

Aunque el lipooligosacarido (LOS) no es una proteína, se menciona aquí debido a su presencia en la
membrana externa de M. catarrhalis y su importancia para la virulencia, siendo este otro gran candidato
para la elaboración de vacuna. (Ahmed A. et al.:2006)

II.IV. GENERALIDADES DE LOS LIPOPOLISACARIDOS Y LIPOOLIGOSACARIDOS

El lipopolisacaridos (LPS) está constituidos por el antígeno O y es la endotoxina de las bacterias Gram
(-). El LPS está localizado en la membrana externa de la envoltura celular bacteriana y juega un papel
muy importante en la patogénesis de las infecciones bacterianas,ya que interactúa con el huésped y su
sistema de defensa. Básicamente el LPS se compone de una porción lipídica muy conservada entre las
especies, denominada lípido A inmersa en la cara externa de la membrana de la bacteria y una porción
hidrofilica compuesta por azúcares que presenta una gran variabilidad estructural. El polisacárido O que
es la porción más externa, le confiere a las bacterias su especificidad serológica. El oligosacárido
nuclear o también llamado core une el poligosacarido O con el lipido A.
El lipooligosacárido (LOS) es un importante factor de virulencia en las bacterias Gram negativas, su
peso molecular fluctúa entre 3000 y 7000, no tiene largas cadenas antigénicas y es inmunogenico. Los
anticuerpos anti-LOS son las IgM y IgG que funcionan como bactericidas, fijan el complemento y
producen quimiotaxis de los leucocitos polimorfonucleares. (fig. 6) (Martinez. I. et al.)
8

II.IV.I El lipooligosacarido de M.cartarrhalis
De manera similar a otras bacterias Gram negativas, M. catarrhalis también posee una endotoxina
lipooligosacárido (LOS) en su membrana externa. Se han distinguido tres serotipos en M. catarrhalis de
acuerdo a su LOS.
El serotipo A es el predominante, y se encuentra en el 61% de las cepas, mientras que los serotipo B y
C se encuentran en el 29% y 5%, respectivamente. El 5% restante permanece sin identificar. La
estructura interna contiene un polisacárido común en el serotipo A, B y C, lo que explica la reacción
cruzada existente entre los tres serotipos. Además, se ha visto que la respuesta humoral está dirigida a
estos epítopos comunes, por lo que un LOS correctamente detoxificado y conjugado con una proteína
transportadora podría ser un interesante candidato como posible vacuna, que sería efectiva en el 95%
de las cepas. (Esparcia. O. et al.)

M. catarrhalis comparte similitudes estructurales con otras moléculas LOS de bacterianas no entéricos,
tales como los de N. meningitidis, N. gonorrhoeae , y H. influenzae . (Stefan P. et al.:2009)

II.IV.II Estructura del lipooligosacarido
El LOS de M. catarrhalis consta de un núcleo de oligosacárido y del lípido A sin las cadenas laterales
de polisacárido - antígeno O repetidas. El gen IpxA está Implicado en la etapa inicial de la biosíntesis del
Lípido A. El gen IpxX y IpxL son responsables de la incorporación de cadenas de acilo secundarias en
Lípido A. y el gen kdotA está encargado de vincular la fracción del Lípido A hacia el oligosacárido.
(Stefan P. et al.:2009)

Fig. 6 Estructura del Lipopolisacarido (LPS) y Lipooligosacaridos (LOS). (Rietschel et al.:1996)
9

II.IV.III. Función del lipooligosacarido de Moraxella
El LOS de M. catarrhalis juega un papel importante en la adhesión e invasión a las células epiteliales,
Otra propiedad del LOS de M. catarrhalis es su capacidad para inducir la inflamación excesiva a través
de la estimulación de los monocitos humanos para producir citosinas proinflamatorias como IL-8
mediante la activación de NFKB, todo esto estimula a los monocitos y estos producen TNFα.(Stefan P.
et al.: 2009)

II.IV.III.I. Características del serotipo A
Gracias a estudios estructurales y serológicos realizados a cepas de M. catarrhalis se ha encontrado
este serotipo en la mayoría de los aislados estudiados, este serotipo presenta una porción R la cual se
compone de α-D-GlcpNAc y termina con Galp-Galp-Glcp conocido como Epitopo Pk (fig. 7). Mediante la
técnica de PCR se puede identificar ya que produce amplicones de 1900pb (Cees. M. et al.:2002)

II.IV.III.II. Características del serotipo B
Presenta un epitopo Pk (Galp-Galp-Glcp) al final y tiene una porción R la cual está formada por α-D-
Galp-(14)-β-D-Galp-(14)-α-D-Glcp. (fig. 7)
Mediante la técnica de PCR este serotipo se puede identificar por el tamaño de su amplicon el cual es
de 3300pb, de acuerdo a estudios realizados a diferentes aislados, este es el segundo serotipo más
prevalente en pacientes sobre todo de edad avanzada. (Edwards J. et al.:2005)
Este serotipo ha sido encontrado exclusivamente en aislados de M. catarrhalis que contienen el gen 16S
rRNA tipo 1 cuyo linaje se considera seroresiste (Verhaegh, et al.: 2008).

II.IV.III.III. Características del serotipo C
Este serotipo es el menos frecuente en los aislados de M. catarrhalis, con la técnica de PCR este
serotipo presenta amplicones de 4300pb. Su porción R consta de α-D-Galp-(14)-β-D-Galp-(14)-α-D-
GlcpNAc cuya similitud es muy parecida al serotipo B por lo cual los primers para identificarlo son los
mismos que para el B (primer 406 y 408), sin embargo el amplicon del serotipo B es de 3300pb por lo
que se puede diferenciar claramente en los geles, terminando de igual manera con el epitopo Pk
compuesto por Galp-Galp-Glcp (fig. 7) (Cees. M.et al: 2002)

II.V. ENFERMEDADES ASOCIADAS
M. catarrhalis coloniza la nasofaringe en la infancia causando patología muy variada sin embargo,
dentro de las más frecuentes se encuentran las siguientes enfermedades:
II.V.I Otitis media

La otitis media es una infección muy frecuente en niños. Alrededor del 50% desarrolla esta enfermedad
antes del primer año de edad, aumentando este porcentaje hasta el 70% al cumplir los tres años. M.
catarrhalis es la tercera causa más importante de esta infección, después de S. pneumoniae y H.
influenzae, provocando una elevada morbilidad y requiriendo un amplio uso de antibióticos y elevado
coste económico.

II.V.II Sinusitis

La sinusitis es una enfermedad muy frecuente en la infancia, representando un 5-10% de las infecciones
del tracto respiratorio superior. Al igual que ocurre en las otitis medias, esta infección es sub
diagnosticada debido a que sus síntomas son inespecíficos. Además, el examen físico y radiológico son
de poco valor en los niños y para realizar un diagnóstico etiológico se requiere el cultivo de aspirado de
secreciones nasales. Por el contrario, se cuestiona la necesidad del tratamiento con antibiótico. En la
sinusitis aguda (donde los síntomas persisten de 10 a 30 días) y sinusitis subaguda (con síntomas
durante 30 a 120 días) en niños, se observa que los patógenos respiratorios más comunes son S.
pneumoniae, H. influenzae y M. catarrhalis, aislándose en un porcentaje de 30-40%, 20% y 20%
respectivamente. Sin embargo, en otro estudio realizado a partir de aspirados de adultos jóvenes con
sinusitis aguda, M. catarrhalis sólo se aisló en un 2% de las muestras. Se ha sugerido que el porcentaje
de aislamientos de M. catarrhalis es menor al real debido a que el crecimiento de esta bacteria se
detiene en un ambiente de bajo potencial de oxígeno el cual existe durante la sinusitis. (Esparcia.
O.et.al.)

II.V. III. Infecciones del tracto respiratorio inferior y de otras localizaciones

Las infecciones del tracto respiratorio inferior debidas a M. catarrhalis son muy raras en la infancia, así,
existen estudios de seroconversión de M. catarrhalis en niños hospitalizados con infecciones del tracto
respiratorio medio (laringitis, traqueítis, bronquitis) e inferior, que muestran que sólo el 5% de estos niños
con cultivos de aspirados nasofaríngeos son positivos a M. catarrhalis, lo que indicaría que esta bacteria
Fig. 7 Estructura de los tres serotipos de Moraxella catarrhalis (Cees. M. et al: 2002)
11

no es la probable causa de la enfermedad. Sin embargo, otros investigadores defienden la importancia
de M. catarrhalis en este tipo de infección argumentando el aislamiento de esta bacteria en cultivos
puros a partir de aspirados traqueales de neonatos y niños, y la respuesta local y sistémica mediada por
anticuerpos frente a M. catarrhalis. Así pues, la pregunta queda abierta a nuevas investigaciones.
Aunque son muy raros los casos descritos de infecciones oculares por M. catarrhalis, algunos
investigadores han sugerido su implicación en conjuntivitis y queratitis. En las últimas décadas se handescrito casos de bacteriemia, meningitis y celulitis preseptal. (Ahmed a.et.al.:2006)

Infecciones en los adultos, M, catarrhalis ha pasado recientemente de la consideración de simple
comensal a la de patógeno reconocido, causante de infección del tracto respiratorio inferior en tres
situaciones diferenciadas:
i) exacerbaciones en pacientes con EPOC
ii) neumonía en ancianos
iii) infecciones nosocomiales.

II.V. IV. Exacerbaciones en pacientes con EPOC

Moraxella catarrhalis es la tercera causa de exacerbaciones en pacientes con EPOC, después de S.
pneumoniaey de las cepas de H. influenzae no tipificables. El cuadro clínico que produce es el de una
traqueobronquitis, caracterizado por tos y expectoración purulenta, algunas veces abundante. En los
casos en que aparece fiebre, ésta es baja, siendo rara la aparición de dolor pleurítico. Muchos de estos
pacientes tienen una enfermedad cardio-pulmonar subyacente y son fumadores o exfumadores. El
porcentaje de riesgo es mayor en el hombre que en la mujer, aunque esto podría ser debido a las
diferencias en el hábito del tabaco. Se ha visto que un 20% de pacientes con bronquiectasias son
colonizados de forma crónica por Moraxella catarrhalis, incluso con cuatro cepas diferentes, aunque no
se ha probado la existencia de una relación entre el aislamiento de la bacteria y la exacerbación.
También se debe tener en cuenta las infecciones mixtas de esta bacteria con S. pneumoniae y H.
influenzae, siendo importante establecer el papel de M. catarrhalis especialmente para realizar un
adecuado manejo del paciente y para establecer una correcta pauta antibiótica a seguir.

II.V.V. Neumonía en ancianos

Se ha determinado que, aproximadamente, un 10% de las neumonías adquiridas por ancianos estarían
causadas por M. catarrhalis, situándose la edad media entre 64-68 años. El cuadro clínico se caracteriza
por fiebre, tos, expectoración purulenta, signos en la auscultación e infiltrados lobares o intersticiales en
la radiografía. La mayoría de estos ancianos tienen como factor predisponente una enfermedad
cardiopulmonar subyacente, como EPOC, bronquiectasias, insuficiencia cardíaca congestiva,
predisposición a aspiración, tratamiento con corticoides, diabetes mellitus y cáncer. (Ahmed
a.et.al.:2006)

II.V. VI. Infección nosocomial

En el pasado se sugirió la propagación de M. catarrhalis dentro del hospital, como fuente de infección
nosocomial, pero no pudo ser confirmado por carecer de sistemas de tipificado fiables. A mitad de la
década de los 80 se pudo demostrar la implicación de esta bacteria como causante de infección
nosocomial en unidades respiratorias, aislándose la misma cepa en cinco pacientes y dos miembros del
12

personal hospitalario, confirmando el mismo patrón genotípico mediante análisis de los fragmentos
obtenidos con endonucleasas de restricción.
Así pues, se desconoce el modo de transmisión, pudiendo ser persona a persona, por diseminación
mediante aerosol o por fuentes medioambientales, ya que M. catarrhalis es capaz de sobrevivir en un
esputo expectorado durante al menos tres semanas.
En tanto no se aclaren estas cuestiones, es difícil proponer estrategias racionales para prevenir esta
fuente de infección nosocomial. (Esparcia O. et. al.)

II.V. VII. Otras infecciones en adultos

En algunos estudios se ha aislado M. catarrhalis en el 55% de los pacientes con laringitis, frente al 0%
aislado en los adultos sanos. A pesar de ser la bacteria aislada con más frecuencia en este tipo de
infección, se desconoce su papel patogénico.
Ocasionalmente se han descrito casos de bacteriemia, asociada a neumonía o inmunosupresión,
peritonitis (principalmente en pacientes con diálisis peritoneal), sinusitis, meningitis, artritis séptica,
celulitis, osteomielitis, endocarditis y pericarditis. Sin embargo aún se realiza investigación para conocer
más sobre estos casos. (Ahmed a.et.al.:2006)

II.VI. RESPUESTA INMUNE A LA INFECCION DE M. catarrahalis

La respuesta inmune a patógenos bacterianos es un proceso altamente complejo que implica tanto
mecanismos no específicos como específicos.

Como se sabe la respuesta inmune no especifica o también conocida como innata incluye mecanismos
no específicos donde se incluye la presencia de moco y el agente tensoactivo en la superficies
pulmonares, los macrófagos alveolares y la lisis mediada por el complemento M. catarrhalis se elimina
lentamente de los pulmones con un incremento significativo en el número de granulocitos. Además
induce activación de las células mástil M. y factor nuclear kappa B dependiente de la citoquina (IL - 6 y
MCP - 1) cuya síntesis se da después del contacto directo con los mastocitos.

II.VI.I. La respuesta inmune específica o adquirida

La finalidad de la respuesta inmune específica es la producción de unas proteínas llamadas anticuerpos
los cuales reconocerán y se unirán a los antígenos específicos provocando una serie de reacciones que
conducirán a la eliminación de este.
Se ha demostrado en la mayoría de los casos donde M. catarrhalis está presente se encontraron la
unión de la IgG1, IgG2 e IgG3 y subclase, sin embargo la IgG4 no, además de que la subclase IgG3
puede ser importante particularmente para la infección de M. catarrhalis (Rahman, M et al.: 1997), ya
que como anticuerpos específicos estos son bajos o no detectables en niños menores de 4 años de
edad (Chen,D et al.:1999).
Se indicó que la colonización de M. catarrhalis en la primera infancia se asoció con una respuesta
inmune de IgA la cual está dirigida contra las proteínas de membrana externa. (Stutzmann Meier. Et
al.:2003)

II.VI.II. Estrategias de evasión inmune de M. catarrhalis

El sistema inmune innato se compone de varios componentes, tales como el sistema del complemento y
receptores de reconocimiento de patógenos (PRR).
M. catarrhalis exhibe diferentes mecanismos donde es capaz de activar las tres vías del sistema del
complemento. Donde las principales proteínas de membrana externa (UspAs, OMP E, OMP CD, CopB)
y estructuras de la superficie expuesta (LOS) están involucradas en la defensa del complemento.
También es capaz de unirse a la proteína de unión C4b regulador de la proteína a través de UspA1 y
UspA2 (Nordstrom T. et al.: 2004). Además, UspA2 es capaz de unirse a C3 y vitronectina y de ese
modo inhibe la activación de la vía alternativa del complemento (Singh B.: 2010). Por otro lado las
vesículas de la membrana externa de M. catarrhalis donde se encuentra UspA1 y UspA2 son capaces
de contribuir a una mejora de la supervivencia de Haemophilus influenzae a través de la inactivación de
C3. (Tan T. et al.:2007)

III. JUSTIFICACION

M. catarrhalis actualmente es considerada un patógeno tanto del tracto respiratorio superior e inferior.
En nuestro país no se han realizado estudios de caracterización de factores de virulencia. El LOS es una
estructura relacionada con virulencia de esta bacteria y los serotipos reportados en niños y adultos no
han sido identificados en aislados de nuestra población,

IV. HIPOTESIS

Las prevalencia del serotipo A será mayor en población infantil y el B en población adulta en aislados
clínicos de M. catarrhalis

V. OBJETIVO GENERAL

Identificar los serotipos A, B y C del lipooligosacáridos (LOS) en aislados clínicos de M. catarrhalis,
mediante la técnica de PCR.

V.I. OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Determinar la prevalencia de los serotipos A, B, C del lipooligosacarido (LOS), en las colonias
aisladas de M. catarrhalis de exudados faríngeos en una población abierta mediante la técnica
PCR.

 Comparar la prevalencia de los serotipos que predominan entre niños y adultos.

VI.- MATERIAL Y MÉTODOS

16Metodología
Obtención de muestra
(exudado faríngeo)
Sembrado masivo en
agar sangre incubar
24hrs/37°C
Seleccionar colonias
sospechosas y
resembrar en agar AST
+ x por dilución e
incubar 48/37°C
Pbas bioquimicas Gram,
catalasa, oxidasa,
DNa’asa, Lipasa, CHO’s
Resultados (+) Resultados (-)
Desechar muestras
Extracción de DNA
Cuantificación DNA de
las muestras y cepas
control
Conservación del DNA a
-4
o
C
Preparación de la
reacción de PCR
Realizar PCR de acuerdo al
protocolo de amplificación:
T° desnaturalización: 98°C/ 5seg
T° alineamiento: 53.1°C/ 1min
T° extensión: 72°C/ 4min
T° retención: 72°C/ 1min
Preparar gel de agarosa
al 1.7%
Cargar en cada pozo
5μl de muestra y 2 de
loading y correr
electroforesis
Observar Resultados
 Serotipo A 1900pb
 Serotipo B 3300pb
 Serotipo C 4300pb

Del agar se picaba y se
tomaban 5 colonias del
paciente las cuales
serían clonas.
Congelar las 5 colonias
aisladas de
M.catarrhalis a -70°C
Se resembraban y
corrían pruebas
bioquímicas
nuevamente.
17

VI.I Material biológico

Exudados Faríngeos de pacientes remitidos a los laboratorios de las Unidades Medico Familiar N° 64,
63 del IMSS e INP

VI.II Colección de muestra biológica

Al paciente remitido se le invito a colaborar en el proyecto de investigación, cuando aceptaba firmaba la
carta de consentimiento (ver anexo) y posteriormente el paciente en ayunas, sin lavarse los dientes se
colocaba en la silla con la cabeza semi inclinada hacia atras y con un abatelenguas estéril se presionaba
la lengua hacia abajo mientras que con un hisopo estéril se frotaba la superficie de la faringe, se
procedía a sembrar los agares necesarios de la unidad médico familiar (agar sangre y agar chocolate) y
posteriormente el hisopo se colocaba en tubos de ensaye previamente rotulado que contenían caldo BHI
el cual servía como medio de transporte para llevar a procesar la muestra al laboratorio de Bacteriología
de la Facultad de estudios Superiores Cuautitlán.

VI.III Aislamiento e identificación de M. catarrhalis

Para realizar el aislamiento de cepas de M. catarrhalis, la muestra obtenida mediante el hisopo
transportado en BHI el cual se sembró en medio rico (Agar Sangre) mediante la técnica de dilución y se
incubo a 37°C por 24hrs.
Posteriormente se seleccionaron todas aquellas colonias cuya características fueran: contorno definido
homogéneo, color blanco cremoso, no hemolíticas y se procederá a realizar la tinción de Gram en esta
la morfología debía ser de un diplococo Gram negativo. Una vez realizado la identificación morfológica
se corrieron pruebas de catalasa y oxidasa las cuales si eran positivas se consideraba como bacteria
sospechosa de M. catarrhalis.

En cuanto a la identificación de la bacteria una vez concluidas las pruebas primarias se procedió a
resembrar con una asa estéril la colonia identificada como M. catarrhalis la cual se resembro en medio
AST más extracto de levadura incubándolas a 37°C durante un periodo de 48hrs, pasado el tiempo se
realizaron pruebas secundarias como DNA’asa, Lipasa y Carbohidratos (glucosa, fructuosa, sacarosa,
maltosa y lactosa). Donde para las dos primeras pruebas el resultado debía ser positivo y respecto a los
carbohidratos negativo. De esta placa se seleccionaron 5 colonias de cada paciente.

Al obtenerse 5 colonias de M. catarrahalis de cada paciente, cada colonia se propago en medio AST y
se congelo en medio de conservación Skim-Milk. en al menos 2microviales, a -80°C

VI.IV Extracción y cuantificación de DNA de las colonias de M. catarrhalis

Se descongelo cada colonia y se sembraron cada una en un cuarto de caja Petri con medio AST con
extracto de levadura durante 48hrs a 37°C, para posteriormente la extraer el DNA. en una caja se
podían procesar 4 colonias de cada paciente. El cultivo obtenido se verifico que estuviera puro y se
procedió a cosecharlo siempre y cuando se corroborara que las cepas no estuvieran contaminadas, el
cultivo se cosecho de la caja Petri con un asa para colocarlo en 1ml de SSF (solución salina fisiológica)
en tubos Eppendorf.
18

A los tubos de SSF con la biomasa de bacteria se extrajo el DNA mediante el kit Wizard DNA extraction
de la marca PROMEGA CAT # A1120. De acuerdo a las siguientes instrucciones del producto:

Los tubos de SSF con biomasa bacteriana se centrifugaron a 13000rpm durante 2 minutos, se eliminó el
sobrenadante y se continuó con los siguientes pasos:

1.- Lisado de Células

Se Adiciono 600 microlitros de la solución de lisis y se mezcló suavemente, para llevarse a incubar a
80°C por 5 minutos y después se dejaron enfriar a temperatura ambiente. Luego se adiciono 6
microlitos de la solución RNase incluida en el kit y se incubara nuevamente a 37°C durante una hora y
se dejara enfriar a temperatura ambiente una vez transcurrido el tiempo de incubación.

2.-Precipitación de proteína

A los mismo tubos Eppendorf se colocaran 200 microlitros de la solución de precipitación y se agitaron
con el vortex, para su posterior incubación en hielo durante 5 minutos, al transcurrir ese tiempo se
centrifugaran a 14000rpm por 3 minutos.

3.- Rehidratación y Precipitación del DNA

Se transfirió el sobrenadante a otro tubo Eppendorf previamente rotulado el cual contenía 600
microlitros de isopropanol y se mezcló, se llevó a centrifugar a 14000rmp durante 2 minutos y se eliminó
el etanol después se introdujeron en el vacufage durante 20 minutos o hasta que se elimine el exceso de
humedad.

Por último se colocaron 100 microlitros de la solución de rehidratación y se dejaron durante toda la
noche a temperatura ambiente.

Cuantificación del DNA

Para realizar la cuantificación del DNA se utilizó el equipo (NANODROP 2000), por lo que se requirió
calibrar el equipo mediante un blanco donde se utilizó un poco de la solución de rehidratación la cual
venia el kit, y en el cual se diluyo el DNA extraído.

Con una sanita se limpió el lector y posteriormente de la solución de rehidratación se tomaron 1
microlitro y se calibro el equipo, posteriormente de los tubos que contenían el DNA se agitaron en el
vortex uno por uno y se colocó 1 microlitro para medir el DNA de cada muestra las concentraciones se
obtuvieron en nanogramos/microlitro, asi como la relación de 260/280 y 260/230 que muestra la pureza
del DNA cuando esta relación sea mayor de 1.6 pero no mayor a 2.0.

VI.V Determinación de los lipooligosacáridos mediante reacción en cadena de la
polimerasa (PCR)

La determinación de los tres distintos serotipos se llevó a cabo mediante la identificación de los
diferentes tamaños del amplificado utilizando los primers reportados por (Edwards K. et al.: 2005)

 SEROTIPO A: 1900pb
 SEROTIPO B: 3300 pb
 SEROTIPO C: 4300pb

VI.VI. Preparación de la mezcla de PCR

Para la preparación de la mezcla de PCR se usaron reactivos de la marca PROMEGA y ROCHE,
cuyas concentraciones fueron las siguientes:

Buffer: 5X
MgCl2: 25mM
dNTP’s: 10 mM
PrimerPr649: 50 mM
Primer Pr 406: 50 mM
Primer Pr 408: 50mM
Taq (ROCHE): 5 U/microlitro

De los tubos originales se realizaron cálculos para usar la cantidad necesaria que se requiere para poder
llevar a cabo una reacción de PCR (ver anexo 3) quedando las siguientes cantidades:

SEROTIPO A
Buffer : 5X………………………..2.5 µl
MgCl2: 25Mm…………………….0.75 µl
dNTP’s: 10 mM…………………..0.5 µl
Primer Pr649: 50 mM…………..0.6 µl
Primer Pr 408: 50mM……………0.25 µl
Taq (ROCHE): 5 U/microlitro…...0.25 µl

SEROTIPO B

Buffer : 5X…………………………2.5 µl
MgCl2: 25mM……………………..1.75 µl
dNTP’s: 10 mM……………………0.5 µl
Primer Pr 406: 50 mM……………0.8 µl
Primer Pr 408: 50mM…………….0.25 µl
Taq (ROCHE): 5 U/microlitro….…0.25µl

VI.VII Condiciones de amplificación

Una vez realizadas las mezclas de acuerdo a lo descrito anteriormente y después de agitar en el vortex
cada uno de los tubos verificando que no contengan burbujas de aire se procedió a realizar las
amplificaciones en un termociclador ARKTIK de thermo scientific bajo el siguiente protocolo de
amplificación:
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 Temperatura de desnaturalización de 98°C durante 5 segundos
 Temperatura de alineamiento de 53.1°C y un tiempo 1 minuto
 Temperatura de extensión de 72°C y un tiempo de 4 minutos
Estas tres temperaturas se llevaron a cabo durante 25 ciclos. Por último la temperatura de extensión fue
de 72°C durante 1 minuto.
Para observar los productos de amplificación se realizó un gel de agarosa al 1.7% (Ver anexo 2) donde
en cada pozo se colocaba 5 µl de cada una de las muestras previamente agitadas en el vortex y 2 µl de
loading buffer, también se colocaba 3 µl de un marcador de peso molecular (1Kb) el cual nos ayudaría a
identificar el tamaño del producto y así conocer que serotipo era para cada muestra.

Al terminar de cargar cada uno de los pozos con su respectiva muestra se procedió a correr una
electroforesis, al término se colocaba el gel en un transiluminador UVP donde se verían los productos
de acuerdo al tamaño del peso molecular, para el serotipo A seria de 1900pb, para el serotipo B de
3300pb y para el serotipo C de 4300pb.

Durante el proceso de identificación, extracción de DNA y realización de la técnica de PCR se utilizaron
cepas control como M. catarrhalis ATCC Ravasio y ATCC 49143 donde la primera era positiva para el
serotipo A y la segunda para el serotipo B.

VII.- RESULTADOS

Después de muestrear durante un año a pacientes remitidos a las unidades medico familiares del IMSS
N° 63 y 64 y del INP se obtuvieron los siguientes resultados:
Un total de 678 pacientes se obtuvieron durante un periodo de un año de los cuales 33 pacientes (4.9%)
fueron positivos para M. catarrhalis cuya población está constituida como se muestra en la tabla 1 y
tabla 2

Tabla 1. Descripción de la población positiva a M. catarrhalis
Origen de la muestra
N= número de
pacientes
GENERO EDAD
F (%) M (%) Niños
(%)
Adultos
(%)
UMF IMSS 63 n=1 100% 0% 100% 0%
UMF IMSS 64 n= 30 63.33% 36.66% 53.33% 46.66%
INP n= 2 100% 0% 100% 0%

Tabla 2. Estratificación de edad en pacientes positivos para M.catarrhalis.
EDADES DE PACIENTES (años) CANTIDAD DE PACIENTES
0-18 19
Mayores de 18 14

Una vez obtenidos los aislados de M. catarrhalis se aislaron un promedio de 5 colonias (clonas) de M.
catarrhalis de cada paciente. Con la finalidad de investigar si un paciente podría tener presente más de
un serotipo. Por lo cual se obtuvieron un total de 151 colonias estudiadas de los 33 pacientes (Tabla 4.)

Tabla 3. Desglose del número de colonias obtenidas de cada paciente.
No.
consecutivo
Código
del
paciente
N° DE
CLONAS
1 563 6
2 864 6
3 1264 6
4 1764 6
5 1864 6
6 2264 6
7 2864 6
23

8 3864 2
9 4264 6
10 5064 5
11 5164 6
12 6764 6
13 7264 6
14 NC151 6
15 NC147 6
16 364 3
17 964 5
18 3064 2
19 27564 2
20 53964 3
21 53064 4
22 24564 2
23 11664 5
24 15364 3
25 24864 2
26 35664 3
27 GCE 5
28 OEC 5
29 DLC 2
30 GO 5
31 R11 5
32 C70 5
33 F8 5

VII.I. Resultados por paciente:

La identificación de los serotipos encontrados se aprecia en la tabla 4. Los serotipos más frecuentes
dentro de la población estudiada independientemente del género y edad fueron el B con un 30.30% y el
A con un 27.27%. Entre los pacientes estudiados no se presentó ninguno que tuviera el serotipo C.
Tabla 4. Frecuencia de los serotipos en los 33 pacientes
SEROTIPOS PORCENTAJES POR
PACIENTE n= (%)
A 9 (27.27%)
B 10 (30.30%)
C 0 (0%)
Indeterminado 11 (33.33%)
Infección Mixta
(más de un
serotipo en un
mismo paciente)

3 (9.09%)

En los adultos se encontraron los serotipos A y B teniendo una mayor prevalencia el serotipo B el cual
está presente en 4 (26.7%) de los pacientes y el serotipo A en 3 (20%) de los pacientes y un 53.3%
fue serotipo indeterminado. A diferencia de los niños los cuales presentan la misma cantidad de
pacientes 6 (33.3%) para el serotipo A y el serotipo B. En el 16.7% de los niños no fue identificado
ningún serotipo (Tabla 5.)

Tabla 5. Prevalencia de los serotipos de acuerdo a la edad del paciente

En grafico 1. Podemos apreciar que algunos pacientes pueden presentar más de un serotipo ya que de
los 33 pacientes estudiados 3 (9.09%) de ellos presentaron dicha característica es decir infección mixta,
pero es importante resaltar que solo en el caso de niños ocurrió esto. y el resto de los pacientes 19
(57.7%) solo presento un solo serotipo, ya sea A o B y el resto de los pacientes 11 (33.3%) no presento
ninguno de los serotipos.

Grafico 1. Frecuencia de pacientes que presentaron 1, 2, 3 o ningún serotipo
PACIENTES
1 SEROTIPO
2 SEROTIPOS
3 SEROTIPOS
NINGUN SEROTIPO
57.7%
33.3%

9%
Serotipo A
n= (%)
Serotipo B
n= (%)
Serotipo
C n= (%)
Indeterminado
n = (%)
Infección
Mixta ser (más
de un
serotipo)
NIÑOS n= 18 6 (33.3%) 6 (33.3%) 0 (0%) 3 (16.7%) 3 (16.7%) A y
B
ADULTOS n=15 3 (20%) 4 (26.7%) 0 (0%) 8 (53.3%) 0 (0%) A y B

VII.II. Resultados de acuerdo a las colonias de M. catarrhalis de cada paciente

La tabla 6 muestra que el serotipo B con un porcentaje de 33.11% fue el que predomino en los 151
aislados estudiados de los 33 pacientes, seguido del serotipo A que presento un 29.13% y del serotipo C
con un 0% y un 47.01% de colonias con serotipo indeterminado.

Tabla 6. Porcentajes de los serotipos en las 151 colonias totales
SEROTIPOS n= (%)

A 44 (29.13%)
B 50 (33.11%)
C 0 (0%)
Indeterminado 71 (47.01%)

En las siguientes imágenes se aprecian los geles de agarosa con los resultados obtenidos en los
pacientes y sus colonias obtenidas donde queda confirmado que existen pacientes que pueden
presentar solo 1 serotipo o más de 2 serotipos al mismo tiempo.
Ejemplo de un paciente el cual presenta solo el serotipo A en todas sus colonias, se representa en la
figura 1.

Figura N° 1 Resultados del paciente NC147 con sus respectivas colonias todas del serotipo A (1.9Kb). Al mismo tiempo se
observa la cepa Ravassio (como control positivo) y la cepa 49143 (como control negativo).
26

Ejemplo del paciente GO donde todas sus colonias presentan el serotipo B

En la figura 2 se representa el resultado del paciente GO con sus respectivas colonias positvas para el serotipo B
(3.3 Kb) .Al mismo tiempo se observa la cepa Ravassio (como control negativo) y la cepa 49143 (como control
positivo).

La Figura3 muestra el caso de un paciente con infección mixta ya que se presentaron dos serotipos en
este caso A y B en sus colonias

Figura3 Resultados del paciente 1864 con sus respectivas colonias positivas para el serotipo A (1.9 Kb) y B. (3.3
Kb) .Al mismo tiempo se observa la cepa Ravassio (como control positivo para el serotipo A) y la cepa 49143
(como control positivo para el serotipo B)

VIII.- ANÁLISIS DE RESULTADOS

De acuerdo a lo que se encontró en la población estudiada, el serotipo B fue el más prevalente
(30,30%) seguido del serotipo A con un 27.27% independientemente de la edad y género. De acuerdo a
Vaneechoutte. M. et. al.:1990) el cual es el único de la prevalencia específica de los serotipos de
lipooligosacarido (LOS) de M. catarrhalis en Bélgica señala que el serotipode mayor prevalencia en
general es el serotipo A (60%), seguido del B (30%), y por último el C (5%), y un 5% de la cepas no
resultan tipificables La razón por la cual, hacen la tipificación mediante técnica moleculares y no
serológicas es por las dificultades con la expresión de LOS de M. catarrhalis y su limitada cantidad de
anticuerpos, el requisito absoluto para purificar la muestra, y el potencial de reactividad cruzada entre
serotipos A y C. Cabe considerar que la variación de prevalencia respecto a lo reportado, así como el
número de pacientes con serotipo no identificado es diferente a lo reportado y esto puede deberse al
origen de la población estudiada ya que la población reportada es de origen Europeo, así como al
número de pacientes estudiados y el origen de la muestra.

Por otro lado, en estudios realizados por Verhagh, et al.: 2008 la distribución de los serotipos parece
diferir de acuerdo a la edad del paciente, reportándose que los aislados de los niños tienen mayor
proporción del serotipo A, en comparación con los adultos cuyo serotipo más prevalente es el B. En
nuestra población no parece ocurrir esto en niños ya que de los 33 pacientes que resultaron positivos
para M. catarrhalis se observó que los serotipos A y B se presentaron con la misma prevalencia en
población infantil.; Sin embargo, en adultos predomino el serotipo B (12.12%) lo cual es igual a lo
reportado.

Esto puede deberse a la composición química de los LOS en la cepas a diferencia de las cepas que se
presentan en otros países, también dependiendo del origen geográfico de la cepa, o la prevalencia del
serotipo puede variar dependiendo del origen de la muestra es decir, si es un exudado faríngeo,
secreción de oído, etc. debe considerarse también que la población es abierta con un diagnostico no
definido aún al momento de la toma de muestra por lo que no podemos correlacionar el serotipo con el
origen de la muestra. Sin embargo es algo que se seguirá investigando ya que no hay estudios
reportados específicamente para este campo, donde sería necesario considerar a la población por el tipo
de enfermedad de tracto respiratorio, así como probar otros tipos de muestra clasificándola por lugar
donde viven, estatus social, conociendo algunos antecedentes de los pacientes es decir en niños si
acuden algún tipo de guardería ya que como se sabe la otitis media tiene un alto índice de incidencia
cuando se acuden a estas, en los adultos saber si han presentado casos de neumonía, o enfermedades
de las vías respiratorias.
30

Debido a que otras bacterias pueden presentar una amplia diversidad genética como H. pylori y puede
presentarse infección mixta en un paciente, nos pareció interesante investigar si en un aislado de M.
catarrhalis de un paciente pudiera haber más de un serotipo, por lo tanto se aislaron 5 colonias promedio
de cada paciente y se buscó en cada una de ellas el serotipo y cabe resaltar que en nuestra población
estudiada se presentó este hecho, aunque es bajo el porcentaje pero es importante por la problemática
que pudiera implicar el tratamiento con antibiótico pudiendo ser una cepa sensible y otra resistente. y es
importante mencionar que solo se presentó en población infantil, curiosamente esta situación parece
indicar que en población infantil la variabilidad de cepas es mayor, esto puede entenderse por qué
puede estar en contacto con niños infectados con distintas cepas y adquirirlas en escuelas, guarderías
etc., siendo más susceptibles a estar colonizados por más de un tipo de cepa, y esto provocar varias
infecciones o reinfecciones con distintas cepas, además de que como se ha señalado los antecedentes
esta bacteria es común en población infantil..

Estudios epidemiológicos indican que los aislados de M. catarrhalis son genéticamente diversos y como
consecuencia existen dos linajes filogenéticos distintos. El primero de estos dos linajes filogenéticos,
conocido como el linaje serosensible, se caracteriza por moderada virulencia y lo componen cepas que
son sensibles a la muerte mediada por complemento. El otro linaje más virulento también llamado linaje
seroresistente, está compuesto principalmente por cepas resistentes al complemento y con una amplia
habilidad para adherirse a células epiteliales [Bootsma, et al., 2000]. El linaje seroresistente está
compuesto predominantemente por aislados que contienen el gen 16S rRNA tipo1, y los que contienen
el gen 16S rRNA tipo 2/3 son predominantemente del linaje serosensibles [Bootsma, et. al., 2000,
Verhaegh, et. al., 2008].

Respecto a la asociación de los linajes con los serotipos A, B y C del lipooligosacarido (LOS) deM.
catarrhalis, el serotipo B ha sido encontrado exclusivamente en aislados de 16S rRNA tipo 1 [Verhaegh,
et al., 2008] cuyo linaje se considera seroresistente y asociado con virulencia. En nuestra población en
general el serotipo B se encontró con mayor prevalencia (33.11%). Esto indica que nuestras cepas
pudieran ser del tipo seroresistente y lo trascendente de esto es que tanto niños como adultos de
nuestra población portan esta tipo de M. catarrhalis. Por lo que podría significar que existiría una mayor
virulencia en nuestras colonias de M. catarrhalis. Sin embargo, para poder hacer esta asociación
necesitaríamos comprobar que linaje presentan estas colonias de M. catarrhalis en nuestra población.

IX.- CONCLUSIONES

En conclusión, la población positiva para M. catarrhalis presento un 29.13% el serotipo A, un 33.11%
el serotipo B y un 47.01% no identificado (ninguno de los tres serotipos) independientemente del género
y edad. .

En población infantil los serotipos A y B fueron encontrados en la misma prevalencia 33.3% para cada
uno y un 16.7% no identificado para ningún serotipo.

Respecto a la población adulta estudiada el serotipo más prevalente encontrado fue el B con un
26.6%.para el A 20% y un 53.3% no tipificable

Se encontró que el 16.7% de la población infantil el 9% presento infección mixta es decir que se
encontraron más de un serotipo en un solo paciente, algo hasta el momento no reportado para M.
catarrhalis

De tal forma que con esta investigación se ha obtenido información importante respecto a la
identificación de los serotipos reportados para M. catarrhalis por lo que se pretende conocer más acerca
de esta bacteria, la cual ha sido considerada por muchos años como flora normal y no un patógeno en
nuestra población.

X.- ANEXO 1 MATERIAL Y REACTIVOS

MATERIAL:

 Matraz Erlenmeyer 500ml
 Cajas Petri
 Parafilm
 Tubos de ensaye con rosca
 Abatelenguas esteriles
 Mechero
 Hisopos esteriles
 Gradillas
 Portaobjetos
 Asas bacteriológicas
 Guantes y cubre bocas
 Plumones permanentes
 Estufa
 Microviales de 1.5ml
 Tubos Eppendorf 5ml, 1.5ml
 Tubos de PCR
 Microcentrifuga Labnet
 Camara de Electroforesis Labnet
 Concentrador de vacio Eppendorf
Vacufuge
 Centrifuga 5417c Eppendorf
 Balanza Metfler PC440
 Termociclador Thermo scientific
ARKTIK
 Nanodrop 2000 Thermo Scientific
 Transluminador UVP
 Vortex VELP Scientifica
 TermoBlock
 Micropipetas Thermo:
 2-20 microlitros
 20-200 microlitros
 0.2-2 microlitros
 100-1000 microlitros

REACTIVOS:

 Medio de cultivo Agar Soya
tripticaseina BD Bioxon
 Medio de cultivo base de agar
sangre
 Medio de cultivo infusión cerebro
corazón BD Bioxon
 Medio de cultivo Agar DNAsa
MercK
 Extracto de levadura BD Bioxon
 Medio de cultivo D (+) Glucosa
 Medio de cultivo D (+) Fructuosa
 Medio decultivo D (+) Sacarosa
 Medio de cultivo D (+) Lactosa
 Medio de cultivo D (+) Maltosa
 Medio Muller- Hilton BD Bioxon
 Medio de cultivo Caldo Soya
Tripticaseina
 Glicerol
 Twin 80
 Aceite de oliva extra virgen Great
Value
 Leche en polvo deslactosada
Svelty
 Sangre de Carnero
 Cristal violeta
 Lugol
 Alcohol-acetona
 Safranina
 Peróxido de hidrogeno 10%
 Discos de Oxidasa
 Alcohol 100%
 Agua destilada
 Ultrapure TAE 50X Buffer
Invitrogen
 Ultrapure Distilled Water GIBCO
 Bromuro de etidio
 DNA purificación Kit #A1120
Promega
 Etanol 70%
 Primer 408 IDT
 Primer 649 IDT
 Primer 406 IDT
 Buffer 10X Fermentas
 MgCl2 25Mm Fermentas
 dNTP’s 10Mm Fermentas
 Taq BioTecMol 5U/ 500U
 Agarosa D1 Low EEO Pronadisa
 Loading Promega 5x Green go taq
 Marcador Bioline 5000 bp

XI.- ANEXO 2 PREPARACIÓN DE
REACTIVOS

MEDIO DE TRANSPORTE CALDO BHI:
2ml en cada tubo
2.37g BHI ---- 1000ml
X ----- 100ml
X= 0.237 g BHI
Se pesó 0.237g BHI y agrego en un matraz el cual contenía 100ml de agua destilada, posteriormente
se vació en tubos de rosca y se esterilizo a 15’/15min.

AGAR SANGRE:
40g de agar base sangre ---- 1000ml
X ---- 400ml
X= 16g de agar
Cantidad de sangre de carnero
400ml ---- 100%
X ---- 5%
X= 20ml de Sangre
A la cantidad total que se requiere preparar se le restaran los militros de sangre que se usaran
quedando 380ml y nuevamente se realizaran las operaciones necesarias para saber cuánto agar se
utilizara.
Una vez pesado se vaciara en un matraz y se depositara 380ml de agua destilada se esterilizara
15/15min posteriormente se dejara enfriar un poco (Aprox. temperatura corporal) y se depositaran los 20
ml de sangre de carnero se disolverá y se procederá a servir en las cajas.

AGAR AST MÁS EXTRACTO DE LEVADURA.
Caldo
30g - 1000ml
X - 600ml x=18g
Agar base
600ml – 100%
9g ----- 1.5%
38

Extracto de levadura
600ml – 100%
3 - 0.5%

 Pesar, agregar los medios a un matraz agregar agua, esterilizada 15’/115 libras.

MEDIO DNA’ asa

Preparación 30 cajas c/u 20ml
600ml
42g – 1000ml
X - 600ml x=25.5g

Pesar, vaciar a un matraz, agregar agua y esterilizar a 115libras/15’

MEDIO LIPASA

 Tween 80
 Omega (aceite de oliva)

1ml tween 80 - 400ml agua (tibia) + 100ml aceite de oliva

Base AST - esterilizar
500ml + 30 ml Reactivo de lipasa

La mezcla de tween 80, agua y aceite se encontraba esteril por lo que la base que era de AST + X, se
esterilizaba y después se agrega la mezcla y por último se vaciaba a las cajas petri.

Nota: El sembrado de los medios de Lipasa y DNA’asa se realizaba de la siguiente forma:

CARBOHIDRATOS 1% (GLUCOSA, SACAROSA, FRUCTUOSA, MALTOSA, LACTOSA)

3.5ml en cada tubo
39

Medio base CTA
28.5g --- 1000ml
X --- 70ml

X=1.995 g del medio

70 --- 100%
X --- 1%
X=0.7g de cada carbohidrato

Se pesa la cantidad necesaria del medio base CTA y se coloca en un matraz con 70ml de agua
destilada se homogeniza calentándose y posteriormente se agrega 0.7g del carbohidrato
homogenizando y posteriormente se depositan alícuotas de 3 ml en cada uno de los tubos con rosca se
esterilizan a 10lb/10min, al terminar el proceso de esterilización se colocan los tubos inclinados para que
el agar se solidifique.

MEDIO DE CONGELAMIENTO SKIM-MILK

15 tubos C/U con 3-5 ml

(15 tubos)(4ml) = 60ml

Leche en polvo descremada:
2g ----- 100ml
X ----- 60 ml X=1.2g

Caldo de soya tripticasa
3g ----- 100ml
X ------ 60ml X= 1.8g

Glucosa
0.5g ---- 100ml
X ---- 60ml X= 0.3 g

Glicerol
120ml ---- 100%
X ---- 13% X= 15.6ml

Agregar los medios (Leche descremada, caldo soya tripticasa, glucosa) en el frasco con rosca y después
colocar 60 ml de agua destilada calentar y una vez homogéneo agregar el glicerol después de
esterilizara 115lb/15’.

XII.- Anexo 3 Iniciadores de PCR

 Pr 649 IDT
5’ ATCCTGCTCCAACTGACTTTC 3’
Tm= 54.8°C
Amount of oligo
7.2OD260= 38.9 nM = 0.24mg

Para suspender el Primer se multiplico el nM por dos es decir:

38.9 x 2 = 77.8 Microlitros

Esos 77.8microlitros es el vol. De agua que se utilizara para suspender el primer y que este
quede a una concentración de 500 microlitros el cual se congelara a -20°C (sol. Stock)

 Pr 406 IDT
5’ CAAAAGAAGACAAACAAGCAGC 3’
Tm= 53.2°C
Amount of oligo
6.8 OD260 = 28.6 nM = 0.19mg

Para suspender el Primer se multiplico el nM por dos es decir:

28.6 x 2 = 52.2 Microlitros

Esos 52.2microlitros es el vol. De agua que se utilizara para suspender el primer y que este
quede a una concentración de 500 microlitros el cual se congelara a -20°C (sol. Stock)

 Pr 408 IDT
5’ CATCAAAAACCCCCCTACC 3’
Tm= 53.3°C
Amount of oligo
6.1 OD260 = 34.5 nM = 0.19mg
Para suspender el Primer se multiplico el nM por dos es decir:

34.5 x 2 = 69 Microlitros

Esos 69 microlitros es el vol. De agua que se utilizara para suspender el primer y que este quede
a una concentración de 500 microlitros el cual se congelara a -20°C (sol. Stock)

De cada una de las soluciones stock se tomaron 10 microlitros y se agregaron 90 microlitros de agua
quedando una dilución 1:10 donde cada uno de los primer’s tendrá una concentración de 50mM las
cuales se rotularon y se refrigeran a 4°C para su uso en la PCR

XIII.- Anexo 4 Cartas de consentimiento

INSTITUTO NACIONAL DE PEDIATRIA
LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA EXPERIMENTAL

CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO

TÍTULO DEL PROYECTO:
TIPIFICACIÓN Y CARACTERIZACION DE FACTORES DE VIRULENCIA DE CEPAS MEXICANAS DE
Moraxella catarrhalis AISLADAS DE NIÑOS Y ADULTOS.
Responsable:
Dra. Carolina Ma. Antonieta. Romo González
Investigador en Ciencias Médicas B del Laboratorio de Bacteriología Experimental
crgaro_06@yahoo.com.mx

Se nos invita a participar en una investigación que tiene como objetivo tipificar cepas de Moraxella
catarrhalis en exudados faríngeos aisladas de niños y adultos e identificar en ellas algunos de los
factores de virulencia recientemente descritos como: UspA1, UspA2 y UspA2H y pilA y serotipos LOS.
NOTA: En el caso de ser un menor de edad al que se le tomara la muestra, la madre, padre o tutor
responsable del niño le explicara en que consiste su participación en el estudio. En el caso de un adulto
leer cuidadosamente los puntos que a continuación se señalan.
Se nos informa que:
 Los investigadores me pedirán información como algunos datos personales como nombre, edad y
zona donde radico y algunas preguntas en relación al motivo del estudio (toda esta información
será confidencial).
 Los investigadores tomarán muestras de exudado faríngeo.
 De las bacterias que se aíslen de mi exudado faríngeo PODRAN CONOCER QUE OTRO TIPO DE
BACTERIAS SE ME HAN AISLADO PERO SOLO OCUPARAN PARA EL ESTUDIO las cepas de
Moraxella catarrhalis (si es que el exudado resulta positivo para esta bacteria). Las cepas
obtenidas se procesarán bajo la responsabilidad de los investigadores relacionados al proyecto de
investigación.
 Al participar en este estudio, no recibiremos ningún beneficio personal, pero los resultados de la
investigación podrían ayudar en el futuro a otros pacientes,