Identificacion-y-caracterizacion-de-la-actividad-proteoltica-durante-el-macerado-en-diferentes-variedades-de-cebadas-cerveceras

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas 
 
 
Identificación y caracterización de la actividad proteolítica durante el macerado 
en diferentes variedades de cebadas cerveceras 
 
TESIS 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
Maestro en Ciencias 
 
 
 
 
PRESENTA: 
 
Edgar Nájera Torres 
 
 
 
TUTOR PRINCIPAL 
 
Dr. Felipe Cruz García 
Facultad de Química, UNAM 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR 
 
Dr. Eleazar Martínez Barajas, Facultad de Química, UNAM 
Dr. Agustín López Munguía Canales, Instituto de Biotecnología, UNAM 
 
 
Ciudad de México., Junio del 2016 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
1 
 
GLOSARIO 
ABA: Ácido abscísico 
AEBSF: Fluoro hidrocloruro de 4-(2-aminoetil) bencenosulfonilo 
BSA: Albúmina de suero bovino 
C1A: Cistatina 
cGMP: Guanosín monofosfato cíclico 
CHILL HAZE: Fenómeno que enturbia la cerveza y es ocasionado por la reacción de polifenoles 
con proteínas formando complejos insolubles a bajas temperaturas 
DMSO: Dimetil sulfóxido 
E-64: Inhibidor irreversible de proteasas de cisteína 
EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético, inhibidor de metaloproteasas 
EPB-1: Endoproteasa de cisteína de cebada 
ESI: Ionización por electrospray 
GA: Ácido giberélico 
GAP 1: Permeasa general de aminoácidos 
HV-11: Malta mexicana 11 
HV-19: Malta mexicana 19 
kDa: Kilodaltons 
kV: Kilo volts 
LC/MS: Cromatografía líquida acoplada a masas 
LTP: Proteína transportadora de lípidos de cebada 
MASH OUT: Fase final del macerado donde el mosto se lleva a 80-90 °C para inactivar las 
actividades enzimáticas remanentes 
METCALFE: Malta canadiense 
mU: Miliunidades de enzima 
mUa: Miliunidades de absorbancia 
OC-1: Cistatina 1 de arroz 
OC-2: Cistatina 2 de arroz 
P34: Proteasa de cisteína de soya 
pH: Potencial hidrógeno 
pKa: Logaritmo negativo de la constante de disociación ácida 
PMSF: Fluorofenilmetil sulfonil, inhibidor reversible de proteasas de serina 
REACTIVO DE MARFEY´S: Derivatizante de aminoácidos 
RPM: Revoluciones por minuto 
SCF: Complejo proteico de las proteínas Skp1, Cullina 1 y proteína de caja F 
SEP-1: Proteasa de serina de cebada 
TCA: Ácido tricloroacético 
TR: Tiempo de retención 
U: Unidad enzimática 
UPLC/MS: Cromatografía líquida de ultra desempeño acoplado a espectrometría de masas 
VC: Volumen cama 
V/V: Relación volumen/volumen 
2 
 
 
 
 
Índice 
1 RESUMEN ............................................................................................................. 27 
REF _
Toc48
03534
74 \h
 27 
2 INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 28 
REF _
Toc48
03534
75 \h
 28 
2.1 ¿Por qué la cebada? .......................................................................................... 29 
REF _
Toc48
3 
 
03534
76 \h
 29 
2.2 El grano de cebada ............................................................................................ 29 
REF _
Toc48
03534
77 \h
 29 
2.3 Cambios durante la germinación del grano de cebada .................................. 30 
REF _
Toc48
03534
78 \h
 30 
2.3.1 Modificación del endospermo .................................................................... 33 
REF _
Toc48
4 
 
03534
79 \h
 33 
2.4 Proteínas de reserva ......................................................................................... 34 
REF _
Toc48
03534
80 \h
 34 
2.5 Tipos de proteasas y su clasificación ............................................................. 35 
REF _
Toc48
03534
81 \h
 35 
2.5.1 Papaína ........................................................................................................ 37 
REF _
Toc48
5 
 
03534
82 \h
 37 
2.5.2 Termolisina .................................................................................................. 38 
REF _
Toc48
03534
83 \h
 38 
2.5.3 Subtilisina .................................................................................................... 39 
REF _
Toc48
03534
84 \h
 39 
6 
 
2.5.4 Renina .......................................................................................................... 40 
40 
2.6 Las proteasas en el grano de cebada y su importancia en el proceso de 
elaboración de cerveza ........................................................................................... 41 
REF _
Toc48
03534
86 \h
 41 
2.7 Inhibidores de proteasas .................................................................................. 42 
REF _
Toc48
03534
87 \h
 42 
7 
 
2.7.1 E-64; inhibidor de proteasas de cisteína ................................................... 43 
REF _
Toc48
03534
88 \h
 43 
2.7.2 PMSF; Inhibidor de proteasas serina ........................................................ 43 
REF _
Toc48
03534
89 \h
 43 
2.7.3 AEBSF; inhibidor de proteasas de serina ................................................. 44 
REF _
Toc48
03534
90 \h
 44 
8 
 
2.7.4 EDTA; inhibidor de metaloproteasas ........................................................ 44 
REF _To
c4803
53491
 \h 44 
2.8 Los inhibidores endógenos de las proteasas en el grano de cebada
................................................................................................................................... 45 
REF _
Toc48
03534
92 \h
 45 
2.8.1 LTP-1 y cistatinas, como inhibidores endógenos de cisteín proteasas en 
el grano de cebada ............................................................................................... 46 
REF _
Toc48
03534
9 
 
93 \h
 46 
2.8.2 Inhibidores endógenos de proteasas de serina en cebada ..................... 46 
 PAGE
REF _
Toc48
03534
94 \h
 46 
2.9 Producción de cerveza ...................................................................................... 47 
REF _
Toc48
03534
95 \h
 47 
2.9.1 Malteo y secado .......................................................................................... 47 
REF _
Toc48
10 
 
03534
96 \h
 47 
2.9.2 Molienda y macerado ................................................................................. 49 
REF _
Toc48
03534
97 \h
 49 
2.10 Aminoácidos en los mostos cerveceros ....................................................... 51 
REF _
Toc48
03534
98 \h
 51 
3 JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO ............................................................................... 52 
REF _
Toc48
11 
 
03534
99 \h
 52 
4 HIPÓTESIS ................................................................................................................ 54 
REF _
Toc48
03535
00 \h
 54 
5 OBJETIVO GENERAL ............................................................................................... 54 
REF _
Toc48
03535
01 \h
 54 
5.1 OBJETIVOS PARTICULARES ........................................................................... 54 
REF _
Toc48
12 
 
03535
02 \h
 54 
6 MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 55 
REF _
Toc48
03535
03 \h
 55 
6.1 Material biológico .............................................................................................. 55 
REF _
Toc48
03535
04 \h
 55 
6.2 Obtención del extracto crudo de semilla y malta verde ................................ 55 
13 
 
REF _
14 
 
Toc48
15 
 
03535
16 
 
05 \h
17 
 
 55 
6.3 Cuantificación de proteína total en losextractos de semilla, malta verde y 
macerado por el método de Bradford .................................................................... 56 
REF _
Toc48
03535
06 \h
 56 
6.3 Ensayo de actividad proteolítica utilizando azocaseína como sustrato
................................................................................................................................... 56 
REF _
Toc48
03535
07 \h
 56 
6.4 Ensayos de inhibición específica de la actividad proteolítica de extractos 
del macerado ........................................................................................................... 57 
REF _
18 
 
Toc48
03535
08 \h
 57 
6.5 Medición de los niveles de actividad de proteasas estándar y su inhibición
................................................................................................................................... 58 
REF _
Toc48
03535
09 \h
 58 
6.6 Secado de la malta y determinación de humedad total ................................. 59 
REF _
Toc48
03535
10 \h
 59 
19 
 
6.7 Macerado de la malta ........................................................................................ 59 
REF _
Toc48
03535
11 \h
 59 
6.8 Estandarización de la técnica para la determinación del perfil aminoacídico 
durante el macerado de la malta ............................................................................ 61 
REF _
Toc48
03535
12 \h
 61 
6.8.1 Cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas (UPLC/MS)
 ............................................................................................................................... 61 
REF _
Toc48
03535
20 
 
13 \h
 61 
6.8.3 Derivatización y análisis de estándares de aminoácidos. ....................... 62 
 PAGE
REF _
Toc48
03535
14 \h
 62 
6.8.4 Separación y análisis en UPLC/MS de estándares de aminoácidos.
 ............................................................................................................................... 64 
REF _
Toc48
03535
15 \h
 64 
6.8.5 Derivatización y análisis de aminoácidos en muestras del macerado
 ............................................................................................................................... 64 
21 
 
REF _
Toc48
03535
16 \h
 64 
7 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................. 65 
REF _
Toc48
03535
17 \h
 65 
7.1 Actividades proteolíticas utilizando azocaseína como sustrato ................... 65 
 PAGE
REF _
Toc48
03535
18 \h
 65 
22 
 
7.2 Humedad total de la malta ................................................................................ 67 
REF _
Toc48
03535
19 \h
 67 
7.3 Efecto del secado sobre la actividad proteolítica ........................................... 68 
REF _
Toc48
03535
20 \h
 68 
7.4 Actividad proteolítica e inhibición específica de proteasas estándar
................................................................................................................................... 70 
REF _
Toc48
03535
23 
 
21 \h
 70 
7.4.1 Actividad proteolítica de papaína .............................................................. 70 
REF _
Toc48
03535
22 \h
 70 
7.4.2 Actividad proteolítica de termolisina ........................................................ 71 
REF _
Toc48
03535
23 \h
 71 
7.4.3 Actividad proteolítica de subtilisina .......................................................... 73 
REF _
Toc48
03535
24 
 
24 \h
 73 
7.4.4 Actividad proteolítica de renina ................................................................. 74 
REF _
Toc480
35352
5 \h 
74 
7.5 Medición de la actividad proteolítica durante el macerado de las variedades: 
Metcalfe, HV-11 y HV-19. ......................................................................................... 76 
REF _
Toc48
03535
26 \h
 76 
7.6 Inhibición de proteasas estándar ..................................................................... 78 
REF _
Toc48
25 
 
03535
27 \h
 78 
7.7 Inhibición de la actividad proteolítica durante el macerado de las 
variedades: Metcalfe, HV-11 y HV-19. .................................................................... 84 
REF _
Toc48
03535
28 \h
 84 
7.8 Determinación de los perfiles de aminoácidos del macerado de Metcalfe, 
HV-11 y HV-19 .......................................................................................................... 89 
REF _
Toc48
03535
29 \h
 89 
26 
 
8 CONCLUSIONES .................................................................................................... 102 
REF _
Toc48
03535
30 \h
 102 
9 BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................... 103 
REF _
Toc48
03535
31 \h
 103 
Apendice A ................................................................................................................ 110 
REF _
Toc48
03535
32 \h
 110 
27 
 
Cuantificación de proteína total por el método de Bradford en placas de ELISA
................................................................................................................................. 110 
REF _
Toc48
03535
33 \h
 110 
Ensayo de actividad proteolítica utilizando azocaseína como sustrato
................................................................................................................................. 111 
REF _
Toc48
03535
34 \h
 111 
 
1 RESUMEN 
 
La hidrolisis enzimática de proteínas de reserva (hordeínas), en péptidos y aminoácidos 
es uno de los procesos más importantes para el desarrollo de la semilla, así como en la 
industria de producción de malta y fabricación de cerveza. Durante el proceso de malteo, 
la cebada es germinada parcialmente en condiciones controladas para provocar la 
hidrolisis de biopolímeros (carbohidratos y proteínas) en sustancias más simples, con el 
28 
 
fin de que las levaduras utilizadas para la fermentación puedan asimilarlas para su 
crecimiento y producción de etanol. A su vez una hidrolisis total de las proteínas es poco 
deseable debido a que existe muy poca proteína en la cerveza, impactando en la 
habilidad de espumado, color y otras características requeridas. 
Se ha documentado que la hidrolisis enzimática es el producto de actividades exo- y 
endo-peptidasa. Hasta el momento se han identificado cuatro tipos de proteasas, 
clasificadas de acuerdo a su mecanismo catalítico; proteasas dependientes de serina, 
cisteína, aspártico y por ultimo metaloproteasas. 
Se midieron las actividades proteolíticas de tres variedades de cebada, dos de ellas 
mexicanas (HV-11 y HV-19) y una canadiense (Metcalfe). Se encontró que el proceso de 
malteo tuvo un efecto sobre la actividad de la variedad Metcalfe disminuyéndola en 
comparación con la actividad proteolítica medida en la semilla seca de Metcalfe. A su 
vez, el secado de la malta solo tiene un efecto sobre la actividad proteolítica de las 
variedades mexicanas, aumentando para la variedad HV-11, y disminuyendo de manera 
significativa para la variedad HV-19. 
Durante el macerado de la malta, para las tres variedades, la tendencia es el aumento 
de la actividad proteolítica conforme incrementa la temperatura. Es notable que la 
variedad HV-19, fue la única que mantuvo su actividad proteolítica a temperaturas muy 
altas de macerado (80°C), y esta es atribuida a la acción de proteasas de serina y 
metaloproteasas. 
Se estableció un método para el análisis de aminoácidos de mostos cerveceros, 
revelando que tanto la variedad Metcalfe como HV-19 presentan hidrolisis prematura de 
proteínas ya que estos son detectados al tiempo cero de macerado, aunque la 
concentración de aminoácidos aumenta conforme progresa el macerado, indicando que 
existe hidrolisis de proteínas para ambas variedades durante el macerado. En cuanto a 
la variedad HV-11, solo se detectaron los aminoácidos alanina y prolina al tiempo cero 
del macerado pero la presencia de los aminoácidos restantes se hace evidente al final 
del macerado,sugiriendo que, la mayor hidrolisis de proteínas para la variedad HV-11 se 
da en el macerado y no en el malteo. 
29 
 
 
2 INTRODUCCIÓN 
 
El arte de la producción de cerveza se ha desarrollado por alrededor de 5000 años 
(Hough, 1991). Hoy en día, la elaboración de esta bebida alcohólica ha redundado en 
una de las industrias más redituables a nivel mundial, con una producción cercana a los 
970 millones de hectolitros anuales (Anger et al., 2009). 
La cebada, junto con el lúpulo, levadura y agua forman los cuatro ingredientes básicos 
para la elaboración de cualquier tipo de cerveza, otorgándole características únicas que 
ningún otro ingrediente podría. 
2.1 ¿Por qué la cebada? 
Una gran variedad de cereales pueden ser malteados para la producción de cerveza, 
desde el trigo, arroz, maíz hasta el sorgo; sin embargo, el grano de cebada es el cereal 
mayoritariamente utilizado por su fácil manejo en cuanto a cultivo, almacenamiento y 
germinación en comparación con los ya mencionados, además de generar un perfil de 
aromas y sabores característicos que solo este cereal puede otorgar. Y no solo eso, 
también es responsable del color, cuerpo, espuma y palatabilidad que va a adquirir la 
cerveza. La cebada también, contribuye con los azúcares y fuentes de nitrógeno 
necesarias para alimentar a las levaduras que se encargaran de la fermentación (Nachel, 
2012). 
El grano seco de cebada por sí solo no se puede utilizar para elaborar cerveza, ya que 
carece de las enzimas activas necesarias para la producción de azúcares fermentables, 
dificulta la molienda y produce mostos de alta densidad con bajos niveles de aminoácidos 
impactando en su color y sabor (Lewis et al., 2001). Para que la cebada sea utilizable, 
tiene que sufrir una serie de modificaciones que se conocen como malteo, que no es 
más que la germinación del grano bajo condiciones controladas, con el fin de producir 
las enzimas hidrolíticas con la mínima degradación del endospermo (Lewis et al., 2001). 
30 
 
2.2 El grano de cebada 
La cebada (Hordeum vulgare. L) es un cereal monocotiledóneo perteneciente al género 
Hordeum, de la tribu Triticeae (Ullrich, 2011) y miembro de la familia Poaceae. En 
términos generales, el grano de cebada contiene al embrión de la planta junto con 
materiales de reserva, principalmente carbohidratos y proteínas que serán movilizados 
para proveer de nutrimentos y energía al embrión para su desarrollo (Boulton, 2013). 
Puede considerarse como una cariópside, esto es, un solo fruto seco e indehiscente (que 
no se abre espontáneamente al llegar a la madurez) en donde la cubierta de la semilla, 
o testa (Figura 1), se encuentra fusionada al pericarpio (Boulton, 2013). 
 
Figura 1. Corte transversal del grano de cebada donde se aprecian los tejidos 
que la componen, así como el embrión (Adaptado de Lewis y Young, 2001). 
 
El grano de cebada cuenta con 6 tejidos; tres de ellos “vivos” y tres “muertos”. En granos 
maduros, los tejidos “vivos” comprenden el embrión, el escutelo y la capa de aleurona 
(Figura 1), mientras que, el endospermo, pericarpio y testa comprenden el tejido “muerto” 
(Etokakpan, 1993). 
El endospermo está compuesto de gránulos de almidón que se encuentran rodeados por 
una matriz proteica. A su vez, la matriz proteica se encuentra rodeada de una capa de 
β-glucanos formándose una pared (Tester et al., 2004). 
31 
 
 
2.3 Cambios durante la germinación del grano de cebada 
 
En la industria cervecera, ocurre un proceso de germinación controlada, la cual es 
detenida por medio de calor. Se conoce como malteo y tiene como objetivo la síntesis de 
enzimas hidrolíticas, modificación parcial del endospermo y la producción de malta verde. 
La germinación requiere de la hidrolisis de los gránulos de almidón presentes en el 
endospermo, de la pared celular y de las proteínas de reserva para liberar los nutrimentos 
requeridos para el crecimiento y desarrollo del embrión (Bell, 2013). La cebada requiere 
de su hidratación para que se active el metabolismo y la consecuente síntesis de 
macromoléculas, entre las que destacan las enzimas hidrolíticas (Zhang y Jones, 1995), 
las cuales se sintetizan y secretan de la aleurona hacia el endospermo donde comenzara 
la hidrólisis. 
 
Figura 2. Representación del ciclo de germinación en 
granos de cebada (Adaptado de Lewis y Young, 2001) 
32 
 
La germinación del grano de cebada está controlada por las hormonas ácido abscísico 
(ABA), promotora del estado quiescente en la semilla, y el ácido giberélico (GA), que se 
sintetiza en el embrión promoviendo la degradación de las reservas y el desarrollo 
(Dominguez y Cejudo, 1996). En granos maduros, el ABA se sintetiza al final de la 
maduración de la semilla cuando ésta se deshidrata para entrar al estado de quiescencia. 
En esta etapa funciona como un represor metabólico manteniendo el estado quiescente 
de la semilla. Cuando la semilla se hidrata, como parte del proceso de germinación, 
disminuye la síntesis de ABA mientras que la síntesis de ácido giberélico aumenta 
(Figura 2). 
La giberelinas son secretadas por el embrión hacia la capa de aleurona (Figura 2), 
promoviendo la inducción de los genes que codifican para distintas enzimas hidrolíticas 
como proteasas, amilasas y glucanasas, entre otras, que son necesarias para hidrolizar 
las reservas almacenadas en el endospermo (Peng y Harberd, 2002). 
El mecanismo por el cual las giberelinas ejercen su efecto sobre las células de la capa 
de aleurona es complejo y aun no se encuentra completamente dilucidado; sin embargo, 
se sabe que el ácido giberélico participa en dos vías de transducción de señales. La 
primera es la vía independiente de calcio que involucra a cGMP. En esta vía, la activación 
33 
 
ocurre sobre una proteína con caja F (Boulton, 2013). Las proteínas con caja F se han 
asociado a la transducción de señales y a la degradación de proteínas vía el proteosoma 
26 S, ya que forman parte del complejo ubiquitin-ligasa SCF (por Skp1-Cullin1-F-
complejo proteico). 
Figura 3. Esquema de la degradación de proteínas vía el complejo SCF (Adaptado 
de Elledge Lab) 
 
El complejo SCF cataliza la ubiquitinación de proteínas, con el fin de marcarlas para 
degradación por el proteosoma (Dharmasiri, Dharmasiri y Estelle, 2005). En la figura 3 
se muestran los componentes y el mecanismo de ubiquitinación vía el complejo SCF. 
Una proteína con caja F interacciona con Skp 1 (S-phase kinase-associated protein 1, 
por sus siglas en inglés), que a su vez une a la proteína Cul 1 (Cullin 1, por sus siglas en 
inglés) que mediante la interacción con Rbx 1 (RING-box protein 1, por sus siglas en 
inglés) estabilizan la unión con la E2 ligasa. Por otro lado, el sustrato fosforilado 
interacciona con la proteína con dominio de caja F, de esta manera el sustrato estará 
anclado y cerca de la E2 ligasa para que pueda ser marcada mediante la ubiquitinación 
y posteriormente degradado vía el proteosoma (Pavletich et al., 2000). 
La proteína con caja F se encuentra unida al represor, que bloquea la transcripción del 
gen, cuyo producto es requerido para la expresión de los genes que codifican para las 
enzimas hidrolíticas. Al aumentar los niveles de GA, el represor unido a la proteína con 
caja F es degradado vía el proteosoma 26S y la transcripción de los genes para enzimas 
hidrolíticas tiene lugar. La segunda vía involucra la regulación positiva del sistema 
secretor del aparato de Golgi, en el cual las enzimas recién sintetizadas son 
transportadas desde la capa de aleurona hacia el endospermo (Boulton, 2013). 
 
2.3.1 Modificación del endospermo 
 
Una vez sintetizadas las enzimas hidrolíticas inducidas por el GA, estas son secretadas 
hacia el endospermo donde comenzará la modificación. El paso inicial de la modificación 
es la degradación de glucanos y pentosanos que forman parte de la pared que recubre 
34 
 
a los gránulos de proteína-almidón.Este es un paso clave para el proceso de 
germinación (Jones, 2005) no solo para la degradación de almidón, ya que también se 
da acceso a las proteasas que degradan a la matriz proteica, compuesta por hordeínas, 
glutelinas, albúminas y globulinas. Estas proteínas constituyen aproximadamente el 40, 
30, 20 y 10%, con respecto al total del contenido de proteínas de reserva en el grano 
(Shewry y Halford, 2002) y su hidrólisis resulta esencial para el crecimiento y el desarrollo 
de la plántula. 
 
2.4 Proteínas de reserva 
 
El tipo y distribución de las proteínas de reserva en los cereales resulta diverso. Por 
ejemplo, en avena y arroz, las globulinas forman la mayor fracción de proteínas de 
reserva, cercano al 70% de la proteína total (Shewry y Halford, 2002). 
La mayoría de las albúminas en endospermos de granos maduros de trigo y cebada, 
pertenecen la familia de inhibidores ɑ-amilasa (Triboi et al., 2003). Más allá de funcionar 
como reserva, estas proteínas son capaces de inhibir ciertas enzimas otorgando 
protección contra una germinación prematura o el ataque de patógenos (Gahoonia y 
Nielsen, 2004). 
 
Otro ejemplo de un inhibidor de proteasas en el endospermo de los cereales, es la 
serpina. Concretamente en cebada, se encuentra la serpina Z, que es capaz de inhibir 
in vitro la actividad de la quimotripsina. Además, la serpina Z es la proteína con mayor 
abundancia en la cerveza (Schmidt et al., 2016). 
A excepción del arroz y la avena, las principales proteínas de reserva en el endospermo 
de los cereales son las prolaminas. Se caracterizan por poseer una composición de 
aminoácidos inusual, particularmente rica en prolina y glutamina. Además, diversas 
prolaminas contienen dominios comprendidos por repetidos de aminoácidos (Shewry y 
Halford, 2002). 
35 
 
En cebada, las prolaminas se conocen como hordeínas (debido al nombre de la especie, 
Hordeum vulgare) y se clasifican de acuerdo a su peso molecular y a su contenido de 
aminoácidos azufrados (Tabla 1). Debido a su composición, las hordeínas son solubles 
en soluciones de etanol al 70%.Representan del 40-50% de la proteína total del grano, 
además son el principal blanco de degradación por parte de las proteasas sintetizadas 
durante la germinación (Jones, 2005). 
Como se aprecia en la tabla 1, las hordeínas pueden ser clasificadas en dos grandes 
grupos; de alto y bajo peso molecular, así como por su contenido de azufre, representado 
por la cantidad de cisteínas presentes en la secuencia. De esta manera, al ser las 
hordeínas B, las proteínas con mayor contenido de azufre, están presentes en la espuma 
de la cerveza, donde forman complejos con la serpina y la LTP (Lipid Transfer Protein) 
para formarla y estabilizarla, ya que, la Hordeína B es capaz de formar puentes disulfuro 
que le confieren estabilidad térmica y proteolítica, logrando mantener su presencia 
durante todo el proceso de elaboración de la cerveza. 
 
Tabla 1. Clasificación de hordeínas en el grano de cebada (Shewry y Halford, 2002). 
 
2.5 Tipos de proteasas y su clasificación 
 
Las proteasas son enzimas que catalizan el rompimiento de los enlaces peptídicos de 
proteínas propiciando su degradación. Tienen diversas funciones biológicas, como, la 
Tipo Característica 
Hordeína B 
Ricas en azufre 
28-45 kDa 
Hordeína C 
Pobres en azufre 
49-72 kDa 
Hordeína D 
Alto peso molecular 
~100 kDa 
Hordeína Ɣ 
Bajo peso molecular 
< 20 kDa 
36 
 
regulación de la función de otras enzimas o proteínas, la activación de proteasas por 
cortes en sitios específicos, la degradación de proteínas que no serán requeridas más 
para la vía que controlan, entre otras. De esta manera, las proteasas se convierten en 
los mayores reguladores de los procesos biológicos (Schilling y Overall, 2007). Existen 
dos tipos de mecanismos de acción de las proteasas; exo-proteasas y endo-proteasas. 
Las exoproteasas catalizan la hidrolisis realizando el corte en el amino o carboxilo 
terminal de las proteínas blanco, no requieren de un secuencia consenso específica para 
realizar su función, mientras que, las endo-peptidasas reconocen sitios específicos de 
corte dentro de la secuencia proteica, provocando el rompimiento del sustrato en puntos 
intermedios (Harris et al., 2000). También, las proteasas pueden subdividirse en cuatro 
grupos de acuerdo a sus mecanismos de acción, que dependen en gran medida, de los 
aminoácidos involucrados en el sitio activo. La clasificación de las proteasas de acuerdo 
a su sitio activo se ha realizado mediante experimentos donde se hace uso de inhibidores 
específicos que actúan sobre los sitios activos (Jones, 2005) secuestrando la actividad 
proteolítica. En el mosto cervecero se han identificado diversas actividades proteolíticas 
pertenecientes a cuatro tipos de proteasas: 
 
a. Proteasas de cisteína. La catálisis se logra a través de un residuo de cisteína 
presente en el sitio activo. La actividad ocurre por medio de la formación de un 
enlace covalente vía ataque nucleofílico del átomo de azufre de la cisteína sobre 
el grupo carbonilo del enlace peptídico (Beynon y Bond, 2001). Este tipo de 
proteasas puede inhibirse de manera irreversible por el E-64 (inhibidor irreversible 
de proteasas de cisteína) o de manera reversible por leupeptina (que también 
inhibe proteasas de serina y proteasas de treonina). 
 
b. Proteasas de serina. Estas enzimas catalizan la hidrolisis del sustrato de manera 
similar a las proteasas de cisteína solo que, en este caso, el grupo hidroxilo del 
residuo de serina en el sitio activo forma un intermediario covalente con el grupo 
carbonilo del enlace peptídico propiciando su rompimiento. Pueden ser inhibidas 
por el PMSF (por sus siglas en inglés, phenylmethylsulfonyl fluoride) aunque no 
37 
 
es tan especifico porque también puede inhibir proteasas de cisteína, el AEBSF 
(por sus siglas en inglés, 4-(2-aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride) que es un 
análogo de PMSF soluble en agua o incluso por la leupeptina (Beynon y Bond, 
2001). 
 
c. Proteasas de aspartato. Este tipo de proteasas, junto con las metaloproteasas, 
llevan a cabo la catálisis sin la necesidad de formar un intermediario covalente. El 
mecanismo que siguen es ácido-base, esto es, necesitan una molécula de agua 
“activada” que en contacto con los dos residuos de ácido aspártico en el sitio 
activo, actúa como nucleófilo, promoviendo el rompimiento del enlace peptídico. 
Esta clase de proteasas puede ser inhibida por la Pepstatina A (Beynon y Bond, 
2001). 
 
d. Metaloproteasas. Requieren de la presencia de un ion metálico divalente 
(usualmente zinc) para llevar a cabo la catálisis (Beynon y Bond, 2001). Este tipo 
de enzimas no inducen la formación de intermediarios covalentes. Al igual que las 
proteasas de aspartato, hace uso del ion en el sitio activo, el cual une una 
molécula de agua polarizándola y formando un nucleófilo fuerte que lleva a cabo 
el ataque sobre el grupo carboxilo del sustrato. 
Es importante señalar, que si bien, las proteasas de cisteína son las principales 
responsables de la degradación de las hordeínas (Christensen et al., 2014), no se 
conocen las contribuciones de los otros tipos de proteasas a dicha degradación. 
A continuación, se detallan las características de las proteasas representativas de cada 
grupo, que fueron utilizadas en este trabajo para los ensayos de actividad proteolítica. 
 
2.5.1 Papaína 
 
Pertenece a la familia de las proteasas de cisteína y es extraída de las semillas de 
papaya. Tiene preferencia de corte entre aminoácidos básicos, leucina o glicina. Es 
estable en un rango de pH de 4.0-8.0, aunque la actividad máxima la alcanza en pH 6.0-
38 
 
7.0. Se desnaturaliza en pH > 8.0 y por arriba de 37°C (Ozari y Jagur-Grodzinski, 1974). 
Es monomérica, unida por tres puentes disulfuro y un grupo sulfhidrilo es necesario para 
su actividad (Figura 4)Figura 4. Modelo y arquitectura del sitio activo de la papaína. Cisteína e Histidina son necesarios para la catálisis. 
Tomado de (Berg et al., 2002). 
 
2.5.2 Termolisina 
 
Es una metalopeptidasa neutra y termoestable, purificada de Bacillus 
thermoproteolyticus rokko. Requiere de un ion Zn2+ para la catálisis y cuatro iones Ca2+ 
que le confieren estabilidad (Reslow et al., 1988). El pH óptimo de actividad es de 8.0, 
aunque es estable entre pH 5.0 – 9.5. Como se ha mencionado, es termoestable teniendo 
a 60 °C su temperatura óptima de actividad. Tiene preferencia de corte en: X – corte – 
PROTEASAS DE CISTEINA 
 Papaína 
39 
 
Y- Z; donde x=cualquier aminoácido, y= Leu, Phe, Ile, Val, Met, Ala y z= cualquier 
aminoácido excepto prolina (Cline et al., 1984). El sitio activo se muestra en la figura 5. 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Modelo y arquitectura del sitio activo de la termolisina. El ion Zn2+ estabiliza las interacciones entre los 
residuos de histidina y glutamina en el sitio activo. Tomado de Berg et al. 2002 
 
2.5.3 Subtilisina 
 
Otro tipo de proteasas presente en el macerado de la malta, son aquellas dependientes 
del aminoácido serina para la catálisis, una de las enzimas más representativas es la 
subtilisina (Sigma-Aldrich, USA). Es obtenida mediante fermentación de la bacteria 
Bacillus lichenformis. Requiere de un residuo de serina para realizar un ataque 
nucleofílico sobre el sitio de corte (Erez et al., 2009). El valor de pH, donde la actividad 
alcanza un máximo de actividad se encuentra en el intervalo de 8.0 – 10.0, aunque 
presenta actividad a pH 6.0. En la figura 6 se muestra un acercamiento sobre el sitio 
METALOPROTEASAS 
 Termolisina 
40 
 
activo de las proteasas de serina, donde además del residuo de serina, tanto la histidina 
como el ácido aspártico completan la triada catalítica que guía la proteólisis. 
 
 
Figura 6. Modelo y arquitectura del sitio activo de Subtilisina. Consiste en una reacción ácido-
base donde el residuo de Serina realiza el ataque nucleofílico sobre el enlace peptídico del 
sustrato. Tomado de (Erez et al., 2009). 
 
2.5.4 Renina 
 
La última proteasa estándar elegida fue la renina que pertenece a la clase de las 
proteasas de aspartato. Tiene dos residuos de ácido aspártico en su sitio activo (Figura 
7), necesarios para la actividad. La renina o quimosina forma parte del complejo llamado 
rennet (coloquialmente conocido como cuajo). Dicho complejo, está compuesto por otras 
enzimas importantes como la pepsina y la lipasa, que es utilizado para la elaboración de 
quesos. 
PROTEASAS DE ASPÁRTICO 
 Renina 
41 
 
Figura 7. Modelo y arquitectura del sitio activo de la renina. El agua activada lleva a 
cabo la hidrolisis del sustrato por medio de un mecanismo ácido-base. Tomado de 
(Berg et al.,. 2002). 
 
El sustrato natural de la renina es la κ-caseína que cataliza el rompimiento del enlace 
peptídico entre el residuo Phe105 y Met106 (Kapoor y Metzger 2008). Es sintetizada en 
forma de zimógeno, teniendo su actividad óptima entre los valores de pH 3.0 – 5.0 , 
aunque es estable hasta pH 7.0 (Richardson et al., 1967). 
Si bien necesita dos residuos de ácido aspártico para la catálisis, el agua circundante es 
realiza el ataque nucleofílico sobre el enlace peptídico. La molécula de agua es “activada” 
por la carga parcial negativa de uno de los ácidos aspárticos presentes en el sitio activo. 
 
2.6 Las proteasas en el grano de cebada y su importancia en el proceso de 
elaboración de cerveza 
 
El espectro de proteasas en la malta y en el macerado de cebada es una mezcla 
compleja de clases de proteasas que difieren en sus patrones de expresión espacio-
temporal en el caso de la malta, y de la resistencia térmica en el macerado (Wrobel y 
Jones 1992). Los niveles de actividad proteolítica en granos maduros de cebada son 
bajos; situación que cambia significativamente durante la germinación, cuando las 
proteasas son activas y se mantienen así hasta el 3° o 4° día del malteo. 
Estas enzimas son clave en el proceso, no solo porque proveen a las levaduras de 
fuentes de nitrógeno, azufre y aminoácidos, sino porque también son importantes 
contribuyentes a la clarificación, sabor y filtrabilidad del mosto, además de participar en 
la formación y estabilización de la espuma (Heisner y Bamforth, 2008). Incluso, 
inhibidores de proteasas como la serpina (inhibidor de proteasas de serina) resulta ser 
importantes componentes que impactan en la estabilidad de la espuma (Robinson et al., 
2007). La proteasa EPB (EndoProtease Barley) es una cisteín proteasa que se ha 
postulado como la principal proteasa que degrada proteínas de reserva en la cebada. La 
expresión de esta enzima se encuentra regulada por las giberelinas y su síntesis es 
suprimida por el ácido abscísico, además tiene su actividad máxima a los 50°C 
42 
 
(Mikkonen et al., 1996). Es importante señalar, que si bien, las proteasas de cisteína son 
las principales responsables de la degradación de las hordeínas (Christensen et al., 
2014), no se conocen las contribuciones de los otros tipos de proteasas a dicha 
degradación. 
De esta manera, conocer el espectro proteolítico del germinado de cebada, así como su 
funcionamiento en el macerado, provee una herramienta potencial para la industria 
cervecera, no solo para obtener productos de buena calidad, sino para implementar 
posibles cambios en los protocolos de malteo y macerado que puedan reducir costos y 
tiempos de proceso. 
 
2.7 Inhibidores de proteasas 
 
En los sistemas biológicos, las enzimas pueden interactuar con otros compuestos 
químicos como: análogos de sustratos, fármacos, toxinas u otros agentes bioquímicos 
causando la inhibición de la actividad enzimática. De acuerdo con su capacidad de unión 
con las enzimas, los inhibidores se han clasificado en dos tipos: reversible e irreversibles. 
Los inhibidores reversibles pueden ser fácilmente disociados de la enzima y solo ejercen 
un efecto inhibitorio temporal, mientras que, los inhibidores irreversibles se unen con 
mayor afinidad a la enzima (regularmente en el sitio activo), formando un complejo 
altamente estable dejando a la enzima inactiva (Boyer, 2000). En este trabajo, se 
utilizaron inhibidores de proteasas comerciales tanto irreversibles como reversibles que 
se unen al sitio activo de las proteasas, a continuación se detallan las características de 
cada uno. 
 
 
 
 
 
43 
 
 
2.7.1 E-64; inhibidor de proteasas de cisteína 
 
Es un inhibidor irreversible específico de proteasas de cisteína que no reacciona con 
otros grupos tiol. No presenta inhibición cruzada con proteasas dependientes de serina, 
excepto tripsina (Govrin y Levine, 2000). Tiene un rango de concentración efectiva que 
va de 1 – 10 μM. 
Figura 8. Estructura ramificada del inhibidor E-64. El grupo trans-epoxisuccinil se une 
Irreversiblemente al grupo tiol del sitio activo. 
 
2.7.2 PMSF; Inhibidor de proteasas serina 
 
El PMSF (fluoro fenilmetilsulfonil) es un inhibidor reversible de las proteasas de serina 
como quimotripsina, tripsina y trombina. No inhibe metaloproteasas, proteasas de 
aspartato y a la mayoría de las proteasas de cisteína (aunque puede generar inhibición 
no específica). 
 
Figura 9. Estructura ramificada del inhibidor PMSF. El grupo fluoro sulfonilo es el 
que realiza la inhibición 
 
44 
 
Es poco soluble en agua, por lo que debe disolverse en solventes orgánicos como el 
etanol, metanol, alcohol isopropílico o DMSO. Es efectivo a una concentración final de 
0.1 – 10 mM En la figura 9 se muestra la estructura del inhibidor PMSF, donde el grupo 
fluoro sulfonilo reacciona con el residuo de serina del sitio activo de la proteasa 
“secuestrando” su actividad. Esta unión es reversible. 
 
2.7.3 AEBSF; inhibidor de proteasas de serina 
 
AEBSF o fluoro hidroclorurode 4 – (2 – aminoetil) bencenosulfonilo es un inhibidor 
irreversible de proteasas de serina como la quimotripsina, kalicreina, plasmina, trombina 
y tripsina, no se ha reportado que inhiba a las proteasas de cisteína. En comparación 
con el PMSF, el inhibidor AEBSF es soluble en agua, su efecto inhibitorio presenta mayor 
especificidad y es más estable a valores bajos de pH (Gold y Fahrney, 1964). 
 
Figura 10. Estructura ramificada del inhibidor AEBSF. Al igual que 
en el inhibidor PMSF, el grupo fluoro sulfonilo lleva a cabo el 
proceso inhibitorio. 
 
El mecanismo inhibitorio de AEBSF es similar al de PMSF, donde el grupo fluoro sulfonil 
(Figura 10) reacciona con el hidroxilo del residuo de serina en el sitio activo, formándose 
así un derivado sulfonado de la enzima impidiendo que ejerza su función proteolítica. Es 
utilizado en un rango efectivo de 0.1 – 1 mM de concentración final. 
2.7.4 EDTA; inhibidor de metaloproteasas 
 
El uso de EDTA como inhibidor de metaloproteasas es común en diversas 
investigaciones (Engel et al., 2005; M. Osman et al., 2002), ya que es un agente quelante 
45 
 
que puede formar complejos con iones metálicos que cuenten con una estructura de 
coordinación octaédrica (Figura 11). Como se ha mencionado, las metaloproteasas 
dependen de un catión divalente para permanecer activas. De esta manera el EDTA 
cumple con la función de inhibidor proteolítico positivo a metaloproteasas, dado que, 
remueve el ion divalente del sitio activo provocando la perdida de función. 
 
 
 
 
Figura 11. EDTA como quelante de iones metálicos divalentes. A la 
izquierda se observa la estructura del EDTA. Cuando se le adiciona 
un catión divalente, el EDTA forma un anillo (derecha) alrededor del 
catión, formando un complejo coordinado estable. 
 
 
2.8 Los inhibidores endógenos de las proteasas en el grano de cebada 
 
El estudio de las proteasas de cebada y sus actividades en extractos crudos, durante el 
malteo y el macerado se vuelve complejo debido a la presencia de inhibidores endógenos 
que pueden enmascarar las actividades presentes en el grano (Jones et al., 2000). Los 
inhibidores endógenos son proteínas estables que tienen gran afinidad y pueden regular 
la actividad de sus proteasas blanco (Jones, 2005). Estos inhibidores no solo se 
encuentran presentes durante la germinación, también se han detectado durante el 
desarrollo y maduración del grano, cumpliendo funciones como la represión de la 
actividad proteolítica, manteniendo el endospermo intacto para la germinación (Osman 
et al., 2003). Otra posible función dentro del grano, es la de inhibir endógenamente a las 
proteasas bacterianas o de insectos, protegiendo a la planta de patógenos y plagas 
(Jamal et al., 2013). 
Los inhibidores endógenos son proteínas estables que tienen gran afinidad y pueden 
regular la actividad de sus proteasas blanco (Jones, 2005). En el caso del grano de 
Mg2+ 
46 
 
cebada, se han caracterizado inhibidores endógenos para las proteasas de serina y de 
cisteína (Jones, 2005). Sin embargo, hasta el momento no se han identificado inhibidores 
para las proteasas de aspartato y metaloproteasas. 
 
2.8.1 LTP-1 y cistatinas, como inhibidores endógenos de cisteín proteasas en el 
grano de cebada 
 
LTP-1 (Lipid Transfer Protein 1) es una proteína de 9.7 kDa sintetizada en la capa de la 
aleurona, presente en granos maduros y/o germinados (Stanislava, 2007). Esta proteína 
tiene un papel importante en la formación y estabilización de la espuma, además de ser 
un inhibidor de EPB-1 (EndoProtease Barley 1, por sus siglas en inglés), (Limure y Sato, 
2013). Es probable que LTP-1 no sea activa en su conformación nativa (Davy et al., 
1999). Durante el calentamiento del mosto, LTP-1 cambia su conformación, adquiriendo 
la función de inhibidor. Debido a esto, es poco probable que LTP-1 juegue un papel en 
la regulación de la actividad proteolítica durante la germinación, no así durante el 
macerado, donde es activa y puede afectar la actividad de proteasas de cisteína, 
mayores contribuyentes de la degradación de proteínas de reserva. Diversas isoformas 
de LTP-1 han sido identificadas en el grano de la cebada, lo que indica que al menos 
una o más isoformas del inhibidor pueden estar activas durante la maduración y el 
malteo. 
La cistatina es un inhibidor de la familia de las papaínas C1A (proteasas de cisteína). 
Estos inhibidores fueron inicialmente descritos en granos de arroz (Arai et al., 1991). La 
familia de las cistatinas está formada por dos grupos, cistatina 1 (OC-1) y cistatina 2 (OC-
2). Estos inhibidores se han encontrado también en cebada (Martinez et al., 2009) y 
mostraron actividad inhibitoria contra proteasas tipo catepsina L (proteasas de cisteína). 
Estudios de inmunolocalización muestran que ambas proteínas se detectan en el 
endospermo durante el desarrollo y la germinación, sugiriendo un posible papel en el 
llenado del grano y la movilización de nutrientes. 
47 
 
 
2.8.2 Inhibidores endógenos de proteasas de serina en cebada 
 
Los miembros de la familia de los inhibidores tripsina / ɑ-amilasa se encuentran 
involucrados en la inhibición de proteasas de serina en el grano de cebada ( Jones y 
Fontanini, 2003). Estas proteínas tienen inhibición específica sobre la proteasa SEP-1, y 
tienen un rol potencial en la regulación de la degradación de las proteínas de reserva. 
Recientemente se han visto involucradas en la formación y estabilización del “chill haze” 
(Robinson et al., 2007). El “chill haze” es un fenómeno que ocurre por la interacción de 
polifenoles con proteínas. Dichas moléculas están disueltas en la cerveza a temperatura 
ambiente, pero cuando ésta es enfriada, los complejos polifenol-proteina se vuelven 
insolubles manteniéndose en suspensión, dando a la cerveza un aspecto turbio (Steiner 
et al., 2010). 
La serpina es una proteína que tiene actividad inhibitoria sobre proteasas de serina (Li 
et al., 2014). Es parte de la familia de los inhibidores de tripsina ɑ1 a los que se les 
atribuyen funciones de reguladores durante el llenado del grano. En la germinación, la 
serpina es activada por acción de proteasas de cisteína (Li et al., 2014). 
 
 
2.9 Producción de cerveza 
 
La cadena de producción de cerveza cuenta con seis etapas; malteo, macerado, 
centrifugación, fermentación, maduración y empaquetado. En cada una suceden una 
serie de transformaciones bioquímicas, como la degradación diferencial del endospermo 
y la solubilización de sus componentes (formación del mosto) y la generación de alcohol 
vía fermentación de azúcares (malta y glucosa principalmente) por parte de la levaduras. 
Sin embargo, las proteasas tienen especial injerencia en las dos primeras etapas del 
proceso, ya que, posterior al macerado, el mosto es calentado por arriba de los 100 °C 
con el objeto de esterilizarlo y adicionar el lúpulo. A tan altas temperaturas, las 
48 
 
actividades enzimáticas cesan por la desnaturalización térmica de las proteasas y 
amilasas (Hu et al., 2014). 
 
2.9.1 Malteo y secado 
 
La malta se obtiene de ciertos granos, usualmente de cebada (en algunas preparaciones 
se ocupa trigo, arroz, avena, sorgo o maíz), la cual es germinada bajo condiciones 
controladas con el objetivo de producir las enzimas hidrolíticas con la mínima 
degradación del endospermo (Lewis y Young, 2001). 
El proceso de malteo comienza con el remojo del grano con el fin de hidratarlo para 
comenzar la germinación (Lewis y Young, 2001). Durante este proceso el grano pasa de 
una humedad total del 12-14% hasta 42-46% (Briggs, 1978). Los niveles de humedad 
deben estar controlados ya que, a niveles bajos de humedad el desarrollo del embrión 
es débil y la modificación del endospermo es pobre (el contenido de extracto de malta 
para la elaboración de cerveza es bajo). En cambio, niveles excesivos de humedad traen 
consigo una alza en la modificación del endospermoe incluso la muerte del embrión 
(Hornsey, 1999). El proceso de germinación dura de 3-5 días aproximadamente, siempre 
controlando la humedad y manteniendo el grano a 22 °C. La malta verde puede ser 
utilizada de manera inmediata para la producción o ser almacenada, para lo que tendrá 
que ser sometida a un proceso de secado. 
El secado es la parte final del proceso en el cual los granos germinados están sometidos 
a calentamiento con aire seco (Boulton, 2013). Su objetivo es convertir la malta verde en 
un producto final estable. Durante esta etapa se logran definir las características que 
tomará la malta, estas incluyen al sabor, aroma, color, rendimiento de extracto y la 
cantidad de enzimas. El color y aroma se desarrolla principalmente por las reacciones 
de Maillard favorecidas a altas temperaturas, que ocurren entre los grupos reductores de 
los azúcares y los grupos amino de proteínas y aminoácidos (Briggs, 1978), dando como 
resultado la formación de melanoidinas y diversos intermediarios aromáticos como el 3-
metilbutanal o el metilpropanal (Cerny, 2008). La temperatura tiene que ser controlada, 
ya que se tiene que lograr que el secado sea lo más rápido posible con la mínima 
49 
 
destrucción de enzimas producidas durante el malteo. Estas enzimas son más 
vulnerables cuando el grano esta húmedo y comienza el calentamiento (temperaturas 
cerca de 50-70°C), la temperatura actual del grano en ese punto es de 25-30°C debido 
a que gran parte de la energía del aire es absorbida por el calor latente de la evaporación 
(Hornsey, 1999). 
 
2.9.2 Molienda y macerado 
 
Posterior al secado de la malta, esta se tiene que triturar con el propósito de reducir el 
tamaño de partícula y de esta manera exponer al endospermo para ser degradado por 
enzimas durante el proceso de macerado (Bamforth, 2009). Por otro lado, se tiene que 
cuidar la molienda para no reducir demasiado el tamaño de las partículas y poder 
preservar la cáscara (pericarpio) del grano lo más intacta posible, ya que esta servirá 
como un filtro natural en la recirculación y clarificación del mosto (Elinger, 2009). La 
operación final de este proceso se conoce como molienda la cual se mezcla con agua 
para dar lugar al macerado. 
El macerado se define como la solubilización de los componentes de la malta vía 
procesos enzimáticos, físicos y químicos (Elinger, 2009), para dar lugar a la formación 
del mosto (extracto fermentable). 
El mosto contiene compuestos solubles, como azúcares fermentables, péptidos y 
aminoácidos libres, así como moléculas volátiles que otorgan olores y sabores 
característicos (Montanari et al., 2005). Dentro de este proceso, el endospermo es 
degradado, por la acción enzimática, en moléculas más pequeñas, que son necesarias 
para el crecimiento y desarrollo de las levaduras encargadas de la fermentación 
(Montanari et al., 2005). Entre las enzimas involucradas en la hidrólisis del endospermo 
se encuentran las amilasas, proteasas, peptidasas y glucanasas y su actividad es 
regulada por diversos factores como la temperatura, el pH, el tiempo y la concentración 
del mosto (Montanari et al., 2005). Usualmente, el macerado consiste en mezclar malta 
seca molida con agua y en agitación someter la mezcla a un perfil de temperatura-tiempo. 
50 
 
Existen tres procedimientos básicos de macerado dependiendo del tipo de cerveza que 
se quiera obtener (Nachel, 2012); 
• Infusión: Es el procedimiento más fácil y básico. Consiste en mezclar malta seca 
molida con agua, sometiendo la mezcla a 65-70 °C y manteniéndola de 60 a 90 minutos. 
Este tipo de macerado es muy utilizado para fabricar cervezas tipo Pale Ale. 
• Infusión escalonada: Es muy parecido al método de infusión, salvo que la mezcla 
es llevada a 50-55°C por 15-30 minutos, una etapa conocida como protein rest. Dicha 
etapa propicia que las proteasas degraden las proteínas de reserva (hordeínas) en 
péptidos y aminoácidos libres que además de servir como nutrimentos para las 
levaduras, contribuyen con el cuerpo de la cerveza y el espumado. Pasada esta etapa, 
el mosto es llevado a 65-70 °C por 60 minutos con el fin de realizar la conversión del 
almidón en azúcares fermentables. 
• Decocción: Es el procedimiento más complejo, bastante similar a la infusión 
escalonada salvo que presenta más etapas de calentamiento (al menos tres). Permite 
tener mayor control sobre la hidrólisis del endospermo. La ventaja que ofrece este 
procedimiento es impartir aromas y sabores característicos, por ejemplo en cervezas tipo 
Bocks o Weizens. 
Diversas reacciones enzimáticas suceden durante el macerado. Estas reacciones se 
verán favorecidas por las combinaciones de temperatura – tiempo (Figura 12). 
En la figura 12 se muestra una gráfica que sigue la progresión de la decocción. En ella 
se indican las temperaturas óptimas para la actividad de las enzimas hidrolíticas que se 
liberan durante la germinación. Por medio del macerado es posible favorecer ciertas 
actividades sobre otras para así establecer la degradación selectiva del endospermo. 
51 
 
La actividad proteolítica durante el macerado de la malta presenta un máximo de 
actividad entre los 45 – 50 °C (Jones, 2005). 
 
Figura 12. Macerado tipo decocción (Briggs, 1978) 
 
El mantenimiento de temperatura durante esta etapa es crucial para alcanzar una 
proteólisis “correcta”, ya que en promedio, los mostos cerveceros contienen cerca de 65-
100 mg de nitrógeno por cada 100 mL, donde, el 20% son proteínas solubles, 30-40% 
polipéptidos, del 30-40 % aminoácidos libres y aproximadamente el 10% restante son 
nucleótidos u otros compuestos nitrogenados (Verbelen et al., 2009). 
2.10 Aminoácidos en los mostos cerveceros 
Los aminoácidos libres representan la mayor fuente de nitrógeno asimilable para las 
levaduras cerveceras. El transporte de estos aminoácidos a través de la membrana 
celular es activo, dirigido por la permeasa general de aminoácidos (Lei et al., 2013). La 
permeasa general se conoce como Gap1 (por sus siglas en inglés, General amino acid 
permease) que es regulada negativamente por la presencia de ciertos aminoácidos, 
fenómeno que se denomina “represión catabólica por nitrógeno” (Beltran et al., 2004). 
De esta manera, los aminoácidos libres se han dividido en cuatro grupos (Lei et al., 2013), 
basándose en los patrones de la toma de aminoácidos por parte de Gap1, estos son: 
Te
m
p
er
at
u
ra
 (
°C
) 
Tiempo (horas) 
β-glucanasas 
Proteasas 
β-amilasa 
α-amilasa Inactivación 
75-90 °C 
52 
 
• Grupo A: Son los aminoácidos de rápida absorción, la toma de estos 
comienza en cuanto la levadura entra en contacto con el mosto. Son 
totalmente consumidos a las pocas horas de iniciada la fermentación, 
entre estos se encuentran; ácido glutámico, ácido aspártico, asparagina, 
glutamina, serina, treonina, lisina y arginina. 
• Grupo B: La toma de valina, metionina, leucina, isoleucina e histidina es 
de manera más lenta, por lo que se catalogan como de absorción media. 
Estos aminoácidos son asimilados durante todo el proceso de 
fermentación. 
• Grupo C: Se conocen como aminoácidos de absorción lenta, y solo son 
utilizados cuando los aminoácidos del grupo A se han agotado. La 
glicina, fenilalanina, tirosina, triptófano y alanina son los miembros de 
este grupo. 
• Grupo D: El único aminoácido de este grupo es la prolina, este 
aminoácido es de baja o nula absorción ya que las levaduras cerveceras 
son capaces de sintetizarlo a partir de glutamato. Sin embargo, la prolina 
es el aminoácido más abundante en el mosto cervecero, debido a que 
las hordeínas presentan dominios ricos en prolina, que derivado de la 
proteólisis, son liberados hacia el medio. 
Por tanto, dependiendo de la actividad proteolítica se obtendrán patrones característicos 
de liberación de aminoácidos por variedad de cebada. Conocer este patrón de liberación 
resulta una herramienta poderosa para conocer los rendimientosde liberación de 
aminoácidos e inferir si la variedad elegida para la elaboración de cerveza será eficiente 
para el proceso o no. Incluso, conociendo el patrón se podrían probar condiciones 
específicas del macerado, con el fin de favorecer la liberación de aminoácidos de cierto 
grupo sobre otro, y hacer de esta manera más eficiente la fermentación. 
Actualmente, la industria cervecera en México experimenta problemas durante el 
proceso de elaboración de cerveza, debido a la nula información en cuanto a las 
actividades hidrolíticas de las variedades mexicanas. Estos problemas técnicos se 
traducen en el taponamiento de los filtros debido a una baja actividad proteolítica durante 
53 
 
el macerado, provocando que existan altas concentraciones de proteína soluble en el 
mosto, que por acción de las temperaturas alcanzadas durante el macerado y la 
pasteurización, forman agregados proteicos insolubles que repercuten en la filtración del 
mosto. Otro problema que se presenta, son las bajas actividades proteolíticas por parte 
de las variedades mexicanas durante el macerado, llevando al uso de proteasas 
comerciales, que son adicionadas durante el macerado para aumentar la tasa de 
proteólisis. A pesar de que actualmente la industria cervecera cuenta con distintas 
pruebas de plataforma para estimar el contenido de nitrógeno total en los mostos, no 
existe registro hasta la fecha de alguna caracterización bioquímica de las variedades 
mexicanas para conocer de manera más acertada las actividades proteolíticas que 
presentan. 
3 JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO 
Durante la germinación de las semillas, distintos biopolímeros, incluido las proteínas de 
reserva, pueden ser hidrolizado para proveer una fuente de nitrógeno al embrión y por 
ende se promueva el desarrollo y crecimiento de la plántula (Jones, 2005). Este proceso 
bioquímico es de particular importancia en la cebada, ya que sienta las bases del proceso 
de malteo y elaboración de la cerveza. 
Como se ha mencionado, la hidrolisis de hordeínas es de suma importancia para la 
elaboración de cerveza, ya que la presencia de proteína parcialmente hidrolizada en 
mostos cerveceros impacta de manera negativa en el proceso de filtrado y clarificación 
del mismo, ya que, por acción de las altas temperaturas alcanzadas durante el proceso 
de fabricación de cerveza, la proteína parcialmente hidrolizada forma agregados que 
dificultan la clarificación y filtración del mosto, además, esto trae como consecuencia la 
obtención de mostos bajos en aminoácidos que son poco fermentables (Hornsey, 1999). 
Si bien la baja actividad proteolítica tiene desventajas claras para el proceso, una 
excesiva proteólisis trae consigo problemas como, la obtención de cervezas con baja 
capacidad de espumado (indicador de calidad en cervezas). Por tanto, la proteólisis tiene 
que ser balanceada para evitar características indeseables tanto en el mosto como en la 
cerveza. 
54 
 
Debido a que cada variedad de cebada cervecera es diferente debido a las condiciones 
de cultivo utilizadas, se espera que haya disparidades en el contenido y tipo de 
proteasas, obteniéndose así, perfiles de proteasas y actividades proteolíticas que pueden 
ser comparables. 
La variedad Metcalfe de origen canadiense es ampliamente utilizada a nivel mundial para 
la elaboración de cerveza, es de espiga conformada en 2 hileras y cultivo anual (verano). 
Presenta un alto rendimiento en el contenido de proteínas y almidón (Legge, 2002) y 
recientemente se han estudiado tanto su actividad proteolítica como la proteomica 
derivada de ella (Jin et al., 2013). 
En el caso de las variedades mexicanas HV-19 y HV-11, ambas son de 6 hileras pero 
tienen condiciones de cultivo diferentes, la variedad HV-19 se cultiva en la zona del Bajío 
de la República Mexicana (Guanajuato, Guadalajara, Querétaro y Michoacán) en 
condiciones de riego, mientras que, la variedad HV-11 es sembrada y cultivada en la 
región del Antiplano mexicano (Hidalgo, Puebla, Tlaxcala) bajo condiciones de temporal 
(Fernández-Vera, 2013). 
Por estas razones, resulta de suma importancia contar con una caracterización 
bioquímica de las actividades proteolíticas de las cebadas mexicanas y así poder 
optimizar procesos de malteo y producción de cerveza en México. 
 
4 HIPÓTESIS 
 
Considerando que el perfil de proteasas de la variedad Metcalfe la hace la malta más 
utilizada para la fabricación de cerveza, aquellas variedades que tengan el perfil 
proteolítico similar a Metcalfe, serán las más adecuadas para dicho proceso. 
 
5 OBJETIVO GENERAL 
 
Evaluar actividades proteolíticas en la malta y macerado, así como el perfil de 
aminoácidos derivado de la proteólisis en diferentes variedades de cebada mexicanas. 
55 
 
 
 
5.1 OBJETIVOS PARTICULARES 
 
▪ Medir la actividad proteolítica en diferentes variedades de cebada, malta verde, 
malta seca. 
 
 
▪ Realizar el macerado de malta seca. 
 
 
▪ Identificar y medir las actividades proteolíticas termoresistentes en diferentes 
etapas del macerado. 
 
▪ Determinar el perfil de aminoácidos que se obtiene al final del macerado. 
 
56 
 
6 MATERIALES Y MÉTODOS 
 
6.1 Material biológico 
 
Las variedades de semilla seca y malta verde fueron proporcionadas por la empresa 
Impulsora Agrícola S.A. de C.V., de Cortázar, Guanajuato, México. Para la medición y 
comparación de las actividades proteolíticas, se utilizaron tres variedades de cebada, 
una de ellas de origen canadiense llamada Metcalfe y las dos restantes de origen 
mexicano llamadas HV-19 y HV-11. Todas las muestras de malta verde fueron 
almacenadas a -70 °C con el fin de preservarlas hasta su uso. Cabe destacar que la 
empresa no proporcionó información acerca del proceso de malteo que empleó para la 
obtención de la malta verde. 
6.2 Obtención del extracto crudo de semilla y malta verde 
 
Los experimentos para la medición de la actividad proteolítica fueron realizados 
utilizando extractos crudos no fraccionados de semilla (grano de cebada sin maltear) y 
malta verde siguiendo un protocolo modificado de Jones, 1995. La semilla y malta verde 
se molieron en nitrógeno líquido y se pesaron 0.5 g de harina de cada uno que fueron 
transferidos a un mortero. A continuación se adicionó 1.0 mL de solución amortiguadora 
de extracción frío el cual consistía en una solución de fosfatos 50 mM pH 6.0, 1 % Tritón 
X-100, 50 mM NaCl, 5 mM DTT y se homogenizó en mortero aproximadamente durante 
2 minutos. Los extractos fueron colocados en tubos Eppendorf con capacidad de 2.0 mL 
y centrifugados a 15,000 xg, a 4 °C durante 10 minutos. Se recuperaron los 
sobrenadantes, a los cuales se le retiraron la capa superior de lípidos con un hisopo. Los 
extractos libres de lípidos se transfirieron a tubos Eppendorf para una segunda 
centrifugación bajo las condiciones previamente descritas, recuperando los 
sobrenadantes (̴ 600 μL). Dichos extractos se mantuvieron en congelación a -20°C hasta 
su utilización. 
 
 
57 
 
6.3 Cuantificación de proteína total en los extractos de semilla, malta verde y 
macerado por el método de Bradford 
 
El contenido de proteína total en los extractos de semilla, malta verde y macerado fue 
medido utilizando el protocolo adaptado de Bradford, 1976 (Apéndice A) para leer en 
micro placas ELISA. Se utilizó una curva estándar con concentraciones conocidas de 
BSA 1 μg/ μL. 
A partir de una solución de colorante Bradford 5X (Sigma-Aldrich, USA) se preparó otra 
solución de colorante a un concentración final 1X (v/v) diluida con agua desionizada. 
Posteriormente se añadieron 150 μL de Bradford 1X en cada pozo de la micro placa 
ELISA. Por separado, se preparó una solución stock de BSA 1 μg/ μL y se mezclaron 
volúmenes crecientes (2, 4, 6, 8 y 10 μL) del stock con el colorante contenido en la micro 
placa ELISA para construir la curva de calibración. A su vez se pusieron en contacto 2 
μL de cada uno de los extractosde semilla, malta verde y macerado con la micro placa 
ELISA. Finalmente la micro placa fue agitada por 30 segundos en IKA® MS 3 digital vortex 
y leída a 595 nm en el equipo EPOCH™ Microplate Spectrophotometer (Biotek®, 
USA). Los resultados de absorbancia UV fueron utilizados para estimar la concentración 
en μg/ μL de cada uno de los extractos. 
 
6.3 Ensayo de actividad proteolítica utilizando azocaseína como sustrato 
 
El método elegido para la cuantificación de la actividad proteolítica de los extractos de 
semilla, malta verde y macerado es el ensayo con azocaseína (Jones, 1995) modificado 
(Apéndice A), ya que representa un método rápido y confiable produciendo un 
componente colorido (derivado de la proteólisis) detectable a 440 nm. 
La azocaseína consiste en conjugar la caseína (proteína de la leche) con un colorante 
azoico mediante una reacción química. Los cortes proteolíticos de la azocaseína, traen 
como resultado la liberación del colorante azoico al medio, cambiándolo de color (tonos 
de color amarillo). La cantidad de colorante liberado es directamente proporcional a la 
cantidad de actividad proteolítica del extracto a estudiar y puede ser medida 
58 
 
espectrofotométricamente a una longitud de onda de 440 nm (Bell, 2012), por tanto se 
vuelve un ensayo cuantitativo. 
El ensayo consistió en la preparación de una solución de azocaseína 1% (p/v) 
(Megazyme, Ireland) en solución amortiguadora de fosfatos 50 mM pH 6.0 (para todas 
las enzimas a caracterizar) la cual se mantuvo a 37 °C durante todo el ensayo. 
Por separado y a partir de la cuantificación proteica de los extractos, se prepararon tubos 
que contenían aproximadamente 50 μg de proteína total y se llevaron a un volumen final 
de 50 μL. Dichos tubos fueron pre incubados a 37 °C durante 3 minutos con el fin de 
activar las proteasas de los extractos. Terminado el tiempo de pre incubación se 
adicionaron 50 μL de azocaseína 1% pH 6.0 y se mantuvo la reacción a 37 °C durante 
10 minutos. Pasado el tiempo de reacción, a cada tubo se le añadieron 20 μL de una 
solución de ácido tricloroacético (TCA) al 20% en agua (v/v) para detener la reacción y 
fueron centrifugados a 16,000 xg durante 10 minutos. El sobrenadante resultante, fue 
recuperado (~100 μL) y mezclado con 20 μL de NaOH 2 N (p/v) con vortex. Por último, 
la mezcla fue colocada en micro placas ELISA y leídas a 440 nm en el equipo EPOCH™ 
Microplate Spectrophotometer. 
La actividad proteolítica fue expresada como mUa 440 nm/μg proteína (mili unidades de 
absorbancia 440 nm / microgramos de proteína total). 
 
6.4 Ensayos de inhibición específica de la actividad proteolítica de extractos del 
macerado 
 
Para identificar el perfil de proteasas en extractos crudos de diferentes puntos del 
macerado, se hizo uso de inhibidores específicos de la actividad proteolítica (Tabla 2): 
E-64 (inhibidor irreversible de proteasas de cisteína), PMSF (inhibidor reversible de 
proteasas de serina y algunas proteasas de cisteína), AEBSF (inhibidor irreversible de 
proteasas de serina, soluble en agua), EDTA (agente quelante, inhibidor de metalo 
proteasas). 
 
59 
 
Tabla 2. Inhibidores específicos por tipo de proteasa 
Inhibidor Tipo de proteasas Disolvente 
Concentración 
final* 
E-64 Cisteína Agua desionizada 10 μM 
PMSF Serina Etanol 5 mM 
AEBSF Serina Agua desionizada 8 mM 
EDTA Metalo Agua desionizada 10 mM 
*Es la concentración utilizada en la reacción de actividad proteolítica 
 
Los experimentos de inhibición proteolítica especifica fueron realizados de acuerdo al 
protocolo previamente descrito en el apartado anterior (sección 6.3), tomando en cuenta 
la concentración efectiva de trabajo de cada inhibidor específico (Tabla 2) y restando el 
volumen a la solución amortiguadora de fosfatos 50 mM pH 6.0 para asegurar un 
volumen final de 50 μL. Cabe destacar, que previo a la adición del sustrato hidrolizable 
(azocaseína), el tubo de reacción con extracto crudo e inhibidores específicos, fue pre 
incubado a 37 °C por 15 minutos para asegurar la inhibición completa de las proteasas 
de los extractos del macerado. 
 
6.5 Medición de los niveles de actividad de proteasas estándar y su inhibición 
 
Con el objeto de generar los controles adecuados para validar los ensayos de actividad 
proteolítica, así como la inhibición de la misma, se utilizaron proteasas estándar 
representativas de cada clase de proteasa que se han descrito en malta verde (Jones, 
2005). Estas fueron; Papaína (proteasa dependiente de cisteína), Subtilisina (proteasa 
de serina), Termolisina (proteasa dependiente de Zn2+, metaloproteasa) y Renina 
(dependiente de ácido aspártico). Todos los concentrados fueron preparados a 10 mU/ 
μL (excepto para la renina, que fue de 10 U/ μL), en solución amortiguadora de fosfatos 
pH 6.0 y glicerol 10% como crioprotector. Todos los concentrados fueron almacenados 
a -20 °C hasta su uso. 
60 
 
Tanto los ensayos de actividad como de inhibición fueron realizados bajo las condiciones 
previamente descritas (secciones 6.3 y 6.4). 
 
6.6 Secado de la malta y determinación de humedad total 
 
El secado es la etapa final del proceso de malteo, donde los germinados (malta verde) 
son calentados bajo condiciones controladas. La etapa de calentamiento mata al embrión 
y detiene la germinación (Boulton, 2013). Tiene como objetivo lograr un producto estable 
y almacenable, con el suficiente contenido enzimático además de conservar las 
propiedades y color de la malta (Lewis y Young, 2001). La malta verde es sometida al 
secado para facilitar su molienda y, por ende, aumentar el rendimiento de extracto. Los 
niveles de humedad total en malta seca están entre el 3-5% (Michael, 2009). 
La determinación de humedad total en la malta se realizó por el método de peso 
constante. Se pesaron 10 g de malta verde por variedad, en charolas de aluminio a peso 
constante. Posteriormente, las charolas se colocaron en un horno de convección 
Imperial III® a 50 °C y se fue registrando el peso en intervalos de 4 horas hasta que el 
peso de la malta no cambió. Una vez que la malta llegó a peso constante (indicando que 
toda el agua libre es evaporada), se utilizó la fórmula 1 para calcular el porcentaje de 
humedad total por cada variedad de malta. Utilizando el mismo método, se calculó el 
tiempo de secado en el cual la malta quedaría entre el 3-5% de humedad total. 
 
%𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 − 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
 𝑥 100 
Fórmula 1. Ecuación para el cálculo de porcentaje de humedad total por el método de peso constante. 
 
6.7 Macerado de la malta 
 
Se estableció un protocolo de micro macerado tipo infusión modificado de Nachel 2012 
y Michael 2009. La malta seca se hizo pasar por un molino de rodillos para obtener la 
61 
 
molienda, de la cual se pesó la cantidad suficiente para mezclarla con agua desionizada 
y formar el mosto inicial al 20% (p/v). 
Figura 13. Programa de macerado tipo infusión. 
 
La figura 13 muestra un programa de macerado tipo infusión, en el cual la mezcla malta 
molida-agua se calienta y mantiene a diferentes temperaturas para formar el mosto 
cervecero. Es de importancia mencionar, que las etapas de mantenimiento de 
temperatura pueden variar de acuerdo al tipo de mosto a obtener. 
Con el fin de estandarizar el micro macerado, se estableció que el mosto sería llevado a 
las temperaturas indicadas en la figura 13, pero manteniendo cada etapa de 
calentamiento durante 10 minutos. La toma de muestra se realizó de la siguiente manera; 
llegando a cualquier punto de calentamiento, se tomó 1.0 mL de mosto al cual se le midió 
el pH y se centrifugó a 16,000 xg durante 10 minutos. Se recuperó el sobrenadante 
(extracto de macerado) y se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf el cual fue almacenado 
en congelación a -20 °C hasta su uso. 
Las muestras se identificaron con la clave X °C I ó F donde;X °C significa el punto de 
calentamiento en el cual se tomó muestra del mosto, y el sufijo I ó F se refiere al inicio o 
final de la etapa de calentamiento. 
62 
 
 
6.8 Estandarización de la técnica para la determinación del perfil aminoacídico 
durante el macerado de la malta 
 
Las levaduras utilizadas para la elaboración de cerveza necesitan fuentes asimilables de 
carbono, nitrógeno, algunas vitaminas y pequeñas cantidades de oxígeno esenciales 
para la biosíntesis celular y el mantenimiento del estado metabólico (Lewis y Young, 
2001). 
El mosto provee a la levaduras de fuentes de nitrógeno asimilable en forma de 
aminoácidos y péptidos de bajo peso molecular (Michael 2009), producto de la hidrolisis 
de proteínas (mayoritariamente hordeínas). De este modo, se generan perfiles de 
aminoácidos que pueden ser comparables entre variedades y que dependerán del tipo 
de proteasas que estén contenidas dentro de cada variedad de malta. Por esta razón, 
resulta relevante el estudio de los aminoácidos generados al final del macerado, ya que 
estos impactarán en la fermentación y la producción de metabolitos secundarios durante 
la misma. Estos metabolitos tienen injerencia en el sabor y en el aroma del producto final. 
 
6.8.1 Cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas (UPLC/MS) 
 
Para la detección de biomoléculas, la técnica espectrometría de masas acoplada a la 
cromatografía líquida (UPLC/MS) es la más utilizada por las diversas ventajas que 
ofrece, entre las que destacan, mayor sensibilidad y precisión, una preparación más 
simplificada de la muestra y también la poca cantidad de muestra a utilizar. 
Para este tipo de análisis se requiere una previa separación de las moléculas a estudiar 
por medio de técnicas de cromatografía líquida de alta presión (UPLC). Posteriormente, 
los analitos fluyen hacia el espectrómetro de masas para ser identificados. 
La espectrometría de masas se basa en la obtención de iones a partir de moléculas 
orgánicas en fase gaseosa, los cuales se hacen pasar por un acelerador de partículas 
63 
 
que las separa de acuerdo a su relación masa/carga, donde finalmente serán detectadas 
mediante un dispositivo adecuado. 
Al ser la espectrometría de masas una técnica basada en procesos químicos, la 
presencia y abundancia en el espectro de determinados tipos de iones, identificables a 
partir de su masa, será función de la estructura química de cada compuesto, 
produciéndose una especie de “huella química” característica de cada analito a detectar. 
De esta manera, la técnica UPLC/MS ofrece ventajas en el análisis, como la posibilidad 
de detectar la presencia del analito en bajas concentraciones (alta sensibilidad) y la 
rapidez con la que se obtienen los resultados del análisis. Es importante mencionar que 
para la realización de este tipo de experimentos, se debe contar con analitos estándar 
de concentración conocida, con el fin de poder compararlos con los analitos encontrados 
en la muestra problema. 
6.8.3 Derivatización y análisis de estándares de aminoácidos. 
 
Para el análisis de aminoácidos se requiere una derivatización pre columna con el fin de 
poder separarlos e identificarlos. La derivatización consiste en una reacción química de 
conjugación entre un grupo funcional (en el caso de los aminoácidos, es el grupo amino 
NH3+) con un reactivo químico, que dará como resultado un derivado del producto original 
con estructura química similar. Las reacciones de derivatización proveen al analito de 
una “etiqueta química” que puede ser utilizada para facilitar su separación y posterior 
cuantificación. 
Se llevó a cabo la reacción de derivatización con el reactivo de Marfey´s de acuerdo al 
protocolo tomado de Ayers et al. (2012). Éste consistió en la conjugación del grupo 
amino y el grupo nitro del reactivo de Marfey´s (Figura 14) bajo condiciones alcalinas a 
40 °C para formar el aminoácido derivatizado correspondiente. El producto fue secado y 
el cristal formado se resuspendió en metanol (MetOH). La detección se hizo a 340 nm. 
64 
 
 
Figura 14. Reacción de derivatización entre un aminoácido y el reactivo de 
Marfey´s. La reacción se lleva a cabo bajo condiciones alcalinas a 40 °C por 
60 minutos en agitación, al final se obtiene una mezcla racémica. 
 
Se pesaron en un vial 0.2 mg de cada aminoácido estándar y se disolvieron en 50 μL de 
agua grado LC/MS más 10 μL de NaHCO3 1M y 100 μL del reactivo de Marfey´s 1%. La 
mezcla se incubó en agitación a 40 °C por 1 hora. Terminada la incubación, a cada 
reacción de derivatización se le adicionaron 10 μL de HCl 2 N. El producto fue llevado a 
deshidratación total. 
El aminoácido derivatizado se resuspendió en 1.7 ml de MetOH y se inyectó en el equipo 
UPLC/MS para su análisis. En un principio se inyectó cada aminoácido estándar de 
manera individual y posteriormente la mezcla de 19 aminoácidos derivatizados. Esto para 
determinar los tiempos de retención de cada uno de ellos, tanto en solitario como la 
mezcla de los mismos y poder compararlos con los aminoácidos presentes en los mostos 
producidos por cada variedad. 
 
 
 
 
65 
 
6.8.4 Separación y análisis en UPLC/MS de estándares de aminoácidos. 
 
La separación de los aminoácidos derivatizados se realizó en el sistema UPLC Waters 
Acquity® acoplado al espectrómetro de masas Thermo LTQ Orbitrap XL y con la 
columna de fase reversa Sinergy Fusion-RP™ C-18 de la marca Phenomenex® (4 μM; 
250 X 21.2 mm). Las condiciones de trabajo fueron establecidas bajo un flujo de 2 mL/min 
de Acetonitrilo/Agua (80:20) con un volumen de inyección por cada muestra de 2 μL y 
monitoreado a 340 nm. 
El método de ionización utilizado fue ESI (Electrospray Ionization) y el análisis de los 
datos obtenidos se hizo con el software Empower™ (Waters, Corp., Milford MA, USA). 
El método ESI consiste en hacer pasar la muestra líquida a través de un capilar al cual 
se le aplica un potencial de 3-4 kV, el líquido comienza a salir del capilar, incrementando 
su carga hasta llegar a un punto crítico donde se pierde la capacidad de retener más 
carga y la muestra finalmente se dispersa en forma de niebla de pequeñas gotas 
altamente cargadas (iones), ya sea de manera positiva o negativa. Por tanto, los 
espectros obtenidos mediante ESI presentan dos canales de ionización (el positivo y 
negativo) donde, el ion molecular presenta la forma “PM (peso molecular) + 1” debido a 
la ganancia de un partícula de carga para el ion positivo y “PM – 1” por la pérdida de una 
partícula de carga en el caso del ion negativo. De esta forma, se facilita la búsqueda del 
ion molecular en ambos canales de ionización, los cuales deben empatar en las 
coordenadas “% vs m/z” dando certeza y exactitud al resultado. 
En un principio se inyectó cada aminoácido estándar de manera individual y 
posteriormente la mezcla de 19 aminoácidos derivatizados. 
 
6.8.5 Derivatización y análisis de aminoácidos en muestras del macerado 
 
Debido a la gran cantidad de carbohidratos solubles que son liberados durante el 
macerado de la malta y que afectan la medición de los aminoácidos libres, fue necesario 
un paso adicional de purificación previo a la derivatización con el reactivo Marfey´s (Nɑ-
66 
 
[2,4-Dinitro-5-Fluorofenil)-L-alaninamida). Para esto, se generó un protocolo de 
purificación de aminoácidos (Apéndice A), modificado Ayers et al. (2012). 
En primer lugar, se precipitó la proteína soluble con una solución de TCA 10%/Acetona 
(V/V) en proporción 4:1, seguida de una centrifugación a 15,000 xg por 10 minutos. Se 
recuperó el sobrenadante y se llevó a sequedad. El producto seco se resuspendió en 1 
mL de HCl 1M pH 1.0 y se incubó por una hora con la resina de intercambio catiónico 
DOWEX® 50 WX8 H+ previamente empacada en columna, pasado el tiempo de 
incubación se aplicaron a la columna 30 VC (volúmenes cama) de ácido fórmico 0.001% 
para eluir carbohidratos, por último,