Caracterizacion-de-la-esterasa-de-Aspergillus-nidulans-PW1

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
“CARACTERIZACIÓN DE LA ESTERASA DE 
Aspergillus nidulans PW1” 
 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
Q U Í M I C A DE A L I M E N T O S 
P R E S E N T A : 
BALLESTEROS RAMÍREZ 
NORMA ELIZABETH 
 
 
 MÉXICO, D. F. 2006 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
JURADO ASIGNADO 
 
Presidente: Prof. MARÍA DEL CARMEN WACHER RODARTE. 
Vocal: Prof. AMELIA MARÍA DE GUADALUPE FARRÉS GONZÁLEZ SARAVIA. 
Secretario: Prof. RUTH MARTÍN FUENTES. 
1er Suplente: Prof. FRANCISCO RUIZ TERÁN. 
2do Suplente: Prof. MARICARMEN QUIRASCO BARUCH. 
 
 
El trabajo se desarrolló en el: 
 
DEPARTAMENTO DE ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA 
LAB 312 CONJUNTO “E” FACULTAD DE QUÍMICA. 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
 
 
 
 
 
ASESOR. 
 
 
Dra. AMELIA MARÍA DE GUADALUPE FARRÉS GONZÁLEZ-SARAVIA. 
 
SUSTENTANTE. 
 
 
NORMA ELIZABETH BALLESTEROS RAMÍREZ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Este trabajo se realizó formando parte del Sub-Programa 127 
“Formación Básica en Investigación”
AGRADECIMIENTOS 
Agradezco a la Universidad Nacional Autónoma de México, por ser la Máxima 
Casa de Estudios del País, y además de ser la forjadora de muchos profesionistas a 
los cuales con este trabajo me incluyo. 
 
Mi gran gratitud y admiración para la Facultad de Química, ya que me ha dado 
la satisfacción más grande de mi vida, y se que con las herramientas que aprendí 
aquí podré consolidarme en el ámbito profesional. 
 
Deseo agradecer a las siguientes personas por las facilidades prestadas para la 
elaboración de este trabajo: 
 
Dra. Amelia Farrés González Saravia, Dra. Carmen Wacher Rodarte y QFB 
Ruth Martín Fuentes, por sus acertados comentarios en la escritura de esta tesis. 
 
M. en C. Carolina Peña Montes y M. en C. Dense Castro Ochoa, por su gran 
asesoría técnica durante todo el trabajo experimental. 
 
M. en C. Sandra Pérez Murguía, por su asesoría en la elaboración de geles de 
electroforesis y técnicas para evaluación de actividad proteolítica. 
 
Dr. José Luis Nava, gracias por hacer posible el préstamo del pH-stat. 
DEDICATORIAS 
A DIOS: Por que a pesar de no ser una persona no muy dedicada ha este tipo 
de situaciones, se que el está siempre conmigo y también está dentro de mi corazón, 
gracias por el simple hecho de permitirme vivir cada día. 
A mi MAMITA: Infinita mi gratitud, ya que muy a pesar de ser mi mamá se 
también que tengo una amiga y espero que el tiempo me alcance para poder 
disfrutar de este logro que hemos hecho juntas; además le agradezco por haberme 
dado la vida, por estar siempre a mi lado y por todos los consejos e impulsos. 
GRACIAS. 
A Lucía: Sabes que has sido mi más grande apoyo durante casi toda mi vida 
escolar, debo agradecer que fueras la persona por la que yo conociera la UNAM, 
también se que en ocasiones te desespero, y a pesar ello creo que hemos tenido 
grandes momentos y hemos disfrutado juntas de grandes cosas, espero y cuando 
seamos más grandes esta relación continúe ya que siempre serás mi única Hermana. 
A Omar: Gracias por ser mi compañero de juegos y sobre todo por 
aguantarme. Gracias por todo el apoyo recibido para el término de este ciclo, sin tu 
asesoría en computación la tesis no hubiera quedado así. 
A César: El hermano mayor, el ejemplo a seguir. A pesar de ser mi hermano 
mayor, se que tú y yo tenemos cosas en común, mi gran reconocimiento por el papel 
que desempeñaste durante un buen tiempo y gracias por el apoyo que recibí. A 
también te doy las gracias por hacerme tía por primera vez (espero y me des la 
oportunidad de disfrutar a Diego). 
A mi Abuelita Pachita: GRACIAS por ser como una madre. Sabe de antemano 
que siempre estaremos agradecidos con usted por todo el apoyo recibido casi 
durante toda la existencia de mi Familia y tenga presente que en el momento en el 
que necesite de mí ahí estaré para ayudarla. 
DEDICATORIAS 
A la Familia Ramírez: Quiero agradecerles, ya que con su apoyo permitieron 
que mi familia fuera así de fuerte y sólida. Cada uno de ustedes forma parte 
importante de este logro. Gracias a todos mis Tíos y sus respectivas familias. 
A la Dra. Amelia Farrés: Por su excelente dirección, consejos, amistad, por 
ser un ejemplo a seguir, sobre todo por la confianza y el apoyo brindado. MIL 
GRACIAS: 
A Carolina y Denise: Les agradezco su enorme paciencia y dedicación, ya que 
sin ustedes este trabajo no hubiera sido el mismo Gracias por ser más que una guía. 
Para ambas una gran admiración por saber combinar familia y estudio. Gracias por 
hacerme partícipe de una parte importante de su vida, la gran fortuna de 
convertirse en Mamá. También quiero que sepan que son uno de mis ejemplos a 
seguir y les agradezco por impulsarme a continuar mi desarrollo intelectual. 
A mis primeros Grandes Amigos: Con ustedes viví grandes momentos y creo 
que el conocerlos fue una gran experiencia, ya que todos crecimos a la par y hemos 
compartido momentos inolvidables, saben que siempre serán Mis Amigos: Con 
enorme gratitud para Gisela, Jacqueline y Bernardo. Nunca se olviden de mí. 
A mis Amigos de la Carrera: Por tantos momentos compartidos, por su 
sinceridad y apoyo en las buenas como en las malas, espero y que la amistad que 
hicimos perdure, Gracias a todos: Carol, Chivis, Gaby Pineola, Grissel, Maribel, 
Evelin, Melissa, Paty, Cyntia, Anita, Pepe, Reyes, Rodrigo, Victor, Sito, George, 
Héctor, Gato, Alberto, Christian, entre muchos otros. 
A mis Compañeros del Lab. 312: Por sus consejos, amistad y ayuda recibida: 
Caro, Denise, Vane, Katia, Aideé, Ángeles Beleguixaiba, Marisol, Israel, Ivón, 
Amandita, Bere, Abraham, Verito, Idalia, Gaby, Carmen, Nayeli, Paloma, y todos los 
que estuvieron en turno. 
DEDICATORIAS 
A la Familia Ballesteros: A pesar de que no hemos pasado mucho tiempo 
juntos Gracias por compartir este logro y de algunos momentos felices espero y no 
pierdan nuestra pista. 
A mi Padre: Sabes que tú regreso fue en un momento en el cual nadie estaba 
preparado, y suelo confesarte que yo nunca imagine estar en una situación similar, 
pero creo que la decisión que tomaste fue la más correcta y que a pesar de las 
circunstancias tú siempre serás mi Padre, solo te pido que aguardes un tiempo en el 
que yo pueda ordenar mi mente y ten por seguro que ganaras mi confianza. 
A mi FAMILIA: Mil gracias por todo el apoyo recibido. 
 
USTEDES SON MI FAMILIA 
Que fuerte es decir adiós, cuando no deseas hacerlo. 
Se que la separación es corta. 
Pero igual siento una tristeza, que no puedo controlar. 
Y me repito a cada instante, que cada segundo que pasa. 
Está más cerca el volver a estar junto a ustedes. 
Pues hoy comprendo más que nunca. 
Que sin ustedes no soy nada. 
Pues mi pasado fue junto a ustedes. 
Mi presente por ustedes. 
Y mi futuro serán ustedes. 
Todo lo que fui, soy y será. 
Es gracias a ustedes. 
Mi mayor tesoro son ustedes. 
Gracias a Dios por tenerlos. 
Pues ustedes son mi FAMILIA. 
CONTENIDO 
1. INTRODUCCIÓN.........................................................................................1 
2. OBJETIVOS................................................................................................ 3 
3. ANTECEDENTES....................................................................................... 4 
3.1 Enzimas en estudio............................................................................... 4 
3.1.1 Lipasas.......................................................................................... 4 
3.1.2 Esterasas...................................................................................... 5 
3.1.3 Proteasas...................................................................................... 5 
3.1.4 Diferencias en los mecanismos de acción de las lipasas, 
esterasas y proteasas................................................................ 8 
3.2 El género Aspergillus............................................................................. 10 
3.2.1 Características del género............................................................. 10 
3.2.2 Clasificación e importancia económica.......................................... 11 
3.2.3 Importancia del género Aspergillus como modelo de estudio....... 12 
3.3 Aspergillus nidulans............................................................................... 13 
3.3.1 Ventajas de Aspergillus nidulans como modelo de 
 experimentación........................................................................... 14 
3.4 Planteamiento del Problema y estrategia de trabajo............................. 14 
4. MATERIAL................................................................................................... 15 
5. METODOLOGÍA........................................................................................... 17 
5.1 Microorganismo empleado y su conservación....................................... 17 
5.2 Reactivación del microorganismo........................................................... 17 
5.3 Producción de la enzima........................................................................ 19 
5.3.1 Condiciones para producción de actividad lipolítica...................... 19 
5.3.1.1 Concentración de la enzima para evaluar actividad lipolítica 
o esterasa.......................................................................................... 20 
5.3.1.2 Condiciones de producción de actividad proteolítica............. 21 
5.4 Caracterización de la enzima evaluando sustratos de diferente 
 naturaleza............................................................................................... 22 
5.4.1 Determinación de actividad lipasa................................................. 23 
5.4.1.1 Determinación de especificidad por el sustrato..................... 23 
5.4.1.2 Determinación de temperatura y pH óptimos para 
 el ensayo................................................................................ 24 
5.4.1.3 Determinación de estabilidad frente a la temperatura 
 y al pH.................................................................................... 24 
5.4.2 Determinación de actividad esterasa............................................. 25 
5.4.2.1 Método espectrofotométrico.................................................. 25 
5.4.2.2 Zimogramas........................................................................... 25 
5.4.3 Determinación de actividad proteasa............................................. 26 
5.4.3.1 Evaluación cualitativa............................................................ 26 
5.4.3.2 Métodos espectrofotométricos............................................... 26 
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN..................................................................... 29 
6.1 Determinación de actividad lipasa.......................................................... 29 
6.1.1 Efecto de la temperatura................................................................ 29 
6.1.2 Efecto del pH.................................................................................. 31 
6.2 Determinación de actividad esterasa..................................................... 34 
6.3 Actividad proteasa en condiciones de cultivo reportadas para la 
 producción de la proteasa y/o esterasa.................................................. 35 
6.4 Identificación de bandas de proteína con actividad proteolítica............. 47 
7. CONCLUSIONES......................................................................................... 50 
8. APÉNDICE................................................................................................... 52 
A) Curva patrón para cuantificación de proteína.......................................... 52 
B) Estandarización de la metodología de cuantificación de actividad 
 lipasa en pH-stat...................................................................................... 53 
C) Estandarización de la metodología de cuantificación de actividad 
 esterasa método espectrofotométrico..................................................... 54 
D) Estandarización de la metodología de cuantificación de actividad 
 proteasa método espectrofotométrico..................................................... 55 
9. BIBLIOGRAFÍA............................................................................................ 56 
 
INTRODUCCIÓN 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 1 
1. INTRODUCCIÓN: 
Aspergillus nidulans es un hongo filamentoso ampliamente estudiado, 
particularmente como modelo para estudios genéticos. No obstante, existen pocos 
reportes sobre la regulación o asimilación de lípidos en este microorganismo. Uno de 
los primeros trabajos, realizados en este grupo de investigación, permitió identificar la 
capacidad de asimilación de lípidos y el efecto de fuentes de carbono fácilmente 
asimilables sobre el proceso (Kawasaki et al., 1995). Se detectaron halos de lisis en 
cajas Petri creciendo diferentes cepas en un medio mínimo conteniendo tributirina y 
glucosa como fuentes de carbono y se demostró que el aceite de olivo fungía como 
inductor, comportamiento que correspondería al de una enzima lipolítica cuyo papel 
metabólico fuese la asimilación de lípidos. No obstante, aunque se ensayaron diversas 
metodologías para la determinación de actividad lipasa, la única forma de evaluarla fue 
el empleo de o-nitrofenil laurato como sustrato en métodos espectrofotométricos, lo que 
indicaría que se trata más de una esterasa que de una lipasa. 
Peña (2001) realizó la purificación y caracterización de esta enzima. La producción 
se realizó en un medio optimizado con 0.5% de aceite de olivo como inductor. La 
enzima fue purificada a homogeneidad. Se determinó actividad lipolítica “in situ” en 
geles-SDS tanto el extracto crudo como a la enzima pura, observándose solo una 
banda con actividad de lipasa en ambos casos. La enzima purificada presentó un peso 
molecular aproximado de 37 kDa y pI de 4.7, así como pH óptimo de 8.5 a 40°C. Se 
determinó que la enzima conserva el 80% e su actividad después de incubada durante 
30 minutos en un rango de temperatura de 30 a 70°C, propiedad que podría ser 
interesante para una enzima a emplearse en bioreactores industriales. 
INTRODUCCIÓN 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 2 
Al determinar la especificidad por el sustrato se observó que la enzima tiene una 
mayor preferencia por sustratos de cadena corta, y muestra su máxima actividad con 
tributirina y p-nitrofenil butirato, lo que reforzaría la idea de que se trata de una esterasa, 
más que de una lipasa. 
Para identificar de manera específica el gen que codifica para la enzima, 
considerando que se acababa de publicar el genoma de A. nidulans, se decidió obtener 
la secuencia de la proteína. Ésta se digirió con tripsina y se obtuvo el patrón de masas 
de los péptidos. Después de secuenciar el extremo amino terminal de uno de los 
péptidos y comparar con las reportadas en las bases de datos, se encontró que lasecuencia correspondía a una proteasa alcalina hipotética de Aspergillus nidulans, 
producto del gene prtA (Katz, 1994; Peña 2001; Castro, 2005). Analizando estos 
resultados era importante definir si la enzima realizaba las actividades de lipasa, 
esterasa y proteasa. 
El presente proyecto tiene como objeto contribuir a la caracterización bioquímica 
de esta enzima. Se emplearán formulaciones de medios de cultivo basadas en el medio 
de producción reportado por Peña (1998) para la producción de lipasa y por Cohen 
(1973) para la de proteasas. Una vez producida y concentrada la enzima, se evaluarán 
los siguientes sustratos para determinar la actividad enzimática: 
a) Lípidos: tripalmitina, trioleína, tricaprilina, tributirina y triestearina. 
b) Ésteres: p-nitrofenil laurato, p-nitrofenil palmitato, p-nitrofenil butirato. 
c) Proteínas: Azocaseína, elastina y colágeno. 
En una etapa inicial, que es la que se describe en el presente trabajo, se empleará 
un extracto crudo con actividad enzimática, con el fin de establecer las condiciones para 
la determinación de cada una de las actividades señaladas. 
OBJETIVOS 
 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 3 
2. OBJETIVOS: 
 
•••• GENERAL: 
 
Caracterizar mediante metodologías que permitan distinguir entre actividades 
lipolítica, esterasa y proteasa, extractos enzimáticos de Aspergillus nidulans PW1 
obtenidos en condiciones de producción idóneas para cada uno de estos tipos de 
enzimas. 
 
•••• PARTICULARES: 
1) Obtener enzima en medios evaluados por diversos autores para producción de 
lipasas o proteasas, que cubren las siguientes condiciones. 
a) Medios con aceite de oliva como inductor. 
b) Medios con fuentes orgánicas de nitrógeno. 
c) Medios con combinaciones de fuentes orgánicas de nitrógeno. 
d) Medios con altas concentraciones de glucosa. 
2) Determinar la especificidad que tiene la enzima obtenida en diferentes condiciones 
sobre sustratos de diferente naturaleza (lípidos, ésteres y proteínas, previa 
estandarización de metodologías. 
a) Empleo de p-nitrofenoles como sustratos. 
b) Cuantificación con titulador automático de ácidos grasos liberados. 
c) Actividad sobre azocaseína, elastina y colágeno. 
d) Actividad en zimogramas. 
ANTECEDENTES 
 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 4 
3. ANTECEDENTES: 
3.1 Enzimas en estudio. 
3.1.1 Lipasas. 
Las lipasas, también llamadas triacilglicerol éster hidrolasas (E.C. 3.1.1.3) son una 
de las familias de las hidrolasas menos caracterizada y se han definido como enzimas 
que catalizan la reacción de hidrólisis de los enlaces éster de triglicéridos y generan 
como productos ácidos grasos libres y glicerol cuando se trata de una hidrólisis total, 
mientras que cuando la hidrólisis es incompleta generan diglicéridos y monoglicéridos 
con diferencias en las posiciones finales de esterificación. Esta reacción es reversible y 
la generación de los diferentes productos depende de las condiciones de actividad y 
naturaleza de la lipasa (Godtfredsen, 1990). 
Hasta el momento no se tiene una definición de lipasa satisfactoria. Las reacciones 
de las enzimas lipolíticas ocurren en una interfase agua-lípido, donde el sustrato lipídico 
se encuentra usualmente formando un equilibrio entre los estados monomérico micelar 
y emulsificado. Se han establecido dos criterios para clasificar una enzima lipolítica 
como una lipasa “verdadera” (E.C. 3.1.1.3). 
• Debe ser activada por la presencia de una interfase, es decir; su actividad 
debe incrementarse notablemente cuando el triglicérido se encuentra en la 
forma emulsificada. Este fenómeno se ha definido como “activación 
interfacial”. 
• Debe tener una “tapa” que cubra el sitio activo de la enzima, la cual es 
desplazada dejando el sitio activo descubierto al contacto con la interfase. 
ANTECEDENTES 
 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 5 
Sin embargo, estos criterios no representan una clasificación adecuada debido a 
que se han descrito numerosas excepciones de enzimas que presentan una “tapa”, 
pero no presentan una activación interfacial. Por lo tanto, las lipasas se definen 
simplemente como carboxilesterasas que catalizan la hidrólisis y síntesis de 
acilgliceroles de cadena larga, insolubles en agua. No existe una definición estricta del 
término “cadena larga”, pero ésteres de glicerol con un grupo acilo ≥ 10 átomos de 
carbono se consideran como un sustrato para lipasas (Jaeger, et. al., 1998). 
3.1.2 Esterasas. 
Las carboxilesterasas (carboxil esterhidrolasa, EC 3.1.1.1) son enzimas capaces 
de hidrolizar enlaces éster, generando como productos un ácido y un alcohol. Pueden 
ser obtenidas a partir de una variedad de microorganismos. Cuando el medio de 
reacción es una mezcla de agua-alcohol, las carboxilesterasas pueden sintetizar 
compuestos éster que pueden contribuir deseable y perjudicialmente a las 
características de sabor en productos lácteos (Mathewson, 1998). 
3.1.3 Proteasas. 
Las proteasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de proteínas. Participan en 
una gran variedad de funciones dentro del organismo. Tienen gran participación en 
industrias de alimentos y detergentes por su diversidad y especificidad, además ocupan 
un importante lugar dentro de las ventas mundiales de enzimas industriales (Rao et al., 
1998). Estas enzimas pueden obtenerse de plantas, animales y microorganismos 
(bacterias, hongos y virus). En procesos biotecnológicos se prefiere el uso de proteasas 
microbianas por poseer características tales como crecimiento rápido, requerir de 
ANTECEDENTES 
 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 6 
espacios pequeños para su cultivo y facilidad para ser manipuladas genéticamente para 
la producción de nuevas enzimas con propiedades de interés (Rao et al., 1998). 
3.1.3.1Clasificación. 
La diversidad tan amplia de proteasas en cuanto a función y estructura permite 
varias maneras de clasificarlas. Puede basarse en criterios como el tipo de reacción 
catalizada y la naturaleza química del sitio catalítico. Tomando en cuenta el sitio en el 
que inician su acción pueden dividirse en dos grandes grupos: exoproteasas y 
endoproteasas. 
Las exoproteasas pueden atacar en los extremos de la cadena polipeptídica y 
remover un aminoácido. Se les llama carboxipeptidasa a las exoproteasas que 
hidrolizan el aminoácido que está en el extremo carboxilo terminal de la proteína, 
mientras que las aminopeptidasas son exoproteasas que hidrolizan el aminoácido que 
se encuentra en el extremo amino terminal de la proteína Las endoproteasas hidrolizan 
enlaces peptídicos internos de la cadena polipeptídica, lejos de los extremos (Rao et al., 
1998). 
Las enzimas proteolíticas pueden ser clasificadas sobre las bases de la química de 
sus mecanismos catalíticos en cuatro grupos, designados como serinproteasas, tiol o 
sulfhidrilproteasas, metaloproteasas y carboxiproteasas (Mathewson, 1998). 
 
• Serin: 
Las serin, o alcalina proteasas, típicamente se caracterizan por que tienen un 
residuo de serina y uno de histidina en el sitio activo. Catalizan la hidrólisis de ésteres y 
amidas. Son activas a pH neutros y alcalinos con un óptimo entre 7.5 y 10.5. Tienen un 
ANTECEDENTES 
 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 7 
tamaño de 18-35 kDa. Son inhibidas por el DFP (di-isopropil-fluoro-fosfato) (Creighton, 
1993; Rao et al., 1998). 
• Tiol: 
Las tiol proteasas requieren de un grupo sulfhidrilo para que funcione el sitio 
activo, el cual es aportado por el aminoácido cisteína. La acción catalítica de ésta 
requiere frecuentemente de la presencia de agentes reductores, como el HCN. La 
mayoría presenta una actividad máxima a valores de pH neutros, aunque hay algunas 
que son activas a pH ácidos, con gran actividad a pH por debajo de 7. La papaína es la 
tiolproteasa mejor caracterizada. Son susceptibles a la acción de agentes sulfhidrilos 
como el PCMB o a los que reaccionan con el grupo tiol (Creighton, 1993; Rao et al.,1998). 
• Metalo: 
A este grupo pertenecen la mayor parte de proteasas activas. Para ser activas 
requieren de la presencia de un ion metálico divalente, usualmente zinc, calcio, niquel, 
etc. en el sitio activo. 
Con base a su especificidad, pueden clasificarse en: 
a. Metaloproteasas que actúan a valores neutros de pH y que actúan sobre 
aminoácidos hidrofóbicos. 
b. Metaloproteasas que actúan a valores alcalinos de pH. 
c. Metaloproteasas que actúan sobre residuos pequeños de aminoácidos. 
d. Metaloproteasas que actúan específicamente sobre residuos de lisina. 
Estas tienden a actuar mejor cuando el valor de pH se encuentra alrededor de 7.0 
y son originariamente nombradas como proteasas “neutras”. Todas las metaloproteasas 
son inhibidas por quelantes como el EDTA. La termolisina, colagenasas y las 
ANTECEDENTES 
 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 8 
carboxipeptidasas A y B son ejemplos de este tipo de enzimas (Creighton, 1993; Rao et 
al., 1998). 
• Carboxi: 
A este grupo también se le conoce con el nombre de aspartilproteasa o proteasas 
ácidas. Los grupos carboxilo catalíticos comúnmente son residuos de asparagina. La 
mayor parte de las carboxilproteasas presentan máxima actividad a valores de pH bajos 
(3 o 4). Presentan masas moleculares de 30-45 kDa. La pepsina y otras enzimas 
gástricas (quimosina, renina) pertenecen a este grupo de proteasas. Las proteasas 
ácidas, normalmente requieren de un ácido carboxílico en el sitio activo, el cual es 
aportado frecuentemente por un residuo de ácido aspártico, y funciona relativamente a 
pH bajos de 2-4. 
A pesar de las diferencias que hay entre las diferentes proteasas, las cuatro 
presentan en su mecanismo de reacción una etapa de acilación seguida de un proceso 
de deacilación, en donde ocurre un ataque nucleofílico al intermediario (Creighton, 
1993). El carbono del carbonilo trigonal del enlace peptídico se arregla tetraédricamente 
debido a la adición temporal con el nucléofilo. Para las serin y las cisteínproteasas los 
nucléofilos son el grupo hidroxil-serin- y cisteín-tiol, presentes en el sitio catalítico de la 
enzima; mientras que para las carboxi y metaloproteasas, una molécula de agua es la 
encargada de hidrolizar al enlace peptídico. 
3.1.4 Diferencias en los mecanismos de acción de las lipasas, esterasas y 
proteasas. 
Desnuelle y colaboradores (1975) postularon que las lipasas presentaban el 
fenómeno de activación interfacial, el cual fue utilizado como criterio principal para 
ANTECEDENTES 
 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 9 
distinguir entre lipasas y esterasas. Sin embargo, recientemente se ha observado que 
existen enzimas lipolíticas que no se activan interfacialmente, a pesar de la homología a 
la secuencia de otras lipasas. 
La forma más confiable para distinguir entre lipasas y esterasas es la especificidad 
de sustrato. Las lipasas hidrolizan preferentemente ésteres insolubles en agua, 
triglicéridos con ácidos grasos de cadena larga, mientras que las esterasas hidrolizan 
solamente ésteres solubles en agua y triglicéridos con ácidos grasos de cadena corta 
como tributirina (Miroslaw y Shrag, 1997). Aunque las proteasas rompen enlaces éster, 
éstos sólo serán de proteínas. 
En la Tabla 1 se explica de una forma más breve las diferencias que existen entre 
las lipasas, esterasas y proteasas. 
Tabla 1- Características principales de las enzimas en estudio. 
Característica 
Esterasa 
EC 3.1.1.1 
Lipasa 
EC 3.1.1.3 
Serin Proteasas 
EC 3.1 
Sustrato 
principal 
Ésteres solubles 
en agua 
 
 
Triglicéridos 
 
 
Proteínas 
 
 
 
Otros 
sustratos 
------------ 
Ésteres solubles en 
agua 
Ésteres, amidas 
Estructura α/β hidrolasas 
α/β hidrolasas, sitio 
activo cubierto por 
una tapa. 
α/β hidrolasas 
Mecanismo de 
reacción 
Triada catalítica 
formada por 
Ser-His-Asp 
Triada catalítica 
formada por 
Ser-His-Asp 
Triada catalítica 
formada por 
Ser-His-Asp 
 
ANTECEDENTES 
 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 10 
Existen diversas metodologías para evaluar estas actividades enzimáticas. La 
similitud de las reacciones permite que algunos sean comunes, por lo que deben 
emplearse métodos suficientemente sensibles para distinguir cada tipo de actividad. 
El uso de pH-stat como metodología de determinación de actividad lipasa, se basa 
principalmente en la valoración potenciométrica de ácidos grasos liberados como 
consecuencia de la hidrólisis enzimática de triglicéridos, por lo cual el pH-stat está 
equipado con un electrodo de platino, que es sensible a la temperatura; además de 
tener integrada una bureta. Para el buen funcionamiento del pH-stat, se deben 
establecer parámetros de trabajo constantes para evitar dispersión de los resultados, y 
los más importantes son temperatura, pH y flujo en el volumen de NaOH que se va a 
adicionar (Mathewson, 1998). Esta metodología tiene la ventaja de monitorear la 
reacción en los primeros minutos, por lo tanto hace que el estudio de actividad lipasa 
sea más fino y se genere poca variabilidad. 
En el caso de la actividad esterasa se emplean sustratos que pueden detectarse 
colorimétricamente y lo mismo ocurre con las proteasas, se emplean complejos 
proteicos que liberan color (Stauffer, et. al., 1989). En este último caso se pueden 
emplear como control enzimas con valores conocidos de actividad, como la tripsina. 
3.2 El género Aspergillus. 
3.2.1 Características del género. 
El género Aspergillus se clasifica dentro de los ascomicetos, dado que se les ha 
identificado un mecanismo de reproducción sexual (Ward, 1991), como es el caso de 
Aspergillus nidulans. 
ANTECEDENTES 
 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 11 
Una de las características de este género es que son tolerantes a bajas 
actividades de agua, lo que los hace capaces de crecer en sustratos de altos 
potenciales osmóticos y esporular en una atmósfera de baja humedad relativa (Cotty, et 
al., 1994). 
Los hongos del género Aspergillus poseen una gran diversidad bioquímica, que 
involucra diferentes sistemas enzimáticos que les permiten sobrevivir en una amplia 
variedad de hábitat y como consecuencia, están reconocidos como fuente rica de 
enzimas usadas en una amplia variedad de industrias (Bennett y Klich, 1992). 
3.2.2 Clasificación e importancia económica. 
Este género se divide en subgéneros y secciones, nombrados por la especie mejor 
conocida dentro de éstos. Existe un gran número de especies de importancia 
económica, algunas de las cuales son sus enzimas y metabolitos de interés, se citan en 
la Tabla 2 (Berka, Duna-Coleman y Ward, 1992). Industrialmente el género Aspergillus 
posee gran importancia debido a que tiene un alto nivel de secreción de enzimas, lo 
que facilita el proceso de purificación y pueden ser usadas a nivel industrial, además de 
que hay experiencia en el manejo de este organismo. 
Varias especies producen compuestos con alta toxicidad hacia otros organismos 
llamados micotoxinas, las cuales pertenecen a un grupo químicamente diverso de 
metabolitos secundarios cuya función no es muy clara. A. flavus y A. parasiticus 
sintetizan una o más aflatoxinas que son hepatotóxicas, teratogénicas y carcinogénicas 
(Cotty, et al., 1994). Se evaluó la toxicidad de Aspergillus oryzae, ya que es muy 
utilizado a nivel industrial para la producción de lipasas y de otras enzimas, además se 
ANTECEDENTES 
 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 12 
encontró que es un microorganismo de baja toxicidad y que la lipasa producida por el 
mismo no es tóxica (Greenough, 1996). 
Tabla 2- Enzimas de importancia industrial producidas por el género Aspergillus. 
Especie Enzimas 
Aspergillus níger 
95% enzimas comerciales (catalasa, α-amilasa, adenilatocilasa, 
celulasa, lactasa, glucoamilasa, fosfodiesterasa, β-glucanasa, 
hemicelulasa, invertasa, queratinasa, lipasa, maltasa, proteasa, 
ribonucleasa, pectinasa) 
Aspergillus oryzae 
α-amilasa, catalasa, β-glucanasa,invertasa, lipasa, pectinasa, 
proteasa. 
Aspergillus ficum Fitasa. 
Aspergillus nidulans Celulasa, proteasa. 
Aspergillus awamori α-amilasa, lipasa, proteasa. 
Aspergillus flavus Toxinas carcinogénicas, lipasas, proteasa. 
Aspergillus fumigatus Celulasa, proteasa. 
Aspergillus sojae Celulasa, pectinasa. 
Aspergillus saitoi Hemicelulasa, pectinasa. 
Aspergillus sydowii Lipasa. 
Aspergillus foetidus Lipasa, proteasa. 
Aspergillus terrus Celulasa. 
Aspergillus candidus Celulasa, lipasa. 
Fuente: Berka (1992). 
3.2.3 Importancia del género Aspergillus como modelo de estudio. 
La importancia del género Aspergillus en investigación se debe principalmente a 
que: 
a) Secreta una gran variedad de enzimas. 
b) Hay experiencia en el manejo de estos microorganismos a nivel industrial y por lo 
tanto es un sistema en el cual se pueden expresar proteínas de otros 
microorganismos fácilmente. Por ejemplo en A. nidulans se han clonado la 
ANTECEDENTES 
 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 13 
quimosina de bovino (Ward, et al., 1990) y la interleucina 6 humana (Contreras, et 
al., 1991) entre muchas otras. 
c) Las enzimas se secretan generalmente al medio y por lo tanto es probable escalar 
el proceso a bajo costo. 
d) Algunas especies se consideran como microorganismos seguros para el consumo 
humano (GRAS) por la Administración de Alimentos y Medicamentos en los 
Estados Unidos (FDA) (van den Hondel, et al., 1992) 
3.3 Aspergillus nidulans. 
Aspergillus nidulans es un hongo filamentoso del grupo de los ascomicetos. Se 
encuentra comúnmente en el suelo, es de fácil crecimiento y tiene algunas 
características que lo hacen ser el más usado para estudiar genética práctica (Jones y 
Richards, 1991), por lo que fue uno de los primeros microorganismos a los que se le 
secuenció su genoma (Broad Institute, 2003). Además posee un estilo de vida 
saprofítico que le permite utilizar una amplia gama de sustratos como fuente de 
nutrición, es un género filogenéticamente relacionado con Penicillium y Cephalosporium 
que agrupan especies productoras de metabolitos secundarios y proteínas de gran valor 
comercial (Powell, et al., 1994). En A. nidulans se han reconocido algunas enzimas que 
pueden ser empleadas en una gran variedad de aplicaciones industriales, por 
mencionar algunas enzimas se encuentran las involucradas en la degradación de pared 
celular (xilanasas, celulasas y cutinasas), esterasas, y proteasas (Berka, et al., 1992; 
García-Lepe, et al., 1997; Mayordomo, et al., 2000; MacCabe, et al., 2002). 
ANTECEDENTES 
 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 14 
3.3.1 Ventajas de Aspergillus nidulans como modelo de experimentación. 
Dentro de las ventajas que tiene Aspergillus nidulans como modelo experimental 
se encuentran 
a) Formar colonias compactas que facilitan la réplica en placa. 
b) Contar con un mapa genético bien definido. 
c) Presenta un crecimiento rápido. 
d) Los requerimientos para su crecimiento son simples. 
3.4. Planteamiento del problema y estrategia de trabajo 
El problema a abordar en este trabajo será el determinar si la actividad enzimática 
es la misma que se ha reportado como lipasa o esterasa por este grupo de trabajo 
(Kawasaki, 1995, Peña, 2001) y como proteasa por otros autores (Cohen, 1973, Katz et 
al., 1994). Se evaluará la producción de la enzima en condiciones reportadas para 
obtención de lipasas y de proteasas, así como la actividad sobre los sustratos 
correspondientes, de acuerdo con la siguiente estrategia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
REACTIVACIÓN DEL MICROORGANISMO 
PRODUCCIÓN DE LA ENZIMA 
EN DIFERENTES CONDICIONES DE CULTIVO 
CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA 
DETERMINAR ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 
SOBRE DIFERENTES SUSTRATOS 
MATERIAL 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 15 
4. MATERIAL: 
•••• Aceite de olivo (Ibarra) 
•••• Acetato de sodio (Baker) 
•••• Ácido acético (Baker) 
•••• Ácido bórico (Baker) 
•••• Ácido clorhídrico (Baker) 
•••• Ácido tricloroacético (Baker) 
•••• Agar bacteriológico (Oxoid) 
•••• Arginina (Merck) 
•••• Azocaseína (Sigma) 
•••• Biotina (Sigma) 
•••• Carbonato de sodio (Baker) 
•••• Cloruro de potasio (Baker) 
•••• Cloruro de calcio (Baker) 
•••• Cloruro de cobalto ( Baker) 
•••• Cloruro de manganeso (Baker) 
•••• Dextrosa (Baker) 
•••• Elastina (Elastin Congo Red, Sigma) 
•••• Etilendiaminotetracetato disódico (Baker) 
•••• Fast Red (Sigma) 
•••• Fosfato diásico de potasio (Baker) 
•••• Fosfato monobásico de potasio (Baker) 
•••• Colágeno (Hide Powder Azure, Sigma) 
MATERIAL 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 16 
•••• Hidróxido de sódio (Baker) 
•••• Marcadores de peso molecular (Sigma) 
•••• Metionina (Research Organics) 
•••• Molibdato de amonio (Baker) 
•••• α-naftil aceteto (Sigma) 
•••• Nitrato de sódio (Baker) 
•••• p-nitrofenil butirato (Sigma) 
•••• p-nitrofenil laurato (Sigma) 
•••• p-nitrofenil palmitato (Sigma) 
•••• Reactivos de electroforesis (BioRad) 
•••• Sulfato de amonio (Baker) 
•••• Sulfato de cobre (Baker) 
•••• Sulfato de magnésio (Baker) 
•••• Sulfato de hierro (Baker) 
•••• Tributirina C4:0 (Sigma) 
•••• Tricaprilina C8:0 (Sigma) 
•••• Triestearina C18:0 (Sigma) 
•••• Tripalmitina C16:0 (Sigma) 
•••• Trioleina C18:1 (Sigma) 
•••• Tris-base (Baker) 
•••• Triton X-100 (Sigma) 
•••• Tween 80 (Sigma) 
METODOLOGÍA 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 17 
5. METODOLOGÍA: 
5.1 MICROORGANISMO EMPLEADO Y SU CONSERVACIÓN 
El microorganismo que se empleó es Aspergillus nidulans PW1, una cepa 
auxótrofa a arginina proporcionada por el Dr. Jesús Aguirre, del Instituto de Fisiología 
Celular, UNAM. Las esporas de A. nidulans se cosecharon de placas de medio mínimo 
y se resuspendieron en una solución al 0.1% de NaCl y se conservaron a 4°C en sílica 
gel. 
5.2 REACTIVACIÓN DEL MICROORGANISMO. 
Medio de cultivo, activación de cepas y preparación del inóculo 
• Medio mínimo.- Se utilizó el medio de Käfer (1977) de acuerdo con lo señalado en la 
Tabla 3. 
Tabla 3.- Medio mínimo para A. nidulans. 
Compuesto Cantidad por litro 
Sales 20x (Tabla 2) 50 mL 
Elementos traza (Tabla 3) 1 mL 
Glucosa 10 g 
Agar 12.5 g 
Se ajustó el pH a 6.5 y se esterilizó 15 minutos a 121°C. 
Las sales 20x y los elementos traza se prepararon de acuerdo a las cantidades 
que se exponen en la Tabla 4 y Tabla 5. 
 
 
 
 
 
METODOLOGÍA 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 18 
Tabla 4.- Sales 20x, para preparar medio mínimo de A. nidulans. 
Compuesto Cantidad por litro 
NaNO3 120 g 
KCl 10.4 g 
MgSO4 7H2O 10.4 g 
KH2PO4 30.4 g 
Se afora a 1L y se guarda a temperatura ambiente. 
Tabla 5.- Elementos traza para prepara medio mínimo de A. nidulans. 
Compuesto Cantidad por 100 mL 
ZnSO4 7H2O 2.20 g 
H3BO3 1.10 g 
MnCl2 4H2O 0.50 g 
FeSO4 7H2O 0.50 g 
CoCl2 5H2O 0.16 g 
CuSO4 5H2O 0.16 g 
(NH4)6Mo7O24 4H2O 0.11 g 
Na4EDTA 5.00 g 
 
Los componentes se disolvieron uno a uno, de acuerdo al orden establecido en 80 
mL de agua destilada, y se verificó que cada ingrediente estuviera completamente 
disuelto antes de agregar el siguiente. Se calentó la solución hasta ebullición, 
posteriormente se dejó enfriar a temperatura ambiente y aforar a 100 mL con agua 
destilada. Los requerimientos nutricionales se adicionaron de acuerdo a las cantidades 
establecidas en la Tabla 6. 
Tabla 6.- Requerimientos nutricionales de A. nidulans en cultivo. 
Compuesto Sol. Stock Cantidad por litro de medio 
Arginina 16.8% 5.0 mL 
Biotina 0.05% 0.5 mL 
Metionina 0.6 Mm 1.25 mL 
La biotina se disolvió en etanol al 70%. Todos los reactivos se guardaron a 4°C. 
METODOLOGÍA 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 19 
• Activación de cepas.- Se inoculó y se dispersó material proveniente de 
almacenamiento en una caja Petri con medio mínimo y se incubó a 37°C 
durante 5 días. Para el caso en que se cuente con la cepa conservada en sílica 
gel, se siembran de 2 a 3 granos y se incuba a 37°C durante 3 a 5 días. 
Posteriormente se sembróa confluencia y se incubó en las mismas 
condiciones. 
• Preparación del inóculo.- Se adicionaron 10 mL de Tween 80 al 0.1% 
directamente sobre la caja. Posteriormente se rasparon las esporas con un asa 
micológica y se recuperaron en un tubo desechable Falcon de 15 mL. Se 
centrifugó durante 10 minutos a 14000 rpm en el rotor JA20, (centrífuga 
Beckman J2-MC), se desechó el sobrenadante, se le adicionó 10 mL de agua 
destilada estéril y se volvió a centrifugar con las condiciones anteriores, 
finalmente se resuspendieron las esporas en agua destilada estéril y se 
almacenaron a 4°C. Se realizó un conteo en el microscopio con el 
hematocitómetro y se verificó la viabilidad. 
5.3 PRODUCCIÓN DE LA ENZIMA. 
5.3.1 CONDICIONES PARA PRODUCCIÓN DE ACTIVIDAD LIPOLÍTICA. 
• Medio optimizado.- Al medio base de Käfer, ajustado a pH 6.5, se adicionó 
almidón como fuente de carbono en lugar de glucosa, así como también se 
agregó extracto de levadura como fuente de nitrógeno. Se adicionó aceite de 
olivo como inductor de la producción de la enzima y los requerimientos 
nutricionales para A. nidulans, de acuerdo a lo que se muestra en la Tabla 7. 
METODOLOGÍA 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 20 
 
Tabla 7.- Composición del medio optimizado para producción de la 
enzima de A. nidulans (Peña, 2001) 
 Componente Cantidad por litro 
Sales 20x 50 mL 
Elementos traza 1 mL 
Aceite de olivo 0.5% 
Extracto de levadura 0.5% 
Almidón 1.5% 
 
Las sales 20x, elementos traza y requerimientos nutricionales se prepararon de la 
misma forma señaladas en las Tablas 4, 5 y 6, finalmente el medio se esterilizó a 121°C 
por 15 minutos. 
• Condiciones de la fermentación.- El crecimiento del microorganismo se realizó 
en matraces Erlenmeyer de 250 mL, conteniendo 50 mL del medio de cultivo 
optimizado estéril, se inoculó con 1 x 106 esporas/mL, se incubó a 37°C por 24 
horas y 300 rpm en agitador rotatorio (LABLINE-ORBIT). 
5.3.1.1 Concentración de la enzima para evaluar actividad lipolítica o esterasa. 
• ULTRAFILTRACIÓN.- Se ultrafiltró en una celda con agitación (Amicon) 
usando una membrana YM con un límite de exclusión de 10 KDa a 4°C, ya que 
la enzima tiene un peso aproximado de 37 KDa (Peña, 2001). 
• Concentración de proteína.- Esta se cuantificó por medio del método de 
Bradford, que se basa en determinación de la proteína soluble y se empleó 
como reactivo azul de Coomassie concentrado. El color generado se cuantificó 
en un espectrofotómetro (SPECTRONIC 21D) a 595 nm. 
METODOLOGÍA 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 21 
5.3.2 CONDICIONES DE PRODUCCION DE ACTIVIDAD PROTEOLITICA 
5.3.2.1 Producción de proteasa y/o esterasa en diferentes condiciones de cultivo 
Para este experimento se procedió a evaluar diferentes medios de cultivo, con el 
fin de determinar si se favoreció la producción de proteasas, basándose en los medios 
de cultivo de Cohen, 1973; Katz, 1996; y Frosco, 1992. Estos consisten en una 
preparación idéntica de sales minerales y elementos traza, así lo único que se varió fue 
la cantidad de leche desgrasada o glucosa en el medio. Se evaluó también el efecto de 
la presencia de extracto de levadura. Como referencia, se introdujo el medio descrito 
anteriormente para la producción de lipasas (medio optimizado). 
Tabla 8.- Medios de cultivo sólidos probados. 
 
 
 
 
 
 
 
NOTA: SM: Leche en polvo desengrasada, EL: Extracto de levadura, MM: Medio Mínimo (Käfer, 1977) 
suplementado con elementos traza, sales 20X y requerimientos nutricionales para A. nidulans, GLU: 
Glucosa y MOPT: Medio Optimizado (Peña, 2001). 
 
Para la producción en medio líquido se emplearon los medios descritos en la tabla 
9., el microorganismo se cultiva 24 h, se centrifugó y a los sobrenadantes obtenidos, se 
les realizó la medición de actividad proteasa con los métodos descritos más adelante. 
Las formulaciones varían en la naturaleza de la fuente de nitrógeno (leche descremada, 
proteosa peptona, extracto de carne, extracto de levadura y diferentes proporciones 
1 0.5%SM+MM+0.5%GLU 
2 1.0%SM+MM+0.5%GLU 
3 2.0%SM+MM+0.5%GLU 
4 1.0% SM+MM+2.0%GLU 
5 0.5%SM+0.5%EL+MM+0.5%GLU 
6 1.0%SM+0.5%EL+MM+0.5%GLU 
7 2.0%SM+0.5%EL+MM+0.5%GLU 
8 1.0%SM+0.5%EL+MM+2.0%GLU 
9 1.0%SM+MM+0%GLU 
10 1.0%SM+MOPT +0%GLU sin aceite de oliva 
METODOLOGÍA 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 22 
entre ellas). Se emplearon también concentraciones crecientes de glucosa y como 
referencia se introdujo el medio optimizado para producción de lipasas. 
Tabla 9.- Medios de cultivo líquidos probados. 
1 0.5%SM+MM+0%GLU 14 1.0%ECa+MM+0%GLU 
2 1.0%SM+MM+0%GLU 15 2.0%ECa+MM+0%GLU 
3 2.0%SM+MM+0%GLU 16 0.5%ECa+MM+0.5%GLU 
4 0.5%SM+MM+0.5%GLU 17 1.0%ECa+MM+0.5%GLU 
5 1.0%SM+MM+0.5%GLU 18 2.0%ECa+MM+0.5%GLU 
6 2.0%SM+MM+0.5%GLU 19 0.5%SM+0.5%EL+MM+0%GLU 
7 0.5%PP+MM+0%GLU 20 1.0%SM+0.5%EL+MM+0%GLU 
8 1.0%PP+MM+0%GLU 21 0.5%SM+0.5%EL+MM+0.5%GLU 
9 2.0%PP+MM+0%GLU 22 1.0%SM+0.5%EL+MM+0.5%GLU 
10 0.5%PP+MM+0.5%GLU 23 0.5%SM+MOPT+0%GLU sin aceite de oliva 
11 1.0%PP+MM+0.5%GLU 24 1.0%SM+ MOPT+0%GLU sin aceite de oliva 
12 2.0%PP+MM+0.5%GLU 25 2.0%SM+ MOPT+0%GLU sin aceite de oliva 
13 0.5%ECa+MM+0%GLU 26 
MOPT con aceite de oliva sin concentrar con 
membrana YM10 
A MOPT con aceite de oliva concentrado con membrana YM10 
 
NOTA: MM: Medio Mínimo (Käfer, 1977) suplementado con elementos traza, sales 20X y requerimientos 
nutricionales para A. nidulans, SM: Leche en polvo desengrasada, EL: Extracto de levadura, PP: 
Proteosa Peptona, ECa: Extracto de Carne, GLU: Glucosa y MOPT: Medio Optimizado (Peña, 2001). 
 
5.4 CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA EVALUANDO SUSTRATOS DE 
DIFERENTE NATURALEZA. 
Para determinar la actividad de la enzima hacia sustratos de diferente naturaleza, 
se emplearon diferentes metodologías, para las que se establecieron condiciones de 
determinación. Se consideraron resultados previos del grupo de trabajo en lo referente 
a: 
a) Se empleó una muestra concentrada por ultrafiltración. 
b) Temperatura 37°C. 
c) pH 8. 
 
 
METODOLOGÍA 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 23 
Los sustratos evaluados fueron los siguientes: 
a) Lípidos: tributirina, tricaprilina, triestearina, tripalmitina y trioleína. 
b) Ésteres: p-nitrofenil butirato, p-nitrofenil laurato y p-nitrofenil palmitato. 
c) Proteínas: azocaseína, elastina y colágeno. 
5.4.1 DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD LIPASA: 
Para la determinación de actividad lipasa se empleó un pH-stat (Copenhaguen 
Radiometer) facilitado por el Dr. José Luis Nava, responsable del Laboratorio de 
Electroquímica Aplicada en la UAM-Iztapalapa. 
5.4.1.1 Determinación de especificidad por el sustrato. 
Se prepararon emulsiones en un sonicador (Desmembrator) al 5% de tricaprilina y 
2% de goma arábiga, 5% de tributirina y 2% de goma arábiga; 2.5% de tripalmitina y al 
1% de goma arábiga, 2.5% de triestearina y al 1% de goma arábiga, así como al 0.5% 
de trioleína y 0.5% de Triton X100. La reacción de hidrólisis se llevó a cabo en vasos de 
precipitado y se colocó 9.8 mL de emulsión y se le adicionaron 200 µL enzima 
(proveniente de la muestra ultrafiltrada). Previamente, tanto la emulsión como la 
muestra se ajustaron a pH 8 y se inició el monitoreo de los cambios en pH tras la 
adición de NaOH 10 mM cada minuto durante un lapso de 20 minutos (Ferrer, et. al., 
2000). 
Una unidad internacional (UI) se definió como la cantidad de enzima que libera 1 
µmol/min de ácidos grasos a 37°C. 
METODOLOGÍA 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 24 
5.4.1.2 Determinación de temperatura y pH óptimos para el ensayo. 
Para la determinación de estos parámetros, con un experimento previo se 
determinó el sustrato con el que la enzima presentó una mayor actividad y se procedió 
a realizar un barrido de temperaturas. La reacción se siguió por 15 minutos a las 
diferentes temperaturas desde 20 a 70 °C y se mantiene constante el pH 8. 
El pH en el que se obtuvo la actividad máxima se determinó tras evaluar diferentesvalores de pH de reacción, dicha reacción se siguió durante 15 minutos, por lo que se 
ajusto el sustrato y la enzima con NaOH 10 mM a los diferentes pH desde 5 a 10. La 
temperatura se mantuvo constante y corresponde a la óptima determinada previamente. 
5.4.1.3 Determinación de estabilidad frente a la temperatura y al pH. 
Para este ensayo fueron de suma importancia los resultados obtenidos en el 
experimento anterior, por lo cual se requirió saber la temperatura y pH óptimos, para 
que con esas condiciones se cuantificara la actividad residual de la enzima. Por lo que 
para evaluar estabilidad frente a la temperatura, se prepararon los tubos con el extracto 
enzimático necesarios para las diferentes temperaturas (desde 20 a 60°C), se les ajustó 
el pH de acuerdo al óptimo y se incubaron a las diferentes temperaturas durante 30 
minutos. Tras la incubación se determinó actividad residual a la temperatura óptima, 
empleando la técnica de pH-stat. 
Por otra parte para la medir la estabilidad frente al pH se utilizaron soluciones 
amortiguadoras de pH a 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11, todos en concentración 50 mM. Para lo 
cual se tomaron 400 µL de extracto enzimático y se les adicionaron 100 µL de solución 
amortiguadora respectivamente; se incubaron a 4°C durante 12 h y transcurrido este 
METODOLOGÍA 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 25 
período se determinó actividad residual a la temperatura y pH óptimos, empleando la 
técnica de pH-stat. 
5.4.2 DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ESTERASA: 
5.4.2.1 Método espectrofotométrico 
Se emplearon como sustrato los ésteres p-nitrofenil laurato, p-nitrofenil butirato, p-
nitrofenil palmitato. Se adicionó 20 µL de la enzima (extracto crudo), 880 µL de buffer 
Tris 100 mM a pH 8 y 100 µL de sustrato 10 mM, la reacción se detuvo a los 5 minutos 
con Na2CO3 100 mM, este último para precipitar al sustrato que no reaccionó. La 
reacción se llevó a cabo a 37°C, después de que el tiempo transcurre se procedió a 
centrifugar (Centrífuga 5415 C, Eppendorf) a 10000 rpm durante 10 minutos. 
Una unidad internacional (UI) es definida como la cantidad de enzima que libera 1 
µmol/min de p-nitrofenol a 37°C (coeficiente de extinción molar es de 4.6 mM-1/cm-1 a 
410 nm). Finalmente se midió la absorbancia a los 5 min a 410 nm (Nawani and Kaur, 
2000). 
5.4.2.2 Zimogramas 
Se empleó como sustrato α-naftil acetato de acuerdo con la metodología 
propuesta por Karpushova, et. al., (2005). Se elaboraron geles nativos de acrilamida al 
12% y el gel se corrió en una cámara de electroforesis a 80 Volts. Posteriormente se 
incubó el gel en buffer de fosfatos 0.1M, pH 7.5 durante 30 min., se cambió a una 
solución buffer de fosfatos 0.1 M, pH 7.5, con 5% de Tritón X100 y se incubó durante 90 
min. más, se transfirió e incubó por 2 a 3 horas a otra solución buffer de fosfatos 0.1 M, 
pH 7.5, 0.5% de Tritón X100. Se considera que con este tratamiento las proteínas 
METODOLOGÍA 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 26 
alcanzan la conformación activa y se procede a lavar el gel con buffer de fosfatos 0.1 M, 
pH 7.5. 
Inmediatamente después se colocó en una solución con el α-naftil acetato, se 
incubó durante 10 min a temperatura ambiente con agitación y, por último, se colocó 
una solución de Fast Red como revelador y se incubó hasta ver desarrollo de color café 
oscuro característico de la actividad esterasa. 
5.4.3 DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD PROTEASA: 
5.4.3.1 Evaluación cualitativa: 
Se observó la producción de halos de hidrólisis en medio sólido (ver tabla 8) para 
tener un indicador cualitativo de la producción de la enzima 
5.4.3.2 Métodos espectrofotométricos: 
5.4.3.2.1 Sustrato: Azocaseína 1% (w/v): 
La reacción de hidrólisis se llevó a cabo en tubos Eppendorf de 2.0 mL con 
agitación y temperatura controlada (Thermomixer, Eppendorf, 800 rpm y 37°C), la 
reacción se realizó como se indica en la Tabla 10. 
Tabla 10.- Reacción enzimática. 
Reactivo (mL) 
Orden de adición. 
Reacción con 
Muestra 
Control Blanco 
Azocaseína 0.8 0.8 0.8 
Enzima 0.2 --- --- 
Buffer (pH 8) --- --- 0.2 
 
METODOLOGÍA 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 27 
Después se incubó a las mismas condiciones durante 60 minutos. Transcurrido el 
tiempo se procedió a hacer la siguiente adición de reactivos como lo indica la Tabla 11 y 
se incubó a 37°C durante 30 minutos más sin agitación. 
Tabla 11.- Continuación de la reacción enzimática. 
Reactivo (mL) 
Orden de adición. 
Reacción con 
Muestra 
Control Blanco 
TCAm 1.0 1.0 1.0 
Enzima --- 0.2 --- 
 
Al término del tiempo se centrifugó a 10 000 rpm, durante 10 min para separar el 
sustrato que no reaccionó, se tomó una alícuota del sobrenadante (1.0 mL) y se 
adicionó un volumen equivalente de NaOH 0.1 N, que se mezclo para lograr 
homogeneidad. Finalmente se registró el valor de absorbancia del sobrenadante a 440 
nm (Espectrofotómetro LamdaBio, Perkin Elmer). Una unidad de actividad enzimática 
se define como el incremento de absorbancia/hora µg de proteína (Hazen, et. al., 1965). 
5.4.3.2.2 Sustrato: Elastina: 
Se llevó a cabo la reacción de hidrólisis en tubos Eppendorf de 2.0 mL con 
agitación y temperatura controlada (Thermomixer, Eppendorf, 800 rpm, 37°C). Se 
mantuvo el sustrato con agitación magnética y se tomó una alícuota de 0.8 mL. Que se 
adicionó a cada tubo Eppendorf. Se permitió que la mezcla alcanzara el equilibrio 
térmico (5 min de incubación) y se inició la reacción al adicionar 0.2 mL de enzima, se 
mezcló y se mantuvo la reacción con agitación (800 rpm). Se registró el tiempo de 
incubación (2h). En paralelo se corrió (por triplicado) el blanco de reacción (0.8 mL de 
sustrato y 0.2 mL de solución buffer, pH 8). La reacción se detuvo enfriando los tubos 
en un baño de hielo seguido de la remoción del sustrato no digerido mediante 
METODOLOGÍA 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 28 
centrifugación (10 000 rpm, 10 min., a 4 °C). Se registró el valor de absorbancia 
(λmax=495nm) del sobrenadante de cada muestra (Espectrofotómetro LamdaBio, Perkin 
Elmer) y se calculó el delta (∆) de absorbancia. 
Una unidad de actividad elastasa se define como la cantidad de enzima que 
produce un incremento de absorbancia de una unidad/hora µg proteína (Kessler, et. al., 
1993). 
5.4.3.2.3 Sustrato: Colágeno: 
Se llevó a cabo la reacción de hidrólisis, en tubos Eppendorf de 2.0 mL con 
agitación y temperatura controlada (Thermomixer, Eppendorf, 800 rpm, 37°C). Se 
adicionó a cada tubo 0.5 mL de agua destilada y 0.5 mL de buffer pH 8 y se mantuvo el 
sustrato con agitación magnética. Se toma una alícuota de 0.8 mL que se adiciona a 
cada tubo Eppendorf y se permitió que la mezcla alcanzara el equilibrio térmico (5 min 
de incubación). Se inició la reacción al adicionar 0.2 mL de enzima, se mezcló y se 
mantuvo con agitación (800 rpm) por 2h. Se corrió paralelamente (por triplicado) el 
blanco de reacción (0.8 mL de sustrato y 0.2 mL de solución buffer, pH 8). La reacción 
se detuvo enfriando los tubos en un baño de hielo seguido de la remoción del sustrato 
no digerido mediante centrifugación (10 000 rpm, 10 min., a 4 °C). Se registró el valor 
de absorbancia (λmax=595nm) del sobrenadante de cada muestra (Espectrofotómetro 
LamdaBio, Perkin Elmer) y se calculó el delta (∆) de absorbancia. 
Una unidad de actividad enzimática se define como el incremento de absorbancia/ 
hora µg proteína (Rinderknecht, et. al., 1968,Kessler, et.al, 1993). 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 29
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN: 
6.1 Determinación de actividad lipasa. 
Una característica importante que se ha empleado para distinguir a las esterasas 
de las lipasas es su especificidad por el sustrato. Se afirma que las esterasas son más 
afines por los sustratos de cadena corta, más solubles en agua y que no requieren 
emulsificarse, así como tampoco pueden hidrolizar sustratos insolubles en agua como 
el aceite de olivo y trioleína.Las lipasas, por su parte, presentan el fenómeno de 
activación interfacial (Akoh, et. al., 2002). Otros tipos de especificidad se refieren a la 
preferencia de ácidos grasos saturados sobre insaturados, así como a la posición de la 
insaturación. En este caso se utilizó el método de pH-stat para evaluar la liberación de 
ácidos grasos de diferente longitud de cadena a partir de triglicéridos. El empleo de esta 
metodología ha sido avalado por diversos autores pues permite mantener a la enzima 
en condiciones estables de temperatura y pH, lo que evita problemas de 
desnaturalización. Por tal motivo, en una primera etapa del trabajo se evaluaron las 
condiciones óptimas de reacción para esta enzima. 
6.1.1 Efecto de la Temperatura: 
La temperatura óptima promedio en las condiciones de ensayo evaluadas para el 
extracto enzimático crudo es de 40°C, a pH de 8 (Figura 1). Este resultado coincide con 
el reportado para la lipasa de A. nidulans WG312, de 40°C a pH 6.5 (Mayordomo, et. 
al., 2000). Otras lipasas estudiadas también han mostrado una temperatura óptima de 
40°C como es el caso de R. niveus (Kohno, et. al., 1994) y A. niger (Höfelmann, et. al., 
1985). 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 30
 
Cuando se comprobó el efecto de la temperatura sobre la estabilidad de la enzima 
(Figura 1), se hizo un análisis en un rango de 20 a 60 °C, incubando durante 30 min. Se 
observa que el extracto enzimático tiene el 60% de su actividad a 20°C, mientras que a 
50°C, pierde 70% de su actividad. Este comportamiento también lo presenta la lipasa 
de P.chrysogemun (Ferrer, et. al., 2000). 
Para la cepa WG312 de A. nidulans se ha reportado una lipasa que presenta 
actividad a una temperatura de 0°C durante 5 min. Se encontró que esta enzima no 
presenta actividad a temperaturas mayores de 40°C durante 5 min y 1 hora 
(Mayordomo, et. al., 2000). En este trabajo se consideró 20°C como la temperatura 
menor; sin embargo, las enzimas que presentan actividad a bajas temperaturas 
presentan una actividad reducida a altas temperaturas y viceversa (Feller, et. al., 1994), 
20 30 40 50 60 70
0
20
40
60
80
100
TEMPERATURA (°C)
AC
TI
VI
DA
D 
RE
LA
TI
VA
 (%
)
 TEMP. ÓPTIMA
0
20
40
60
80
100
120 ACTIVIDAD RESIDUAL RELATIVA (%
)
 ESTABILIDAD
FIGURA 1.- Efecto de la temperatura sobre la actividad y sobre la estabilidad. La 
determinación se hizo usando el método del pH-stat. 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 31
esto se comprueba los resultados obtenidos en este trabajo con la cepa PW1 de A. 
nidulans, ya que a la temperatura de 20°C se conserva una mayor actividad que a 50°C 
(Figura 1). 
La mayoría de las lipasas de hongos son inestables a altas temperaturas y sólo 
algunas como la de A. niger (Namboodiri, et. al., 2000) y Humicola lanuginosa (Ibrahim, 
et. al., 1987) presentan actividad tras ser incubadas a altas temperaturas (45 a 70 °C 
durante 1 h). El patrón de resistencia a la temperatura encontrado en A. nidulans PW1 
es similar al observado en Bacillus sp. de 30-70°C durante 30 min. (Wang, et. al., 1995) 
y B. thermocatenulatus de 30-55°C durante 30 min. (Schmid-Dannert, et. al., 1998). 
6.1.2 Efecto del pH: 
En la Figura 2, se observa que el pH óptimo promedio en las condiciones de 
ensayo evaluadas es de 8 para el extracto enzimático. Aunque el pH óptimo de una 
enzima depende de varios parámetros experimentales, se han reportado algunos 
valores aproximados para varias lipasas. El pH óptimo reportado a 30°C para la lipasa 
de A. nidulans WG312 es de 6.5 (Mayordomo, et. al., 2000). La mayoría de las lipasas 
de origen fungal presentan un pH óptimo entre 6-7 como ocurre con A. niger 
(Höfelmann, et. al., 1985), R. niveus (Kohno, et. al., 1994), entre otros. Sólo algunas 
lipasas tienen un pH óptimo mayor a 7, entre estas se encuentran G. candidum, 8.5 
(Asahara, et. al., 1993), R. oryzae, 7.5 (Hiol, et. al., 2000), A. terreus, 10 (Raman, et. al., 
1998) y P. expansum, 9 (Stocklein, et. al., 1993). 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 32
4 6 8 10 12
0
20
40
60
80
100
pH
AC
TI
VI
DA
D 
RE
LA
TI
VA
 (%
) pH ÓPTIMO
0
200
400
600
800
ACTIVIDAD RESIDUAL RELATIVA (%
)
 ESTABILIDAD
FIGURA 2.- Efecto del pH sobre la actividad y sobre la estabilidad. La 
determinación se hizo usando el método del pH-stat. 
 
Los efectos del pH sobre la estabilidad de la enzima, se evalúan a temperatura de 
refrigeración (4°C). En la Figura 2 se observa que el extracto enzimático conserva casi 
un 40% de su actividad, durante 12 h a pH 5. Pero después a pH de 10 y 11 pierde 
completamente su actividad. Cabe señalar que en el rango de pH desde 6-9, la enzima 
aparentemente presenta una activación, ya que la actividad aumenta drásticamente, lo 
que se podría explicar por cambios conformacionales ocurridos en estas condiciones. 
Se probaron sustratos con diferente longitud de cadena y grado de saturación. Los 
resultados indican que la enzima de Aspergillus nidulans del extracto no purificado 
hidroliza preferentemente sustratos de cadena corta, mostrando su máxima actividad 
con tributirina (C4:0) (Figura 3). Este tipo de especificidad coincide con lo reportado para 
otras lipasas fungales, principalmente del género Penicillium, como P. candidum 
(Asahara, et. al., 1993). Además se observa que la enzima de A. nidulans, presenta 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 33
mayor afinidad por los ácidos grasos con instauraciones, en el caso de las moléculas 
con 18 átomos de carbono (Figura 4). 
 
 
FIGURA 4.- Especificidad de la enzima del extracto no purificado hacia triglicéridos de 18 
átomos de carbono, con o sin instauraciones. 
 
Triglicérido Actividad especifica (UI/mg proteína) 
Actividad 
Relativa 
(%) 
C4:0 
Tributirina 
1.4428E-02 ± 1.00E-03 100 
C8:0 
Tricaprilina 
2.1287E-03 ± 9.76E-04 14.754 
C16:0 
Tripalmitina 
3.3113E-04 ± 5.20E-05 2.295 
C18:0 
Triestearina 
2.1287E-04 ± 9.89E-04 1.475 
C18:1 
Trioleína 
4.9669E-04 ± 7.81E-04 3.443 
 
FIGURA 3.- Especificidad de la enzima del extracto no purificado hacia triglicéridos, se 
determinó la actividad de la enzima con cada uno de los sustratos, durante 20 min, a 37°C y 
pH 8, con agitación constante. 
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
3 .0
3 .5
4 .0
C1 8 :0 C18 :1
T RIG L IC ÉRIDO
A
C
T
I
V
I
D
A
D
 
R
E
L
A
T
I
V
A
 
(
%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C4:0 C8:0 C16:0 C18:0 C18:1
TRIGLICÉRIDO
A
C
T
I
V
I
D
A
D
 
R
E
L
A
T
I
V
A
 
(
%
)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 34
6.2 Determinación de actividad esterasa. 
Los métodos para evaluar actividad esterasa emplean generalmente sustratos que 
presentan un enlace éster, el que al romperse libera un compuesto colorido, en este 
caso algunos derivados del p-nitrofenol. Por tanto, se determinó la actividad de la 
enzima para el extracto obtenido de una fermentación de medio optimizado para 
actividad lipolítica reportado por Peña (2001). Los resultados obtenidos se muestran en 
la Tabla 12. 
 
Tabla 12.- Actividad del extracto enzimático no purificado usando como sustrato ésteres 
de p-nitrofenol. 
 
Sustrato Actividad Específica (UI/mg) 
p-nitrofenil butirato 91.186 ± 3.150E-01 
p-nitrofenil laurato 80.393 ± 3.808E-01 
p-nitrofenil palmitato 75.148 ± 3.150E-01 
 
La máxima actividad fue obtenida con p-nitrofenil butirato como sustrato, que es el 
de cadena corta, lo que coincide con lo obtenido con el pH-stat. Esto indica que la 
enzima presenta actividad esterasa mayor que la de lipasa, puesto que no corresponde 
al comportamiento típico de las lipasas, que prefieren las cadenas largas (Malcata, et. 
al., 1992). Los resultados obtenidos al emplear la gama de sustratos mostrada aquí 
indican que esta enzima presenta una actividad lipolítica sin una aparente activación 
interfacial (Akoh, et. al., 2002). 
 
RESULTADOSY DISCUSIÓN 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 35
6.3 Actividad proteasa en condiciones de cultivo reportadas para la producción 
de la proteasa y/o esterasa. 
 
En primera instancia se buscó detectar la actividad proteolítica en la cepa, que no 
había sido reportada. Era importante probar diferentes formulaciones de medio pues 
existe una alta variabilidad entre cepas, así como de respuesta a los componentes del 
medio de cultivo. Por ello, se evaluaron en medios sólidos que contenían leche en polvo 
desengrasada en diferentes proporciones, basados en los medios de cultivo descritos 
por Cohen, 1973; Katz, 1996; y Frosco, 1992, diseñados para producción y 
caracterización de proteasas alcalinas en el género Aspergillus. El primer punto a 
evaluar fue la detección cualitativa de actividad proteolítica al generarse halos de 
hidrólisis (Tabla 13), que tienen el aspecto observado en la figura 5 
Tabla 13.- Medios de cultivo sólidos para evaluación cualitativa de proteólisis. 
NOTA: SM: Leche en polvo desengrasada, EL: Extracto de levadura, MM: Medio Mínimo (Käfer, 1977) 
suplementado con elementos traza, sales 20X y requerimientos nutricionales para A. nidulans, GLU: 
Glucosa y MOPT: Medio Optimizado (Peña, 2001). Los asteriscos (**) significa presencia de actividad 
proteolítica. 
 
PRESENCIA DE ACTIVIDAD PROTEASA 
HORAS DE INCUBACIÓN A 37°C MEDIO DE CULTIVO SÓLIDOS 
24 48 
1 0.5%SM+MM+0.5%GLU ** ** 
2 1.0%SM+MM+0.5%GLU ** ** 
3 2.0%SM+MM+0.5%GLU ** ** 
4 1.0% SM+MM+2.0%GLU ---- ---- 
5 0.5%SM+0.5%EL+MM+0.5%GLU ** ** 
6 1.0%SM+0.5%EL+MM+0.5%GLU ** ** 
7 2.0%SM+0.5%EL+MM+0.5%GLU ---- ---- 
8 1.0%SM+0.5%EL+MM+2.0%GLU ---- ---- 
9 1.0%SM+MM+0%GLU ** ** 
10 1.0%SM+MOPT +0%GLU sin aceite de oliva ** ** 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 36
Los resultados presentados en la tabla 13 indican que desde las 24 h puede 
apreciarse la hidrólisis de leche en 7 de las 10 condiciones evaluadas. De las tres 
condiciones en que no se detecta, se identifica claramente que dos de las 
formulaciones contienen los niveles mas elevados de glucosa (2%) no presentan halos, 
independientemente de la presencia de otros componentes en el medio de cultivo, por 
lo que se puede afirmar que existe un fenómeno de represión ejercido por la glucosa. 
La otra condición en la que no se presenta halo es aquélla en la que existe un 
mayor contenido de nitrógeno, debido a la alta proporción de leche y extracto de 
levadura, aunque el nivel de glucosa coincida con otros empleados en este 
experimento. 
Este comportamiento confirma lo reportado por Cohen, 1973, quien indicó que la 
síntesis y secreción de proteasas extracelulares neutras y alcalinas en A. nidulans es 
reprimida en presencia de fuentes de carbono de bajo peso molecular, así como por 
nitrógeno y azufre, ya que la proteasa es formada y liberada cuando el medio es 
deficiente en alguno de estos elementos. 
 
 
 
1% SM + MM + 0% GLU 
48 h a 37 °C (Médio 9) 
1% SM + MM + 0.5% GLU 
48 h a 37 °C (Médio 2) 
1% SM + MM + 2% GLU 
48 h a 37 °C (Médio 4) 
FIGURA 5.- Medios sólidos en los cuales se identifica halos de hidrólisis 
característicos de la actividad proteolítica presente (formulaciones ver tabla 8). 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 37
Es importante destacar que en el medio empleado para la obtención de actividad 
lipolítica se presentan halos de lisis sobre la leche, idénticos a los presentados con los 
sustratos proteicos. Se puede afirmar que el aceite de oliva no interfiere con la 
producción de proteasa. Este resultado apoyará los experimentos que conducirán a la 
determinación cuantitativa, ya que la proteasa se obtendrá en los medios de cultivo que 
probaron ser los óptimos 
Una vez confirmada la presencia de actividad proteolítica en la cepa se procedió a 
cuantificarla por métodos espectrofotométricos. En una primera fase se empleó 
únicamente azocaseína como sustrato, con el objetivo de evaluar si la enzima 
hidrolizaba el sustrato proteico, y como control se evaluó a la Tripsina, a una 
concentración de 3.0 µg/ml. Se llevó a cabo una primera prueba con el medio empleado 
para obtención de lipasas. Con el objetivo de determinar la longitud de onda a la cual 
correspondiera el máximo de absorbancia de la azocaseína se realizó un barrido 
espectral (Espectrofotómetro LamdaBio, Perkin Elmer) que se muestra en la figura 6, 
con un máximo a los 440 nm. En la figura se aprecia también una clara hidrólisis del 
extracto ultrafiltrado sobre el sustrato, si bien es menor que el generado por la tripsina. 
La diferencia en la extensión de la hidrólisis puede deberse a que la tripsina comercial 
tiene un mayor grado de pureza y a diferencias en la cantidad de proteína empleada en 
el ensayo (2614 µg/mL para el extracto de A. nidulans PW1 y 3.0 µg/mL para la 
tripsina). 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 38
 
Una vez determinada la actividad en la cepa y las condiciones de determinación de 
la actividad, se procedió a evaluar la actividad en los diferentes medios de cultivo (27) 
que se muestran en la Tabla 9. 
Los resultados que se presentan en la Tabla 14 indican que la mayor parte de las 
formulaciones evaluadas no tienen actividad proteolítica, pues los valores de 
absorbancia registrados son negativos. Aquéllos que presentan actividad se destacan 
por un sombreado y se puede afirmar que tienen como característica principal la 
ausencia de glucosa. Este resultado coincide con los obtenidos durante la evaluación 
cualitativa, esto es, que la presencia de este componente en el medio de cultivo 
provoca una aparente represión catabólica (Cohen, 1973). Se debe notar que en medio 
sólido no se detectaba represión cuando se empleaba 0.5% de glucosa, que fue la 
razón que llevó a emplear el carbohidrato en este nivel, y cuando se pretende detectar 
la producción en matraz ninguna de las formulaciones que contiene glucosa muestra 
actividad. La diferencia en la respuesta a la concentración de glucosa puede deberse a 
problemas de difusión en sólido o a diferencias fisiológicas en organismos en 
fermentación sólida o líquida, tal como ocurre para la producción de otros metabolitos, 
como el reportado por Assaf (2006) para la producción de metabolitos secundarios por 
Paecilomyces fumosoroseus con acción insecticida, haciendo uso de fermentación 
líquida y sólida, donde se determinó que hay una fuerte relación entre los componentes 
del medio de cultivo y la excreción de metabolitos y enzimas; así también la 
 
Figura 6.- Barrido espectral para la determinación de actividad proteolítica en 
solución de A. nidulans (muestra ultrafiltrada) y tripsina sobre azocaseína. 
380 400 420 440 460 480 500 520 540 5500.04 
0.10 
0.15 
0.20 
0.25 
0.30 
0.35 0.38 
Longitud de onda (nm)
TRIPSINA 
(3µg/mL) 
MUESTRA ULTRAFILTRADA 
A
bs
or
ba
nc
ia
 4
40
 n
m
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 39
disponibilidad de oxígeno, ya que en una fermentación líquida sin limitación de oxígeno 
la producción de metabolitos y el crecimiento de P. fumosoroseus fue mayor que en la 
que limitaron el oxígeno disponible. 
También existe en A. niger grandes diferencias en la producción de enzimas de 
interés comercial que son excretadas al medio y cuya producción es por fermentación 
líquida, donde la cantidad se presenta muy disminuida debido a los fenómenos de 
represión catabólica, esto es principalmente por fuentes de carbono o nitrógeno; para 
las enzimas producidas por fermentación sólida pueden presentar características 
modificadas como un aumento en su termorresistencia, menores tiempos de producción 
y mayor actividad (Romero, 2001). 
La actividad se presentó en ausencia de glucosa, aunque no en todas las 
condiciones. Cuando se emplea leche como fuente de nitrógeno no se permite la 
producción de enzima, independientemente de la concentración a la que se emplea.En 
cambio, cuando se suplementa con bajas concentraciones de extracto de levadura sí se 
detecta la actividad (19), lo que obligaría a explorar el efecto de vitaminas y nucleótidos 
en la producción de la enzima. 
 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 40
Tabla 14.- Medición de actividad proteasa en solución, con azocaseína como sustrato para los medios líquidos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
VARIACIONES EN EL MEDIO OPTIMIZADO POR PEÑA (2001) EN EL QUE HAY 
PRESENCIA DE ALMIDÓN COMO FUENTE DE CARBONO. 
SIN ACEITE DE OLIVA CON ACEITE DE OLIVA 
23 0.5%SM -0.0339 ± 1.8000E-03 26 Medio sin concentrar con membrana YM10 -0.0504 ± 5.5012E-03 
24 1.0%SM -0.0440 ± 3.7687E-03 
25 2.0%SM -0.0506 ± 3.9577E-03 
A Medio concentrado con membrana YM10 0.0551 ± 4.2376E-02 
 
VARIACIONES EN LA FORMULACIÓN DEL MEDIO DE MÍNIMO DE Käfer (1977) 
0 % GLUCOSA 0.5 % GLUCOSA 
1 0.5%SM -0.0480 ± 6.2952E-03 4 0.5%SM -0.0444 ± 5.4280E-03 
2 1.0%SM -0.0296 ± 3.2393E-03 5 1.0%SM -0.0368 ± 1.0147E-02 
3 2.0%SM -0.0274 ± 4.7032E-03 6 2.0%SM -0.0345 ± 1.4058E-02 
7 0.5%PP 0.3437 ± 3.6715E-02 10 0.5%PP -0.0371 ± 7.9994E-03 
8 1.0%PP 0.4511 ± 1.7754E-02 11 1.0%PP -0.0468 ± 4.5709E-03 
9 2.0%PP -0.0366 ± 2.9280E-03 12 2.0%PP -0.0436 ± 2.7135E-03 
13 0.5%Eca 0.2068 ± 5.2716E-03 16 0.5%ECa -0.0377 ± 4.5924E-03 
14 1.0%Eca 0.0131 ± 1.5275E-04 17 1.0%ECa -0.0557 ± 8.9716E-03 
15 2.0%Eca -0.0240 ± 5.2291E-03 18 2.0%ECa -0.0400 ± 1.2456E-02 
19 0.5%SM+0.5%EL 0.0497 ± 5.0501E-03 21 0.5%SM+0.5%EL -0.0515 ± 3.6896E-03 
20 1.0%SM+0.5%EL -0.0536 ± 6.8537E-03 22 1.0%SM+0.5%EL -0.0571 ± 2.6102E-03 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 41
La mejor fuente de nitrógeno resulta ser la proteosa peptona cuando no se usa a 
niveles muy altos, pues tal y como ocurrió con la detección de halos de lisis, altas 
concentraciones de nitrógeno parecen conducir a una represión. La actividad de la 
enzima en presencia de extracto de carne es manera similar: la actividad disminuye a 
medida que éste se incrementa, pero no se obtienen valores tan altos como con 
proteosa peptona. 
En el medio empleado normalmente para producción de lipasas no se detecta 
actividad proteolítica, ni en presencia ni en ausencia de aceite de olivo. Se exploró en 
este último caso la posibilidad de que la proteasa estuviese presente en cantidades 
pequeñas, por lo que el medio extracelular se concentró a través de una membrana de 
ultrafiltración. Como se observa, entonces se detectan niveles de actividad similares a 
los obtenidos con medio que contiene 0.5% de leche adicionado de extracto de 
levadura. Sería de interés concentrar el material extracelular para definir si en otras 
condiciones ocurre lo mismo. 
Se llevó a cabo una segunda prueba, de tipo cualitativo, que permite la detección 
de actividad esterasa en microplacas. El sustrato empleado es α-naftil acetato (Figura 
7). Los resultados indican que no necesariamente hay correspondencia entre la 
actividad proteolítica y la actividad esterasa. En algunos casos (7 y 8), una alta actividad 
proteasa parecería correlacionar inversamente con la actividad esterasa. En este mismo 
sentido se debe resaltar el aspecto de los pozos 7-12, que provienen todos de medio 
con proteosa peptona, pues parecería indicar que esta fuente de nitrógeno reprime o 
afecta negativamente la producción de esterasa. La leche (1-6) parecería ser la mejor 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 42
fuente de nitrógeno para la producción de esterasa. La presencia de glucosa no parece 
afectar negativa o positivamente esta actividad. 
El medio optimizado para lipasas también presenta una alta actividad esterasa; 
por lo que medios que presentaron una fuerte actividad con el α-naftil acetato, así como 
los que dieron valores positivos con azocaseína (Tabla 14), se seleccionaron y al final 
quedaron se evaluaron sólo 12 medios con los otros dos sustratos. 
 
 Bco 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 
 
 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 A 
Figura 7.- Determinación rápida de actividad proteolítica en solución de A. 
nidulans con α-naftil acetato como sustrato. 
 
Esta reducción en el número de muestras a analizar se llevó a cabo porque 
algunas formulaciones produjeron resultados similares, entre las que se encontraban 
grupos que incluían concentraciones crecientes de algún ingrediente, por lo que sólo se 
trabajó con un representante del grupo. Por ejemplo, los medios marcados del 1-6 
presentaron resultados similares tanto para azocaseína y los del α-naftil acetato (Figura 
8), y tienen en común la presencia de leche desengrasada y glucosa a diferentes 
concentraciones, por lo que se optó por evaluar el medio 3; entre los medios 7-12 se 
encuentra que todos tienen proteosa peptona a diferentes concentraciones como fuente 
de nitrógeno, pero en las dos mediciones de actividad presentaron comportamientos 
diferentes, se descartaron los medios con valores parecidos entre sí (entre 7 y 8, sólo 
se evaluó el 8); en el caso del medio 9 mostró mucha actividad con α-naftil acetato y 
poca con azocaseína, lo que hace que este medio sea interesante para estudiar. 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 43
En lo que se refiere a los medios del 10-12 prácticamente no presentaron actividad 
con ninguno de los dos sustratos, esto se pudo deber a que todos tienen una 
concentración del 0.5% de glucosa y posiblemente ésta reprimió la producción de las 
proteasas, por lo que no se evaluaron con los otros sustratos para actividad proteolítica. 
 
Azocaseína 
Colágeno 
Elastina 
α-Naftil 
acetato 
p-nitrofenol 
laurato 
 Blanco 3 8 9 13 14 15 18 19 22 23 26 A 
Figura 8.- Panel de determinaciones de actividad proteolítica en solución de A. 
nidulans con diferentes sustratos. 
 
Entre los medios de 13-18, se seleccionaron los medios 13, 14, 15 y 18, debido a 
que los tres primeros presentaban comportamientos diferentes con ambos sustratos, 
tienen en común en su formulación extracto de carne, pero en diferente concentración. 
Los resultados indican que disminuye la actividad al incrementar la fuente de nitrógeno. 
Los medios 16,17 18 tienen 0.5% de glucosa, por lo que sólo se evaluó el último. 
Para el resto de los medios se consideró que los medios 19 y 20 o 21 y 22 difieren en 
concentración de leche desengrasada y contienen 0% y 0.5% de glucosa 
respectivamente, y por el fenómeno de represión sólo se evaluaron los que no tienen 
glucosa. Entre los medios 23, 24 y 25, que son medios optimizados sin glucosa y aceite 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Ballesteros Ramírez Norma Elizabeth 44
de oliva, y que además lo que los hace diferentes es que tienen 0.5%, 1.0% y 2.0% se 
evaluó el de menor concentración de leche desengrasada. 
Los medios 26 y A difieren en que el medio extracelular de este último está 
concentrado por ultrafiltración, por lo que se evaluó éste para determinar si la 
concentración es un factor que influye en la cuantificación de actividad proteasa. 
Los valores de actividad obtenidos con los otros dos sustratos se muestran en la 
tabla 15. Los resultados reflejan una similitud entre los valores obtenidos con la 
determinación empleando como sustrato azocaseína y los obtenidos con colágeno. Esto 
indica que estos dos sustratos permiten evaluar actividad proteasas en general, 
mientras que la elastina identifica una actividad que muestra mayor especificidad por 
ciertos enlaces peptídicos (elastasa), aunque los valores más altos también coinciden 
con los otros dos sustratos, lo que nos da indicios que hay más de una enzima 
responsable de la actividad proteolítica. También es importante que el crecimiento del 
hongo y la presencia de actividad no tienen correlación, por lo que aún si hay poco 
crecimiento puede conducir a la obtención de una