Caracterizacion-funcional-de-la-prostaglandina-reductasa-1-en-el-desarrollo-de-cancer-hepatico

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS 
FACULTAD DE MEDICINA 
 
 
Caracterización funcional de la Prostaglandina reductasa 1 en el desarrollo de 
cáncer hepático 
 
 
TESIS 
 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE 
DOCTOR EN CIENCIAS 
 
 
PRESENTA 
RICARDO SÁNCHEZ RODRÍGUEZ 
 
 
TUTOR PRINCIPAL 
Dr. Julio Isael Pérez Carreón 
Facultad de Medicina 
 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR 
Dra. Victoria Chagoya Hazas 
Instituto de Fisiología Celular 
 
Dr. Emilio Rojas del Castillo 
Instituto de Investigaciones Biomédicas 
 
México D.F. Diciembre 2016 
 
	
	
	
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO 
 
Presidente: Dr. Alfonso Dueñas González 
Secretario: Dr. Julio Isael Pérez Carreón 
Vocal: Dr. Rogelio Enrique Hernández Pando 
Vocal: Dra. Isabel Cristina Méndez Hernández 
Vocal: Dr. Joselín Hernández Ruiz 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL PROYECTO: 
Instituto Nacional de Medicina Genómica, INMEGEN. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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“El amor se hace más grande 
y noble en la calamidad” 
-Gabriel García Márquez- 
El amor en los tiempos del cólera. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Dedicatoria 
 
 
A mi hermana Leticia Sánchez Rodríguez por todo su apoyo, amor y 
comprensión. 
 
 
A mi cuñado Luis Alberto Flores y sobrino Luis Ángel Flores por ser siempre 
una familia con quien contar. 
 
 
A mi abuelita Hermelinda Ortiz y toda mi familia por su entusiasmo y afecto. 
 
 
A la Dra. Julia E. Torres Mena, Dra. Valeria Quintanar y Biol. María Paulette 
Castro Gil por brindarme su amistad y sabiduría. 
 
 
A mis amigos, M.C. Diana Tapia y QFB. David López. 
 
 
A Diana Ortiz por todo su amor, paciencia y cariño, Gracias por todo tu 
apoyo, por ser fuente de inspiración y de nuevas aventuras en este viaje 
llamado vida, mi dicha y mi felicidad, gracias por ser simplemente tú. 
Te amo 
 
 
De todo corazón a todos ¡Mil gracias! 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Agradecimientos 
 
 
 
A Dios quien siempre busca como encontrarnos. 
 
 
A mi familia por su apoyo incondicional. 
 
 
Al Dr. Julio Isael Pérez Carreón por todas las oportunidades brindadas 
durante mi formación académica. 
 
 
A mis sinodales quienes revisaron y aprobaron oportunamente esta tesis. 
 
 
Al personal de las Unidades de Alta Tecnología del INMEGEN. 
 
 
A mis compañeros de laboratorio y cada una de las personas que hicieron 
posible culminar este trabajo. 
 
 
A CONACYT por el financiamiento No. 421197 otorgado durante estos 
estudios realizados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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ÍNDICE 
INTRODUCCIÓN	..........................................................................................................................	7	
MARCO TEÓRICO	......................................................................................................................	9	
Carcinogénesis y cáncer	..................................................................................................................	9	
Anatomía y función del hígado	...................................................................................................	11	
Hepatocarcinogénesis	....................................................................................................................	13	
Epidemiología del Carcinoma hepatocelular	........................................................................	14	
Modelos de hepatocarcinogénesis	...........................................................................................	16	
Mecanismo de acción de los carcinógenos; DEN y 2-AAF	.............................................	17	
Especies reactivas	...........................................................................................................................	18	
Estrés oxidante	..................................................................................................................................	19	
Señalización celular y estado redox	.........................................................................................	19	
Respuesta antioxidante	.................................................................................................................	20	
Prostaglandina reductasa 1	.........................................................................................................	22	
OBJETIVOS	................................................................................................................................	25	
HIPÓTESIS..................................................................................................................................	25	
METODOLOGÍA	........................................................................................................................	25	
Modelos animales de hepatocarcinogénesis química	......................................................	25	
Muestras clínicas de Carcinoma Hepatocelular	..................................................................	26	
Inmunohistoquímica PTGR1 y Glipican-3	..............................................................................	26	
Análisis bioinformático de la región promotora del gen Ptgr1	.....................................	27	
Inmunoprecipitación de cromatina	...........................................................................................	27	
qPCR tiempo real	..............................................................................................................................	28	
Ensayo de retardamiento de la movilidad electroforética (EMSA)	..............................	29	
Inmunofluorescencia acoplada a histoquímica para GGT	..............................................	30	
Extracción de RNA y formación de cDNA	..............................................................................	31	
Extracción y cuantificación de proteína	..................................................................................	32	
Purificación de fracciones nucleares y citoplasmáticas.	................................................	33	
Inmunodetección mediante Western Blot	..............................................................................	33	
Lipoperoxidación	..............................................................................................................................	34	
Cuantificación de Glutatión	..........................................................................................................	34	
Activación de NRF2 y expresión de PTGR1 en células epiteliales hepáticas.	........	35	
Clonación de PTGR1	.......................................................................................................................	35	
Transfección y generación de células estables C9-PTGR1	............................................	37	
Ensayo de viabilidad celular por exposición a estrés oxidante.	...................................	38	
Curva de crecimiento	......................................................................................................................	38	
Ensayo de incorporación de BrdU	............................................................................................	38	
Determinación de actividad de Caspasa 3	.............................................................................39	
Ensayo de TUNEL	.............................................................................................................................	39	
Análisis estadístico.	........................................................................................................................	39	
CONCLUSIONES	......................................................................................................................	65	
PERSPECTIVAS	.......................................................................................................................	65	
REFERENCIAS	..........................................................................................................................	67	
	
	 7	
INTRODUCCIÓN 
	 El carcinoma hepatocelular (CHC) es el quinto tipo de cáncer más frecuente 
y la segunda causa de muerte por tumores malignos a nivel mundial. Su tiempo de 
desarrollo va de 5 a 30 años, debido a que es una enfermedad con múltiples etapas 
que generalmente involucran el daño crónico del hígado. La exposición a los 
factores de riesgo lleva a la transformación de células a CHC. El CHC generalmente 
cursa con otra patología, la cirrosis, dentro de los factores de riesgo en los seres 
humanos para el desarrollo de cirrosis y CHC se encuentran las infecciones crónicas 
por virus de hepatitis B y hepatitis C, consumo crónico de alcohol, la exposición a 
aflatoxinas, enfermedades como la hemocromatosis y enfermedades metabólicas 
como el hígado graso, contribuyen al daño crónico del hígado. Cada uno de los 
factores de riesgo a pesar de ser de diferente naturaleza, mediante mecanismos 
diferentes convergen en la generación de estrés oxidativo que induce daño al 
hígado y muerte celular, lo que favorece el desarrollo de la cirrosis y el CHC. Al igual 
que otros tipos de cáncer el CHC presenta características como: mantenimiento de 
señales proliferativas, evasión de la muerte celular, evasión de supresores de 
crecimiento, angiogénesis, invasión y metástasis. 
 Una de las formas de abordar el estudio del CHC es mediante modelos 
animales, los cuales permiten recrear el complejo desarrollo de la carcinogénesis 
hepática y dar seguimiento desde las etapas iniciales del mismo, lo que permite 
obtener información de mecanismos moleculares, celulares y fisiológicos del CHC. 
En la presente tesis se emplean dos modelos de hepatocarcinogénesis en ratas; el 
modelo de Solt y Farber (S&F), el cual genera cronológicamente el proceso de 
iniciación, promoción y progresión (displasia a neoplasia) sin cirrosis en 9 meses, 
mientras que el modelo descrito por Schiffer (DEN) induce CHC asincrónico 
asociado a cirrosis. 
 Nuestro grupo de investigación describió la presencia de la enzima 
Prostaglandina reductasa 1 (PTGR1) únicamente en tumores hepáticos 
provenientes del modelo S&F, mediante espectrometría de masas MALDI-TOF-
TOF. La enzima PTGR1 se conforma como homodímero cuyo monómero tiene un 
peso molecular de 33 kDa, la cual posee actividad alquenal/ona oxido reductasa y 
se encuentra involucrada en el catabolismo de eicosanoides y productos de 
lipoperoxidación como el 4-Hidroxinonenal (4-HNE). Nosotros en este trabajo de 
tesis, reportamos la sobreexpresión de Ptgr1 en carcinoma hepatocelular de origen 
humano y experimental, estudiamos la regulación de la expresión de Ptgr1 a nivel 
de factores de transcripción, analizamos parámetros de la respuesta antioxidante 
como la lipoperoxidación y balance de glutatión, así como el efecto de la 
sobreexpresión de PTGR1 en la proliferación celular y la resistencia al estrés 
oxidante en cultivo celular. 
 Nuestro estudio encontró que la Ptgr1 es sobreexpresada desde focos de 
hepatocitos alterados en etapas tempranas de la carcinogénesis hasta los tumores, 
esta sobreexpresión está regulada por el factor de transcripción NRF2 por su unión 
en el DNA a un elemento de respuesta antioxidante a -653 pb del primer exón del 
gen Ptgr1 de rata. La activación de NRF2 lleva a la expresión de proteínas de la 
respuesta antioxidante como GCLC, NQO1 y GSTP1, que en conjunto podrían ser 
las responsables de provocar un incremento de glutatión y el predominio de la forma 
	 8	
reducida (GSH) que en general conduce a un estado celular reducido que llevaría a 
una alta tasa de proliferación celular en los tumores experimentales. De hecho, la 
sobreexpresión exclusiva de PTGR1 en células epiteliales hepáticas redujo el 
tiempo de proliferación y protege de la muerte celular inducida por especies 
reactivas como el peróxido de hidrógeno y el 4-HNE, esto fue consistente con la 
colocalización de PTGR1 con aductos de proteínas de 4-HNE en los tumores 
inducidos experimentalmente. Estos resultados sugieren que PTGR1 y la respuesta 
antioxidante, son una adaptación metabólica que puede contribuir a la proliferación 
y evasión de la muerte celular en células tumorales del hígado, sin embargo, Ptgr1 
podría ser usada para el diagnóstico oportuno o el diseño de terapias dirigidas al 
CHC por fármacos activados mediante bioreducción usando la actividad de PTGR1. 
	 	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
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MARCO TEÓRICO 
Carcinogénesis y cáncer 
La carcinogénesis es el proceso o la vía por la cual se desarrolla el cáncer. 
Mientras que este, también llamado neoplasia o tumor maligno, se refiere a un 
término genérico para definir a un conjunto de enfermedades cuya principal 
característica es la generación rápida de células, que crecen más allá de sus límites 
y por tanto pueden invadir y propagar otras partes del cuerpo, fenómeno 
denominado como metástasis, la cual es la principal causa de muerte por cáncer1. 
Si bien el crecimiento acelerado y la metástasis son características fundamentales 
del cáncer, no son las únicas por lo que Hanahan y Weinberg han propuesto las 
alteraciones fisiológicas en las células tumorales conocidas como hallmarks del 
cáncer2, y también son estudiadas durante el proceso de carcinogénesis para saber 
el momento de su aparición, su regulación o si estas son limitantes para el 
establecimiento del tumor; son diez los hallmarks del cáncer y se describen a 
continuación. 
1) Autosuficiencia en las señales de crecimiento: Las células normales 
requieren de diversas señales para entrar en su ciclo proliferativo, sin embargo, las 
células tumorales adaptan su señalización celular para proliferar, la cual puede ir 
desde la producción de sus propios factores de crecimiento, incremento en el 
número de receptores, estimulación de células aledañas para la producción de 
factores de crecimiento, pérdida de contacto con matriz extracelular y de célula-
célula2-4. 
2) Evasión de supresores de crecimiento: Es una característica relacionada a 
las señales de crecimiento para mantener la homeostasis replicativa en las células 
normales, pero las células de los tumores inactivan este tipo de señales, las más 
estudiadas son las señalizaciones por el Factor de crecimiento tumoral beta (TGFb), 
los supresores de tumor p53 y Rb, ya sea por mecanismos genéticos o epigenéticos, 
pero también por la pérdida de inhibición por contacto2,5,6. 
3) Evasión de la muerte celular: La capacidad de expansión de las células 
tumorales no está dado únicamente por su proliferación celular, también por la tasa 
de muerte, donde las células tumorales tienen la característica de regular para 
inhibir esta, ya sea por la sobreexpresión de proteínas antiapoptóticas, 
subexpresión de proteínas proapotóticas, perdida de p53 o redireccionarla a otro 
tipo de respuesta fisiológica que favorece el desarrollo tumoral como la autofagia y 
la necrosis, que favorecen la sobrevivencia de las células tumorales y promoción 
del tumor2,7,8. 
4) Potencial de replicación ilimitado: Las células normales tienen un número 
limitado de divisiones, el cual está relacionado a la senescencia celular, al 
acortamiento del telómero y a la inestabilidad cromosómica. Las células tumorales 
	 10	
adaptan la reactivación o sobreexpresión dela proteína telomerasa (TERT), que 
permite incrementar el número de ciclos replicativos y evadir la senesencia2,9 
5) Capacidad de angiogénesis: Para la sobrevivencia de las células tumorales 
se requieren ser abastecidas de nutrientes y oxígeno, los cuales son transportados 
por la sangre y para ello se requiere la formación de vasos sanguíneos como 
respuesta de las células a estados de hipoxia por el crecimiento tumoral, siendo el 
Factor de Crecimiento de Endotelio Vascular (VEGF) el más potente angiogénico 
en los tumores, adicionalmente se ha descrito la participación de células de origen 
de la medula ósea y del sistema inmune2,10. 
6) Invasión y metástasis: Esta condición se presenta en los diferentes tipos de 
cáncer como consecuencia de la progresión tumoral y es la responsable del 90% 
de las muertes por neoplasias. Para que se lleve a cabo se requieren cambios a 
nivel bioquímico y genético que involucran cambios en la interacción de las células 
con su microambiente, ya que las células tumorales suelen activar proteasas 
extracelulares. Esta capacidad genera que se formen colonias de células malignas 
de forma adyacente en un tejido, incluso realizar metástasis, donde las células 
malignas viajan por fluidos como sangre y linfa, para ello se ha descrito la necesidad 
de la transición epitelial-mesénquimal2,11. 
7) Evasión de la respuesta inmune: En los tumores se ha demostrado la 
presencia de infiltrado de células del sistema inmune, donde se reconocen células 
transformadas y las destruyen. Sin embargo, las células neoplásicas evaden al 
sistema por la secreción de TGFb, además de reclutar otro tipo de células del 
sistema inmune que favorecen el desarrollo tumoral2. 
8) La inflamación como promotor del cáncer: Dentro de los tumores, los 
investigadores han encontrado la presencia de infiltrado celular del sistema inmune, 
además de liberarse diferentes citocinas proinflamatorias como interleucinas; la 
presencia de inflamación beneficia la presencia de especies reactivas de oxígeno 
(ROS) favoreciendo la presencia de mutaciones y la promoción tumoral2,12. 
9) Inestabilidad genómica y mutaciones: Las células tumorales presentan a lo 
largo de su genoma modificaciones, ya sea en el número de copias, perdida de 
genes, fusiones, translocaciones y mutaciones, generadas directamente por el 
proceso de carcinogénesis o bien por el propio metabolismo celular, que confieren 
nuevas capacidades a las células2. 
10) Reprogramación energética: Bajo las condiciones de estrés que son 
sometidas las células tumorales, como ROS, inflamación, hipoxia y concentraciones 
de glucosa, se ha propuesto la adaptación de las células neoplásicas para obtener 
energía como el efecto Warburg, el uso de lactato en el ciclo de Krebs y la 
sobreexpresión de transportadores de glucosa, lo cual más recientemente se ha 
llamado reprogramación metabólica2,13. 
Las características anteriores reflejan una visión más holística de las 
características del tumor, donde no solo involucra a células transformadas, sino 
	 11	
también componentes de matriz extracelular y células no-parénquimales; 
generando un microambiente celular donde diversos factores fisiológicos y tisulares 
intervienen en el desarrollo de los tumores. 
Para el proceso de carcinogénesis, se han descrito diferentes modelos de los 
cuales 5 actualmente son los más aceptados y están estrechamente relacionados 
a los factores de riesgo para desarrollar cáncer: 1) El modelo de mutaciones se 
enfoca más a los factores de riesgo, como son exposición a carcinógenos químicos, 
infecciones crónicas por virus de hepatitis B y C, virus de papiloma humano, 
consumo de tabaco, alcohol, y exposición a radiación ionizante; este modelo 
involucra un proceso múltipasos que va desde la iniciación (exposición al 
carcinógeno), promoción (expansión de la célula transformada) y la progresión 
(adquisición de nuevas mutaciones). 2) El modelo de inestabilidad cromosómica se 
ajusta a los cánceres familiares siendo la hipótesis de Knudson o de los dos hits, la 
más representativa para retinoblastoma. 3) El modelo no genotóxico se emplea para 
explicar los cánceres asociados a mecanismos epigenéticos, principalmente por la 
vía de los folatos, por factores de riesgo como uso de hormonas o la dieta. 4) El 
modelo Darwiniano, explica los fenómenos observados en los tumores en la 
resistencia a quimioterapia y la recurrencia, como son la expansión clonal y la 
selección. 5) El modelo de organización de tejido, incluye la participación del 
microambiente tumoral14-16. 
Una vez establecido el cáncer, se agrupan de acuerdo a la clasificación 
internacional estándar por el tipo de tejido donde es originado o clasificación 
histológica, teniendo seis categorías: Carcinomas, Sarcomas, Mielomas, 
Leucemias, Linfomas y Mixtos. El carcinoma se refiere a los cánceres de origen 
epitelial, representan el 90% de los tipos de tumores, y a su vez pueden dividirse en 
adenocarcinoma, si se origina en una glándula u órgano, y carcinoma de células 
escamosas, si se origina en el epitelio escamoso. Los sarcomas se refieren a los 
tumores originados en el tejido mesénquimal, es decir, en tejido conectivo y de 
soporte de los órganos. El mieloma es un cáncer que se origina en las células 
plasmáticas de la medula ósea, mientras que las leucemias son cánceres de la 
medula ósea. Los linfomas se desarrollan en las glándulas o nódulos del sistema 
linfático. Los tumores mixtos son aquellos que no pueden agruparse en una sola 
categoría anterior17. 
 
Anatomía y función del hígado 
El hígado es el segundo órgano más grande del cuerpo humano con un peso 
de 1.4 a 1.7 Kg y se localiza en el cuadrante superior derecho del abdomen, tiene 
una forma semiovoide y recibe el 20% de irrigación de la arteria hepática y el 80% 
de la vena porta18,19. 
El hígado tiene la capacidad de realizar múltiples funciones vitales para el 
organismo, como lo son el metabolismo de carbohidratos y aminoácidos, formación 
	 12	
de urea y sales biliares, síntesis de colesterol, ácidos grasos y cuerpos cetónicos, 
síntesis e inactivación de hormonas, síntesis y degradación de componentes de 
matriz extracelular, reserva de sangre y regulación de pH sanguíneo, presentación 
de antígeno a linfocitos, síntesis de proteínas de fase aguda, función 
hematopoyética en etapas fetales y metabolismo de xenobióticos19. 
 El 80% de las células que componen al hígado son los hepatocitos, que son 
células con un diámetro promedio de 20 um y son las responsables de las funciones 
metabólicas del hígado y la secreción de bilis. Las células no parénquimales del 
tejido hepático son: Células del endotelio sinusoidal, las cuales regulan el flujo y 
comunicación entre hepatocitos y el sinusoide, su principal característica es la falta 
de membrana basal y ser altamente fenestradas. Células de Kupffer, localizadas en 
el endotelio sinusoidal son macrófagos residentes del tejido hepático y principal 
sistema de respuesta inmunológica de este órgano. Células estelares o células de 
Ito, se encuentran en el espacio de Disse y en estado de salud almacenan ácido 
retinoico, pero por daño al tejido hepático y señalización por TGF son activadas a 
miofibroblastos, responsables del proceso de fibrogénesis en el hígado. Células 
troncales hepáticas o células ovales, son células pluripotentes capaces de 
diferenciarse a hepatocitos o colangiocitos, localizadas en el canal de Hering. 
Células de Pit, son linfocitos granulares que tienen una función similar a las células 
NK. Colangiocitos o células del conducto biliar, responsables de la formación del 
epitelio del conducto biliar18,20. 
 La unidad estructural es el lobulillo hepático, el cual es caracterizado por la 
presencia de una vena hepática central y cordones de hepatocitos que se 
estructuran de forma radial formando un hexágono, del cual en cada vértice se 
encuentran los tractos portales formados por la arteria hepática, vena porta y 
conductos biliares (Figura 1). Mientras quela unidad funcional o de microcirculación 
hepática llamada acino, el cual se forma por el alineamiento de los hepatocitos 
alrededor de vénulas y arteriolas hepáticas de forma elipsoidal, el acino se divide 
en 3 zonas de acuerdo al nivel de oxigenación de la sangre: la zona 1 (periportal) 
corresponde a la zona cercana a la arteria hepática y es sangre rica en oxígeno, la 
zona 2 o zona de transición donde la concentración de oxígeno en la sangre está 
disminuida, mientras que la zona 3 cercana a la vena central es pobre en 
oxigeno18,20,21 (Figura 1). 
 
 
 
 
 
 
	 13	
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Hepatocarcinogénesis 
Los tipos de cáncer de hígado más frecuentes son el carcinoma hepatocelular 
(CHC), el colangiocarcinoma y el angiosarcoma hepático dependiendo el tipo celular 
que de origen a los tumores. El CHC representa el 90% de estos cánceres y 
presenta una gran heterogeneidad fenotípica y molecular22,23, debido a la gran 
variedad de factores de riesgo para desarrollar CHC que incluyen la infección por el 
virus de hepatitis B (HBV) y hepatitis C (HCV), cirrosis alcohólica, síndrome 
metabólico, cirrosis biliar, lesión hepática crónica, hemocromatosis y consumo de 
alimentos contaminados con aflatoxina B124. 
El proceso de carcinogénesis de CHC, es un proceso de múltiples etapas 
que van desde la exposición crónica del factor de riesgo, los cuales convergen en 
el desarrollo de cirrosis, de hecho el 85% de los casos de CHC se desarrolla en 
presencia de cirrosis, hasta la progresión de la enfermedad a la formación de 
nódulos hiperplásicos, nódulos displásicos y diferentes grados de CHC según su 
tiempo de progresión, como tempranos, intermedios y avanzados, lo cual el tiempo 
del proceso de hepatocarcinogénesis puede llevar un tiempo de 5 a 30 años23,24. 
El CHC pese a tener diferentes factores etiológicos todos convergen en la 
presencia de estrés oxidante hasta el desarrollo del cáncer, de hecho se ha 
considerado que la presencia de estrés oxidante es importante en la etapa de 
iniciación y promoción de la carcinogénesis25. Las infecciones crónicas por HBV 
generan especies reactivas incrementando la permeabilidad de la membrana 
mitocondrial en los canales iónicos dependientes de voltaje por la proteína X del 
virus, también la proteína X altera la señalización de calcio y la lipoperoxidación de 
lípidos al activar la vía SeP, adicionalmente los pacientes con infecciones crónicas 
presentan bajos niveles en la actividad de proteínas antioxidantes como la catalasa 
(CAT) y superóxido dismutasa (SOD), además presentan cambios en las proteínas 
de la familia del citocromo P450, capaces de producir especies reactivas de oxigeno 
(ROS), principalmente CYP2E1 que participa en el metabolismo del alcohol etílico 
Figura	1.	Representación	de	la	unidad	
estructural	(lobulillo)	y	funcional	
(acino)	del	hígado.	
	 14	
y carcinógenos como la dietilnitrosamina26. Las infecciones crónicas por HCV, 
generan estrés oxidante por la influencia de la proteína viral NS3, que favorece la 
secreción de citocinas proinflamatorias y el estallido respiratorio de las células de 
Kupffer, adicionalmente se ha observado en los pacientes con HCV la alteración del 
metabolismo de hierro, pudiendo este contribuir a la generación de ROS por la 
reacción de Fenton, que consiste en la reacción de Fe2+ con H2O2 formando 
radicales hidroxilo27, un mecanismo similar se ha sugerido para el caso de la 
hemocromatosis y la acumulación de hierro en el tejido hepático. 
En el caso del alcohol, el mecanismo que genera ROS involucra su 
metabolismo por la CYP2E1, asimismo genera inflamación, lo que activa la 
respuesta inmune mediada por las células de Kupffer además el intermediario de 
su metabolismo, acetaldehído, es mutagénico e induce lipoperoxidación28. La 
aflatoxina B1 su mecanismo principal para generar cáncer es su alta capacidad 
mutagénica, sin embargo, debe ser metabolizada por los CYP1A2 y CYP3A4 dónde 
también puede generarse ROS, además de favorecer la disminución del cofactor 
antioxidante NADPH29. 
A pesar de los avances en el diagnóstico y tratamiento del cáncer en lo 
general, para el CHC el pronóstico es desfavorable, con una esperanza de vida 
menor del 5% debido a la falta de un diagnóstico temprano y el impedimento de usar 
quimioterapéuticos. En la actualidad existe un algoritmo empleado para la decisión 
del tratamiento del CHC; para un nódulo menor a 2 cm in situ, puede ser tratado con 
una resección quirúrgica, de 1 a 3 nódulos menores a 3 cm se puede manejar con 
un tratamiento de inyecciones percutáneas de etanol o mediante ablación por 
radiofrecuencia, para ambos casos el tratamiento es potencialmente curativo. Para 
el caso de estados intermedio o avanzado de CHC, únicamente se cuenta con la 
quimioembolización y tratamiento con Sorafenib (fármaco inhibidor de ciertas 
cinasas), los cuales únicamente son considerados paliativos30. 
 
Epidemiología del Carcinoma hepatocelular 
El CHC es el quinto tipo de cáncer más frecuente y la segunda causa de 
muerte por tumores malignos a nivel mundial, presentando una relación de 
mortalidad/incidencia de 0.95 denotando el pobre pronóstico de sobrevivencia de 
los pacientes con este tipo de cáncer31, adicionalmente la epidemiología ha 
mostrado una tendencia a incrementar el número de casos principalmente en Asia, 
Oceanía y América32. 
 Cerca del 80% de los casos de CHC ocurren en el Este de Asia y el África 
Subsahariana (Figura 2), siendo diferentes los factores que lo causan, en Asia está 
relacionado al elevado número de casos de infecciones con virus de hepatitis. Las 
infecciones crónicas por virus de hepatitis B y C son responsables del 5% de los 
casos de cáncer en el mundo33, mientras que en África se asocia a zonas rurales 
con alimentos contaminados con aflatoxinas24,31. 
	 15	
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 En el caso de México, el CHC representa el séptimo tipo de cáncer más 
común y siendo el tercero más mortal a nivel nacional, tanto en hombres como en 
mujeres (Figura 3), siendo las entidades de Veracruz, San Luis Potosí, Oaxaca, 
Tabasco y Yucatán los que concentran la mayor tasa de incidencia y mortalidad, 
además las estadísticas muestran prospectivamente una tendencia a incrementar 
el número de casos en los próximos años34,35. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
	 	
Figura	2.	Mapa	de	estandarizadas	de	incidencia	de	CHC	por	edad.	(Tomado	de:	
GLOBOCAN	2008	v2.0,	Cancer	incidence	and	mortality	worldwide:	IARC	Cancer-Base	
No.	10.	Lyon	(France):	International	Agency	for	Research	on	Cancer;	2010).	
Figura	3.Tasas	estimadas	de	incidencia	y	mortalidad	en	
México.	Ambos	sexos	por	100,000	habitantes.	(Tomado	
de:	GLOBOCAN,	2012	Agencia	Internacional	para	la	
Investigación	sobre	el	Cáncer	(IARC)	
http://globocan.iarc.fr/Default.aspx)	
	 16	
Modelos de hepatocarcinogénesis 
 Las etapas pre-tumorales del CHC en los seres humanos están 
caracterizadas por la presencia de lesiones, denominadas nódulos displásicos, cuya 
investigación es importante para la identificación de tumores tempranos y diseñar 
estrategias preventivas para el desarrollo de la enfermedad, sin embargo, los 
nódulos son difíciles de identificar debido a su tamaño, por lo que su detección es 
incidental; además de coexistir con otras patologías y el tiempo de desarrollo de 5 
a 30 años complican el diagnóstico oportuno36. 
 Una de las formas de abordar el estudio de esta patología, aprovechando 
ventajas experimentales, es mediante modelos animales, los cuales permiten 
recrear el complejo desarrollo de la carcinogénesis hepática in vivo y dar 
seguimiento desde las etapas iniciales del mismo. Los modelos animales han 
contribuido para caracterizar las etapas de iniciación, promoción, progresión y 
permiten obtener información sobre los mecanismos moleculares, celulares y 
fisiopatológicos del CHC37. Existe una amplia variedad de modelos animales para 
estudiar el CHC, por ejemplo: Modelos de implantación, que permiten el estudio de 
fármacos antineoplásicos.Modelos genéticamente modificados como los 
transgénicos o knockout, estos modelos permiten investigar el papel específico de 
un gen en el desarrollo del cáncer. Modelos virales de CHC empleados para explicar 
el mecanismo de carcinogénesis por virus de hepatitis. Modelos de dieta deficiente 
en folatos, metionina y colina para el estudio del papel de la alimentación y la 
epigenética en el desarrollo del CHC y los modelos de inducción con carcinógenos 
químicos, permiten entender como agentes externos contribuyen al desarrollo del 
cáncer37-40. 
 Dentro de los modelos de inducción por carcinógenos químicos, el más 
empleado consiste en la administración del carcinógeno Dietilnitrosamina, el uso de 
este presenta la ventaja que puede ser empleado en animales de diferentes 
orígenes genéticos, induce una alta incidencia de CHC, es altamente reproducible, 
además de permitir recapitular el proceso de carcinogénesis desde la iniciación 
hasta la progresión incluyendo el fenómeno de metástasis, también permite recrear 
el proceso inflamatorio similar a la hepatitis y favorecer la activación de células de 
Kupffer40. Dos de los modelos más estudiados que emplean Dietilnitrosamina, son 
el descrito por Solt y Farber (S&F) o modelos del hepatocito resistente41 y el modelo 
de Schiffer (DEN)42. 
 El modelo Schiffer consiste en la administración de Dietilnitrosamina 50 
mg/kg una vez por semana durante 16 semanas, esto permite recapitular un 
proceso crónico similar al ser humano ya que de 12 a 16 semanas de tratamiento 
se produce un hígado cirrótico, mientras que desde la semana 16 se presenta el 
CHC multinodular en el hígado cirrótico. Así ́en el modelo en pocas semanas se 
generan patologías que en el ser humano ocurren en decenas de años42. 
	 17	
 El modelo S&F considera las etapas de iniciación, promoción y progresión, 
este modelo consiste en la administración de una dosis necrogénica de 200 mg/kg 
de dietilnitrosamina vía intraperitoneal, con una posterior administración de 2-
acetilaminofluoreno (2-AAF) 25 mg/kg por día, vía oral; al día 7, 8 y 9, con una 
posterior hepatectomía parcial36, este modelo permite recrear de forma secuencial 
la formación de lesiones preneoplásicas hasta tumores en 12 meses sin el 
desarrollo de fibrogénesis ni cirrosis41, sin embargo, se ha descrito que cerca del 
80% de los genes desregulados en este modelo se comparten con los tumores de 
CHC de origen humano43. 
 
	 Mecanismo de acción de los carcinógenos; Dietilnitrosamina y 2-AAF 
 La Dietilnitrosamina, es un agente alquilante capaz de formar enlaces 
covalentes con las bases nitrogenadas, formando etil-aductos, principalmente en el 
Nitrógeno 7 de la Guanina, el Oxígeno 2 de la Timina44 y la oxidación de grupos tiol 
en las proteínas45, para que la Dietilnitrosamina lleve a cabo su efecto 
carcinogénico, requiere ser biotransformada por la hidroxilación del grupo etilo, 
mecanismo que lo realiza las monooxigenasas P450, principalmente CYP2A3 y 
CYP2E1, lo que genera la liberación de un carbocatión (etilcarbonio) y ROS 
altamente reactivas con las biomoléculas, adicionalmente se ha descrito otro 
proceso de bioactivación que involucra la acción de N-acetiltransferasas u O-
acetiltransferasas, los cuales también forman una especie altamente reactiva44,46 
(Figura 4). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura	4.	Mecanismos	de	activación	de	Dietilnitrosamina.	El	metabolismo	de	
Dietilnitrosamina	por	CYP450,	N-acetiltransferasas	y	O-acetiltransferasas,	
generan	un	etilcarbonio	y	Especies	Reactivas	de	Oxígeno	(ROS)	capaces	de	
reaccionar	con	el	DNA.	Editado	de	Aiub	et	al.	2006	.	
	 18	
 El 2-AAF es considerado un carcinógeno debido a que su metabolismo por 
el CYP450, primordialmente por CYP1A1 y CYP1A2 genera ROS, además de un 
intermediario hidroxiacetilaminofluoreno capaz de reaccionar con el DNA, 
principalmente formando N-Deoxiguanosina-8-il-2-aminofluoreno47, sin embargo, la 
formación de estos aductos no presentan efectos adversos en hígado48 (Figura 5), 
al 2-AAF se le ha asociado inhibir el ciclo celular de hepatocitos maduros pero no 
en células ovales ni colangiocitos, debido a la ausencia de CYP450 en estas células, 
el mecanismo por el cual se ha explicado este fenómeno involucra la acumulación 
de cliclina D1-CDK4, la inhibición de la translocación al núcleo de CDK2, el aumento 
del nivel nuclear de p53, la disminución de ciclina E y E2F. Adicionalmente, se ha 
reportado que el 2-AAF induce cambios en los patrones epigenéticos en la 
trimetilación de la lisina 9 y 27 de la Histona 3 (H3), principalmente en genes 
supresores de tumor como Rassf1 y p1649-51. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
	 Especies reactivas 
 Las especies reactivas son moléculas, como los radicales libres, capaces de 
modificar químicamente las biomoléculas como lípidos, proteínas y DNA52. Un 
radical libre es una especie altamente reactiva que contiene uno o más electrones 
desapareados en uno de sus orbitales moleculares capaces de existir 
independientemente53. En general los radicales libres y sus metabolitos son 
Figura	5.	Metabolismo	del	2-Acetilaminofluoreno	(2-AAF),	la	bioactivación	del	
2-AAF	por	el	CYP450,	sulfotransferasas	y	acetiltransferasas	permite	la	
formación	de	especies	reactivas	que	forman	aductos	con	el	DNA.	Editado	de	
Williams	et	al.	2015	
	 19	
considerados especies reactivas y pueden ser generados de forma natural en los 
sistemas biológicos, las especies reactivas más comunes son las de oxígeno (ROS) 
y de nitrógeno (RNS), aunque también existen especies reactivas de hierro y de 
cobre52. 
 Las ROS incluyen el anión superóxido O2.-, el peróxido de hidrógeno H2O2, 
radical hidroxilo OH.-, el oxígeno singlete 1O2 y peróxidos orgánicos R-O-O-R’. Las 
ROS se pueden generar en la célula de forma endógena, por la actividad de 
enzimas como NADPH oxidasa, el citocromo P450, xantina oxidasa, 
mieloperoxidasa y por la cadena de transporte de electrones de la mitocondria o 
bien formarse de manera exógena, por ejemplo la radiación ionizante54. El principal 
representante de las RNS es el óxido nítrico, producto de la actividad de la óxido 
nítrico sintasa (NOS). Además, el óxido nítrico al reaccionar con el superóxido es 
capaz de formar peroxinitritos52. 
La reacción de las especies reactivas con las biomoléculas generan 
diferentes metabolitos. Por ejemplo: la reacción de las especies reactivas con los 
ácidos grasos poliinsaturados de la membrana celular produce metabolitos 
reactivos los cuales tienen capacidad mutagénica, tales como el malondialdehído 
(MDA), el 4-Hidroxinonenal (4-HNE) que sirven como marcadores de estrés 
oxidativo55,56, formando 8-Hidroxi-20-deoxiguanosina (8-OH-dG), entre otros 
nucleótidos oxidados por la reacción de las especies reactivas con el DNA, los 
cuales pueden ser mutagénicos57,58, además de este proceso se da la formación de 
3-nitrotirosina, por la reacción entre RNS y las proteínas59. 
 
	 Estrés oxidante 
 El estrés oxidante es definido como la pérdida del balance oxidación-
reducción, ya sea causado por el incremento de agentes oxidantes o por la 
deficiencia de los sistemas antioxidantes celulares, que genera un alto nivel de 
especies reactivas52,57,59, por lo que el estrés oxidativo es una alteración del balance 
del estado oxido-reducción favoreciendo un ambiente oxidante celular. 
 La relación del glutatión reducido (GSH) y oxidado (GSSG) es considerado 
el mejor parámetro para medir la presencia de estrés oxidante celular en un 
organismo. Otros parámetros incluyen mediciones en el nivel de depleción de 
GSH52,60, nivel elevado de MDA, 4-HNE, 8-OH-dG y 3-nitrotirosina. 
 
	 Señalización celular y estado redox 
 Diferentes estudios demuestran que la regulación del estado redox modula 
las funciones de las células normales como tumorales, la señalización celular se ve 
alterada o se modifica de acuerdo a la concentración y duración de la señal 
generada, ya sea directamente por especies reactivas o por la disminución de 
antioxidantes como elGSH. Por ejemplo, las ROS y RNS tienen la capacidad de 
	 20	
estimular la liberación de citocinas proinflamatorias como IL-6 o TNFa, también 
citocinas anti-inflamatorias como IL-10, por lo que las ROS pueden modular la 
respuesta inmune, además de contribuir a la angiogénesis y la muerte celular de 
forma dependiente de su concentración. Por ejemplo: el 4-HNE es capaz de activar 
las vías de rescate celular o bien inducir apoptosis, necrosis, senescencia o 
autofagia52,61. Las especies reactivas pueden oxidar directamente residuos de 
proteínas generando cambios en su actividad como en las vías de señalización de 
EGF, insulina, PKC y MAPK57. 
 Dichas especies reactivas pueden generar otro tipo de modificaciones 
postraduccionales como la S-nitrosilación62 o mediado por GSH la S-
glutationilzación63 de proteínas, las cuales son dependientes del status 
oxidado/reducido de los residuos de cisteínas. La oxidacion del residuo en el grupo 
tiol genera grupos sulfénicos, sulfínicos y sulfónicos, según el grado de oxidación 
dictaminando el potencial redox de la proteína, como se describe más adelante, 
asimismo juegan un papel importante en la señalizacion e inactivacion de proteinas 
de importancia en vías de señalización. Adicionalmente se ha sugerido su 
importancia en la regulacion epigénetica a tráves de la adicion de marcas de 
glutatión en el DNA e histonas63,64. Proteínas como ATM, PLC, PI3K, PTEN e HIF, 
son sensibles a la concentración de GSH generalmente asociada a hipoxia por fallas 
en el complejo III de la cadena respiratoria65. La concentración de GSH, está 
estrechamente relacionada al nivel de especies reactivas y por tanto contribuye en 
varios procesos celulares, por ejemplo, el nivel bajo de GSH favorece la activacion 
de la apoptosis o arresto del ciclo celular60,66, en tanto su incremento favorece la 
resistencia a la apoptosis. La relación núcleo/citoplasma de la concentración de 
GSH es esencial en la regulación del ciclo celular63, ya que se caracteriza por 
fluctuaciones en el ambiente redox como las CDK’s, p53 y p2152. 
 
Respuesta antioxidante 
 Las células poseen un sistema de eliminación directa de especies reactivas 
para modular el estado redox estas incluyen, enzimas antioxidantes tales como la 
superóxido dismutasa, catalasa y peroxidasas, además de otras proteínas con 
capacidades oxidoreductasas o con dominio tiorredoxina y sistemas no enzimáticos 
tales como GSH, con el fin de mantener la homeostasis redox en las células. La 
expresión de estas proteínas está regulada por la activación de factores de 
transcripción capaces de modular la presencia de especies reactivas, como NFE2L2 
o NRF2, NFkB, AP-1, entre otros, una vista global de la red de respuesta 
antioxidante se ilustra en la Figura 6. Los sistemas de respuesta antioxidante no son 
sistemas aislados, sino que convergen uno con otro favorecidos 
termodinámicamente, siendo los 3 sistemas centrales el de glutatión, las 
tiorredoxinas y el NADPH67 (Figura 6). 
	 21	
 
 
 Especies reactivas de oxígeno tales como el anión O2.- y el H2O2 son 
eliminadas directamente por la actividad de las enzimas Superoxido dismutasa 
(SOD), Catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GPX) principalmente57, aunque 
mecanismos mediados por Peroxiredoxinas (PRX), metalotinoneinas (MT) y 
Glutation-S-Transferasas tambien han sido descritos52, por lo que fallas en algunos 
de estos sistemas provocan el aumento de la concentracion intracelular de ROS, 
que pueden reaccionar con las biomoleculas, por ejemplo con acidos grasos n-6 
Figura 6. Principales vías de respuesta antioxidante. Los factores de transcripción NFE2L2, 
NFkB, AP-1, ATF-2, HNF4a, RAR/RXR y PPAR’s son los principales factores que regulan la 
expresión de proteínas del sistema antioxidante celular. Existen diferentes vías de 
destoxificación de especies reactivas, que se interconectan entre ellos esencialmente en los 
sistemas de GSH, NADPH y TRX. La concentración de ROS como el O2
.-
 y H2O2 pueden ser 
moduladas directamente por las enzimas SOD, CAT, GPX, PRX y MT’s, mientras que el resto 
de ROS y RNS su concentración puede ser regulada por su conjugación con GSH (GSSG-X) 
por las GST’s, reducción por TRX o metabolismo por enzimas con actividad oxido/reductasa. 
El mantenimiento de la respuesta antioxidante puede desencadenar la síntesis de mayor 
cantidad de GSH o TRX o la activación de vías de reciclaje por enzimas reductasas, TXNR, 
GSR las cuales dependen de la presencia de NADPH, o bien por el reciclaje de aminoácidos, 
por ejemplo, de Glu por la actividad GGT que permite sintetizar nuevo GSH. 
	
	 22	
poliinsaturados (PUFA), formando algunos compuestos como el 4-HNE68, el cual 
puede intervenir en diversas vías principalmente en aquellas que involucran el 
proliferación celular, arresto del ciclo celular y la muerte celular de forma dosis 
dependiente69,70. Los mecanismos celulares que involucran la destoxificación del 4-
HNE para mantener la homeostasis involucran enzimas de fase I y fase II de 
destoxificación generando diversos productos, por ejemplo: las aldoceto reductasas 
metabolizan el 4-HNE a 1,4-dihidroxinonenol, mientras que las aldehído reductasas 
lo transforman a ácido 4-hidroxinonenoico (4-HNA), otras enzimas como las 
Glutatión-S-transferasas (GST’s) principalmente la GSTA4A forman como producto 
del metabolismo del 4-HNE el conjugado hemiacetal unido a Glutatión (GS-HNE), 
el caso de CYP4504A tiene como sustrato el 4-hidroxinonanal conjugado con 
lactona (HNA-lactona) obteniendo como producto el omega-hidroxi-HNA lactona 
para la destoxificación del 4-HNE68, pese a estos mecanismos el sistema con mayor 
eficiencia y afinidad hacia el 4-HNE está asociado a enzimas alquenal 
oxidoreductasas dependiente de NADPH, principalmente la prostaglandina 
reductasa 1 (PTGR1), la cual reduce directamente el doble enlace para formar 4-
hidroxinonanal 71,72. 
	 	
Prostaglandina reductasa 1 
La Prostaglandina reductasa 1 (PTGR1) es una proteína de 329 amino ácidos 
y un peso molecular de 34 kDa, capaz de formar homodimeros73. La PTGR1 es 
codificada en el brazo largo del cromosoma 9 en los humanos, mientras que su gen 
ortólogo en ratas se localiza en el brazo largo del cromosoma 5. La PTGR1 ha sido 
denominada con varias funciones como alquenal/ona oxido reductasa dependiente 
de NADPH (AO), leucotrineno B4 12-hidroxidehidrogenasa (LTB4DH) y gen-1 
inducido por ditioletionas (DIG-1). 
La PTGR1 fue descubierta en la fracción citosólica de extracto renal de 
cobayos con nefropatías, tiene capacidad de metabolizar el leucotrieno B4 (LTB4), 
potente quimioatractor de neutrófilos, a 12-oxo-LTB4 por la hidroxilación en la 
posición 12 usando como cofactor NADPH, este mecanismo difiere a la ω-oxidación 
vía citocromos P450 de los neutrófilos que dependen de NADH74. Del análisis y 
clonación de cDNA para PTGR1 de riñón humano y porcino se detectó que entre 
especies se comparte un 97.1% de homología en su secuencia, además de su 
presencia en otras especies como, conejos, ratas y ratones75. La detección 
mediante inmunohistoquímica en tejidos de cobayos revelo que la PTGR1 no solo 
se localiza en el riñón, sino que también está presente en otros órganos como 
hígado, intestino delgado, alveolos y colon, pero no en células del sistema inmune 
como se esperaría para el metabolismo del LTB476 
De acuerdo a las características y homología en su secuencia, la PTGR1 
forma parte de la superfamilia dehidrogenasas/reductasas de cadena media (MDR), 
a la cual pertenecen también otras enzimas de destoxificación como la alcohol 
deshidrogenasa y la NADPH quinona oxidoreductasa, las MDR se caracterizan por 
la capacidad de llevar a cabo su función en ausencia de Zn2+ y transfiriendo el 
grupo hidruro de forma estereoespecífica al carbono β del doble enlace77. 
	 23	
 La PTGR1 es inducida en respuesta al nivel elevado de LTB4 en infecciones 
crónicas o por agentes quimioprotectores como las ditioletionas, Oltipraz78, 
sulforafanos79 y ácido gálico80; compuestosorganosulfurados contenidos en 
vegetales, los cuales inducen la expresion de enzimas de destoxificación, por lo que 
Primiano y colaboradores la clasificaron como una enzima quimioprotectora contra 
la formación de tumores de colon por su capacidad de inactivar el LTB4, lo cual 
conlleva a una disminución de la quimiotaxis de neutrófilos, disminución en la 
respuesta inflamatoria y el daño por ROS81. Otros eicosanoides, moleculas 
mediadoras del dolor y la inflamación, que tambien pueden ser metabolizados son 
la Prostaglandina J282 y la lipoxina A4, adémas se reveló que la PTGR1 puede ser 
inhibida por anti inflamatorios no esteroideos como el Acetaminofem, Diclofenaco e 
Indometacina83. 
La PTGR1 también es capaz de metabolizar diversos aldehídos y cetonas 
alfa-beta insaturados, productos de la presencia de estrés oxidante, como los 
nitroalquenos84 y el 4-HNE71, pese a que el 4-HNE puede ser metabolizado por otras 
enzimas como GSTA4A, AKR1B10, ALDH1A1 y HMOX1; la PTGR1 es la única 
capaz de reducir el doble enlace, adémas de tener la más alta eficiencia catalítica y 
mayor afinidad hacia esta molécula68,71,72,85. La inducción de PTGR1 mediante 
infección por adenovirus recombinantes en líneas celulares de cáncer de pulmón, 
suprimió su crecimiento, además incrementó el nivel de apoptosis en las células, 
corroborando la disminución de su potencial tumorigénico por implantación en 
ratones desnudos, en líneas celulares sin expresión de PTGR1 con lo que se 
propuso que su expresión previene el desarrollo de cáncer de pulmón, sin embargo, 
se puso en manifiesto otro tipo de líneas derivadas de tumores con expresión 
constitutiva de PTGR1 como la A54986. Adicionalmente, la presencia de PTGR1 en 
tumores de vejiga se asoció a una disminucion en el tiempo de sobrevivencia de los 
pacientes87. 
 La PTGR1 se ha mostrado también como un posible blanco terapéutico, con 
el uso de fármacos bioactivados por la presencia y actividad de esta enzima como 
son el Hidroximetil Acilfulveno, el cúal muestra alta selectividad a células con alta 
expresión de PTGR1, induciendo la muerte de las células por daño al DNA por el 
metabolito generado78,88,89. 
 
 Antecedente directo 
 En el Instituto Nacional de Medicina Genómica, en el modelo de S&F se 
analizó el perfil de proteínas de los tumores hepáticos inducidos en rata, 5 tumores 
de 4 ratas diferentes, fueron procesados por electroforesis y espectrometría de 
masas MALDI-TOF-TOF, con un promedio de identificación de 5 proteínas por 
banda, los resultados fueron analizados por el algoritmo Paragon, donde se 
identificó a la PTGR1 únicamente en tejido tumoral y no así en tejido que lo rodeaba, 
ni en hígados sanos, teniendo el máximo número de péptidos, de 12 hasta 23 
péptidos, que concordaban con la proteína con un nivel de confianza >99%. 
Adicional a la PTGR1, se logró identificar a las proteínas AKR7A3, JUN (D/B), M3K1 
y TALDO. La identificación de PTGR1 de forma consistente generó varias 
interrogantes que se abordaron en la presente tesis: 
	 24	
 
• ¿Los tumores de CHC en humanos también sobreexpresan la PTGR1?, 
• ¿Qué mecanismo controla la sobreexpresión de PTGR1 en el CHC? 
• ¿Cómo contribuye la expresión de PTGR1 en las células neoplásicas al 
desarrollo del tumor? 
 
 Justificación 
 Debido a la alta incidencia y mortalidad del Carcinoma Hepatocelular (CHC) 
a nivel mundial y nacional, aunado a los pocas herramientas para el diagnóstico y 
tratamiento para este tipo de cáncer, es esencial la búsqueda de moléculas 
presentes en los tumores como blancos terapéuticos y de diagnóstico, el trabajo 
previo del laboratorio arrojó la posibilidad de localizar exclusivamente en los tumores 
experimentales en rata la proteína PTGR1, por lo que en la presente tesis se 
investigará su presencia desde etapas tempranas de la carcinogénesis hepática 
experimental y en tumores de origen humano, adicionalmente se investigará el 
mecanismo que controla la expresión de PTGR1 y las ventajas que ofrece a las 
células tumorales la expresión de esta enzima, pudiendo otorgar conocimiento 
sobre posibles blancos terapéuticos y de diagnóstico para el CHC, así como datos 
sobre la adaptación metabólica y biología del cáncer. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
	
	 25	
OBJETIVOS 
Objetivo general: 
 Estudiar la participación de la PTGR1 en el desarrollo de cáncer de hígado. 
 
Objetivos específicos: 
• Analizar la localización histológica de la PTGR1 en el CHC experimental y 
de muestras clínicas. 
• Estudiar el posible mecanismo, a nivel de factores de transcripción, que 
regula la expresión de la PTGR1 en tumores hepáticos. 
• Evaluar la modificación en las funciones celulares, proliferación, viabilidad 
celular, resistencia al estrés oxidante y a la muerte celular al sobreexpresar el gen 
de la Ptgr1 en líneas celulares. 
 
HIPÓTESIS 
 Considerando la capacidad de la Ptgr1 para metabolizar el 4-HNE, nuestra 
hipótesis plantea la posibilidad de que la sobreexpresión de la PTGR1 en las células 
tumorales ofrezca una ventaja de protección contra el 4-HNE, volviéndolas 
resistentes y contribuyendo a la evasión de la muerte celular, lo que favorecería el 
crecimiento de los tumores. 
 
METODOLOGÍA 
Modelos animales de hepatocarcinogénesis química 
Se emplearon ratas Fisher 344 macho de acuerdo al régimen de administración 
correspondiente (Figura 7), las ratas fueron obtenidas de la Unidad de Producción 
Animal y Experimentación (UPEAL-CINVESTAV) siguiendo las guías y protocolos 
institucionales para el cuidado animal. 
• Modelo de cirrosis y cáncer (DEN)42. Se administró cada semana 
Dietilnitrosamina 50 mg/kg vía intraperitoneal durante 16 semanas, con tiempos de 
sacrificio a la semana 6, 12 y 18 (Figura 7). 
• Modelo del hepatocito resistente (S&F)36. Se administró una dosis de 
Dietilnitrosamina 200 mg/Kg vía intraperitoneal, con subsecuente administración de 
2-acetilaminofluoreno 25 mg/Kg vía intragástrica a los días 7, 8 y 9, seguida de una 
hepatectomía parcial del 70% del hígado al día 10. Realizando sacrificios a los 9 
meses cuando los tumores se han establecido (Figura 7). 
• Control. Un grupo de ratas fue sacrificado de forma paralela a la semana 18, 
el cual no recibió ningún tratamiento con carcinógenos, el cual fungió como control 
de hígado normal en los experimentos (NL). 
 
 
	 26	
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para el sacrificio de los diferentes grupos de ratas se empleó como método 
de anestesia cámara de éter. Las ratas anestesiadas se les realizó una punción 
cardiaca con un posterior desangramiento cortando la vena cava inferior. Mediante 
resección quirúrgica se obtuvo el tejido hepático, el cual fue inmediatamente 
congelado con nitrógeno líquido, empleando como crioprotector 2-metil butano, y 
almacenando a -70 ºC para su preservación. 
 
	 Muestras clínicas de Carcinoma Hepatocelular 
 Biopsias y resecciones quirúrgicas de tejido hepático embebido en parafina 
de 12 casos de pacientes con CHC fueron obtenidos del Centro de Especialidades 
Médicas del Estado de Veracruz (CEMEV), avalado por el comité científico y ético 
del hospital (permiso 005/2011). Las muestras fueron de 6 hombres y 6 mujeres con 
un rango de edad de 17 a 70 años, sin criterio de discriminación con otra patología 
hepática. Los especímenes fueron cortados en micrótomo (Leica) y teñidas con 
Hematoxilina Eosina para realizar el diagnostico histológico, realizado por dos 
patólogos diferentes confirmando el diagnóstico y la clasificación de acuerdo a su 
grado de diferenciación: Bien diferenciado (n=2), moderadamente diferenciado 
(n=6) y pobremente diferenciado (n=4). 
 
Inmunohistoquímica PTGR1 y Glipican-3 
Cortes de 5 micrómetros en microtomo (Leica) fueron hechos de muestras 
de modelos experimentales y biopsias clínicas de CHC, los cortes fueron 
desparafinados y rehidratados mediante incubaciones de 5 min cada una con Xilol 
y etanol, 100%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50% y finalizando con agua. Se expuso 
el antígeno mediante el calentamientoa 95ºC en olla de presión por 5 min en buffer 
Tris-EDTA (10mM/1mM pH 9). Las laminillas fueron lavadas 2 veces con agua 
destilada y se bloqueó la peroxidasa endógena con Dual Endogenous Enzyme 
Blocking Reagent (DAKO) por 5 minutos, se realizó un lavado con agua destilada y 
un lavado más con buffer TBS 1X pH 7.4 de 5 min cada uno. Se colocó el anticuerpo 
Fig.	7	
Esquematización	de	
los	regímenes	de	
administración	y	
sacrifico	para	los	
modelos	DEN	y	S&F.	
	 27	
primario anti-PTGR1 (NovusBio) o Glipican-3 (BioSB) en una dilución 1:50 en TBS 
1X pH 7.4 o control de isotipo (Invitrogen) y se incubó toda la noche. Se realizó tres 
lavados con TBS 1X pH 7.4 e incubado posteriormente con EnVisio-HRP Labelled 
Polymer anti-Rabbit (DAKO) por 30 minutos a temperatura ambiente, después 3 
lavados con TBS 1X pH 7.4, la marca fue revelada mediante el reactivo Liquid-DAB 
substrate chromogen system (DAKO) y los núcleos celulares fueron contra teñidos 
con Hematoxilina de Mayer, finalmente fueron deshidratados y montados con 
Entellan (Sigma Aldrich). 
 
	 Análisis bioinformático de la región promotora del gen Ptgr1 
 El análisis se inició con la búsqueda de factores de transcripción para el gen 
Ptgr1 hasta -3000 pb río arriba del primer exón con el programa MathInspector 
(Genomatix) 
https://www.genomatix.de/online_help/help_matinspector/matinspector_help.html 
los factores de transcripción con un valor de Matrix Sim mayor a 0.8 fueron 
considerados. De los factores de transcripción seleccionados se obtuvo la base de 
datos TRANSFAC las secuencias consenso reconocidas por factores de 
transcripción (http://www.gene-regulation.com/pub/databases.html). 
Posteriormente se realizó una búsqueda de las secuencias consenso mediante RSA 
tools (http://rsat.sb-roscoff.fr) en el gen Ptgr1 hasta -3000 pb en DNA-patter, 
considerando un score de 1. En la base de datos se obtuvo la secuencia consenso 
reconocidas por factores de transcripción. 
 
Inmunoprecipitación de cromatina 
 El ensayo de Inmunoprecipitación de cromatina dirigido a NRF2 se realizó 
mediante el Kit EZ-ChIP (Millipore) empleando como anticuerpo anti-NRF2 H-300 
(Santa Cruz)90,91. A partir de 20 mg de tejido congelado fue resuspendido en PBS 
1X y fijado con formaldehído 1% durante 15 minutos en agitación suave a 
temperatura ambiente, la reacción fue detenida por la adición de glicina a una 
concentración final de 125 mM y se incubó por 5 minutos a temperatura ambiente, 
se centrifugó por 5 minutos a 500g, se descartó el sobrenadante y el pellet fue 
resuspendido en 2 mL de PBS 1X y centrifugado nuevamente por 5 minutos a 500g, 
el paso anterior se repite 3 veces. Finalmente, el pellet es resuspendido en 1 mL de 
SDS Lysis Buffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris HCl, pH 8.1) con inhibidor de 
proteasas a 4ºC. Posteriormente se sonicó 15 veces con ciclos de 45s de sonicación 
y 45s reposo a 4ºC, se tomaron 200 uL como input y se almacenaron a -20 ºC, el 
resto del volumen se llevó nuevamente a un volumen de 1 mL con buffer de dilución 
(1% Triton, 2 mM EDTA, 20 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 8.1). Se agregaron 50 
uL de G-agarosa y se incubó a 4ºC con agitación durante 1h, después se centrifugó 
a 3000g y se recuperó el sobrenadante en un tubo nuevo. 500 uL del sobrenadante 
	 28	
fueron llevados a 1 mL con buffer de dilución y se agregó 10 ug de anticuerpo anti-
NRF2 H-300 (Santa Cruz) y se incubó a 4ºC con agitación toda la noche. Finalizado 
la incubación se agregaron 60 uL de G-agarosa y se incubó a 4ºC con agitación por 
1h. Posteriormente se realizaron lavados de 1mL de cada buffer secuenciales con 
incuabciones de 5 minutos entre cada uno y centrifugando a 5000g, desechando el 
sobrenadante y resuspendiendo el pellet: 1) Low Salt Immune Buffer (0.1% SDS, 
1%Triton, 2mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1), 2) High Salt Immune 
Buffer (0.1% SDS, 1%Triton, 2mM EDTA, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1), 
3) LiCl Immune Buffer (0.25 M LiCl, 1% NP40, 1% Deoxicolato, 1mM EDTA, 10 mM 
Tris HCl, pH 8.1) 4)TE Buffer (10 mM Tris HCl, 10 mM EDTA, pH 8.1), se repitió el 
ultimo lavado 2 veces. A la G-agarosa se le agregaron 100 uL de Buffer de Elución 
preparado en el momento (1% SDS, 0.1 M NaHCO3) e se incubó por 15 minutos, se 
centrifugó a 5000g por 1 minuto y recuperó el sobrenadante, se añadió nuevamente 
a la G-agarosa 100 uL de Buffer de Elución y repitieron los pasos hasta recuperar 
200 uL de eluido. Al eluido se agregó 8 uL de NaCl 5M e incubó de 4 a 5 horas y 
procedió a la purificación del DNA inmunoprecipitado e input mediante columnas 
QIAmp-DNA minikit (QIAGEN). A los 200 uL de eluido e input se le agregaron 20 uL 
de proteinasa K y 100 uL de buffer AL a cada uno, se agitó con vortex por 15s y se 
incubó por 10 minutos a 56ºC, se añadieron 200 uL de etanol al 96% y se agitó en 
vortex por 15 segundos y se transfirió a una columna dejando reposar por 5 minutos 
y centrifugando a 6000g por un minuto. Se realizaron lavados de la columna con 
500 uL de buffer AW1 y centrifugando a 6000g por un minuto, y 500 uL de buffer 
AW2 centrifugando a 20000g por 3 minutos, se cambió el tubo colector y se 
centrifugó a 20000g por un minuto más, se quitó el tubo colector, se colocó un tubo 
ependorff de 1.5 y se eluyó con 30 uL de buffer TE dejando reposar 2 minutos previo 
a la centrifugación a 6000g por 1 minuto, el DNA se almacenó a -20ºC hasta su uso 
en qPCR. 
 
qPCR tiempo real 
Se realizó el qPCR en tiempo real mediante el sistema de marca SYBR Green 
(Applied Biosystems) en el equipo ViiA7 (Applied Biosystems) verificando el 
producto único por gel de agarosa al 1.5% y curvas de punto de fusión, los primers 
empleados se enlistan en la tabla 1 e incluyeron amplicones para los genes Gclc, 
Nqo1 y Ptgr191, las condiciones empleadas fueron una concentración final de 1.25 
uM de cada primer Forward y Reverse, 3 uL de DNA inmunoprecipitado en una 
reacción de 20 uL. Las condiciones del termociclador se muestran en la figura 8. 
 
 
 
 
	 29	
Tabla 1: Primers para qPCR de DNA ChIP-NRF2 
Primer Secuencia 
F-GCLC ARE3 ACGACGCACACATCTGAAAC 
R-GCLC ARE3 CGTAGTTGTGGTAGCGCTGG 
F-NQO1 ARE GCGTGTACACCCAAGGGCCAC 
R-NQO1 ARE CCTTTGCACGCAAGGGGAAGG 
F-PROM GCLC TTGTTAACACCCGGGAACAC 
R-PROM GCLC ATTTTATAGGCTACGGCGGG 
F-PTGR1 ARE GGCCAGGGAAATCCTTCATA 
R-PTGR1 ARE GAGGCGATGGCATCTCTAAA 
 
 
Ensayo de retardamiento de la movilidad electroforética (EMSA) 
El ensayo EMSA fue ajustado de los protocolos descritos92,93. 
Oligonucleótidos biotinilados en el 5’ con la secuencia ARE se diseñaron, los sitios 
ARE mutantes fueron cambiadas las purinas por pirimidinas y viceversa, Tabla 2, y 
el Kit LightShift Chemiluminescent EMSA (Pierce) fue empleado, oligonucleótidos 
sin marcar con la secuencia ARE consenso fue empleado para los ensayos de 
competición (Tabla 2). Las dobles cadenas de los oligonucleótidos fueron 
generados por la combinación equimolar de oligos y calentados a 95 ºC (-1ºC por 
ronda) por 1 minuto y enfriado a 4ºC por 70 ciclos en termociclador. 
 
Tabla 2. Oligonucleótidos empleados para ensayos de retardamiento 
Oligonucleótido Secuencia 
F-NQO1wt /5Biosg/TCTAGAGTCACAGTGACTTGGCAAAATCTGA 
R-NQO1wt /5Biosg/TCAGATTTTGCCAAGTCACTGTGACTCTAGA 
F-PTGR1wt /5Biosg/AAAACTTGGGAAGTGAGAGGGCAGGAAGGGAGAG 
R-PTGR1wt /5Biosg/CTCTCCCTTCCTGCCCTCTCACTTCCCAAGTTTT 
F-NQO1mt /5Biosg/TCTAGAGTCACAGGAGCTTGGAAAAATCTGA 
Figura	8:	Condiciones	de	
qPCR	tiempo	real	
	
	 30	
R-NQO1mt /5Biosg/TCAGATTTTTCCAAGCTCCTGTGACTCTAGA 
F-PTGR1mt2 /5Biosg/AAAACTTGGGAAGGAGGAGGGCAGGAAGGGAGA 
R-PTGR1mt2 /5Biosg/CTCTCCCTTCCTGCCCTCCTCCTTCCCAAGTTTT 
F-AREconCTR GCACAAAGCGCTGAGTCACGGG 
R-AREconCTR CCCGTGACTCAGCGCTTTGTGC 
 
Las reacciones de EMSA se realizaron en un volumen de 20 uL con Binding 
Buffer 1X, 1mM de EDTA, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 4% de glicerol, 1 mM DTT, 3 
ug/mL poly dI-dC y 7.5 ug de extracto nuclear de proteínas con 20 fmol de 
oligonucleótidos marcados en doble cadena, para los ensayos de competición se 
colocó 200 veces más de exceso de oligo sin marcar,para el ensayo de 
inmunodepleción de NRF2 se colocó 10 ug de anticuerpo anti-NRF2 H300 (Santa 
Cruz) al extracto celular, las reacciones fueron incubadas por 30 minutos a 20ºC, se 
corrió un gel de acrilamida 0.5X TBE al 5% a 100V por 45 minutos, el gel fue 
transferido a membrana de nylon (Millipore) en cámara húmeda en TBE 0.5X. La 
membrana transferida fue entrecruzada por luz UV de 312nm en transiluminador 
por 15 minutos, la membrana fue revelada donde los oligos biotinilados fueron 
retenidos, mediante quimioluminiscencia por el sistema de HRP con luminol en 
fotodocumentador Uvitec (Cambridge). 
 
Inmunofluorescencia acoplada a histoquímica para GGT 
El protocolo acoplado se empleó únicamente en la detección de KEAP1 y 
NRF2 (Santa Cruz), el resto de las inmunofluorescencias se siguió el mismo 
protocolo omitiendo el paso de la histoquímica. Se realizaron en criostato (Leica) 
cortes de 20 um de espesor de tejido congelado se realizaron y se colocaron en 
laminillas silanizadas o bien células C9 crecidas sobre cubreobjetos por 48 horas, 
fueron fijados con acetona durante 5 min a -20 ºC, realizando posteriormente un 
lavado con PBS 1X y tres más con TBS 1X, se bloqueó durante 2 horas con 
albumina 1% en TBS 1X a temperatura ambiente, se colocó el anticuerpo primario 
a una dilución 1:50 (tabla 3) en TBS 1X y como control negativo se usó Control de 
Isotipo para Conejo (Invitrogen), se incubaron durante toda la noche a 4ºC, 
terminada la incubación se realizaron 4 lavados con TBS 1X. Posteriormente se 
colocó el reactivo 4,6-diamino-2-fenidol (DAPI) diluido 1:2000 en PBS 1X por 5 
minutos y se realizaron 4 lavados con PBS 1X. Sin dejar secar la laminilla, se realizó 
la histoquímica modificada para la actividad GGT94 añadiendo la mezcla de reacción 
que consiste en: γ-glutamil-4-metoxi-2-naftilamina (GMNA) 0.25 mg/mL, glicilglicina 
2 mg/mL Fast Blue BB 0.5mg/mL en buffer MOPS 50 mM pH 7.4, incubando por 12 
minutos, se realizó 4 lavados con PBS 1X y finalmente se realizó́ el montaje con 
Fluorescent mounting medium (DAKO), conservando las laminillas a 4°C protegidas 
de la luz. Los ensayos fueron visualizados y capturados en imagen mediante 
microscopio confocal Carl Zeiss LSM 510. 
	 31	
 
Tabla 3. Anticuerpos empleados para Inmunofluorescencia 
Anticuerpo Marca 
PTGR1 NovusBio 
NRF2 (H-300) SantaCruz 
KEAP1 SantaCruz 
Ki67 Cell Marker 
 
Extracción de RNA y formación de cDNA 
La extracción de RNA se realizó a partir de 20 mg de tejido congelado 
mediante el kit RNA easy (QIAGEN), el tejido fue disgregado y homogenizado en 
350 uL de Buffer RLT con 1% de b-mercaptoetanol, se agregó 350 uL de etanol al 
70% y homogeneizó suavemente. El volumen se colocó en la columna y se dejó 
reposar por 5 minutos y se centrifugó por 15 segundos a 8000g, se realizó un lavado 
a la columna con 700 uL de buffer RW1 y centrifugó a 8000g por 15 segundos, 
posteriormente con 500 uL de buffer de RPE y centrifugó a 8000g por 15 segundos 
y un segundo lavado con buffer RPE centrifugando a 8000g por 2 minutos, se 
cambió el tubo colector y se centrifugó nuevamente a 12000g por 1 minuto, se 
colocó un tubo eppendorf y se eluyó el RNA total con 35 uL de agua libre de 
RNAsas. El RNA obtenido se cuantificó espectrofotométricamente a las longitudes 
de onda de 260 y 280 nm mediante nanodrop ND1000 y se verificó su integridad 
por corrimiento electroforético en gel de agarosa al 1.5% y por la densidad de 
bandas del RNA ribosomal 28S y 18S. 
Se sintetizó cDNA mediante el kit High Capacity (Applied Biosystems), 
partiendo de una cantidad de 750ng de RNA total en un volumen total de reacción 
de 20uL, las condiciones de termociclador se muestran en la figura 9 y 
posteriormente realizando una dilución 1:10 del cDNA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura	9.	Condiciones	de	
síntesis	de	cDNA.	
	
	 32	
PCR en tiempo real 
Se empleó el sistema de sonda TaqMan (Tabla 4) en placas MicroAmp 
Optical (Applied Biosystems), colocando 8 uL de cDNA y 11 uL de TaqMan 
Universal PCR Master Mix 2X y 1 uL de sonda de interés, las cuales se listan en la 
tabla 4 marcadas con fluoróforo FAM. La amplificación se llevó acabo en el equipo 
ViiA7 (Applied Biosystems) siguiendo el protocolo recomendado. El valor del umbral 
y de la línea base fueron estimados de forma manual con el software del equipo, 
ajustando a las zonas de inicio de amplificación y previo a la curva de amplificación 
(ΔRN vs ciclos) respectivamente, una vez ajustados estos valores se determinó el 
valor del Ct para cada muestra. Con los resultados obtenidos se realizó́ la 
determinación de la expresión relativa de los genes mediante el cálculo doble delta 
Ct, tomando como referencia el ribosomal 18S y como control al hígado normal. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Extracción y cuantificación de proteína 
De 100 mg de tejido congelado fue homogenizado de forma mecánica en 
tubo Potter con buffer NP40, 150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1% NP40 pH 8.0, 
posteriormente se centrifugó a 8000g por 10 minutos a 4 ºC, recuperando la fracción 
soluble, con 3 uL de esta fracción se realizó la cuantificación de proteína mediante 
el kit de ácido bicinconínico (ABCAM). 
 
 
 
Tabla 4. Sondas Taqman empleadas en análisis de expresión 
Sonda ID 
Ptgr1 Rn00593950_m1 
Akr1b10 Rn00593950_m1 
Gstp1 Rn00561378_gH 
Nrf2 Rn00477784_m1 
Keap1 Rn00589292_m1 
Nqo1 Rn00566528_m1 
18S Rn03928990_g1 
Figura	10.	Condiciones	
para	PCR	en	tiempo	real.	
	
	 33	
Purificación de fracciones nucleares y citoplasmáticas. 
La purificación de proteínas nucleares y de citoplasma, se realizó mediante 
el kit ProteoJETTM Cytoplasmic and Nuclear Protein Extraction (Fermentas), se 
disgregó 200 mg de tejido en PBS 1X con inhibidor de proteasas, se centrifugó a 
600g por 3 min y se desechó el sobrenadante, se agregó 10 volúmenes de buffer 
Cell Lysis con 0.1M de Ditiotreitol (DTT), se agitó suavemente y se incubó 10 min a 
4ºC, se centrifugó a 500g por 7 min a 4ºC, el sobrenadante se colocó en un tubo 
nuevo y se centrifugó a 20000g por 25 min y se recuperó nuevamente el 
sobrenadante. Al pellet se le agregó Nuclei Wash Buffer con 0.1M de DTT y se 
centrifugó a 500g por 7 min a 4ºC, este paso se repitió por 3 veces, posteriormente 
el pellet obtenido se le añadió 10 volúmenes de Nuclei Store Buffer y 1:10 de Nuclei 
lysis buffer, se homogenizó y se incubó por 10 min a 37ºC con agitación, después 
se centrifugó a 20000g por 10 min a 4ºC y el sobrenadante fue colectado en un tubo 
nuevo. 
 
Inmunodetección mediante Western Blot 
Para la electroforesis en geles desnaturalizante de poliacrilamida (SDS 
PAGE) al 12% se empleó el sistema MiniProtean (BioRad), cargando por cada 
muestra 30 ug de proteína en buffer de carga Laemmli (BioRad) adicionado con b 
mercaptoetanol como agente reductor, las muestras se calentaron por 5 minutos a 
95 ºC y colocadas en hielo inmediatamente. Se realizó el corrimiento en buffer de 
corrida Laemmli a 50V por 30 minutos e incrementando a 100V por 2 horas más, 
usando como fuente PowerPac HC, concluido el corrimiento se realizó la 
electrotransferencia a membrana de Polifluoruro de vinilideno (PVDF), activada 
previamente con metanol, en cámara húmeda en buffer estándar Towbin, la 
transferencia se llevó a cabo por 2 horas a 100V a 4ºC con una fuente PowerPac 
hc BioRad. Terminada la transferencia la membrana fue bloqueada con albumina al 
5% por 1 hora en TBS 1X con 0.2% Tween 20, posteriormente se colocó el 
anticuerpo primario (tabla 5) diluido 1:1000, incubado toda la noche a 4ºC en 
agitación suave. Posteriormente se lavó la membrana 4 veces con TBS 1X con 0.2% 
Tween 20 de 10 minutos cada uno. Se colocó el anticuerpo secundario anti-rabbit 
HRP (Jackson) diluido 1:10000. Después se lavó por 4 veces más con TBS 1X con 
0.2% Tween 20. El revelado se llevó a cabo mediante quimioluminiscencia 
Immobilon Western Chemiluminescent HRP (Millipore), la cual se basa en la 
formación de luz que emite a 425 nm al oxidarse el sustrato luminol en presencia de 
peróxido de hidrogeno y HRP.La luminiscencia se detectó́ en el fotodocumentador 
VersaDoc Imaging System (BioRad). Los análisis densitométricos se realizaron con 
el software IMAGEJ. 
 
 
	 34	
Tabla 5. Anticuerpos empleados para Inmunodetección por Western Blot 
Anticuerpo Marca 
PTGR1 NovusBio 
GCLC Abcam 
NQO1 Sigma Aldrich 
GSTP1 Sigma Aldrich 
NRF2 (H-300) SantaCruz 
KEAP1 Santa Cruz 
ACTB ---- 
GADPH Cell Marke 
HNE AlexisBio 
 
Lipoperoxidación 
Los ensayos de cuantificación de lipoperoxidación se llevaron a cabo 
espectrofotométricamente de acuerdo al protocolo descrito por Yagi95, 25 mg de 
tejido fueron homogenizados mecánicamente en tubo Potter con buffer de lisis 1.15 
% de KCl, manteniendo la relación de una concentración de 10% m/v con el tejido, 
se adicionaron 200 uL de SDS 8.1% y 1.5 mL de ácido acético al 20% pH 3.5 
ajustado con NaOH, se añadió 1.5 mL de solución acuosa de ácido tiobarbitúrico 
0.8% y se aforó a 4 mL con agua destilada. Se incubó a 95ºC por 60 min, finalizada 
la incubación se dejó enfriar y se agregó 1 mL de agua destilada más 5 mL de n-
butanol/piridina 15:1 y se agitó vigorosamente. Se centrifugó a 3000g por 10 
minutos, se recuperó la fase orgánica y fue leída a 532 nm en espectrofotómetro 
(EPOCH), los datos fueron ajustados mediante curva estándar de malondialdehído 
(MDA). 
 
Cuantificación de Glutatión 
La cuantificación de glutatión oxidado y reducido se realizó de forma paralela 
mediante fluorometría de acuerdo al protocolo de Hissin96. 250 mg de tejido fueron 
homogenizados de forma mecánica en tubo Potter con 3.75 mL de buffer de 
fosfatos-EDTA (FEDTA), 0.1M de fosfato monobásico de sodio, 0.005M EDTA pH 
8, adicionando 1 mL de ácido fosfórico 25% a 4ºC, se centrifugó a 20000g por 30 
minutos a 4ºC, del sobrenadante 500 uL se tomaron para cuantificar el glutatión 
reducido y 500 uL más para el glutatión oxidado. 
Para el glutatión reducido se adicionaron 4.5 mL de FEDTA y se homogenizó, se 
tomaron de la mezcla anterior 100 uL y se adicionaron 1.8 mL de FEDTA y 100 uL 
de O-ftaraldehído 1mg/mL disuelto en metanol absoluto, la mezcla se incubó por 15 
minutos y fue leída en el fluorómetro (Fluorolog) en el espectro de 
emisión/excitación de 420/350 nm. 
	 35	
Para medir el glutatión oxidado se adicionó a cada alícuota de muestra 200 
uL de N-etilmaleimida 0.04M y se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente, 
posteriormente se adicionaron 4.3 mL de NaOH 0.1M y se agitó, después se 
tomaron 100 uL de la mezcla anterior a los cuales se les agregó 1.8 mL de NaOH 
0.1M y 100 uL de O-ftaraldehído y se incubó por 15 minutos, finalmente fue leída la 
muestra en el espectro de emisión/excitación de 420/350 nm en el fluorímetro 
Fluorolog. Los datos de glutatión oxidado y reducido fueron ajustados mediante el 
uso de curva estándar para cada uno de ellos. 
 
Activación de NRF2 y expresión de PTGR1 en células epiteliales 
hepáticas. 
La línea CRL-1439 (ATCC) o clona 9 (C9) fue mantenida en medio F12-K 
(ATCC) 10% de suero fetal bovino (SFB) en incubadora a una temperatura de 37ºC 
con 5% CO2 (Thermo Scientific). 5x105 células fueron sembradas en placas de 24 
pozos previo al tratamiento. Las células fueron expuestas a diferentes 
concentraciones de inductores de NRF2: 30 uM, 15 uM y 5 uM de curcumina y 50 
uM, 25 uM y 5 uM de terbutil hidroquinona (tBHQ), por 5 horas, posteriormente las 
células fueron tripsinizadas y se realizó un lisado celular con buffer NP40, el extracto 
de proteína fue cuantificado y se corrió el experimento de Western blot para revelar 
a PTGR1. 
 
Clonación de PTGR1 
A partir del cDNA de tejido hepático del modelo DEN a la semana 18 se 
amplificaron mediante PCR los 10 exones con los primers 10E diseñados en el 
programa Primer3Plus, (tabla 6) con la polimerasa Phusion (Thermo Scientific), la 
amplificación fue visualizada en corrimiento electroforético en gel de agarosa al 2%, 
posteriormente el producto de PCR fue purificado del gel mediante el kit QIAquick 
gel extraction (QIAGEN), por cada 100 mg de gel se adicionó 300 uL de buffer QG 
y se incubó por 10 min a 50 ºC agitando ocasionalmente, posteriormente se colocó 
el líquido en la columna y se dejó reposar por 3 minutos y se centrifugó a 10000g 
por 1 min, posteriormente se adicionaron a la columna 500 uL de buffer QG y se 
centrifugó nuevamente a 10000g por 1 min, se realizó un lavado a la columna con 
750 uL de buffer PE y se centrifugó 1 min a 10000g, se cambió el tubo colector y se 
volvió a centrifugar a 10000g por 1 min, el producto se eluyó con 50 uL de buffer TE 
dejando reposar 5 minutos y centrifugando a 10000g por 1 minuto. El producto fue 
clonado en el vector pGEM-T easy (PROMEGA), partiendo de 54 ng de producto se 
le adicionaron 50 ng de vector y buffer de ligación con ligasa T4 del kit, 5 uL de la 
mezcla de reacción se colocaron en un tubo estéril y se colocaron 50 uL de bacterias 
JM109 High Efficiency Competent Cells (PROMEGA). Se incubó 20 min a 4ºC 
posteriormente se hizo un choque térmico por 1.5 min a 42 ºC y se colocó 
inmediatamente a 4ºC por 2 minutos más. Se adicionó 950 uL de medio SOC 
	 36	
(Invitrogen) y se incubó por 1.5 horas a 37ºC en agitación suave. 100 uL fueron 
sembradas en placas de medio agar LB/ampicilina/IPTG y se incubaron a 37ºC 
durante toda la noche, al otro día se seleccionaron colonias blancas para verificar 
la inserción del vector y el producto de PCR. 
Las colonias seleccionadas fueron crecidas en medio liquido LB/Ampicilina y 
el plásmido con el inserto fueron purificados mediante el kit QIAprep Spin Miniprep 
(QIAGEN). 5 mL de colonias crecidas por 16 horas a 37 ºC con agitación fueron 
centrifugadas a 6800g por 3 min, las bacterias fueron resuspendidas con 250 uL de 
buffer P1 y se agregó 250 uL de buffer P2 y homogenizado por inversión, se 
agregaron 350 uL de buffer N3 y homogenizado por inversión, el líquido fue 
centrifugado a 18000g por 10 minutos, posteriormente el sobrenadante se añadió a 
la columna y se incubó por 3 minutos, se centrifugó a 18000g por 1 minuto, se realizó 
un lavado a la columna con 500 uL de buffer PB y se centrifugó a 18000g por 1 min. 
Se lavó nuevamente la columna con 750 uL de buffer PE y se centrifugó a 18000g 
por 1 min, el vector con el inserto fue eluidó con 50 uL de agua libre de DNAsas y 
se dejó incubar por 3 minutos y se centrifugó por 1 min a 18000g. 
Del vector con el inserto de PTGR1 purificado se realizó la reacción de PCR 
usando la DNA polimerasa Phusion (Thermo Scientific) con los primers PP3 para el 
marco de lectura abierto de Ptgr1 (ORF) integrando sitios de restricción para las 
enzimas EcoRI y XhoI (tabla 6). 
 
Tabla 6. Primers empleados para la clonación de Ptgr1 
Primer Secuencia Tm 
F-10E CGGGAAGGAGTTTCTGTGAG 64ºC 
R-10E CCCACCATGTTTTATTAGATAGGC 
F-PP3 GATCGAATTCTGTGTTCATCAGGATGGTACAAG 76ºC 
R-PP3 GATCCTCGAGTCACGCTTTCACTATAGTCTTCC 
 
Tanto el ORF de Ptgr1 como el vector pLXSN (Clontech) fueron digeridos con 
las enzimas de restricción EcoRI y XhoI (Roche) por 2 horas a 37 ºC, los productos 
digeridos fueron purificados por columnas GenePCR purification kit (Thermo 
Scientific), adicionando la mezcla de digestión 1:1 de Binding buffer, colocando la 
mezcla en la columna e incubando por 3 minutos, posteriormente se centrifugó a 
12000g por 1 min, se realizó un lavado a la columna con 700 uL de Wash Buffer y 
se centrifugó por 1 min a 12000g, se cambió el tubo colector y se centrifugó una vez 
más a 12000g, se eluyó con 50 uL de agua libre de DNAsas centrifugando a 12000g 
por 1 min. 
El ORF de Ptgr1 y el vector linearizado pLXSN fueron ligados con T4 DNA 
ligasa Rapid DNA Ligation kit (Thermo Scientific), en una relación molar de 3:1, el 
producto ligado fue insertado mediante la transformación de bacterias E. coli DH5a 
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mediante el kit TransformAid Bacterial Transformation (Thermo Scientific). 5 mL de 
medio LB con 1x106 bacterias fueron crecidas por 12 horas a 37ºC, se tomaron 100 
ul y se inoculó 2 mL de medio C, se incubó por toda la noche a 37ºC con