Caracterizacion-morfologica-de-la-gla-de-Bergmann-del-lobulo-x-del-cerebelo-de-raton

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
MAESTRÍA EN CIENCIAS (NEUROBIOLOGÍA) 
INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA 
 
 
CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE LA GLÍA DE BERGMANN DEL 
 LÓBULO X DEL CEREBELO DE RATÓN 
 
 
T E S I S 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
MAESTRA EN CIENCIAS (NEUROBIOLOGÍA) 
 
 
P R E S E N T A: 
 
BIOL. GABRIELA BERENICE GÓMEZ GONZÁLEZ 
 
 
TUTOR PRINCIPAL 
DR. ATAÚLFO MARTÍNEZ TORRES 
INSTITUTO NEUROBIOLOGÍA, UNAM 
 
 
COMITÉ TUTOR 
DRA. SOFIA Y. DIAZ MIRANDA 
INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA, UNAM 
 
DR. ALFONSO CÁRABEZ TREJO 
INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA, UNAM 
 
 
 
MÉXICO, JUNIO 2014 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
2 
 
Universidad Nacional Autónoma de México 
Instituto de Neurobiología 
 
 
Los miembros del Comité Tutoral certificamos que la tesis elaborada por: Gabriela 
Berenice Gómez González, cuyo título es: “Caracterización morfológica de la glía de 
Bergmann del lóbulo X del cerebelo de ratón” se presenta como uno de los requisitos 
para obtener el grado de Maestra en Ciencias (Neurobiología) y cumple con los 
criterios de originalidad y calidad requeridos por la División de Estudios de Posgrado 
de la Universidad Nacional Autónoma de México. 
 
 
 
 Firma 
 
Presidente 
Dr. Jorge Larriva Sahd 
Secretario (Tutor) 
Dr. Ataúlfo Martínez Torres 
Vocal 
Dra. Diana Escalante Alcalde 
Suplente 
Dr. Alfredo Varela Echavarría 
Suplente 
Dra. Sofía Y. Díaz Miranda 
 
 
Aprobado por el Comité Académico 
_______________________________ 
Dr. Alfredo Varela Echavarría 
Coordinador del Programa 
3 
 
 
 
 
 
 
Dedico este trabajo a Taide González la persona que es mi inspiración, mi sostén, mi 
guía, mi alegría, mi madre. Gracias por tanto tanto, que si lo escribiera no terminaría. 
 
Agradezco a mi hermano Edgar Gómez, por sus consejos que siempre me guían, me 
dan apoyo y fuerza para seguir. 
Agradezco a mi abuelito Julián Rivera, por ser siempre nuestro apoyo constante y 
ejemplo de vida. 
Luis Jiménez, gracias por acompañarme en este camino, el cual ha sido 
indudablemente mejor a tu lado. 
A toda mi familia (tías, primos) por los ánimos y apoyo. 
 
Gracias a mis excelentes compañeros de la generación, fue un orgullo y un privilegio 
estar y aprender con ustedes, gracias por su apoyo. 
Gracias a mis amig@s de antaño por su gran apoyo a través de la distancia 
 
 
 
 
 
 
4 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por otorgarme el apoyo 
económico para llevar acabo mis estudios de Maestría en el Instituto de Neurobiología 
de la Universidad Autónoma de México como becario No. 277694 
 
Al financiamiento brindado por PAPIT (IN 200913) y CONACyT (101851). 
 
A la Dirección General de Estudios de Posgrado de la UNAM, No. Cuenta: 513003143 
 
Al Dr. Ataúlfo Martínez Torres por su tutoría durante toda la maestría, su apoyo 
constante, su responsabilidad y compromiso para con el proyecto y para con mi 
formación, por su ejemplo de trabajo. Por las oportunidades que me brindó. 
 
A los Drs. Alfonso Cárabez Trejo y Sofía Y. Díaz Miranda, por sus aportaciones y 
compromiso con el proyecto. Por sus consejos y ejemplos de vida científica, por el 
tiempo y conocimiento brindado, por apoyarme siempre. 
 
A la M.en C. Edith Espino: por su ayuda y enseñanzas, especialmente en la parte de 
biología molecular. A la M en C. Alejandra González por introducirme al mundo del 
cerebelo, por las enseñanzas, consejos, y por compartir conmigo su pasión por el 
proyecto. A la Sra. Marina Ramírez Romero por su gran apoyo con el mantenimiento 
del laboratorio. 
 
A la Dra. Guadalupe Lorenzana, Dr. Miguel Condés, Dr. Gerardo Rojas, por su amable 
ayuda y orientación en la técnica de inyección viral, y por todo el apoyo recibido. 
 
Al Biol. Edgar Morales por su asistencia técnica en el uso de software para el análisis 
de las imágenes. 
 
5 
 
A la M en C. Leonor Casanova Rico, por su asistencia y apoyo administrativo durante 
toda la maestría. 
 
A la Unidad de Microscopía: 
Ing. Elsa Nydia Hernández Ríos, por el gran apoyo brindado al enseñarme y 
orientarme en la técnica de microscopía confocal para los fines de este proyecto. 
 
Al personal del Bioterio: 
Dra. Alejandra Castilla, M.V.Z. José Martín García Servín y Efrén Ruíz Alcíbar, por el 
servicio brindado y por el mantenimiento de la colonia de ratones transgénicos y CD1. 
 
Al personal de Cómputo: 
Ing. Ramón Martínez Olvera y la I.S.C Sandra Hernández García, por su asistencia 
técnica. 
 
 
 
6 
 
ÍNDICE DE CONTENIDO 
 
 
RESUMEN .................................................................................................................... 8 
SUMMARY .................................................................................................................. 10 
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 11 
2. ANTECEDENTES ................................................................................................ 12 
El Cerebelo ........................................................................................................... 12 
2.1. Estructura anatómica y función ................................................................ 12 
2.2 Desarrollo del cerebelo ............................................................................ 14 
2.2.1 Diferenciación celular durante el desarrollo ............................................. 15 
2.2.2 Establecimiento de la corteza cerebelosa ................................................ 16 
2.3 Macrocircuitos cerebelosos: aferencias y eferencias ............................... 18 
2.4 Tipos celulares y microcircuitos ............................................................... 18 
2.5 Células Gliales ......................................................................................... 20 
2.5.1 Astrocitos y glía radial .............................................................................. 21 
2.5.2 La Glía de Bergmann ............................................................................... 22 
2.6 Interacción glía-neurona .......................................................................... 23 
2.7 Diversidad celular en el techo del cuarto ventrículo ................................. 25 
3. JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................... 27 
4. HIPÓTESIS ............................................................................................................. 28 
5. OBJETIVOS ............................................................................................................ 28 
6. MATERIAL BIOLÓGICO ......................................................................................... 28 
7. MATERIAL Y MÉTODOS ........................................................................................ 29 
7.1 Marcaje in vivo empleando un AdV recombinante como vector ..................... 29 
7 
 
7.1.1 Producción del AdV mCherry a pequeña escala ..................................... 30 
7.1.2 Lisis y filtración del virus: .........................................................................32 
7.1.3 Titulación del AdV mCherry ..................................................................... 32 
7.1.4 Inyección intracerebelosa de AdV mCherry en ratón ............................... 34 
7.2 Obtención de las rebanadas de cerebelo ................................................ 36 
7.3 Protocolo de inyección: trazador DiI (carbocianina) ................................. 37 
7.4 Obtención y procesamiento de las imágenes .......................................... 39 
7.4.1 Análisis morfométrico de la GB ................................................................ 40 
8.RESULTADOS ......................................................................................................... 42 
8.1 Estrategias de inyección viral .................................................................. 42 
8.2 Citoarquitectura de la glía de Bergmann ................................................. 44 
8.2.1 Análisis cuantitativo ................................................................................. 46 
8.2.2 Análisis descriptivo .................................................................................. 51 
9. DISCUSIÓN ............................................................................................................ 61 
10. CONCLUSIONES .................................................................................................. 66 
11. PERSPECTIVAS ................................................................................................... 66 
REFERENCIAS ........................................................................................................... 67 
ABREVIATURAS ......................................................................................................... 71 
ANEXOS ..................................................................................................................... 73 
ANEXO 1. ESTANDARIZACIÓN DE TÉCNICAS DE INYECCIÓN VIRAL ........... 73 
ANEXO 2. RESULTADOS DEL ANÁLISIS DE IMÁGENES ................................. 81 
 
 
 
 
8 
 
RESUMEN 
La composición celular en los lóbulos del cerebelo es aparentemente homogénea; sin 
embargo, antecedentes generados en el laboratorio indican la existencia de una 
diversidad celular en la capa subventricular del lóbulo X, la cual se encuentra 
adyacente al cuarto ventrículo. También en este lóbulo se ha encontrado evidencia 
que sugiere la existencia de glía de Bergmann (GB) especializada, cuyos procesos 
pudiesen extenderse hacia la luz del cuarto ventrículo. Aunado a que actualmente no 
hay una descripción morfología de la GB ventral (GBv). El presente trabajo tuvo como 
objetivo establecer sí esta población de células gliales difiere de la población de GBp 
(pial) la cual proyecta sus procesos hacia la pía. 
Para cumplir este objetivo se realizó un estudio morfológico de la vGB y la pGB, en 
ratones transgénicos (GFAP-GFP), mediante la inyección intracerebelosa de 
trazadores virales acoplados a proteínas fluorescentes (Adenovirus mCherry). A partir 
de las imágenes adquiridas por microscopía confocal, se determinó: el área y diámetro 
mayor del soma, el número de procesos principales y la longitud total de cada 
proceso. Posteriormente se evaluó, el destino y disposición de los procesos de la GB 
pertenecientes a las dos poblaciones mencionadas. 
Las observaciones sugieren que sólo existen diferencias significativas entre las 
poblaciones de GB en cuanto al soma (área y diámetro mayor). Sin embargo se 
encontró que en cuanto a los procesos, en comparación con la GBp, los procesos de 
la GBv proyectan hacia tres destinos diferentes, lo cual permitió clasificarla en tres 
grupos: 1) las GB que proyectan sus procesos hacia la región subventricular, 2) las 
que proyectan hacia un cúmulo de células que son positivas para nestina y 3) las que 
proyectan hacia la región periventricular. Estos hallazgos no descartan la existencia de 
diferencias a nivel ultraestructural. 
Por otra parte, el análisis sistemático de la región subventricular del lóbulo X permitió 
la identificación de un cúmulo celular llamado cúmulo periventricular medial del 
cerebelo (CPMC), compuesto por alrededor de 12 células (algunas de ellas GFAP 
positivas). Éste, se distingue por encontrarse en la capa periventricular, estar en 
9 
 
contacto con el lumen del ventrículo (zona anterior) y con el plexo coroideo (zona 
posterior); además de estar rodeado de astrocitos que proyectan sus procesos hacia 
él. La función de este novedoso cúmulo de células es desconocida actualmente. 
 
10 
 
SUMMARY 
 
It seems that the cellular composition is homogeneous in the cerebellar lobules; 
nevertheless, recent studies have shown the existence of a cellular diversity in the 
subventricular layer of the lobule X, that lines the fourth ventricle. In addition, in this 
lobule some evidence suggests the existence of specialized Bergmann glia (BG), 
whose processes extend towards the light of the fourth ventricle. Nonetheless, there is 
not a detailed description about the morphology of this ventral BG (vBG). 
The aim of this study was to determine whether the BGs of the lobe X differ from the 
pial BG (pBG), which projects its processes towards the pia. 
For this purpose, a morphological study about vBG and pBG was made in GFAP-GFP 
transgenic mice, using an intracerebellar injection of viral tracers attached to a 
fluorescent protein (Adenovirus mCherry). Based on the images acquired by confocal 
microscopy, the BG was characterized determining: the area and diameter of soma, 
the number of principal processes and the length of each one. Later, the destination 
and arrangement of BG processes were evaluated on both populations. 
The results suggest that there is only a significant difference in the soma (area and 
diameter) between the parameters evaluated in both populations. Nevertheless respect 
to the processes, it was found that vGB processes project to different sites. This aspect 
allow to classify them into 3 groups: 1) BG processes that project to the subventricular 
zone, 2) BG process that reach a nestin positive cellular cluster, and 3) BG processes 
whose project to the periventricular zone. These findings do not discard the possibility 
that ultrastructural differences exist between BG groups. 
On the other hand, the systematic analysis of the lobule X subventricular zone 
identified a cluster (CPMC) of around 12 cells (some of them GFP positive), that is 
characterized by: being in the periventricular zone, in contact with the ventricle’s lumen 
and choroid plexus, and contacted by processes of astrocytes localized around it. The 
function of this cluster is currently unknown. 
 
11 
 
1. INTRODUCCIÓN 
 
El cerebelo es considerado como una “máquina neural” cuya complejidad funcional se 
asocia a la presencia de circuitos neuronales intrincados que intervienen en el 
procesamiento de información relacionada a la coordinación de la destreza motriz 
mediante sinapsis inhibitorias y excitatorias (Ito, 2012). En las últimas cinco décadas 
diversos estudios basados en modelos de plasticidad sináptica, aprendizaje–error y 
adaptación sugieren la participación del cerebelo en la coordinación de procesos de 
aprendizaje motor, cognitivos-emocionales y acciones motoras complejas (Bellamy, 
1997; Grosche et al., 2002; Lippman et al., 2008; Schmahmann, 2010; Ito, 2012). 
Se sabe que la glía (astrocitos) y de manera específica la glía de Bergmann (GB) 
juegan un papel fundamental en la integración sináptica dentro de los circuitos 
neuronales del cerebelo. Esto es debido a que estas células modulan procesos de 
sinaptogénesis, migración, neurotransmisión y maduración neuronal, a través de su 
interacción con las neuronas de Purkinje (Grosche et al., 2002; Lippman et al., 2008). 
Toda esta información se ha obtenido gracias a estudios electrofisiológicosy 
morfológicos empleando técnicas clásicas como la tinción de Golgi o más 
recientemente con el uso de modelos de ratones transgénicos y knock out, entre otros. 
Sin embargo, es muy limitada la información que se tiene acerca de la fisiología y/o 
morfología de la GB presente en el lóbulo X cerebeloso, cuyos procesos están 
orientados hacia el IV ventrículo. Por lo que su estudio morfológico y funcional podría 
dar indicios sobre el papel que desempeña la GB en esta zona, en la homeostasis del 
cerebelo. 
 
 
 
 
 
 
12 
 
2. ANTECEDENTES 
El Cerebelo 
2.1 Estructura anatómica y función 
El cerebelo está situado en la parte posterior de la base del cerebro, se une a éste 
mediante los pedúnculos cerebelosos, que son extensos tractos de fibras aferentes y 
eferentes. Es una estructura que se conserva de forma regular en los vertebrados, fue 
descrita desde los años 300-250 d.C. por Erasistrato y cuyas características 
morfológicas han sido analizadas de manera rigurosa desde mediados del siglo XX 
(Ito, 2012). Durante el desarrollo, se origina a partir del metencéfalo y al igual que el 
cerebro, el cerebelo está compuesto por dos hemisferios, que se expanden a partir del 
vermis (Figura 1a) y que están divididos por las fisuras posterolateral y primaria en 
tres regiones (floculo-nodular, anterior y posterior). Cada una de las regiones 
mencionadas se subdividen en lóbulos mediante fisuras transversales. De manera 
general el cerebelo está integrado por 10 lóbulos numerados del I-X, que se 
caracterizan por la presencia de folias (pliegues de la corteza cerebelosa) (Figura 1c). 
Este patrón de organización se presenta en todos los mamíferos, con ciertas variantes 
entre las especies (Watson et al., 2012). Richard Hawkes definió cuatro zonas antero-
posteriores transversas en las que se agrupan dichos lóbulos de acuerdo al patrón de 
marcadores moleculares: zona anterior (lóbulo I-V), zona central (lóbulo VI-VII), zona 
posterior (lóbulo VIII- dorsal IX) y zona nodular (lóbulo ventral IX-X). Al mismo tiempo 
dichas zonas transversas están delimitadas funcionalmente a través de la expresión 
genética diferencial (Watson et al. 2012). 
 
El lóbulo X, también llamado nódulo según la clasificación de Inouye y Oda (Watson et 
al., 2012), conforma el borde superior del IV ventrículo, también conocido como techo 
del ventrículo (Figura 1b-1c). Siendo la zona de interés particular de este proyecto. 
 
 
13 
 
 
Figura 1. Localización y anatomía externa del cerebelo de ratón (cepa C57BL6). A.- vista dorsal, 
B.- Corte coronal a nivel de la línea b mostrada en la figura a. La zona de interés se señala en el 
recuadro. C.- Sección media sagital del cerebelo a nivel del vermis (línea c), donde se muestran los 
lóbulos. Barra 1mm. (Adaptado y modificado de Watson et al., 2012). 
 
El cerebelo ha sido asociado a varias funciones integradoras de tipo motor y somato-
sensorial que residen principalmente en el área anterior del cerebelo. Entre estas se 
han descrito: coordinación y aprendizaje motor, control del movimiento ocular fino, 
adaptación del reflejo vestíbulo-coclear y un sistema detector que compara los 
movimientos predictivos con los ejecutados (Glickstein et al., 2006; Ito, 2008). Sin 
embargo, estudios realizados en los últimos años, sugieren la intervención de la zona 
del vermis-posterior del cerebelo en el procesamiento y coordinación de información 
cognitiva, emocional así como en la ejecución del lenguaje; por ello se plantea la 
existencia de un circuito pre fronto-límbico-cerebeloso, que permite el desarrollo de 
estas funciones (Schmahmann, 2010; Koziol, 2013). Estos antecedentes han llevado a 
generar una nueva teoría sobre la función general del cerebelo, la cual lo define como 
una estructura encargada de secuenciar el procesamiento de información (aferencias) 
y las respuestas (eferencias), independientemente de si la información es de tipo 
motor, sensorial o de tipo conductual o emocional (Leggio, 2011; Koziol, 2013). 
 
14 
 
2.2 Desarrollo del cerebelo 
De manera general el desarrollo del cerebelo durante la embriogénesis se da a partir 
de la coordinación precisa en la activación y/o expresión, a nivel temporal y espacial, 
de factores de transcripción, genes homeóticos y moléculas secretadas tales como 
fgf8: fibroblast growth factor 8, Wnt1, Enx1-2: engrailed, Pax2, 5: paired, Gbx2: 
gastrulation (Sotelo, 2004; Millet et al., 1999). Además, este proceso se acompaña de 
una serie de movimientos e interacciones celulares indispensables (Watson et al., 
2005). En conjunto estos arreglos moleculares y celulares, posteriormente establecen 
los circuitos que integran el cerebelo, y determinan la arquitectura laminar que lo 
caracteriza (corteza cerebelosa, folias, lóbulos) (White y Sillitoe, 2011). 
El desarrollo del cerebelo, junto con el resto del SNC, comienza con el enrollamiento 
de la placa neural lo cual da origen tubo neural. Posteriormente en él se generan 
patrones de expresión génica los cuales establecen los ejes antero-posterior (AP) y 
dorso-ventral (DV). La zona más anterior del eje AP origina el prosencéfalo que 
contiene al telencéfalo y diencéfalo, mientras que la parte posterior forma el 
mesencéfalo, rombencéfalo y médula espinal. A su vez el rombencéfalo se divide en 
siete segmentos llamados rombómeros, siendo el rombómero 1 el que da origen al 
cerebelo (Figura 2) (Chizhikov y Millen, 2003; Sotelo, 2004). 
La diferenciación del rombencéfalo y mesencéfalo está marcado por la expresión de 
Wnt1 y Fgf8 a partir de una región reguladora llamada istmo organizador (IsO), la cual 
se localiza en el borde limitante (Figura 2) (Wang et al., 2005; Millet, 1999). Una vez 
establecida y diferenciada la región protocerebelo, éste comienza un largo periodo de 
maduración caracterizado por el establecimiento de los diferentes componentes 
celulares, que en el ratón culmina hasta el día postnatal 15 (Chizhikov y Millen, 2003). 
15 
 
 
Figura 2. Esquema del desarrollo embrionario del SNC en el ratón. A: anterior, D: dorsal, P: 
posterior, V: ventral, tel: telencéfalo, di: diencéfalo, rh: rombómero, IsO: istmo organizador. (Modificado 
de Chizhikov y Millen, 2003) 
 
 
2.2.1 Diferenciación celular durante el desarrollo 
Las células que integran al cerebelo se desarrollan a partir de precursores de tipo 
neuronal originados en dos zonas germinales: la cresta rómbica “rhombic lip” y la zona 
ventricular (IV ventrículo) (Watson et al, 2012; Sudarov et al., 2011; Larouche y 
Hawkes, 2004; Chizhikov y Millen, 2003). Los precursores de células granulares 
(PCG) y las células de los núcleos cerebelosos profundos (cNCP) provienen de la 
cresta rómbica; mientras que neuronas e interneuronas como las células de Purkinje, 
las células de Golgi, células estrelladas, células en canasta y astrocitos como la GB, 
se desarrollan en el ratón, desde el día embrionario (dE) 9 a partir de precursores 
originados en la zona ventricular, (Watson et al, 2012; Sudarov et al., 2011; Larouche 
y Hawkes, 2004; Chizhikov y Millen, 2003). En cuanto a las interneuronas inhibitorias 
se sabe que sus precursores originados en la zona ventricular migran hacia la materia 
blanca. 
El modelo propuesto por Sudarov et al., en 2011, respecto a la ventana temporal en la 
que se generan los diferentes tipos celulares en el ratón es el siguiente: durante la 
embriogénesis temprana (dE 10.5-13.5) se originan las CP y las de los NCP, 
posteriormente en la embriogénesis tardía (dE 13.5- dp 0) se origina la GB y las 
16 
 
células de Golgi, es durante este lapso que la GB madura y migra para ejercer la 
función de andamio para las CG recién diferenciadas. Durante el estadio postnatal 0-5 
dp se generan las células en canasta y en el estadio dp 5-15 las células estrelladas, 
ambas son interneuronas. 
El establecimiento de la identidad de cada tipo celular que conforma el cerebelo, 
dependede la actividad genética regulada por señales moleculares locales, como por 
ejemplo Math1, Bmp6, Bmp7 y Gdf7 (Watson et al, 2012, Larouche y Hawkes, 2004). 
La cresta rómbica es una región especializada que se localiza en el techo del cuarto 
ventrículo, la cual funciona como un centro generador de rutas celulares migratorias a 
nivel del cerebelo y fuera de él, que contribuye a establecer las redes sensoriales de 
propiocepción, vestibular y auditiva. Dichas redes le permiten al organismo 
posicionarse en el espacio (Hachem et al., 2007; Wang et al., 2005). 
 
2.2.2 Establecimiento de la corteza cerebelosa 
La migración celular permite el establecimiento de las capas laminares de la corteza 
del cerebelo. En el ratón en los dE 12-13 ocurre una migración tangencial de los 
progenitores de las neuronas granulares sobre la superficie del cerebelo, lo cual forma 
la capa granular externa (cGE) (Figura 3A). Ésta se considera como un epitelio 
germinal secundario que se mantiene mitóticamente activa hasta la segunda semana 
postnatal, tiempo durante el cual da origen a neuronas como las células de Golgi y las 
células unipolares en cepillo (Larouche y Hawkes, 2004). 
Para el día postnatal 1 (dp) los PCG comienzan a diferenciarse en neuronas 
granulares maduras (células granulares (CG)), las cuales migran hacia el interior de la 
corteza del cerebelo a través de las fibras radiales de la GB inmadura, estableciendo 
así para el dp 15, la capa granular interna (cGI) (Figura 3B). Esta migración, se da por 
medio de la interacción de la proteína neuregulina expresada en las CG, y por el 
receptor a ésta (erbB), el cual, junto con otras proteínas como nestina, BLBP, 
astrotactina 1-2, se expresan en la GB inmadura y madura permitiéndole funcionar 
como andamio en la migración (Buffo y Rossi, 2013; Sotelo, 2004; Rio, et al. 1997). 
17 
 
Por su parte entre las CP un vez que terminaron de dividirse (dE 10/13) establecen 
una arreglo transitorio a manera de cúmulos el cual dura de 2-3 días, transcurrido el 
tiempo la señalización de la proteína reelin promueve la disociación de dichos cúmulos 
y la migración tangencial de las células desde la zona ventricular hacia la corteza de 
cerebelo a través de los proceso de la GB inmadura. Una vez allí, se establecen a 
manera de monocapa dando origen a la capa de neuronas de Purkinje (dE 19 al dp 4) 
(Larouche y Hawkes, 2004; Sotelo, 2004). Durante estos procesos de migración, la GB 
(inmadura y madura) juega un papel fundamental en la formación de la corteza 
cerebelosa (corticogénesis) al favorecer el establecimiento de la capa de Purkinje y 
por consiguiente la expansión de la capa granular (cG) y la capa molecular (CM). 
Posteriormente junto con las CP intervienen en la foliación de la corteza (Buffo y 
Rossi, 2013). 
 
Figura 3. Establecimiento de las capas de la corteza cerebelosa. Se muestra las dos zonas 
germinales en el embrión, A.- Establecimiento temprano de la CGE, B.- Formación de la CGI, la capa 
molecular y capa de Purkinje a partir de la migración celular. (Adaptado y modificado de Patel y 
Barkovich, 2002). 
 
18 
 
2.3 Macrocircuitos cerebelosos: aferencias y eferencias 
El cerebelo de mamíferos incluye tres núcleos neuronales embebidos en la materia 
blanca profunda; estos son: el medial, el interpuesto y el lateral. Los núcleos 
cerebelosos constituyen la principal vía de eferencias, las cuales proyectan hacia el 
tálamo y la médula espinal (Kettenmann y Ransom, 2005; Ito, 2012). 
En cuanto a las aferencias, las cuales fueron descritas en 1911 por Ramón y Cajal, se 
sabe existen tres vías principales constituidas por fibras que llevan información hacia 
el cerebelo: 1) Las fibras trepadoras, que tienen su origen en el núcleo olivar inferior 
de la médula. 2) Las fibras musgosas cuyo origen es múltiple (médula, puente), 
constituyen una vía aferente indirecta hacia las células de Purkinje. 3) Las fibras 
delgadas que provienen del locus coeruleus y núcleo del rafe; que proyectan hacia la 
corteza y núcleos del cerebelo (Kettenmann y Ransom, 2005; Ito, 2012). 
 
 
2.4 Tipos celulares y microcircuitos 
El tejido nervioso que integra al cerebelo se encuentra histológicamente dispuesto en 
tres capas, cuya distribución en dirección externa a interna son las capas: molecular, 
la de células de Purkinje y la granular; cada una con una composición celular distintiva 
(Ito, 2012) (Figura 4). La capa molecular está compuesta principalmente por dendritas 
de las células de Purkinje (CP), axones de las células granulares (fibras paralelas) e 
interneuronas (células estrelladas “stellate cells” y de canasto “basket cells”), (Watson 
et al., 2012). La capa de células de Purkinje está compuesta principalmente por los 
somas de dichas células que forman una monocapa, incluye además los somas de la 
glía de Bergmann (GB) y de las células de candelabro. La capa granular que se 
encuentra circundando el centro medular del cerebelo, está compuesta por las células 
granulares que son las más abundantes en el cerebro, las células en cepillo (“brush 
cells”), los somas de las células de Golgi y las interneuronas de Lugaro, (Watson et al., 
2012). 
19 
 
En conjunto estas células (fibras, interneuronas, neuronas, glía) constituyen un circuito 
a través de sinapsis excitatorias e inhibitorias que operan mediante la liberación-
recepción de neurotransmisores como: Glutamato y GABA (Lino et al., 2001; Lee et al. 
2010) (Figura 5.). Este circuito modula el procesamiento de las señales que 
convergen en el cerebelo de manera que le permite dar una respuesta de salida 
adecuada al estímulo, a través de las vías aferentes y eferentes (Ito, 2012). 
 
 
 
 
Figura 4. Composición celular de la corteza del cerebelo. Los números señalan los diferentes tipos 
de células y su disposición en las tres capas (10-12). La GB se representa en verde. (Esquema 
modificado y adaptado de Netter, 2008). 
 
Glía de 
Bergmann 
20 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Circuito neuronal del cerebelo. Los signos positivos indican sinapsis excitatoria, mientras 
que los negativos las inhibitorias. (Esquema modificado de Netter, 2008). 
 
 
2.5 Células Gliales 
En el encéfalo se encuentran principalmente dos clases de células: neurona y glía. La 
diferencia principal entre ambas radica en la excitabilidad eléctrica que poseen las 
neuronas, mientras que la glía carece de esta. Por lo tanto la glía no genera 
potenciales de acción, aunque expresa en su membrana plasmática canales 
dependientes de voltaje (Verkhratsky y Butt, 2007). La glía constituye 
aproximadamente el 90% de todas las células del cerebro humano, encontrándose en 
una proporción de 3:1, con respecto a la población neuronal (Lippman, et al., 2008). 
 
En el SNC, la glía se encuentra representada por dos tipos de células; el primer tipo 
llamado macroglía o neuroglía de origen ectodérmico constituye aproximadamente el 
85-90% de la población glial, e incluye astrocitos, oligodendrocitos y células 
ependimales. El segundo grupo denominado microglía, se compone de células de 
origen mesodérmico, que llegan al cerebro durante el desarrollo temprano y cumplen 
la función de macrófagos durante procesos infecciosos o de lesión (Kettenmann y 
21 
 
Ransom, 2005). En el Sistema Nervioso Periférico (SNP), la glía se encuentra 
representada por las células de Schwann (Verkhratsky y Butt, 2007). 
 
2.5.1 Astrocitos y glía radial 
De la macroglía, los astrocitos (células estrelladas) constituyen el grupo más 
abundante (80%) y diverso. Estas células poseen una morfología general 
caracterizada por la presencia de un soma del cual se originan diversos procesos 
primarios (“stem processes”). Presentan filamentos intermedios que forman el 
citoesqueleto y que son formados por proteínas que caracterizan a este tipo celular 
que incluyen a la proteína ácida fibrilar glial (Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP) y lavimentina; es por ello que la expresión de GFAP es utilizada para la identificación de 
astrocitos. La expresión de GFAP es diferencial dependiendo del tipo glial, siendo 
abundante en prácticamente toda la población de la glía de Bergmann en el cerebelo, 
y solamente se expresa en el 15-20% de los astrocitos presentes en la corteza e 
hipocampo (Nolte, 2001; Verkhratsky y Butt, 2007). 
La población de astrocitos a su vez se compone de dos grupos: 
1) Los verdaderos que comprenden a los astrocitos protoplásmicos y a los astrocitos 
fibrosos, presentes en la materia gris y en la materia blanca, respectivamente. 
2) La glía radial cuyas células bipolares poseen un soma ovoide y procesos largos. 
Esta glía presenta dos tipos principales de procesos: 1) aquellos que proyectan hacia 
la pared ventricular y 2) aquellos que proyectan hacia la superficie pial (Reichenbach 
et al., 1995; Grosche et al., 2002; Kettenmann y Ransom, 2005; Verkhratsky y Butt, 
2007). La glía radial se encuentra distribuida de manera amplia durante el desarrollo 
temprano del cerebro, donde participa en la migración neuronal en los primeros 
estadios embrionarios. Después de la maduración, este tipo glial desaparece de 
muchas de las regiones del cerebro, quedando únicamente en la retina (glía de Müller) 
y en el cerebelo como GB (Reichenbach et al. 1995; Verkhratsky y Butt, 2007). 
 
22 
 
2.5.2 La Glía de Bergmann 
Las células que constituyen la glía de Bergmann (GB) también denominada célula 
epitelial de Golgi “Golgi epithelial cell” (Kettenmann y Ransom, 2005), se caracterizan 
por tener somas de aproximadamente 15m de diámetro localizados en la capa de 
Purkinje (Kettenmann y Verkhratsky, 2013), poseen de tres a seis procesos delgados 
pero altamente complejos que se extienden desde la capa molecular hacia la capa de 
la pía (Lipmman 2008; Kettenmann y Ransom, 2005) así como pequeñas protrusiones 
(microdominios) que se extienden a partir de proyecciones mayores. El pie terminal de 
la GB localizada en las folias cerebelosas contacta con la pía, formando la glía 
limitante (Figura 6). Sin embargo la morfología de la GB localizada en las folias 
inferiores cuyos procesos proyectan en dirección al ventrículo no ha sido descrita de 
manera particular. 
Los procesos de la GB presentan microdominios aislados eléctricamente que forman 
pequeñas unidades funcionales mediante la sincronización con grupos de sinapsis 
(Bellamy, 2006; Grosche et al., 1999). Dichos procesos se caracterizan por ser 
altamente dinámicos, con patrones motiles similares al de las espinas, por poseer la 
capacidad de formar nuevos procesos, crecer y retraerse de manera lateral (Lippman 
et al., 2008). Además, funcionan como andamios que dirigen la migración de las 
células granulares durante el desarrollo postnatal (Xu et al., 2013) así como en el 
crecimiento dendrítico de las CP (Bellamy, 2006; Lippman et al., 2008). La GB rodea y 
recubre a las neuronas de Purkinje, cubriendo sus terminales dendríticas de tal 
manera que se encuentra conectada al propio recubrimiento sináptico (Lippman et al., 
2008). Cada GB recubre entre 2000 y 6000 de estos puntos sinápticos (Kettenmann y 
Ransom, 2005). 
El recubrimiento sináptico glial se encuentra distribuido a lo largo del cerebro, de 
manera específica en la zona del hipocampo, corteza y cerebelo; sin embargo, el 
grado de recubrimiento varía según la región (Lippman et al., 2008). A medida que se 
reduce el recubrimiento glial, se incrementa la sinaptogénesis (; Lippman et al., 2008; 
Grosche et al., 2002). Se ha demostrado que alteraciones en la morfología de la GB y 
en el recubrimiento que ésta ejerce tiene varios efectos como la alteración en el 
23 
 
número de las sinapsis que se establecen en la CP, la neurodegeneración de las CP, 
problemas de memoria y alteraciones en la plasticidad sináptica (Lippman et al., 2008, 
2010; Wang et al., 2011). Por lo tanto, existe una correlación temporal entre el 
incremento del número, longitud y complejidad de los procesos de la GB durante el 
desarrollo y el incremento en el recubrimiento sináptico que ejerce. Se sabe que este 
recubrimiento sobre la CP en el cerebelo interviene en la desarrollo y número de las 
sinapsis, más no en la motilidad o densidad de las espinas dendríticas (Lippman et al., 
2008; 2010). 
 
 
Figura 6. a.- Disposición de la GB (rosa) en una representación tridimensional de una folia del cerebelo, 
y su interacción con otros componentes celulares de la zona, como astrocitos protoplasmáticos (verde), 
fibras musgosas y trepadoras (gris). b.- Morfología característica de una célula de GB de la corteza 
cerebelosa. c.- Relación morfológica entre la GB (verde) y la CP (rojo). Barra en b, 10 ; en c, 20 . 
(Adaptado y modificado de Brockhaus et al., 2002; Hoogland et al., 2010; Lino et al., 2001). 
 
 
2.6 Interacción glía-neurona 
Descubrimientos recientes, indican que la relación glía-neurona va más allá de 
conformar estructuralmente la materia cerebral. Se ha demostrado que la glía 
interviene en la plasticidad, regulación y maduración de las sinapsis (Lippman et al., 
2008, 2010; Verkhratsky y Butt, 2007; Kettenmann y Ransom, 2005). En el cerebelo 
las proyecciones de la GB son una de las estructuras encargadas de dicho papel 
24 
 
(Grosche et al., 2002; Lippman, 2010). En principio estas interacciones son 
principalmente de tipo glutamatérgico o GABAérgico, y están asociadas con la 
sinapsis tripartita. 
De manera que en cuanto a las interacciones glutamatérgicas, la GB participa en la 
homeostasis de la neurona mediante la remoción del K+, la recaptura reversible y la 
liberación de glutamato (Barakat y Bordey, 2002; Brockhaus et al., 2002). Estas 
funciones se deben en parte, a la presencia de receptores a glutamato permeables a 
Ca2+ en los procesos y soma de la GB. Dichos receptores son co-activados durante la 
transmisión sináptica de las CP (Barakat y Bordey, 2002) y permiten la liberación del 
“gliotransmisor” por la despolarización de la célula glial, ejerciendo efectos depresivos 
de largo plazo en la CP (Brockhaus et al., 2002). De manera específica se sabe que la 
GB posee la mayor cantidad de receptores AMPA (tipo GluA1 y GluA4) del cerebelo, 
mediante los cuales regula la sinapsis glutamatérgica de la CP (Lino et al., 2001). Los 
efectos funcionales de esta interacción se reflejan a nivel de la coordinación motora 
fina en la que está directamente involucrada la GB (Saab et al., 2012). 
Otra evidencia entre la interacción GB-neurona es la generada a través del ácido 
amino-γ butírico (GABA). Este neurotransmisor inhibitorio es liberado de las neuronas 
de manera fásica a través de mecanismos de exocitósis dependientes de Ca2+, en 
contraste la glía lo libera de manera tónica a través del canal aniónico Best1 y es 
independiente de la concentración de Ca2+ (Lee et al., 2010). Por otra parte, se sabe 
que en la zona ependimal y subventricular del cuarto ventrículo del cerebelo, existen 
poblaciones celulares (células ependimales, CE) que presentan receptores para dos 
de las subunidades del receptor GABA-A (GABAρ1, GABAα) (Reyes-Haro et al., 
2012). Se tiene evidencia de que las CE responden al GABA a través de estos 
receptores ionotrópicos, por lo que tomando en cuenta el hecho de que la glía en el 
cerebelo libera tónicamente GABA, existe la posibilidad de que en esta zona existan 
interacciones funcionales en las que participa este neurotransmisor. 
 
 
25 
 
2.7 Diversidad celular en el techo del cuarto ventrículo 
Existe evidencia de una diversidad celular en cuanto a componentes y perfiles de 
corrientes en las poblaciones celulares localizadas en la capa subventricular del cuarto 
ventrículo (lóbulo X) (Reyes-Haro et al., 2013) (Figura 7). Dichas poblaciones se 
componen de oligodendrocitos, astrocitos, GB, CE y CP, entre otras. Estas células 
expresan receptores o transportadores para diversosneurotransmisores, entre ellos 
GABA y Glutamato (Fritchy et al., 2006; Lee et al., 2010; Reyes-Haro et al., 2013). 
Aunado a ello, observaciones recientes realizadas en el laboratorio (González-
González, tesis de maestría 2012; Pereida-Jaramillo, servicio social), sugieren la 
existencia de GB cuyos procesos contactan la luz del ventrículo (Figura 8), lo cual 
muestra la existencia de una heterogeneidad morfológica de la GB de la zona. 
 
Figura 7. Corte coronal a la altura del cuarto ventrículo, lóbulo X cerebeloso del ratón GFP/GFAP. 
Glía de Bergmann (GB), células gliales ependimales (EGCs), capa molecular (ML), cuarto ventrículo 
(IV), (Modificado de Reyes-Haro et al. 2012). 
 
26 
 
 
Figura 8. Glía de Bergmann con proyecciones en contacto con el IV ventrículo. a) impregnación 
argéntica en un corte coronal de cerebelo de ratón, donde se observan los procesos de la GB que 
contactan con la luz del ventrículo (punta de flecha). b) Inmunohistoquimica para nestina (verde) y 
contratinción con yoduro de propidio (rojo) en un corte coronal de cerebelo de ratón. Se indica con una 
cabeza de flecha un proceso de la GB que se extiende hacia la luz del ventrículo. IV: cuarto ventrículo. 
Barra: 100 µm. 
 
 
González-González 2012 Pereida-Jaramillo 2012 
IV 
a b 
27 
 
3. JUSTIFICACIÓN 
 
Actualmente no existen descripciones detalladas de la morfología o de la 
electrofisiología de la glía de Bergmann (GB) localizada en el lóbulo X del cerebelo. 
Esta GB se caracteriza porque sus proyecciones no se dirigen hacia la pía, sino que 
proyectan en dirección del IV ventrículo. Los antecedentes generados recientemente 
en el laboratorio indican la existencia de diversidad celular en esta zona (Reyes-Haro 
et al. 2012) y la posible existencia de GB especializada cuyos procesos pudiesen 
extenderse hacia la luz del ventrículo. Por ello es importante determinar si esta 
población de células gliales difiere de la población de GB localizada en las folias que 
proyectan hacia la pía (Reinchenbach et al., 1995; Glickstein, 2006), la cual se sabe 
participa de manera activa en la sinapsis y metabolismo de neuronas de Purkinje 
(Barakat y Bordey, 2002; Grosche et al. 2002). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
4. HIPÓTESIS 
Debido a que la organización celular del lóbulo X del cerebelo es heterogénea y varía 
con respecto a la organización del resto del cerebelo, se espera que las propiedades 
morfológicas de la glía de Bergmann presentes en esta zona sean diferentes en 
comparación con las de la glía de Bergmann que proyecta hacia la pía. 
 
5. OBJETIVOS 
1. Describir la cito-arquitectura de la GB localizada en el techo del cuarto ventrículo 
(lóbulo X del cerebelo). 
2. Determinar el destino de las proyecciones de esta población de GB e identificar sí 
existe alguna interacción física con células aledañas. 
3. Comparar la cito-arquitectura de la GB que proyecta hacia la pía y la que está 
presente en techo del cuarto ventrículo (lóbulo X del cerebelo). 
 
6. MATERIAL BIOLÓGICO 
Para la realización de este proyecto se emplearon camadas de ratones de la cepa 
CD1, hembras y machos de 60 días postnatales, así como ratones transgénicos GFP-
GFAP (Nolte et al., 2001) machos jóvenes de aproximadamente 60 días de edad. Se 
utilizaron células HEK293 para la propagación del adenovirus recombinante. 
 
 
 
 
 
29 
 
7. MATERIAL Y MÉTODOS 
 
Citoarquitectura de la glía de Bergmann (GB) del lóbulo X 
Para realizar el primer objetivo, el cual consiste en identificar la morfología de la GB 
localizada en el lóbulo X del cerebelo, se utilizó un adenovirus (AdV) recombinante 
serotipo 5 Ad-mCherry (Vector BioLabs, Philadelphia, U.S.A., Cat. 1767) que expresa 
a la proteína mCherry bajo el control del promotor de los genes tempranos del 
citomegalovirus humano (CMV). Se empleó la técnica de marcaje in vivo con este 
adenovirus, y se detectó la proteína fluorescente (excitación λ587nm, emisión 
λ610nm), primero en células HEK293 en cultivo y después de la microinyección en los 
ventrículos laterales de ratón. 
 
La expresión del mCherry aunada a la expresión de la proteína verde fluorescente 
GFP (excitación λ509nm, emisión λ488nm) que se expresa de manera endógena en la 
células positivas a GFAP (astrocitos) del cerebelo en el ratón transgénico GFAP-GFP, 
permitirá corroborar y ubicar con mayor facilidad si la célula infectada corresponde a 
un astrocito (GB). De esta manera y tomando como referencia la morfología 
característica de la GB (Grosche et al., 2002; Lippman et al., 2008), se pretende 
identificar y describir la morfología de la GB que no proyecta hacia la pía, presente en 
la región del lóbulo X del cerebelo. 
 
7.1 Marcaje in vivo empleando un AdV recombinante como vector 
La metodología empleada para la implementación de esta técnica fue la siguiente: 
 Producción del AdV mCherry a pequeña escala. 
 Lisis y filtración de AdV mCherry 
 Titulación del AdV mCherry 
 Inyección intracerebelosa (parénquima) de AdV mCherry en ratón GFAP-GFP 
 
30 
 
7.1.1 Producción del AdV mCherry a pequeña escala 
El objetivo de este paso fue la producción de material viral a partir de la alícuota 
comercial AdV mCherry mediante el siguiente procedimiento: 
I. Cultivo de células HEK-293: 
A partir de un cultivo celular mantenido en medio DMEM (Gibco, Thermo Fisher 
Scientific Inc., U.S.A, Cat.11995-040) a 37°C en botellas T-175 (Corning CellBIND, 
Sigma-Aldrich, U.S.A, Cat. CLS3290) con una confluencia celular de 90-100% (botella 
fundadora), se realizó un pase en proporción 1:6, es decir, se distribuyó en 6 botellas 
de la siguiente manera: 
 
 Se mantuvo a 37ºC (baño maría) el medio DMEM, tripsina-EDTA (Gibco, 
Thermo Fisher Scientific Inc., U.S.A, Cat. 25300-096), suero bovino fetal (SBF) 
(Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., U.S.A,, Cat.10438-028), y PBS 1X, pH 7.4 
(NaCl 137mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2HPO4 2 mM ) 
 Se preparó un stock de 500ml de medio DMEM/SBF 10%. 
 A cada botella T-175 se le agregaron 28 ml del medio para cultivar. 
 Se retiró el medio de la botella fundadora (~30ml) y se le adicionaron 7 ml de 
PBS para lavar la monocapa celular. A esta misma botella se le adicionó 7 ml 
de tripsina para desprender la monocapa celular. Se dejó actuar durante 5 min 
a 37ºC en cámara CO2/O2. Posteriormente se le agregaron 7 ml de medio 
DMEM/SBF 10% para detener el efecto de la tripsina. Finalmente, de la botella 
fundadora se tomaron 2.3 ml, los cuales fueron agregados a cada una de las 6 
botellas que contenían 28 ml del medio DMEM/SBF 10%. 
 Las botellas se mantuvieron en incubación en una cámara de CO2/O2 a 37ºC, 
hasta que volvieron a tener una confluencia celular del 90-100%. 
 De las 6 botellas cultivadas, una se utilizó para continuar con la producción de 
la línea celular HEK-293. Las 5 botellas restantes se emplearon para la 
propagación del AdV. 
 
 
31 
 
II. Infección de células HEK-293: 
Una vez que la confluencia celular de las 5 botellas previamente cultivadas con células 
HEK-293 llegó al 70-80% se procedió a infectarlas con el AdV mCherry con el objetivo 
de producirlo a pequeña escala, para lo cual se empleó el siguiente protocolo: 
 El sobrenadante viral almacenado a -80ºC, se calentó a 37ºC. 
 Se agregaron 5 ml del sobrenadante a cada botella con células HEK-293. 
 Se mezcló ladeando la botella suavemente y se dejó incubando a 37ºC en una 
cámara de CO2/O2. 
 Cuando el efecto citopático (CPE) del virus sobre el cultivo celular fue del 80-
85%, se procedió a la cosecha del mismo. 
 
III. Cosecha del AdV mCherry: 
 
 El contenido de las botellas con células infectadas con el virus se repartió de 
manera equitativa en 4 tubos Falcon (Corning Incorporated, U.S.A, Cat. 431720) 
de 50 ml c/u. 
 Los tubos de 50ml se centrifugaron a 8,000 rpm a 37ºC durante 2 min. 
 Se decantó el sobrenadante y se almacenó a -80ºC paraposteriores 
infecciones. 
 Las “pastillas” (virus más detrito celular) obtenidas de la centrifugación, se re-
suspendieron en 5 ml de DMEM cada una. 
 Finalmente se almacenaron a -80ºC, hasta su uso. 
 
Este protocolo se repitió periódicamente hasta obtener el material viral suficiente (600 
ml/producción a pequeña escala). 
 
32 
 
7.1.2 Lisis y filtración del virus: 
Debido a que el material obtenido posee células además del virus, fue necesario lisar 
las células faltantes para liberar las partículas virales (PV). 
 La pastilla y el medio DMEM fueron colocados a una temperatura de 37ºC y se 
congelaron nuevamente a una temperatura de -70ºC. Este procedimiento se 
repitió dos veces más. 
 Las pastillas se pasaron a un tubo Falcon de 50 ml y se agitaron fuertemente 
con vortex para homogenizar el contenido celular-viral. 
 Una vez homogenizadas las pastillas, se centrifugaron a 6,000 rpm durante 5 
min. 
 Se recuperó el sobrenadante (partículas virales) y se desechó la pastilla 
(detritos celulares). 
 El sobrenadante se filtró utilizando un filtro en disco, con un tamaño de poro de 
0.22 μm (MF-Millipore disk membrane filters, Merck millipore, Alemania, Cat. 
GSWP02500). 
 Se hicieron alícuotas de 10 y 50 μl, las cuales fueron almacenadas a -70°C para 
su uso posterior. 
 
7.1.3 Titulación del AdV mCherry 
La titulación del virus se realizó con el protocolo llamado prueba de multiplicidad de 
infección (MOI test; AdEasy Vector System Application Manual v. 1.4, QBioGene, 
U.S.A), el cual permite determinar el número de partículas virales (PV) o unidades 
formadoras de placas (PFU) para obtener de una manera aproximada la concentración 
final del virus después de haber sido filtrado. El protocolo empleado fue el siguiente: 
 
 Se sembraron 3.6x106 células HEK-293 en 25 ml de medio DMEM/SBF 10%, el 
total de la mezcla resultante fue repartido en dos placas de cultivo de seis 
pozos cada una (Corning CellBIND, Corning Incorporated, U.S.A, Cat. 3335). El 
33 
 
sembrado fue homogéneo es decir con aproximadamente la misma cantidad de 
células en cada pozo. 
 Las placas fueron colocadas de 2-3 días a una temperatura de 37ºC en una 
incubadora de CO2/O2 hasta que el cultivo celular alcanzó una confluencia del 
70%. En la línea celular HEK293 este porcentaje equivale a 1x106 células por 
pozo. 
 Se hicieron diluciones seriales del stock viral utilizando diferentes volúmenes 
partiendo de 0.01 µl hasta llegar a 5 µl colocados en un volumen final de 1 ml 
de medio DMEM/SBF 10% sin antibiótico. 
 Se removió el medio de cultivo de las placas con el 70% de confluencia celular 
y se le agregó a cada pozo 1 ml de las diferentes diluciones virales. Se 
incubaron durante 3 h a 37°C en una cámara de CO2/O2 y se agitó la placa de 
manera suave cada 15 min. 
 Al término de la incubación se agregó 1 ml de medio DMEM/SBF 10% a cada 
pozo. Las placas se incubaron nuevamente por 72 h a una temperatura de 
37ºC. 
 Finalizada la incubación, se identificó el pozo con la menor concentración de 
virus que en ese lapso de tiempo provocó un CPE del 100%. 
 Se realizaron los cálculos para conocer la concentración viral del stock; 
considerando que el pozo identificado tiene un MOI de 15 y conociendo el 
número de células infectadas del pozo (1x106) así como el volumen del virus en 
el mismo, empleamos la siguiente fórmula: 
 
𝑃𝑉 ó 𝑃𝐹𝑈 =
15 × 𝑛𝑜. 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑣𝑖𝑟𝑢𝑠 (𝑚𝑙)
 
 
 
 
 
34 
 
7.1.4 Inyección intracerebelosa de AdV mCherry en ratón 
El trazador viral fue inyectado en el parénquima del cerebelo a la altura del lóbulo X 
empleando el método estereotáxico utilizando las coordenadas Bregma -6.36 mm, 
ventral -3.30 mm, de acuerdo al atlas del cerebro de ratón de Paxinos (Paxinos, 2001). 
Para este procedimiento se utilizaron ratones macho de la cepa GFAP/GFP, de 2 
meses de edad (Figura 9). 
Anestesia: a cada ratón se le administró una dosis de 20u/100g de una mezcla de 
ketamina/xilacina 10% (Cheminova de México, S.A. de C.V) en una proporción 7:3 la 
cual fue diluida al 50% en SSF 0.9% para lograr la anestesia general. 
Identificación de coordenadas en estereotáxico e inyección intracerebelosa: Una 
vez anestesiado el animal, se siguió el siguiente protocolo para identificar el sitio de 
inyección, aplicar el virus y lograr la recuperación del sujeto experimental. Todo el 
material y herramientas empleadas fueron previamente esterilizadas (120ºC por 20 
min) 
a) Se colocó al animal en un aparato estereotáxico adaptado para ratón donde se 
le fijó la cabeza por medio de tornillos ajustados en el meato auditivo externo. 
Se alineó el cráneo de manera que quedara horizontal al plano de la base y se 
sujetó del hocico por medio de un soporte del aparato. 
b) Se le colocó una cama térmica para evitar la pérdida de calor producto de la 
anestesia y estabilizar el estado general del ratón. 
c) Una vez posicionado el ratón, se realizó una incisión de aproximadamente 2 cm 
en la parte superior del cráneo para exponer las suturas craneales (bregma y 
lambda) y localizar las coordenadas anteriormente mencionadas. El periostio 
del cráneo fue removido con H2O2 al 8% con ayuda de una gasa estéril. 
d) Después de identificar el sitio exacto (parte anterior lóbulo X), se realizó un 
trépano craneal empleando un minitaladro inalámbrico de 7.2V marca Dremel 
7700 (Robert Bosch Tool Corporation, Alemania) y una broca de 0.4 pulgadas, 
a intensidad baja evitando perforar las meninges o cerebro. 
35 
 
e) Al localizar la zona de interés se inyectó un volumen final de 1 μl de una 
solución de 0.5 μl de AdV mCherry (3.3x107 PV) + 0.5 μl de azul de pontamina 
(Sigma Aldrich, U.S.A, Cat. R309109) a flujo constante por un periodo de 2 min 
con la ayuda de una jeringa Hamilton (Hamilton Neuros syringe 1710, Hamilton 
Company, U.S.A, Cat. 65460-20) de 100 µl sostenida por una torre calibrada y 
adaptada al aparato estereotáxico. Transcurridos los 2 min se dejó la aguja 2 
min adicionales para evitar el retorno del líquido debido a la presión del tejido. 
Nota: la SSF 9% se empleó como diluyente y el azul de pontamina como 
marcador del sitio de inyección. 
f) El trépano se recubrió con cera de hueso (Ethicon Bone Wax, Johnson & 
Johnson Medical Devices & Diagnostics Group, U.S.A, Cat. W810) y se suturó 
la herida con la técnica de sutura continua simple, empleando una sutura 
quirúrgica sintética absorbible (Atramat PGA, Atramat, México, Cat. EA895/2) 
g) Finalizada la cirugía se administraron 2 unidades de ampicilina al 50% 
(Meprizina Solución Inyectable 250 mg, Laboratorios Pisa, México) y se dejó al 
ratón en recuperación de 2-4 h. con una fuente externa de calor (lámpara de 
escritorio). 
Periodo de incubación del AdV: Se permitió la propagación del virus en el ratón 
GFP-GFAP durante un lapso de 3-5 días, periodo en el que el virus alcanza la zona de 
interés y en la concentración aproximada que se requiere para los fines del proyecto. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. A.- Aparato estereotáxico con adaptador para ratón; se puede observar la posición en la que 
el ratón es colocado y en la parte superior la jeringa Hamilton en el sitio de inyección. B.- Imagen 
tomada y modificada del atlas del cerebro de ratón (Paxinos, 2001), que ilustra con una línea roja el sitio 
de inyección viral. 
A. B. 
36 
 
7.2 Obtención de las rebanadas de cerebelo 
Una vez que transcurrieron los 5 días de incubación in vivo del AdV en el ratón, se 
procedió a obtener las rebanadas de cerebelo, utilizando el siguiente protocolo. 
(Figura 10) 
 
a) Anestesia y perfusión intracardiaca: con la finalidad de conservar la cito-
arquitectura del tejido se fijó con paraformaldehido al 4% en PBS 1X. 
Primeramente se anestesió al ratón con una dosis de pentobarbital sódico 
(Cheminova de México, S.A. de C.V) 90 mg/kg vía intraperitoneal para 
posteriormenterealizarle una perfusión intracardiaca de solución salina al 0.9% 
y formaldehído al 4%. 
b) Decapitación y disección del cerebro: una vez que el ratón fue 
completamente fijado (incluyendo el cerebro), se decapitó y se removió el 
cerebro. 
c) Crioprotección del tejido: el cerebro se colocó en gradientes de sacarosa (10, 
20 y 30%), en ≈ 15 ml de solución, esto con el objetivo de evitar la formación de 
cristales de agua y daño del tejido al momento de ser congelado. 
d) Congelación: el cerebro se congeló en hielo seco pulverizado y se almacenó 
en el ultracongelador a -70ºC hasta su procesamiento. 
e) Obtención de los cortes histológicos: se obtuvieron cortes coronales del 
cerebelo de un grosor de 50 µm utilizando un criostato (Research Cryostat 
Leica CM3050 S, Leica Biosystems, Alemania, Cod. 14047033518). Las 
rebanadas se seleccionaron de acuerdo a la zona de interés, en este caso, el 
cuarto ventrículo del cerebelo. Las rebanadas se recuperaron en frío sobre un 
portaobjetos de 75 X 25 mm (Daigger Superfrost Plus, Daigger & Company, 
Inc., U.S.A, Cat. EF15978Z). Posteriormente fueron montadas agregando de 2-
3 gotas de Vectashield (Vectashield Mounting Medium, Vector Laboratories, 
U.S.A, Cat. H-1000) y se les colocó un cubreobjetos. En todo momento las 
preparaciones se protegieron de la luz para evitar la pérdida de fluorescencia. 
37 
 
f) Contratinción de núcleos con DAPI: Para lograr un tener un punto de 
referencia sobre la ubicación, identificación y posible interacción de la GB con 
células aledañas así como un contraste entre la marca viral y el GFP, a los 
cortes histológicos se les realizó una contratinción de núcleos con DAPI (1:500) 
(4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, Sigma-aldrich, U.S.A, Cat. 
D9542). 
 
 
Figura 10. Metodología general empleada a partir de la inyección intracerebelosa y hasta el 
procesamiento de las imágenes obtenidas de la GB marcada. 
 
 
 
7.3 Protocolo de inyección: trazador DiI (carbocianina) 
Para esta técnica se emplearon ratones macho GFAP-GFP y CD1, de 2 meses de 
edad (60dp), los cuales fueron sometidos a experimentación bajo el siguiente 
protocolo: 
38 
 
Anestesia: para generar una anestesia general, a cada ratón se le administró una 
dosis de 20u/100g de una mezcla de ketamina/xilacina (7:3) diluida al 50% en SSF 
0.9%. 
Identificación de coordenadas en estereotáxico e inyección intracerebelosa: 
1. Se colocó al animal en un aparato estereotáxico adaptado para ratón, donde se 
le fijó la cabeza por medio de tornillos ajustados en el meato auditivo externo. 
Se alineó el cráneo de manera que quedará horizontal al plano de la base y se 
sujetó del hocico con un soporte del aparato. 
2. El ratón fue colocado en una cama térmica para evitar la pérdida de calor 
producto de la anestesia y estabilizar el estado general del ratón. 
3. Se realizó una incisión de aproximadamente 2 cm en la parte superior del 
cráneo para exponer las suturas craneales (Bregma y lambda) y localizar las 
coordenadas de inyección (Bregma: -5.8mm, ventral: -3.8mm). El periostio del 
cráneo fue removido con H2O2 al 8% y con ayuda de una gasa estéril. 
4. Después de identificar el sitio exacto, se realizó un trepano craneal con la 
ayuda de un mini taladro inalámbrico de 7.2V DREMEL 7700 (broca de 0.4 
pulgadas, intensidad baja), evitando perforar las meninges o cerebro. 
5. Después de que la zona elegida fue expuesta se inyectó un volumen final de1 
μl de DiI [0.025%] en DMSO 3%, a flujo constate por un periodo de 2 min con la 
ayuda de una jeringa Hamilton de 1ml sostenida por una torre adaptada al 
aparato estereotáxico. Transcurridos los 2 min se dejó la aguja 2 min 
adicionales para evitar el retorno del líquido debido a la presión del tejido. 
6. El trepano se recubrió con cera de hueso (bone wax, ETHICON, W810) y se 
suturó la herida con la técnica de sutura continua simple, empleando una sutura 
quirúrgica sintética absorbible (ATRAMAT, Cat. EA895/2) 
7. Finalizada la cirugía se administró, se dejó al ratón en recuperación 
aproximadamente 2hrs con una fuente externa de calor (lámpara de escritorio). 
 
Periodo de latencia: el DiI se dejó difundir durante 6 horas. 
Perfusión, decapitación y disección: Transcurrido el tiempo los ratones fueron 
anestesiados con una sobredosis de Pentobarbital (10U/30g), y perfundidos 
39 
 
intracardiálmente con 15 ml de SSF 0.9% y posteriormente con 30ml de PFA al 4% en 
PBS 1X. Posteriormente se disectó el cerebro y se dejó 3hrs a 4°C en la misma 
solución de PFA (periodo de post-fijación). 
Procesamiento del tejido: El cerebro se crioprotegió en gradientes de sacarosa (20% 
y 30%) y se congeló durante 2 min en hielo seco pulverizado. Posteriormente se 
obtuvieron cortes de 60µm empleando un criostato (Leica CM3050 S), las rebanadas 
se recuperaron por flotación en PBS 1x. 
Contratinción de núcleos con DAPI: Para lograr un tener un punto de referencia 
sobre la ubicación del borde subventricular a los cortes histológicos se les realizó una 
contratinción de núcleos con DAPI (1:500). 
 
7.4 Obtención y procesamiento de las imágenes 
Las preparaciones obtenidas se analizaron en un microscopio de epifluorescencia 
(Olympus CKX41 Inverted Microscope, Olympus Corporation, Japón), empleando los 
filtros correspondientes para cada longitud de onda así como los objetivos con las 
siguientes características: 
 LACHN 4x/0.13/Php, 
 CACHN 10x/0.25/Php. 
 CACHN 20x/0.04/Php. 
 UPLAN FLN 40x/0.55/Php. 
 
En cada corte se buscó indicio de infección viral, a través de la expresión de la 
proteína mCherry (marcaje rojo fluorescente) en alguna de las células de la región del 
lóbulo X del cerebelo. 
Las imágenes se procesaron con el software Olympus Optical 2002 (Olympus 
Corporation, Japón). Las preparaciones que presentaban marcaje en la zona de 
interés, fueron adquiridas mediante microscopía confocal (Zeiss LSM 510, Zeiss 
Group, Alemania) utilizando varios filtros para las diferentes longitudes de onda (λ575-
485, λ435-485, λ500-550) con el objetivo de identificar el tipo celular marcado en base 
40 
 
a la morfología característica de la GB (Grosche et al., 2002; Lippman et al., 2008). El 
procedimiento de adquisición de las imágenes consistió en realizar un Z stack (bloque 
de varios cortes ópticos en el eje espacial Z) de rebanadas ópticas de un grosor de 1 
μm utilizando el objetivo 40X (Ec Plan-Neofluar 40x/1-30 Oil Dic M27), abarcando una 
profundidad de 25-40 µm totales hasta cubrir la totalidad de la GB identificada. Una 
vez obtenida la serie de 40 a 60 cortes ópticos se realizó una proyección en una sola 
imagen así como una reconstrucción 3D para poder visualizar con mayor detalle las 
propiedades morfológicas de la GB (procesos, alcance, distribución e interacción con 
otros componentes). Posteriormente, se realizó un tile scan, el cual es una opción del 
software que permite reconstruir una imagen panorámica de la zona a partir de varias 
imágenes. De esta manera se localizó la región y posición exacta en el ventrículo de la 
GB identificada. 
 
 7.4.1 Análisis morfométrico de la GB 
La GB identificada en la zona de interés mencionada, se caracterizó cualitativa y 
cuantitativamente empleando el programa Aim Image Examiner Zeiss (Zeiss Group, 
Alemania) e Image J v. 1.47 (National Institutes of Health, U.S.A) tomándose en 
consideración los siguientes parámetros: 
 Longitud y número de procesos principales. 
 Área y diámetro mayor del soma. 
 Interacción física de los procesos con células vecinas. 
 Disposición del pie terminal de los procesos. 
La medición del área y diámetro de soma, así como de la longitud de los procesos 
principales fueron determinados con el software ImageJ de la siguiente manera 
(Figura 11): 
1. A la imagen Z stack adquirida en el confocal, se le extrajo la señal-ruido con el 
método Rolling ball (20 pixeles). 
41 
 
2. El stackse convirtió en una sola imagen a partir de la intensidad máxima lo cual 
dio como resultado una imagen en un solo plano compuesta por todos los cortes 
ópticos (25-60 cortes). 
3. La imagen obtenida se segmentó en base a una función umbral y filtro, empleando 
el comando (umbral) threshold < Isodata en el caso del soma (para determinar 
área y diámetro), y threshold < Isodata o IJ_Isodata en el caso de las 
proyecciones, de esta manera se sustrajo la señal-ruido de la señal real para 
delimitar la longitud del soma y sus procesos. Esto permitió realizar un análisis 
confiable y semi-automático. 
4. Con la función ROI (segmentación) se delimitó la región del soma y se obtuvo el 
valor del área y diámetro en μm, con la función < measure < limit to threshold 
(limitar a umbral). 
5. La longitud de los procesos se midió a partir de la señal más intensa que arrojó la 
función threshold del inciso 3, con la herramienta < line < segmented (línea 
segmentada) La cual permite trazar una línea a lo largo de los procesos tomando 
en cuenta las irregularidades de los mismos. La medición está dada en μm. 
 
Figura 11. Imagen representativa del proceso de análisis de imágenes con el software ImageJ. 
Las ventanillas de la derecha así como las flechas, muestran las herramientas implementadas descritas 
en el texto. 
Filtro y 
segmentación 
umbral 
(threshold) 
Region delimitada 
(ROI) 
42 
 
8. RESULTADOS 
 
8.1 Estrategias de inyección viral 
 
Con el objetivo de lograr la descripción de la citoarquitectura de la GB a través del 
marcaje de células aisladas, se probaron en total cuatro variantes de la técnica de 
inyección de trazadores virales. 
Los protocolos estandarizados y los detalles de los resultados obtenidos para cada 
variante técnica se muestran en el anexo 1, figuras A1-A6. 
Las observaciones indicaron que el sitio, magnitud y eficiencia de marcaje/trazado 
obtenido, depende de la variante técnica (Figura 12): 
 
 Intravetricular (ventrículos laterales) en neonatos: Expresión de mCherry 
sólo en el contorno del 4to ventrículo, marcando células del borde 
(ependimales, plexos coroideos) y tractos a nivel del puente. 
 Intra cisterna magna en adultos (mano alzada): En general baja expresión, 
limitada a bulbo raquídeo. Alta mortalidad de los ratones, debida a la dificultad 
al acceso de la cisterna magna a pulso. 
 Intra cisterna magna (cuarto ventrículo) en adultos mediante estereotaxia: 
Expresión sólo en el contorno del 4to ventrículo, marcando células del borde 
(ependimales, plexos coroideos). 
 Intracerebelo (parénquima lóbulo X) en adultos mediante estereotaxia: 
Expresión en la GB, tractos cerebelosos, CP. Marcaje general de tractos y 
estructuras aledañas al sitió de inyección (Figura 9). 
 
 
 
 
 
 
43 
 
 
Figura 12. Zonas de expresión de mCherry obtenidas con cada variante de la técnica de 
inyección viral. En verde se observa GFP mientras que en rojo la proteína mCherry. Pc: plexo 
coroideo, Pt: puente, IV: cuarto ventrículo, X: lóbulo diez del cerebelo, Barra (de izquierda a derecha): 
400µm, 300µm, 250µm y 500µm. 
 
 
De acuerdo con estos resultados, se eligió la inyección intracerebelosa de AdV en 
adulto como la mejor técnica de marcaje in vivo para los fines del proyecto, al ser la 
que permitía la expresión de mCherry en el parénquima del lóbulo X así como el 
marcaje semi-aislado de GB. 
Posterior al establecimiento de la técnica, se optimizó la estrategia para alcanzar el 
sitio exacto de inyección, la concentración del virus, volumen inyectado y tiempo de 
incubación in vivo del virus. El protocolo final y detalles de la estandarización se 
muestran en la sección 7.2.4 de métodos y en el anexo 1.3, respectivamente. 
 
 
44 
 
8.2 Citoarquitectura de la glía de Bergmann 
 
 Una vez estandarizada la técnica, se realizaron en total 8 experimentos con ratones 
machos de la cepa GFAP-GFP de 2 meses de edad, siguiendo el protocolo descrito en 
la sección de métodos (Figura 10). Se analizaron un total de 32 ratones (Tabla 1), 8 
de estos ratones presentaron marcaje de GB aisladas o semiaisladas. Se obtuvieron 
en total 19 GB de las dos poblaciónes de interés (Tabla 2): 
 12 de la población del techo del cuarto ventrículo (GB ventral: GBv), que se 
encuentra en la parte ventral del lóbulo X y proyecta su procesos en dirección al 
ventrículo 
 7 de la población pial (GB pial: GBp), localizada en la parte de la corteza 
cerebelosa del lóbulo X formando la pia. 
 
Estos dos tipos de poblaciones gliales fueron clasificadas como ventral y pial en base 
a su localización (Figura 13). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 1. Detalla el número de ratones procesados por experimento y en total. 
 
 
RELACIÓN DE EXPERIMENTOS REALIZADOS 
# experimento # ratones 
1 4 
2 4 
3 3 
4 3 
5 2 
6 3 
7 5 
8 8 
TOTAL 32 
45 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 2. Muestra el número de GB identificadas por tipo y el número de ratones (N) en las que fueron 
identificadas. 
 
 
 
Figura 13. Ejemplos de los dos tipos de GB marcados con el Adv Cherry. A.- GB de la corteza 
cerebelosa que proyecta hacia la pía. B.- GB de la parte ventral del lóbulo X. En verde GFAP-GFP, en 
rojo la expresión de mCherry y en azul DAPI (núcleos).CG: capa granular, IV: cuarto ventrículo. 
 
 
Una vez identificadas las células y adquiridas las imágenes mediante microscopía 
confocal, se analizaron de manera cuantitativa y cualitativa con el objetivo de 
compararlas y determinar similitudes y/o diferencias. 
 
 
RELACIÓN DE GB IDENTIFICADAS 
Tipo de GB # ratones (N) # GB identificadas 
GB pial 3 7 
GB ventral 6 12 
GB total 8 19 
A. B. 
IV 
GB 
Pía 
GB 
CG 
46 
 
8.2.1 Análisis cuantitativo 
 
Se examinaron las imágenes adquiridas mediante microscopía confocal, compuestas 
por stacks (conjunto de imágenes en el eje z) de alrededor de 40 rebanadas ópticas 
de 1 µm cada una (Figura 14A). Empleando el programa Zeiss LSM ImageExaminer, 
cada imagen se segmentó y se analizó cada 7 stacks, hasta encontrar el intervalo en 
el cual se pudiera identificar con mayor claridad los procesos y soma de la GB elegida. 
Posteriormente empleando el programa ImageJ el conjunto de stacks elegido 
(alrededor de 25 stacks) se convirtió a una imagen de 8 bits y se le aplicó una función 
de mejoramiento de contraste binario que permitió discriminar entre la señal auténtica 
y la señal ruido a partir del establecimiento de umbrales de señal (“threshold”), lo cual 
permitió la extracción parcial semi-automatizada de la glía marcada del resto de 
células aledañas marcadas (Figura 14B). El umbral aplicado para la identificación de 
somas fue IsoData, mientras que para la identificación de procesos fue IsoData y IJ- 
IsoData. 
La secuencia de análisis mencionada fue complementada con el análisis de la 
proyección en 3D (de la GB medida) en el programa LSM, lo cual permitió corroborar o 
esclarecer la anatomía identificada con el software ImageJ. 
 
Figura 14. Procesamiento y análisis de imágenes. A.- Imagen adquirida mediante microscopía 
confocal, se muestran los tres canales adquiridos (rojo: proteína mCherry. Verde: proteínas GFP, en 
azul: DAPI, en amarillo se muestra la co-localización de la GB identificada). B.- Stacks de la Gb 
seleccionada de A, en amarillo se muestra el esqueleto trazado de una sola célula. C.- Imagen 
convertida a 8 bits con filtro. Barra en a 50, en b y c 40 µm. 
47 
 
Características morfométricas evaluadas 
 
Para el análisis se tomaron en consideración las siguientes características: Área y 
diámetro mayor del soma, número y longitud de los procesos principales. 
Para determinar el área y diámetro del soma: se aisló el soma de cada GB de interés, 
a partir de la imagen del núcleo asociado dada por la contra tinción de núcleos DAPI 
(Figura 15A). Una vez identificado el soma, se midió el diámetro trazando una línea 
recta entre los extremos más distantes,el valor final se obtuvo promediando las tres 
longitudes mayores tomadas (Figura 15B). Para determinar al área, se delimitó el 
perímetro del soma con un círculo y se obtuvo el valor del área con la función mesure 
del software mencionado. 
En cuanto a la longitud total de los procesos, se consideró como tal, la longitud a partir 
del punto de intersección de soma con el proceso principal y hasta el punto vertical 
más distal de cada proceso (Figura 16). 
 
Figura 15. Identificación y medición de somas. A.- La imagen dentro del recuadro muestra el soma 
de una GB, el cual está marcado con mCherry (rojo) y se resalta el núcleo con DAPI (azul). B.- Proceso 
de medición del soma empleando el software Image J, la línea amarrilla ilustra las líneas trazadas para 
la medición del diámetro. Barra: 10 micras. 
 
 
48 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Resultados 
Una vez procesadas las imágenes de las 16 GB (Anexo: Figura A7) se midieron para 
cada célula las diferentes características consideradas en este estudio (área y 
diámetro mayor de los somas, número y longitud de los procesos principales) (Tabla 
5); posteriormente se obtuvo el promedio de los valores por grupo (población glial) 
para cada aspecto evaluado (Tabla 4). A partir de estos valores promedio se realizó la 
comparación entre ambas poblaciones gliales. El análisis estadístico realizado (prueba 
U-Mann Whitney) indicó que sólo existen diferencias significativas entra la GB pial y la 
GB ventral en cuanto al área y diámetro mayor de los somas (p<0.05) (Figura 17). 
 
 
Figura 16. Puntos de referencia 
considerados para establecer la 
longitud total de los procesos. Las 
flechas indican el punto inicial 
(intersección con soma) y el final (pie 
terminal). Azul: DAPI (núcleos), en 
rojo: mCherry. Barra: 20 micras 
49 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 4. Mediciones del conjunto de GB evaluadas en ambos grupos, cada columna índica el 
parámetro, mientras que las filas contienen los valores del promedio, la desviación estándar (d.s) y el 
error estándar de las medias (e.e). Unidades: µm. 
 
 
VALORES PROMEDIO DE LAS CARACTERÍSTICAS EVALUADAS 
GLIA BERGMANN pial 
No. GBp Area del soma Diámetro soma 
Longitud 
procesos 
Núm. procesos 
promedio 94.47 12.54 126.65 3.28 
d.s 23.38 1.62 27.98 0.76 
e.e 8.84 0.61 11.42 0.31 
GLIA BERGMANN ventral 
No. GBv Area del soma Diámetro soma 
Longitud 
procesos 
Núm. procesos 
promedio 63.38 10.03 145.47 3.50 
d.s 15.67 1.39 41.96 0.67 
e.e 4.52 0.40 12.11 0.19 
50 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 5. Medidas individuales de las 16 GB analizadas. La tabla superior contiene los datos 
promedio de la población ventral, mientras que la inferior los de la población pial. Las unidades de las 
cifras están dadas en µm. Cada tabla esta subdivida de acuerdo al sujeto experimental (N) del que 
provienen. 
 
 
VALORES INDIVIDUALES DE LAS CARACTERÍSTICAS EVALUADAS 
GLIA DE BERGMANN ventral 
No. GB 
ventral 
Área 
soma 
Diámetro 
soma 
Longitud 
procesos 
Núm. 
Procesos 
N Ubicación 
1 57.84 9.43 126.25 4 N1 lateral 
2 85.07 12.05 202.84 4 
N2 
central 
3 79.95 12.14 170.64 4 central 
4 72.52 10.16 194.45 4 
N3 
central 
5 80.77 11.30 202.86 3 central 
6 80.29 10.77 177.63 4 central 
7 36.89 7.79 115.78 2 N4 central 
8 51.27 8.73 92.06 3 
N5 
central 
9 51.56 10.45 130.63 3 central 
10 60.16 10.04 133.79 3 central 
11 52.34 8.98 99.23 4 
N6 
central 
12 51.85 8.54 99.52 4 central 
GLIA DE BERGMANN pial 
No. GB 
pial 
Área 
soma 
Diámetro 
soma 
Longitud 
procesos 
Núm. 
procesos 
N 
1 135.96 15.78 102.10 4 
N1 
2 95.79 12.37 87.11 4 
3 97.91 13.07 133.67 3 
N2 
7 72.23 11.59 176.24 2 
4 70.83 10.88 130.4 4 
N3 5 109.98 12.69 128.79 3 
6 78.595 11.40 128.25 3 
51 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 17. Comparación de las GB ventral y pial. Las gráficas muestran los valores promedio (Media 
± EEM) de las diferentes características evaluadas en ambas poblaciones gliales. Se observa que sólo 
existen diferencias significativas en el área y diámetro del soma (p< 0.05, prueba U-Mann Whitney: 
área, p= 0.0171*; diámetro mayor soma, p= 0.0018**; número de procesos, p=0.5616; longitud de los 
procesos, p=0.4147). 
 
 
8.2.2 Análisis descriptivo 
 
El análisis de las imágenes adquiridas mediante microscopía confocal basado en la 
información dada por las distintas proteínas fluorescentes (DAPI, mCherry y GFAP), 
permitió la identificación de tres “subpoblaciones” de la GB ventral de acuerdo al 
destino final de sus procesos (Figura 18). Dichas subpoblaciones se ubican de 
manera distintiva en la región del lóbulo X. 
L o n g itu d d e lo s p r o c e s o s

m
G B p ia l G B v e n tr a l
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
1 2 6 .65
1 4 5 .47
A re a d e l s o m a

m
G B p ia l G B v e n tr a l
0
5 0
1 0 0
1 5 0
6 3 .38
*
9 4 .47
D iá m e tro m a y o r d e l s o m a

m
G B p ia l G B v e n tr a l
0
5
1 0
1 5
**
1 2 .54
1 0 .03
N ú m e r o d e p ro c e s o s
N
o
.
G B p ia l G B v e n tr a l
0
1
2
3
4
3 .28 3 .5
52 
 
 
Figura 18. Esquematización de las tres subpoblaciones de la GB encontradas. 1) Subpoblación 
tipo 1, 2) subpoblación tipo 2, 3) Subpoblación tipo 3. Los círculos en gris simulan las CP, las 
estructuras que están en azul, morado y amarillo, las células presentes en la capa periventricular y 
subventricular; la GB se muestra en verde. CP: células de Purkinje, SVZ: capa subventricular, PVZ: 
capa periventricular. 
 
Subpoblación 1: Se localiza en todo el eje antero-posterior del lóbulo X, es la más 
abundante en la parte central del techo del ventrículo situándose en un corte coronal, y 
se caracteriza porque el alcance de sus procesos finaliza en la zona subventricular 
(SVZ), (aproximadamente 10-20µm de la capa ventral del lóbulo X) (Figuras 18-1, 19). 
Subpoblación 2: Se localiza en las zonas laterales del techo del cuarto ventrículo 
(vista coronal), específicamente en las zonas donde el cuarto ventrículo se hace 
angosto en sus extremos (entre Bregma -6.96 y -6.64). Es poco abundante en 
comparación a la subpoblación 1. Los procesos de estas GB terminan en la zona 
periventricular (PVZ) (Figuras 18-2, 20). 
Subpoblación 3: Constituye una subpoblación que limita con la parte superior de una 
estructura en proceso de caracterización (tesis doctoral González-González). Su 
ubicación es más restringida y se reduce a Bregma -6.24 a -6.32mm (Figuras 18-3, 
21). 
 
53 
 
Figura 19. GB del tipo 1. A.- Conjunto de GB (en rojo) que detienen sus procesos en la SVZ. B.- 
Ampliación del recuadro en A, donde se indican con flechas los pies terminales que descansan sobre la 
zona mencionada. C.- Muestra la región y coordenada donde se localiza la población de GB identificada 
en A (esquema tomado de Paxinos 2001). Rojo: mCherry, Azul: DAPI. CP: capa células de Purkinje, 
PVZ: zona periventricular, SVZ: zona subventricular, IV: cuarto ventrículo. Barra 100 µm. 
 
Figura 20. GB del tipo 2. A.- Conjunto de GB (en verde) que detienen sus procesos en la PVZ. B.- 
Ampliación del recuadro indicado en la imagen A, donde se observa a mayor detalle el pie terminal de 
los procesos a la altura de la PVZ. C.- Muestra la región donde se localiza la GB identificada en la 
imagen A (Esquema tomado de Paxinos 2001). Verde: GFAP-GFP, Azul: DAPI. cP: capa de Purkinje, 
PVZ: zona subventricular, IV: cuarto ventrículo. Barra: 50 y 20 µm, respectivamente. 
C. 
Bregma: -6.00 mm 
B.
Bregma: -6.72 mm 
54 
 
 
Figura 21. GB del tipo 3. A.- Muestra el conjunto de GB (en verde) que detienen sus procesos en el 
borde superior de la estructura en proceso de identificación (rojo). B.- Región donde se localiza la GB 
identificada en la imagen en A (Esquema tomado de Paxinos 2001). Verde: GFP-GFAP, Rojo: mCherry. 
GB: glía de Bergmann, IV: cuarto ventrículo. Barra: 50µm. 
 
 
A la par de los resultados