Efecto-de-la-carmustina-sobre-la-organizacion-de-un-novedoso-nicho-celular-en-la-zona-subventricular-del-cerebelo

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS 
INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA 
 
 
 “EFECTO DE LA CARMUSTINA SOBRE LA ORGANIZACIÓN DE UN 
NOVEDOSO NICHO CELULAR EN LA ZONA SUBVENTRICULAR DEL 
CEREBELO” 
 
TESIS 
PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
DOCTOR EN CIENCIAS 
 
PRESENTA: 
M. en C. María Alejandra González González 
 
 
Director de Tesis: 
Dr. Ataúlfo Martínez Torres 
Instituto de Neurobiología, UNAM 
 
Comité tutor: 
Dr. Miguel Pérez de la Mora 
Instituto de Fisiología Celular, UNAM 
 
Dr. Alfonso Cárabez Trejo 
Instituto de Neurobiología, UNAM 
 
Querétaro, Qro., México, Octubre de 2016 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
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objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
Universidad Nacional Autónoma de México 
Instituto de Neurobiología 
 
Los miembros del Jurado de examen de grado certificamos que la tesis elaborada por la 
M. en C. María Alejandra González González cuyo título es: “Efecto de la carmustina 
sobre la organización de un novedoso nicho celular en la zona subventricular del 
cerebelo”, se presenta como uno de los requisitos para obtener el grado de Doctor en 
Ciencias y cumple con los criterios de originalidad y calidad requeridos por la División de 
Estudios de Posgrado de la Universidad Nacional Autónoma de México. 
 
 Firma 
Presidente: 
Dra. Ana Brígida Clorinda Arias Álvarez _______________________ 
 
Secretario (Tutor): 
Dr. Ataúlfo Martínez Torres _______________________ 
 
Vocal: 
Dra. Sofía Yolanda Díaz Miranda _______________________ 
 
Vocal. 
Dra. Esther Ivonne López-Bayghen Patiño _______________________ 
 
Vocal 
Dr. Rogelio Arellano Ostoa _______________________ 
 
 
Aprobado por el Comité Académico 
 
___________________________________________ 
Dra. Aurea Orozco Rivas 
Coordinadora del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas
i 
 
RESUMEN 
La zona periventricular del cerebelo tiene un papel fundamental durante el periodo 
embrionario, hasta la primera semana postnatal mantiene funciones de proliferación 
neuronal y glial. Durante la etapa adulta se mantiene como una capa de células 
ependimales y su organización y funciones han sido poco exploradas. 
En el presente trabajo se evidencia un nicho celular en la zona subventricular del 
cerebelo de ratón adulto (NCSV) asociado a una estructura celular peculiar en el techo 
del cuarto ventrículo, que denominamos cordón ventromedial (CVM). Se aplicaron 
diferentes estrategias experimentales para caracterizar el NCSV. Los resultados indican 
que el NCSV está delimitado dorsalmente por los pies terminales de la glía de Bergmann 
y ventralmente por células ependimales con características estructurales peculiares que 
incluyen células biciliadas y células GFAP+ y nestina+. La diversidad de su composición 
celular y su organización estructural indican que el NCSV incluye interneuronas y células 
gliales que establecen contactos con capilares y sugiere representar vías de 
comunicación entre el parénquima cerebeloso y el líquido cefalorraquídeo. Se 
encontraron evidencias de la expresión de la enzima GAD65, la cual sugiere actividad 
GABAérgica en la región. 
Los procesos celulares que tienen lugar en los periodos embrionarios ejercen un 
impacto crucial en el establecimiento correcto y funcionalidad celular en la etapa 
postnatal. Para analizar sí las alteraciones del establecimiento del NCSV durante el 
periodo crítico de gliogénesis (día embrionario 13), afectan su organización, se recurrió a 
la administración de carmustina (un agente alquilante del DNA que produce alteraciónes 
en el ciclo de división celular) y se analizaron las modificaciones del NCSV. Los 
resultados mostraron una región ependimal multiestratificada y una densidad glial 
aumentada, así como la presencia de células cuya morfología sugiere corresponder a 
células en migración tangencial, lo que indica un retraso en la formación del NCSV. 
La descripción de nuevas estructuras en la zona subventricular del cerebelo y el 
estudio de su dinámica ontogénica y sus características celulares, aporta conocimiento 
nuevo para el entendimiento de la función del cerebelo y provee indicios de que esta zona 
consiste de estructuras especializadas en el periodo postnatal. 
 
ii 
 
ABSTRACT 
The periventricular zone of the cerebellum has a fundamental role during the embryonic 
period; until the first postnatal week is a neuronal and glial proliferative niche. During 
adulthood remains as a single layer of ependymal cells and has been poorly explored. 
In this thesis a novel cellular niche in the subventricular zone of adult mouse 
cerebellum (NCSV) is described, that is associated with a cellular structure on the roof of 
the fourth ventricle, which we named ventromedial cord (CVM). The results indicate that 
the NCSV is surrounded dorsally by end feet of Bergmann glial cells and ventrally by 
ependymal cells with peculiar structural characteristics (bicilliated cells and GFAP+ and 
nestin+). The diverse cellular composition and structural organization indicate that the 
NCSV include interneurons and glial cells in contact with capillaries, which suggests a 
communication path between the cerebellar parenchyma and cerebrospinal fluid. We 
provide evidence of the expression of the enzyme GAD65, that synthesizes GABA, 
suggesting a role of this neurotransmitter in the area. 
Cellular processes that take place during the embryonic period exert a crucial 
impact on the establishment and cellular function in the postnatal stage. To determine 
whether the NCVS is affected by perturbing the proper embryonic development, we 
injected carmustine, a DNA alkylating agent, during the critical period of gliogenesis 
(embryonic day 13), and analyzed the effect in the adult NCSV. The results showed 
several modifications in the organization of the periventricular zone and a delay in the 
formation of the NCVS. The cellular organization was affected, showing a multilayered 
ependymal and glial cells increased density and the presence of cells whose morphology 
suggests to be migrating cells in tangential orientation. 
The description of new structures in the subventricular zone of adult cerebellum 
and studying its ontogenetic dynamics and cellular characteristics, provide new 
knowledge for the understanding of the cerebellar function. The function of the structures 
described here has not been yet determined, and more studies will be necessary. 
 
 
 
 
 
iii 
 
AGRADECIMIENTOS 
Agradecimientos institucionales 
A la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) por la oportunidad que me dio 
para desarrollarme profesionalmente en sus instalaciones, porque el haber compartido 
tantas experiencias con la comunidad UNAM ha sido algo único que llevaré conmigo por 
siempre y que sin lugar a dudas me dio las bases para el siguiente paso en mi carrera. 
El presente proyecto fue financiado por: 
PAPIIT-DGAPA IN200913 y 206616 
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología 
Becario No. 339430 
Programa de Apoyo a los Estudios de Posgrado (PAEP) 
No. 51000192-0 
Consejo de Ciencia y Tecnología del Estado de Querétaro (CONCYTEQ) 
Apoyó con recursos para asistenciaa dos cursos y una estancia de investigación en el 
extranjero. 
Director 
Dr. Alfredo Varela Echevarría 
Jefes del Laboratorio de Neurobiología Molecular y Celular (D15) 
Dr. Ricardo Miledi 
Dr. Ataúlfo Martínez Torres 
Tutor principal 
Dr. Ataúlfo Martínez Torres 
Comité tutor 
Dr. Alfonso Cárabez Trejo 
Dr. Miguel Pérez de la Mora 
Jurado de examen 
Dra. Ana Brígida Clorinda Arias Álvarez 
Dr. Ataúlfo Martínez Torres 
Dr. Rogelio Arellano Ostoa 
Dra. Sofía Yolanda Díaz Miranda 
Dra. Esther lvonne López-Bayghen Patiño 
iv 
 
 
Personal de apoyo en el Instituto de Neurobiología, UNAM 
Laboratorio de Neurobiología Molecular y Celular (D15) 
M. en C. Angeles Edith Espino Saldaña 
Marina Ramírez Romero 
Laboratorio de Neuromorfometría y Desarrollo (C02) 
M. en C. Azucena Ruth Aguilar Vázquez 
Laboratorio de Neuromorfología (A01) 
M. en C. Gema Martínez Carbrera 
Unidad de enseñanza 
M. en C. Leonor Casanova Rico 
Ma. Carmen Mendoza López 
Unidad de microscopía 
Ing. Elsa Nidia Hernández Ríos 
IBQ Ma. de Lourdes Palma Tirado 
Unidad de proteogenómica 
Dra. Anaid Antaramian 
M. en C. Adriana González Gallardo 
Dr. Michael Jeziorski 
Biblioteca 
Dr. Francisco Javier Valles Valenzuela 
Lic. Soledad Median 
Bioterio 
MVZ José Martín García Servín 
Dra. Alejandra Castillo León 
Unidad de videoconferencia 
Lic. en Psic. Maria de Lourdes Lara Ayala 
Unidad de fotografía 
Laura Sánchez Carballo 
 
 
 
v 
 
Agradecimientos a otras instituciones 
Universidad Autónoma de Querétaro (UAQ) 
Por la asistencia técnica para el procesamiento de muestras biológicas en el microscopio 
electrónico de barrido: 
M. en C. Ana Lucía Tovar Álvarez 
Pontificia Universidad Católica de Chile (UC) 
Por darme la oportunidad de una estancia de Investigación en sus instalaciones: 
Dr. Nibaldo Inestrosa Cantin 
Dr. Waldo Cerpa 
Universidad de Stanford, Cracking the Neural Code 
Por la capacitación para desarrollar la tecnología de “CLARITY for the brain”: 
Dr. Karl Deisseroth 
Dr. Kristin Engberg 
 
Agradecimientos personales 
A Dios por la vida y por seguirme dando fuerza... 
Dr. Ricardo Miledi: Agradezco por haberme abierto las puertas de su grupo de 
investigación, por orientarme y apoyar los proyectos propuestos y por ser un gran ejemplo 
a seguir. 
Tutor principal 
Dr. Ataúlfo Martínez Torres: Durante este largo camino hay tanto que agradecer que me 
faltarán palabras; gracias por permitirme ser parte de su grupo de investigación, por 
orientarme cuando hubo tanta incertidumbre cuando al frente había nuevos hallazgos que 
más que desvío de mi proyecto representaron nuevos retos… después de todo fue lo que 
le dio tanto sabor a esta “aventura”. Gracias por guiarme, por sus consejos, por creer en 
mí, como profesional y como persona hasta el último momento del cierre de este ciclo. 
Comité tutor 
Dr. Alfonso Cárabez Trejo y Dr. Miguel Pérez de la Mora: gracias por el tiempo que me 
dedicaron y por lo que me enseñaron con sus valiosas aportaciones. 
 
vi 
 
Durante el desarrollo de mi proyecto…. 
hubo investigadores cuya orientación fue fundamental: 
- Dr. Arturo Álvarez Buylla –Universidad de California, San Francisco, (UCSF), USA. 
- Dra. Annalisa Buffo – Instituto de Neurociencias Cavalieri Ottolenghi, Torino, Italia. 
- Dr. Alfonso Cárabez Trejo - Instituto de Neurobiología, INB-UNAM. 
- Dra. Sofía Y. Diaz Miranda - Instituto de Neurobiología, INB-UNAM. 
- Dra. Teresa Morales Guzmán – Instituto de Neurobiología, INB-UNAM. 
- Dr. Jorge Larriva Sahd – Instituto de Neurobiología, INB-UNAM. 
Compañeros de laboratorio 
Gracias a todos, de todos aprendí algo, hasta de quien nunca hablaba.… 
Agradezco especialmente a: 
Adriana Pétriz Reyes 
Abraham Rosas Arellano 
Gabriela Gómez González 
Angeles Edith Espino Saldaña 
Marianne Lizeth Martínez Mendoza 
Elizabeth Pereida Jaramillo (Freya) 
Alfredo Alaniz Palacios 
Cinthya Alejandra Rodríguez Arzate 
Ragú Barman 
Marymar Becerra González 
José Luis Tellez Arreola 
Mi familia 
Esposo, José Alberto Monroy Ríos e hijas, Yanni Elizabeth y Ashanti Monroy González, 
puesto que el concluir esta etapa y los logros obtenidos, no son resultado solo de mi 
trabajo, son el resultado de esfuerzos en conjunto y hay tiempo de todos ustedes 
implicado. Gracias infinitas de corazón, esto es suyo. 
Gracias a mis padres por su apoyo incondicional, por sus enseñanzas de vida, por su 
amor y por creer en mi: Manuel González García y Aurelia González Gómez. 
A mis hermanos: Victor Manuel, Alma Gabriela y Octavio de Jesús González, por sus 
consejos, apoyo y por creer en mí. 
 
 
 
 
 
 
vii 
 
 
Dedico esta tesis a los dos ángeles que 
Dios envió a mi vida: a mis hijas Yanni y Ashanti 
y a mi compañero de vida: Alberto Monroy. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
viii 
 
INDICE GENERAL 
 Página 
 
1. INTRODUCCIÓN 1 
2. ANTECEDENTES 3 
2.1 El cerebelo 3 
2.2 Anatomía externa del cerebelo 4 
2.3 Anatomía interna del cerebelo 5 
2.4 Componente glial en el cerebelo 6 
2.5 Componente neuronal en el cerebelo 8 
2.6 Organización de los circuitos neuronales del cerebelo 9 
2.7 Embriología del cerebelo 11 
2.8 El cerebelo como parte de las zonas periventriculares 14 
2.9 Identificación de nuevos nichos celulares en la zona 
 periventricular del cerebelo. 18 
3. HIPÓTESIS 20 
4. OBJETIVO GENERAL 20 
 4.1 Objetivos específicos 20 
5. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 21 
5.1 Declaraciones bioéticas 21 
5.2 Cepas de ratón empleadas 21 
5.3 Metodología 21 
5.3.1 Resumen de la metodología 21 
5.3.2 Métodos 23 
5.3.2.1 Obtención de material biológico 23 
5.3.2.2 Tinción con azul de toluidina 24 
5.3.2.3 Análisis de la identidad celular 24 
5.3.2.4 Análisis de la proliferación celular 25 
5.3.2.5 Análisis de capilares fenestrados con azul 
de Evans 26 
5.3.2.6 Análisis de la vascularización del NCSV 27 
5.3.2.7 Análisis estructural y ultraestructural 27 
 
ix 
 
5.3.2.7.1 Microscopía electrónica 
 de transmisión 27 
5.3.2.7.2 Microscopía electrónica de barrido 28 
5.3.2.8 Caracterización electrofisiológica 29 
5.3.2.9 Análisis de la composición celular del techo del 
 cuarto ventrículo 30 
6. RESULTADOS 31 
6.1 Coordenadas del nicho celular subventricular 31 
6.2 Fenotipos celulares en el NCSV 31 
 6.3 Evaluación de la proliferación celular en el NCSV 37 
6.4 Análisis de la permeabilidad capilar en el NCSV 41 
6.5 Análisis de la distribución celular en el techo del cuarto 
 ventrículo 41 
6.6 Análisis de la organización ependimal en el techo del cuarto 
 ventrículo 45 
6.7 Análisis estructural de la superficie ventricular del cerebelo 48 
6.8 Efecto de la carmustina en el NCSV 53 
6.9 Nuevas estructuras definen las zonas peri y subventricular 
 del cerebelo 64 
7. DISCUSIÓN 66 
8. CONCLUSIONES 72 
9. PERSPECTIVAS 74 
10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 75 
11. ANEXOS 82 
 
 
 
 
 
 
 
x 
 
INDICE DE FIGURAS 
 
Figura Página 
 
 1. El cerebelo y su ubicación anatómica 3 
 2. Anatomía del cerebelo 5 
 3. Núcleos profundos y pedúnculos del cerebelo 6 
 4. Componente glial del cerebelo 8 
 5. Componentes neuronales del cerebelo 10 
 6. Embriología del cerebelo 12 
 7. Establecimiento de los circuitos neuronales en el cerebelo 13 
 8. El sistema ventricular 14 
 9. Nichos neurogénicos en los ventrículos laterales 16 
 10. Heterogeneidad celular en la zona subventriculardel cerebelo 20 
 11. Nicho celular en la zona subventricular del cerebelo 18 
 12. Ubicación del nicho celular subventricular 32 
 13. Componentes glial y neuronal en el NCSV 33 
 14. Axones mielinizados en el NCSV 35 
 15. Características electrofisiológicas de las células del NCSV 36 
 16. Células del NCSV expresan nestina 38 
 17. Marcaje con vimentina define estructuras en la ZPVCb 39 
 18. Análisis de la proliferación celular 40 
 19. Análisis de la permeabilidad capilar 41 
 20. La glía forma un cordón ventromedial en el techo del cuarto 
 ventrículo 42 
 21. Células Nestina+ definen un cordón ventromedial 43 
 22. Células nestina+ y GFAP+ constituyen el cordón ventromedial 44 
 23. Organización de las células ependimales en el techo del 
cuarto ventrículo 45 
 24. El cordón ventromedial se extiende al parénquima 47 
 25. El CVM consiste de células biciliadas con múltiples 
microvellosidades 49 
 26. Características superficiales del cordón ventromedial 50 
xi 
 
 27. Ultraestructura de las células biciliadas 51 
 28. Estructuras vesiculares se extienden hacia la luz ventricular 52 
 29. Efecto de la carmustina en la zona periventricular de cerebelo 
postnatal 54 
 30. Cerebelo de ratón GFAP-eGFP P5 55 
 31. Efecto de la carmustina en el NCSV en el día 5 postnatal 56 
 32. Control de edad P10 para evaluar el efecto de la carmustina en el 
NCSV 58 
 33. Efecto de la carmustina en el NCSV en el día 10 postnatal 60 
 34. Cerebelo control de ratón GFAP-eGFP de edad P21. 61 
 35. Efecto de la carmustina en el NCSV en el día 21 postnatal 63 
 36. Dos nuevas estructuras: el NCSV y CVM definen la organización 
 de la zona periventricular del cerebelo 65 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
xii 
 
ABREVIATURAS 
 
BCNU 1,3-Bis(2-cloroetil)-1-nitrosourea (por sus siglas en inglés) 
BrdU bromodesoxiuridina 
CG capa granular 
CM capa molecular 
CP capa de células de Purkinje 
CVM cordón ventromedial 
DAPI 4´,6-diamidino-2-fenilidona (por sus siglas en inglés) 
E edad embrionaria 
EGCs células gliales ependimales (por sus siglas en inglés) 
GABA ácido gamma aminobutírico (por sus siglas en inglés) 
GAD descarboxilasa del ácido glutámico (por sus siglas en inglés) 
GFAP proteína ácida glial fibrilar (por sus siglas en inglés) 
GFP proteína verde fluorescente (por sus siglas en inglés) 
HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanesulfonico (por sus siglas en inglés) 
I lóbulo 1 del cerebelo 
IB4 isolectina tipo B4 
LCE líquido cerebro espinal 
MBP proteína básica de mielina (por sus siglas en inglés) 
MEB microscopía electrónica de barrido 
MET microscopía electrónica de transmisión 
NCSV nicho celular subventricular 
NeuN marcador neuronal nuclear 
P edad postnatal 
PBS tampón de fosfatos 
PC plexos coroideos 
PFA paraformaldehido 
YP yoduro de propidio 
SNC sistema nervioso central 
SSF solución salina fisiológica 
Tris tris(hidroximetil) aminometano 
ZPVCb zona periventricular del cerebelo 
IV cuarto ventrículo 
X lóbulo 10 del cerebelo 
 
 
 
 
 
xiii 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Una de las experiencias más satisfactorias en el universo de la ciencia…. 
 es convencerte a ti mismo de lo incuestionable ante tus ojos…. 
M.A.G.G. 
 
 
1 
 
1. INTRODUCCIÓN 
El cerebelo es una estructura del Sistema Nervioso Central (SNC) que integra la 
información relacionada con la ejecución de movimientos finos y coordinados y el 
mantenimiento de la postura. Dado que la ejecución de dichas funciones requiere de una 
resolución precisa en los aspectos espacio-temporales, los circuitos celulares 
involucrados en ello implican procesos de modulación altamente especializados (Rondi-
Reig et al., 2014; Hashimoto y Hibi 2012). 
El origen, diferenciación y establecimiento de las diferentes poblaciones celulares 
durante la ontogenia están determinados por una gran cantidad de mecanismos de 
señalización en el SNC. Diferentes proteínas que funcionan como factores de 
transcripción, se expresan durante periodos de tiempo específicos del desarrollo 
embrionario y son cruciales para el correcto establecimiento y funcionalidad celular 
durante el periodo postnatal. Cualquier modificación o alteración en el desarrollo 
embrionario correcto, ya sea por factores internos o externos, tiene repercusiones en el 
desarrollo anatomo-estructural y/o funcional postnatal (Buffo y Rossi, 2013; Carulli et al, 
2013). La carmustina (1,3-Bis(2-chloroetil)-1-nitrosourea) es un agente alquilante del 
DNA que se ha empleado para generar modelos de estudio de estas alteraciones en la 
etapa adulta, al ser administrado durante el periodo embrionario (Bernardete y Kriegstein 
2002; Ewend et al., 2005; Moroni et al., 2008). 
Los componentes glial y neuronal se encuentran funcionalmente asociados. 
Durante el desarrollo embrionario las células progenitoras gliales y neuronales, tienen 
características gliales. En el cerebelo la glía de Bergmann funciona como andamio para 
el establecimiento de las capas celulares que forman la corteza cerebelosa (Hibi y 
Shimizu, 2010; White y Sillitoe, 2013). Para el funcionamiento neuronal, la glía provee de 
nutrientes, procesa desechos metabólicos neuronales y neurotransmisores, 
convirtiéndose en un elemento imprescindible en la homeostasis del SNC (Pál, 2015). 
Las diferentes poblaciones celulares del cerebelo tienen origen en dos nichos 
embrionarios: el labio rómbico y la zona subventricular. Las propiedades glio y 
neurogénicas de estos nichos se mantienen solo hasta los primeros días postnatales y 
en la vida adulta de algunas especies (Hashimoto y Hibi, 2012). La zona subventricular 
 
2 
 
del cerebelo adulto está formada por una capa de células ependimales ciliadas, sin 
embargo, no se ha realizado un análisis exhaustivo de la organización celular a través de 
la zona peri y subventricular del cerebelo. 
En el presente trabajo de tesis se reporta el hallazgo de un nicho celular novedoso 
en la zona subventricular del cerebelo adulto, y los objetivos se enfocan en la 
caracterización anatómica-estructural del mismo, así como de las características de los 
elementos celulares que lo rodean tanto en la región parenquimal como en la zona que 
contacta el ventrículo. Se evaluaron la capacidad para proliferar de las células que 
componen esta zona y la presencia de capilares fenestrados. Además, se analizaron las 
modificaciones estructurales en la glía que conforma este nicho celular en el periodo 
adulto después de la exposición al agente alquilante carmustina durante la etapa 
embrionaria crítica para la gliogénesis, para determinar si el origen de esta estructura 
depende de procesos celulares que tienen lugar en dicho momento ontogenico. 
El conocimiento de la organización celular de la zona subventricuar del cerebelo, 
así como la descripción de nuevas estructuras anatómicas en esta zona representan un 
paso imprescindible para comprender la función del cerebelo, incluyendo las posibles 
vías de comunicación del mismo con el líquido cerebroespinal y el sistema circulatorio, y 
así comprender mejor sus implicaciones en situaciones patológicas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
2. ANTECEDENTES 
2.1 El cerebelo 
El cerebelo es el principal centro integrador de la ejecución de movimientos finos y 
coordinados y del mantenimiento de la postura (Hashimoto y Hibi, 2012) y durante las 
últimas décadas se ha demostrado su relación con funciones cognitivas y emocionales 
(Ito, 2006 y Schmahmann, 2010). Es una estructuraaltamente conservada desde el 
punto de vista filogenético y se encuentra desde los teleósteos hasta los mamíferos 
(Hashimoto y Hibi, 2012). En roedores, se ubica dorsal al tallo cerebral y posterior al 
mesencéfalo. Dorsalmente, contacta al cráneo y en su porción ventral al líquido 
cerebroespinal del cuarto ventrículo (Carpenter, 1994). En la Figura 1 se presentan cortes 
ortogonales del encéfalo de roedor, en el que se muestra la ubicación del cerebelo en 
tres planos anatómicos: coronal, sagital y horizontal. 
 
 
 
Figura 1. El cerebelo y su ubicación anatómica. Cortes ortogonales del encéfalo de roedor, 
que exponen el cerebelo en tres planos anatómicos: coronal, sagital y horizontal. El cerebelo se 
encuentra dorsal al tallo cerebral y posterior al encéfalo; en la imagen, las regiones de 
intersección de las líneas rojas corresponden a la ubicación del cuarto ventrículo y 
particularmente a las coordenadas en las que se ha enfocado el presente proyecto de tesis. 
Nótese la organización foliada, característica del cerebelo. I, izquierda; D, derecha; Ds, dorsal; V, 
ventral; A, anterior; P, posterior. Tomado y modificado de: http://mouse.brain-map.org/agea, 
www.alleninstitute.org. 
 
 
 
DI A P A P
D
I
Ds
V
http://mouse.brain-map.org/agea
http://www.alleninstitute.org/
 
4 
 
2.2 Anatomía externa del cerebelo 
La anatomía externa del cerebelo se muestra en la Figura 2, y consiste de dos 
hemisferios plegados que forman fisuras, divididos por una porción medial denominada 
vermis. En la parte anterior, la fisura primaria separa el lóbulo anterior del posterior; la 
fisura posterolateral delimita la ubicación de lóbulo floculonodular, el cual a su vez está 
conformado por el floculo (con porción hemisférica) y el vermis (con porción nodular) 
(Voogd y Glickstein, 1998; Brodal, 2010). En la superficie cerebelosa hay otro tipo de 
fisuras de menor profundidad, que han sido empleadas como referencia anatómica para 
dividir al cerebelo en lóbulos. El cerebelo se conforma de diez lóbulos (I-X); los lóbulos II-
X están cubiertos con meninges y están en contacto con el cráneo (Apps y Hawkes, 
2009), mientras que los lóbulos I y parte del II y del X tienen células ependimales con 
cilios proyectando hacia la luz ventricular (Alvarez-Morujo, et al., 1992). 
La relación entre la división en lóbulos y la topología que constituyen las folias es 
compleja. La literatura enfatiza primordialmente en la organización longitudinal, sin 
embargo, basándose en la expresión de diferentes genes durante la ontogenia se ha 
sugerido que la arquitectura primordial del cerebelo se basa en cinco zonas transversas: 
la zona anterior (lóbulos I-V), zona lateral (anterior: lóbulo VI, y posterior: lóbulo VIII), zona 
posterior (lóbulos VIII y IX dorsal) y zona nodular (lóbulos IX ventral y X) (Ozol, et al., 
1999; Armstrong y Hawkes, 2000; Apps y Hawkes, 2009). 
Por otra parte, cada zona transversa se encuentra conformada por una serie de 
bandas orientadas en el eje rostro-caudal, caracterizadas por la expresión de diferentes 
marcadores moleculares, el más estudiado es el denominado zebrina II, que se trata de 
la enzima aldolasa C. Este marcador se expresa en una población de células de Purkinje, 
con lo que se forman bandas de células de Purkinje zebrina II positivas y negativas. Se 
ha reportado que la organización de estas células es simétrica, reproducible entre 
individuos (Hawkes et al., 1985; Hawkes y Leclerc, 1987) y conservada entre las especies 
(Sillitoe, et al., 2005). 
La anatomía del cerebelo también se ha dividido en módulos, esto basado en 
agrupar poblaciones celulares que proyectan a una misma estructura anatómica 
(somatotopía), esta organización modular se ha descrito tanto en la corteza cerebelosa 
 
5 
 
como en la zona floculo-nodular (Voogd,1998, 2012, 2014). La terminología anatómica 
empleada para cerebelo humano es diferente que la empleada para roedor, en la Figura 
2 se presentan la terminología para ambos, así como la representación modular. 
 
 
Figura 2. Anatomía del cerebelo. A la izquierda se muestra la división externa del cerebelo, se 
indica la terminología empleada para cerebelo de roedor y de humano; a la derecha la 
organización modular establecida con base a la conexión cerebelosa, que se clasifica en cerebelo 
vestibular, espinal y pontino. LA, lóbulo anterior; LP, lóbulo posterior; LS, lóbulo simple; PF, 
paraflóculo; FL, flóculo; LPM, lóbulo paramedial; COP, cópula piramidis; fp, fisura posterior; fps, 
fisura posterior superior. Modificado de Apps y Hawkens, 2009 y Voogd y Glickstein 1998. 
 
2.3 Organización histológica del cerebelo 
La organización histológica del cerebelo se muestra en la Figura 3, y se divide en la 
corteza, constituida de materia gris y en los núcleos profundos constituidos de materia 
blanca. La corteza cerebelosa mantiene una organización celular laminar formando folias, 
las cuales se caracterizan por tener tres capas celulares, de la más externa a la más 
interna: capa molecular, capa de neuronas de Purkinje y la capa granular (White y Sillitoe, 
2013; Hashimoto y Hibi, 2012). Por otra parte, los núcleos del cerebelo incluyen los 
núcleos profundos que con base en su ubicación anatómica se denominan de la porción 
medial a lateral como: fastigial, interpuesto (conformado por globoso y emboliforme) y 
dentado (Manto y Oulad Ben Taib, 2010). 
Vestibular
Espinal
Pontino
Vermis
Paravermis
Hemisferio
Lóbulo central alar
Lóbulo cuadrangulado
anterior
Lóbulo cuadrangulado
posterior
Lóbulo superior 
semilunar
Lóbulo inferior 
semilunar
Lóbulo gracilis
Lóbulo biventral
Paraflóculo accesorio
Flóculo
HUMANOROEDOR
Lingula
Central I
Culmen
Declive
Folium
Tuber
Pirámide
Uvula
Nódulo
PF Crus I
Crus II
LPM
FL
COP
LS
fps
fp
Fisura 
Horizontal
LA
LP
Lingula vincingulada
 
6 
 
 
 
Figura 3. Núcleos profundos y pedúnculos del cerebelo. En una vista dorsal, se muestra la 
ubicación anatómica de los núcleos cerebelosos profundos: fastigial, interpuesto (conformado por 
el globoso y emboliforme) y el dentado y la ubicación de los tres pedúnculos cerebelosos (inferior, 
medio y superior) que contienen las fibras aferentes y eferentes del cerebelo. Modificado de 
Purves et al., 2004. 
 
2.4 Componente glial en el cerebelo 
La glía es un tipo de célula cuya función hace algunas décadas se creía que era 
únicamente la de dar soporte a las neuronas. Actualmente se sabe que la glía establece 
una estrecha relación funcional con las neuronas. Se encarga de "limpiar" el espacio 
intersináptico al recapturar los neurotransmisores que prevalecen en la hendidura 
sináptica después de un potencial de acción, así como de metabolizar y/o liberar dichos 
neurotransmisores y una gran cantidad de sustancias asociadas con la homeostasis en 
el SNC; también establece comunicación entre el parénquima y el torrente sanguíneo por 
medio de la estrecha asociación con capilares (Verkhratsky y Butt, 2007; Kettenman y 
Ransom, 1995). 
Mesencéfalo
Cerebelo
Superior
Medio
Inferior
• Nucleo fastigial
• Nucleo interpuesto
(Globoso y emboliforme)
• Nucleo dentado
Pedúnculos 
cerebelosos
Nucleos
cerebelosos
profundos
 
7 
 
El cerebelo incluye una gran cantidad de células gliales distribuidas en las 
diferentes capas celulares, como se muestra en la Figura 4. La materia blanca contiene 
astrocitos denominados fibrosos, los cuales extienden procesos alineados en dirección 
de los axones neuronales; en la materia gris se encuentran los astrocitos protoplásmicos, 
los cuales presentan procesos delgados y en forma estrellada (Karaasek et al., 2004). 
Uno de los principales tipos de glía en el cerebelo es la glía radial denominada glía de 
Bergmann (Das, 1976; Lordkipanidze y Dunaevsky, 2005). Los somas de la glía de 
Bergmann se establecen a un lado de los somas de las neuronas de Purkinje y extienden 
sus procesos hacia la capa molecular entre las dendritas deestas neuronas. Se ha 
reportado que la glía de Bergmann al estar estructuralmente asociada con las células de 
Purkinje, participa en la modulación de la transmisión sináptica de éstas, al rodear con 
sus procesos las terminales sinápticas (Nimmerjahn et al., 2009; Lordkipanidze y 
Dunaevsky, 2005). También en la Figura 4, se ilustran los diferentes tipos de glía en el 
cerebelo, incluyendo la glía de Bergmann, la cual a su vez se evidencia en una 
preparación de tinción de Golgi. En estas células se distinguen los múltiples procesos 
radiales extendidos hacia la capa molecular y hasta contactar la pía, así como sus somas 
alineados en la capa de células de Purkinje. 
En la Figura 5 se resalta la organización de los pies terminales de la glía de 
Bergmann, formando la glía limitante en la región pial; en este punto cabe mencionar que 
la organización estructural de los pies terminales de la glía de Bergmann hacia la zona 
ependimal no se reporta a detalle en la literatura, y en general se ha descrito que 
mantiene la misma organización glial que se presenta en corteza, indiferente de la 
ubicación. En esta tesis se reporta la organización de los pies terminales de la glía de 
Bergmann en la región periventricular. 
 
 
 
 
8 
 
 
Figura 4. Componente glial del cerebelo. A la izquierda se representan los diferentes tipos de 
células gliales en el SNC, nótese la asociación con vasos sanguíneos y/o epéndimo y/o pía. A la 
derecha se muestran dos células de Bergmann que han sido impregnadas por la tinción de Golgi, 
son un tipo de células gliales y radiales en el cerebelo, las cuales tienen sus somas alineados 
con los somas de las neuronas de Purkinje y extienden sus procesos hacia la capa molecular, en 
donde establece sus pies terminales en la zona subpial, o bien hacia la zona subventricular. Tipos 
celulares morfológicos: Ia - tanicito pial; y Ib tanicito vascular; y astrocitos: II, radial (glía de 
Bergmann); III, marginal; IV, protoplasmático; V, en vela; VI, fibroso; VII, perivascular; VIII, 
interlaminar; IX, inmaduro; X, ependimocito; y las celulas: XI, del plexo coroidal. Así como las 
Capas celulares: CG, granular; CP, de Purkinje y CM, molecular. Modificado de Verkhratsky y 
Butt, 2007; a la derecha imagen de González-González MA (no publicado). 
 
2.5 Componente neuronal en el cerebelo 
El cerebelo, a través de sus capas celulares establece circuitos altamente organizados y 
especializados. Las neuronas del cerebelo se clasifican en dos grupos con base a su 
naturaleza química: excitatorias (neuronas granulares y en cepillo unipolares) e 
inhibitorias (neuronas de Purkinje, en cesto, de Lugar, estrelladas y de Golgi) (Sotelo, 
2008). Las neuronas excitatorias emplean glutamato como neurotransmisor y las 
inhibitorias el ácido gamma aminobutírico (GABA) y glicina en menor grado (Yamada et 
al., 2014). En la capa molecular se encuentran las neuronas en cesto y estrelladas; en la 
capa granular se distribuyen las neuronas de Golgi, de Lugaro, granulares y en cepillo 
cilios
capilares
capa granular
ca
p
il
ar
es
pía
Capa molecular
materia gris
capilares
materia blanca
zona subependimal
epéndimo
ventrículo
CG
CP
CM
pía
 
9 
 
unipolares. Las neuronas de Purkinje se encuentran alineadas en una capa denominada 
capa de células de Purkinje (Welie et. al, 2011). En la Fig. 5 se muestra la distribución de 
las diferentes poblaciones neuronales a través de las capas del cerebelo. 
 
2.6 Organización de los circuitos neuronales del cerebelo 
La corteza del cerebelo recibe tres tipos de aferencias extra cerebelosas, las fibras 
musgosas y fibras trepadoras que son de tipo excitatorias (glutamatérgicas), y un tercer 
tipo de aferencias que han sido descritas como estructuras difusamente organizadas, que 
son de tipo mono-aminérgicas y colinérgicas (Welie et. al, 2011). 
Las neuronas granulares son las más abundantes de la corteza cerebelosa, son 
pequeñas y glutamatérgicas; las terminales de las fibras musgosas (rosetas) contactan 
terminales de varias células granulares, formando estructuras denominadas glomérulos. 
Los axones de las células granulares se extienden hacia la corteza, a la capa molecular, 
en donde bifurcan y contactan terminales de neuronas de Purkinje e interneuronas 
(Sotelo, 2008; 2011). Las neuronas de Purkinje por otra parte, son GABAérgicas, son 
células de gran tamaño con complejas ramificaciones extendidas hacia la capa molecular, 
orientadas de forma perpendicular a las fibras paralelas y constituyen la única eferencia 
de la corteza cerebelosa. Sus axones contactan neuronas de los núcleos del cerebelo y 
tallo cerebral (Voogd y Glickstein, 1998). Sus árboles dendríticos en su porción proximal 
son lisos y en su porción distal presentan gran cantidad de espinas dendríticas, en donde 
son contactados por las proyecciones de las fibras paralelas, mientras que la porción más 
proximal es contactada por múltiples sinapsis de una sola fibra trepadora (Voogd, 2012). 
Las neuronas de Golgi modulan la activación de las células granulares, mediante 
la liberación de GABA y glicina. La localización, morfología y características 
neuroquímicas distinguen a las células de Golgi de las células estrelladas y en cesto, que 
son puramente GABAérgicas y funcionan como inhibitorias de la activación de las células 
de Purkinje (Yamada et al., 2014). 
 
 
10 
 
En la Figura 5 se ilustran los diferentes tipos de neuronas en el cerebelo y su 
organización a través de las diferentes capas, tanto de los somas como de las diferentes 
fibras aferentes y eferentes. 
 
Figura 5. Componentes neuronales del cerebelo. Se muestran las diferentes poblaciones 
neuronales distribuidas a través de las capas del cerebelo: molecular (M), granular(G) y de células 
de Purkinje (CP). En la capa molecular se distribuyen las células estrelladas y en cesto, además 
de los árboles dendríticos de las células de Purkinje y las proyecciones de las fibras trepadoras y 
paralelas. En la capa de células de Purkinje se alinean los somas de las neuronas de Purkinje. 
En la capa granular se encuentran las células granulares que contactan a terminales de las fibras 
musgosas formando estructuras denominadas rosetas, y proyectan hacia la capa molecular como 
fibras paralelas. En esta capa también se encuentran las células de Golgi. Nótese que las únicas 
vías eferentes son los axones de las neuronas de Purkinje que proyectan hacia los núcleos 
cerebelosos profundos; mientras que las únicas aferencias son las fibras trepadoras y musgosas. 
A la derecha se representa la asociación estructural que comparten las células de Purkinje con 
la glía de Bergmann, resaltan las proyecciones de la glía de Bergmann hacia la zona que subyace 
a las meninges y hacia las células ependimales. En la parte inferior se muestran los códigos de 
colores correspondientes a cada tipo de célula. Reproducido y modificado de Purves et al., 2004. 
 
Núcleos 
cerebelosos
profundos
M
G
CP
astrocitos
células ependimales
glía de Bergmanncélula en cesto
células granulares
célula de Golgi
célula en cepillo unipolar
célula de Lugaro
célula estrellada
fibra trepadora fibra musgosa
células de Purkinje
Células ependimales
meninges
 
11 
 
2.7 Embriología del cerebelo 
La ontogenia del sistema nervioso es sumamente compleja, una vez formado el tubo 
neural se establecen diversos patrones estructurales en los planos dorso-ventral y medio-
lateral comandados por la expresión de elementos morfogénicos, con ello se establecen 
las regiones que darán lugar a las estructuras del sistema nervioso. El cerebelo se deriva 
de la parte dorsal del romboencéfalo anterior, que de las tres vesículas embrionarias del 
cerebro (prosencéfalo, mesencéfalo y romboencéfalo) es la más caudal (Butler y Hodos, 
1996; Altman y Bayer, 1997). El romboencéfalo se divide en rombómeros, de los cuales 
el cerebelo se formará del rombómero 1 (Zervas et al. 2005). Durantela morfogénesis 
del cerebelo participan diferentes moléculas clave, que determinan la división 
mesencéfalo-romboencéfalo. Las primeras son los genes Otx2 y Gbx2, observados en 
las porciones anteriores y posteriores del tubo neural, respectivamente, cuya expresión 
es manifestada claramente durante el día embrionario (E) 8.5 en ratón (Simeone et al. 
1992, 2002; Nakamura et al., 2005). Algunos estudios han demostrado que estos factores 
de transcripción, así como el factor Fgf8 definen la posición del denominado organizador 
ístmico, mediante la supresión recíproca, con lo que Gbx2 permite el desarrollo del 
cerebelo en el mesencéfalo mediante la supresión de la expresión de Otx2 en dicho 
territorio (Hashimoto y Hibbi, 2012; Crossley et al. 1996, Millet et al., 1999, Broccoli et al., 
1999; Wurst y Bally-Cuif 2001; Li y Joyner, 2001). 
Después de que el territorio cerebeloso se ha establecido, dos compartimientos 
germinales se forman en el labio rómbico y en la zona ventricular entre los días E9 y E11 
en ratón. En esta etapa la porción cerebelosa está conformada por dos estructuras 
simétricas ubicadas dorsolateral al romboencéfalo, las cuales posteriormente se fusionan 
para formar la placa cerebelosa. Las capas germinales se constituyen por una capa 
interna y una externa, constituidas por la zona ventricular y la porción rostral del labio 
rómbico, respectivamente. Este proceso es crucial para la especificación de los diferentes 
tipos celulares en el cerebelo (Alder et al., 1999; Chizhikov y Millen, 2005; Landsberg et 
al., 2005). 
 
 
12 
 
La zona ventricular y el labio rómbico dan origen a diferentes poblaciones celulares 
en ventanas de tiempo específicas durante el periodo embrionario. La zona ventricular 
da origen a células GABAérgicas y glía, y el labio rómbico a células glutamatérgicas. 
Estos procesos son mediados por la expresión de los genes ptf1a y atoh1 
respectivamente (Hoshino et al., 2005; Hoshino, 2006; Leto et al., 2006; Sudarov et al., 
2011; Machold y Fishell, 2005; Wang et al., 2005). El origen de neuronas se lleva a cabo 
entre E10-E12, mientras que el origen de la glía se lleva a cabo entre E13-E14. 
Controversialmente, estudios recientes han demostrado que postnatalmente prevalecen 
sitios germinales en la substancia blanca y en la capa de células de Purkinje, dando lugar 
a interneuronas y glía, respectivamente (Parmigiani et al., 2015). En la Figura 6 se 
muestran diferentes estadios embrionarios, en los que a su vez se indica la región que 
da origen al cerebelo. 
 
Figura 6. Embriología del cerebelo. En A se muestran las vesículas embrionarias secundarias, 
el cerebelo tiene su origen en el romboencéfalo anterior (en verde). En B, al día E9.5 el 
romboencéfalo forma secciones denominadas rombómeros, el cerebelo se forma a partir del 
rombómero 1 (r1 en verde). En C se indica el estadio E11.5, en el que distingue la distribución de 
los rombómeros. El origen de las células GABAérgicas y glutamatérgicas es controlado por la 
expresión de los genes ptf1a y atoh1, respectivamente; en D y E se indican cortes sagital y coronal 
que indican la distribución de la expresión de estos genes tanto para el cerebelo como para el 
tallo cerebral. Posteriormente la región que expresa el gen ptf1a se establecerá como la zona 
periventricular, mientras que la que expresa el gen atoh1 corresponde al labio rómbico. pro, 
prosencéfalo; di, diencéfalo; mes, mesencéfalo; r, rombómero; is, istmo; cb, cerebelo; cn, cresta 
neural; lrc, labio rómbico cerebeloso; lrr labio rómbico del romboencéfalo; cge, capa granular 
externa; 4v, cuarto ventrículo; IO, oliva inferior; LRN, nucleo reticular lateral. Tomado y modificado 
de Hashimoto y Hibi, 2012. 
A B C
D
E
Telencéfalo
Diencéfalo
Metencéfalo
Mielencéfalo
Prosencéfalo
Mesencéfalo
Romboencéfalo
Médula espinal
cb
lrc
lrr
cn
ojo
is
mes
is
lrc
cn
cge
cnlrr
 
13 
 
Durante el establecimiento neuronal en el SNC, la glía radial juega un papel crucial; 
participa como andamio mediante el cual las diferentes poblaciones celulares migran para 
establecerse en su destino final (Lippman et al., 2008, 2010). En el periodo postnatal la 
glía radial retrae sus procesos para convertirse en astrocitos parenquimales, no obstante, 
el cerebelo es la única estructura en la que la glía radial prevalece como glía de 
Bergmann, la cual extiende sus procesos hacia la pía en la corteza cerebelosa y hacia la 
zona subventricular en los lóbulos I y X, que forman el techo del cuarto ventrículo (Buffo 
y Rossi, 2013). En la Figura 7 se esquematiza el proceso de establecimiento neuronal 
durante el desarrollo, en A se aprecia la capa granular externa en la región 
correspondiente a la capa molecular, que posteriormente se establecerá como capa 
granular en la porción más interna; también se indica el aumento en la arborización de 
las células de Purkinje acompañadas por las proyecciones de las fibras trepadoras. 
 
 
 
Figura 7. Establecimiento de los circuitos neuronales en el cerebelo. La diferenciación 
durante el desarrollo postnatal del cerebelo se refleja en los cambios presentados en la 
organización celular durante diferentes etapas del desarrollo para roedores: A. semana postnatal 
1; B. semana postnatal 2; C. etapa adulta. Las células de Purkinje (anaranjado) extienden sus 
árboles dendríticos durante la primera semana postnatal (gradiente anaranjado) y establecen 
sinapsis con otras células de Purkinje, las cuales se reducen en número en la segunda semana 
postnatal y por completo en adulto. Las células de Purkinje reciben múltiples aferencias de las 
fibras trepadoras (verde) durante la primera semana postnatal, y se reduce a una monoinervación 
en adulto. Las células granulares migran de la capa granular externa a la capa granular interna 
entre la primera y segunda semana postnatal. Las interneuronas de la capa molecular (morado) 
inervan a las células de Purkinje a partir de la segunda semana postnatal y en periodo adulto. c, 
célula; f, fibra. Esquema modificado de Welie et al. 2011. 
 
 
c.Purkinje c.granular intetneurona c.Golgi Gap junction f. paralela f. trepadora
A B C
 
14 
 
2.8 El cerebelo como parte de las zonas periventriculares 
El sistema ventricular consiste de una serie de cavidades intracerebrales comunicadas 
entre sí; estas cavidades se distribuyen en un plano anterior - posterior como: dos 
ventrículos laterales, tercer ventrículo y el cuarto ventrículo, el cual se comunica con el 
canal central en la médula espinal (Hermann et al., 2009). Estas cavidades contienen 
liquido cerebroespinal (LCE), el cual es producido por los plexos coroideos, que son 
estructuras epiteliales altamente plegadas e irrigadas, que se suspenden en la luz de los 
ventrículos. La reabsorción del LCE se lleva a cabo en las fosas sagitales profundas, por 
lo que está en constante recambio y mantiene microambientes de composición altamente 
controlada (Johanson, 2011; Kaur et al., 2016). Las zonas periventriculares, debido a su 
acceso al LCE, representan una vía de comunicación entre el parénquima cerebral y el 
exterior del SNC (Joly et al., 2007). 
En la Figura 8 se muestra el sistema ventricular del roedor, y la ubicación del cuarto 
ventrículo, cuya parte dorsal constituye la zona periventricular del cerebelo y la porción 
ventral la superficie del tallo cerebral. 
 
Figura 8. El sistema ventricular. A la izquierda se presenta un cerebro de roedor en el que se 
indica con placas los cortes para exponer en orientación coronal los ventrículos laterales (A-A), 
tercer ventrículo (B-B), acueducto de Silvio (C-C) y cuarto ventrículo (D-D), nótese que el sistema 
ventricular se extiende como canal central hacia la médula espinal. Modificado de Hermann et al., 
2009. 
 
Las zonas periventriculares incluyen células ependimales que forman mosaicos 
estratificados con organización diferente entre ventrículos (Hermann et al., 2009). Estas 
células tienencilios que se baten para favorecer el movimiento del LCE. Como se 
mencionó en los apartados anteriores, las zonas periventriculares constituyen nichos 
Ventrículos 
laterales
Tercer
Ventrículo 
Acueducto
De Silvio 
Cuarto
Ventrículo 
Cerebelo
Puente
Ventrículos 
laterales
Tercer
Ventrículo 
Acueducto
De Silvio 
Cuarto
Ventrículo 
Cerebelo
Puente
 
15 
 
germinales cuyas características neuro y/o gliogénicas se restringen a la etapa 
embrionaria a excepción de los ventrículos laterales (Ihrie y Alvarez-Buylla, 2011). 
En el periodo adulto, se ha caracterizado la presencia de nichos neurogénicos 
activos en la zona subventricular de los ventrículos laterales (Ihrie y Alvarez-Buylla, 2011; 
Lim y Alvarez-Buylla, 2014). Estos nichos poseen características tanto estructurales 
como histoquímicas muy peculiares. Forman estructuras en forma de rehilete en la 
superficie ventricular, tiene células biciliadas (E2) y monociliadas (E1) que funcionan 
como antenas sensoras de señales químicas en el LCE (Mirzadeh et al., 2008). Estos 
nichos incluyen células germinales denominadas células B, que proliferan lentamente y 
dan lugar a células de proliferación rápida (células C o en estado intermedio) que 
finalmente dan lugar a neuroblastos inmaduros denominados células A, las cuales migran 
tangencialmente a la zona periventricular en forma de cadenas, constituyendo la 
denominada corriente migratoria rostral que se establece en el bulbo olfatorio como 
interneuronas GABAérgicas (Gengatharan et al., 2016). Estas poblaciones celulares 
poseen características peculiares, las células B expresan el filamento intermedio nestina, 
la proteína glial fibrilar ácida GFAP y la proteína CD133 (por sus siglas en inglés, CD: 
cluster of differentiation) y las células C expresan el receptor de factor de crecimiento 
epidérmico (por sus siglas en inglés, EGFR: epidermal growth factor receptor) y los 
factores de transcripción ascl1 y dlx2 (Ihrie y Alvarez-Buylla, 2011). En la Figura 9 se 
ilustra la región de la zona subventricular de los ventrículos laterales, así como la 
organización de los nichos neurogénicos mencionados. La porción ventral o zona 
periventriular del cerebelo (ZPVCb) constituye el techo del cuarto ventrículo. Es poca la 
información que se tiene acerca de las características estructurales y funcionales de esta 
región en etapa adulta. Álvarez-Morujo, et al. (1992) reportan a esta zona como una capa 
celular ciliada, con algunas regiones no ciliadas que aparentan parches. Sin embargo, se 
reportaron características muy generales y no se realizó un estudio sistematizado a través 
de la ZPVCb. 
Durante estudios previos en el laboratorio mostramos que la ZPVCb no solo está 
compuesta por células ependimales, sino que está constituida por diferentes tipos 
celulares. 
 
16 
 
 
 
Figura 9. Nichos neurogénicos en los ventrículos laterales. A la izquierda se muestra un corte 
coronal al nivel de los ventrículos laterales, con la zona subventricular (SVZ, por sus siglas en 
inglés) que contiene células troncales tipo B1, con características de astrocitos que dan lugar a 
las células en transición rápida (C) y éstas a su vez a células A, que son neuroblastos que migran 
a través de la denominada corriente migratoria rostral, para establecerse en el bulbo olfatorio 
como interneuronas GABAérgicas. Las células B extienden un proceso largo que contacta a los 
vasos sanguíneos y un proceso apical que se extiende hacia la luz ventricular. Los nichos 
neurogénicos forman en su superficie ventricular estructuras en forma de rehilete y las células 
que rodean al cilio apical de las células B1 son células multiciliadas y biciliadas (E2 y E1, 
respectivamente). En la superficie se han descrito axones serotoninérgicos (5HT). En la parte 
inferior se muestran los procesos de división que pueden ser simétrica (dando origen a nuevas 
células B1) o asimétrica (dando origen a células C). Modificado de Lim y Alvarez-Buylla, 2014. 
 
Esto fue determinado al realizar registros electrofisiológicos en rebanadas agudas 
de cerebelo, y obteniendo los perfiles electrofisiológicos de las células peri- y 
subventriculares, que sugieren la presencia de células ependimales, glía, neuronas, 
oligodendrocitos y un quinto tipo de perfil con características de células progenitoras, esto 
se muestra en la Figura 10 (Reyes-Haro et al., 2013). 
ACB
 
17 
 
 
Figura 10. Heterogeneidad celular en la zona subventricular del cerebelo. En A se muestra 
un corte coronal de cerebelo GFAP-eGFP, en donde se indica la ubicación de las células gliales 
ependimales (EGCs, por sus abreviaturas en inglés:). En B un ejemplo de célula que ha sido 
llenada con sulforodamina durante el proceso de registro electrofisiológico. En C ejemplo 
representativo de un perfil de corriente y la relación lineal corriente-voltaje. Las corrientes fueron 
generadas al cambiar el voltaje desde el potencial de fijación a -70mV hasta -150mV y hasta 
+30mV en pasos de 10 mV por 50 mseg. En D, en el siguiente orden se muestran los perfiles de 
corriente obtenidos para las diferentes poblaciones celulares: células ependimales GFAP+, 
células subependimales GFAP+, neuronas, oligodendrocitos y un tipo de perfil característico de 
las células progenitoras. Tomado de Reyes Haro et al., 2013. 
 
18 
 
2.9 Identificación de nuevos nichos celulares en la zona periventricular del 
cerebelo. 
 Debido a que las observaciones indicaban la presencia de heterogeneidad celular 
y organizacional a través de la ZPVCb, se diseñaron experimentos para determinar con 
mayor detalle dicha organización. En la Figura 11, se muestran tinciones de cortes 
seriados con el colorante metacromático azul de toluidina, con el que se identificó una 
estructura en la zona subventricular del cerebelo, la cual se encuentra restringida a un 
área de 300 ± 20 μm en el plano lateral y de 160 ± 20 μm en el plano anterior-posterior. 
Dicha estructura está constituida por células con distintas características morfológicas y 
nos referiremos a ésta como nicho celular subventricular (NCSV). Estos resultados 
constituyen los antecedentes directos para el planteamiento del presente proyecto. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11. Nicho celular en la zona subventricular del cerebelo. En A un corte coronal de 
cerebelo de ratón adulto de 1 mm de grosor, teñido con azul de toluidina y embebido en resina, 
en el que se evidencia un cúmulo celular en la región medial subventricular, en una interface entre 
la capa molecular y la zona periventricular (cabeza de flecha). En B un corte de 40 µm en la 
misma disposición, en el que se define la presencia de somas celulares en dicha estructura. CG: 
capa granular, CP: capa de células de Purkinje, CM: capa molecular, ZPVCb: zona periventricular 
del cerebelo. 
120 μm
ZPVCb
CP
CM
CG
250 µm
IV
ZPVCb
A
B
 
19 
 
El presente proyecto se enfocó en la caracterización del NCSV. El diseño 
experimental consistió en el empleo de estrategias que permitieron evidenciar los 
diferentes fenotipos celulares, su organización estructural y ultraestructural, se analizó si 
las células de dicha estructura se encuentran en proliferación en condiciones basales. 
Además, se evidenció la organización de su vasculatura y se evaluó la presencia de 
capilares fenestrados. Se analizó por microscopía electrónica de barrido las 
características del techo del cuarto ventrículo que subyacen al nicho celular en estudio. 
Asimismo, se evaluaron las modificaciones de esta región por la administración del 
agente alquilante carmustina en un periodo embrionario crítico para la gliogénesis. 
La carmustina (IUPAC: 1,3-Bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea), o BCNU, es un 
compuesto de la familia de las nitrosoureas y es un agente alquilante ampliamente 
empleado como quimioterapéutico por producir efectos antineoplásicos, debido a que 
contiene dos grupos cloroetilo que alquilan los ácidosnucleicos y las proteínas celulares 
formando entrecruzamientos de ADN-ADN o de ADN-proteína (Brandes et al., 2016; 
Reithmeier et al., 2010). 
Como se describió en el apartado de desarrollo embrionario del SNC, hay 
ventanas de tiempo específicas para la generación de las diferentes poblaciones 
celulares. En este proyecto se empleó la carmustina para alterar el desarrollo normal de 
las poblaciones gliales durante el momento embrionario crítico de gliogénesis (día E13), 
y con ello se pudo evaluar en la etapa adulta las modificaciones en el nicho celular 
subventricular. Esta estrategia permitió analizar en retrospectiva si el establecimiento del 
nicho celular subventricular depende de procesos que tienen lugar durante dicho 
momento embrionario. 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
3. HIPÓTESIS 
 
La administración del agente alquilante carmustina durante la etapa embrionaria crítica 
para la gliogénesis, produce modificaciones estructurales en la glía del nuevo nicho 
celular subventricular del cerebelo. 
 
 
4. OBJETIVO GENERAL 
 
Determinar las características estructurales y la composición celular de un novedoso 
nicho celular subventricular en el cerebelo, asi como evaluar el efecto de la administración 
de carmustina durante la etapa crítica para la gliogénesis, sobre su organización. 
 
 4.1. Objetivos específicos 
 
Para el nicho celular subventricular: 
i) Determinar los fenotipos celulares que lo conforman. 
ii) Describir su organización estructural. 
iii) Evaluar la capacidad para proliferar de las células que lo conforman. 
iv) Describir las características de su vasculatura. 
v) Analizar las características de la región ventricular. 
vi) Evidenciar las modificaciones anatómicas y estructurales que presenta en respuesta 
a la administración de carmustina durante el periodo embrionario crítico para la 
gliogénesis. 
 
21 
 
5. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 
5.1 Declaraciones bioéticas 
Todos los procedimientos que involucran el uso de animales durante el desarrollo del 
presente proyecto, fueron aprobados por el comité de bioética del Instituto de 
Neurobiología de la Universidad Nacional Autónoma de México (No. de aprobación: 
INEU/SA/CB089); y fueron diseñados para evitar en mayor medida el sufrimiento de los 
animales. 
5.2 Cepas de ratón empleadas 
- Ratones machos adultos de la cepa CD1. 
- Ratones machos adultos de la cepa C57. 
- Ratones transgénicos GFAP-eGFP, hembras preñadas y crías en 
etapas postnatales (P5, P10, P21 y P30). 
5.3 Metodología 
Para permitir una mejor visualización de la metodología, ésta se dividió en dos bloques, 
en el primero se presenta la metodología empleada en forma de resumen, en ésta se 
muestran los puntos generales. En el segundo bloque se presenta la metodología 
detallada. 
5.3.1 Resumen de la metodología 
 
 Determinación de coordenadas del NCSV 
- Cortes seriados de cerebelo de ratón y su tinción con azul de toluidina. 
- Cortes seriados de cerebelo de ratón GFAP-eGFP para ubicar el NCSV y 
la distribución de las células gliales. 
 Análisis del fenotipo de las células que conforman el NCSV. 
- Empleo de marcadores selectivos para evidenciar el fenotipo de las células 
que conforman el NCSV y de los elementos celulares que lo rodean: a) 
NeuN, marcador de neuronas maduras; b) GFAP (proteína glial fibrilar 
ácida), marcador de células gliales; c) MBP (proteína básica de mielina), 
marcador de oligodendrocitos; d) Nestina (filamento intermedio tipo VI), 
marcador de células progenitoras proliferando rápidamente y en cerebelo 
en algunas células de la glía de Bergmann; e) Vimentina (filamento 
 
22 
 
intermedio tipo III), marcador de células mesenquimatosas; f) Calbindina 
(proteína de unión a calcio), en cerebelo es marcador de interneuronas, 
particularmente expresado en neuronas de Purkinje; g) Calretinina (proteína 
de unión a calcio), en SNC expresado en algunas interneuronas; h) GAD-
65 (descarboxilasa del ácido glutámico), marcador de neuronas 
GABAérgicas, se expresa en terminales sinápticas. 
 Determinación de la capacidad de proliferar de las células del nicho celular 
subventricular el cerebelo. 
- Evaluación de incorporación de BrdU mediante dos protocolos, el primero 
para evaluar si hay proliferación rápida (administración única de BrdU y 
sacrificar después de cuatro horas) y el segundo para evaluar la 
proliferación lenta (administración de BrdU durante cuatro días, dos veces 
al día con intervalo de seis horas y sacrificar al quinto día). 
- Evidenciar células en división empleando el anticuerpo de la proteína 
nuclear Ki67. 
 Evaluación de permeabilidad capilar, característica propia de los órganos 
circunventriculares. 
- Administración de azul de Evans por vía intraperitoneal para la 
determinación de la permeabilidad de los capilares en el nicho 
subventricular del cerebelo en cortes coronales y por microscopía de 
fluorescencia. 
 Análisis de la vasculatura en el nicho celular subventricular del cerebelo. 
- Empleo de faloidina-rodamina para marcar F-actina y evidenciar 
organización celular en el NCSV. 
- Empleo de IB4 (isolectina B4), que es un marcador que se une a células 
endoteliales, por lo que permite evidenciar la vasculatura. 
 Análisis estructural y ultraestructural. 
- Empleo de la carbocianina DiI como trazador anterógrado retrógrado para 
conocer la organización celular. 
- Análisis ultraestructural por microscopía electrónica de transmisión. 
 
 
23 
 
 Caracterización electrofisiológica y morfológica de las células que conforman el 
nicho celular subventricular. 
- Registros de células en rebanadas de cerebelo por el método de fijación 
de voltaje. 
- Administración de biocitina después del registro electrofisiológico. 
- Revelado de biocitina para el análisis de la morfología de las células 
registradas. 
 Análisis de la organización de la superficie del techo del cuarto ventrículo 
asociada con el nicho celular subventricular. 
- Disección del cerebelo en disposición de "libro abierto" para exponer el 
techo del cuarto ventrículo. 
- Análisis de la distribución de nestina y GFAP en el techo del cuarto 
ventrículo. 
- Análisis de la distribución de los capilares en el techo del cuarto ventrículo. 
- Análisis por microscopía electrónica de barrido de la superficie del techo del 
cuarto ventrículo. 
 Análisis de modificaciones gliales en el NCSV en respuesta a la administración 
de carmustina. 
- Administración de carmustina en madres preñadas GFAP-eGFP, durante 
el día embrionario (E)13. 
- Procesamiento de cerebelos de crías a los días postnatales (P) 
- P5, P10 y P21. 
 
5.3.2 Métodos 
 
5.3.2.1 Obtención de material biológico 
En las diferentes estrategias empleadas en el presente proyecto se requirió fijar el 
encéfalo, lo cual se realizó mediante perfusión intracardiaca con solución de fomaldehído. 
Previo a la obtención de cerebelos, los ratones fueron anestesiados con pentobarbital 
sódico (30 mg/Kg), se expuso la cavidad torácica, se seccionó la aurícula derecha y por 
el ventrículo izquierdo se hizo pasar solución salina fisiológica (SSF: NaCl 0.9%) durante 
 
24 
 
30 segundos y posteriormente 150 mL de una solución fijadora, que se preparó 
disolviendo paraformaldehído (4 %) en solución de fosfatos PBS (PBS 10X: Na2HPO4 77 
mM, NaH2PO4*H2O 23 mM y NaCl 0.3 M, pH 7.4) y ajustado a un a un pH de 7. La 
perfusión se realizó por 20 min o hasta que el ratón presentara rigidez corporal. Se 
extrajeron los cerebros y se postfijaron en un volumen diez veces mayor a la del tejido, 
esto se llevó a cabo a 4 oC por cuatro horas. Posterior a esto los cerebros se 
crioprotegieron en concentraciones crecientes de sacarosa (10, 20 y 30 % en PBS 1X), 
realizando el cambio de solución hasta que el cerebro se depositara en el fondo del vial 
que lo contenía y manteniendo a 4 oC. Se embebieron en medio para congelación 
(Tissue-Tek O.C.T. marca Sakura®) y se llevarona -80 oC. Se realizaron cortes coronales 
de la zona que abarca los lóbulos I y X del cerebelo, con un espesor de 40 μm en el 
criostato Leica® (CM3050S) a -25 oC, se colocaron en porta objetos y se almacenaron a 
-80 oC hasta su procesamiento. 
 
5.3.2.2 Tinción con azul de toluidina 
Para determinar las coordenadas específicas, así como las dimensiones del NCSV, se 
obtuvieron cortes coronales de 40 μm de 5 cerebelos. Se colectaron en portaobjetos y se 
tiñeron con azul de toluidina como se describe a continuación: 
Se realizaron 3 lavados (10 min cada uno) con PBS 1X; se tiñó con azul de 
toluidina por cinco segundos y se lavó inmediatamente con agua, seguido por trenes de 
deshidratación con alcohol (30, 60, 75, 90 y 100 %) y con xilol. Finalmente, las muestras 
se cubrieron con cubreobjetos, empleando como medio de montaje Entellan (Merck®). 
Las preparaciones fueron procesadas en un microscopio Olympus BX60®. 
 
5.3.2.3 Análisis de la identidad celular 
Para determinar la identidad de las células que constituye el NCSV, se llevó a cabo 
inmunofluorescencia empleando los siguientes anticuerpos: nestina (Santa Cruz, sc-
21249), vimentina (sigma v4630), calbindina (Santa Cruz, sc7691), calretinina (Santa 
Cruz, sc11644), proteína básica de mielina (abcam, ab40390), ácido glutámico 
descarboxilasa (GAD) 65 (Santa Cruz, sc32270), Ki67 (abcam, ab15580) y NeuN 
(Millipore, MAB377). 
 
25 
 
Para la detección inmunológica con los anticuerpos primarios, las preparaciones 
se lavaron dos veces con solución de PBS-Tween 20 (PBS 1X, Tween 20, 0.5 %) y se 
incubaron con solución de bloqueo (suero de la especie en la que se generó el anticuerpo 
secundario al 2 %, albúmina bovina, 0.1 %, Tween 20, 0.05 % y Tritón X-100, 0.1% en 
PBS 1X) por 30 min. Posteriormente los cortes se incubaron a 4 oC por 24 h con el 
anticuerpo disuelto en una solución que incluye PBS 1X y Tween 20, 0.1 %, en orbital a 
baja velocidad. Los controles negativos consisten en incubar solución sin anticuerpo 
primario. 
Se realizaron diez lavados de diez min cada uno y se incubaron con los anticuerpos 
secundarios correspondientes, que pudieron ser Alexa flúor 488 (Invitrogen A11055) o 
Alexa flúor 594 (Invitrogen A11058) a una dilución de 1:200 en PBS 1X que contiene 
Tween 20 (0.1 %) por 24 h a 4.0 oC en oscuridad y ligera agitación. Los tejidos se lavaron 
diez veces (diez min cada lavado). Para realizar el marcaje nuclear, los tejidos se lavaron 
dos veces con solución de PBS 1X, Tween 20, 0.1 % y se incubaron con una solución de 
4´,6-diamidino-2-fenilidona (DAPI, 0.01 mg/mL) en PBS 1X por 20 min. Se deshidrató el 
tejido con etanol 96 % y posteriormente con etanol absoluto, se montaron en un 
portaobjetos. Las preparaciones se procesaron para obtener imágenes en un microscopio 
confocal ZEISS® (LSM 780). 
 
5.3.2.4 Análisis de la proliferación celular 
Para evidenciar si las células del NCSV se encontraban en proceso de proliferación, 
empleamos una estrategia que en general consiste en la administración de 
bromodesoxiuridina (BrdU) por vía intraperitoneal, que es un nucleótido sintético análogo 
a la timidina que se incorpora al DNA de células en división y es detectado posteriormente 
por un anticuerpo. 
Se emplearon dos protocolos, el primero tuvo como objetivo determinar si había 
proliferación rápida, tomando como referencia la zona subventricular de los ventrículos 
laterales (Ihrie y Alvarez-Buylla, 2011; Lim y Alvarez-Buylla, 2014), el segundo es un 
protocolo para evaluar división lenta (modificado de Zhao et al., 2014). 
https://es.wikipedia.org/wiki/Nucle%C3%B3tido
https://es.wikipedia.org/wiki/Timidina
 
26 
 
El protocolo de proliferación rápida consistió en una dosis única de BrdU (50 
mg/kg) por vía intraperitoneal (n=4). Para los grupos controles (n=3) se administró 
únicamente el vehículo, que consiste de solución salina fisiológica. Después de cuatro 
horas se sacrificaron los ratones y procesaron los cerebros como fue descrito para 
inmunofluorescencia. Se obtuvieron rebanadas coronales del cerebelo y la región que 
incluye los ventrículos laterales para emplearlos como control positivo, se realizaron 
lavados con PBS 1X (3 de 10 min), seguido de un lavado con PBS 1X con Tritón X100 (1 
%) por 30 min. La hidrólisis del DNA se realizó con HCl 2 N por una hora a 37 oC, seguido 
de un lavado con PBS 1X, Tween 20 0.1 % (2 de 10 min) y solución de bloqueo (PBS 1X 
con albúmina bovina, 10 %, Tween 20, 0.1 % y Tritón x100, 0.3 %) durante 30 min. La 
inmunodetección se realizó como se describe en el apartado de inmunofluorescencia, 
empleado un anticuerpo anti BrdU (Santa Cruz, 3H579), un anticuerpo secundario 
acoplado a Alexa 488 (A-11006) y se marcaron los núcleos celulares con DAPI. 
Para el protocolo de proliferación lenta se administró la misma dosis dos veces al 
día cada seis horas durante cuatro días consecutivos. Al quinto día se sacrificaron los 
ratones y se procesaron como ya se mencionó para proliferación rápida. Las muestras 
fueron procesadas en un microscopio confocal Zeiss (LSM 780®). 
 
5.3.2.5 Análisis de capilares fenestrados con azul de Evans 
Para evaluar si el NCSV incluye capilares fenestrados, como los presentan otras 
estructuras a través del sistema ventricular (órganos circunventriculares) (Joly et al., 
2007; Bennett et al., 2009); se empleó azul de Evans, el cual es un colorante que tiene 
afinidad por las proteínas séricas, por lo que en las zonas en donde no hay barrera 
hematoencefálica, el colorante se incorpora. 
Para el análisis con azul de Evans, se administró el colorante (4 % en solución 
salina fisiológica) por vía intraperitoneal (100 mg/Kg) en un grupo de 5 ratones. Una vez 
que la piel de los ratones se tornó azul (24 h), los ratones fueron perfundidos con solución 
salina fisiológica (previa anestesia con pentobarbital sódico (30 mg/Kg). Los cerebelos 
fueron obtenidos inmediatamente, cortados en un vibratomo (Leica, VT1000S) y 
montados en portaobjetos. Las preparaciones fueron analizadas empleando microscopio 
 
27 
 
de campo claro y posteriormente por fluorescencia empleando un microscopio confocal 
Zeiss (LSM 780®). 
 
5.3.2.6 Análisis de la vascularización del NCSV 
Para evidenciar la distribución de los capilares sanguíneos en el NCSV se emplearon dos 
estrategias. La primera consistió en el empleo de la isolectina IB4, la cual es una 
glicoproteína proveniente de una leguminosa africana (Griffonia simplicifolia) acoplada a 
un fluoróforo (Alexa-594). Esta isolectina se une a los residuos terminales de α-
galactosidasa expresados en células endoteliales y permite evidenciarlos. 
Para esta estrategia se partió de tejido fijado obtenido como se describió para 
inmunofluorescencia. Se realizaron dos lavados (10 min cada uno) con PBS 1X, se incubó 
en una solución de PBS 1X que contiene IB4 1:500 y Tritón x100 0.3 % por 24 h. Se 
realizaron 10 lavados (10 min cada uno) con PBS 1X. Finalmente las muestras se 
montaron con cubreobjetos. 
Para la segunda estrategia se empleó el complejo rodamina-faloidina, que tiene 
afinidad por la F-actina y que en permitió evidenciar la organización celular de la zona 
periventricular, y con ello los epitelios capilares. La faloidina es un péptido bicíclico 
perteneciente a una familia de toxinas aisladas a partir de la seta Amanita phalloides. 
Para esta técnica se realizaron lavados con PBS 1X, seguido por la incubación con glicina 
0.1 % por un minuto y con PBS 1X con Tritón X100, 0.1 % por un min. Se procedió a 
incubar con una solución de rodamina-faloidina 1:100 disuelta en PBS 1X por 15 min y 
se realizaron lavados con PBS 1X. Finalmente se contratiñeron los núcleos con DAPI, 
0.01 mg/mL, como se describió para inmmunofluorescencia. Las preparaciones, tanto las 
de IB4 como las de rodamina-faloidina se observaron en el microscopio confocal Zeiss 
(LSM 780®). 
5.3.2.7 Análisis estructural y ultraestructural5.3.2.7.1 Microscopía electrónica de transmisión 
Para analizar las características ultraestructurales de la zona peri- y subventricular del 
cerebelo, se empleó microscopía electrónica de transmisión (MET). La metodología que 
se empleó se describe a continuación: 
 
28 
 
Se emplearon ratones CD1 (machos de 30 días), fueron fijados por perfusión 
intracardiaca como se describió para inmunofluorescencia, pero empleando una solución 
fijadora que contiene formaldehído 4 % y glutaraldehído 0.5 %, disueltos en solución 
tamponada de arsenato de sodio o cacodilato (0.1 M, pH 7.4). Se obtuvo una sección de 
la zona de interés de aproximadamente 1 mm3 y se mantuvo en glutaraldehído 3.0 % en 
cacodilato 0.1 M pH 7.4, a 4 C por 2 h. Se lavó con solución de cacodilato 0.1 M y 
sacarosa 0.25 M (3 lavados de 15 min). Se procedió a postfijar con tetraóxido de osmio 
1 % en cacodilato 0.1 M por 2 h en baño de hielo, bajo campana de extracción y se lavó 
con una solución de ácido tánico 2 % en cacodilato 0.2 M, pH 7.4, a 4.0 C (5 lavados de 
15 min). El tejido se deshidrató empleando concentraciones crecientes de alcohol (10, 
20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 96 y 100 %) en baño de hielo (2 incubaciones de 15 min 
para cada concentración), finalizando con una incubación a temperatura ambiente en 
etanol absoluto y una con óxido de propileno. 
Para embeber las muestras en bloques de resina, estas se incubaron en rotación 
y a temperatura ambiente en una mezcla de óxido de propileno: resina Epon 812 (1:1) 
hasta que esta mezcla tuviera una consistencia espesa. Se mantuvo en rotación con 
resina completa por 4-5 h y finalmente se pasó a un molde con resina nueva, para 
proceder a polimerizar a 60 oC por 36 h. Se obtuvieron cortes semifinos de 60-70 nm en 
un ultramicrotomo MTx (RCM®) y se montaron en rejillas de cobre. Para contrastar el 
tejido, se empleó acetato de uranilo 2 %, seguido de citrato de plata, 2 % en cámara libre 
de CO2. Las preparaciones fueron procesadas para obtener imágenes en un microscopio 
electrónico de transmisión JEM-1010 (JEOL) a 80 KV. 
 
5.3.2.7.2 Microscopía electrónica de barrido 
Para analizar la organización estructural superficial del techo del cuarto ventrículo, se 
procesaron cerebelos de ratones CD1, machos de 30 días de vida, y se procesaron para 
microscopía electrónica de barrido. Para esta estrategia se procesó el tejido como para 
(MET), con algunas modificaciones: se disecó el techo del cuarto ventrículo, que 
corresponde a la porción ventral del cerebelo (en disposición de libro abierto (Anexo 1), 
y después de deshidratar en alcohol al 100 % se llevaron hasta el punto crítico de 
deshidratación empleando un equipo Tousimis dryer (samdri-PVT-3D®), se cubrió la 
 
29 
 
superficie con oro empleando un equipo Denton vacuum (Desk®). Finalmente, las 
muestras fueron procesadas en un microscopio electrónico de barrido EVO 50 (Zeiss®). 
 
5.3.2.8 Caracterización electrofisiológica 
Para conocer las características electrofisiológicas de las células que constituyen el 
NCSV, se utilizó la técnica de fijación de voltaje en configuración de célula completa, en 
rebanadas de cerebelo de ratón adulto (P30). Los ratones fueron anestesiados en una 
cámara hermética, empleando isofluorano. Se colectaron los cerebros en solución de 
disección fría y burbujeada con carbógeno que contenía en mM: sacarosa (212.7), KCl 
(5.0), NaH2PO4 (1.25), MgSO4 (3.0), CaCl2 (1.0), NaHCO3 (26) y glucosa (10), pH 7.4. Se 
empleó la misma solución para obtener rebanadas en un vibratomo. Las rebanadas se 
mantuvieron en burbujeo con carbógeno a temperatura ambiente por 30-60 min. 
Para determinar la viabilidad de las rebanadas, basado en la cantidad de células 
vivas en la misma, se realizó la tinción con Hoecsht. Se incubaron las rebanadas en una 
solución de Hoecsht 1:100 en PBS 1X por 5 min, se lavó con PBS 1X, se montaron y se 
observaron al microscopio de fluorescencia. Los criterios empleados para determinar las 
buenas condiciones de una rebanada consistieron en encontrar al menos el 90 % de 
células viables en la misma y particularmente en la zona de interés. 
Par realizar los registros electrofisiológicos se empleó una solución extracelular 
que contenía en mM: NaCl (125), KCl (2.5), NaH2PO4 (1.25), MgCl2 (1), CaCl2 (2), 
NaH2PO4 (1.25), NaHCO3 (26) y glucosa (10), pH 7.4. La solución intracelular contenía 
en mM: K-gluconato (130), KCl (7), ATP-Mg (4), GTP-Na (0.3), fosfocreatina-di (Tris) (10), 
HEPES (10) y biocitina (0.4 %), esta última para posteriormente ser revelada y evidenciar 
la morfología de las células registradas. 
Los registros fueron realizados a 37 oC empleando pipetas de registro con 6-8 MΩ 
de resistencia. Las células fueron visualizadas con objetivos de 20x y 40x en un 
microscopio Nikon FN-S2N. Los registros se realizaron empleando un amplificador 
Multiclamp 700B (Molecular Devices®). 
 
 
30 
 
Las rebanadas de las que se obtuvieron registros electrofisiológicos fueron fijadas 
por al menos 12 h en PFA (4 %) a 4 oC; la actividad de peroxidasa endógena fue 
bloqueada mediante la incubación en peróxido de hidrógeno (3 %) por 30 min, se 
procedió a formar complejos avidina-biocitina empleando el kit Vectastain ABC (DAKO) y 
reveladas con diaminobencidina (Vector Laboratories). Las rebanadas de 250 µm fueron 
crioprotegidas con gradientes de sacarosa, embebidas en Tissue Tek O.C.T. (Sakura) 
para obtener rebanadas de 40 μm de grosor. Se obtuvieron imágenes en un microscopio 
Olympus BX60. 
 
 5.3.2.9 Análisis de la composición celular del techo del cuarto ventrículo 
Para analizar la organización estructural del techo del cuarto ventrículo, se emplearon 
cerebelos CD1 y GFAP-eGFP fijados como se ha descrito en los protocolos anteriores 
con algunas modificaciones: se empleó PFA 4 % en PBS que incluye Triton X100, 0.1 % 
como fijador (Mirzadeh et al., 2010). Se procedió a remover el tallo cerebral para exponer 
la porción ventral del cerebelo, a lo que denominados disección en disposición de “libro 
abierto” (Anexo 1) y se procesó para inmunofluorescencia empleando el mismo protocolo 
descrito para cortes en criostato, con aumento en el tiempo de incubación: 72 h tanto 
para anticuerpos primarios como secundarios, realizando 10 lavados de 1 h y un lavado 
de 24 h después de la incubación con cada anticuerpo. Se realizó tinción de núcleos 
incubando las muestras con yoduro de propidio (0.05 mg/mL) con RNAsa (0.01 μg/mL) ó 
con 4´,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 0.01 mg/mL) durante 24 h. Todas las incubaciones 
se realizaron a 4 oC. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
31 
 
6. RESULTADOS 
6.1 Coordenadas del nicho celular subventricular 
En cortes coronales de cerebelo de ratón adulto, específicamente en la zona 
periventricular del cerebelo (ZPVCb) se evidenció un complejo de células agrupadas en 
la porción medial del techo del cuarto ventrículo, al cual referimos como nicho celular 
subventricular (NCSV); la tinción con azul de toluidina permitió evidenciar su posición 
(Figura 12A). Se determinaron las coordenadas de la porción media del NCSV en -6.24 
mm, tomando como referencia Bregma (Paxinos y Franklin, 2001), y las dimensiones del 
mismo son de 300 ± 20 μm en el plano lateral y de 160 ± 20 μm en el plano anterior-
posterior (n=5). Esta preparación permitió determinar que este nicho se compone por 314 
± 8 células de diversos tamaños, esto fue corroborado también con experimentos 
posteriores empleando DAPI y yoduro de propidio. El análisis se realizó en proyecciones 
de imágenes en el plano z y se empleó el contador celular del procesador de imágenes 
Image J®. En la Figura 12 se esquematiza la ubicación del NCSV tanto en disposición 
sagital como en coronal (paneles B-C, respectivamente). 
 
6.2 Fenotipos celulares en el NCSV 
Para determinar los fenotipos celulares que conforman el NCSV, se emplearon diferentes 
marcadores de identidad. Las