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1 ! DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS INSTITUTO DE FISIOLOGÍA CELULAR “CONTRIBUCIÓN DE LA VÍA DE ASIMILACIÓN DE AZUFRE Y DE LA SÍNTESIS DE FITOQUELATINAS A LA RESISTENCIA DE Cd2+ EN Euglena gracilis” Que para optar por el grado de: DOCTOR EN CIENCIAS PRESENTA: M. en C. JORGE DONATO GARCÍA GARCÍA TUTOR PRINCIPAL: Dr. RAFAEL MORENO SÁNCHEZ Entidad de adscripción: Instituto de Fisiología Celular MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR: Dr. JUAN PABLO PARDO VÁZQUEZ Entidad de adscripción: Facultad de Medicina Dr. ANTONIO PEÑA DÍAZ Entidad de Adscripción: Instituto de Fisiología Celular MÉXICO D.F. Octubre 2014 ! ! ! UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO (NOMBRE DEL PROGRAMA) (NOMBRE DE LA FACULTAD, ESCUELA, CENTRO O INSTITUTO) (OPTATIVO: CAMPO DE CONOCIMIENTO, CAMPO DISCIPLINARO) (TÍTULO DEL TRABAJO) (MODALIDAD DE GRADUACIÓN) QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: (GRADO) EN (TAL COMO ESTÁ REGISTRADO EN LA SEP) PRESENTA: (NOMBRE DEL ALUMNO) TUTOR O TUTORES PRINCIPALES EN SU CASO, MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR MÉXICO, D. F…. 20XX UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 Agradecimientos Comité tutoral: Dr. Rafael Moreno Sánchez Dr. Juan Pablo Pardo Vázquez Dr. Antonio Peña Díaz Departamento de Bioquímica Dra. Emma Saavedra Silva Dra. Sara Rodríguez Dra. Viridiana Olin Sandoval Centro de Ciencias Genómicas Dra. Georgina Hernández Delgado Dra. Ma. De Lourdes Girard Cuesy Dr. David Zamorano Candidata a Dra. Bárbara Nova Franco M. en C. Patricia Rivera University of Missouri-Columbia Dr. David Guillermo Mendoza-Cózatl Dra. Norma Angélica Castro Guerrero 3 Indice pág. Abreviaturas 5 1 Justificación del proyecto de Doctorado 6 2 Aporte científico y social 8 3 Resumen 9 3.1 Abstract 10 4 Introducción 12 4.1 Cuerpos de agua en territorio Mexicano contaminados con metales pesados. 12 4.2 Organismos acuáticos con potencial para ser aplicados en la biorremediación de cuerpos de agua contaminados con metales pesados. 14 4.3 Mecanismos de resistencia y acumulación de metales pesados en E. gracilis . 17 4.4 Vía de asimilación de azufre, síntesis de GSH y PCs en E. gracilis. 22 4.5 Los PMST, la γ-ECS y la PCS son etapas controladoras de la síntesis de GSH y PCs en algas, levaduras y plantas. 28 5 Hipótesis 33 6 Objetivo general 33 6.1 Objetivos particulares 33 7 Resultados 34 7.1 Contribución de los PMSTs y la γ-ECS al control de las vías de asimilación de azufre y de síntesis de GSH y PCs en E. gracilis cultivada con Cd2+, o con deficiencia de sulfato, o con sobrecarga de Cys. Mecanismos de regulación transcripcionales y cinéticos. 34 7.2 Resumen de los principales hallazgos, significado y avance al conocimiento de la Publicación 1. 40 Publicación 1 41 7.3 Evaluaciones de los revisores a la Publicación 1 y respuestas a sus comentarios. 53 7.4 Otros resultados incluidos en la Publicación 1. 66 7.5 Caracterización cinética y transcripcional de la fitoquelatinas sintasa de E. gracilis (EgPCS). 72 4 7.6 Resumen de los principales hallazgos, significado y avance al conocimiento de la Publicación 2. 78 Publicación 2 79 7.7 Evaluaciones de los revisores a la Publicación 2 y respuestas a sus comentarios. 109 8 Discusión general 115 8.1 PMST 115 8.2 γ-ECS. 120 8.3 EgPCS. 123 8.4 Alcances del proyecto de doctorado. 129 9 Conclusiones 131 10 Perspectivas 132 10.1 Caracterización del transporte de sulfato, glutatión y fitoquelatinas en cloroplastos y mitocondrias de E. gracilis. 132 10.2 Aumento de la capacidad de acumulación de Cd2+ de E. gracilis mediante presión de selección con Zn2+. 134 10.3 Análisis de la función del dominio carboxilo terminal de las PCSases 136 10.4 Contribución del metabolismo de los polifosfatos (poliP) a la resistencia y acumulación de Cd2+ en E. gracilis 138 10.5 Diseño de un vector de sobre-expresión de proteínas específico para E. gracilis. 139 10.6 Estandarización de un protocolo piloto para obtener un biorreactor de E. gracilis. 140 11 Bibliografía 141 12 Otras publicaciones en las que se colaboró durante el doctorado 149 5 Abreviaturas APSR Adenosin fosfo-sulfato Reductasa ATPS ATP sulfurilasa Cd-GS2 bis-glutationato de cadmio Cter Dominio Carboxilo terminal CCCP m-clorocarbonilcianuro fenilhidrazona EgPCS Phytochelatin Synthase from Euglena gracilis EgPMST Plasma Membrane Sulfate Transporters from Euglena gracilis EST Expression Sequence Tag GSH Glutatión γ-EC gamma-glutamilcisteína γ-ECS gamma-glutamilcisteína sintetasa HAST High Affinity Sulfate Transporter HMWC High Molecular Weight Complex IARC International Agency of Research on Cancer LAST Low Affinity Sulfate Transporter Nter Dominio Amino terminal ORF Open Read Frame PCs Phytochelatins (fitoquelatinas) PC2 Fitoquelatina 2 (Glu-Cys-Glu-Cys-Gly) PC3 Fitoquelatina 3 (Glu-Cys-Glu-Cys-Glu-Cys-Gly) PC4 Fitoquelatina 4 (Glu-Cys-Glu-Cys-Glu-Cys-Glu-Cys-Gly) PCS Phytochelatin synthase (fitoquelatina sintasa) PMST Plasmatic Membrane Sulfate Transporter ppm partes por millón RACE Rapid Amplification cDNA Ends SAAC Solución amortiguadora de aislamiento de cloroplastos Zn-GS2 bis-glutationato de zinc 6 1 Justificación del proyecto de Doctorado La contaminación con metales pesados es un problema ambiental que afecta negativamente la salud de los seres humanos. La toxicidad de estos metales puede desencadenar problemas hepáticos, renales, hipertensión, deformación de los huesos, glaucoma y neuropatías [http://www.inecc.gob.mx], dependiendo del metal, de la dosis y del tiempo de exposición. El efecto tóxico más severo está asociado al cáncer. La International Agency for Research on Cancer (IARC) clasifica al aluminio, arsénico, cadmio y cromo dentro del Grupo 1 (es decir, compuestos y elementos carcinogénicos para humanos); y al cobalto, plomo y metil-mercurio en el Grupo 2 (es decir, probables elementos carcinogénicos para humanos) [http://monographs.iarc.fr]. Existen diversas normatividades que intentan reglamentar diferentes aspectos de la contaminación de cuerpos de agua con metales pesados. Sin embargo, la actividad antropogénica (industrial, minera, urbanización y doméstica) ha conducido a la creciente contaminación del medio ambiente. En México la norma NOM-127SSA1-1994 establece que la coagulación, floculación, sedimentación, filtración, intercambio iónico y ósmosis inversa son los tratamientos mediante los cuales se puede remediar un cuerpo de agua; desafortunadamente, se ha documentado que la concentración de los metales después del tratamiento con estas metodologías es ≥ 20 partes por millón (ppm) 1, concentración superior a los límites permisibles en la NOM-127SSA1-1994 para agua de uso yconsumo humano. Además, estas metodologías son costosas debido a los requerimientos de equipo, sistemas de monitoreo, de mantenimiento, reactivos y energía, aunado a que generan desechos tóxicos que son difíciles de confinar 2, 3. La situación actual exige el desarrollo de tecnologías de remoción más eficientes a concentraciones menores a 20 ppm y que sean amigables con el medio ambiente tales como la biorremediación. 7 A este respecto Euglena gracilis es uno de los organismos más abundantes en afluentes de agua dulce contaminados con metales pesados provenientes de minas e industrias 4; estos afluentes son moderadamente ácidos (pH de 3 a 5), lo cual también favorece la proliferación de este microorganismo. Nuestro grupo de trabajo ha dilucidado los principales mecanismos de resistencia y acumulación de metales pesados de este protista 5. En el caso del Cd2+, E. gracilis acelera la asimilación de sulfuro (S2-), cisteína (Cys), glutatión (GSH) y de los polímeros de GSH llamados fitoquelatinas (PCs), lo cual conduce al aumento de los niveles intracelulares de estos metabolitos para secuestrar al Cd2+ y posteriormente almacenarlo en mitocondrias y cloroplastos 6,7, pues este microorganismo carece de vacuolas. Debido a la importancia biotecnológica que puede llegar a tener éste protista en la biorremediación de cuerpos de agua contaminados con metales pesados, en el presente proyecto de Doctorado se planteó responder la siguiente pregunta científica: ¿Cuáles son los mecanismos de control de la vía de asimilación de azufre, síntesis de GSH y PCs en Euglena gracilis expuesta a estrés por Cd2+? Para dar respuesta, el proyecto se enfocó en determinar la contribución y los mecanismos de regulación de los transportadores de SO42- de la membrana plasmática (PMST, por sus siglas en inglés), de la γ-glutamilcisteina sintetasa (γ-ECS) y de la fitoquelatina sintasa (PCS, por sus siglas en Inglés), basado en la información que se presenta en la Introducción que señala a estas enzimas/transportadores como los principales sitios de control. 8 2 Aporte científico y social El presente proyecto aporta información molecular, cinética y metabólica sobre la contribución de los PMST, γ-ECS y PCS al control de las vías de asimilación de azufre, y de síntesis de GSH y PCs, así como de los mecanismos de regulación que modulan su respuesta ante una exposición a Cd2+ en el protista E. gracilis. Los datos generados y los enfoques experimentales desarrollados en el presente proyecto se podrán extender hacia otros organismos hiperacumuladores de metales pesados tales como plantas y hongos ayudando a comprender los mecanismos moleculares utilizados para almacenar de manera estable cationes metálicos tóxicos. En base a ésta información será posible diseñar protocolos microbiológicos y/ó de ingeniería genética para obtener cepas de E. gracilis hiperacumuladoras de Cd2+ que tengan mayor potencial biotecnológico para ser usadas en procesos de biorremediación. Por otro lado, debido a que en México no existen protocolos establecidos para biorremediar cuerpos de agua contaminados con metales pesados, la visión a mediano y largo plazo de éste proyecto es que se desarrollen líneas de investigación que generen protocolos piloto para que el protista sea usado en esquemas de tratamiento de biorremediación de agua residual contaminada con metales pesados. Si, además, esto se lograra implementar con cepas modificadas de E. gracilis con mayor capacidad de acumular metales pesados, el beneficio a la sociedad sería mayor. De esta forma el proyecto de Doctorado pretende contribuir al diseño de estrategias más eficientes y ecológicas para subsanar éste problema de contaminación ambiental. 9 3 Resumen Los PMST, la γ-ECS y la PCS fueron analizados transcripcional, cinética y metabólicamente en el protista fotosintético E. gracilis en presencia de Cd2+ para determinar su contribución al control de las vías de asimilación de azufre, y de síntesis de GSH y de PCs. El análisis cinético reveló la presencia de un PMST de alta afinidad (EgPMST1) y otro de baja afinidad (EgPMST2) , los cuales transportan SO42- acoplados al gradiente de H+, que a su vez depende (parcialmente) de la fotosíntesis y de la fosforilación oxidativa. EgPMST1 y EgPMST2 incrementaron su eficiencia catalítica 3.5 y 26 veces en células expuestas a Cd2+ y deficientes de SO42-; en contraste, la acumulación de Cys los inhibe 70%. En células deficientes de SO42- la re-incubación con 10 mM SO42- estimuló la síntesis de Cys y, a pesar de que la actividad de la γ-ECS aumentó 3.4 veces, la síntesis de γ-EC y GSH se mantuvo en niveles similares a células control. El contenido de PCs no cambió. La PCS de E. gracilis (EgPCS) mostró ser una enzima monomérica capaz de sintetizar PC2, PC3 y PC4 usando como sustratos GSH (Km GSH = 14 – 22 mM) y Zn-GS2 (Km Zn-GS2 = 1.5–2.5 µM), preferentemente. La cinética de dos componentes de ésta enzima sugiere cambios conformacionales al momento de unir alguno de los sustratos. En el dominio Nter se localizó la triada catalítica característica de las PCSs, mientras que el dominio Cter demostró ser necesario para la actividad de la enzima. La regulación transcripcional de los EgPMST1 yEgPMST2 no pudo determinarse con certeza, mientras que para la EgPCS fue nulo, por lo que la regulación de ésta última enzima depende sólo de mecanismos cinéticos (post-transcripcionales). 10 Finalmente, los EgPMST1 y EgPMST2 demostraron tener una contribución significativa en la homeóstasis de la Cys, mientras que la γ-ECS ejerció control en la síntesis de GSH, y la EgPCS sobre la síntesis de PCs. 3.1 Abstract PMST, γ-ECS and PCS contribution over the control of sulfur assimilation pathway, GSH and PCs synthesis were determined by transcriptomic, kinetic and metabolic analysis in the photosynthetic protist E. gracilis exposed to Cd2+. Two kinds of SO42- transporters were reveled by kinetic analysis, high (EgPMST1) and low (EgPMST2) affinity, which are coupled to the H+ gradient. This electrogenic transprot is partially supported by photosynthesis and oxidative phosphorylation, but not by glycolysis. The catalytic efficiency of EgPMST1 and EgPMST2 increased 3.5 and 26 times in cells exposed to Cd2+ and under sulfate deficiency. In contrast, 70% inhibition was observed in cells over-loaded with Cys. Sulfate deficient cells re-supplied with 10 mM of SO42- stimulated Cys synthesis and, despite an increased activity of γ-ECS (3.4 times), the γ-EC and GSH synthesis remained similar to control cells. The PC content did not change. The PCS from E. gracilis (EgPCS) is an enzyme able to synthesize PC2, PC3 and PC4 using GSH (Km GSH = 14 – 22 mM) and Zn-GS2 (Km Zn-GS2 = 1.5–2.5 µM) as the preferred substrates. Surprisingly, the kinetic analysis revealed two components, unexpected from a monomeric enzyme; which suggests conformational rearrangements when the enzyme binds to one substrate. On the other hand, the canonical catalytic triade of PCSs was found in the Nter domain, while the Cter domain showed to be essential for the EgPCS activity. 11 We were unable to determine the transcriptional regulation of EgPMST1 and EgPMST2, while EgPCS was null because the regulation of this enzyme only depends on kinetic mechanisms. Finally, this work demonstrates that EgPMST1 and EgPMST2 have a significant contribution to the Cys homeostasis, while the γ-ECS exerted control over GSH synthesis, and EgPCS on PC synthesis. 12 4 Introducción 4.1 Cuerpos de agua en territorio mexicano contaminados con metales pesados. La NOM-127-SSA1-1994 reglamenta las concentraciones permisibles en agua de uso y consumo humano de metales pesados esenciales como el cobre, fierro, manganeso y zinc; y de los noesenciales como el aluminio, cadmio, cromo, mercurio y plomo, así como el metaloide arsénico. Desafortunadamente en el centro y norte del país se han documentado concentraciones de estos metales por arriba de lo que establece dicha norma, lo cual está asociado principalmente a la actividad antropogénica y en menor grado a causas geológicas (Tabla 1). Tabla 1 Metales pesados en cuerpos de agua mexicanos. Valores en ppm (µg/mL o mg/L). * Indica la concentración máxima permisible en la NOM-127-SSA1-1994. Cuerpo de agua Cd, *0.005 Hg, *0.001 Cr *0.05 Pb *0.025 Zn *5 Cu *2 RSPA 8 0.13 0.11 1.28 0.25 2.5 0.44 BSCO 9 4.9 2.18 79.4 124 423 107 RTLSAT 10 0.45 3.9 RBS 11 0.64 1.1 106.9 38.5 IG 12 4 IPS 12 20 RB 12 8 400 35 120 50 IM 12 280 120 600 IT 12 300 100 300 LG 13 50,000 RSPA = Río San Pedro, Aguascalientes BSCO = Bahía de Salina Cruz, Oaxaca RTLSAT = Río Tigre, Laguna de San Andrés, Tamaulipas RBS = Río Baluarte, Sinaloa IG = Industria Galvanoplástica IPS = Industria de Polímeros Sintéticos RB = Río Blanco LG = León, Guanajuato IM = Industria Metalúrgica IT = Industria Textil Respecto al Cd2+, los estudios sobre la contaminación del Río San Pedro muestran una fuerte correlación con descargas industriales y domésticas que se vierten directamente en ese cuerpo de agua, el cual atraviesa gran parte del estado de 13 Aguascalientes 8. Sin embargo, también hay antecedentes de contaminaciones que se generan de forma indirecta, tal como la contaminación del Río Tigre, Tamaulipas, en dónde las descargas industriales y domésticas se hacen en la Laguna de San Andrés, la cual comunica por un lado con el Río Tigre y por el otro con un estuario que desemboca en el Golfo de México 10. La contaminación con Cd2+ que se reporta en la Bahía de Salina Cruz, Oaxaca, es un daño al medioambiente asociado con la planta petroquímica de PEMEX “Antonio Dovalí Jaime”, la cual entró en operaciones en 1979 y a la cual se le atribuye la contaminación de dicho cuerpo de agua con distintos derivados del petróleo, entre ellos los metales pesados 9. La salud humana también se ve afectada de forma indirecta mediante el fenómeno conocido como “biomagnificación”, definido como el proceso por el cual los animales o plantas para consumo humano acumulan metales pesados en sus tejidos a lo largo de su ciclo de vida por estar en contacto crónicamente con cuerpos de agua contaminados con metales pesados no esenciales (Tabla 2). A éste respecto, la NOM-242-SSA1-2009, que establece las especificaciones sanitarias que deben cumplir los productos de la pesca frescos, refrigerados, congelados y procesados, indica que los límites de arsénico, cadmio, metilmercurio y plomo deben ser ≤ 80, 0.5, 1, 0.5 ppm, respectivamente (Sección 7.1.8.1, NOM-242-SSA1-2009). Sin embargo, en la Tabla 2 se muestran los resultados de distintos monitoreos hechos en peces, ostras y crustáceos, en los cuales se han encontrado concentraciones de metales que sobrepasan los límites especificados en dicha norma; además se reporta la presencia de cromo en los peces Gobiesox fluviatilis y Agonostomus monticola y en el crustáceo Macrobrachium occidentale, metal que no está contemplado en la NOM-242-SSA1-2009, pero que también es extremadamente tóxico. 14 Tabla 2 Metales pesados en organismos acuáticos de lagunas costeras de Sinaloa (LCS) y el Río Baluarte, Sinaloa (RBS). Valores reportados en ppm Cuerpo de agua Organismo Cd Hg Cr Pb LCS 14 Mugil cephalus (pez) Músculo Hígado 0.17 2.03 1.63 1.43 LCS 15 Crassostrea gigas (ostra) 13.9 2.1 RBS 11 Gobiesox fluviatilis (pez) 0.06 0.06 RBS 11 Agonostomus monticola (pez) 0.06 0.06 1.65 RBS 11 Guavina guavina (pez) 0.56 RBS 11 Macrobrachium occidentale (crustáceo) 0.05 0.09 Estos antecedentes muestran que la contaminación de cuerpos de agua con metales pesados es un problema de salud vigente en México, por lo que el desarrollo de la biorremediación como una estrategia complementaria de los protocolos considerados en la NOM-127-SSA1-1994 tendría beneficios directos en la sociedad. 4.2 Organismos acuáticos con potencial para ser aplicados en la biorremediación de cuerpos de agua contaminados con metales pesados. Los protistas de vida libre son organismos acuáticos con alto potencial debido a que fisiológica y metabólicamente están adaptados a condiciones extremas de pH, temperatura, limitación de nutrientes y concentraciones altas de metales pesados esenciales y no esenciales. Los protistas que se han encontrado en mayor abundancia en cuerpos de agua provenientes del drenaje ácido de minas, ríos contaminados y descargas urbanas son Euglena gracilis, Euglena mutabilis, Drepanomonas revolute, Uronema nigricans y Euplotes sp.16,17,18,19. E. gracilis es el protista mejor caracterizado respecto a sus mecanismos de resistencia y acumulación de metales pesados (como se detalla más adelante), por lo que existe un nicho aún sin explorar de varios protistas de vida libre que podrían ser estudiados con fines de ser aplicados en la biorremediación. 15 Por otra parte, se ha evaluado una gran variedad de especies de algas para determinar su potencial en la biorremediación, y se ha encontrado que dicha capacidad está asociada principalmente al mecanismo de adsorción. De ésta forma, la microalga verde Chlamydomonas reinhardtii remueve 78 mg/g peso fresco al exponerse a 3.5 mM Cd2+ por 2 hr 3; la macroalga verde Fucus spiralis remueve 115 mg/g peso seco al exponerse a 1 mM Cd2+ por 2 hr 3; la macroalga roja Hypnea valentiae remueve 24 mg/g peso seco al exponerse a 4.4 mM Cd2+ por 5 hr 20; y la macroalga café Padina gymnospora remueve 67 mg/g peso seco al exponerse a 8 mM Cd2+ por 3 hr 21. Estos niveles de remoción son los más altos entre organismos acuáticos, y son comparables con la capacidad de remoción que tienen las resinas sintéticas como la Amberlite 200 y el Dowex50W 3. Debido a que la capacidad de remoción de las algas depende del mecanismo de adsorción, el desarrollo biotecnológico de éstos organismos se ha basado tanto en el uso de biomasa viva como de biomasa muerta. Por ejemplo, los biorreactores BIOALGA, High Rate Algal Ponds (HRAP) y el Algal Turf Scrubber (ATF) utilizan biomasa viva de S. obliquus, Chlorella, Scenedesmus y Cladophora 3, 22; mientras que el producto AlgaSORB® es fabricado con biomasa muerta de algas (no se especifica la o las especies usadas). El AlgaSORB® se ha utilizado para remover Cd2+, Hg2+, Pb2+, Cr3+, Cu2+, Ni2+ y Ag+2; mientras que la capacidad de remoción de metales del biorreactor HRAP se ha puesto a prueba frente al sistema Waste Stabilization Ponds (WSP) (el cual no utiliza algas) usando cuerpos de agua provenientes de descargas urbanas de la ciudad de Ouarzazate, Marruecos, y los cuales contienen hasta 5 mM Zn2+, 0.9 mM Cu2+ y 0.15 mM Pb2+. Los resultados muestran que ambos sistemas remueven alrededor de 91, 92 y 70 % del Zn2+, 16 Cu2+ y Pb2+, respectivamente, pero el biorreactor HRAP es 10 veces más eficiente por unidad de volumen y por día 22. La alta capacidad de adsorción de metales pesados que tienen las algas se ha asociado a las cargas negativas netas y parciales que tienen sus membranas y paredes celulares, las cuales son conferidas por los grupos carboxilo, fosfato, amino e hidroxilo del peptidoglicano (cadenas de N-acetilglucosamina y ácido β1,4-N-acetilmurámico) y distintos lipopolisacáridos 2, 23. Estas moléculas constituyen hasta el 50% del peso seco de las algas, y en el caso de las algas cafés el contenido de celulosa, alginatos y fucoidan en sus paredes celulares llega a ser hasta del 60% de su peso seco 21. Una desventaja que tiene el mecanismo de adsorción es que a pH ácidos los residuos con cargas negativas se protonan y no pueden tener interaccionesiónicas con los metales pesados. Por ésta razón, la remoción mediante el uso de algas no es eficiente a pH < 7; esto último indica que en cuerpos de agua provenientes de desechos mineros o de algún otro cuerpo de agua con pH ácido la biorremediación por adsorción con algas no sería la mejor opción. Otra desventaja es que, después del proceso de adsorción de metales, se tiene que llevar a cabo un proceso de “desorción” y “regeneración de la biomasa”, lo cual genera desechos altamente tóxicos. La “desorción” se realiza con soluciones ácidas de HCl, HNO3 y H2SO4, ácido acético y ácido cítrico; y su objetivo es liberar al metal de la biomasa del alga. La “regeneración de la biomasa” es un proceso posterior en donde se utilizan soluciones alcalinas de NaOH, sales de amonio y carbonato de sodio para que los residuos electronegativos se des-protonen y la biomasa pueda reutilizarse 2, 24, 25. 17 4.3 Mecanismos de resistencia y acumulación de metales pesados en E. gracilis. E. gracilis es un protista flagelado, fotosintético y unicelular de vida libre que habita afluentes de agua con pH desde 3 hasta 8 y con temperaturas entre 10–35ºC, y que resiste los cambios osmóticos que se generan en ríos y lagos. Tiene gran flexibilidad metabólica ya que puede obtener energía de la fotosíntesis (cloroplastos) así como también de la fosforilación oxidativa (mitocondrias) utilizando una amplia variedad de fuentes de carbono, y de la glicólisis. Se ha documentado que E. gracilis puede remover con alta eficiencia metales pesados no-esenciales como Cd2+, Cr6+, Hg2+ y Pb2+, y esenciales como el Zn2+ y el Cu2+; cabe resaltar el hecho de que estos hallazgos se han documentado en un intervalo de concentraciones entre 1-20 ppm 5, intervalo en el cual las metodologías reportadas en la NOM-127SSA1-1994 son poco eficientes. Contrario a lo que sucede en algas, la capacidad de remover metales pesados en E. gracilis no está asociada a la adsorción, pues utiliza mecanismos de biotransformación, unión extracelular, quelación intracelular y compartimentación (Fig. 1). Sin embargo, tomando en cuenta los fines biotecnológicos que se han planteado en este proyecto de Doctorado, es conveniente enfatizar que algunos mecanismos le proveen más ventajas que otros para considerarlo un organismo biorremediador. La biotransformación es un mecanismo de resistencia que utiliza E. gracilis para reducir intracelularmente el Hg2+ a Hg0 (el cual es volátil) y el Cr6+ a Cr3+ (éste último también extracelularmente) 26, 27. En el caso de la reducción intracelular del Cr6+ se ha propuesto la participación de una enzima citosólica con actividad de cromato reductasa (Fig. 1), la cual puede usar ascorbato como donador de electrones y sobre-expresarse durante exposiciones crónicas a Cr6+ y Cr3+ 28. Por otro lado no se ha caracterizado a una 18 Figura 1. Mecanismos de resistencia y acumulación de Cd2+, Cr6+ y Hg2+ en E. gracilis. La figura resume información generada por distintos autores (detallada en el texto) sobre los mecanismos de resistencia y acumulación (letras rojas), así como de las vías metabólicas y los principales metabolitos involucrados. La vía de asimilación de azufre y el metabolismo de GSH y fitoquelatinas (PCs) se detalla en la Fig. 2. Los signos (?) indican a los transportadores o enzimas que no han sido caracterizados pero que existe evidencia experimental de su actividad. Mitocondria* Cd2+% ***Transportadores! de cationes ! divalentes ! esenciales! Cd2+% Cd2+% Cd2+% Cd2+% Cd2+% ***! ***! Cd2+* Cd2+* Quelación! Cd.HMWC* S2-, Cys, ! GSH y PCs! Cd.LMWC* Quelación! 3 H+ (?)! SO42-! Transportadores! de SO42-! SO42-! Cys! Asimilación de azúfre ! y metabolismo de Cys! GSH! PCs! Cd2+* Cd.LMWC* Transportadores! Cd-LMWC (cloro)(?)! (Compartimentación)! Hg2+* Hg0* Hg0* Volatilización! (?) Mercurio ! reductasacito! Hg2+* Metabolismo del GSH y PCs! ***! CrO42.* 3 H+ (?)! CrO42.* CrO42.* Transportadores! de SO42- (cloro)(?)! Cromato ! reductasacito! CrO42.* CrO42.* (?) Cromato ! reductasamembranal! Cr3+* Cr3+* Ascorbato! DHA! Cr3+* (?)%Cd2+* CrO42.* MALATOMitocondrial! Metabolismo ! citosólico ! del malato! Transportador! de malato! MALATOMitocondrial! MALATOCitosólico! Cr*Cr* Cr3+% Quelación ! extracelular! Adsorción!Cr * 19 enzima responsable de la reducción extracelular del Cr6+, sin embargo se ha observado que éste mecanismo disminuye la acumulación del metal y aumenta la disponibilidad de Cr3+ en el medio de cultivo 27. En el caso de la reducción del Hg2+ tampoco se ha propuesto una enzima responsable (Fig. 1). Sin embargo, a pesar de que la biotransformación es un mecanismo benéfico para que E. gracilis pueda resistir exposiciones a Cr6+ y Hg2+, estos antecedentes sugieren que la permanencia de Cr3+ en el cuerpo de agua y la volatilización del Hg0 no son formas ecológicamente viables para biorremediar un cuerpo de agua. La quelación es otro mecanismo de resistencia descrito en E. gracilis que consiste en la inactivación de los metales pesados mediante la formación de enlaces coordinados con metabolitos con carga negativa neta o que tienen la capacidad de compartir electrones. Este mecanismo tiene una gran relevancia bioquímica y metabólica debido a que la síntesis de los metabolitos quelantes involucra respuestas transcripcionales y cinéticas para que se activen sus vías de síntesis. En E. gracilis expuesta a Cr6+ y Cr3+ se ha descrito un mecanismo de quelación extracelular mediado por el aumento de 3 veces en la velocidad de expulsión del malato y el aumento intracelular de la actividad de la malato sintasa y la malato deshidrogenasa 28 (Fig. 1). Desafortunadamente, no se ha evaluado la eficiencia del mecanismo de quelación extracelular para remover metales pesados de cuerpos de agua, tal vez porque los complejos metal pesado-malato son solubles y, por tanto, no pueden precipitarse, y removerse. Cómo se mencionó en la Justificación del proyecto de Doctorado, la quelación intracelular es uno de los mecanismos principales que le permite a E. gracilis resistir y acumular Cd2+ (Fig. 1). Para ello, participan como metabolitos quelantes el S2-, la Cys, el GSH y las PCs, entre otros. El contenido de Cys, GSH y PCs en células control (no 20 expuestas a Cd2+) de E. gracilis es 5, 7 y >1 nmol/1x107cél, respectivamente; sin embargo, durante una exposición a 200 µM Cd2+ se observa que a partir del tercer día se promueve la síntesis de Cys a 45 nmol/1x107cél, de GSH a 63 nmol/1x107cél y de PCs a 25 nmol/1x107cél, lo cual representa un aumento de 6, 8 y más de 25 veces en Cys, GSH y PCs, respectivamente, en referencia al contenido de éstos tioles en células control. Estos cambios metabólicos le permiten al protista acumular 194 nmol/1x107cél de Cd2+ (0.48 % del peso seco del protista) en 3 días 29. A tiempos más largos, los contenidos intracelulares de Cys, GSH y PCs no presentan diferencias estadísticamente significativas, aunque la acumulación de Cd2+ aumenta hasta 249 nmol Cd/1x107cél (0.62% del peso seco) después de 8 días de exposición. Lo que si sucede en este tiempo de exposición es una re-distribución intracelular tanto de las PCs como del Cd2+, ya que a los 3 días de exposición la mayor parte de las PCs y Cd2+ se encuentran en el citosol, pero al octavo día el 78% de las PCs y el 68% del Cd2+ se localiza en los cloroplastos 29. A este fenómeno de re-distribución intracelular se le ha definido como mecanismo de compartimentación del Cd2+. La compartimentación del Cd2+ se caracterizó inicialmente en las vacuolas de la levadura Schizosaccharomyces pombe, y actualmente muchos trabajos se han desarrollado en las vacuolas de Arabidopsis thaliana. En éstos modelos se ha demostrado cualitativamente que diferentes familias de transportadores tipo ABC (por ejemplo:Hmt1 y Abc1-4 en S. pombe y ABBC1 y ABCC2 en A. thaliana) son los responsables de compartimentar a los complejos PC-Cd 30. Tomando en cuenta que una de las funciones de la vacuola es almacenar productos celulares de desecho, hace sentido pensar que la compartimentación de Cd2+ se lleve a cabo en ese organelo. Por el contrario, se generan muchas preguntas acerca de por qué en E. gracilis la 21 compartimentación ocurre en los cloroplastos, los cuales son organelos generadores de energía y de intermediarios metabólicos esenciales (Fig. 1). A esto se suma el hecho de que los estudios pioneros para demostrar la compartimentación en E. gracilis se hicieron en la cepa blanqueada (células sin cloroplastos), en donde se demostró que el 63% del Cd2+ acumulado en la célula se encontraba en la mitocondria 6. Dentro de los cloroplastos de E. gracilis el Cd2+ se compartimenta en forma de complejos de alto peso molecular (HMWCs, por sus siglas en inglés) (Fig. 1), constituido por PCs, S2-, GSH, γ-EC y algunos aminoácidos como el aspártico 7. Se ha propuesto que la participación de las PCs es de gran importancia en éste mecanismo de resistencia ya que las mutantes de S. pombe sin el gen de la pcs son más sensibles al estrés por Cd2+ 31. En la mitocondria aún no se ha determinado si el Cd2+ se acumula en forma de HMWCs. Estos antecedentes muestran que los mecanismos de remoción de metales pesados más eficientes, y ecológicamente viables, en E. gracilis son la quelación intracelular y la compartimentación subcelular (almacenamiento intracelular). Estos mecanismos le permiten al protista acumular Cd2+ a niveles tan altos que lo identifican como un organismo hiperacumulador de Cd2+, según la clasificación de Bhargava et al en 2012 (organismo hiperacumulador de Cd2+ ≥ 0.01% del peso seco)32. Por otro lado, el citrato también aumenta de 20–40% en la cepa blanqueada (sin cloroplastos) de E. gracilis expuesta a Cd2+. Sin embargo, este aumento solo representa una cuarta parte de lo que aumentan las PCs en respuesta al Cd2+ 6, y no sería suficiente por si solo para neutralizar al Cd2+ acumulado. No se ha determinado la contribución que los polifosfatos (poliP) puedan tener en los mecanismos de resistencia y acumulación a Cd2+, aunque se han relacionado con la homeostasis de metales divalentes esenciales como Ca2+, Mg2+ y Mn2+. Plantas 22 transgénicas de tabaco sobre-expresan la polifosfato cinasa (ppk) 33 e incrementan sus niveles de poliP cuando se exponen al Cd2+. El avance en la caracterización de los acidocalcisomas en distintos organismos (incluidos los Trypanosomátidos filogenéticamente cercanos a Euglenophyta), abre la posibilidad de que en E. gracilis la compartimentación subcelular de metales pesados se pueda llevar a cabo en estos organelos ricos en pirofosfato y poliP 34; sin embargo estos estudios se encuentran en proceso. 4.4 Vía de asimilación de azufre, síntesis de GSH y de PCs en E. gracilis. El funcionamiento de los mecanismos de quelación y compartimentación para inactivar al Cd2+ en E. gracilis depende, en gran medida, de las vías de asimilación de azufre, y de síntesis de GSH y PCs; por lo tanto, a continuación se presenta la información que se conoce al respecto en este protista. La vía de asimilación de azufre inicia con el transporte de sulfato (SO42-) catalizado por transportadores de SO42- de la membrana plasmática (PMST), los cuales son dependientes de energía (ATP) porque están acoplados al co-transporte, y consumo, de 3 protones (H+) para contrarrestar las 2 cargas negativas del SO42- (proceso electrogénico) 35; el gradiente de H+ a través de la membrana plasmática (exterior ácido) lo genera la actividad de la ATPasa de H+ con una estequiometría de 1 ATP hidrolizado por cada H+ expulsado. En E. gracilis no se ha caracterizado la contribución que tienen la fotosíntesis, la fosforilación oxidativa y la glucólisis al aporte de ATP requerido para el transporte de SO42-; de hecho, éste tipo de estudios sólo se han descrito en las algas verdes Chlamydomonas reinhardtii y Chlorella ellipsoidea 36, 37. En éstos modelos se observó que el transporte se inhibe con m-clorocarbonilcianuro fenilhidrazona (CCCP, por sus siglas en 23 Inglés) (un protonóforo) y con nigericina (un intercambiador K+/H+), los cuales disipan el gradiente de H+ de la membrana plasmática necesario para la actividad de los PMSTs y también disipan el gradiente de H+ de mitocondrias y cloroplastos necesario para la síntesis de ATP. Los ionóforos valinomicina y gramicidina que transportan K+ (y, con menor afinidad, Na+) también inhiben el transporte de sulfato, en cuyo caso al colapsar los gradientes de K+ disipan el potencial eléctrico de las membranas (Δψ) mitocondrial y cloroplastídica afectando la síntesis de ATP 38. Por otro lado, la incubación con DCMU (inhibidor del fotosistema II por unión al sitio de la plastoquinona) afecta al transporte de SO42-en un 16% 36, 37, mientras que el inhibidor mitocondrial KCN (inhibidor de la citocromo c oxidasa de la cadena respiratoria) lo disminuye 96% 37. Estos datos sugieren que el transporte de SO42- depende principalmente del aporte de ATP de la fosforilación oxidativa. A nivel cinético, los estudios hechos en plantas, algas y levaduras establecen que hay dos tipos de PMSTs dependiendo de la afinidad por el SO42-. Aquellos que tienen KmSO42- < 100 µM se definen como de alta afinidad (HAST, por sus siglas en Inglés) y los de KmSO42- > 100 µM de baja afinidad (LAST, por sus siglas en Inglés) 39. En E. gracilis sólo se ha reportado un componente con Km SO42- = 0.9 mM 27 (Fig. 2), sin embargo no se ha profundizado en la identificación de isoformas HAST y LAST. Una vez que el SO42- se encuentra en el citosol es reducido a sulfito (SO32-) y luego a sulfuro (S2-) para que éste último sea transferido a la O-acetilserina y de esta manera el protista pueda sintetizar Cys. La primera reacción de la vía es la activación del SO42-, para lo cual se le transfiere un grupo adenosin–fosfato (AMP) proveniente de una molécula de ATP, formándose el intermediario de alta energía AMP-sulfato (APS) y liberándose al medio pirofosfato (PPi). Esta reacción la cataliza la ATP sulfurilasa (ATPS) 39. 24 Posteriormente el APS es reducido a sulfito (SO32-) por la APS reductasa (APSR) con gasto de GSH (como donador de electrones) y finalmente el SO32- es reducido a S2- por la sulfito reductasa (SiR). La SiR en plantas toma como cofactor a la ferredoxina debido a su localización en el cloroplasto, aunque en E. gracilis se ha propuesto que utiliza al NADPH (como sucede en procariontes y levaduras) por su localización en la mitocondria (Fig. 2) 39, 40. La posible localización de la SiR en la mitocondria en E. gracilis sugiere que su actividad puede estar limitada por la disponibilidad de NADPH, puesto que las principales enzimas productoras de éste piridín nucleótido (glucosa 6-fosfato Figura 2. Vías de asimilación de azufre y de síntesis de GSH y PCs en E. gracilis. Las enzimas se señalan en los cuadros azules. Para la SiR, OAS-TL y el transportador mitocondrial de Cys el signo ? indica que no hay información en E. gracilis. Las esferas en la membrana interna mitocondrial y en la del cloroplasto indican transportadores del metabolito señalado y los signos ? también indican falta de información al respecto. 25 deshidrogenasa, la enzima málica y la isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP+) se localizan en el citosol como en plantas y en mamíferos, aunque para las dos últimas enzimas podrían existir isoformas mitocondriales. Finalmente el S2- es transferido a la O- acetilserina por la O-acetilserina tiol liasa (OAS-TL) para formar Cys y liberar acetato dentro de la matriz mitocondrial 41 (Fig. 2) como se ha reportado para plantas, aunque la OAS-TLtambién se ha localizado en el citosol y en los cloroplastos 39. En E. gracilis se ha reportado que la ATPS 42 y la APSR 43 se encuentran adosadas a la membrana interna mitocondrial pero con el sitio catalítico dirigido hacia el espacio intermembranal (Fig.2). En el caso de la SiR y de la OAS-TL no se ha reportado su localización subcelular, pero se sugiere que ambas enzimas se ubican en el citosol y la matriz mitocondrial, porque se ha observado la síntesis de novo de Cys en mitocondrias sin membrana externa alimentadas sólo con SO42- 41. Contrario a lo que sucede en plantas y algas, en E. gracilis no hay síntesis de Cys en los cloroplastos 41, 44; sin embargo, se debe tener en cuenta que hay otros procesos que pueden consumir SO42- en este organelo, tal como la síntesis de sulfolípidos (abundantes en membranas de cloroplastos) 45. Éstas ramificaciones alternativas del SO42- no se han evaluado hasta el momento. Respecto al consumo de Cys en E. gracilis, hay tres vías metabólicas que dependen de éste metabolito: 1) síntesis de metionina; 2) síntesis de proteínas y 3) síntesis de GSH (Fig. 2). En éste protista no se ha determinado cual de las tres vías consume más Cys ni la velocidad a la que lo hacen, aunque variables como la fase del ciclo celular y agentes estresantes deben repercutir en ello. En la síntesis de GSH, el consumo de Cys lo cataliza la γ-ECS, quien también usa al ácido glutámico (Glu) y ATP como sustratos para sintetizar γ-EC. Después la γ-EC, la 26 glicina (Gly) y el ATP son sustratos de la glutatión sintetasa (GS) para obtener GSH (Fig. 1). Por otro lado, la glutatión reductasa (GR) reduce al glutatión oxidado (GSSG) con gasto de NADPH, y de esta forma la GR contribuye a mantener las pozas de GSH 39. El GSH puede ser consumido por diferentes isoformas de la glutatión-S- transferasas (GSTs) y por la glutatión peroxidasa (GPx) (Fig. 2); sin embargo, ante un estrés por Cd2+ también es consumido por la fitoquelatina sintasa (PCS) 46, que lo usa como sustrato para sintetizar fitoquelatinas (PCs) de distinta longitud 39. La estructura de las PCs se puede sintetizar con la fórmula (Glu-Cys)n-Gly; en dónde n ≥ 2. En el caso de n = 2 se representa a la PC2, la cual es sintetizada a partir de dos moléculas de GSH, una de las cuales pierde su Gly como parte del mecanismo cinético de la PCS (ver mas adelante). En la naturaleza, las PCs más frecuentemente reportadas son la PC2, PC3, PC4, PC5 y PC6, mientras que en E. gracilis se ha medido a la PC2, PC3 y PC4, aunque se han observado otras PCs a las cuales no se ha podido determinar con precisión su identidad química. En el alga roja Cyanidioschyzon merolae, en C. reinhardtii, en la levadura Schizosaccharomyces pombe y en los nematodos Schistosoma manosni y Caenorhabditis elegans se sintetizan PC2–PC4 47, 48, 49, 50, 51, mientras que en plantas se han detectado PC2–PC6 52. Por otro lado, no se ha establecido una correlación que indique que la síntesis de PC5 y PC6 le confiera a las plantas una mayor resistencia y capacidad de acumular metales pesados. La reacción catalizada por la PCS requiere de otro sustrato además del GSH, el bis- glutationato de metal (Me-GS2). Esto significa que en el caso de una exposición con Cd2+ el segundo sustrato es el bis-glutationato de cadmio (Cd-GS2) y en exposiciones con Zn2+ se forma el bis-glutationato de zinc (Zn-GS2) 52 (Fig. 2). Como se muestra en la Tabla 3, el Cd2+ es el metal con el que las PCSs de distintos organismos (desde plantas hasta 27 algas rojas) tienen mayor actividad; no obstante se sugiere que otros metales como Ag+, As3+, As5+, Cu2+, Pb2+, Zn2+ y Hg2+ también pueden formar el sustrato Me-GS2. En las referencias que se consultaron para construir la Tabla 3 no se encontró que las PCSs tuvieran actividad en presencia de Cr6+ y Cr3+, lo cual correlaciona con que la quelación Tabla 3 Orden de metales y metaloides que favorecen la actividad de la PCS de distintos organismos. Organismo Metales y metaloides A. thaliana 52 Cd2+> Hg2+> As3+> Cu2+> Zn2+> Pb2+ > Mg2+> Ni2+> Co2+ Silene cucubalus (planta herbácea) 53 Cd2+> Ag+> Bi3+> Pb2+> Zn2+> Cu2+> Hg2+> Au3+ Lycopersicon esculentum (planta del tomate) 54 Cd2+> Ag+> Cu2+> Au+> Zn2+> Fe2+> Hg2+ = Pb2+ C. merolae (alga roja) 49 Cd2+> Pb2+> As5+> As3+> Ag+> Cu2+> Hg2+ S. pombe 47 Cd2+> Cu2+> Pb2+> Zn2+> Ag+> Hg2+ intracelular no sea el principal mecanismo de resistencia que utilizan los organismo, incluida E. gracilis, cuando está expuestos a cromo. El mecanismo cinético de la PCS no se ha dilucidado por completo. Se sabe que la enzima toma una molécula de GSH e hidroliza el enlace peptídico entre la Cys y la Gly para formar un residuo γ-EC que se queda unido a la enzima (intermediario enzima acilada), mientras la Gly se libera al medio. En el cristal del dominio aminoterminal (Nter) de la PCS de Nostoc sp. se pudo confirmar que la Cys-70, la His-183 y el Asp-201 participan en esta reacción 55. Sin embargo, no se sabe cuál es el sitio de unión del sustrato Me-GS2 en dónde se lleva a cabo la transferencia del residuo γ-EC del intermediario enzima acilada a una de las moléculas de glutatión del Me-GS2 para sintetizar PC2 56. Además de ésta incógnita existen otras aún sin entender en la síntesis 28 de PC3, PC4, etc.; la principal de ellas es acerca de la naturaleza del segundo sustrato que se necesita para sintetizar éstas PCs de cadena más larga, ya que el Me-GS2 ya no podría serlo. Como se puede ver, el mecanismo de quelación intracelular de Cd2+ depende del funcionamiento de los transportadores y enzimas de las vías de asimilación de azufre, y de síntesis de GSH y PCs, en dónde todo comienza con el transporte de SO42- por los PMST y termina con la síntesis de PCs por la PCS. Aún no se ha caracterizado el transporte de PCs, Cd-PC, GSH y/ó Cd-GS2 en los cloroplastos y mitocondrias de E. gracilis (Fig. 2). Ésta información sería de gran valor para ampliar el conocimiento de los mecanismos de resistencia y acumulación de Cd2+ en éste protista. Lo único que se ha reportado en cloroplastos aislados de E. gracilis es el transporte de Cd2+libre (Km Cd2+ = 13 µM y Vmax = 11.3 nmol (min x mgproteína)-1) 57 (Fig.2); sin embargo, su contribución al control de la síntesis de PCs podría ser muy bajo en la célula tomando en cuenta que en presencia de GSH la concentración de Cd2+libre es del orden fentomolar, por lo que no se alcanzaría los valores de la Km Cd2+ 52 de la PCS (en el orden micromolar). 4.5 Los PMSTs, la γ-ECS y la PCS son etapas controladoras de la síntesis de GSH y PCs en algas, levaduras y plantas. A la fecha no se ha efectuado en ningún organismo el análisis de control metabólico de las enzimas y los transportadores involucrados en la síntesis de PCs desde la vía de asimilación de azufre hasta la propia síntesis de PCs, aunque si se han estudiado éstas vías por separado utilizando distintos enfoques. 29 La regulación de la vía de asimilación de azufre se ha analizado enfocándose solo en la ATPS y la APSR en raíces de A. thaliana incubadas con distintas concentraciones de Cys, GSH, Cys + L-Butionina-S Sulfoximina (BSO; inhibidor de la γ-ECS) y Cys + BSO + GSH 58. La disminución de la expresión, el contenido de proteína y la actividad de la APSR es la principal consecuencia de las incubaciones con Cys y GSH, lo cual correlaciona con la acumulación de éstos tioles. Por el contrario, en la incubación con Cys + BSO no hay ningún efecto sobre la APSR, ni aumento en GSH; pero al adicionar GSH (Cys + BSO + GSH) se vuelve a observar la inhibición de la APSR. Al parecer, el aumento en el nivel de γ-EC y/o de GSH regula negativamente la expresión genética, el contenido de proteína y la actividad de la APSR. Por otro lado, el transporte de SO42- medido con SO42- radioactivo (35SO42-)sin y con GSH añadido, demostró que el transporte de SO42- y el flujo hacia la síntesis de ambos tioles (medido como incorporación de 35S en Cys y GSH) disminuyen debido a la presencia del GSH. Por lo tanto, se ha sugerido que el GSH es uno de los principales metabolitos intermediarios que regula a la vía de asimilación de azufre mediante el desencadenamiento de eventos transcripcionales y cinéticos sobre los PMSTs y la APSR 58, a lo cual habría que añadir la retro-inhibición (inhibición de una enzima por un metabolito “downstream” de la vía) sobre la γ-ECS. La regulación de la síntesis de GSH y PCs se ha analizado en plantas y levaduras mediante la construcción de un modelo matemático con el software GEPASI, basado en la información experimental disponible en la literatura sobre parámetros (Vmax, constantes de afinidad -Km- para sus respectivos ligandos y Keq) y ecuaciones cinéticas para las reacciones catalizadas por la γ-ECS, la GS, las GSTs y la PCS. La contribución del transporte de PCs hacia la vacuola se evaluó considerando sólo una Keq debido a la falta 30 de información al respecto 46. El modelo matemático predijo que en condiciones sin estrés por metales pesados, las enzimas con mayor grado de control sobre la síntesis de GSH eran la γ-ECS (enzima del bloque productor) y las GSTs (enzima del bloque consumidor); la contribución de la PCS se descartó de éste primer análisis puesto que su actividad es nula en la ausencia de metales pesados. Sin embargo, en presencia de un estrés por Cd2+ el modelo predice que el bloque productor de PCs sigue bajo el control ejercido por la γ-ECS (debido a la baja actividad de esta enzima dentro de la célula y a su inhibición feedback por GSH), mientras que en el bloque consumidor pierden control las GSTs y lo gana la PCS 46. El transporte de PCs a la vacuola no tuvo una contribución importante al control de la vía, sin embargo esto se debe re-evaluar cuando se tenga mayor información cinética sobre éste proceso. En E. gracilis no se han elaborado estudios como los previamente descritos en plantas. Por lo tanto, con el objetivo de fundamentar la hipótesis del presente proyecto se construyó la Tabla 4 con la información disponible sobre la cantidad de enzima activa en células vivas (Vmax) y las Km de los transportadores y las enzimas de las vías de asimilación de azufre, y de síntesis de GSH y PCs en E. gracilis. La tabla se complementó con información publicada en algas, hongos y plantas. Se puede observar que las actividades de los PMSTs y la PCS son hasta 1 orden de magnitud más lentas que las demás enzimas, además de que tienen las Km más altas (es decir, son las proteínas con las afinidades más bajas por sus sustratos); en el caso de los PMSTs lo anterior aplica principalmente para los LAST. Por lo tanto, en base al análisis de la arquitectura de la vía metabólica y de los parámetros cinéticos es posible sugerir como etapas cuellos de botella (parámetro cualitativo para referirse a un transportador o enzima con alto grado de control) 59 a los PMSTs y la PCS, y a que su 31 relativa baja capacidad catalítica (Vmax/Km) puede estar frenando el flujo hacia la síntesis de PCs (Fig. 2). Tabal 4 Actividades de las enzimas de las vías de asimilación de azufre, y de síntesis de GSH y PCS de protistas, levaduras y plantas. Actividad reportada en nmol (min x mgproteína)-1 y Km en mM. * Actividad referida a proteína celular mientras que para el resto de las actividades se considera proteína citosólica (la cual se enriquece usualmente de 3 a 10 veces); por lo tanto los valores sin el asterisco disminuirían al hacer la corrección para referir todas las actividades sólo a la proteína celular. Enzima Actividad Constantes de afinidad Organismo PMST 27, 60 *0.0004 - 0.08 Km SO42- (LAST) = 0.41-0.9 Km SO42- (HAST)= 0.0036 E. gracilis; A. thaliana ATPS 42, 61, 62 700 - 2,300 Km SO42-= 0.002 - 0.85 Km ATP= 0.046 – 0.19 E. gracilis; Penicillium chrysogenum; Soya; Espinaca APSR 63, 64, 65, 66 0.5 - 70 Km APS= 0.011 – 0.017 Km GSH= 0.49 – 1.15 A. thaliana; Soya; Populus tremula; Lemna minor SiR 67, 68, 69 580 (Brassica rapa) Km SO32-= 0.008 – 0.2 Km Fx= 0.002 – 0.01 KmNADPH= 0.08 B. rapa; C. merolae; E. coli O-ASTL 70, 71, 72,73 149 - 590 Km O-AS-= 0.31 – 2.9 Km S2-= 0.9 – 6.4 C. reinhardtii; Potato; Brasica juncea; A. thaliana γ-ECS 74, 75, 76 2 - 2.6 Km Glu= 0.13 – 10.4 Km Cys= 0.19 – 0.69 Km ATP= 0.03 – 0.07 Ki GSH= 1 – 1.6 Nicotiana tabacum; Tripanosoma brucei; Tripanosoma cruzi GS 76, 77, 78 1.1 – 8.6 Kmγ-EC= 0.04 – 0.27 Km Gly= 0.67 – 1.51 Km ATP= 0.03 – 0.45 S. pombe; A. thaliana; T. cruzi PCS 52, 53 0.058 (S. cucubalus) Km GSH= 6.7 – 13.6 KmCd-GS2= 0.009 KmZn-GS2= 0.004 S. cucubalus; A. thaliana Después de la PCS, la APSR, la γ-ECS y la GS son las enzimas más lentas y, en contraste, la ATPS, la SiR y la OSTL son las enzimas más rápidas, aunque los valores de Km por los sustratos de la APSR, la γ-ECS y la GS no muestran diferencias muy grandes. Sin embargo, la fuerte inhibición tipo feedback del GSH sobre la γ-ECS es un mecanismo 32 de regulación que limita la actividad de ésta enzima y por lo tanto también puede ser considerada como otro cuello de botella. Este análisis semi-cuantitativo en E. gracilis tiene correlación con los trabajos teóricos reportados en plantas. El presente proyecto busca avanzar en la descripción experimental de los mecanismos de regulación de las vías de asimilación de azufre, y de síntesis de GSH y PCs en el protista hiperacumulador de Cd2+ E. gracilis, para poder entender el funcionamiento de los mecanismos de quelación intracelular y compartimentación. 33 5 Hipótesis La vía de asimilación de azufre, síntesis de glutatión y fitoquelatinas están controlados principalmente por los transportadores de sulfato, la γ-glutamilcisteína sintetasa y la fitoquelatina sintasa en E. gracilis fotosintética expuesta a Cd2+. 6 Objetivo general Determinar la contribución de los transportadores de sulfato, la γ-glutamilcisteína sintetasa y la fitoquelatina sintasa al control de la vía de asimilación de azufre, síntesis de GSH y fitoquelatinas en E.gracilis fotosintética sujeta a estrés por Cd2+. 6.1 Objetivos particulares a) Caracterizar los eventos transcripcionales y cinéticos que regulan la actividad de los transportadores de sulfato, la γ-glutamilcisteína sintetasa y la fitoquelatina sintasa en E. gracilis expuestas a Cd2+. b) Determinar la concentración de metabolitos intermediarios de las vías de asimilación de azufre, síntesis de glutatión y fitoquelatinas en células expuestas a Cd2+. c) Caracterizar transcripcional y cinéticamente a la fitoquelatina sintasa de E. gracilis (EgPCS). 34 7 Resultados 7.1 Contribución de los PMSTs y la γ-ECS al control de las vías de asimilación de azufre y de síntesis de GSH y PCs en E. gracilis cultivada con Cd2+, o con deficiencia de sulfato, o con sobrecarga de Cys. Mecanismos de regulación transcripcionales y cinéticos. El proyecto inició con la caracterización a nivel transcripcional, cinético y bioenergético de los PMSTs de E. garcilis (EgPMST) en células no expuestas a Cd2+, debido a que no existía en la literatura suficiente información que pudiera servir como plataforma para discutir una respuesta atribuida al Cd2+. Por lo tanto, se diseñó un esquema experimental en el que se determinaran éstos parámetros en E. gracilis cultivada bajo un estrés por deficiencia de sulfato e incubada con una sobrecarga de Cys, y en paralelo se describió el fenómeno de la exposición a Cd2+. Este diseño experimental también permitió estudiar a la γ- ECS y a la PCS. Las células deficientes de SO42- se originaron usando como primer inoculo células control (cultivadas en presencia de 2.1 mM SO42-),las cuales se cultivaron en deficiencia de SO42- (0.06 mM SO42-). A partir de las primeras 5 generaciones (5 días) se observó que en la fase estacionaria la densidad celular era menor respecto a las células control, y fue hasta después de 10 Figura 3. Crecimiento de E. gracilis de células cultivadas bajo deficiencia de SO42- por 5 (〇), 10 (▲) y >10 (▽) generaciones; y células cultivadas en condiciones control con suficiencia de sulfato (■). La cinética de crecimiento se determinó por conteo de E. gracilis inmovilizadas con 0.05% HCl usando un hemocitómetro. n = 3. 35 generaciones que la cinética de crecimiento se mantuvo constante (Fig. 3). Las células cultivadas en deficiencia de SO42- por más de 10 generaciones se utilizaron en la caracterización de los EgPMSTs reportada en García-García et al, 2012 79 (ver Publicación 1 más adelante). Un resultado que no se mostró en la Publicación 1 79 es el perfil de pH de la actividad de los EgPMSTs, lo cual se hizo usando una solución amortiguadora compuesta de 100 mM KH2PO4 y 20 mM Na-acetato ajustada a diferentes valores de pH (Fig. 4). El perfil de pH muestra que la máxima actividad de los PMSTs se alcanza a pH = 2, lo cual puede ser una condición muy extrema para levaduras, algas y plantas, pero para E. gracilis es una condición que puede ser cercana a lo fisiológico, tomando en cuenta el pH ácido de los cuerpos de agua en dónde se ha encontrado(pH < 5) y que su medio de cultivo está ajustado a pH = 3.5. Por otro lado, en la Publicación 1 se describió que los EgPMSTs están acoplados al gradiente de H+ de la membrana plasmática; por lo tanto, el perfil observado en la Fig. 4 también podría estar asociado a que a pH 2 hay mayor disponibilidad de H+, y aunque a pH 1 es aún mayor, ya resulta tóxico para la célula. En la Publicación 1 tampoco se mostraron los trazos de dónde se calculó la velocidad de expulsión de H+ de la membrana plasmática (H+ efflux) asociada al transporte de SO42- (Fig. 5). Cabe señalar que si bien el objetivo de ésta serie de experimentos era demostrar que el transporte de SO42- está acoplado al consumo de H+, no se determinó Figura 4. Transporte de 9 mM 35K2SO4 en células control de E. gracilis a diferente pH. n = 3. 36 directamente la velocidad de consumo de H+ (H+ influx) por dos razones: 1) porque la clorofila interfiere con la señal de las sondas fluorescentes (tales como el BCECF) que miden cambios de pH intracelulares, y 2) la velocidad de H+ efflux es mucho más fácil de determinar que la H+ influx, por lo tanto las mediciones son más certeras y reproducibles. Cabe recordar que en un estado estacionario las concentraciones de los intermediarios permanecen constantes ([H+]) porqué las velocidades de producción (H+ efflux) y consumo (H+ influx) son iguales. Al perturbar un sistema en estado estacionario (con la adición de -OH), este trata de re-establecer el estado inicial mediante el aumento en la velocidad de expulsión de H+. La presencia de sulfato disminuyó la velocidad del H+ efflux en dichas condiciones, porque su entrada consume H+. Entonces, la diferencia en la Figura 5. Trazos representativos para mostrar (A) la sensibilidad del sistema y la determinación del H+ efflux. (A) El sistema se estabilizó en un pH = 7.23 (marcado con flecha gris), se adicionó 0.8 µmol de NaOH (-OH) y después 0.8 µmol de HCl (+H); si el sistema regresaba al pH inicial se consideraba adecuado para continuar el experimento. En la determinación del H+ efflux se adicionaron las células (5-15 x 106cél) y se permitió que se estabilizara el sistema, se alcalinizaba -OH y la pendiente (líneas rojas) de la acidificación inicial se consideraba el H+ efflux basal (B). En una nueva preparación se volvía a realizar el procedimiento anterior pero con la adición de 2 (C) y hasta 10 mM (D) SO42-. 37 velocidad de salida de H+ entre sin y con sulfato revela la velocidad del transporte de sulfato acoplado al co-transporte de H+. El sistema constaba de un electrodo de pH conectado a un potenciómetro de alta sensibilidad (Orion Research, Boston, MA, USA) y éste a su vez a un graficador. El medio de reacción fue una solución amortiguadora con solo KH2PO4 1 mM ajustada a pH 7.2, ya que concentraciones más altas de buffer amortiguaban por completo los cambios de pH debidos al transporte de SO42- que se querían detectar. La sensibilidad del sistema se comprobó haciendo adiciones secuenciales de 0.8 µmol de NaOH y 0.8 µmol HCl como se detalla en la Fig. 5A. Una vez optimizado el sistema, se calculó el H+ efflux usando dos preparaciones celulares: una sin SO42- y otra con SO42- (diferentes concentraciones). En ambas muestras se calculó el H+ efflux tomando en cuenta la velocidad inicial de acidificación del medio, sólo que en la primer muestra el H+ efflux medido se consideró el basal (Fig. 5B) y en la segunda muestra el H+ efflux basal plus el adjudicado al transporte de SO42-(Fig. 5 C y D); por lo tanto, la diferencia entre ellas representó el H+ influx acoplado a los EgPMSTs. Por otro lado, en el presente proyecto no se analizó el contenido de proteína debido a que no existen anticuerpos para los EgPMSTs, así como tampoco para la γ-ECS, GS y PCS de E. gracilis, y generarlos implicaba dedicar tiempo del proyecto de doctorado que comprometía el cumplimiento de los objetivos particulares restantes. Sin embargo, se analizó la expresión transcripcional utilizando RNA aislado de E. gracilis control (cultivada en suficiencia de SO42- y sin exposición a Cd2+), de células cultivadas en deficiencia de SO42- y de células expuesta a Cd2+ (Fig. 6 A), con el cual se sintetizó cDNA. 38 En la base de datos http://tbestdb.bmc.umontreal.ca, donde están publicados una serie de Expression Sequence Tags (ESTs) de E. gracilis, se identificaron a los EST2960 y el EST2822, quienes mostraron similitudes con los transportadores de SO42- de otros organismos. Estos ESTs se utilizaron para diseñar primers y evaluar, mediante reacciones de PCR con el cDNA previamente sintetizado, si ésta información era Figura 6. (A) Integridad del RNATotal de células crecidas en condiciones control, en deficiencia de sulfato y expuestas a 50 µM Cd2+. (B) Productos de la reacción de PCR realizada usando cDNA sintetizado a partir del RNATotal de células control y primers diseñados en base a los EST2960 (451 pb) y 2822.(526 pb). Los controles negativos de la reacción se hicieron usando RNATotal. Figura 7. Ensayo de restricción de los productos de PCR mostrados en la Fig. 6 clonados en el plásmido TOPO2.1. El ensayo se hizo incubando 3 clonas de cada EST con EcoR1. Debido a que ambos ESTs no tienen sitios EcoR1, mientras que el plásmido sí tiene dos sitios que flanquean a los insertos, la predicción era obtener a los ESTs completos (para el EST2822 un producto de 526 pb y para el EST2960 de 451 pb) y el plásmido abierto (4Kb). Las tres clonas evaluadas del EST2822 (1 -3) fueron positivas; mientras que para el EST2960 sólo dos lo fueron (4 y 6). 39 reproducible en la cepa de E. gracilis que se utilizó en este proyecto. Los resultados mostraron los productos esperados (Fig. 6, B); y tanto la secuenciación como los ensayos de restricción (Fig. 7) lo confirmaron. Por lo tanto, el EST2960 y el EST2822 fueron usados para evaluarla expresión de PMSTs putativos en células deficientes de SO42- y expuestas a Cd2+; estos resultados se reportaron en la Publicación 1. A continuación se muestran los resultados que cubren el primer y segundo objetivo del presente proyecto de doctorado, el cual se publicó en el 2012 en la revista Biochimica et Biophysica Acta-General Subjects (Factor de impacto 2014 = 3.829). El título de la Publicación 1) es: “Sulfate uptake in photosynthetic Euglena gracilis. Mechanisms of regulation and contribution to cysteinehomeostasis” 79. 40 7.2 Resumen de los principales hallazgos, significado y avance al conocimiento de la Publicación 1. La publicación fue de gran relevancia para los objetivos del presente proyecto de doctorado; la cual aportó información relevante a diferentes niveles del conocimiento: 1) Se demostró que en E. gracilis el transporte de SO42- acoplado al gradiente de H+ puede ser soportado tanto por el metabolismo energético de las mitocondrias como por el de los cloroplastos. 2) Se demostró que el protista tiene HAST y LAST, los cuales incrementan su actividad cuando las células se cultivan bajo una deficiencia de sulfato o se exponen al Cd2+, y la disminuyen ante una sobrecarga de Cys. 3) Los transportadores de SO42- ejercen control sobre la homeostasis de la Cys, pero no sobre la del GSH y PCs, en cuyo caso la γ-ECS y la PCS tienen una mayor contribución. 4) A pesar de que las células deficientes de sulfato y expuesta a Cd2+ tienen una mayor cantidad de enzima activa de γ-ECS, la inhibición feedback del GSH sigue regulando fuertemente a esta enzima clave. El hecho de que en ésta Publicación 1 se abarcaran aspectos transcripcionales, bioenergéticos, cinéticos y metabólicos en un organismo distinto a algas y plantas, contribuye al entendimiento de la fisiología celular de organismos de vida libre que como en el caso de E. gracilis tienen potencial biotecnológico, sobretodo integrando tres tipos de estreses en un solo estudio: deficiencia de sulfato, exposición a Cd2+ y sobrecarga de Cys. 41 Author's personal copy Sulfate uptake in photosynthetic Euglena gracilis. Mechanisms of regulation and contribution to cysteine homeostasis Jorge Donato García-García a, Viridiana Olin-Sandoval a, Emma Saavedra a, Lourdes Girard b, Georgina Hernández b, Rafael Moreno-Sánchez a,⁎ a Departamento de Bioquímica, Instituto Nacional de Cardiología, México D.F. 14080, México b Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de México, Ap. Postal 565-A, 62210, Cuernavaca, Morelos, México a b s t r a c ta r t i c l e i n f o Article history: Received 6 October 2011 Received in revised form 9 May 2012 Accepted 10 May 2012 Available online 18 May 2012 Keywords: Sulfate uptake kinetics Sulfate uptake regulation Sulfate deficiency Cadmium stress Cys accumulation Background: Sulfate uptake was analyzed in photosynthetic Euglena gracilis grown in sulfate sufficient or sul- fate deficient media, or under Cd2+ exposure or Cys overload, to determine its regulatory mechanisms and contribution to Cys homeostasis. Results: In control and sulfate deficient or Cd2+-stressed cells, one high affinity and two low affinity sulfate transporters were revealed, which were partially inhibited by photophosphorylation and oxidative phos- phorylation inhibitors and ionophores, as well as by chromate and molybdate; H+ efflux also diminished in presence of sulfate. In both sulfate deficient and Cd2+-exposed cells, the activity of the sulfate transporters was significantly increased. However, the content of thiol-metabolites was lower in sulfate-deficient cells, and higher in Cd2+-exposed cells, in comparison to control cells. In cells incubated with external Cys, sulfate uptake was strongly inhibited correlating with 5-times increased intracellular Cys. Re-supply of sulfate to sul- fate deficient cells increased the Cys, γ-glutamylcysteine and GSH pools, and to Cys-overloaded cells resulted in the consumption of previously accumulated Cys. In contrast, in Cd2+ exposed cells none of the already elevated thiol-metabolites changed. Conclusions: (i) Sulfate transport is an energy-dependent process; (ii) sulfate transporters are over-expressed under sulfate deficiency or Cd2+ stress and their activity can be inhibited by high internal Cys; and (iii) sulfate uptake exerts homeostatic control of the Cys pool. © 2012 Elsevier B.V. All rights reserved. 1. Introduction The sulfur assimilation pathway synthesizes Cys, which is a precur- sor for methionine, glutathione (GSH) and protein syntheses [1]. Plas- ma membrane sulfate transporters (PMSTs) catalyze the first reaction in the pathway. The PMSTs are classified by their substrate affinity in high affinity sulfate transporters (HAST) with Km valuesb100 μM, and low affinity sulfate transporters (LAST) with Km values>100 μM [1]. Under sulfate deficiency, HASTs are over-expressed in the green algae Chlamydomonas reinhardtii [2] and Chlorella ellipsoidea [3] and in plant roots from Stylosantes hamata [4], Hordeum vulgare [5], Zea mays [6], and Arabidopsis thaliana [7], whereas LASTs in A. thaliana xylem and other sulfate transporters localized in root and leaf vacu- oles are also expressed under such conditions [8–10]. In addition to transcription regulation by the sulfur status, transcriptional and kinet- ic modulation of the PMSTs by some sulfur assimilation pathway me- tabolites and thiol metabolites has been described. High GSH or Cys seem to exert a dual effect on PMSTs, ATP sulfurylase and APS reduc- tase, by decreasing their gene transcription and inhibiting their activ- ities [11–14]. Heavy metal stress also affects PMSTs expression; for instance, Cd2+ exposure induces in a few hours significant PMSTs in- creased expression in Z. mays [6,15] and A. thaliana roots [16]. These data, which are mostly described for plants, suggest that the sulfate transport reaction, together with ATP sulfurylase and APS reductase, are involved in the homeostasis of thiol-metabolites [12–14,17,18]. However, in other organisms of promising biotechnological relevance, this knowledge is scarce. The free-living fresh water protist Euglena gracilis is a unicellular, flagellated microorganism able to endure stressful environmental conditions such as acidic heavy-metal polluted streams and water bodies derived from mining and urban areas [19–22]. In this protist the mechanisms that confer resistance to heavy metals and which also allow for their intracellular ion accumulation include increased synthesis of chelating molecules with thiol (Cys, GSH, PCs) and Biochimica et Biophysica Acta 1820 (2012) 1567–1575 Abbreviations: APS, adenosine 5´-phosphosulfate; EST, expressed sequence tags; γ-EC, γ-glutamylcysteine; γ-ECS, γ-glutamylcysteine synthetase; GSH, glutathione; GS, glutathione synthetase; HAST, high affinity sulfate transporters; LAST, low affinity sulfate transporters; PMSTs, plasma membrane sulfate transporters; PCs, phytochelatins ⁎ Corresponding author at: Instituto Nacional de Cardiología, Departamento de Bio- química, Juan Badiano No. 1, Sección XVI, Tlalpan, México D.F. 14080, Mexico. Tel.: +52 55 5573 2911. E-mail addresses: rafael.moreno@cardiologia.org.mx, morenosanchez@hotmail.com (R. Moreno-Sánchez). 0304-4165/$ – see front matter © 2012 Elsevier B.V. All rights reserved. doi:10.1016/j.bbagen.2012.05.002 Contents lists available at SciVerse ScienceDirect Biochimica et Biophysica Acta j ourna l homepage: www.e lsev ie r .com/ locate /bbagen 42 Author's personal copy carboxylate groups (malate, citrate) and their sub-cellular compart- mentalization into chloroplasts andmitochondria [1,23–29]. In contrast to yeast (cytosol), green algae and plants (plastids), sulfate reduction in E. gracilis is localized in mitochondria [30]. The sulfate transport reaction was recently characterized in pho- tosynthetic E. gracilis [29]. It displayed a Km SO42− of 0.9 mM and com- petitive inhibition by CrO42- with a Ki of 0.7 mM, suggesting that the E. gracilis PMST belongs to the LAST family. Information on other E. gracilis sulfate transporter isoforms, and their regulatory mecha- nisms, has not been yet generated, although the presence of two expressed sequence tags (ESTs) with sequence similarity to LAST were annotated in the E. gracilis EST databank [31]. Therefore, the main objective of the present study was to characterize the E. gracilis PMST by analyzing its possible mechanisms of regulation under a varietyof conditions, i.e. sulfate deficiency, Cd2+ stress and Cys over- load, as well as to analyze the transcriptional profile of the annotated sulfate transporter ESTs under these conditions. In parallel, variation patterns of key thiol-metabolites were examined to explore the role of the PMST in the homeostatic control of Cys and GSH syntheses. 2. Materials and methods 2.1. Growth conditions Axenic cultures of Euglena gracilis Klebs (a Z-like strain) were grown in acidic (initial pH 3.5) Hutner medium [32], as modified by Schiff et al. [33]: 34 mM glutamic acid, 15 mM malic acid, 2 mM CaCO3, 3 mM KH2PO4, 1.5 mM (NH4)2HPO4, 2 mM Mg2SO4.7H2O, 0.01 mMH3BO3, 0.1 mM Na2MoO4.2H2O, 2×10−4 mM Na2VO4.16H2O, 0.03 mM Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O, 0.02 mM FeCl3, 0.02 mM ZnSO4.7H2O, 0.01 mM MnSO4.4H2O, 7 × 10−3 mM CoCl2.6H2O, 3 × 10−3 mM CuSO4.5H2O and vitamins (3 × 10−3 mM thiamine and 0.2 μg L−1 cyanocobalamin). This growth medium contained a total sulfate con- centration of 2.093 mM and was used for control, sulfate sufficient cultures of E. gracilis (E. gracilisControl). For E. gracilis grown under sulfate deficient conditions (E. gracilisS deficient), the growth mediumwas mod- ified by replacing MgSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O and MnSO4.4H2O with 2 mM MgCl2, 0.02 mM ZnCl2 and 0.01 mM MnCl2, respectively, giving a final sulfate concentration of 0.063 mM. Cell aliquots from cultures of 5 days (at the end of the exponential growth) were used to initiate E. gracilisControl and E. gracilisS deficient cultures at a density of 0.2×106 cells mL−1. Cd2+ stress was generated by incubating cells with 15 or 50 μM CdCl2 (E. gracilisCd2+) for 5 days in control medium. The CdCl2 stock was calibrated by atomic absorption spectrophotometry, sterilized by filtration through a 0.22 μm pore diameter sterile cellulose esters membranes (Millipore, Bedford, MA, USA), and added to the culture medium before the cellular inoculum. For Cys overload experiments, cells were grown in control medium for 5 days, harvested by centrifugation at 1,464 g for 1 min at 4 °C, and washed once with K-phosphate buffer (0.1 M KH2PO4, pH 7.2). Then, the cellular pellet was re-suspended in K-phosphate buffer at a density of 2–3×107 cells mL−1 and incubated with 10 mM of Cys for 3 h (E. gracilisCys). The L-Cys hydrochloride (Sigma, Japan) stock solu- tion was freshly prepared for each experiment and calibrated by reacting with 0.1 mM 5,5′-dithiobis (2-nitro-benzoic acid) (DTNB) and determining the absorbance at 412 nm, using the extinction coef- ficient for thiol groups of 13600 M−1 cm−1 [34]. The general culture conditions for E. gracilisControl, E. gracilisS deficient and E. gracilisCd2+ included cycles of 12 h white light (70 μmol quanta m−2 s−1) and 12 h darkness at 20–25 °C. The incubation conditions for E. gracilisCys were light at 70 μmol quanta m−2 s−1 and orbital agitation at 150 rpm and 20–25 °C. Cell growth and viability was determined by counting HCl-immobilized cells with a hemocytometer and incubating with 0.05% (w/v) trypan blue for 2 min at 25 °C, respectively. 2.2. Sulfate uptake The cells were harvested and washed by centrifugation for 1 min at 1,464 g and 4 °C with K-phosphate buffer, except for E. gracilisCys which were washed twice. The cellular pellet was re-suspended in K-phosphate buffer and stored on ice at a density of 0.6–3.4×109 cells mL−1. Thereafter, the cells were incubated for 2 to 10 min at 25 °C under orbital shaking of 150 rpm. Then, cellular aliquots to reach a density of 1×107 cells mL−1 were further incubated at 25 °C with different K235SO4 (8.3–141.66 Bq nmol−1; American Radiolabeled Chemicals, St. Louis, MO, USA) concentrations (0.1 to 50 mM) in K-phosphate buffer. Aliquots of 0.4 mL were withdrawn after 15, 30, 45, 60, 90 and/or 120 min, filtered through polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes of 0.65 μm pore diameter (Millipore, Cork, Ireland) and immediately washed with 20 mL of ice-cold K-phosphate buffer supplemented with 50 or 250 mM K2SO4 for 0.1–2.5 or 3–50 mM K235SO4 experiments, respectively. The filters were counted for radio- activity (Beckman Coulter LS 6500, USA) after immersion in 5–6 mL of a scintillation liquid (tritosol) that contained 0.25% (w/v) 2,5- diphenyloxazole (Sigma, St. Louis, MO, USA), 0.005% (w/v) 1,4-bis- (2-methylstyryl)-benzene (New England Nuclear, Boston, MA, USA), 32% (v/v) Triton X-100, and 10% (v/v) ethanol in toluene. Filters receiving comparable isotopic loads and washing treatment, but with- out cells, were used as controls. The uptake rate was linear for up to 2 h when [K235SO42−]≤1 mM or for up to 0.5 h when [K235SO42−]≥ 1 mM (data not shown). Due to the relatively high rates of sulfate transport in E. gracilisS deficient, the experiments were carried out at 15 °C for only 1 min (sampling every 15 s) and using 0.5 to 10 mM K235SO4; under these conditions the uptake rates were linear and reproducible. Sulfate uptake activity in E. gracilisControl was not detected at 15 °C. E. gracilisControl cells were used to evaluate the effect of some in- hibitors on sulfate uptake. Cellular suspensions of 1×107 cells mL−1 were incubated for 2 min at 25 °C and 150 rpm orbital shaking, then inhibitors were added and the mixture further incubated for 10 min. Thereafter, 2 mMK235SO4was added. Aliquots of 0.4 mLwerewithdrawn 30min later and the incorporated radioactivity was measured as de- scribed above. Inhibitors used were 10 μM m-chlorophenylhydrazone (CCCP), 20 μM nigericin sodium (Sigma, St. Louis, MO, USA), 10 μM gramicidin D (ICN, Cleveland, OH, USA), 2 mM Na3VO4 (Sigma, India), 50 μM 3-(3,4-dichloro-phenyl)-1,1-dimethyl-urea (DCMU) (Sigma, England), 10 μM rotenone, 1 mM KCN (JT Baker, Phillipsburg, NY, USA), 1 mM NaCN, 10 μM oligomycin, 2 mM K2CrO4 (JT Baker), 2 mM Na2MoO4.H2O (Aldrich, Milwaukee, WI, USA). 2.3. Determination of photosynthesis and respiration To determine the rates of photosynthesis and respiration, the cells were harvested by centrifuging for 1 min at 1464g and 4 °C and washed with KME buffer which contained 120 mM KCl, 20 mM 3- (N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS), 1 mM ethyleneglycol- bis(aminoethyl ether)-N,N′-tetraacetic acid (EGTA) (Sigma, St. Louis, MO, USA), pH 7.2. The cells were re-suspended in KME buffer and stored on ice until use. A cell aliquot to give a density of 1–2×107 cells mL−1 was added to the oxymeter chamber that contained KME buffer at 25 °C and was placed in a dark box. After an initial pre-incubation in the dark for 2 to 5 min, photosynthesis was activated by irradiating a white light beam (10,000 μquanta m−2 s−1) to the cellular suspension; then the rate of O2 production was determined with a Clark-type O2 electrode. In turn, the rate of O2 consumption was determined after light was turned off. The photosynthesis/respiration cycle was repeated once. 2.4. Determination of cellular H+ efflux The cells were harvested, washed, re-suspended in 1 mM KH2PO4 plus 100 mMKCl pH 7.2 (K-buffer) and stored on ice until use. Changes 1568 J.D. García-García et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1820 (2012) 1567–1575 43 Author's personal copy in [H+] were detected with a semi-micro gel Ag/AgCl pH electrode (Corning) connected to a digital pH/millivolt meter 611, log R compen- sation potentiometer (Orion Research; Boston,MA, USA) and a recorder (Kipp&Zonen, Holland). After allowing an initial pH stabilization period of the K-buffer under constant agitation at room temperature, a cell aliquot of 1×107 cells mL−1, plus 2 or 10 mM sulfate, inhibitors and ap- proximately 800 nmol NaOH to reach a pH of 7.75–8.15 were consecu- tively added in that order. The medium acidification was followed for about 10 min (reaching a pH of 7.3–7.5) and the initial slope after NaOH addition was taken for calculation of the H+ efflux rate. The compounds used were 10–20 μM CCCP, 10–20 μM nigericin, 50 μM DCMU, 10 μM rotenone, 5 μM stigmatellin, 10 μM oligomycin and 2 mM chromate. Previous to each assay, pH changes were calibrated with 800 nmol NaOH
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