Deteccion-de-ADN-de-toxocara-canis-en-sangre-de-conejos-infectados-experimentalmente

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Universidad Nacional 
Autónoma de México 
Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán 
 
Detección de ADN de Toxocara canis en 
sangre de conejos infectados 
experimentalmente 
 
 
 
T E S I S 
Que para obtener el título de: 
Médico Veterinario Zootecnista 
 
 
Presenta: 
Francisco Rosales Chanes 
 
Asesor: Dr. Fernando Alba Hurtado 
Coasesor: Dr. Marco Antonio Muñoz Guzmán 
 
 
 
Cuautitlán Izcalli, Edo. de México. 2015 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN 
UNIDAD DE ADMINISTRACIÓN ESCOLAR 
DEPARTAMENTO DE EXÁMENES PROFESIONALES 
Vm VEI\'IDAD l'iAc:,IONAI. 
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ASUNTO:!'VOTO-A>PROBATORIO AVJOJioMA DE 
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M. en C. JORGE ALFREDO CUÉLLAR ORDAZ 
DffiECTOR DE LA FES CUAUTITLAN 
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PRESENTE i::r'J ¡r;:', ,lo' 
ATN: M. en A. ISMAEL HE~~i\l~EZMAURICIO 
J efe del Dell.!I,r:tamento de Exámenes 
Profesi~~~~e~~~~ la FE~ S~antitlán. 
Con base en el Reglamento General de Exámenes, y la Dirección de la Facultad, nos permitimos 
comunicar a usted que revisamos La Tesis: 
Detección de ADN de Toxocara canis en sangre de conejos infectados experimentalmente 
Que presenta el pasante: FRANCISCO P.OSALES CHANES 
Con número da cuenta: 40801887-8 para obtener el Titulo de: Médico Veterinario Zootecnista 
Considerando que dicho trabajo reúne los requisitos necesarios para ser discutido en el EXAMEN PROFESIONAL 
correspondiente, otorgamos nuestro VOTO APROBATORIO_ 
ATENTAMENTE 
"POR MI RAZA HABLARA EL ESpjRITU" 
Cuautitlán Izcalli, Méx_ a 12 de marzo de 2015. 
PROFESORES QUE INTEGRAN EL JURADO 
NOMBRE 
PRESIDENTE M. en C. Juan Pablo Martinez l ab.1 
VOCAL Dr. Fernando Alba Hurtado 
FIRil1A 
SECRETARIO Oc. Miguel Allgel Co.::.rn",ei,,-o ::;Co"'rt::::és'--__________ -+--¡I'7"'-'1é\mv-"-
l e,' SUPLENTE M.V.Z. Melilón Laro Rocha ~------------------
2do SUPLENTE M.V.Z. Eloisa Chino Rosario -------------------
NOTA: Los sinodales suplentes están obligados a presentarse el dia y hora del Examen Profesional (art. 127). 
En caso de que algún miembro del jurado no pueda asistir al exame,¡ profesiona l deberá dar aviso por anticipado al departamento. 
(M 127 REPI 
HrlA/Vc 
 
DEDICATORIA 
 
A todos aquellos que fueron, son y serán parte de lo mejor de mí, porque los 
quiero mucho, y sé ustedes me quieren con la misma intensidad. 
 
 
A mi madre, Yolanda Chanes Zamora 
 
Por darme la vida, por abrigarme, por protegerme, por educarme, por todo 
tu amor incondicional; tu fuerza, y tu amor me han sabido dirigir por la 
vida y me han dado las armas que necesito. Quisiera compensarte por todo 
lo que me has dado hasta ahora, pero no existe en el universo algo tan 
inmensamente valioso que se le compare. Me siento orgulloso de ser tu 
único hijo, Te quiero Yulis, 
 
 
A mi padre, Francisco Rosales González 
 
Por el apoyo que me has brindado, no sólo en la escuela, sino en la vida; por 
los momentos en los que convivimos, que a pesar de ser breves, he 
aprendido con tu ejemplo a ser un hombre trabajador, honesto y honrado. 
Te quiero papá. 
 
 
A mi abuela, Cira Zamora Arcos (QEPD) 
 
Por tu infinito amor incondicional, por ser una segunda madre, por ser 
una mujer fuerte, inteligente y protectora que nos amó a sus hijos y nietos 
a pesar de todo y nos mantuvo unidos. Te admiro y te quiero, nos haces 
mucha fala. 
 
 
A mi amada familia Chanes Zamora 
Mis tíos Fernando, Noé, Silvia, Rosalía, José Luis, Paty, Norma, 
Aurora y Paulo. 
 Mis primos Reyna, Mayra, Ulises, José Luis, Cintia, Dulce y mi 
sobrina Adeneri. 
 
Porque somos una gran familia unida, ustedes me han guiado, me han 
enseñado, he compartido momentos especiales, felices y tristes y no nos 
hemos dejado vencer ante las adversidades. Este trabajo también es de 
ustedes. 
 
 
 
A mis muy queridas amigas y colegas 
Aidee, Lucy, Lupita, Damaris, Marylu, Lety, Angie, Laura y 
Katy. 
 
Quienes conocí alguna vez en un salón o laboratorio de la facultad y desde 
ese día volvernos inseparables para estudiar, jugar, bromear, echar relajo 
y sobre todo aprender de otras especies. Las quiero. 
 
 
A mi amiga Rosy y la familia León Barragán. 
Que a pesar de la gran distancia geográfica que nos separa, seguimos 
siendo los mejores amigos. Los quiero. 
 
 
A Robbin Isaac, Cinder Grisita, Eevangeline Manuela III, Sandy y 
Rayito 
Anubis, Bruno, Manuela I, Bastet, Goro, Mijari, Pechán, Goldy 
 
Y a todos los seres que no hablan humano, pero les pude comprender con el 
lenguaje del alma. Ellos me inspiraron para elegir, iniciar, continuar y 
terminar esta preciosa carrera. Va por ustedes, mascotas queridas. 
 
 
Francisco Rosales Chanes 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Quiero dominar el mundo. Cada vez que alcanzo la cima de un pico 
descubro otro al que quiero subir. Es como si no pudiera parar. Quizá 
debería descansar y admirar el paisaje, pero no puedo. Tengo que seguir. 
¿Por qué? No lo sé” 
Madonna 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
A la omnipotente fuerza creadora y transformadora 
 
A la Universidad Nacional Autónoma de México y a mi querida 
Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán. 
 
A mi familia y todos mis amigos. 
 
A los doctores Fernando Alba Hurtado y Marco Antonio Muñoz 
Guzmán, por asesorarme y guiarme en la realización de esta tesis. 
 
A Iván Pérez Luna, quien me enseñó las técnicas útiles para 
desarrollar y concluir este trabajo. 
 
A mis compañeros y amigos del laboratorio 1, Lucy, Aidee, Mario y 
Lorena, etcétera. 
 
Al técnico académico M. en C. Cesar Cuenca Verde, por el apoyo 
técnico brindado a este trabajo. 
 
A los médicos Roberto y Estela, por integrarme en el equipo de 
trabajo de La Huella, con Isaac y Coco, y dejar que adquiriera 
experiencia. 
 
A los conejos. 
 
Este trabajo fue financiado por el Programa de Apoyo a Proyectos 
de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), proyectos IN-
215314 e IN-216913 de la UNAMAS 
 
I 
 
ÍNDICE 
ÍNDICE………………………………………………………………………………………I 
 
ÍNDICE DE FIGURAS……………………………………………………………………III 
 
RESUMEN…………………………………………………………………………………1 
 
INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………….2 
 
 MORFOLOGÍA…………………………………………………………………….2
 
CICLO BIOLÓGICO……………………………………………………………….3 
 
EPIDEMIOLOGÍA………………………………………………………………..5 
 
 PATOGENIA……………………………………………………………………….5 
 
 SEMIOLOGÍA…………………………………………………………………..….6 
 
 TOXOCARIOSIS EN HUMANOS………………………………………………..6 
 
 DIAGNÓSTICO DE LA TOXOCARIOSIS………………………………………8 
 
JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………..……………..12 
 
HIPÓTESIS……………………………………………………………………………….13 
 
OBJETIVOS………………………………………………………………………………14 
 
MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………………….15 
 
 LUGAR DE RALIZACIÓN……………………………………………………….15 
 
 ANIMALES EXPERIMENTALES……………………………………………….15 
 
 OBTENCIÓN DE GUSANOS ADULTOS DE T. canis……………………..15 
 
 OBTENCIÓN Y CULTIVO DE HUEVOS DE T. canis……………………...15 
 
 DISEÑO EXPERIMENTAL……………………………………………………...16 
 
 MONITOREO DE INFECCIÓN…………………………………………………16 
 
MODIFICACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE KNOTT 
PARA LA CONCENTRACIÓN DE LARVAS DE T. canis DE LA SANGRE 
……………………………………………………………………………………..17 
II 
 
 
 EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO (ADNg)………………………………..17 
 
 ESTANDARIZACIÓN DE LA PCR……………………………………………..18 
 
RESULTADOS…………………………………………………………………………...19 
 
DISCUSIÓN………………………………………………………………………………24CONCLUSIÓN……………………………………………………………………………27 
 
BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………..28 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
III 
 
ÍNDICE DE CUADROS Y FIGURAS 
Cuadro 1: Nombre y secuencia de los iniciadores utilizados para la amplificación 
del fragmento ITS-2 de Toxocara canis……………………………………………18 
FIGURA 1: Ciclo biológico de Toxocara canis…………………………………………4 
FIGURA 2: Lesiones hemorrágicas observadas en el día 20 pos-infección en 
pulmones de conejos infectados con 5000 huevos larvados de Toxocara 
canis……………………………………………………………………………………….20 
FIGURA 3: Promedio (±DS) del número de larvas recuperadas en los sedimentos 
de las muestras de sangre obtenidos por la técnica de Knott modificada 
…………………………...………………………………………………………………...21 
FIGURA 4: Amplificación por PCR del fragmento ITS-2 de Toxocara canis a partir 
de ADN extraido de sedimentos obtenidos por técnica modificada de Knott con 
diferentes concentraciones larvarias…………………………………………………..22 
 
FIGURA 5: Amplificación por PCR del fragmento ITS-2 de Toxocara canis a partir 
de muestras (negativas) de sangre (procesadas por técnica modificada de Knott) 
de conejos infectados experimentalmente con T. canis……………………………..23 
 
1 
 
RESUMEN 
 
El objetivo del presente estudio fue estandarizar una técnica para la concentración 
de larvas de T. canis presentes en sangre para su detección molecular en 
conejos infectados con el parásito. Se Infectaron 35 conejos Nueva Zelanda con 
huevos larvados de T. canis y se sacrificaron grupos de cinco a diferentes 
tiempos post-infección, 3, 5 10, 20, 30 y 60 días, se tomaron muestras de pulmón 
e hígado y se realizaron digestiones artificiales para la búsqueda de larvas, 
además se observaron las lesiones macroscópicas en los órganos más afectados. 
La sangre obtenida fue procesada por una técnica de Knott modificada para 
evaluar la concentración de larvas de T. canis. De los concentrados obtenidos se 
extrajo el ADN total para la realización de la PCR. La infección con T. canis 
produjo lesiones hemorrágicas en pulmones e hígado de los conejos infectados. 
Las muestras de pulmón e hígado de todos los conejos infectados fueron positivos 
a la presencia de larvas de T. canis en la digestión artificial. Durante la 
estandarización de la técnica de Knott modificada se logró la sedimentación y el 
conteo de larvas de T. canis a partir de sangre de conejos con 100, 50, 25 y 10 
larvas/mL. Los cebadores YY1/NC2 amplificaron los productos esperados (330 pb) 
de las muestras de 100, 50 y 25 larvas/mL así como de gusanos adultos y larvas 
de T. canis, sin embargo, no se obtuvieron amplificados positivos en ninguna 
muestra de sangre obtenida de los conejos infectados. Estos resultados mostraron 
la eficiencia de la modificación de la técnica de Knott para la recuperación de 
larvas de T. canis en muestras de sangre sin alterar el DNA del parásito para su 
detección molecular. La falta de detección molecular del parásito en las muestras 
de sangre de los conejos infectados posiblemente fue debido a una baja 
concentración larvaria en las muestras, menos de 25 larvas/mL. 
 
 
2 
 
INTRODUCCIÓN 
 
La Toxocariosis es una enfermedad parasitaria causada por la presencia y acción 
del nematodo Toxocara canis, caracterizada por disturbios entéricos en el 
hospedador definitivo, así como los síndromes de Larva migrans visceral (LMV), 
Larva migrans ocular (LMO) y toxocariosis encubierta en hospedadores 
paraténicos, principalmente el humano, provocados por la segunda fase del 
estado larvario del parásito (Quiroz, 2003). 
Es una de las más importantes enfermedades parasitarias de perros y otros 
cánidos ya que su distribución geográfica es cosmopolita; en México es el 
helminto más común (Alba-Hurtado y Muñoz-Guzmán, 2011). Las infecciones 
masivas por T. canis provocan molestias abdominales intensas en los cachorros 
lactantes, pues los vermes se enmarañan formando nudos, provocando la muerte 
por ruptura u obstrucción del intestino. El aspecto de mayor importancia es su 
carácter zoonótico, la infección en el humano es por la ingestión de huevos 
embrionados infectantes. Los niños pequeños están especialmente expuestos 
cuando juegan con tierra contaminada o cuando tienen contacto corporal estrecho 
con perros que llevan adheridos a su pelaje huevos infectantes de Toxocara 
(Overgaauw, 1997). 
Morfología 
 
T. canis es un ascárido que se encuentra en el duodeno de cánidos jóvenes 
durante sus primeros tres meses de vida. Tiene coloración blanquecina, los 
machos adultos miden de 4 a 10 cm y las hembras hasta 18 cm de longitud, 
presenta tres labios en el extremo anterior y un bulbo esofágico glandular 
localizado en la unión del esófago e intestino, posee aletas cervicales que le dan 
aspecto de punta de flecha. Una hembra puede producir hasta 200,000 huevos al 
día, éstos son esféricos, oscuros, de superficie irregular, de 75 a 90 micrómetros 
(Alba-Hurtado y Muñoz-Guzmán, 2011; Beck, 2010). 
3 
 
Ciclo biológico 
 
El ciclo de T. canis es complejo y varía dependiendo de la edad del hospedador 
definitivo y de la posible intervención de hospedadores paraténicos. Inicia con la 
eliminación de huevos en el excremento de cachorros parasitados que bajo 
condiciones óptimas de humedad, temperatura y oxígeno, desarrolla la larva 2 (L2) 
pasiva, la cual es la fase infectante. La infección ocurre cuando los perros, los 
humanos u otros hospedadores susceptibles ingieren huevos larvados, la eclosión 
de las L2 es en el duodeno, ahí la larva atraviesa la pared intestinal (Schacher, 
1957, Webster 1958b). 
En los cachorros menores de tres meses, las larvas pasan por vía linfática o 
sanguínea, a nodos linfáticos o al hígado, continúan hacia corazón y pulmones, la 
mayoría pasa por bronquios, tráquea y faringe y es deglutida (Webster, 1958b). La 
muda para el tercer estado larvario es en pulmón, tráquea y esófago. En el 
intestino se realiza la siguiente muda, que da a lugar a la cuarta larva, que crece 
hasta convertirse en adulto, copula y de 4 a 5 semanas después los huevos son 
eliminados en las heces (Webster, 1958a). 
En perros adultos y hospedadores paraténicos, las larvas que llegan a los 
pulmones regresan al corazón y se distribuyen a través de la circulación 
sanguínea (migración somática), llegando principalmente al músculo estriado, 
hígado, pulmones, riñones y cerebro donde permanecen en estado de hipobiosis 
como larvas somáticas infectantes por años, hasta que mueren o se calcifican. En 
el humano, siendo hospedador paraténico, la migración somática incluye la 
circulación de larvas por el torrente sanguíneo (Alba-Hurtado y Muñoz-Guzmán, 
2011). 
En las perras, las larvas somáticas hipobióticas que puedan estar presentes en 
sus tejidos, se reactivan y movilizan hacia la placenta y glándula mamaria, 
produciéndose de esta forma la infección intrauterina de los cachorros, 
produciendo infecciones perinatales y ocasionando que la perra se re-infecte con 
la materia fecal de sus cachorros, cuando estos nacen, debido a los hábitos de 
4 
 
limpieza. En la perra lactante, la eliminación de larvas por calostro y leche se inicia 
inmediatamente después del parto. Los cachorros continuamente se reinfectan 
con las larvas a través de la ingestión de calostro y leche, este modo de infección 
no implica migración compleja, pues las larvas se desarrollan directamente hasta 
adultos en el intestino (Lloyd et al., 1983). 
 
5 
 
Epidemiología 
 
La toxocariosis es una de las helmintiasis intestinales más frecuentes de perros 
en el mundo y con alta prevalencia, por lo que la mayoría de los perros cachorros 
recién nacidos están infestados con Toxocara canis (Cordero et al., 1999; Quiroz, 
2003). La contaminación se debe a los perros callejeros o caseros que al salir a la 
calle y defecar, contaminan un área determinada con huevos o estadios larvarios 
de parásitos. Los parques públicosque tienen un acceso sin control de los perros 
y los gatos son la fuente importante de infección para humanos. Especialmente los 
niños menores de 5 años de edad, por sus hábitos de juego, se llevan tierra a la 
boca de manera accidental, esto aunado a la presencia de cachorros y el contacto 
estrecho con ellos, puede llevar a la ingesta de miles de huevos. Otra razón por la 
que la prevalencia de T. canis sea tan alta, es su alto poder biótico (200,000 
huevos por hembra por día), si se considera que un cachorro puede albergar 
varias decenas de parásitos, el medio en el que vive puede quedar contaminado 
con millones de huevos (Dada et al.,1979; Stewart et al., 1986; Esparza-Lozano, 
2004). 
Patogenia 
 
En los cachorros, las fases adultas en el intestino se alimentan de contenido 
intestinal por lo que compiten con el hospedador por los nutrientes y dependiendo 
del número pueden producir diferentes grados de desnutrición; también provocan 
irritación en la luz intestinal, que genera tanto la disminución en la absorción de 
nutrientes, así como diarrea y vómito en algunos cachorros. Además ejercen una 
acción mecánica en el intestino que obstruye el flujo normal de este órgano. 
En los hospedadores paraténicos y accidentales como el humano, la migración 
larvaria tiene un efecto traumático sobre los órganos y tejidos por los cuales estas 
larvas transitan, principalmente se afectan el hígado, pulmón, riñón, músculo y 
cerebro. La presencia de la larva produce ruptura de capilares y alveolos en 
6 
 
pulmones, acción expoliatriz hematófaga, histófaga y de líquidos tisulares, acción 
mecánica por obstrucción de vasos capilares sanguíneos y linfáticos, y un efecto 
proinflamatorio dado principalmente por los antígenos de excreción-secreción de 
la larva de T. canis (AgESTc), caracterizado por formación de granulomas con 
inflitrado eosinofílico que además contiene neutrófilos, linfocitos, histocitos 
epiteloides y células gigantes (Quiroz, 2003). 
Semiología 
 
Los cachorros con infecciones moderadas o leves no presentan manifestaciones 
clínicas aparentes, sin embargo la migración de larvas en infecciones intensas 
pueden provocar signos respiratorios como tos, taquipnea y flujo nasal. Los signos 
nerviosos como incoordinación o convulsiones ocasionalmente observados en 
cachorros pueden ser debidos al paso de las larvas por el cerebro (Kassai, 2002; 
Quiroz, 2003). 
Toxocariosis en humanos 
 
En el humano se han descrito algunas formas de manifestación clínica, omo el 
síndrome de Larva Migrans Visceral (LMV), Larva Migrans Ocular (LMO) y 
toxocariosis encubierta (TE). 
El cuadro de LMV fue reportado por primera vez en la década de los 50’s cuando 
la L2 de T. canis fue encontrada e identificada en los tejidos de varios niños 
(Beaver 1952). Clínicamente, la gravedad de la enfermedad varía según el número 
de huevos larvados ingeridos, la duración de la infección, la presencia de larvas en 
lugares críticos y otros factores aún no entendidos (Beaver et al., 1986). La 
mayoría de las infecciones humanas por T. canis cursan asintomáticamente o con 
signos muy leves (Bass et al., 1989). 
Las lesiones en los órganos pueden ser de tipo agudo o crónico. Los principales 
órganos afectados son el hígado, pulmón y riñón. Estas lesiones pueden verse 
7 
 
con o sin la presencia de la larva y esto sugiere la importancia de los productos 
antigénicos liberados por la larva en los tejidos. La lesión crónica característica es 
el granuloma, en el cual puede verse una gran infiltración por células 
mononucleares, fibroblastos y eosinófilos, así como la presencia de fibrosis 
alrededor de la lesión con trazas de calcificación en el centro que en algunos 
casos puede ser extensa (Parson et al., 1986). 
Se han descrito cuentas leucocitarias de 30,000 a 100,000 por mm3 y con una 
elevación de un 50 a 90 % del nivel de eosinófilos con respecto al normal (Limaye 
et al., 1990). En casos más graves se reportan historias de pica, fiebre, 
hepatomegalia, hiperglobulinemia y dolor abdominal. La mayoría de los pacientes 
se recuperan y sólo algunos llegan a morir (Beaver et al., 1986). 
La presencia y el daño producido por larvas de T. canis en el ojo caracterizan a la 
LMO. Este síndrome fue descrito por primera vez por Wilder en 1950, quien 
encontró larvas de T. canis en 24 de 46 pseudogliomas en ojos enucleados por 
endoftalmitis con aparente retinoblastoma (Wilder, 1950; Glickman et al., 1979). La 
LMO se observa generalmente en ausencia de otros signos y síntomas de LMV, 
(Schantz et al., 1979; Glickman, 1987). La invasión de larvas a las estructuras del 
ojo produce lesiones de gravedad con pérdida de visión, generalmente unilateral. 
En la fase aguda aparecen endoftalmitis y uveítis, y en la crónica, granulomas del 
polo posterior con fibrosis; en la mayoría de casos, hay ausencia de otros signos o 
síntomas (Magnaval; 2001). 
La infección por T. canis raramente resulta en enfermedad ocular y sistémica al 
mismo tiempo; estas diferencias clínicas y epidemiológicas entre LMV y LMO 
pueden estar relacionadas con la dosis ingerida en el organismo (Morales, 1999). 
La TE permanece sin diagnosticar frecuentemente pero puede ocurrir 
comúnmente. Se caracteriza por síntomas y signos no específicos no incluidos 
dentro de las categorías LMV, LMO. La TE parece depender en menor grado de la 
reacción local a las larvas de T. canis pero son varios órganos incluidos en la 
respuesta inmunopatológica del hospedador. Los órganos predispuestos pueden 
8 
 
diferir en los diferentes individuos y debido a esto la expresión clínica de la TE 
varía ampliamente. Se puede presentar compromiso pulmonar como asma, 
bronquitis aguda, neumonía, con o sin síndrome de Loeffler (Buijs et al., 1994). 
Los pacientes que padecen asma y presentan anticuerpos IgE e IgG anti-Toxocara 
son considerados como casos de toxocariosis, también pueden presentarse 
afecciones dérmicas como urticaria y prurito, infadenopatía, miositis y síndrome 
pseudoreumático como artralgia y artritis eosinofílica y linfocítica, dolor abdominal, 
síndrome de irritación intestinal, vasculitis sistémica y equimosis (Soliz-Antezana, 
2009). 
Diagnóstico de la toxocariosis 
 
El diagnóstico de la toxocariosis canina es relativamente sencillo mediante la 
observación de huevos en heces por medio de técnicas de flotación y faust y la 
expulsión de gusanos con el vómito, y heces. A la necropsia se observan lesiones 
en hígado, pulmón y riñones; con presencia de nematodos adultos en intestino 
delgado. Signos clínicos, acompañados de una eosinofília intensa, aumento de 
lactato deshidrogenasa láctica y transaminasa alcalina en las primeras semanas 
de vida (Quiroz, 2003). 
En los seres humanos, los signos clínicos y resultados asociados con LMV y LMO 
son inespecíficos y pueden señalar otras de causas posibles de infección. Debido 
a que las larvas de T. canis no completan su ciclo biológico en humanos, nunca se 
pueden encontrar huevos en las heces, por lo que no es posible dar un 
diagnóstico por medio de exámenes coproparasitoscópicos, además, la biopsia 
puede no tener éxito o estar contraindicada. Por consiguiente, en la práctica el 
diagnóstico presuntivo puede basarse en signos clínicos, resultados de 
laboratorio, historia de geofagia y convivencia con perros, principalmente 
cachorros. En exámenes de laboratorio se encuentra comúnmente leucocitosis 
con predominio de eosinófilos. La confirmación del diagnóstico debe realizarse con 
9 
 
la búsqueda de anticuerpos específicos en el suero a través de pruebas 
serológicas (Huntley, 1965). 
Para el inmunodiagnóstico se han empleado múltiples pruebas que incluyen 
fijación de complemento, inmunodifusión, hemoaglutinación directa, 
inmunofluorescencia, y radioinmunoensayo. Estas pruebas varían en sensibilidad 
y especificidad, principalmente por diferencias en el estado del antígeno 
parasitarioempleado (adulto o larva, somáticos o de excreción-secreción), la 
definición del título diagnóstico y las modificaciones en las técnicas del laboratorio 
(Morales, 1999; Glickman, 1981). 
Las larvas de T. canis producen una serie de glicoproteinas, que son reconocidas 
antigénicamente y se conocen como antígenos de secreción-excreción (AgSETc), 
estos antígenos aparentemente varían de acuerdo a las diversas condiciones 
fisiológicas del nematodo y forman parte de la envoltura externa del mismo 
(Maizels et al., 1984; Page et al, 1992) La mejor elección para el serodiagnóstico 
de las diferentes formas de toxocariosis se basa en el uso inicial de pruebas de 
ELISA empleando AgESTc, después de cualquier resultado positivo, 
posteriormente, debe ser probado por Western Blot (Magnaval, 1991). 
La prueba de ELISA ha sido desarrollada y está dirigida principalmente para la 
detección de anticuerpos IgG anti-Toxocara con una sensibilidad que varía entre 
80 y 100% y una especificidad del 90-95%. Estos indicadores pueden variar según 
la región geográfica, en países tropicales donde existen zonas endémicas de otras 
helminitiasis y problemas de poliparasitismo, las reacciones cruzadas suelen ser 
más frecuentes y, por lo tanto, se obtienen falsos positivos con más frecuencia 
(Magnaval y col., 2001; Finstener y col., 2007; Fu, 2014). 
La técnica de Western Blot supera a las pruebas utilizadas convencionalmente en 
cuanto a sensibilidad y especificidad, además permite la realización de estudios 
seroepidemiológicos en las diferentes regiones donde esta parasitosis es un 
problema de salud pública. Por Western blot se han determinado dos patrones de 
AgESTc que son reconocidos por sueros humanos a los que se les llamó LMW 
10 
 
(Low Molecular Weight, bajo peso molecular) y HMW (High Molecular Weigth, alto 
peso molecular), estos grupos fueron correlacionados con una prueba de ELISA 
ampliamente usada para el diagnóstico de toxocariasis, resultando el WB una 
prueba más específica con la que es posible reducir el margen de error del 
diagnóstico. En el patrón de HMW formado por bandas de 200, 147 y 132 kD hay 
mayor reacción cruzada con otros helmintos, mientras que la fracción LMW 
formada por bandas de 24, 28, 30 y 35 kD es más específica para el género 
Toxocara (Magnaval et al, 1991). 
Sin embargo, se ha demostrado que los AgESTc pueden cruzar con antígenos de 
otros nematodos como: Anisakis simplex, Taenia solium, Strongyloides sp, 
Fasciola hepática, metacestodo de Echinococcus granulosus, Toxascaris leonina, 
Schistosoma sp y Oncocerca sp y dar falsos positivos.(Magnaval et al., 2001; 
Perteguer y col., 2003). 
La reacción en cadena de la polimerasa (Polimerase chain reaction, PCR) es una 
técnica que permite una rápida selección, aislamiento, amplificación y 
secuenciación de ADN de pequeñas cantidades de tejido; un fragmento específico 
de ADN es seleccionado de un genoma complejo y se amplifica enzimáticamente 
in vitro, el ADN genómico de doble cadena es desnaturalizado por calor, 
reduciendo posteriormente la temperatura para permitir que los cebadores 
específicos se acoplen con sus secuencias complementarias, sobre las hebras 
opuestas del ADN, catalizando por una enzima polimerasa; los productos 
resultantes son de doble cadena y el procedimiento se repite varias veces. La 
secuencia específica de ADN es replicada por un factor de 2 en cada ciclo, 
produciendo una amplificación enorme del fragmento de ADN específico original, 
que está disponible para su manipulación posterior (Kassai, 2002). Es en general 
una prueba de mayor sensibilidad y especificidad que las pruebas inmunológicas y 
ha sido empleada para el diagnóstico e identificación de especies de protozoarios 
como: Plasmodium, Leischmania, Toxoplasma (Weiss, 1995) y Trypanosoma 
(Desquensnes and Dávila, 2002), así como algunos helmintos como: Trichinella 
spiralis (Dupouy-Camet et al., 1991) y Onchocerca vulvulus (Meredith et al., 1991). 
11 
 
Para la identificación molecular de T. canis se ha empleado principalmente la 
región de espaciador transcrito interno 1 y 2 (ITS-1 e ITS-2) del ADN ribosomal, 
utilizando técnicas como PCR convencional, PCR-RAPD y RFLP (Chen et al., 
2012). Algunos autores han logrado diferenciar exitosamente T. canis de T. cati y 
T. leonina utilizando los cebadores Tcan1 y NC2 (Jacobs et al., 1997) o utilizando 
los cebadores YY1 y NC2 (Lie et al., 2007). 
 Aunque existen varios trabajos que reportan la identificación específica de T. 
canis por técnicas moleculares, sólo existe en la literatura un reporte de 
identificación molecular del parásito a partir de animales infectados. Boreka et al. 
(2008) utilizando PCR convencional detectaron larvas de T. canis en tejido 
hepático de jerbos de Mongolia (Meriones unguiculatus) infectados con 1000 
huevos del parásito, sin embargo los autores no reportaron amplificaciones 
positivas a partir de otros órganos. 
El ciclo biológico de T. canis tiene fases en las que puede ser factible encontrar 
larvas en la circulación sanguínea u otros líquidos corporales como el humor 
acuoso, tomando en cuenta las dificultades antes mencionadas en las técnicas de 
diagnóstico serológico, es interesante explorar la posibilidad de una detección 
molecular del parásito a partir de muestras sanguíneas, lo anterior podría 
contribuir al mejoramiento del diagnóstico de la toxocariosis. 
 
 
 
 
 
 
 
12 
 
JUSTIFICACIÓN 
 
Debido a que las larvas de T. canis no completan su ciclo de vida en el humano y 
otros hospedadores paraténicos, no es posible detectarlas mediante exámenes 
coproparasitoscópicos. Por lo tanto, para determinar la presencia del parásito, son 
indispensables las pruebas de inmunodiagnóstico, como ELISA y Western Blot, 
para detectar antígenos de secreción-excreción de T. canis. Sin embargo, estas 
pruebas no presentan una especificidad y/o sensibilidad suficientes ya que hay 
cruce antigénico con otros ascaridos, dando resultados falsos positivos. 
La PCR es una técnica de mayor sensibilidad y especificidad, en la que se replica 
una secuencia determinada de ADN para definir o diagnosticar la especie de un 
organismo. Se ha logrado diseñar cebadores específicos para la secuencia ITS-2 
de las especies de ascáridos, así como de T. canis para poder detectarlos 
mediante este procedimiento. Se han realizado estudios en donde ha sido posible 
la detección molecular del parásito en algunos tejidos como hígado (Boreka et al., 
2008), sin embargo, no en todos los casos es posible el acceso a muestras 
tisulares para la detección molecular. Las larvas de T. canis pasan por algunos 
periodos por la circulación sanguínea del hospedero paraténico, por lo que su 
detección en la sangre podría ser posible. Es por ello que en el presente estudio 
se pretende detectar la secuencia de ADN específico de T. canis en torrente 
sanguíneo, ya que esta ruta es el medio de transporte de las larvas de T. canis 
siguen dentro de cualquier hospedador después de infectarse con ellas, lo anterior 
podría ofrecer una herramienta útil para el diagnóstico. 
 
 
 
 
 
13 
 
HIPÓTESIS 
 
Si las larvas de T. canis migran a través de la circulación sanguínea, entonces es 
posible amplificar por PCR un fragmento específico del ADN de T. canis a partir de 
sangre de conejos infectados experimentalmente con el parásito. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
14 
 
OBJETIVOS 
 
 Estandarizar la técnica de PCR para la amplificación del segundo 
espaciador interno transcrito (2nd Internal Transcribed Spacer, ITS-2) de T. 
canis. 
 
 Detectar el fragmento de ITS-2 en muestras de sangre de conejos 
infectados a con T. canis, obtenida en diferentes tiempos post-inoculación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
15 
 
MATERIAL Y MÉTODOS 
Lugar de realización 
 
La investigación se desarrolló en el laboratorio de Inmunología y BiologíaMolecular de Parásitos de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria de la FES-
Cuautitlán, UNAM, campo 4, en el municipio de Cuautitlán Izcalli, Estado de 
México. Los conejos fueron alojados en el área de corrales de Posgrado de la 
misma Facultad. 
Animales experimentales 
 
Se utilizaron 35 conejos machos de la raza Nueva Zelanda de 70 días de edad 
con un peso promedio de 2 kg. Antes del experimento los animales fueron 
adaptados a las condiciones experimentales y se mantuvieron en observación 
durante una semana. Cada conejo se colocó en una jaula individual de 
aproximadamente 1 X 0.6 m con comedero de tolva y bebedero automático, el 
área de alojamiento se acondicionó con cortinas de plástico y se monitoreó 
diariamente la temperatura y humedad con un termómetro ambiental. Los 
animales se mantuvieron con alimento balanceado comercial y agua ad libitum. 
Obtención de gusanos adultos de T. canis 
 
Se realizaron necropsias a cachorros sacrificados en el antirrábico de Cuautitlán, 
México. El intestino delgado fue incidido y fueron recolectados gusanos adultos de 
T. canis. Los gusanos obtenidos se depositaron en un recipiente limpio, se lavaron 
varias veces con agua, y se colocaron en solución salina fisiológica para su 
transporte en refrigeración al laboratorio, en donde fueron identificados y 
guardados hasta su utilización. 
16 
 
Obtención y cultivo de huevos de T. canis. 
 
La obtención y cultivo de los huevos de ascaroideos se realizó modificando el 
método de Oshima, (1961). Se procesaron por separado hembras de cada 
especie en una caja de Petri con solución salina, se realizó una incisión para 
obtener los huevos. Los restos de los parásitos fueron eliminados con un colador 
fino, los huevos fueron lavados y resuspendidos en una solución de formol al 2% e 
incubados a temperatura ambiente durante 28 días. La embrionación de los 
huevos fue monitoreada a partir de los 20 días. 
Diseño experimental 
 
Los conejos fueron divididos en 7 grupos experimentales (n = 5). Cada grupo 
experimental fue inoculado por sondeo esofágico con 5000 huevos larvados de T. 
canis por conejo. En los días 1, 3, 5, 10, 20, 30 y 60 post-inoculación (p.i.) se 
sacrificaron humanitariamente los conejos de cada grupo experimental bajo la 
norma NOM-033-ZOO-1995, se obtuvo por punción intracardiaca sangre con 
anticoagulante y se almacenó a -80 °C hasta su utilización. Para monitorear la 
infección de los animales se tomaron muestras de pulmón e hígado y se realizaron 
digestiones artificiales para la búsqueda de larvas, además se observaron las 
lesiones macroscópicas en los órganos más afectados. La sangre obtenida fue 
procesada por una técnica de Knott modificada para evaluar la concentración de 
larvas de T. canis. De los concentrados obtenidos se extrajo el DNA total para la 
realización de la PCR. 
Monitoreo de la infección 
 
A la necropsia se inspeccionaron los órganos abdominales de todos los conejos 
para la búsqueda de lesiones macroscópicas. Las muestras de hígado y pulmón 
colectadas de los conejos del día 3 p.i. fueron seccionados finamente y colocados 
en un tubo de ensaye con una solución de pepsina al 1% en HCl al 1% (pH 1.7) 
17 
 
durante 24 horas, posteriormente los digeridos fueron observados al microscópio 
para la detección de larvas. 
 Modificación y estandarización de la técnica de Knott para la 
concentración de larvas de T. canis de la sangre 
 
Se realizaron preparciones de 10, 25, 50 y 100 larvas de T. canis suspendidas en 
1 mL de sangre de ovino para estandarizar la prueba. Para la concentración de 
las larvas, se mezcló 1 mL de sangre con larvas con 9 mL de una solución de KCl 
0.075 M y se incubó durante 30 minutos a 37 °C. Posteriormente la mezcla se 
homogeneizó lentamente para favorecer la hemólisis y se centrifugó a 4000 rpm 
por 10 minutos con el objeto de romper membranas eritrocíticas y sedimentar las 
larvas. El sedimento se lavó tres veces con solución de KCl hasta obtener un 
sobrenadante claro. El sedimento de tres repeticiones se observó bajo un 
microscopio de campo claro para el conteo de larvas. Los sedimentos se 
procesaron para la extracción de ADN para las pruebas de PCR. 
Extracción del ADN genómico (ADNg) 
 
El aislamiento del ADNg a partir de gusanos adultos y larvas de T. canis así como 
a los sedimentos obtenidos por la técnica de Knott modificada de las muestras de 
sangre de los conejos infectados con T. canis, fue realizado utilizando el kit Wizard 
Genomic DNA Purification y siguiendo el protocolo de Boreka et al., (2008) como 
se describe: A cada paquete sedimentado inicialmente se le agregó 300 μl de 
Solución de lisis nuclear y 17 μl de proteinasa K, se homogeneizaron y se 
incubaron a 56 °C por 10 horas, después a 37 °C por 30 minutos, en baño maría y 
finalmente se dejaron a temperatura ambiente por 5 minutos. Se agregó en cada 
muestra 1.5 μl de RNAsa, 100 μl de solución precipitadora de proteínas y se 
homogeneizó por 20 segundos. Las muestras fueron centrifugadas a 16000 rpm 
por 4 minutos, la fase líquida se transfirió a otro vial con 600 μl de isopropanol y se 
homogeneizó lentamente. Después de una centrifugación a 16000 rpm por 4 
18 
 
minutos, la fase líquida fue desechada y al sedimento se homogeneizó en 600 μl 
de Etanol al 70%. Las muestras fueron centrifugadas a 16000 rpm por 1 minuto y 
se retiró la fase líquida dejando el ADN sedimentado. Finalmente el ADN fue 
resuspendido en 50 μl de solución hidratadora de ADN a 63 °C por 1 hora. La 
cantidad de ADN fue cuantificada por medio de un nanoespectofotometro (ND-
1000, Nanodrop®). 
Estandarización de la PCR 
 
La amplificación de la región del ITS-2 de T. canis fue realizada de acuerdo al 
método descrito por Jacobs et al., (1997) y modificado por Borecka et al. (2008) 
como se describe: Para la mezcla de reacción se usaron los siguientes 
componentes: Buffer 12.5 μL, Primer YY1 0.5 μL, Primer NC2 0.5 μL, ADN de la 
muestra 2 μL y agua libre de nucleasas 8 μL. El ciclo se estableció con las 
siguientes condiciones: 98 °C por 30 segundos para desnaturalización, 56 °C por 
30 segundos para el alineamiento y 74 °C para la extensión, por 40 ciclos. En 
cada ciclo de PCR se corrió un control negativo, con la mezcla de reacción sin 
ADN y como controles positivos, un tubo con ADN extraido de sedimentos de 
sangre mezclada con 25 y 50 larvas de T. canis, y otro tubo con ADN de T. canis 
adulto. La región ITS-2 fue amplificada a partir de 5 a 10 ng del ADN extraído de 
los gusanos adultos o de las muestras de sangre de los conejos infectados 
utilizando los cebadores YY1 (frontal) y NC2 (reverso). Los productos de la PCR 
fueron separados en geles de agarosa al 2% por 30 minutos y teñidos con 
GELRED® (Biotium Labs.), transiluminados y fotografiados para su estudio. 
CEBADOR SECUENCIA REFERENCIA 
YY1 (frontal) 5’-CGGTGAGCTATGCTGGTGTG-3’ Li et al., 2007. 
NC2 
(Reverso) 
5’-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3’ Lie et al., 2007; Jacobs et 
al., 1997. 
Cuadro1. Nombre y secuencia de los cebadores utilizados para la amplificación 
del fragmento ITS-2 de Toxocara canis. 
 
19 
 
RESULTADOS 
 
La infección con T. canis produjo lesiones (hemorragias petequiales y equimosis) 
en pulmones e hígado de los conejos (figura 1). Las muestras de pulmón e hígado 
de todos los conejos infectados fueron positivos a la presencia de larvas de T. 
canis en la digestión artificial. 
 Durante la estandarización de la técnica de Knott modificada y PCR, se logró 
la sedimentación y el conteo de larvas de T. canis a partir de sangre de conejos en 
todas las concentraciones probadas: 100, 50, 25 y 10 larvas/mL (figura 2). De 
estas, los cebadores YY1/NC2 amplificaron productos esperados (330 pb) de las 
muestras de 100, 50 y 25 larvas/mL así como del control positivo de T. canis 
adulto (figura 3). 
 No se obtuvieron amplificados positivos de las muestras de sangre de los 
conejos infectadosen ningún día p.i. las cuales fueron probadas siempre junto con 
ADN del estándar de 50 larvas/mL y ADN de T. canis adulto como controles 
positivos (figura 4). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Lesiones hemorrágicas obselVadas en el día 20 post infección en 
pulmones de conejos infectados con 5000 huevos larvados de Toxocara canis. 
2
1 
 
 
90 
VI 80 
nl 
"C 
nl 70 "-
al 
Q. 
::::s 60 
t.) 
al 
"- 50 
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al 30 
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O 20 
"-
al 
E 10 
'::::s 
Z 
O 
100 50 25 10 
-10 Concentración de larvas de T. canis en sangre (larvas/mL) 
Figura 3. Promedio (±DS) del número de larvas recuperadas en los sedimentos de las muestras de sangre 
obtenidos por la técnica de Knott modificada. Cada dato es producto de tres repeticiones de cada muestra 
estándar. 
2
2 
 
 
 
Figura 4. Amplificación por PCR del fragmento ITS-2 de Toxocara canis a partir de ADN extraido de 
sedimentos obtenidos por técnica modificada de Knott con diferentes concentraciones larvarias. Carril 1: 
Marcadores de tamaño molecular; Carril 2: control negativo; carril 3: 100 larvas de T canislmL; carril 4: 50 
larvas de T canislmL; carril 5: 25 larvas de T canislmL; carril 6: 10 larvas de T canislmL; carril 7: ADN de 
T canis adulto. 
2
3 
 
 
Figura 5. Amplificación por PCR del fragmento ITS-2 de Toxocara canis a partir de muestras (negativas) de 
sangre (procesadas por técnica modificada de Knott) de conejos infectados experimentalmente con T 
canis . Carril 1: Marcadores de tamaño molecular; Carril 2: control negativo; carril 3: muestra de sangre de 
conejo 1; carril 4: : muestra de sangre de conejo 2; carril 5 : muestra de sangre de conejo 3; carril 6: 
muestra de sangre de conejo 4; carril 7: muestra de sangre de conejo 5; carril 9: control 50 larvas/mL de 
sangre ; carril 10: ADN de T canis adulto. 
24 
 
DISCUSIÓN 
 
El diagnóstico de la toxocariosis en humanos se realiza integrando los 
antecedentes del paciente, su información clínica y pruebas de laboratorio como 
ELISA y Western blot que demuestran de manera indirecta la presencia del 
parásito. Algunos autores han descrito secuencias cebadoras para la detección 
molecular del fragmento ITS-2 de T. canis (Jacobs et al., 1997; Lie et al., 2007; 
Boreka et al., 2008) y se ha logrado la amplificación de este fragmento a partir de 
hígado de animales experimentales (Boreka et al., 2008). En este estudio se 
estandarizó una técnica para la concentración de larvas de T. canis presentes en 
la sangre y se logró la amplificación del fragmento ITS-2 del parásito a partir de 
larvas adicionadas a sangre, sin embargo no se logró amplificar el fragmento a 
partir de sangre de conejos infectados con el parásito, las causas posibles de esto 
se discuten más adelante. 
 La técnica de Knott se utiliza para la detección de microfilarias de Dirofilaria sp. en 
sangre, se basa en la lisis de los eritrocitos de la muestra, la fijación de las larvas 
con formalina al 2%, su concentración por centrifugación y su visualización 
adicionando azul de metileno (Kassai, 2002). En el presente estudio se modificó 
esta técnica para concentrar larvas de T. canis presentes en la sangre, a 
diferencia de la técnica original, no se fijaron las larvas con formalina porque esto 
desnaturalizaría el ADN necesario para la detección molecular, por lo cual se usó 
una solución hipotónica de KCl (0.075M) para producir la lisis de eritrocitos, 
posteriormente se utilizó la centrifugación para la concentración de larvas y ciclos 
de resuspensión-centrifugación para su limpieza. El proceso anterior permitió 
obtener un sedimento limpio de proteína contaminante (hemoglobina). Con esta 
técnica modificada de Knott, se logró la recuperación de larvas en muestras de 
sangre mezclada con 100 y hasta 10 larvas/mL (figura 2), lo cual indicó la alta 
eficiencia de nuestra técnica para medir la concentración de larvas de T. canis a 
partir de sangre. 
25 
 
Lie et al. (2007), describieron un par de secuencias cebadoras específicas para el 
fragmento ITS-2 de T. canis, logrando diferenciarlo de T. cati, T. malaysiensis y 
Toxascaris leonina. En este trabajo se utilizaron estas secuencias para la 
detección de ADN a partir de larvas y adultos de T. canis y en los sedimentos de 
las muestras de sangre mezclada con larvas del parásito. Se obtuvo en todos los 
casos un amplificado esperado de 330 pb tal como lo describieron Lie et al. 
(2007). Adicionalmente en otro estudio paralelo a este, se probó la especificidad 
de dichos cebadores con extractos de Ascaris suum, A. lubricoides y Toxascaris 
leonina, no encontrándose amplificados en estas especies (Pérez-Luna, 2012). Lo 
anterior hizo patente la utilidad de estos cebadores en la detección específica de 
T. canis y demostró que la técnica de Knott no modifica el ADN del parásito 
haciendo posible su detección. 
A partir de los sedimentos obtenidos por la técnica de Knott modificada se logró la 
amplificación del fragmento ITS-2 de T. canis en muestras hasta con 25 larvas/mL 
de sangre de conejo, sin embargo no se logró amplificar el fragmento a partir de 
las muestras de sangre de los conejos infectados con 5000 huevos larvados de T. 
canis. Existe un trabajo en la literatura que reporta la amplificación de ADN de T. 
canis en hígado de jerbos infectados con el parásito y reportan una sensibilidad de 
hasta 3.5 larvas por gramo de tejido (Borecka et al., 2008), es decir, en una 
relación equivalente (gramos/mililitros), la técnica descrita por Borecka et al. 
(2008) es siete veces más sensible. Pérez-Luna et al., (2014) utilizando los 
cebadores YY1/NC2, logró amplificar el fragmento ITS-2 (330 pb) en cerebros de 
conejo infectados con T. canis en el día 30 y 60 p.i. Por otro lado la intensidad de 
la infección en el modelo utilizado por ellos (jerbo) no fue la misma. Mientras que 
en este estudio se infectó con 5000 larvas a conejos en promedio de 2 kg de peso 
(2.5 huevos por gramo de peso vivo) ellos infectaron con 1000 huevos jerbos de 
aproximadamente 200 gramos (5 huevos por gramo de peso vivo). Por otra parte, 
la cantidad de larvas que pueden estar presentes en la sangre es mucho menor 
que las que pueden estar presentes en el hígado, mientras que Cho et al., (2007) 
reportaron hasta 100 larvas en el hígado de jerbos con infecciones de 1000 
huevos larvados, Manhardt (1980) reporta 0.28 larvas/gramo de sangre de perros 
26 
 
inyectados (vena cefálica) con 200 mil larvas de T. canis (datos calculados por el 
autor del presente estudio). Lo anterior puede ser la principal causa de que no 
haya sido posible la detección molecular de larvas en la sangre de conejos 
infectados experimentalmente. Estudios en donde se inyecten cantidades 
conocidas de larvas directamente en circulación sanguínea en modelos 
experimentales podrían indicar de mejor manera el umbral de detección de T. 
canis por PCR en la sangre. 
Por último, si se considera que los conejos estaban infectados porque se 
detectaron larvas de T. canis en pulmón e hígado y que en una tesis paralela 
(Parral-Sánchez, 2012), usando estos mismos conejos se demostró la presencia 
de anticuerpos específicos antitoxocara. Entonces pese a la propuesta de que la 
prueba de PCR puede ser efectiva para el diagnóstico de la toxocariosis, se 
demostró que las pruebas inmunológicas resultan ser más sensibles. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
27 
 
CONCLUSIÓN 
 
Con la técnica de Knott modificada, se logró la recuperación de larvas de T. canis 
en muestras de sangre mezclada con 100 y hasta 10 larvas/mL. 
Los cebadores YY1 y NC2 amplificaron específicamente el fragmento ITS-2 de T. 
canis a partir de los concentrados de la técnica de Knott así como de muestras de 
larvas y adultos de T. canis. 
La técnica de Knott modificada no alteró el ADN del parásito haciendo posible su 
detección molecular por PCR. 
No se logró la detección molecular del fragmento apartir de las muestras de 
sangre de los conejos infectados con T. canis quizá debido a una baja 
concentración larvaria. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
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	Portada
	Índice
	Resumen
	Introducción
	Justificación
	Hipótesis
	Objetivos
	Material y Métodos
	Resultados
	Discusión
	Conclusión
	Bibliografía