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DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL VIRUS 
EPSTEIN BARR EN SANGRE PERIFÉRICA Y PLASMA 
DE PACIENTES PEDIÁTRICOS. 
 
TESIS 
 
 
 
 PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
 ESPECIALISTA EN: 
 
 
 PEDIATRIA 
 
 
 
 
 PRESENTA: 
 
Dra. Mayra Alondra Liévano Pérez 
 
 
 
 
 
 
MÉXICO, D. F Febrero 2011 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE MEDICINA 
DIVISIÓN DE ESTUDIO DE POSGRADO 
HOSPITAL INFANTIL DE MÉXICO FEDERICO GÓMEZ 
 
 
TUTORES: 
M.C. JOSE LUIS SANCHEZ HUERTA 
DRA. BRICEIDA LÓPEZ MARTÍNEZ 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
2 
 
DEDICATORIA. 
 
A MIS PADRES: Porque son parte de mi vida, son los que me han visto crecer, 
quienes han disfrutado mis logros y tristezas tomándome siempre de la mano, 
no importando el camino eterno del sueño anhelado, sabiendo y teniendo fe en 
que el logro llegaría, a pesar de que el camino no termina. Con todo el amor 
que guardo en mi ser gracias. 
 
A MIS HERMANOS: Ari, Karina , Guillermo y Karina Guadalupe 
Por ser mis compañeros de vida, por continuar pendientes de mis sueños y 
decisiones. 
 
A MIS SOBRINOS: Ambar, Adrian y Alex: Porque su existencia me envuelve de 
entusiasmo para continuar en el sendero de la vida. 
 
A MI AMOR: Sergio, por la maravillosa vida que tengo a su lado y las fuerzas 
que me inspira para mantenerme de pie, caminar y correr. 
 
A MI TUTORA DE TESIS: Dra. Briceida López Martínez por darme su tiempo, 
paciencia y hacer realidad este trabajo de investigación. 
 
 
 
 
 
3 
 
ÍNDICE 
 
I Marco teórico 6 
 
II Planteamiento del Problema 14 
 
III Justificación 15 
 
IV Objetivo 16 
 
V Material y Métodos 17 
a) Diseño 
b) Población 
c) Muestra 
d) Criterios de inclusión 
e) Criterios de exclusión 
f) Metodología 
 
VI Plan de Análisis Estadístico 19 
 
VII Resultados 19 
 
VIII Discusión 22 
 
IX Conclusiones 23 
 
X Anexos 24 
 
XII Bibliografía 25 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
 
RESUMEN 
 
 Detección y cuantificación del virus Epstein Barr en sangre 
periférica y plasma de pacientes pediátricos. 
 
Introducción. El virus Epstein Barr (VEB) tiene la característica de provocar 
latencia, el 90% de la población ha presentado la primoinfección, por lo que se 
encuentra ampliamente distribuido en todo el mundo. La enfermedad que se 
asocia con mayor frecuencia al VEB es la mononucleosis infecciosa sin 
embargo, se relaciona con la aparición de enfermedades malignas como el 
linfoma de Burkitt, carcinoma nasofaríngeo, linfoma no Hodgkin y el síndrome 
linfoproliferativo postrasplante (SLPT). La alta incidencia del SLPT la cual es de 
1 a 20% en niños se debe a que la primoinfección la padecen después de ser 
trasplantados. Se recomienda la determinación de la carga viral del VEB en 
sangre periférica y plasma para dar seguimiento a los pacientes 
inmunosuprimidos y en riesgo de padecer el SLPT. 
 
Objetivo. Describir la detección y cuantificación del virus Epstein Barr en 
sangre periférica y plasma de pacientes pediátricos. 
 
Material y Métodos: Se analizaron de forma retrospectiva 1052 muestras de 
pacientes pediátricos, recibidas en el periodo de abril del 2008 a noviembre del 
2009, a los cuales se les realizó la investigación del virus de Epstein Barr (VEB) 
en sangre total periférica y plasma por medio de PCR en tiempo real (2104 
determinaciones). Utilizando un diseño de la compañía TIBMOL Biol y el equipo 
LightCycler®, 
 
Resultados: De las 1052 muestras estudiadas, en 498 (47.3%) muestras de 
sangre periférica (SP) y en solamente 253 (24.05%) muestras de plasma (PL), 
se detectó y se cuantificó la carga viral del VEB. Las muestras negativas para 
la detección en SP fue de 52.7% (554) y en plasma 75.95% (799). Se 
identificaron 99 (9.41%) muestras de SP con carga viral mayor de 5,000 
 
 
 
5 
 
copias/ml y valores menores a 100 copias/ml en plasma, en su mayoría 
muestras de pacientes postrasplantados. 
 
Conclusiones: En éste estudio observamos que tanto en la determinación en 
sangre total como en plasma se logra detectar la presencia de VEB, sin 
embargo es importante considerar que la cantidad de copias encontrada a 
través de muestras de plasma son mucho más bajas que las encontradas en 
sangre total, por lo que en base a este estudio sugerimos que el clínico debe 
tomar en cuenta que una cifra baja de capias de VEB en plasma no excluye al 
paciente de cursar con la enfermedad activa, debiendo tener siempre la 
determinación en sangre total para un mejor seguimiento de sus pacientes. 
Es necesaria la realización de más estudios para determinar los valores de 
corte en el estudio cuantitativo de carga viral para infección de VEB con PCR 
en tiempo real. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
 
I.-MARCO TEÓRICO 
 
 VIRUS EPSTEIN BARR 
El virus Epstein Barr (VEB) fue descubierto por Dennis Burkitt en 1950, 
mediante el estudio de una forma de cáncer que afectaba la mandíbula de 
los niños y adolescentes del África Ecuatorial. Posteriormente en 1964, Tony 
Epstein, Ivonne Barr y Burt Achong examinaron las biopsias de tumores 
extirpados y encontraron un virus parecido a las partículas de los herpesvirus 
y así establecieron que el VEB era el causante de estos tumores 1. 
Los VEB son virus grandes (100 a 200 nm de diámetro) que poseen una 
nucleocápside con simetría icosaédrica, rodeada por una cubierta externa 
que contiene lípidos. Su genoma está constituido por una molécula de ADN 
bicatenario que tiene de 170 a 175 kpb, y codifica para aproximadamente 
unas 100 proteínas. La molécula de ADN está flanqueada en ambos 
extremos por un número variable de repeticiones terminales, cada una de 
ellas de una longitud aproximada de 500 pb 2. 
Al igual que el resto de los integrantes de la familia de los Herpes virus, el 
virus Epstein Barr (VEB) tienen la característica de provocar latencia (1), se 
encuentra ampliamente distribuido en todo el mundo, pues más del 90% de 
la población mundial se encuentra infectada 2. 
El virus entra en el huésped y provocala infección, generalmente como 
resultado de la transmisión oral con un individuo portador de VEB 5, aunque 
hasta el momento no está totalmente claro sí el virus que se libera en la 
saliva de los portadores sanos proviene de los linfocitos B de mucosas, 
células plasmáticas o células del epitelio escamoso. Recientemente se ha 
reportado la presencia del virus en secreciones genitales de ambos géneros, 
indicaría que también puede ser transmitido sexualmente. Por otro lado se 
ha reportado que el virus puede encontrarse en leche materna, lo que 
muestra que al parecer pudiera existir una ruta de transmisión vertical muy 
poco común3. 
 
 
 
7 
 
 
MECANISMOS DE LATENCIA DELVIRUS EPSTEIN BARR 
Las células B infectadas por el VEB pueden expresar un grupo bien definido 
de genes de latencia que incluye seis antígenos nucleares (EBNAs) y tres 
proteínas latentes de membrana (LMP1, LMP2A, LMP2B). De estas 
proteínas de latencia, LMP1 es considerada la oncoproteína más fuerte y es 
esencial para la inmortalización de las células B y comparte propiedades 
funcionales con los miembros de la superfamilia de los receptores del factor 
de necrosis tumoral, particularmente CD40 5, 9. 
Las diferencias existentes entre los genes que codifican las proteínas 
nucleares EBNA-2 y EBNA-3A, -3B y -3C distinguen dos diferentes tipos del 
VEB denominados VEB-1 y VEB-2 que se diferencian para trasformar los 
linfocitos B in vitro tal es el caso del VEB tipo 1. Dependiendo de los genes 
expresados en la célula huésped, se han descrito tres formas diferentes de 
latencia del VEB, que se observan en las distintas líneas celulares y en las 
diversas patologías asociadas al VEB 9. 
La forma de latencia I se observa en el linfoma Burkitt (LB) y en los linfocitos 
B infectados que circulan en la sangre periférica. En esta forma de infección 
la expresión del genoma viral queda limitada a los EBERs y a la proteína 
EBNA-1 cuya función es indispensable para mantener el episoma pero que 
carece de capacidad inmunógena. Este patrón tan restringido de expresión 
génica permitiría a las células infectadas escapar a la vigilancia inmune por 
linfocitos citotoxicos (CTL), favoreciendo así la persistencia de la infección 
latente 5.9. 
 La forma de latencia tipo II se asocia fundamentalmente a neoplasias. En 
esta forma se expresan la proteínas EBNA-1 y LMP-1, LMP-2A y 2B y los 
EBERs. Es la que caracteriza a la enfermedad de Hodgkin (EH) y al 
carcinoma nasofaríngeo (CNF) 5,9. 
 
 
 
 
8 
 
La forma de latencia tipo III es la que caracteriza a las líneas linfoblastoides y 
se observa también en la mononucleosis infecciosa y en la gran mayoría de 
los trastornos linfoproliferativos B asociados a inmunodeficiencia. 
La inmunosupresión actuaría permitiendo que los linfocitos B infectados 
expresen todas las proteínas asociadas a la infección latente sin que sean 
reconocidos y eliminados por los CTL 5,9. 
 
MANIFESTACIONES CLÍNICAS DE LA INFECION POR EPSTEIN BARR 
El VEB produce una infección latente, en la que se reporta que los 
portadores sanos tienen de 1 a 50 células infectadas por millón de leucocitos 
(8), con reactivaciones esporádicas, debido a que la mayor parte de las 
poblaciones de los linfocitos B humanos infectados, mantienen un estado 
latente de replicación y expresión genética viral, pero pocas entran a una 
fase productiva del virus a menos que el individuo se encuentre 
inmunosuprimido. Cuando esto sucede, el virus coloniza las células del 
epitelio nasofaríngeo donde establece su ciclo lítico de replicación, 
provocando una respuesta inflamatoria localizada que produce un exudado 
faríngeo y es llevado por vía linfática hasta los ganglios locales, lo que 
ocasiona una viremia, que desarrolla la linfadenopatía local y generalizada, 
así como la esplenomegalia. Los mecanismos patogénicos por los que el 
VEB es capaz de inducir la aparición de tumores se relacionan con las 
proteínas codificadas por algunos de los genes expresados en la infección 
latente, dichos productos inducen diferentes efectos sobre la célula 5-8. 
Cuando la infección por el VEB se presenta durante la infancia generalmente 
pasa clínicamente inadvertida, mientras que si se presenta hasta la 
adolescencia o posteriormente puede provocar la mononucleosis infecciosa. 
En los individuos inmunocoprometidos, el VEB ha sido relacionado con 
enfermedades malignas como el linfoma de Burkitt, carcinoma nasofaríngeo, 
linfoma no Hodgkin y el síndrome linfoproliferativo postrasplante (SLPT) 4. 
 
 
 
9 
 
La Mononucleosis infecciosa es la más típica forma clínica de la infección 
primaria por el VEB. Como sucede con los demás herpesvirus, la infección 
en niños es mucho más leve que la que se produce en adolescentes o 
adultos. El tiempo de incubación de alrededor de un mes. Después de un 
período prodrómico, caracterizado por escalofríos, sudoración, fiebre y 
malestar, se presenta la enfermedad, que en su forma más típica incluye la 
tríada de odinofagia, fiebre y linfadenopatías. También aparecen con 
frecuencia hepatoesplenomegalia y exantema. La mayoría de los casos 
remite de forma espontánea a las 3 o 4 semanas, aunque el cansancio 
puede durar un poco más tiempo. Existen algunas complicaciones 
importantes con alteraciones neurológicas (meningoencefalitis y Guillain 
Barré), obstrucción laríngea o rotura de bazo. En la gran mayoría de casos la 
recuperación es total mediante tratamiento sintomático. 
Dado que el virus inmortaliza o transforma los linfocitos en el cultivo, siempre 
se ha sospechado la participación de este agente en el Linfoma de Burkitt 
Endémico (LBE). Este linfoma endémico de algunas regiones de África 
presenta en sus células viriones y secuencias de ADN del virus. Se pensó 
que VEB actuaría por activación del oncogen c-myc, por la presencia de un 
gen en el propio del virus. Recientemente se sospecha que el papel que este 
virus desempeña es el de cofactor ya que en los LB esporádicos no se 
encuentran secuencias del virus. Parece ser que la infección por 
plasmodium, que produce una importantísima alteración del papel "vigilante" 
de los linfocitos T, puede ser el factor principal del desarrollo de este tumor 
en estas zonas endémicas. 
La respuesta serológica característica en pacientes con Carcinoma 
Nasofaringeo Indiferenciado también lo ha asociado con este virus. A 
diferencia del las células que componen este tumor, también endémico de 
extremo oriente, son de estirpe epitelial. 
 
 
 
 
 
10 
 
Cada vez hay más pruebas de que la inmunosupresión o la alteración de la 
función de los linfocitos T favorece la aparición de Enfermedades 
Linfoproliferativas en pacientes inmunosuprimidos e infectados por VEB tal 
es el caso de leucoplasia peluda de los pacientes VIH positivos o el 
síndrome linfoproliferativo del postrasplantado. 
El Síndrome de Fatiga Crónica (SFC) con cansancio crónico, febrícula, 
debilidad muscular e incapacidad para concentrarse se ha intentado 
relacionar con este virus. La única prueba de esta asociación la constituye 
en una cierta elevación de los títulos de anticuerpos frente al virus. También 
se ha descrito este cuadro en asociación con otros virus y la importancia que 
el paciente dio a su enfermedad. 
 
SINDROME LINFOPROLIFERATIVO POSTRASPLANTE Y EPSTEIN 
BARR. 
Se conoce como síndrome linfoproliferativo postrasplante (SLPT) a un 
espectro de lesiones que abarca desde la proliferación linfoide atípica a un 
verdadero linfoma, que se produce como consecuencia de la 
inmunodepresión en receptores de órgano sólido o de un trasplante 
alogénico de progenitores hematopoyéticos. 
La patogénesis de la SLPT es multifactorial y compleja. Los factores de 
reconocida participación incluyen una vigilancia inmunológica inapropiada 
por parte del huésped, la estimulación antigénica crónica por el injerto, el 
órgano trasplantado, así como el tipo, la intensidady la duración de la 
terapia Inmunosupresora. Sin embargo, el escenario de mayor riesgo para 
desarrollo de SLPT lo encontramos en receptores seronegativos 
pretrasplante para el VEB lo cual indica la no exposición previa a la infección 
viral y por ende la ausencia de protección inmunológica que reciben un 
órgano o productos sanguíneos de donador seropositivo o que adquieren la 
enfermedad primaria de manera natural en la etapa postrasplante, cuando el 
individuo se encuentra con una respuesta inmune comprometida por la 
administración de inmunosupresores. 
 
 
 
11 
 
La frecuencia reportada de SLPT en adultos receptores de trasplante renal 
es de 4.9 y 1.6% en pacientes seronegativos vs. seropositivos pretrasplante, 
respectivamente, y existe una frecuencia mayor en población pediátrica vs. 
adulta, con porcentajes correspondientes de 10 vs. 1.2%, diferencia 
explicada en cierta medida por la frecuencia de receptores pediátricos 
seronegativos cuando se comparan con población adulta (12). 
Los SLPT incluyen las siguientes entidades: a) lesiones precoces (early 
lessions): hiperplasia plasmocítica reactiva y SLPT similares a 
mononucleosis infecciosa; b) SLPT polimórfico; c) SLPT monomórfico; y d) 
linfoma de Hodgkin. La mayoría de SLPT están asociados al VEB y 
corresponden a proliferaciones clonales de células B o, con menor 
frecuencia, policlonales. El patrón de expresión de los productos de latencia 
es del tipo III, similar al de las líneas celulares linfoblastoides obtenidas in 
vitro. No obstante, se han descrito ocasionalmente patrones de latencia de 
los tipos I y II. 
Las características clínicas de los SLPT son variables y dependen del tipo de 
inmunodepresión, del órgano trasplantado y del tipo morfológico. En los 
pacientes sometidos a trasplante de órgano sólido la incidencia de SLPT es 
del 1 al 30%, dependiendo del tipo de trasplante y de la edad del paciente. 
En la población pediátrica sometida a trasplante de hígado, la incidencia es 
del 10%, con una mortalidad del 60% y con una alta morbilidad que incluye 
la pérdida del órgano trasplantado 10-12. 
METODOS DIAGNÓSTICOS DEL VIRUS DE EPSTEIN BARR 
Existen varios procedimiento para el diagnóstico de laboratorio de las 
infecciones por el virus de Epstein Barr, el mejor procedimiento es el 
aislamiento del virus o de alguno de sus componentes o productos. Aunque 
se reconocen tipos celulares naturalmente susceptibles a la infección por el 
VEB, in vitro se reduce prácticamente a linfocitos B, que son transformados, 
en un proceso lento y tecnológicamente complejo, por lo que el aislamiento 
es un procedimiento imposible para la gran mayoría de laboratorios de 
diagnóstico. La identificación de antígenos del virus tampoco ha resultado 
 
 
 
12 
 
una aproximación adecuada. Por último, la detección de DNA del virus por la 
reacción en cadena de la polimerasa ha mostrado un buen rendimiento 
comparativo con los estudios serológicos. 
La determinación de la carga vírica del VEB tiene gran utilidad por sí sola, 
aunque debe combinarse con parámetros clínicos y otras técnicas de 
laboratorio adicionales. En los receptores de trasplante, la detección 
cualitativa del VEB generalmente no se correlaciona con la presencia de 
SLPT, dado que el virus puede detectarse en la sangre periférica de 
individuos infectados sanos en bajos niveles. En cambio, los ensayos 
cuantitativos permiten observar las fluctuaciones de la carga vírica en el 
desarrollo y regresión de esta enfermedad. Actualmente, la forma más 
común de determinar la carga vírica del VEB se basa en pruebas de PCR. 
Inicialmente estos métodos fueron semicuantitativos y su mayor desventaja 
radicaba en la escasa estandarización de la metodología y la posibilidad de 
obtención de resultados falsos negativos por factores de inhibición de la PCR 
presentes en las muestras biológicas. Posteriormente, los métodos 
cuantitativos competitivos de PCR mejoraron la determinación de la carga 
vírica del VEB. La inclusión de calibradores internos para cada reacción 
permitió identificar los problemas de inhibición. Aunque éstos ensayos de 
carga vírica son reproducibles precisos y complejos, requieren una elevada 
manipulación durante y después de la PCR y precisan gran número de 
cálculos para la obtención de los resultados. Este hecho no permite el 
procesamiento de un elevado número de muestras y dificulta el seguimiento 
de un gran número de pacientes. En cambio, la PCR cuantitativa en tiempo 
real, al detectar durante la amplificación la fluorescencia de los productos de 
PCR, requiere poca manipulación y permite el seguimiento de un mayor 
número de pacientes y muestras. Los sistemas Taqman (Applied 
Biosystems) y de LightCycler (Roche Diagnostics) son los métodos más 
empleados actualmente 11. 
Actualmente, se utilizan varios tipos de muestras para los ensayos de 
cuantificación de DNA del VEB. Éstas incluyen la sangre total, células de 
sangre periférica, suero y plasma. El aislamiento de células sanguíneas es 
 
 
 
13 
 
laborioso, requiere mayor cantidad de sangre y el proceso puede dañar las 
células. En cambio, la utilización de sangre total requiere poco volumen de 
muestra, siendo un argumento de peso para el seguimiento de niños y 
pacientes graves. Además, no requiere pasos previos a la extracción del 
DNA. Los niveles de carga vírica hallados en las células de sangre periférica 
y en sangre total, son generalmente más elevados que los hallados en 
plasma. La carga vírica asociada a las células sanguíneas puede persistir a 
elevados niveles, pero no acompañarse con la detección en plasma, o 
detectarse a valores bajos. 
En los laboratorios clínicos se ha incrementado el uso de la carga viral como 
herramienta para el diagnóstico y seguimiento de las enfermedades 
relacionadas con virus. La carga viral del VEB no solo es útil para detectar 
una infección activa, sino también como marcador tumoral de ciertas formas 
malignas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
14 
 
II PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
 
Es bien sabida la relación que guarda el virus de Epstein Barr con la 
aparición de enfermedades linfoproliferativas, sobre todo en pacientes 
inmunocomprometidos; en Hospitales de tercer nivel como el Hospital Infantil 
de México Federico Gómez se atienden pacientes con inmunodeficiencia 
primaria o adquirida. Por lo que se considera que el seguimiento de este tipo 
de pacientes debe ser realizado junto con la determinación de la carga viral 
de Epstein Barr. 
La determinación del virus es realizada determinando la carga viral por PCR, 
siendo el método más usado, sin embargo la literatura destaca que la 
determinación de la carga viral en sangre total y plasma guarda diferencias 
importantes, ya que un porcentaje de pacientes con resultados negativos en 
plasma son positivos en sangre total, y de no realizarle esta ultima el 
diagnóstico de estos pacientes se realiza de manera tardía. 
Por tal motivo se debe conocer cuál es el comportamiento en la detección y 
cuantificación de Epstein Barr en sangre y plasma con PCR en tiempo real 
de muestras de pacientes pediátricos en el Hospital Infantil de México 
Federico Gómez. 
 
 
 
 
 
15 
 
 
 
III JUSTIFICACION 
 
La inmunosupresión en pacientes pediátricos sobre todo en 
postrasplantados de órganos sólidos es todo un reto, ya que el fin es lograr 
preservar el órgano el mayor tiempo posible. Sin embargo, hay varias 
causas de pérdida de injerto, dentro de estas se encuentra el Síndrome 
linfoproliferativo causado por el Virus de Epstein Barr, ante esto como parte 
del seguimiento de pacientes postrasplantados y pacientes con 
inmudeficiencias primarias y secundarias se está obligado a la determinación 
rutinaria de la carga del Virus Eptein Barr. 
En la literatura existen diferencias importantes en cuanto a su determinación 
en sangre total o plasma, encontrandoen esta última a pacientes negativos 
en los cuales al realizar la determinación en sangre total se encuentra 
positiva. 
Es necesario por tal motivo, conocer la detección y cuantificación de virus 
de Epstein Barr en sangre total y plasma de muestras de pacientes 
pediátricos en el Hospital Infantil de México Federico Gómez, con el fin de 
modificar el seguimiento de los pacientes a favor de la preservación de la 
salud. 
Este trabajo de investigación es la base de futuros proyectos de 
investigación relacionados con carga viral y niveles de inmunosupresión de 
pacientes postran plantados, así como la asociación de la enfermedad con la 
carga viral y la actividad del virus Epstein Barr. 
 
 
 
 
 
16 
 
 
IV OBJETIVO 
 
 
Describir la detección y cuantificación del virus Epstein Barr en sangre 
periférica y plasma de pacientes pediátricos. 
 
 
 
 
 
17 
 
V MATERIAL Y METODOS 
 
a) Diseño. 
Estudio retrospectivo, transversal y descriptivo 
 
b) Población de estudio. 
Muestras de pacientes pediátricos, recibidas en el periodo de abril del 2008 a 
noviembre del 2009, a los cuales se les realizó la investigación del virus de 
Epstein Barr (VEB). 
 
c) Muestra. 
Muestreo por conveniencia. 
 
d) Criterios de Inclusión: 
Muestras de pacientes pediátricos, recibidas en el periodo de abril del 2008 a 
noviembre del 2009, a los cuales se les realizó la investigación del virus de 
Epstein Barr (VEB) en sangre total periférica y plasma por medio de PCR en 
tiempo real. 
 
e) Criterios de Exclusión: 
-Muestras de pacientes pediátricos, recibidas en el periodo de abril del 2008 a 
noviembre del 2009, a los cuales se les realizó la investigación del virus de 
Epstein Barr (VEB) solo en sangre total periférica. 
- Muestras de pacientes pediátricos, recibidas en el periodo de abril del 2008 a 
noviembre del 2009, a los cuales se les realizó la investigación del virus de 
Epstein Barr (VEB) solo en plasma por medio de PCR en tiempo real. 
-Muestras coaguladas de pacientes pediátricos, recibidas en el periodo de 
abril del 2008 a noviembre del 2009, a los cuales se les solicitaba la 
investigación del virus de Epstein Barr (VEB). 
 
 
 
 
 
18 
 
f) Metodología: 
Para la determinación de carga viral se utilizaron 3 ml de sangre periférica 
anticoagulada con EDTA, se tomo una alícuota de 400 µl de sangre total, la 
muestra restante se centrifugo a 3000 rpm por 10 minutos y se tomo una 
alícuota de 400 µl de plasma. 
Extracción de ADA: Para la extracción de ADN se utilizó el equipo MagNA 
Pure Compac®; con un juego de reactivos Magna Pure Compact Nucleic Acid 
Isolation Kit I (Roche Molecular Diagnostics) utilizando los programas de 
extracción de ADN a partir de 400 µl de sangre total con un volumen de elusión 
de 200 µl y el programa de ácidos nucleicos totales a partir de 400 µl de 
plasma con un volumen de elusión de 100 µl. Para la detección y cuantificación 
del VEB se amplificó un fragmento de 166 pb del genoma utilizando un diseño 
de la compañía TIBMOL Biol y el equipo LightCycler®, además como control 
positivo interno se utiliza un juego de iniciadores y sonda que amplifica un 
fragmento de 278 pb. La mezcla de reacción a un volumen final de 20 µl, 
utilizando 5.0 µl de ADN extraído de cada una de las muestras. Las mezclas de 
reacción fueron sometidas a un programa de desnaturalización de la muestra y 
activación de la enzima a una temperatura de 95° C por 10 minutos. Seguido 
de un programa de 50 ciclos de amplificación por 5 segundos a 95° C, 10 seg. 
a 60° C, 15 seg. a 72° C. Una curva de desnaturalización para identificar el 
producto de la PCR derivado del ADN del VEB, con un programa de 1ciclo por 
20 segundos a 95° C, 20 seg. a 40° C, 0 seg. a 85° C con un incremento de la 
temperatura de 0.2° C/seg y en modo de adquisición de florescencia continuo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
19 
 
 
VI PLAN DE ANALISIS ESTADISTICO 
 
 
 
Se realizo estadística descriptiva utilizando Excel 2007. 
 
 
 
 
VII RESULTADOS 
 
De las 1052 muestras estudiadas, en 498 (47.3%) muestras de sangre total y 
en solamente 253 (24.05%) muestras de plasma, se detectó y se cuantificó la 
carga viral del VEB. 
 
 
 
FIGURA 1.-Detección positiva para carga viral de virus Epstein Barr 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
 
De las muestras de ST y de PL 554 (52.7%) y 799 (75.95%) muestras 
respectivamente, tuvieron un resultado negativo. 
 
 
 
 
 FIGURA 2.- Detección negativa para carga viral de virus Epstein Barr 
 
Se calcularon las frecuencias de las combinaciones posibles entre carga viral 
en ST y carga viral en PL, encontrándose la combinación siguiente: 
 
 ST negativo – PL negativo: 525 (49.9%) muestras. 
 ST negativo--PL positivo: se detectaron 29 muestras con un valor 
promedio de 364 copias/ml de PL y un intervalo que va de 100 a 1100 
copias/ml. 
 ST positivo – PL negativo: 274 (26.05%) muestras. 
 ST positivo – PL positivo: 224 (21.29%). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
21 
 
 
 
SANGRE TOTAL - PLASMA NUMERO DE MUESTRAS PORCENTAJE 
Negativo - Negativo 525 49.9% 
Negativo - Positivo 29 2.76% 
Positivo - Negativo 274 26.05% 
Positivo - Positivo 224 21.29% 
Totales 1052 100% 
 
 
 
De la combinación de sangre total y plasma positivas, se identificaron 99 
(9.41%) muestras de ST con carga viral de 5,000 copias/ml o más y valores 
menores a 100 copias/ml en PL, que significa un 9.41% del total de las 
muestras o un 44.2% de las 224 muestras. Con parámetros mas estrictos 
encontramos 56 (5.3%) muestras con valores de carga viral menores a 100 
copias/ml en PL y de 10,000 copias/ml o superiores en ST, además dentro de 
estas ultimas muestras existen 7 con valores en ST que van desde las 70,000 
hasta las 364,000 copias/ml. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TABLA 1.- Frecuencia de las combinaciones posibles entre carga viral en ST: sangre 
total y carga viral en PL: plasma. 
 
 
 
22 
 
 
 
VIII. DISCUSION 
En pacientes postrasplantados bajo terapia inmunosupresora y e pacientes 
inmunosuprimidos, el seguimiento de la infección por el VEB se tiene que 
realizar por medio de la carga viral en sangre total y plasma, y nos ayuda a la 
identificación temprana de los pacientes en riesgo de desarrollar la enfermedad 
activa causada por virus de Epstein Barr. 
No existen valores de corte en el estudio cuantitativo de carga viral para 
infección de VEB, que nos permitan identificar a los pacientes que lo van ha 
desarrollar, aunque algunos autores, han propuesto valores de pacientes que 
están en riesgo de padecerlo, como Wagner y cols. que proponen 5,000 
copias/µg de ADN extraído de células mononucleres de sangre periférica 
(CMSP) y valores en plasma superiores a 10,000 copias/ml, concluyendo que 
ambos tipos de muestra son útiles, para dar seguimiento a la infección por el 
VEB, en individuos inmunocompetentes e inmunosuprimidos, aunque al 
parecer el plasma tiene una especificidad superior (14). En cambio Orentas RJ 
y cols reportan que pacientes trasplantados con cargas virales de indetectable 
a 10,000 copias/µg ADN de CMSP son considerados como normales, con 
valores superiores a 20,000 copias/µg ADN de CMSP no parecen estar en 
riesgo letal inmediato por SLPT y con valores superiores a 100,000 copias/µg 
ADN de CMSP están claramente en alto riesgo de mortalidad asociada al 
trasplante (15). 
En este trabajo, hemos encontrado que el 9.41% de nuestras muestras con 
carga viral de 5,000 copias/ml o más y valores menores a 100 copias/ml en PL 
o el 5.3% de muestras con valores de carga viral menores a 100 copias/ml en 
PL y de 10,000 copias/ml o superiores en SP, además dentro de estas ultimas 
muestras existen 7 con valores en SP que van desde las 70,000 hasta las 
364,000 copias/ml. Pacientes que en caso de no haber hecho la determinación 
en sangre periférica hubiesen pasadoinadvertidos y con un alto riesgo de 
padecer el SLPT. 
 
 
 
 
23 
 
 
IX CONCLUSIONES 
En base a los resultados obtenidos a través de esta investigación, proponemos 
que para la valoración y tratamiento en pacientes inmunosuprimidos y pos 
trasplantados con alto riesgo de presentar SLPT, es necesario que el médico 
tratante cuente con los resultados de carga viral en sangre periférica y plasma 
con PCR en tiempo real para que con estos datos se tenga la evidencia 
necesarias que le permita modular la inmunosupresión y por lo tanto prevenir el 
desarrollo del SLPT, como lo reporta Lee TC y Cols. donde el propósito de su 
trabajo fue implementar un protocolo de seguimiento frecuente del VEB, en el 
que la carga viral del virus dirija la reducción de la inmunosupresión y con ello 
disminuir la incidencia de SLPT en sus pacientes (16). 
 
Observamos que tanto en la determinación en sangre total como en plasma se 
logra detectar la presencia de VEB, sin embargo es importante considerar que 
la cantidad de copias encontrada a través de muestras de plasma son mucho 
más bajas que las encontradas en sangre total, por lo que en base a este 
estudio sugerimos que el clínico debe tomar en cuenta que una cifra baja de 
capias de VEB en plasma no excluye al paciente de cursar con la enfermedad 
activa, debiendo tener siempre la determinación en sangre total para un mejor 
seguimiento de sus pacientes. 
Es necesaria la realización de más estudios para determinar los valores de 
corte en el estudio cuantitativo de carga viral para infección de VEB con PCR 
en tiempo real. 
 
 
 
24 
 
 
X ANEXOS 
 
HOJA DE RECOLECCION DE DATOS: 
 
 
 NO. DE 
MUESTRA 
NOMBRE DEL 
PACIENTE 
EDAD FECHA COPIAS DE 
VEB EN 
PLASMA 
COPIAS DE 
VEB EN 
SANGRE 
TOTAL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
25 
 
 
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javascript:AL_get(this,%20'jour',%20'Transpl%20Infect%20Dis.');
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