Determinacion-de-la-expresion-genica-y-actividad-enzimatica-de-la-quitinasa-en-el-pez-blanco-del-Lago-de-Patzcuaro-Menidia-estor-Jordan-1880

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
 
 
 
MAESTRÍA EN CIENCIAS DE LA PRODUCCIÓN 
Y DE LA SALUD ANIMAL 
 
 
 
DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA Y ACTIVIDAD 
ENZIMÁTICA DE LA QUITINASA EN EL PEZ BLANCO DEL LAGO 
DE PÁTZCUARO (Menidia estor JORDAN, 1880) 
 
 
TESIS 
PARA OBTENER EL GRADO DE 
MAESTRA EN CIENCIAS 
 
PRESENTA 
PATRICIA POHLS RAMÍREZ 
 
TUTOR: 
ARMANDO SHIMADA MIYASAKA 
 
COMITÉ TUTORAL: 
MARÍA OFELIA MORA IZAGUIRRE 
CARLOS ANTONIO MARTÍNEZ PALACIOS 
 
 
 
CUAUTITLÁN, IZCALLI 2010 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 I 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Acompaña tus sueños con las ansias, la voluntad y el esfuerzo, 
y se volverán hechos concretos, realidades que 
te llenarán de asombro y satisfacción” 
 
 II 
 
 
 
 
 
A Dios, que siempre ilumina mi camino… 
 
A papá y mamá por su amor incondicional… 
 
A Alberto por ser mi gran amigo y cómplice… 
 
A Juan por estar siempre a mi lado y nunca dejarme vencer… 
 
A mis queridos tíos, primos, sobrinos y abuelita por el cariño de siempre… 
 
 
 III 
AGRADECIMIENTOS 
 
Mi entera gratitud a la Universidad Nacional Autónoma de México, en especial a 
la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, por haberme permitido realizar 
mis estudios de posgrado. 
 
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca otorgada. 
 
A mi comité tutoral integrado por el Dr. Armando Shimada Miyasaka, la Dra. 
María Ofelia Mora Izaguirre y el Dr. Carlos Antonio Martínez Palacios. Ustedes 
han sido el núcleo más importante en mi formación académica y a quienes 
agradezco haber sido el timón que le dio dirección a este proyecto; espero haber 
cubierto sus expectativas como alumna. 
 
Al Dr. Armando por la asesoría y orientación durante su tutela. Su apoyo recibido 
fue no sólo académico sino también humano, y por ello le agradezco su amistad 
y el haber estado al pendiente en todos los aspectos. Gracias también por 
valorar el esfuerzo y alentarme siempre a ser una mejor estudiante y 
profesionista. 
 
A la Dra. Ofelia por haberme asesorado en el trabajo teórico y experimental a 
manos llenas. Le doy especiales gracias por su amistad y por dedicarme tiempo 
de calidad reflejado en sus enseñanzas, paciencia y disposición. Los consejos 
recibidos fueron una guía constante que me ayudó a alcanzar esta meta. 
 
Al Dr. Carlos por su asesoría y apoyo permanentes, agradeciendo sus enseñanzas 
acerca del maravilloso mundo de los peces. 
 
Igualmente gracias a la Dra. Mayra Toledo Cuevas y a la Dra. María Gisela Ríos 
Durán por su orientación y por compartir valiosa información científica que 
forma parte de este trabajo. A la Biol. María Antonia Herrera Vargas por su 
ayuda con las técnicas del laboratorio acuícola. A los Biols. Dafne Moreno 
Basurto y Jesús López García por compartir los conocimientos de su experiencia 
de campo; fue muy gratificante para mí el poder haber estado involucrada en las 
actividades diarias en el centro. Gracias a todo el equipo de investigación por su 
trato hospitalario durante mi estancia en el IIAF, de la UMSNH en Morelia. 
 
Al Instituto de Neurobiología de la UNAM, en especial al Dr. Alfredo Varela 
Echavarría jefe del laboratorio de Diferenciación Neural y Axogénesis, por 
brindarme el servicio y espacio donde se desarrolló la mayor parte de este 
proyecto. A la Dra. Anaid Antaramián y a la M.C. Adriana González Gallardo, en 
la Unidad de Proteogenómica, por la prestación de servicios de secuenciación y 
por el apoyo técnico recibido. 
 
 IV 
De igual forma, agradezco la participación activa de la M.C. Laura González 
Dávalos por la asesoría práctica de las técnicas de laboratorio de biología 
molecular. 
 
Gran agradecimiento a todos mis profesores, Dr. José Luis Romano Muñoz, Dr. 
Sergio Gómez Rosales, Dr. José Antonio Rentería Flores, Dr. Gerardo Mariscal 
Landín, Dra. Tercia Reiz de Sousa, Dr. Ricardo Basurto Gutiérrez, Dr. Juan de 
Dios Garza Flores, Dra. Teresa Peña Rangel y Dr. Enrique Piña Garza por su 
empeño en las clases impartidas. 
 
A los miembros del jurado, Dr. Felipe Ruiz López, Dr. Carlos Regalado González, 
Dra. Mayra Toledo Cuevas y Dra. María Teresa Viana Castrillón, quienes 
enriquecieron mi trabajo de tesis con sus valiosas aportaciones. 
 
A Leticia Díaz Jiménez, por su espíritu de servicio y facilitación de los trámites 
académicos en la Unidad de Posgrado, campus Ajuchitlán. 
 
A mis compañeros del laboratorio A-03, por hacer de éste un lugar agradable 
para trabajar. Agradezco su amistad y apoyo a lo largo del camino. Valoro mucho 
todas las actividades que realizamos juntos: el trabajo en equipo, la discusión de 
un tema, las exposiciones, las prácticas de campo, las comidas y celebraciones… 
en fin siempre un grupo muy unido, me llevo el mejor recuerdo de todo lo 
compartido. 
 
 V 
RESUMEN 
 
El presente trabajo pretende determinar la presencia de la quitinasa, su 
grado de expresión génica y actividad enzimática en el tubo digestivo del pez 
blanco, M. estor. Con esta finalidad se colectaron muestras de peces en las 
distintas fases de crecimiento. Para los ensayos experimentales los huevos y 
las larvas fueron procesados completos, mientras que los juveniles y adultos 
fueron sometidos a dos tratamientos in vivo: presencia o ausencia de 
antibiótico en el alimento. Esto para determinar si la actividad de la 
quitinasa, en caso de presentarse, estaba dada y en qué medida por la 
microflora intestinal. Tras el tratamiento se obtuvieron el intestino y el 
hepatopáncreas de los organismos, en los cuales se analizó tanto la expresión 
génica como la actividad de dicha enzima. La caracterización y cuantificación 
de la expresión de la quitinasa se determinaron mediante las técnicas de 
transcripción reversa – reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y PCR 
tiempo real (qPCR). Se obtuvo la secuencia parcial de la quitinasa del pez 
blanco (GenBank: FJ785521), la cual presenta homología con las secuencias 
reportadas para las quitinasas no acídicas de otras especies de peces. La 
actividad enzimática fue cuantificada mediante el monitoreo de la hidrólisis 
de tres substratos fluorogénicos de quitina. Los análisis de actividad 
enzimática revelaron una mayor hidrólisis para el substrato 4MU β-N-acetil-
glucosamina en comparación con el 4-MU N,N’-diacetil-β-D-quitobiosa y el 4-
MU β-D-N,N’,N’’-triacetilquitotriosa. La actividad quitinasa en los huevos de 
pez blanco, para los tres diferentes substratos fue de 3407, 190, y 153 U/mg 
respectivamente (P<0.01), y en las larvas fue de 3183, 206, y 334 U/mg, 
respectivamente (P<0.01). En los juveniles tratados con antibiótico, la 
actividad enzimática en intestino y en hepatopáncreas (1009 y 3348 U/mg 
respectivamente, P<0.01) fue menor que en los animales no tratados (3602 y 
27437 U/mg respectivamente, P<0.01) para el substrato 4MU β-N-acetil-
glucosamina; no se encontraron diferencias significativas para los otros dos 
substratos. Probablemente el antibiótico disminuyó la actividad quitinasa 
debido a la eliminación de las bacterias en el intestino y/o a una acción 
tóxica en el hepatopáncreas en esta etapa juvenil. En los adultos se observó 
el patrón enzimático contrario, los animales tratados tuvieron una actividad 
quitinasa mayor en intestino y hepatopáncreas (206 y 477 U/mg, 
respectivamente, P<0.01) en comparacióncon los no tratados (169 y 330 
U/mg, respectivamente, P<0.01) para el substrato 4MU β-N-acetil-
glucosamina; no se encontraron diferencias significativas para los otros dos 
substratos. Los resultados sugieren que el antibiótico pudiera tener un efecto 
sobre la quitinasa en los órganos digestivos del pez blanco, alterando la 
síntesis de la enzima, interactuando con uno o más factores de transcripción, 
cuya actividad se correlaciona con la expresión génica in vivo. 
 
Palabras clave: pez blanco, quitinasa, antibiótico, expresión génica, actividad 
enzimática. 
 VI 
ABSTRACT 
 
The present work pretends to determine the presence, expression and 
enzymatic activity of the chitinase in the digestive tract of the pike silverside, 
M. estor. Fish samples were collected from different life stages. For the 
experimental assays the eggs and larvae were processed whole, while 
juveniles and adults were maintained in the presence or absence of antibiotic 
in food prior to sacrifice and then the intestines and the hepatopancreas were 
excised. This was done in order to determine if the chitinase activity was due, 
or at least partially, to microfloral presence. Chitinase characterization and 
gene expression quantification was done by reverse transcription-polymerase 
chain reaction (RT-PCR) and real-time PCR (qPCR) techniques. A partial 
chitinase sequence was cloned (GenBank: FJ785521), which presents 
homology with non acidic chitinase sequences reported for other fish species. 
Enzyme activity was assayed by monitoring the hydrolysis of three fluorogenic 
chitin substrates. Analysis of the enzymatic activity showed that 4-MU N-
acetyl-β-D-glucosaminide was the substrate most catalyzed by chitinase, in 
comparison to 4-MU N,N’-diacetyl-β-D-chitobioside and 4-MU β-D-N,N’,N’’-
triacetylchitotriose. For eggs, chitinase activity for the three same substrates 
was 3407, 190, and 153 U/mg respectively (P<0.01) and for larvae was 3183, 
206, and 334 U/mg respectively (P<0.01). In antibiotic-treated juveniles, 
enzymatic activity in intestines and hepatopancreas (1009 and 3348 U/mg 
respectively, P<0.01) was lower than that in untreated animals (3602 and 
27437 U/mg respectively, P<0.01) for the 4-MU N-acetyl-β-D-glucosaminide 
substrate; no significant differences were found for the other two susbstrates. 
The antibiotic treatment probably reduced the chitinase activity due to 
elimination of chitinolytic bacteria in the intestine and/or to toxicity in the 
hepatopancreas at this juvenile stage. In adults an opposite enzymatic 
pattern was observed, antibiotic treatment did not decrease the activity in 
the intestines and hepatopancreas (206 and 477 U/mg, respectively, P<0.01) 
as it was even lower in untreated animals (169 and 330 U/mg, respectively, 
P<0.01) for the 4-MU N-acetyl-β-D-glucosaminide substrate; no significant 
differences were found for the other two susbstrates. These results suggest 
that the antibiotic could have an effect on chitinase in digestive organs of 
pike silverside, altering synthesis mechanisms and interacting with one or 
more transcription factors, which activity correlates with gene expression in 
vivo. 
 
 
 
 
 
 
 
Keywords: pike silverside, chitinase, antibiotic, gene expression, enzimatic 
activity. 
 VII 
CONTENIDO 
 
1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1 
 1.1 Los peces blancos 1 
 1.1.1 Origen y evolución 1 
 1.1.2 Distribución geográfica 3 
 1.1.3 El pescado blanco en la cultura Purépecha 4 
 1.1.4 Situación actual del Lago de Pátzcuaro 6 
 1.2 Clasificación taxonómica 8 
 1.3 Etapas del desarrollo 8 
 1.3.1 Huevo 8 
 1.3.2 Larva 9 
 1.3.3 Juvenil 10 
 1.3.4 Adulto 11 
 1.4 Aparato digestivo 12 
 1.4.1 Morfología del aparato bucofaríngeo 12 
 1.4.2 Morfología e histología del tubo digestivo 13 
 1.5 Alimentación 14 
 1.6 Particularidades del metabolismo en peces 15 
 1.6.1 Metabolismo de energía 15 
 1.6.2 Metabolismo de carbohidratos 16 
 1.7 Los carbohidratos 18 
 1.7.1 Clasificación de los carbohidratos 18 
 1.7.2 Azúcares 19 
 1.7.3 No azúcares 21 
 1.7.3.1 La quitina 21 
 1.8 Enzimología digestiva en peces 23 
 1.8.1 Enzimas glucolíticas en peces 24 
 1.8.2 Enzimas quitinasas en peces 25 
2. JUSTIFICACIÓN 28 
 VIII 
3. HIPÓTESIS 29 
4. OBJETIVOS 30 
5. MATERIALES Y MÉTODOS 31 
 5.1 Metodología experimental general 31 
 5.2 Animales 32 
 5.2.1 Anestesia 33 
 5.2.2 Disección de órganos 34 
 5.2.3 Muestreo 34 
 5.2.3.1 Protocolos de muestreo 35 
 5.3 Tratamientos 36 
 5.3.1 Dosis de antibiótico 36 
 5.3.2 Preparación del alimento con antibiótico 36 
 5.3.2.1 Alimento inerte 37 
 5.3.2.2 Alimento vivo 37 
 5.4 Ensayos de expresión génica 38 
 5.4.1 Purificación del RNA total 38 
 5.4.2 Identificación de la expresión del gen quitinasa mediante 
 RT-PCR 
39 
 5.4.3 Cuantificación de la expresión del gen quitinasa mediante 
 qPCR 
41 
 5.4.3.1 Curvas de calibración para qPCR 42 
 5.5 Ensayos de actividad enzimática 44 
 5.5.1 Preparación de reacciones enzimáticas y medición fluorométrica 45 
6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 47 
7. RESULTADOS 49 
 7.1 Ensayos de expresión génica 49 
 7.1.1 Purificación del RNA total 49 
 7.1.2 Identificación de la expresión del gen quitinasa mediante 
 RT-PCR 
49 
 7.1.3 Secuenciación de los productos de PCR 51 
 7.1.4 Cuantificación de la expresión del gen quitinasa mediante 52 
 IX 
 qPCR 
 7.2 Ensayos de actividad enzimática 56 
8. DISCUSIÓN 59 
9. CONCLUSIONES 65 
10. ANEXOS 66 
11. BIBLIOGRAFÍA 76 
 
 X 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura Pág. 
 1 Pescador con red mariposa en el lago de Pátzcuaro. 
 
4 
 2 A) Pescado blanco B) Charalitos 
 
5 
 3 A) Huevo fértil de M. estor; se observan los hilos de adhesión. 
B) Embriones de M. estor; se aprecian los ojos bien desarrollados y la 
gota de aceite. 
 
9 
 4 Adulto de M. estor; se muestra tubo digestivo en relación a la longitud 
corporal total. 
 
13 
 5 Representación esquemática de las cadenas de (a) celulosa; (b) quitina 
totalmente acetilada. 
 
22 
 6 Metodología experimental general. 
 
31 
 7 Análisis electroforético en gel de agarosa al 1%. A) RNA de 
hepatopáncreas sin antibiótico de juveniles de M. estor. B) cDNA de 
hepatopáncreas sin antibiótico de juveniles de M. estor. 
 
49 
 8 Producto de PCR de intestino sin antibiótico de adulto de M. estor 
 
50 
 9 Alineación de la secuencia parcial de aminoácidos de quitinasa de M. 
estor con las quitinasas de otros peces. 
 
51 
 10 Curva de calibración de quitinasa. 
 
52 
 11 Curva de calibración de actina. 
 
53 
 12 Actividad enzimática de la quitinasa en huevecillos de M. estor. 
 
56 
 13 Actividad enzimática de la quitinasa en larvas de 30 días de M. estor. 
 
56 
 14 Actividad enzimática de la quitinasa en intestinos de juveniles de 90 días 
de M. estor. 
 
57 
 15 Actividad enzimática de la quitinasa en hepatopáncreas de juveniles de 
90 días de M. estor. 
 
57 
 16 Actividad enzimática de la quitinasa en intestinos de adultos de M. 
estor. 
 
58 
 17 Actividad enzimática de la quitinasa en hepatopáncreas de adultos de M. 
estor. 
 
58 
 XI 
LISTA DE CUADROS 
 
Cuadro Pág. 
1 Protocolo de muestreo para determinar la expresión génica 
 
35 
2 Protocolo de muestreo para determinar la actividad enzimática 
 
35 
3 Código Degenerado Universal 
 
40 
4 
 
Homología secuencias quitinasa 52 
5 Curva Quitinasa 
 
52 
6 Curva Actina 
 
53 
7 Unidades de expresión relativade huevos y larvas 
 
54 
8 Unidades de expresión relativa de intestino de juveniles 
 
54 
9 Unidades de expresión relativa de hepatopáncreas de juveniles 
 
54 
10 Unidades de expresión relativa de intestino de adultos 
 
55 
11 Unidades de expresión relativa de hepatopáncreas de adultos 55 
 
 
 
 1 
1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 
 
1.1 Los peces blancos 
 
1.1.1 Origen y evolución 
 
Debido a su posición biogeográfica y su compleja historia geológica, México 
posee una fauna muy extensa (1). Esta gran diversidad es el resultado de la 
notable variabilidad de hábitats y climas presentes en el territorio mexicano, 
donde la dinámica historia geológica a lo largo de la costa del Pacífico, contrasta 
marcadamente con la relativa estabilidad de la costa Atlántica (2). 
 
Como resultado del activo vulcanismo y los procesos orogénicos en el pasado, se 
ocasionó la división de hábitats acuáticos en la Mesa Central del país o Altiplano 
mexicano. Esta actividad volcánica dio como resultado la fragmentación y 
aislamiento genético de poblaciones nativas, dando lugar a eventos de 
especiación local y a un alto grado de endemismo (1). 
 
La Mesa Central fue asiento de un proceso evolutivo relativamente reciente que 
devino en la existencia de varias especies nativas que conforman la ictiofauna 
dulceacuícola (3). Un notable ejemplo son los peces del género Menidia (antes 
Chirostoma), de la familia de los atherinópsidos, los cuales han contribuido en un 
alto grado (66%) al endemismo de la región (1). 
 
Espinoza-Pérez y cols. consideran que la mayor parte de los peces continentales 
en México tienen origen oceánico (4). La familia de peces Atherinopsidae integra 
a especies neotropicales de origen principalmente marino o estuarino (150-160 
especies), aunque existen algunas especies de agua dulce. El género Menidia está 
restringido a los hábitats dulceacuícolas en los lagos del Altiplano mexicano. 
Estas especies probablemente se originaron y aislaron a partir de ancestros 
estuarinos migratorios y retuvieron características de eurialinos (5). 
 
 2 
“Barbour ha propuesto que los ancestros de los peces del género Menidia eran 
similares a la especie actual M. beryllina y que penetraron a territorio mexicano 
a través de los sistemas marinos que ocuparon zonas que en la actualidad han 
emergido. Se ha asumido que los ancestros de este grupo invadieron el sistema 
fluvial Lerma-Santiago-Chapala a partir del Terciario” (4). 
 
El género Menidia está integrado por 18 ó 19 especies y 6 subespecies, así mismo 
dividido en dos grupos: el grupo Arge y el grupo Jordani. Al grupo Arge 
pertenecen peces pequeños llamados comúnmente charales, de 6 a 15 gramos y 
menos de 10 centímetros de longitud, y al grupo Jordani los llamados peces 
blancos de tallas grandes, de entre 200 y 300 gramos y 20 centímetros de largo 
(8). 
 
Una de las especies más primitivas según sus características de pigmentación y 
dentición es Chirostoma humboldtianum y ha sido considerada filogenéticamente 
como el posible ancestro que dio origen a las especies de mayores dimensiones 
del género Menidia (6). El pez blanco del Lago de Pátzcuaro, Menidia estor, 
pertenece al subgrupo de especies “humboldtianum” del grupo Jordani (4). 
 
Aunque las especies difieren en tamaño son muy similares entre sí y, debido a la 
alta plasticidad del grupo y la posible hibridación entre especies, su taxonomía 
no está completamente resuelta. A pesar de que Barbour sistematizó y ordenó la 
filogenia de las especies del género Menidia, proponiendo una clave taxonómica, 
existen características entre éstas que se sobreponen (7). “Ésto es un obstáculo 
para la realización de los estudios biológico pesqueros que permitan conocer 
específicamente el estado actual de las poblaciones de pescado blanco y su 
dinámica, de manera que se proyecten medidas para su mejor administración y 
conservación” (3). 
 
Los estudios realizados con el género Menidia se han centrado en su morfología, 
sin embargo la investigación acerca de su ecología, distribución y genética es 
 3 
imprescindible para solucionar los problemas de su identificación y comprender 
su evolución (1). 
 
 
1.1.2 Distribución geográfica 
 
Las especies y subespecies del género Menidia habitan los lagos situados a lo 
largo del eje neo-volcánico transversal mexicano. La distribución natural del 
género abarca los Estados de Michoacán, Jalisco, Nayarit, Aguascalientes, México 
y Guanajuato (3). 
 
“El lago de Pátzcuaro es localidad tipo de tres especies de charal, M. 
grandocule, M. attenuatum y M. patzcuaro y una subespecie de pescado blanco, 
M. estor estor” (3). 
 
En el lago de Zirahuén, se encuentra una subespecie de charal, M. attenuatum 
zirahuen y una de pescado blanco, M. estor copandaro (3). 
 
Sin embargo ha habido translocaciones de especies de pescado blanco entre 
lagos, tal es el caso de los lagos de Pátzcuaro y Zirahuén. En el lago de Pátzcuaro 
actualmente se encuentran poblaciones de C. humboldtianum incluso en mayor 
abundancia que el M. estor estor nativo, así como de M. lucius y M. estor 
copandaro (3). 
 
Del lago de Chapala son nativas el mayor número de especies de este género, con 
seis de charales, M. jordani, M. chapalae, M. labarcae, M. arge, M. consocium y 
M. contrerasi y tres de pescado blanco M. lucius, M. sphyraena y M. promelas 
(3). 
 
Las especies del Alto Lerma son C. humboldtianum, M. riojai, y M. jordani (6). 
La de más amplia distribución natural es quizá C. humboldtianum, ya que tiene 
como lugares de origen la laguna de Zacapu, el río Lerma, los lagos del Valle de 
México, los lagos Santa María y San Pedro Lagunillas en Nayarit y el lago 
 4 
Juanacatlán en Jalisco (3). Sin embargo, actualmente debido a la fuerte 
restricción en su distribución, debe considerarse en alto riesgo, pues sólo se le 
encuentra en dos localidades. M. jordani también tiene una amplia distribución; 
llama la atención que todavía existe en el Distrito Federal en los canales de 
Xochimilco (6). 
 
 
1.1.3 El pescado blanco en la cultura Purépecha 
 
Aunque el término de “pescado blanco” se aplica de manera general a las 
especies del género Menidia que alcanzan tallas mayores de 20 cm (3) es, de 
manera particular, a Menidia estor a la que se le conoce localmente como “pez 
blanco”. 
 
El pez blanco ha sido por siglos la base de la pesca artesanal de las comunidades 
indígenas ribereñas e isleñas en el Lago de Pátzcuaro, localizado en el estado de 
Michoacán y que en lengua náhuatl significa “lugar de pescadores”. Ver figura 1. 
 
 
 
 
Figura 1. Pescador con red mariposa en el lago de Pátzcuaro. 
 
 
“Kurucha urápiti es el nombre que recibe el pez blanco en la región lacustre de 
Pátzcuaro en el idioma purépecha. Recibe este nombre por las características de 
color y apariencia del pez vivo y de su carne blanca en el plato” (3). 
 5 
 
Los pescadores del lago lo diferencian de los chacuami y charari, o charales, 
especies pertenecientes a la misma familia pero que presentan una talla menor. 
La talla máxima del pescado blanco hasta hace algunos años llegaba a los 42 cm 
de longitud total (3). Ver figura 2. 
 
 A B 
 
Figura 2. A) Pescado blanco B) Charalitos 
 
 
“En el lago de Pátzcuaro, las especies de pescado blanco y la cultura purépecha 
constituyen un binomio cuyo origen se remonta a la llegada de los primeros 
pobladores a esta región. Por tratarse de especies nativas, sus pesquerías se han 
desarrollado formando parte consustancial de lo purépecha, estas especies 
caracterizan la zona y son elementos indispensables de lo pesquero” (3). 
 
Los peces blancos tienen una enorme importancia cultural, económica y 
alimenticia para los pobladores de estos lagos, y muchas familias dependen en 
forma casi exclusiva de su pesca (5, 8). 
 
Sin embargo, en las últimas décadas se ha visto cómo las pesquerías deestas 
especies van en clara disminución debido al gran deterioro de su entorno en el 
lago de Pátzcuaro (9). “Esta situación pone en peligro su permanencia, en lo que 
según Toledo y Argueta constituyen hoy el único relicto de la cultura lacustre de 
Mesoamérica” (3). 
 
 6 
1.1.4 Situación actual del lago de Pátzcuaro 
 
La reducción pesquera y la pérdida de la biodiversidad acuícola se atribuye a 
diversas causas, entre ellas a la falta de regulación pesquera que ha prevalecido 
desde sus inicios. Las poblaciones de peces en el lago de Pátzcuaro han estado 
sujetas bajo un régimen de explotación a libre acceso, lo que ha generado una 
gran presión de pesca. Así mismo, el uso de técnicas de captura y artes de pesca 
tan poco selectivas, como el chinchorro de arrastre, hacen que se capturen 
peces de todas las tallas, incluyendo estados juveniles de peces blancos, los 
cuales son confundidos y comercializados como charales (3). 
 
Por otro lado, la introducción de especies no nativas al lago ha perjudicado a las 
poblaciones endémicas. En la mayoría de los cuerpos de agua del país se han 
hecho introducciones principalmente de especies de carpa común (Cyprinus 
carpio) y de tilapia (Oreochromis spp) o mojarra africana, que poseen alta 
fecundidad y rápido crecimiento. Las carpas son particularmente nocivas para las 
poblaciones de pescado blanco ya que consumen sus huevos. Otra especie 
exótica depredadora es la lobina negra (Micropterus salmoides), voraz carnívora 
cuyo amplio espectro de alimentación incluye charales y pescado blanco (3). 
 
Otro grave problema es la alteración o desaparición de hábitats. “En efecto, el 
lago de Pátzcuaro enfrenta actualmente una grave crisis producto de una 
compleja serie de actividades antropogénicas que se dan a su alrededor. El lago 
constituye el nivel base de la cuenca y todo lo que en ella suceda, lo afecta 
irremisiblemente” (3). 
 
“La tala inmoderada en los bosques de la cuenca ha provocado una tasa de 
deforestación de 44.9 % de 1963 a 1990. Efecto de la deforestación es el arrastre 
de la capa de suelo y terrígenos hacia el nivel base de la cuenca, produciendo un 
azolve en el lago estimado en 85,000 m3 /año” (3). El efecto de azolve ha 
 7 
provocado que la zona sur del lago pierda profundidad y superficie, y por 
consecuencia se pierdan zonas naturales de reproducción y crianza (8). 
 
El crecimiento desmedido de los aprovechamientos del agua en la cuenca, como 
la extracción del manto freático para las actividades urbanas, agrícolas e 
industriales de la zona, ha traído desequilibrios y ocasionado la escasez del 
recurso. 
 
La liberación de desechos de las áreas urbanas de las cabeceras municipales de 
Pátzcuaro, Quiroga, Tzintzuntzan y Erongarícuaro, así como de pesticidas de la 
agricultura y otros residuos, provocan la contaminación del agua en un vaso que 
no tiene más aporte de agua limpia que la precipitación pluvial y algunos 
escurrimientos superficiales y subterráneos por tratarse de una cuenca cerrada o 
“endorreica”; a la que escurren las aguas de lluvia, a manera de cubeta, pero no 
salen de ella. A esta condición se suma un estado de eutrofización creciente 
(invasión de la vegetación emergente) durante las últimas décadas (3). 
 
Por todo esto, las poblaciones de pez blanco han disminuido drásticamente en los 
últimos años, colocando a varias especies del género en un estatus de amenaza 
en términos de la clasificación de la IUCN (International Union for Conservation 
of Nature) en la lista roja de especies amenazadas (10), así como en el listado de 
la Norma Oficial Mexicana NOM-ECOL-059 de especies en riesgo (11). 
 
En efecto, en Pátzcuaro, de acuerdo con las cifras del Instituto Nacional de 
Pesca, cuando en 1981 se produjeron 136 toneladas de pez blanco, para 1996 el 
rendimiento fue de 13 toneladas, y en 1999 se registraron sólo 4. En 2000 
representó sólo el 1% de la producción total del lago (3,12). 
 
Sin embargo los peces blancos siguen siendo muy valorados en el mercado local y 
regional, colocándose como la especie de mayor valor comercial en la República 
Mexicana. La demanda turística por estos peces ha hecho que el precio por 
 8 
 
kilogramo sea bastante alto, pues se llega a pagar hasta 80 dólares por un kilo de 
peces grandes de 200 a 250 gramos (9). 
 
Una alternativa para recuperar las poblaciones del pez blanco, así como para 
crear fuentes de ingresos para los pescadores de la zona, es la implementación 
de su cultivo, mediante el uso de técnicas de repoblación y explotación, que 
permitan llevarlas a una producción por acuicultura, teniendo en cuenta que 
existe un mercado insatisfecho en la región, que tiene un amplio potencial a 
nivel internacional (8, 9). 
 
1.2 Clasificación taxonómica
 
 
Reino: Animal 
Subreino: Bilateria 
Rama: Deuterostomia 
Infrareino: Chordonia 
Filo: Chordata 
Subfilo: Vertebrata 
Infrafilo: Gnathostomata 
 
 
 
 
 
Superclase: Pisces 
Clase: Osteichthyes 
Subclase: Actinopterygii 
Orden: Atheriniformes 
Suborden: Atherinoidei 
Familia: Atherinopsidae 
Subfamilia: Menidiinae 
Tribu: Menidiini 
Género: Menidia 
Especie: estor 
 
Nombre común: pez blanco de 
Pátzcuaro (pike silverside) 
1.3 Etapas del desarrollo 
 
1.3.1 Huevo 
 
Los huevos de M. estor son esféricos, traslúcidos y de color ámbar, y su tamaño 
oscila entre 0.9 y 1.2 mm de diámetro. Poseen características de huevos 
pelágicos muy pequeños, como es el caso de los peces marinos, los cuales poseen 
de 6 a 9 hilos adherentes permitiéndoles adherirse entre ellos y anclarse a la 
 9 
vegetación. Además son muy resistentes a fuerzas mecánicas y tienen la 
capacidad de sobrevivir fuera del agua por lo menos 10 minutos. Los huevecillos 
poseen una cantidad limitada de vitelo, acompañada de lóbulos de aceite, que 
funciona como reserva energética y que es consumido durante el desarrollo 
larvario. Los huevos fertilizados tardan de 7 a 8 días en eclosionar, a 25°C (5, 
13). Ver figura 3. 
 
Los embriones de M. estor tienen un adecuado desarrollo en agua con una 
salinidad del 5-10‰ (partes por mil). Salinidades mayores del 15‰ generan un 
cambio osmótico progresivo en los huevos, generando una alta mortalidad. 
También se ha encontrado que una salinidad mayor del 10‰ evita la parasitosis 
de hongos del género Saprolegnia, que ataca al pez en todos sus estadíos (14). 
 
 A B 
 
 Figura 3. A) Huevo fértil de M. estor; se observan los hilos de adhesión. 
B) Embriones de M. estor; se aprecian los ojos bien desarrollados y la gota de aceite. 
 
1.3.2 Larva 
 
Las larvas recién eclosionadas miden entre 4.5 y 5 mm de longitud y son 
transparentes. Poseen un extraordinario desarrollo de los ojos, fuertemente 
pigmentados de negro, que se hace patente en su habilidad de captura de presas 
al nacimiento. Poseen una línea de cromatóforos negros que recorre todo lo largo 
del cuerpo, muy cerca del borde ventral. La cabeza es más pequeña en 
comparación con la longitud del cuerpo, abarcando la mayor parte de la región 
caudal o post-anal. Los miómeros son muy aparentes y no presentan escamas. Se 
 10 
observa una conspicua vesícula biliar de color verde pálido a verde intenso, lo 
cual es una inconfundible señal de inanición antes de tomar su primer alimento 
(5,8). 
 
Durante los primeros días después de la eclosión las larvas sufren distintos 
cambios morfológicos. “La apertura de la boca aumenta y presenta un 
movimiento constante. El saco vitelino disminuye notablemente, la vejiga 
gaseosa aparece en forma de burbuja semiesférica y los otolitos se vuelven muy 
aparentes” (5). 
 
El desarrollo larval se puede dividir en dos estadíos; el prelarval y el postlarval. 
La prelarva, a la que los pescadores llaman “cría”, se distingue por el saco 
vitelino; éste es reducido y presenta gotas de aceite incoloras que les permite 
alimentarse durante los primeros días de vida(alimentación endógena). La 
postlarva inicia durante la reabsorción del saco vitelino hacia el tercer o cuarto 
día después de la eclosión. A partir de este momento, en el que al pez se le 
conoce como “alevín” o cría mayor”, el organismo no sufre ya ninguna 
metamorfosis y todas las larvas de Menidia spp. son muy parecidas entre sí, 
pigmentándose más densamente y adquiriendo después las escamas (5). 
 
El mejor crecimiento y la mayor supervivencia para el cultivo de larvas es una 
temperatura de 25°C en salinidades de 10 y 15 ‰ (13, 14). 
 
1.3.3 Juvenil 
 
No se ha definido con exactitud la duración del período larvario en M. estor, sin 
embargo se considera que a partir de los 65 mm de longitud comienza la etapa 
juvenil temprana, fase en la que el pez es todavía muy pequeño pero ya está 
completamente formado y continuará creciendo sin experimentar otras 
transformaciones importantes hasta llegar a la etapa adulta (Ríos-Durán; 
comunicación personal). 
 
 11 
La tasa de crecimiento (TC) y ganancia de peso diaria (GDP) son variables y 
dependen de muchos factores tales como densidad de cultivo, temperatura, 
alimentación, estrés, etc. En condiciones experimentales, juveniles de M. estor 
(peso inicial de 1 g) alimentados ad libitum con nauplios de artemia enriquecidos 
durante 3 meses, cultivados a una densidad de 1 pez por litro a una temperatura 
de 25°C y una salinidad de 5‰, con un fotoperíodo 12hLuz/12hOscuridad; 
alcanzaron tasas de crecimiento de 1.29 %/día y un peso ganado de 221.0 %, 
ganando 27.78 mg/día (Ríos-Durán; comunicación personal). 
 
1.3.4 Adulto 
 
M. estor posee un cuerpo delgado, alargado e hidrodinámico; tiene una banda 
longitudinal ancha y plateada. La cabeza es alargada y recubierta de escamas. La 
boca es protráctil, marcadamente más saliente de la mandíbula inferior, con 
dientes pequeños e inclinados hacia dentro. Posee escamas cicloideas y con 
borde dentado; la parte dorsal del cuerpo esta cubierta por un poco de 
pigmentación de color verde claro y el vientre de color blanco (15, 16). 
 
Es una especie ovípara, que desova todo el año, pero con mayor intensidad en el 
periodo comprendido entre marzo y junio. Los desoves ocurren a las orillas del 
lego con suave declive, a una profundidad de 25 a 30 cm; sobre algas 
filamentosas que proporcionan un sustrato ideal para la fijación de los 
huevecillos y buena oxigenación por el continuo movimiento del agua. Cada 
hembra silvestre madura de M. estor, de alrededor de 300 g de peso, produce de 
15,000 a 20,000 huevecillos en promedio. Después de la temporada de desove, 
los adultos regresan a aguas profundas sin construir ninguna clase de nido ni 
presentar algún tipo de hábito parental (5). 
 
Los adultos llegan a la madurez gonádica en aproximadamente un año con tallas 
que oscilan entre los 12 y 15 centímetros de longitud total. En cautiverio, las 
 12 
hembras con peso de 150 a 200 g ponen de 800 a 1,500 huevecillos (5). La 
proporción sexual es de tres a cuatro machos por cada hembra (3). 
 
Anteriormente se creía que no presentaban dimorfismo sexual, sin embargo un 
estudio reciente revela que es posible diferenciar el género. La diferencia radica 
en la longitud de la aleta pélvica; en hembras es generalmente corta mientras 
que en machos llega hasta el poro genital (Martínez-Chávez; comunicación 
personal). 
 
El fotoperiodo controlado ha resultado una técnica muy provechosa para lograr 
desoves continuos, utilizando una alta frecuencia de iluminación (17,18,19). 
 
 
1.4 Aparato digestivo 
 
Los estudios de las estructuras anatómicas alimentarias, el tubo digestivo, y los 
contenidos gástricos se han utilizado frecuentemente como guía para determinar 
los hábitos alimenticios de una especie (10). 
 
1.4.1 Morfología del aparato bucofaríngeo 
 
M. estor tiene una boca pequeña, en posición terminal y protráctil, con una 
abertura máxima de 22 mm en organismos adultos. El maxilar superior presenta 
tres filas de dientes cónicos unicúspides mientras que el maxilar inferior 
presenta cuatro, los cuales son pequeños y frágiles. Posee dientes faríngeos 
agudos monocúspides dorsales y ventrales. La faringe está constituida por 
branquiespinas ornamentadas y arcos branquiales ornamentados con espículas, 
diseñadas para la filtración y consumo de pequeñas partículas, lo que lo 
convierte en un sistema complejo de filtración. Estas evidencias sugieren que los 
peces blancos son organismos zooplanctófagos eurifagos, que en etapas adultas 
puede consumir ocasionalmente organismos más grandes como astácidos y 
pequeños peces (9, 10) 
 
 13 
1.4.2 Morfología e histología del tubo digestivo 
 
El tracto digestivo consiste de una estructura circular simple, el esófago está 
formado por un tubo corto y musculoso, el cual presenta un epitelio mucoso 
ligeramente plegado y estratificado en su parte anterior, sin embargo en la parte 
posterior se encuentra solamente estratificado. Las células epiteliales contienen 
sustancias mucosas en el citoplasma y la submucosa está constituida de tejido 
conectivo más denso que la lámina propia (9, 10). 
 
El pez banco es una especie agástrica, es decir, carece de estómago o de algún 
tipo de ensanchamiento o incremento muscular del tubo digestivo y tampoco 
presenta evidencia histológica de alguna mucosa glandular. No presenta válvula 
pilórica ni ciegos pilóricos (9, 10). El intestino es muy corto; está formado por 
tres regiones: una parte anterior, posterior y el recto. El intestino tiene una 
proporción de 0.7 la longitud del cuerpo, característico de un carnívoro (8). Ver 
figura 4. 
 
 
 
Figura 4. Adulto de M. estor; se muestra tubo digestivo en relación a la longitud corporal total. 
 
 
A lo largo del tubo digestivo del pez blanco adulto el pH oscila entre neutro y 
alcalino; se mantiene entre 6.5 en la sección anterior y 8.0 en la parte media y 
posterior (5). Posee una alta actividad proteolítica alcalina de tipo tripsina y 
quimotripsina más que de tipo pepsina (20). 
 
 14 
Debido a que no tiene estómago el pez blanco tiene poca capacidad en el tracto 
digestivo para almacenar alimento, hecho que lo convierte necesariamente en un 
consumidor frecuente, lo cual no es extraño en una especie zooplanctófaga (9). 
 
En la parte anterior del tracto digestivo se encuentran los conductos biliares, los 
cuales son análogos con el duodeno y se encuentran antes de la curvatura 
intestinal. La parte posterior del intestino, es más muscular después de la 
curvatura. La mucosa intestinal está formada por una lámina simple de células 
epiteliales columnares que contienen células globulares dispersas. Los dobleces 
de la mucosa, son profundos en todo lo largo del intestino hasta llegar al recto 
en donde los dobleces son más someros. El recto está constituido por capas 
musculares gruesas (9, 10). 
 
En los peces blancos, el páncreas se encuentra infiltrado dentro del tejido 
hepático, constituyendo lo que se conoce como hepatopáncreas. Es de color 
pardo rosáceo, en forma de triángulo no lobulado, más o menos friable y ocupa 
gran parte de la cavidad abdominal. Posee además una vesícula biliar de 
secreción abundante. Tanto los conductos biliares como el conducto pancreático 
vierten en el conducto colédoco que desemboca en el duodeno. 
 
 
1.5 Alimentación 
 
Las especies de pescado blanco varían su alimentación a lo largo de su vida, 
según la disponibilidad de alimento. En estado larvario se alimentan de 
organismos de las comunidades de pequeños insectos y crustáceos que habitan 
alrededor de las plantas acuáticas (perifiton), como de los animales minúsculos 
que viven en el fango del fondo cercano a las orillas (bentos litoral). Conforme 
crecen y llegan a juveniles van cambiando su dieta alimentándose 
preferentemente de larvas y pupas de chironómidos (moscos) y zooplancton 
como: ostrácodos, cladóceros y copépodos. De adultos se alimentan 
 15 
principalmentede peces (ictiófago incluso de su misma especie) complementado 
con insectos y crustáceos del perifiton como anfípodos y decápodos como el 
acocil (3). Sin embargo Martínez et al., sostienen que son de hábitos filtradores 
zooplanctófagos con base en el estudio de su anatomía bucofaríngea, 
describiéndola como estructuras especializadas para filtrar organismos del 
plancton (3, 10). 
 
 
1.6 Particularidades del metabolismo en peces 
 
1.6.1 Metabolismo de energía 
 
El metabolismo energético de los peces es diferente al de los animales 
terrestres. En contraste con los animales homeotermos, los peces son organismos 
Pctodérmicos; por lo que no tienen que gastar energía en el mantenimiento de la 
temperatura corporal a un valor más elevado que el ambiente. Asimismo, debido 
a su habilidad natural de flotación, los peces necesitan menos energía que los 
animales terrestres para mantener su posición en el agua. Consecuentemente los 
requerimientos energéticos para el mantenimiento de organismos acuáticos es 
mucho más bajo que el de los animales terrestres (21). 
 
Los animales terrestres son organismos urotélicos ya que deben convertir el 
amoníaco (producto final del metabolismo proteínico) a substancias menos 
tóxicas (por ejemplo, urea o ácido úrico) antes de su excreción. Los peces son 
organismos amoniotélicos, es decir, eliminan el amoniaco de la sangre a través 
de las branquias, gracias al gran volumen de agua que pasa a través de éstas. 
Debido a esto son capaces de obtener un 10-20% más de energía a partir del 
catabolismo de proteínas. Por lo tanto, la excreción de los desechos nitrogenados 
requiere menos energía en los animales acuáticos en comparación con los 
terrestres (21). 
 
 16 
Los requerimientos de energía para los peces están establecidos para pocas 
especies. La cantidad de energía que requieren los peces depende 
principalmente de la especie, la etapa de vida, el tamaño del animal, el estado 
fisiológico, exposición a la luz, el flujo, la temperatura y las diferentes calidades 
del agua. Para cubrir sus necesidades energéticas los peces utilizan primero las 
proteínas después los lípidos y posteriormente los carbohidratos (21). 
 
1.6.2 Metabolismo de carbohidratos 
 
“Aunque el glucógeno es la principal fuente energética para el metabolismo 
anaeróbico (glucólisis) en el músculo del pez durante el “rompimiento” en el 
nado, la habilidad del hígado y tejidos para almacenar glucógeno es limitada y 
constituye menos del 1% del tejido corporal húmedo” (21). 
 
“Al contrario de los mamíferos omnívoros, los peces no movilizan rápidamente el 
glucógeno del hígado cuando son mantenidos en ayuno. Se ha detectado que 
durante el ayuno de los peces la oxidación de substratos diferentes a 
carbohidratos tiene prioridad sobre la movilización e hidrólisis del glicógeno, lo 
cual sugiere que la capacidad de los peces para oxidar anaeróbicamente la 
glucosa es limitada. Es por ello que la gluconeogénesis parece tener un papel 
fundamental en el mantenimiento de los niveles de azúcar en la sangre de peces 
en ayuno” (21). 
 
Aunque los carbohidratos son utilizados en baja eficiencia por los peces como 
una fuente de energía, esto no significa que los carbohidratos no tengan un papel 
importante en la nutrición de los peces. En numerosas especies, parece ser 
necesario un aporte glucídico ya que éste favorece el crecimiento y sobre todo la 
utilización de proteína (22). 
 
La habilidad o capacidad para utilizar carbohidratos y lípidos para la obtención 
de energía varía entre especies. Existe una considerable controversia acerca del 
nivel óptimo de carbohidratos que deben ser incluidos en la dieta de animales 
 17 
acuáticos. Este nivel varía de acuerdo a las especies, desde menos del 22% en 
trucha arcoiris, hasta niveles altos del 33% para bagre de canal (22). 
 
La habilidad de peces carnívoros para hidrolizar o digerir carbohidratos 
complejos es limitada debido a la baja actividad amilolítica en su tubo digestivo. 
Así, para especies tales como la trucha, conforme aumenta la proporción de 
almidón en la dieta, disminuye su digestibilidad. En trabajos de alimentación de 
mayor duración con peces salmónidos se ha observado que elevados niveles de 
carbohidratos en la dieta disminuyen el crecimiento, elevan los niveles de 
glucógeno en hígado y eventualmente causan mortalidad (21). 
 
Por el contrario, los peces omnívoros o herbívoros de agua caliente, tales como 
la carpa (C. carpio), el bagre de canal (I. punctatus), la tilapia (O. niloticus) y la 
anguila (A. japonica), han mostrado ser más tolerantes para niveles elevados de 
carbohidratos, esto se debe a que los utilizan más eficientemente como fuente 
de energía o bien el exceso es almacenado en forma de lípidos corporales. 
Parece que la habilidad de los peces para adaptarse a dietas con un elevado 
contenido de carbohidratos, depende de su habilidad para convertir el excedente 
energético (p.ej. glucosa) en lípidos o aminoácidos no esenciales (21). 
 
También se ha visto que la utilización de carbohidratos ofrecidos en la dieta 
varía con la complejidad o estructura química de la fuente de carbohidratos 
usada, los polisacáridos y disacáridos tienen un mayor efecto benéfico en el 
crecimiento que los monosacáridos. El estado físico de la fuente de carbohidratos 
también determina el grado de utilización, los almidones cocidos o gelatinizados 
son más digestibles y permiten un mejor crecimiento, en comparación con los 
almidones naturales o crudos (22). 
 
Los carbohidratos son una fuente económica de energía y su inclusión en dietas 
para peces permite un mayor aprovechamiento de la proteína para el 
crecimiento de los organismos. La inclusión de fuentes energéticas no proteínicas 
 18 
en la formulación de la dieta permite reducir el contenido de proteína. Esta 
capacidad se llama el efecto de “escatimación de proteína”, y es de gran interés 
para aquellos involucrados en la formulación de dietas para peces. El precio 
relativo de los ingredientes que contienen altos niveles de proteína, lípidos y 
carbohidratos respectivamente, son lo suficientemente diferentes para que el 
efecto de escatimación de proteína resulte costeable (22). 
 
 
1.7 Los carbohidratos 
 
Después de las proteínas y los lípidos, los carbohidratos representan el tercer 
grupo de compuestos orgánicos más abundantes en los animales. Son compuestos 
que contienen carbono, hidrógeno y oxígeno, muchos de ellos pueden 
representarse con la fórmula estequiométrica simple (CH2O)n. Sin embargo, esta 
fórmula es una simplificación excesiva, ya que muchos carbohidratos están 
modificados y algunos contienen grupos amino, sulfato y fosfato (23). 
 
1.7.1 Clasificación de los carbohidratos 
 
De acuerdo a su estructura química, los carbohidratos se dividen en dos grupos 
principales: azúcares y no azúcares. Los azúcares más simples se denominan 
monosacáridos, mismos que pueden dividirse en subgrupos dependiendo del 
número de átomos de carbono presentes en la molécula: 
 
Triosas (CH20)3, Tetrosas (CH20)4, Pentosas (CH20)5, Hexosas (CH20)6, 
Heptosas (CH20)7 y Octosas (CH20)8 
 
Los monosacáridos pueden unirse entre sí para formar disacáridos, oligosacáridos 
y polisacáridos, conteniendo dos, tres, ó más unidades respectivamente. 
 
Los carbohidratos denominados “no azúcares” son aquellos que contienen más de 
10 unidades de monosacáridos y que no poseen un sabor dulce. Los no azúcares 
pueden dividirse en dos subgrupos, homopolisacáridos y heteropolisacáridos (21). 
 19 
1.7.2 Azúcares 
 
A) Monosacáridos 
 
Los monosacáridos o azúcares simples son los glúcidos más sencillos y no se 
hidrolizan para dar otros compuestos. Son solubles en agua, escasamente en 
etanol e insolubles en éter, son activos ópticamente, poseen propiedades 
reductoras y generalmente son de sabor dulce (21). 
 
Los monosacáridos se clasifican en dos familias: cetosas yaldosas, dependiendo 
de si poseen un grupo funcional cetona o aldehído. Si llevan el grupo cetona se 
les nombra añadiendo el prefijo ceto- y si llevan el grupo aldehído se añade el 
prefijo aldo-. La numeración de los carbonos se inicia en todas las aldosas por el 
aldehído, y en las cetosas por el carbono terminal más próximo al grupo cetona 
(24). 
 
� Triosas: son las moléculas más pequeñas que generalmente se consideran 
monosacáridos, con n = 3. En este subgrupo se encuentran los compuestos 
llamados cetoriosas (ó dihidroxiacetona) y aldotriosas (ó gliceraldehído). Las 
triosas tienen gran importancia en el metabolismo de carbohidratos y la 
respiración (24). 
 
� Tetrosas: su fórmula empírica es (CH2O)4. Tienen dos carbonos quirales en 
las formas aldosa y un carbono quiral en la forma cetosa. Hay dos aldotetrosas 
según la posición del grupo carbonilo: D-eritrosa y D-treosa y una cetotetrosa 
denominada eritrulosa (24). 
 
� Pentosas: su fórmula empírica (CH2O)5. Como en los demás monosacáridos, 
aparecen en su estructura los grupos alcohólicos (OH), además de grupos 
cetónicos o aldehídicos. Importantes pentosas incluyen la L-arabinosa, D-xilosa, 
D-ribosa. Desde el punto de vista nutricional la pentosa más importante es la D-
ribosa (o aldopentosa por contener el grupo funcional aldehído) y sus derivados 
 20 
D-desoxirribosa y ribitol. Por ejemplo, la D-ribosa y la D-desoxirribosa son 
componentes esenciales del ácido ribonucléico (ARN) y el ácido 
desoxiribonucléico (ADN) respectivamente, y el ribitol es un componente 
esencial de la riboflavina (21). 
 
� Hexosas: Su fórmula general es (CH2O)6. Existe un gran número de hexosas 
posibles. Las hexosas más ampliamente distribuidas en la naturaleza y más 
importantes desde el punto de vista biológico son: glucosa, fructosa, galactosa, y 
manosa. Su principal función es producir energía. Un gramo de cualquier hexosa 
produce unas 4 kilocalorías de energía (24). 
 
B) Disacáridos 
Los disacáridos están formados por dos residuos (hexosas) y pueden desempeñar 
múltiples funciones en los organismos vivos. Algunos como la sacarosa, la lactosa 
y la trehalosa, constituyen reservas de energía soluble en las plantas y los 
animales. Otros como la maltosa y la celobiosa, pueden considerarse 
fundamentalmente productos intermediarios de la degradación de otros 
polisacáridos mucho más largos como el almidón y la celulosa respectivamente 
(23). 
 
C) Oligosacáridos 
Los oligosacáridos son polímeros formados a base de monosacáridos unidos por 
enlaces O-glucosídicos, con un número de unidades monoméricas entre 3 y 10. 
Cumplen funciones de reconocimiento celular y se encuentran en la naturaleza 
como constituyentes de la membrana celular, enlazados a moléculas de proteínas 
y lípidos, dando lugar a glicoproteínas y glicolípidos (23). 
 
 21 
1.7.3 No azúcares 
 
Dentro de la división de los no azúcares se encuentran los homopolisacáridos y 
los heteropolisacáridos. Los no azúcares realizan una amplia gama de funciones 
en los organismos vivos. 
 
a) Homopolisacáridos 
 
Los homopolisacáridos están compuestos por un solo tipo de unidad monomérica, 
por lo general de un gran número de hexosas o en menor grado de pentosas, y 
tienen un alto peso molecular. A muchos de ellos se les encuentra en plantas y 
animales como material alimenticio de reserva (almidón y glucógeno) o como 
elementos estructurales (celulosa y quitina) (21). 
 
b) Heteropolisacáridos 
 
Los heteropolisacáridos consisten en mezclas de unidades diferentes de 
monosacáridos e incluso algunos contienen ácidos complejos. Poseen un alto 
peso molecular. Algunos de estos compuestos son: hemicelulosa, gomas, 
mucílagos, sustancias pépticas y mucopolisacáridos (21). 
 
 
1.7.3.1 La quitina 
 
La quitina fue aislada por primera vez por Braconnot en 1811 a partir de hongos 
superiores y por su origen la denominó “fungina” [1]. El nombre quitina -del 
griego xitwuy, que significa cubierta o envoltura- se debe a Odier, que en 1823 la 
aisló a partir de escarabajos en soluciones alcalinas (25). 
 
La quitina se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza, tanto en el 
reino animal como en el vegetal. De hecho, es el segundo polímero natural más 
abundante sólo superado por la celulosa, por lo que constituye un importante 
recurso renovable (25). 
 22 
 
La quitina es el principal componente estructural de artrópodos, insectos, 
arácnidos, crustáceos, moluscos, hongos y algas, entre otros organismos. En los 
animales aparece asociada a otros constituyentes tales como lípidos, pigmentos, 
carbonato de calcio y proteínas. Se estima que solamente la cantidad de quitina 
de crustáceos presente en el medio marino asciende a 1,560 millones de 
toneladas (25). 
 
Es un polímero compuesto por aminoazúcares unidos entre sí por enlaces 
glicosídicos β(1→4), formando una cadena lineal de unidades de N-acetil-D-
glucosamina, algunas de las cuales se encuentran desacetiladas. Se argumenta 
que la quitina natural posee un grado de acetilación, DA, de 0.66, es decir, que 
una de cada tres de sus unidades se encuentran desacetiladas (25). 
 
Existe una gran similitud estructural existente entre la quitina y la celulosa. La 
diferencia entre ambas radica en que el carbono 2 contiene un grupo hidroxilo en 
la celulosa y un grupo acetamida en la quitina. Ver Figura 5. 
 
 
 
 
 
Figura 5. Representación esquemática de las cadenas de (a) celulosa 
(b) quitina totalmente acetilada. 
 23 
Ambos biopolímeros desempeñan roles semejantes, ya que actúan como 
materiales de soporte y defensa en los organismos que los contienen (25). 
 
La quitina es el principal elemento de los exoesqueletos de crustáceos, por ello 
es considerada el carbohidrato dominante y un importante componente 
nutricional en la dieta de peces, especialmente carnívoros. Es de particular 
importancia en las dietas de larvas y juveniles, ya que es usual la práctica de 
alimentar con Artemia, Daphnia y otros crustáceos diminutos (22). 
 
La degradación de la quitina comprende la sinergia de dos familias de enzimas: 
quitinasas y N-acetil-glucosaminidasas (NAGasa). La quitinasa es una endo-
enzima que corta polímeros de una forma azarosa, reduciendo la quitina a 
trímeros (quitotriosa), dímeros (quitobiosa) u oligómeros de N-acetil-β-
glucosamina (NAG). La enzima N-acetil-β-glucosaminidasa es una exo-enzima que 
hidroliza residuos de NAG de las terminales no reducidas de quitobiosa y análogos 
superiores. Además, la palabra quitinasa podría ser usada para referir a alguna 
enzima con actividad quitinolítica o referirse solamente a endoquitinasas. 
Quitobiosidasa es un término considerado sinónimo de N-acetil-β-glucosaminidasa 
(26). 
 
 
1.8 Enzimología digestiva en peces 
 
El estudio de las enzimas digestivas, sus características, funcionalidad y 
adaptaciones al régimen alimenticio, conforman uno de los campos de 
investigación más amplios e interesantes en la nutrición de especies 
acuicultivadas. Un gran número de investigaciones han abordado aspectos que 
van desde la descripción de los parámetros funcionales de las principales enzimas 
hasta la forma en que éstas pueden ser utilizadas para modelizar la digestión en 
una especie concreta o su papel como indicadores de la condición nutricional 
durante la etapa larvaria (27). 
 
 24 
1.8.1 Enzimas glucolíticas en peces 
 
Los carbohidratos más importantes presentes en los alimentos para peces son la 
celulosa, el glucógeno, el almidón y la quitina. La celulosa y quitina son los 
carbohidratos estructurales de plantas y animales, respectivamente. El 
glucógeno es la principal fuente de almacenamiento de carbohidratos en los 
animales, mientras que en las plantas lo es el almidón (28). 
 
Los carbohidratos son digeridos por una variedad de enzimas glucolíticas, 
denominadas en términos generales carbohidrasas. De todas, la amilasa tiene la 
más amplia distribucióny es producida en el páncreas (28). 
 
La amilasa ataca los enlaces 1,4 α-glucosídicos, encontrados en el almidón, pero 
tiene muy poco efecto sobre otras formas de carbohidratos. La digestión del 
almidón por la amilasa resulta en la producción de una variedad de 
oligosacáridos, pero los carbohidratos sólo se absorben en la forma de 
monosacáridos. Por ello, previamente a la absorción, los oligosacáridos deben ser 
reducidos a monosacáridos. Esta digestión la llevan a cabo enzimas carbohidrasas 
de las secreciones pancreáticas, pero más específicamente enzimas asociadas al 
borde de cepillo del epitelio intestinal (28). 
 
En muy pocos peces, si es que en alguno, se producen celulasas para la digestión 
química de las paredes celulares de plantas, y cualquier actividad de tipo 
celulasa presente en el tracto digestivo de los peces, probablemente se deriva de 
la flora intestinal (28). 
 
Debido a que la actividad celulasa en tubo digestivo de los peces es de origen 
bacteriano, no debiera existir ninguna relación entre la actividad celulítica 
registrada en el intestino y los hábitos alimenticios de los peces. Por ejemplo, las 
especies carnívoras, las cuales consumen muy poca o ninguna celulosa, muchas 
veces poseen altos niveles de actividad celulasa intestinal. En peces herbívoros, 
las paredes celulares vegetales pueden ser mayormente degradadas por medios 
 25 
mecánicos, más que por medios químicos, ya sea por acción de los dientes 
faríngeos o por medio del molido y mezclado en un estómago altamente 
especializado y muscular (28). 
 
La laminarina es un carbohidrato de almacenamiento de las algas, consiste en 
una cadena de residuos de glucosa de enlaces β 1-3 y 1-6, así que la digestión de 
este polisacárido requiere que estén presentes enzimas laminarinasas 
específicas. Enzimas de este tipo han sido aisladas de microorganismos, hongos y 
varias especies de invertebrados. En los vertebrados, la actividad laminarasa ha 
sido registrada en el tubo digestivo de especies de peces fitófagas y micrófagas 
(28). 
 
En peces, la actividad quitinasa ha sido asociada al comportamiento alimentario, 
siendo más elevada en las especies que se alimentan de crustáceos o de insectos 
y especialmente en los peces que engullen su presa sin masticarla (29). Las 
enzimas quitinolíticas son secretadas en el estómago, el páncreas y los ciegos 
pilóricos; los cuales son el sitio más importante de digestión de quitina. Sin 
embargo, una fuente adicional de actividad quitinolítica puede ser las bacterias 
que colonizan el intestino (28). 
 
1.8.2 Enzimas quitinasas en peces 
 
Los primeros estudios de las enzimas quitinasas en los animales surgieron a partir 
del cuestionamiento de que debía existir un enzima en el tubo digestivo que 
degradara los caparazones quitinosos de las presas y así poder tener acceso a los 
nutrientes internos de la presa. 
 
El origen de las enzimas quitinasas en los animales ha sido motivo de discusión 
controversial. Anteriormente se había inferido que la actividad quitinolítica se 
derivaba exclusivamente de las enterobacterias presentes en el tubo 
gastrointestinal de los organismos. Sin embargo, Jeuniaux describió por primera 
 26 
vez a las quitinasas como hidrolasas que pueden ser sintetizadas en los tejidos de 
vertebrados como mamíferos, aves, reptiles, peces y anfibios (30). 
 
Algunos autores como Goodrich y Morita, sostienen que la actividad medida de 
las enzimas quitinasas en el contenido digestivo de peces ha sido únicamente de 
origen bacteriano al demostrar la presencia de quitinasas bacterianas en el 
intestino de Enophrys bison y Platichthys stellatus (31). Sin embargo, tanto Sera 
como Hood-Meyers sugirieron que la quitinasa presente en el tubo digestivo era 
producida tanto por el hospedero como por la población microbiana. Lindsay y 
Gooday reportaron actividad quitinasa en el tubo digestivo del bacalao común, 
Gadus morhua, en ausencia de una población bacteriana quitinolítica (32). 
Asimismo, Danulat concluyó que la actividad quitinasa en el bacalao común se 
deriva primariamente de los tejidos del pez (33). También Ramesh y col. 
detectaron actividad quitinasa en intestinos de Tachysurus arius tratados con 
antibiótico, lo cual confirma la presencia de quitinasa nativa en el pez (32). 
 
Dandrifosse y cols., fueron capaces de demostrar que la enzima quitinasa podía 
ser sintetizada y secretada por la mucosa gástrica de la anguila Anguila vulgaris y 
del salmón Salmo irideus, y posteriormente trataron de explicar el mecanismo de 
secreción de quitinasa en vertebrados (30). 
 
La existencia de enzimas quitinasas ha sido demostrada en varias especies de 
peces sin importar sus hábitos alimenticios y su presencia no está restringida al 
aparato digestivo (34, 35). De hecho, de las más de 150 especies de peces 
examinadas para quitinasas digestivas, todas excepto dos dieron resultados 
positivos: la brema Abramis brama y el pez pulmonado africano Protopterus 
aethiopicus (30). 
 
La mayoría de las veces la quitina ha sido referida como pobremente digestible o 
indigestible en los peces, en contraste con el bien documentado hecho de que el 
tubo digestivo de los peces constituye un abundante recurso de quitinasas. 
 27 
Especialmente en el caso del salmón Salmo gairdneri, los reportes de la muy 
baja digestibilidad de quitina parecen ser poco entendibles cuando se ha 
demostrado que poseen un gran potencial quitinolítico (30). 
 
Sin embargo, es necesario realizar más estudios de digestibilidad in vivo, ya que 
es posible encontrar grandes diferencias entre especies. Danulat, encontró una 
digestibilidad de quitina del 90% en el bacalao común Gadus morhua, con una 
alimentación basada en camarón Crangon allmanni; solamente el 9 % de la 
quitina de la dieta fue recuperada del contenido intestinal y heces (30). 
 
La función primaria de las enzimas quitinolíticas aún se encuentra en debate y es 
variable entre las distintas especies. A las enzimas quitinolíticas a lo largo del 
tubo digestivo de los peces se les han adjudicado varios roles. Las quitinasas 
están principalmente asociadas al estómago, en donde degradan los 
exoesqueletos, permitiendo el acceso de otras enzimas a los nutrientes de los 
tejidos internos de la presa. Las quitinasas en los intestinos pueden ayudar a 
remover el bloqueo por fragmentos quitinosos. Sin embargo, estudios recientes 
han demostrado la presencia de actividad quitinasa en el suero sanguíneo de 
peces, como en la tilapia Oreochromis niloticus, proponiendo que tiene una 
función de defensa en el sistema inmune contra patógenos quitinosos. La 
presencia de quitinasa en otros tejidos permanece desconocida (35). 
 
 
 
 
 
 
 
 28 
2. JUSTIFICACIÓN 
 
El conocimiento de la enzimología digestiva es primordial para sentar las 
bases de la nutrición y alimentación de las especies de cultivo. El estudio de 
las enzimas digestivas en los peces, tales como la quitinasa, es de gran 
utilidad para implementar las técnicas alimenticias en cautiverio en las 
diferentes etapas de vida, así como para elaborar dietas comerciales 
balanceadas apropiadas para las especies en cuestión. El medir la actividad 
enzimática de la quitinasa en los peces es fundamental para conocer el grado 
de degradación de los substratos quitinosos presentes en los crustáceos (tales 
como la artemia) ofrecidos en muchas explotaciones piscícolas en las etapas 
de crecimiento o en el ciclo completo, o bien como posible ingrediente en las 
formulaciones balanceadas. 
 
 29 
3. HIPÓTESIS 
 
� El pez blanco del lago de Pátzcuaro, M. estor, es un organismo que posee 
la capacidad de sintetizar la enzima quitinasa en el tubo digestivo para la 
degradación de la quitina presente en el exoesqueleto de sus presas. 
 
� Los estadíos de desarrollo iniciales de M. estor, como huevos y larvas, 
tendrán una expresión génica y una actividad enzimática de quitinasamenor, 
aunque no ausente, en comparación con juveniles y adultos. 
 
� M. estor posee síntesis y secreción endógena de quitinasa en el órgano 
hepatopáncreas así como síntesis y secreción tanto endógena como exógena 
de quitinasa de origen bacteriano en el intestino. 
 
� Si la síntesis y secreción de quitinasa también se debe a un origen 
bacteriano, entonces los niveles de expresión génica y actividad enzimática 
de la quitinasa en los intestinos de juveniles y adultos de M. estor sometidos 
al tratamiento con eritromicina deberán ser menores en comparación con 
aquellos sin eritromicina. 
 
� Los niveles de expresión génica y actividad enzimática de la quitinasa en 
los hepatopáncreas de juveniles y adultos de M. estor no se verán modificados 
por el tratamiento con eritromicina. 
 
 30 
4. OBJETIVOS 
 
4.1 Objetivo general 
 
� Determinar la presencia de la enzima quitinasa en el tubo digestivo del 
pez blanco, M. estor, mediante la identificación y cuantificación de la 
expresión génica y actividad enzimática de la misma en las diferentes etapas 
de crecimiento. 
 
 
4.2 Objetivos particulares 
 
� Clonar y secuenciar la región codificante del gen de quitinasa en M. estor. 
 
 
� Medir los niveles de expresión génica de la quitinasa en los tejidos de 
individuos de M. estor en los diferentes estadíos de desarrollo, y en el caso de 
juveniles y adultos compararlos entre tratamientos (con o sin eritromicina en 
el alimento). 
 
 
� Medir la actividad enzimática de la quitinasa en los tejidos de individuos 
de M. estor en los diferentes estadíos de desarrollo, y en el caso de juveniles 
y adultos compararlos entre tratamientos (con o sin eritromicina en el 
alimento). 
 
 
 
 
 
 31 
5. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
5.1 Metodología experimental general 
 
Hasta el momento la existencia de la enzima digestiva quitinasa en el pez blanco 
es desconocida. El presente trabajo pretende determinar la presencia de la 
quitinasa en el tubo digestivo de M. estor, así como cuantificar el nivel de 
expresión génica y la actividad enzimática. Ver Figura 6. 
 
Para la realización del experimento se colectaron muestras de especímenes de 
M. estor en las cuatro fases de vida: huevo, larva, juvenil y adulto. Los huevos y 
las larvas fueron procesados completos, mientras que juveniles y adultos fueron 
sometidos a dos tratamientos in vivo: con antibiótico y sin antibiótico 
(eritromicina) en el alimento, y después fueron extraídos el hepatopáncreas y el 
intestino. Esto se realizó con el fin de determinar si el antibiótico ejerce 
influencia sobre la producción tanto endógena como exógena de la quitinasa en 
ambos órganos. 
 
Figura 6. Metodología experimental general. 
 32 
 
5.2 Animales 
 
Los peces fueron proporcionados por el departamento de Acuicultura y Nutrición 
del Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales (IIAF), de la 
Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo (U.M.S.N.H. Morelia, Mich). 
 
A) Huevos 
Los huevecillos fueron recolectados del estanque de reproductores con ayuda de 
un cepillo. Una vez colectadas las frezas, se colocaron en solución salina al 10%. 
Se procedió a cortar con unas tijeras de acero con motor para eliminar las fibras 
y separar los huevecillos, mismos que fueron recuperados por decantación. Se 
colocaron en una incubadora de botella con sistema de filtración y aireación; 
temperatura 23°C, salinidad de 10 g/L y gotas de verde malaquita como 
antifúngico preventivo. Los huevos fueron revisados diariamente, eliminándose el 
huevo blanco contaminado y no viable. Al quinto día fueron retirados de la 
incubadora; los huevos que contenían embrión oculado fueron separaron y 
observados bajo microscopio estereoscópico. Para el muestreo se seleccionaron 
los embriones que mostraban signos vitales y que poseían el mismo grado de 
desarrollo ocular. 
 
B) Larvas 
Una camada de crías recién eclosionadas (procedentes de varios desoves) fue 
cultivada hasta los 30 días en un recipiente de plástico con capacidad de 20 litros 
con aireación artificial, salinidad de 5 g/L y temperatura de 23°C. La 
alimentación consistió de rotíferos (Brachionus rubens) una vez al día con 
densidad de 30 rotíferos/ml. Al día 30 se muestrearon 45 larvas al azar. 
 
C) Juveniles 
Otra camada de crías recién eclosionadas (procedentes de varios desoves) fue 
cultivada hasta los 90 días en canaletas de material PVC, con aireación artificial, 
salinidad de 5 g/L y temperatura de 23°C, y dividida en dos grupos. La 
 33 
alimentación consistió de nauplios de Artemia salina una vez al día y de alimento 
en hojuelas para peces (40% PC) tres veces al día. Cinco días antes del muestreo 
se implementaron los tratamientos: con o sin eritromicina en el alimento. Al día 
90 se muestrearon 90 individuos al azar. Antes de realizar el muestreo, los peces 
se dejaron en ayuno durante 5 horas a partir de la última alimentación con el 
objetivo de determinar la actividad enzimática basal. 
 
D) Adultos 
Dieciseis (16) adultos fueron capturados al azar del estanque de reproductores, 
separados en dos grupos y colocados en tanques con capacidad de 200 L, con 
aireación artificial, salinidad de 5 g/L y a temperatura ambiente. Los peces se 
mantuvieron una semana en período de adaptación sin tratamiento y cinco días 
más con tratamiento (con y sin erotromicina en el alimento). La alimentación 
consistió de Artemia salina dos veces al día y de alimento para peces en pellet 
(40% PC), una vez al día. Antes de realizar el muestreo, los peces se dejaron en 
ayuno también durante 5 horas a partir de la última alimentación. 
 
 
5.2.1 Anestesia 
 
Previamente a su sacrificio se procedió a la anestesia de los individuos, según los 
protocolos de anestesia utilizados en el IIAF, para el sacrificio humanitario (36). 
 
� Larvas: se agregaron 0.1 g de metanosulfonato tricaína (MS-222, Western 
Chemical Inc., Ferndale, WA, USA) en 100 mL de agua destilada. Se colocaron las 
larvas una por una; se observó efecto anestésico inmediato. 
 
� Juveniles: se preparó una solución madre de anestésico diluyendo 100 g de 
benzocaína pura en 1L de etanol [100 g/L]. Se agregaron 24 µL de la solución 
madre a 100 mL de agua destilada para obtener una concentración final de 24 
mg/L. Se colocaron los juveniles en grupos de cinco, observándose una completa 
anestesia al minuto. 
 34 
 
� Adultos: se partió de la misma solución madre de benzocaína. Se añadieron 
2.4 mL de la solución a 10 L de agua del medio para obtener una concentración 
final de 24 mg/L. Se observó una completa anestesia a los cinco minutos. 
 
 
5.2.2 Disección de órganos 
 
Para la obtención de los órganos de interés, se procedió a la disección de 
juveniles y adultos. Una vez anestesiados en su totalidad, se colocó a cada 
individuo sobre una placa fría (-20°C). Primeramente se insensibilizó al animal 
puncionando la cabeza con un estilete para destruir el cerebro. Con unas tijeras 
rectas se hizo una incisión longitudinal partiendo del ano hasta la parte anterior 
de la cavidad abdominal delimitada por las branquias. Después se realizaron dos 
cortes laterales; se retiró la piel y el músculo en forma de rectángulo. Con ayuda 
de unas pinzas de ratón se expusieron las vísceras; se diseccionó el tubo digestivo 
desde la parte proximal del esófago hasta el ano y el hepatopáncreas se separó 
cuidadosamente de la vesícula biliar y del tejido adiposo. Para los juveniles se 
llevó a cabo la misma técnica bajo microscopio estereoscópico. 
 
 
5.2.3 Muestreo 
 
Todas las muestras se pesaron y colocaron en tubos de congelación o crioviales 
estériles de 1 y 3 mL (Cryovial®; Simport), previamente enfriados en hielo, de 
acuerdo a la metodología de muestreo para los experimentos de expresión génica 
y de actividad enzimática. Ver Cuadros 1 y 2. 
 
El congelamiento se realizó en dos fases, primero las muestras fueron 
introducidasen un tanque de nitrógeno líquido N2 (l) para su inmediato 
congelamiento y después se transfirieron a un congelador a -70°C (REVCO®) para 
su mantenimiento hasta su posterior análisis. 
 35 
 
Las muestras destinadas a los experimentos de expresión génica fueron 
sumergidas en una solución estabilizadora de RNA (RNAlater® Soln. AM7020, 
Ambion) previamente a su congelamiento, de acuerdo a las recomendaciones del 
fabricante para la preservación del RNA y la utilización de tejidos a largo plazo. 
 
 
5.2.3.1 Protocolos de muestreo 
 
Cuadro 1. Protocolo de muestreo para determinar la expresión génica 
Etapa No. individuos Cantidad Tejido Tratamiento 
Huevo 100 -120 150 mg huevo completo - 
Larva 30 150 mg larva completa - 
Juvenil 30 150 mg hepatopáncreas s/antibiótico 
 150 mg intestino s/antibiótico 
Juvenil 30 150 mg hepatopáncreas c/antibiótico 
 150 mg intestino c/antibiótico 
Adulto 3 150 mg hepatopáncreas s/antibiótico 
 150 mg intestino s/antibiótico 
Adulto 3 150 mg hepatopáncreas c/antibiótico 
 150 mg intestino c/antibiótico 
 
 
 
 
Cuadro 2. Protocolo de muestreo para determinar la actividad enzimática 
Etapa No. Tejido Tratamiento Muestra/criovial # crioviales 
(unidades) 
Huevo 25 huevo completo - 5 huevos/criovial 5 unidades 
Larva 15 larva completa - 1 larva/criovial 15 unidades 
 Juvenil 15 hepatopáncreas s/antibiótico 1 hp/criovial 15 unidades 
 intestino s/antibiótico 1 int/criovial 15 unidades 
Juvenil 15 hepatopáncreas c/antibiótico 1 hp/criovial 15 unidades 
 intestino c/antibiótico 1 int/criovial 15 unidades 
Adulto 5 hepatopáncreas s/antibiótico 1 hp/criovial 5 unidades 
 intestino s/antibiótico 1 int/criovial 5 unidades 
Adulto 5 hepatopáncreas c/antibiótico 1 hp/criovial 5 unidades 
 intestino c/antibiótico 1 int/criovial 5 unidades 
 Total= 100u 
 36 
5.3 Tratamientos 
 
En el presente trabajo se pretende que, por medio de la aplicación de un 
tratamiento con antibiótico, haya una reducción de la flora intestinal en los 
peces tratados. El objetivo es observar si existe diferencia significativa en la 
producción de quitinasa en los diferentes tejidos entre tratamientos. 
 
El antibiótico de elección para este experimento fue la eritromicina, ya que en 
un estudio del efecto de varios componentes antimicrobianos sobre la flora 
intestinal de la trucha arcoiris, la eritromicina causó una rápida reducción en el 
número de colonias bacterianas en el tracto gastrointestinal a corto plazo (37). 
 
La eritromicina (Latotryd MR tabletas de 500 mg; Atlantis Pharma) fue 
administrada en el alimento tanto vivo como balanceado. 
 
 
5.3.1 Dosis de antibiótico 
La dosis de eritromicina utilizada en el presente trabajo fue la recomendada por 
el Departamento de Ciencias Acuáticas y Pesca, de la Universidad de Florida, 
EUA (38). 
� Dosis eritromicina peces: 3.3 g/kg alimento*día 
 
 
5.3.2 Preparación del alimento con antibiótico 
 
Las tabletas de antibiótico fueron molidas en mortero de porcelana y después se 
pulverizaron a partículas muy finas en un molino de perlas (Netsch MM200). El 
antibiótico fue dosificado de acuerdo a la cantidad de alimento utilizada, 
después diluido en agua destilada y posteriormente rociado sobre el alimento 
comercial; o bien mezclado en una emulsión para administrarse al alimento vivo. 
 
 37 
5.3.2.1 Alimento inerte 
 
El alimento en hojuelas y en pellets, se distribuyó uniformemente en charolas de 
malla mosquitero forradas con papel encerado. Se utilizó un aspersor de gota 
fina para rociar la dilución de antibiótico sobre el alimento, la cual fue absorbida 
rápidamente. Las charolas se colocaron en una campana de extracción para secar 
el alimento y evitar la contaminación. 
 
5.3.2.2 Alimento vivo 
 
La Artemia salina es considerada el alimento vivo de elección en la acuacultura, 
ya que posee un buen perfil nutritivo y es muy digestible. Debido a que son 
organismos filtradores, se les ha utilizado como vehículo vivo de sustancias de 
interés como lo son diversos fármacos, ácidos grasos esenciales y otros 
nutrientes. 
 
Recientemente se han desarrollado varias técnicas para el mejoramiento del 
valor nutritivo de la artemia por medio de la bioencapsulación de componentes 
esenciales, a lo que se le llama enriquecimiento. La práctica más generalizada 
consiste en la incubación de los nauplios o artemias adultas hasta 72 horas en 
una suspensión o emulsión de enriquecimiento (39). 
 
Para este experimento, la emulsión enriquecedora con antibiótico se preparó de 
la siguiente manera: por cada litro de agua se requirieron 0.4 g aceite de 
pescado y 0.2 g de lecitina de soya como emulsificador. Se agregó el antibiótico 
(6.6 g/kg alimento*día)1 y se mezcló perfectamente. Se colocó un litro agua del 
medio en una mezcladora de alto torque y se le agrego la mezcla por goteo hasta 
obtener una emulsión de color blanco; parecido a la leche de soya. Las artemias 
permanecieron en el medio con aireación artificial durante 48 horas, antes de ser 
tamizadas y ofrecidas como alimento vivo a los peces adultos. Diariamente se 
 
1
 La dosis de antibiótico para las artemias fue duplicada a 6.6 g/kg alimento/día con el fin de obtener una emulsión más 
concentrada y así favorecer una mayor filtración. La concentración final de antibiótico en las artemias no fue 
determinada. 
 38 
administraron 10 g de artemias por tanque de ocho peces adultos, dividido en 
dos raciones. 
 
5.4 Ensayos de expresión génica 
 
5.4.1 Purificación del RNA total 
 
Los kits de extracción están diseñados para purificar RNA a partir de pequeñas 
cantidades de material biológico. La extracción del RNA total de los tejidos del 
pez blanco se realizó utilizando el RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN®) siguiendo las 
instrucciones del fabricante, correspondientes a la purificación de RNA a partir 
de tejidos animales y para una cantidad máxima de 30 mg de tejido. 
 
Cada tipo de tejido (destinado a los ensayos de expresión génica, ver Cuadro 1) 
de 150 mg, fue descongelado en hielo y alicuotado en cinco muestras de 30 mg 
en tubos de 1.5 mL. Para la disrupción y homogenización de tejidos se utilizó un 
buffer de lisis provisto en el kit (Buffer RLT) suplementado con β-
mercaptoetanol2 (10 µL β-ME por 1 mL de Buffer RLT), utilizando un volumen de 
600 µL por muestra. Los tejidos fueron homogenizados completamente con un 
homogenizador eléctrico de pistilo rotatorio (pellet pestle grinder Z359971; 
Sigma®); cabe mencionar que si la homogenización es incompleta se obtienen 
bajos rendimientos de RNA. El lisado se centrifugó por 3 minutos a máxima 
velocidad hasta obtener un pellet. Se tomó cuidadosamente el sobrenadante con 
una pipeta y se transfirió a un nuevo tubo de 1.5 mL. Se agregó un volumen de 
etanol al 70% (conservado a -20°C) y mezcló por pipeteo. Se transfirieron 700 µL 
de las muestras a las columnas filtradoras RNeasy colocadas en tubos colectores 
de 2 mL, y se procedió a centrifugar a 10,000 rpm durante 15 s, descartando el 
filtrado. Se agregaron 700 µL de buffer de lavado 1 (RW1) y se centrifugó a 
10,000 rpm por 15 s, descartando el filtrado. Se agregaron 500 µL de buffer de 
lavado 2 (RPE), se centrifugó a 10,000 rpm por 15 s y se descartó de nuevo el 
 
2
 Debido a su toxicidad es necesario usar campana de extracción y ropa adecuada durante su manipulación. El buffer de 
lisis (buffer RLT) suplementado con β-ME se conserva a temperatura ambiente. 
 39 
filtrado. Se repitió esta operación pero centrifugando durante 2 min para lavar la 
membrana sílica de las columnas filtradoras. Se centrifugó nuevamente la 
minicolumna a máxima velocidad durante 1 min para secar la membrana y se 
descartó el filtrado. La columna fue colocada en un tubo colector de 1.5 mL 
nuevo y se agregaron 30 µL de agua libre de RNasas