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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS DE LA PRODUCCIÓN Y DE LA SALUD ANIMAL FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA EFECTO DE LA INFUSIÓN DE HIBISCUS SABDARIFFA L. COMO MODULADOR DEL ESTRÉS OXIDANTE HEPÁTICO EN EL SÍNDROME METABÓLICO T E S I S Que para optar por el grado de: Maestra en Ciencias P R E S E N T A Alejandra María Zúñiga Muñoz Tutor: Israel Pérez Torres Instituto Nacional de Cardiología “Ignacio Chávez” Comité tutor: Antonio Díaz Cruz Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM México D.F. Junio 2013 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. I DEDICATORIAS. A DIOS Por sanarme y darme fuerza en los momentos más duros de mi vida, por siempre estar para mí y enseñarme a volar. Yo sé que vives y que eres un Dios de milagros. A MI FAMILIA Pues sin ellos nada soy y por ellos todo lo puedo. II AGRADECIMIENTOS. Dra. MacCarthy, mil gracias por la oportunidad de conocerle y de aprender de usted, por todo el apoyo que siempre recibí de su parte, deseo que siempre pueda tener salud, felicidad y el amor de sus seres queridos. Dr. Israel, estoy en verdad muy agradecida contigo por abrir las puertas de tu laboratorio a una niña que no tenía idea de que era una pipeta y menos de para que servía. Porque tuviste la paciencia y la dedicación de enseñarme, por todo el apoyo que me has dado, eres admirable, de corazón muchas gracias. Dr. Díaz, gracias por recibirme en tu gran familia estudiantil, por estar al pendiente no solo de mi proyecto de tesis sino de mi salud, por impulsarme a superarme académicamente y como persona, por escuchar mis angustias y aconsejarme. A mi gran familia estudiantil: Juanjo, Susana, Pepe, Andrea, Noemí, Maribel, Marú, Marisa por ser más que mis maestros, compañeros y amigos, por ser literalmente mis hermanos, por todas las risas y lágrimas compartidas muchas gracias. Marco. Te debo tanto amigo mío, sin tu apoyo creo no hubiese podido terminar este proyecto, gracias por cuidar y hacer el agua de jamaica para mis animales mientras yo no estuve, gracias por procurarme en todos mis malos y buenos momentos, por alentarme a seguir adelante, en fin no me quedan palabras para decirte lo importante que has sido y eres para mí. III RESUMEN Se ha observado que el síndrome metabólico (SM) en humanos cursa con un cuadro de estrés oxidante y que su prevalencia se ha incrementado en México así como en otros países durante los últimos años. Se ha demostrado que varios compuestos en la infusión de los cálices de Hibiscus sabdariffa l. (HSL) incrementan la capacidad antioxidante celular. En roedores se exploró la posibilidad de aprovechar esta capacidad para limitar el desarrollo de un modelo experimental de SM, para ello se formaron 6 grupos con 10 animales cada uno (ratas Wistar machos, 150 ± 5 g): Grupo 1 Control, grupo 2 SM, grupo 3 SM+HSL 0.75%, grupo 4 SM+HSL 1.5%, grupo 5 SM+HSL 3%, grupo 6 SM+HSL 6%, el tratamiento fue administrado en agua de bebida por 24 semanas. Al final del tratamiento los animales fueron pesados, se les tomó la presión arterial sistólica (PAS), puestos en ayuno por 12 horas y finalmente sometidos a eutanasia para la obtención de suero e hígado. En el homogenado de hígado se realizaron las siguientes determinaciones: FRAP, TBARS, carbonilación de proteínas, actividad enzimática de peroxidasas, GPX, SOD y CAT. En el suero se determinó la concentración de glucosa, colesterol, triglicéridos, insulina y glicación de las proteínas. El tratamiento con HSL aumenta el FRAP y la actividad de las enzimas CAT, SOD y peroxidasas, aminorándose la lipoperoxidación, carbonilación y glicación de las proteínas, mientras que la actividad de GPX disminuyó. Por otro lado, disminuyó la PAS, el peso corporal, la grasa intra-abdominal, los triglicéridos, la insulina y el índice HOMA. Los resultados sugieren que el tratamiento con HSL es capaz de frenar la progresión del SM y sus daños a nivel sistémico mediados por el estrés oxidante en nuestro modelo, pudiéndose considerar la infusión de HSL como un tratamiento alternativo para mejorar la salud y eventualmente prologar la sobrevida de los pacientes con este síndrome. Palabras clave: síndrome metabólico, estrés oxidante, hígado graso no alcohólico. IV ABSTRACT It has been observed that the metabolic syndrome (MS) in humans is associated with oxidative stress and the prevalence has increased in Mexico as well as other countries in recent years It has been shown that several compounds in the calyces infusion of Hibiscus sabdariffa l. (HSL) increase cellular antioxidant capacity. In rodents we explored the possibility to use this capacity for limit the development of an experimental model of MS, for it six groups of ten animals were formed (male Wistar rats 150 ± 5 g): group 1: control rats; group 2: MS rats; group 3: MS+HSL 0.75%; group 4: MS+HSL 1.5%; group 5: MS+HSL 3% and group 6: MS+HSL 6%. At the end of the 24 weeks of treatment, the animals were weighed and their systolic blood pressure (SBP) was measured. After overnight fasting, the animals were subjected to euthanasia to obtain serum and liver. In liver FRAP and the enzymatic activity of peroxidases, GPX, SOD and CAT were determined, while oxidative stress was evaluated by carbonylation and lipid peroxidation. In the serum the concentration of glucose, cholesterol, triglycerides, insulin and glycosylation were determined. The treatment with HSL increased in the MS rats their antioxidant capacity, the activity of the enzymes CAT, SOD and peroxidases, decreasing the activity of GPX in the liver; it decreased the indices of lipid peroxidation and protein carbonylation, and likewise decreased serum glycosylation. Similarly, arterial systolic blood pressure, body weight, intra- abdominal fat and the levels of triglycerides, insulin and HOMA index decreased, suggesting that the treatment with HSL is effective for reducing damage due to oxidation in MS and that it could be regarded as an alternative treatment for the MS to achieve a greater survival rate in patients with this syndrome. Key words: Metabolic syndrome, Oxidative stress, Non alcoholic fatty liver. V CONTENIDO Página. 1. Introducción……………………………………………………………... 1 2. Marco teórico 2.1 La dieta como factor modulador del estrés oxidante………….... 3 2.2 Hibiscus sabdariffa l como fuente de antioxidantes………… 5 2.2.1 Ácido protocatecuíco………………………………………… 8 2.2.2 Antocianinas………………………………………………….. 10 2.2.3 Epigalocatequina-3-O-galato……………………………….. 12 2.2.4 Quercetina……………………………………………………. 13 2.2.5 Ácido hibiscus………………………………………………… 13 2.3 Planteamiento del problema en la rata con SM…………………. 15 3. Hipótesis……………..…………………………………………………… 18 4. Objetivos 4.1 General………………………………………………………………. 19 4.2 Particular…………………………………………………………….. 19 5. Material y métodos 5.1. Ubicación e infraestructura requerida……..……………………… 20 5.2. Preparación de la infusión de HSL………….…………………...... 20 VI 5.3. Animalesy dieta……………………………………………………. 20 5.4. Bioquímica y glicosilación avanzada del suero…………………. 21 5.5. Evaluación del sistema antioxidante enzimático……………….. 21 5.6. Evaluación de la capacidad antioxidante del sistema no enzimático por FRAP…………………………………………………….. 23 5.7. Determinación de los marcadores de estrés oxidante hepático.. 23 5.8. Análisis estadístico………………………………………………….. 25 6. Resultados. 6.1. Efecto del tratamiento con infusión de HSL en las características generales y del suero de los animales 6.1.1 Presión arterial sistólica……………………………………... 26 6.1.2 Peso corporal………………………………………………… 26 6.1.3 Peso de la grasa intra-abdominal………………………….. 26 6.1.4 Colesterol……………………………………………………... 26 6.1.5 Triglicéridos…………………………………………………… 26 6.1.6 Glucosa……………………………………………………… 27 6.1.7 Insulina………………………………………………………... 27 6.1.8 Índice HOMA…………………………………………………. 27 6.1.9 Glicación avanzada de las proteínas séricas…...………… 27 VII 6.2. Efecto del tratamiento con HSL sobre el sistema antioxidante enzimático 6.2.1 Actividad enzimática de catalasa…………………………... 27 6.2.2 Actividad enzimática de superóxido dismutasa…………... 28 6.2.3 Actividad enzimática de las peroxidasas………………….. 28 6.2.4 Actividad enzimática de glutatión peroxidasa…………….. 28 6.3. Efecto del tratamiento con HSL sobre la capacidad antioxidante del sistema no enzimático y los marcadores de estrés oxidante hepático 6.3.1 Sistema no enzimático………………………………………. 29 6.3.2 Lipoperoxidación……………………………………………... 29 6.3.3 Carbonilación de las proteínas……………………………. 29 7. Discusión……………………………………..…………………………... 30 8. Conclusiones……………………………………………………………. 36 9. Referencias……………………………………………………………... 37 VIII LISTADO DE CUADROS Cuadro 6.1.1. Efecto del tratamiento con diferentes concentraciones de la infusión de HSL sobre las características generales y de algunos componentes del suero de los animales Cuadro 6.3.1. Efecto del tratamiento con diferentes concentraciones de la infusión de HSL sobre la capacidad antioxidante del sistema no enzimático y los marcadores de estrés oxidante hepático IX LISTADO DE FIGURAS Figura 6.2.1. Actividad enzimática de la catalasa hepática en los animales de los grupos control, SM y SM con diferentes concentraciones de la infusión de HSL Figura 6.2.2. Actividad enzimática de la SOD Mn y la SOD Cu-Zn hepática en los animales de los grupos control, SM y SM con diferentes concentraciones de la infusión de HSL Figura 6.2.3. Actividad enzimática de las peroxidasas del hígado en los animales de los grupos control, SM y SM con diferentes concentraciones de la infusión de HSL Figura 6.2.4. Actividad enzimática de la glutatión peroxidasa hepática en los animales de los grupos control, SM y SM con diferentes concentraciones de la infusión de HSL X LISTADO DE ABREVIATURAS ABTS Ensayo de captura de radicales libres (siglas en inglés) ABTS+ Radical catión ABTS AGEs Productos de la glicosilación avanzada ALT Alanina aminotrasnferasa APC Ácido protocatecuíco AST Aspartato aminotransferasa CAT Catalasa SICUAE Subcomité interno para el cuidado y uso de los animales de experimentación COX-2 Ciclooxigenasa 2 DPPH 1,1-difenil-2-picrilhidrazil ECA Enzima convertidora de angiotensina EDTA Etilendinitrilotetracetato disódico eNOS Sintasa del óxido nítrico endotelial ERO Especies reactivas de oxígeno FMVZ Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia FRAP Reducción férrica/ poder antioxidante (siglas en inglés) GHS Glutatión reducido GLUT4 Transportador de glucosa tipo 4 (siglas en inglés) GPX Glutatión peroxidasa GSSG Disulfito de glutatión (estado oxidado del glutatión) (+)- HCA (+)- Hidroxicitrato (-)- HCA (-)- Hidroxicitrato XI H2O2 Peróxido de hidrógeno HDL Lipoproteína de alta densidad HGNA Hígado graso no alcohólico HOMA Modelo de valoración de la homeostasis (siglas en inglés) HSL Hibiscus sabdariffa lineaus iNOS Sintasa del óxido nítrico inducible LDH Lactato deshidrogenasa LDL Lipoproteína de baja densidad LDLox Lipoproteína de baja densidad oxidada LPS Lipopolisacárido MCP1 Proteína quimiotáctica de monocitos 1 (siglas en inglés) MDA Malondialdehído NADPH Dinucléotido de nicotinamida-adenina fosfato reducido NAPQI N-acetil-p-benzoquinona imina NBT nitroazul de tetrazolio NO Óxido nítrico NR No radicales O2 Anión superóxido OH Radical hidroxilo ONOO- Peroxinitrito ORAC Capacidad de absorbancia del radical oxigeno (siglas en inglés) PAS Presión arterial sistólica RBP4 Proteína ligadora de Retinol 4 (siglas en inglés) XII RL Radicales libres ROORadical peroxilo SM Síndrome metabólico SOD Cu-Zn Superóxido dismutasa cobre-zinc SOD Mn Superóxido dismutasa manganeso SOD Superóxido dismutasa STZ Estreptozotocina TBARS Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (siglas en inglés) t-BHP Tert-butil hidroperóxido TEMED N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina TNFα Factor de necrosis tumoral α (siglas en inglés) XO Xantina oxidasa 1 1.- INTRODUCCIÓN Uno de los problemas de salud más severos en el mundo es el síndrome metabólico (SM), el cual es dependiente de la capacidad antioxidante del organismo [Pérez T.I., et al, 2009]. El SM se caracteriza por la asociación de al menos tres de las siguientes patologías: hipertensión arterial, dislipidemia, resistencia a la insulina, hiperglucemia y obesidad [Grundy S.M., 2008]. La prevalencia de éste síndrome en la población humana se ha incrementado en los últimos años, debido al alto consumo de carbohidratos y poca actividad física convirtiéndose en una epidemia mundial [Baños Gb., et al, 2005]. En el 2006 se informó que la prevalencia de la enfermedad en Australia correspondía al 44.2% de su población (18.8% hombres y 25.4% mujeres), en E.U.A 68% (34% hombres y 34% mujeres) y en Japón 83% (45% hombres y 38% mujeres) [Panchal S. K. y Brown L., 2011]. Asimismo se reportó que en Latinoamérica la Cuidad de México ocupaba el primer lugar en la prevalencia de SM (27%), seguido por Barquisimeto (21%) y Bogotá (20%); mientras que la menor prevalencia de SM se encontró en Lima (18%), Buenos Aires (17%) y Quito (14%) [Escobedo J., et al, 2009]. Además se ha observado que 70% de los pacientes adultos y 25.6% de los pacientes pediátricos con SM presentan hígado graso no alcohólico (HGNA) [Nseir W., et al, 2010; Patton H.M., et al, 2010]. El HGNA es resultado del incremento en la concentración de ácidos grasos libres séricos y su acumulación en forma de triglicéridos en el tejido hepático durante un estado de resistencia a la insulina.[Ruiz R.A., et al, 2011]. Aún más, se ha comprobado en pacientes con SM presentan una baja concentración de carotenoides, ácido ascórbico, vitamina E, vitamina A y selenio [Ford E.S., et al, 2003]. Por lo tanto, la ingesta de antioxidantes a través de algunos alimentos podría contribuir a disminuir los procesos endógenos de oxidación y aminorar las consecuencias negativas derivadas del estrés oxidante. Estudios recientes indican que tanto los cálices como la infusión de Hibiscus sabdariffa l (HSL) tienen 2 propiedades antioxidantes [Wang C.J., et al, 2000; Ali B.H., 2003; Liu J.Y, 2006; Wang S.C., 2009; Liu L.C., 2010], que podrían ser capaces de modular el estrés oxidante presente en el SM, a fin de proteger los componentes celulares de los daños por oxidación y frenar la progresión de este padecimiento. Este trabajo aborda el empleo sistemático de un alimento al cual se le ha demostrado una importante actividad antioxidante. En efecto, la infusión de los cálices de la planta Hibiscus sabdariffa l, mejor conocida como agua de jamaica, posee propiedades antioxidantes, con capacidad de prevenir o limitar el estrés oxidante presente en un modelo de roedor con SM. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wang%20CJ%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Liu%20JY%22%5BAuthor%5D 3 2.- MARCO TEÓRICO 2.1 La dieta como factor modulador del estrés oxidante La capacidad antioxidante de algunos alimentos contenidos en diversos patrones dietéticos se deriva del potencial acumulativo y sinérgico que muestran vitaminas, polifenoles, carotenoides y algunos minerales, así como de su capacidad para interactuar entre sí [Saura-Calixto F. y Goñi I., 2009]. A continuación se comentan algunos aspectos generales de dos patrones dietéticos, el mediterráneo y el occidental. El patrón dietético mediterráneo se caracteriza por un alto consumo de frutas, vegetales, legumbres, cereales, frutos secos, semillas y el uso del aceite de oliva como la principal fuente de grasa; un consumo bajo de carne roja, cremas, bebidas azucaradas y mantequilla; un consumo moderado de pescado, cerdo, así como un consumo moderado de vino tinto, casi siempre durante las comidas [Sofi F., 2009]. Por sus efectos benéficos sobre la salud, se le considera como uno de los patrones dietéticos mejores del mundo [Roman B., et al, 2008]. En contraste patrón de dieta occidental se caracteriza especialmente por el elevado consumo de ácidos grasos saturados y grasas trans [Moreno J.A., et al, 2008]. Diversos tipos de estudios han mostrado una clara asociación entre el consumo de alimentos con un alto contenido de grasa saturada y el aumento de triglicéridos, la presencia de estrés oxidante, de procesos inflamatorios de bajo grado, de disfunción endotelial y el aumento de la presión arterial sistólica (PAS) [Jakulj F., et al, 2007; Blum S., et al, 2006] Con base en lo anterior, se han realizado estudios sobre la relación existente entre la aparición de enfermedades degenerativas en las cuales frecuentemente subyace un incremento del estrés oxidante [Johnston C., 2009], con el consumo de determinados alimentos, o con el hábito de adoptar ciertos patrones de alimentación o estilos de vida. Así, se ha demostrado una asociación inversa entre el consumo de frutas y verduras, o cereales enteros, y el riesgo de mortalidad por 4 enfermedades cardiovasculares, cáncer y otras patologías crónicas [Genkinger J.M., et al, 2004; Slavin J., 2004; Hu FB., 2003]. Con base en éstos y otros estudios se recomienda la ingesta elevada de antioxidantes a través de algunos alimentos para limitar los procesos de oxidación a nivel endógeno y disminuir así las consecuencias negativas derivadas del estrés oxidante frecuente en las poblaciones urbanas [Haldar S., et al, 2007]. En conclusión, los patrones dietéticos de una población se relacionan con la capacidad del individuo para regular de manera más adecuada las condiciones donde se incremente el estrés oxidante. 5 2.2 Hibiscus sabdariffa l como fuente de antioxidantes Conocida como serenten en la India y aleluya en Malasia, lugares de donde es originaria y se ha sembrado desde hace más de tres siglos. Fue introducida por el comercio chino a la zona tropical de África, de ahí fue llevada a España, para finalmente formar parte de la flora de México durante la época de la colonia [Morton J.F., 1987]. Aquí se convirtió en un sabor representativo de México donde es conocida como flor de jamaica [Sáyago-Ayerdi S.G., et al, 2010]. Se ha utilizado la infusión de HSL en México y en otras partes del mundo para tratar desórdenes gastrointestinales, enfermedades hepáticas, hipercolesterolemias e hipertensión [Farombi E.O. y Fakoya A., 2005]. Actualmente en México la superficie cultivada con HSL es de aproximadamente 19 mil hectáreas, distribuida en 10 estados. Entre los principales estados productores destacan Guerrero, Oaxaca, Michoacán y Nayarit, en donde Guerrero es el principal productor con alrededor de 14,711 hectáreas, con una producción mayor a las 3 mil toneladas de cálices secos por ciclo de cultivo y una derrama económica bruta superior a los $ 47,843. 39 millones de pesos [SAGARPA., 2011]. La planta HSL, pertenece a la familia Malvaceae, género Hibiscus, especie Sabdariffa de la cual existen dos variedades, la variedad Altissima Wester que se cultiva debido a que produce una fibra similar al yute, sus flores son amarillas y sus cálices rojos o verdes, sin embargo no se utilizan en la alimentación humana. La otra variedad es la Sabdariffa de la que a su vez se han identificado 4 sub variedades: Bhagalpuriensi, de cálices verdes con franjas rojas que no son comestibles, Intermedius y Albus ambas producen fibra y presentan cálices comestibles de color amarillo-verde y finalmente Ruber conocida en el mercado por poseer cálices comestibles de color rojo [Morton J.F., 1987]. Hibiscus Sabdariffa var. Sabdariffa subvar. Ruber es igualmente una planta arbustiva de crecimiento anual y propia de climas secos subtropicales, mide aproximadamente 2.5 metros de altura; su tallo es rojo, cilíndrico, liso y suave. Sus hojas son verdes y se observan en ellas venas de color rojo que pueden ser largas http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22S%C3%A1yago-Ayerdi%20SG%22%5BAuthor%5D 6 o cortas; crecen de manera alterna y miden de 7.5 a 12.5 centímetros de longitud. Las hojas de la parte baja pueden contener de tres a siete lóbulos con márgenes dentados. Las flores aparecen individualmente en las axilas de las hojas y miden aproximadamente 12.5 centímetros de ancho; son amarillas, con un centro de color rosa a marrón, y cambian a rosado al final del día cuando se marchitan. A esta hora del día, el cáliz, de 3.2 a 5.7 centímetros de longitud, es típicamente rojo y consiste de cinco largos sépalos con un collar (epicáliz) y de ocho a doce hojas delgadas de 3.2 a 5.7 centímetros dispuestas alrededor de la base. El collar comienza a ensancharse haciéndose carnoso, quebradizo, jugoso y envuelve completamente la cápsula aterciopelada de 1.25 a 2 centímetros de longitud. La cápsula es verde cuando está inmadura y tiene cinco válvulas. Cada válvula contiene de tres a cuatro semillas afelpadas de color ligeramente café y en forma de riñón que miden de 3 a 5 milímetros de longitud [Morton J.F., 1987]. La composición proximal de los cálices de HSL puede variar dependiendo de la variedad genética, el tipo de suelo de cultivo, o del método que se utilice para determinar su composición, por lo que los valores que se presentan en la literatura son heterogéneos; sin embargo tiene un contenido apreciable de proteína (17.4 g/100 g de MS), cenizas (12.0 g/100 g de MS). Ahora bien, en cuanto a los minerales contiene potasio (2732 mg/ 100 g de MS) y Ca++ (1602 mg/ 100 g de MS) y están presentes en mayor proporción que los demás minerales, sin embargo, contiene hierro, magnesio, zinc. Contiene vitaminas tales como: ácido ascórbico, niacina, tiamina y riboflavina. El componente mayoritario de los cálices de HSL es la fibra dietética 33.9 g/ 100 g de MS [Morton J.F., 1987; Sáyago-Ayerdi S.G., et al, 2007; Sáyago-Ayerdi S.G., et al, 2010]. Existen reportes donde se indica que esta fibra dietética presente en los cálices de HSL posee cantidades apreciables de ingredientes naturales asociados a la matriz del conjunto de compuestos no digestibles, con una elevada capacidad antioxidante [Sáyago-Ayerdi S.G., et al, 2007; Sáyago-Ayerdi S.G., et al, 2010], pues se ha estimado que la capacidad antioxidante total de la infusión de HSL, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22S%C3%A1yago-Ayerdi%20SG%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22S%C3%A1yago-Ayerdi%20SG%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22S%C3%A1yago-Ayerdi%20SG%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22S%C3%A1yago-Ayerdi%20SG%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22S%C3%A1yago-Ayerdi%20SG%22%5BAuthor%5D 7 calculada a través de la capacidad para capturar radicales libres es de 335.1 μMol de equivalentes trolox para neutralizar al radicalcatión ABTS+, mientras que por ORAC es de 621.8 μM equivalentes trolox. Finalmente por la capacidad reductora (FRAP) es de 312 μM equivalentes trolox, ésta capacidad reductora se explica en 95.24% de las ocasiones por la cantidad de polifenoles presentes en el agua [Sáyago-Ayerdi S.G., et al, 2010]. Tanto en los cálices como en la infusión de HSL se ha observado la presencia de algunos de estos compuestos fenólicos, tales como: ácido protocatecuíco, antocianinas, quercetina y catequinas. Se ha descrito que en general, el extracto con los polifenoles de HSL protege a los componentes celulares de los daños por oxidación, disminuyendo la peroxidación de los lípidos por captura de radicales libres, incrementa la actividad de las enzimas CAT, GPX y SOD, participa en la regeneración de otros antioxidantes (vitamina C y E) [Wang S.C., et al, 2009], incrementa la concentración del glutatión reducido [Wang C.J., et al, 2000; Ali B.H., et al, 2003; Liu J.Y, et al, 2006; Wang S.C., et al, 2009; Liu L.C., et al, 2010], inhibe la actividad de las enzimas xantina- oxidasa (XO) [Tseng T.H., et al, 1997] y de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) [Herrera-Arellano .A., et al, 2007; Ojeda D., et al, 2010]. Posee efectos antiinflamatorios por una modulación de la ciclooxigenasa 2 (COX-2) y de la sintasa del óxido nítrico inducible (iNOS), con lo que previene la síntesis de la prostaglandina E2 (PGE2) y de NO respectivamente, evita la apoptosis de las células hepáticas por inhibición de la activación de los factores de transcripción p- JNK y p38 MAPK activados durante la inflamación [Kao E.S., et al, 2009]. Finalmente baja los niveles séricos de triglicéridos y lipoproteínas de baja densidad (LDL) e incrementa la concentración de lipoproteínas de alta densidad (HDL), aminora la hiperglucemia y el depósito de los productos de la glicación avanzada (AGEs); con lo que abate el desarrollo y/o la progresión de la aterosclerosis [Wang S.C., et al, 2009]. A continuación se describirán las acciones de los polifenoles de HSL más estudiados, así como de otros compuestos antioxidantes que también han sido aislados de los cálices de la planta. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22S%C3%A1yago-Ayerdi%20SG%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wang%20CJ%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Liu%20JY%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tseng%20TH%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term= http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kao%20ES%22%5BAuthor%5D 8 2.2.1 Ácido protocatecuíco (APC). El APC posee la actividad antioxidante más fuerte de todos los polifenoles contenidos en los cálices de HSL. Hirupanch V. y colaboradores [2005] reportan que por cada 25mg de cálices secos de HSL existen aproximadamente 10.98µg de APC. En este mismo estudio se midió la oxidación in vitro de las LDL por CuSO4 a través de la formación de malondialdehído (MDA), se usó a la vitamina E como estándar y el APC como inhibidor de la oxidación de las LDL, y se encontró que el APC mostró un efecto antioxidante dosis-dependiente ya que a 0.25mg/ml la capacidad de inhibir la formación de LDLox fue 50% mayor, mientras que una concentración de 5mg/ml el APC inhibe completamente la formación de MDA, cabe destacar que cuando se usan los 5mg/ml es más efectivo que 100μM de vitamina E. Sin embargo Lee M.A. y colaboradores [2002] compararon la eficiencia in vitro del APC a una concentración de 1mM con la vitamina E, Vitamina C y curcumina para inhibir la oxidación de las LDL inducida por CuSO4 y observaron que la capacidad del APC para disminuir la formación de MDA es mayor que cuando se usa vitamina C y curcumina pero inferior a la capacidad de la vitamina E. No obstante, el APC demostró tener un efecto protector sobre los antioxidantes endógenos de las LDL (γ-tocoferoles y β-carotenos) contra la oxidación, lo que evita que estos últimos se agoten y eventualmente disminuya el riesgo de favorecer la ateroesclerosis. También se ha reportado un efecto hepatoprotector in vitro del APC contra los daños por oxidación generados por tert-butil hidroperóxido (t-BHP). Este compuesto al ser metabolizado por los hepatocitos promueve la oxidación de dos maneras: la primera es por medio del citocromo p450, donde se forman radicales peroxilo y alkoxilo capaces de reaccionar con los lípidos, proteínas y ácidos nucleicos; la segunda es que reacciona con la GPX y libera t-butanol y glutatión oxidado. Es bien sabido que la actividad de la GPX es dependiente del glutatión reducido, el cual proviene de la acción de la enzima glutatión reductasa que utiliza como cofactor al NADPH. Ahora bien, se sabe que si el glutatión reducido 9 se agota por exceso de oxidación de los nucleótidos de pirimidina, se altera la homeostasis del Ca++ [Tseng T.H., et al, 1996]. En este caso el APC (0.05mg/ml y 0.10mg/ml) aminora el daño generado por el t-BHP, lo que disminuye la formación de MDA y baja el nivel de LDH y ALT en los hepatocitos [Tseng T.H., et al, 1996]. Asimismo se ha observado este efecto hepatoprotector en vivo del APC con un modelo de estrés oxidante en ratón BALB/c inducido por paracetamol. El daño causado por el paracetamol es mediado por su metabolito reactivo, N-acetil-p- benzoquinona imina (NAPQI), que resulta de su oxidación por el citocromo p- 450. Este metabolito reacciona con el glutatión reducido mitocondrial y citosólico agotándolo, disminuyendo con ello la capacidad antioxidante del hígado. Cuando esto sucede, el NAPQI se une a las proteínas mitocondriales causando el desacoplamiento de la fosforilación oxidativa, lo cual libera ERO, y con ello se incrementa la expresión y activación de Bax, tBib y pJNK, que a su vez activan la apoptosis celular vía mitocondrial. En especial la activación prolongada de JNK1 puede generar la degradación del cFLIP, un inhibidor del receptor de señalamiento de muerte celular. En este caso el APC disminuye la formación de MDA, incrementa la actividad de la enzima CAT, e incrementa el nivel de glutatión reducido y aumenta la capacidad antioxidante del hígado, con lo que se evita así la expresión de Bax, tBib y pJNK, y en consecuencia se inhibe la apoptosis celular [Liu L.C., et al, 2010]. En un modelo en rata en donde se indujo el estrés oxidante por aplicación de LPS se observó un incremento en la producción de O2 y H2O2 así como NO generado por la iNOS. Dicha enzima no se expresa bajo condiciones normales, pero sí durante la inflamación, lo que se refleja en la producción de nitritos, que al reaccionar con el O2 forman peroxinitritos altamente reactivos y tóxicos para los hepatocitos. El APC mostró tener potencial de inhibir a la iNOS evitando el daño causado por el LPS [Lin W.L., et al, 2006]. 10 Se ha demostrado que el APC es un agente eficaz para aminorar la acción carcinogénica de la dietilnitrosamina en el hígado, 4-nitroquinolina en la cavidad oral, azoximatano en el colon, N-metil-N-nitrosourea en el tejido glandular del estómago y N-butil-N-nitrosamina en la vejiga; sin embargo aún se desconoce el mecanismo químico por el cual el APC suprime el proceso de carcinogénesis [Tseng T.H., et al, 1996]. 2.2.2 Antocianinas. Se ha reportado que las antocianinas, delfinidina y cianidina- 3-0-sambubiosidos, presentes en la infusión de HSL, tienen un efecto antihipertensivo gracias a dos mecanismos de acción sinérgicos y complementarios. El primero es diurético, probablemente por una farmacocinética similar a la de los antagonistas de aldosterona (aumenta la eliminación de agua y la natriuresis sin modificación en la excreción de potasio) [Herrera-Arellano .A., et al, 2007]. El segundo es como inhibidor por competencia de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) [Ojeda D., et al, 2010]. Se piensa que éste efecto se debe a su estructura planarígida y a la presencia de una orto-hidroxilación en el anillo aromático, siendo más efectiva la delfidina quizá porque tiene un grupo hidroxilo más en su estructura en comparación con la cianidina. Algunos autores sugieren que los flavonoides y otros polifenoles actúan como quelantes del átomo de zinc presentes en el centro activo de la ECA [Ojeda D., et al, 2010], con lo que disminuyen su actividad 29.75%, sólo 15.79% menos que el lisinopril; mientras que su efectividad para el tratamiento de la hipertensión arterial es de 65.12% siendo superior el tratamiento con lisinopril en 17.02%. Sin embargo la tolerabilidad del tratamiento con HSL en los pacientes es 100%, algo que no logra el lisinopril [Herrera-Arellano .A., et al, 2007]. Asimismo, existe evidencia para afirmar que el extracto acuoso de HSL también funciona como bloqueador de los canales para Ca++ en el músculo liso del endotelio, de este modo disminuye la vasoconstricción [Ajay M., et al, 2007], http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term= http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term= http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term= 11 mientras que en infusión incrementa la función endotelial e inhibe la agregación plaquetaria [McKay D.L., et al, 2010]. Por otro lado, el papel de los procesos de oxidación en las LDL para el desarrollo y progresión de las lesiones ateroescleróticas es determinante, pues se han encontrado acumulaciones de LDL sin oxidar en dichas lesiones. Ahora bien las LDL pueden ser oxidadas ya sea por la presencia de metales de transición, oxidación mediada por enzimas plasmáticas u oxidación mediada por células. Estas LDL al ser oxidadas causan una acumulación de lípidos en los macrófagos y con ello la formación de células espumosas, la citotoxicidad de estas LDLox es elevada y favorece la apoptosis de las células, se ha visto que el desprendimiento de la placa aterosclerótica y la muerte celular especialmente de los macrófagos están relacionados [Chang C.Y., et al, 2006]. En relación a dicho efecto degenerativo, las antocianinas de HSL tienen una actividad anti- aterosclerótica, pues funcionan como antioxidantes que evitan la oxidación de las LDL en la pared de las arterias [Chen C.C., et al, 2003], además de reducir la citotoxicidad de las LDLox, previniendo la muerte prematura de los macrófagos, células musculares y células endoteliales [Chang C.Y., et al, 2006]. Se ha observado que la cianidina-3-glucósido después de haber sido absorbida en el yeyuno como glucósido es capaz de reaccionar con los radicales ROO y convertirse en APC. Asimismo, existen reportes donde mencionan que su metabolito, la cianidin anglicona, es inestable en plasma y probablemente sea transformada también en APC. La cianidina-3-glucósido, o sus metabolitos, actúan como antioxidantes en lugar del glutatión y del ácido ascórbico para proteger el hígado en un modelo de estrés oxidante por isquemia-reperfusión en ratas, evitando el agotamiento de ambos antioxidantes naturales [Tsuda T., et al, 2000]. Cabe mencionar otro trabajo en donde la fracción soluble en cloroformo, obtenida a partir de la extracción con etanol de los cálices de HSL, inhibió la actividad de la enzima XO en 94.6% [Kao E.S., et al, 2009], la cual en un proceso de isquemia-reperfusión se desacopla y produce O2 . Existe otro efecto 12 reportado para la cianidina-3-glucósido el cual favorece el incremento de transportadores GLUT4 en la superficie de los adipocitos y la disminución de la proteína RBP4, lo anterior se traduce en una inhibición de las adiponectinas proinflamatorias MCP1 y TNFα, que aumentan el estrés oxidante y la resistencia a insulina. Por lo tanto el tratamiento con cianidina-3-glucósido aminora tanto la hiperglucemia como la cantidad de ERO generadas [Sasaki R., et al, 2007]. Por otro lado, la delfidina-3-glucósido es en sí misma más eficiente que la cianidina-3-glucósido en evitar la formación de MDA y en atrapar a los radicales O2 y OH, dado que en la estructura del anillo-B tiene tres grupos hidroxilo (OH) mientras que la cianidina-3-glucósido tiene dos OH [Tsuda T., et al, 1996]. En otros estudios se ha comprobado que dichos compuestos, que además son pigmentos, tienen la capacidad de quelar radicales como el 1,1-difenil-2- picrilhidrazil (DPPH), evitar el agotamiento del glutatión reducido y disminuir los niveles de MDA en tejido hepático en un modelo de estrés oxidante inducido en ratas por t-BHP hidroperóxido [Wang C.J., et al, 2000]. Además se ha documentado que los compuestos que nos ocupan son capaces de disminuir los niveles séricos de las enzimas ALT y AST en un modelo de estrés oxidante inducido en ratas por paracetamol [Ali B.H., et al, 2003] y tetracloruro de carbono [Liu J.Y., et al, 2006]. 2.2.3 Epigalocatequina-3-O-galato. En un modelo de rata con nefropatía diabética inducida por la administración de estreptozotocina (STZ) en donde la destrucción de las células β del páncreas causa hiperglucemia y daño renal, se observó que la epigalocatequina-3-O-galato aminora la toxicidad de la STZ y el daño renal relacionados con el metabolismo anormal de la glucosa asociado al estrés oxidante, pues reacciona con las ERO y es capaz de regenerar otros antioxidantes, disminuyendo la formación de MDA por la lipoperoxidación y la acumulación de AGEs. Además, el compuesto inhibe la síntesis de NO por la iNOS, también inhibe a expresión de la COX-2 y tiene efectos similares a la insulina, pues reprime la síntesis de glucosa al reducir los niveles de RNAm para 13 la síntesis de enzimas de la gluconeogénesis [Wang S.C., et al, 2009; Yamabe N., et al, 2006]. 2.2.4 Quercetina. La quercetina es un flavonoide aislado de los cálices de HSL, que modula la biosíntesis de eicosanoides lo que favorece un efecto antiinflamatorio, evita la agregación plaquetaria, protege además a las LDL de la oxidación, disminuye la formación de MDA y promueve la relajación del músculo liso vascular. También in vitro se ha mostrado que la quercetina tiene propiedades antiproliferativas y antimutagénicas [Sánchez G.J.I., 2009]. 2.4.5 Ácido hibiscus. Se ha descrito que la infusión de HSL contiene el ácido hibiscus o (+)- hidroxicitrato (HCA), el cual es transformado por la flora intestinal en (-)- HCA [Carvajal-Zarrabal., el al, 2009]. Este ácido inhibe por competencia a la enzima extramitocondrial ATP citrato-liasa, la cual cataliza uno de los pasos más importantes para la síntesis de ácidos grasos: la ruptura del citrato para obtener oxaloacetato y acetil CoA. Asimismo el (-)- HCA inhibe la formación del malonil-CoA, que a su vez, estimula la actividad de la carnitina transferasa lo que resulta en la disminución de la lipogénesis y el incremento en la oxidación de los lípidos y/o la glucogenogénesis [Kovacs E.M., et al, 2001]. Se ha demostrado en roedores que la administración oral del (-)- HCA abate la ingesta de alimento y reduce la ganancia de peso en ratas alimentadas con dietas altas en carbohidratos, como consecuencia de una disminución en la lipogénesis en hígado, tejido adiposo e intestino [Leonhardt M. y Langhans W., 2002]. Asimismo se reporta que el (+)- HCA es un inhibidor de la α-amilasa [Hansawasdi C., et al, 2000] y de la α-glucosidasa, esta última enzima se encarga de degradar los oligosacáridos a monosacáridos antes de ser absorbidos y al inhibir a esta enzima se reduce la absorción de glucosa y en consecuencia los niveles postprandiales de la misma [Hansawasdi C., et al, 2001]. En consecuencia disminuye la generación de Acetil CoA a partir de la glucosa, que sirve como sustrato principal para la síntesis de ácidos grasos, lo que sugiere que el tratamiento con HSL puede disminuir la lipogénesis, ya sea 14 por reducción en la ingesta, la disminución en la absorción de glucosa, o el bloqueo enzimático. Al respecto se ha reportado, que el extracto acuoso de HSLes capaz de inhibir la diferenciación de los adipocitos in-vitro al bloquear la producción de los factores de transcripción necesarios para este proceso, sin afectar con ello la viabilidad de dichas células, asimismo se observó que el extracto acuoso de HSL inhibe en los adipocitos la acumulación de lípidos en 46.6% [Kim J.K., et al, 2007]. 15 2.3 Planteamiento del problema en la rata con SM En el estudio de las causas, la progresión y los agentes terapéuticos relacionados con SM se han utilizado a los roedores como modelo experimental ya que con un tratamiento apropiado es posible reproducir los signos y cambios patológicos presentes en humanos que padecen dicha enfermedad. A pesar de que existen diferentes modelos animales en roedores para estudiar el SM, el que más se asemeja a la enfermedad que se desarrolla en humanos es el modelo en roedores macho basado en una dieta alta en carbohidratos o/y grasas [Panchal S.K. y Brown L., 2011]. En éstos modelos se ha observado que la administración de carbohidratos, como la sacarosa, favorece el aumento de triglicéridos y TBARS en el suero, así como ocurre una disminución en los niveles séricos de GHS y vitamina E [Busserolles J., et al, 2002]. En otro modelo en rata alimentado con fructosa por dos semanas, no se observó un incremento de triglicéridos en el suero, sin embargo, sí existió una reducción en la expresión hepática de CAT y SOD Cu-Zn [Cavarape A., et al, 2001]. De acuerdo con la información previa, el Instituto Nacional de Cardiología: Ignacio Chávez (INCICh), ha desarrollado un modelo en rata con SM a partir del modelo descrito por Reaven y Ho [1991], en el cual las dietas con concentraciones altas de sacarosa o fructosa provocan hipertensión, hipertrigliceridemia, resistencia a la insulina y acumulación de tejido graso intra-abdominal. Las anormalidades metabólicas y funcionales del SM que se observan frecuentemente en el humano, se han reproducido en la rata Wistar mediante la administración de azúcar comercial al 30 % en el agua de bebida. Los hallazgos más relevantes son los siguientes: 1.- La adición de azúcar refinada comercial al agua de bebida (30%) en ratas Wistar produjo hipertensión e hipertrigliceridemia comparables a las encontradas por otros autores que administraron carbohidratos (60%) con el alimento sólido http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term= http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term= 16 [Reaven G. y Ho H., 1991]. En nuestro modelo, únicamente tuvimos que prolongar el tiempo de tratamiento a 24 semanas para obtener diferencias significativas con respecto a los testigos [Baños G., et al, 1997]. 2.- La reactividad vascular de las ratas con SM revela dos tipos de anormalidades: La alteración en el tejido vascular (aórtico y mesentérico) manifiesta por hipercontractilidad a vasoconstrictores e hiporelajación a vasodilatadores dependientes del óxido nítrico endotelial, lo que sugiere daño al endotelio. La presencia de un componente plasmático circulante, posiblemente lípidos alterados, que al ser adicionado in vitro a preparaciones de vasos sanguíneos indujo hipercontractilidad y redujo la respuesta de relajación dependiente de acetilcolina y de óxido nítrico [Pérez I., et al, 2007]. 3.- Se observa un incremento en la acumulación de la grasa intra-abdominal [Martínez A.E., 2006]. 4.- Existe un estado de hiperinsulinemia [El Hafidi M. y Baños G., 1997]. 5.- Se han encontrado diferencias en la composición lipídica asociadas al género [Baños G., 1997], puesto que la composición de los ácidos grasos del plasma de la rata hembra es diferente a la de la rata macho. Cuando se induce estrés oxidante por medio de inyección de fierro dextran en el animal entero, el índice de lipoperoxidación es menor en la hembra que en el macho. Eso se debe probablemente al efecto protector de varios antioxidantes en la hembra [El Hafidi M. y Baños G., 1997; Pérez I., et al, 1999; El Hafidi M., et al, 2000; Baños Ga., et al, 2005], y se puede relacionar con el efecto antioxidante reportado para el estradiol, molécula que posee una estructura química similar a la vitamina E [Busserolles J., et al, 2002]. En general, los cambios causados por el tratamiento en las ratas con SM son más numerosos y desfavorables en los machos. 6.- La dieta alta en sacarosa induce esteatosis hepática en el hígado de la rata con SM [Martínez A.E., 2006], asimismo, se han detectado niveles elevados de ácidos grasos no esterificados (en particular ácido palmítico, palmitoleico y oleico) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term= 17 [Carvajal K., et al, 1999], causando alteraciones en el funcionamiento de las mitocondrias, lo que incrementa la velocidad con la que se libera H2O2 que contribuye al desarrollo de estrés oxidante en el hígado de estos animales [Martínez A.E., 2006]. 7.- El estrés oxidante hepático presente en las ratas con SM se caracteriza por la disminución, tanto en la concentración de glutatión reducido (GHS) como de la actividad de las enzimas SOD y CAT, y con un incremento en la lipoperoxidación y la carbonilación de proteínas [Ruiz R.A., et al, 2011]. 8.- Por sus propiedades fitoquímicas como antioxidante, la infusión de la planta HSL ofrece una acción promisoria en la desaceleración del SM y sus daños a nivel hepático, puesto que en ratones tratados con el extracto acuoso de HSL se observó un mecanismo hepato-protector que aminora el estrés oxidante al incrementar la actividad de CAT y GPX y al disminuir la peroxidación de lípidos, se evita la muerte celular [Liu L.C., et al, 2010]. Sin embargo, en los reportes de otros autores prevalece una ausencia en la estandarización sobre el proceso de extracción de los principios activos, los detalles de la administración, ni las dosis manejadas, las cuales van desde 100mg a 5000mg/kg de peso [Ali B.H., et al, 2003]. Al considerar las observaciones anteriores que indican una disfunción de los sistemas antioxidantes, metabólicos y funcionales en el roedor con SM y con base en las propiedades antioxidantes de los cálices de Hibiscus sabdariffa l, se propuso estudiar su participación en la modulación del estrés oxidante en un modelo de rata con SM. 18 3. HIPÓTESIS Las propiedades fitoquímicas de la infusión de los cálices de HSL disminuirán el estrés oxidante hepático observado en el modelo de rata con SM y tenderán a revertir las modificaciones observadas. 19 4. OBJETIVOS 4.1 General: Estudiar la respuesta antioxidante de concentraciones crecientes de una infusión de los cálices de HSL en el hígado de ratas sometidas a un modelo experimental de SM. 4.2 Particular: Determinar el efecto antioxidante de la infusión de los cálices de HSL en el hígado de ratas con SM a través de algunos marcadores de estrés oxidante: carbonilación de las proteínas, lipoperoxidación, así como glicación de las proteínas séricas; la capacidad antioxidante total (FRAP), la actividad enzimática de peroxidasas, GPX, SOD Mn, SOD Cu-Zn y CAT. 20 5. MATERIAL Y MÉTODOS 5.1 Ubicación e infraestructura requerida. Este proyecto se realizó de manera conjunta en el INCICh y en la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UNAM que se ubican en la zona sur del Distrito Federal. Los animales que se usaron estuvieron bajo el resguardo del Bioterio del INCICh, durante 24 semanas. 5.2 Preparación de la infusión de HSL. A un litro de agua en ebullición se le agregaron 7.5, 15, 30 y 60 g de cálices de HSL de acuerdo al porcentaje de concentración 0.75%, 1.5%, 3% y 6% respectivamente. Se dejó hervir 10 minutos más, se dejó enfriar, se coló y se agregaron 300 g de sacarosa. 5.3 Animales y dieta. Se usaron 60 ratas Wistar machos con peso de 150 ± 5 gramos, para formar 6 grupos con 10 animales cada uno como se indica a continuación: Grupo 1 Control (agua), grupo2 SM (sacarosa 30%), grupo 3 SM+HSL 0.75%, grupo 4 SM+HSL 1.5%, grupo 5 SM+HSL 3%, grupo 6 SM+HSL 6%. Los animales estuvieron durante 24 semanas bajo las siguientes condiciones: ciclo de 12 horas luz/12 obscuridad, temperatura ambiental y la humedad relativa entre los rangos de 18-26 °C y 40-70% respectivamente. El alimento comercial para roedores adicionado con 23% de proteína cruda, 4.5% de grasa cruda, 6% fibra cruda, 8% cenizas y 2.5% minerales, (Labdiet 5008; PMI Nutrition International, Richmond, IN.) fue suministrado a libre acceso. Finalmente, el tratamiento con HSL fue proporcionado vía oral (ad libitum) en el agua de bebida. A las 24 semanas, los animales fueron pesados y se les tomó la presión arterial sistólica (PAS) por medio de un pletismógrafo. Este aparato consiste en un sistema que utiliza un sensor, colocado en la cola del animal, conectado a un transductor de presión (SPEM) que envía las señales a una computadora equipada con un programa para la captura y procesamiento de datos (SIEVART versión 0.1). Finalmente los animales fueron sometidos a eutanasia con guillotina, previa sedación de acuerdo a lo establecido por la NOM ZOO 062- 21 1999, la American Veterinary Medical Association. Guidelines on Euthanasia [2007] y el SICUAE de la FMVZ. Se colectó la sangre y se centrifugó por 20 minutos a 3000 rpm a 4°C obteniéndose el suero que se almacenó a -70ºC. El hígado se extrajo y disecó en fresco, posteriormente se homogeneizó en solución de sacarosa (0.25mM sacarosa, 10mM Tris, 1mM de etilendinitrilotetracetato disódico (EDTA) a pH de 7.35) con inhibidores de proteasas (1 mM PMSF, 2 μM pepstatina A, 2 μM leupeptina y 0.1% de aprotinina) y se centrifugó a 2500 rpm durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante se separó y almacenó a -70°C. La determinación de las proteínas totales del homogeneizado se realizó según el método descrito por Lowry, et al [1951]. Se disecó y pesó el contenido de grasa intra-abdominal. 5.4 Bioquímica, glicación avanzada de las proteínas séricas e índice HOMA. La determinación de glucosa, colesterol, triglicéridos, insulina y glicación se llevó a cabo por medio de kits comerciales (Pointe Scientific Inc. Canton, Michigan, USA). El Modelo de valoración de la homeostasis o índice HOMA (por sus siglas en inglés) permite evaluar la resistencia a la insulina, mediante la relación que existe entre las concentraciones de insulina y de glucosa plasmáticas. Se calculó con la siguiente fórmula: (Insulina μUI/ml * Glucosa mmol/L)/22.5. Cuando el índice HOMA es <2.5 se considera como normal, cuando es >2.5-3 se dice que hay deterioro de la sensibilidad a insulina en los tejidos, sin embargo, si este índice es >3, es indicativo de la resistencia a la insulina [Matthews D.R., et al,1985]. 5.5 Evaluación del sistema enzimático antioxidante. La determinación de la actividad de las enzimas antioxidantes se realizó después de separarlas mediante geles nativos de poliacrilamida, siguiendo la técnica descrita por Laemmli [1979]. El gel concentrador al 4 % se elaboró con 3 ml de agua desionizada y destilada, 1.25 ml de amortiguador pH 6.7, 0.66ml de solución de acrilamida/bis-acrilamida 30 %, 0.015 %de persulfato de amonio y 0.01 % de 22 N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina (TEMED). El gel resolvedor al 8 % se elaboró con 4.73 ml de agua desionizada y destilada, 2.53 ml de amortiguador pH 8.9, 2.43 ml de solución de acrilamida/bis-acrilamida 30 %, 0.008 % de persulfato de amonio y 0.02 % de TEMED. Los geles se cargaron con 100ng de catalasa (Sigma C-40), 150ng de SOD (Sigma S-2515) como estándar y 50 µg de proteína proveniente de los homogenados de hígado por muestra, mientras que para la actividad de peroxidasa se cargaron 8μg de peroxidasa (Sigma P-8375) y 300μg de proteína. La electroforesis se corrió en un amortiguador de tris-glicina pH 8.3 a 15-25mA. Al término de la electroforesis y para determinar la actividad de la CAT [Pérez– T.I., et al, 2009] el gel se lavó con agua destilada por 5 minutos, este procedimiento se realizó tres veces, se incubó con H2O2 por 20 minutos, se decantó la solución de H2O2 después se incubó con una mezcla al 1 % de K3Fe (CN)6 y 1 % de FeCl36H2O por 10 minutos en la obscuridad, por último se lavó con agua destilada para detener la reacción. Para determinar la actividad de la SOD [Pérez–T.I., et al, 2009], el gel se lavó con agua destilada por 5 minutos para después incubarse con 2.45mM de nitroazul de tetrazolio (NBT) por 20 minutos, se decantó la solución de NBT y se incubó en una solución de EDTA 28mM, riboflavina 0.028mM, amortiguador de fosfatos 36mM pH 7.8 durante 15 minutos, después fue expuesto a una lámpara de luz UV durante 10 minutos y se lavó con agua destilada para detener la reacción. Finalmente para observar la actividad de peroxidasa, el gel se lavó con agua destilada por 5 minutos y se reveló de acuerdo a una modificación del método de Abrams y Webster [1990] incubando en una mezcla con 0.3mg/ml 3,3’,5,5’- tetrametilbenzidina disuelta en una solución de etanol, ácido acético y agua (1:1:1 v/v) con H2O2 durante 10 minutos en obscuridad. Los geles fueron analizados por densitometría con un analizador de imágenes Sigma Scan Pro 5 23 y los cálculos para estimar la actividad enzimática se realizaron de acuerdo a lo descrito por Chen C-N y Pan S-M [1996]. La actividad de la enzima GPX puede ser determinada indirectamente por la cantidad de NADPH que es oxidado, ya que esta reacción requiere de glutatión reducido cuya disponibilidad depende de la actividad de la glutatión reductasa, la desaparición del NADPH puede ser monitoreada por espectrofotometría. Para medir la actividad de GPX, 1 mg de proteína del homogeneizado hepático fue suspendido en 1.6 ml de amortiguador de fosfatos 50mM (pH 7.0) adicionado con NADPH 0.2mM, GSH 1mM y glutatión reductasa 1UI/ml. La mezcla se incubó 5 min a temperatura ambiente, después de este tiempo se adicionó el H2O2 y se leyó inmediatamente a 340nm (lectura inicial) y nuevamente a los 5 min (lectura final) [Paglia D.E. y Valentine W.N., 1967; Laurence R.A. y Burk R.F., 1976; Flohé L. y Günzler W., 1984]. 5.6 Evaluación de la capacidad antioxidante del sistema no enzimático por FRAP. Se basa en la reacción de los antioxidantes presentes en la muestra y el cloruro de hierro (FeIII) en un medio ácido, formándose ion ferroso (FeII), el cual es capaz de unirse al 2,4,6,-Tris2-pyridil-s-triazine para generar un compuesto color azul. A 1 mg de proteína del homogeneizado hepático se le agregaron 1.5 ml de mezcla de reacción; la cual consistió de 300mM de amortiguador de acetatos pH 3.6, 20mM de hexahidrato de cloruro férrico, 10mM de 2,4,6,-Tris2- pyridil-s-triazine disuelto en 40mM de HCl en una relación 10:1:1 v/v respectivamente; se mezcló vigorosamente en vortex por 5 segundos y se incubó a 37ºC por 15 minutos en obscuridad, finalmente se centrifugó a 5000rpm. La absorbancia se midió a 593nm en un espectrofotómetro (UNICO UV 2100). La curva de calibración se obtuvo utilizando Fe 2+ (FeSO4) [Benzie I.F.F. y Strin J.J., 1996; Benzie I.F.F. y Strin J.J., 1999]. 5.7 Determinación de los marcadores de estrés oxidante hepático. Determinación de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARs). Esta prueba se basa en la reacción del malondialdehído, que es un producto 24 secundario de la oxidación de los ácidos grasos de 3 o más ligaduras con el ácido tiobarbitúrico en un medio ácido y alta temperatura, lo que genera un producto de color rosa [Gutteridge J.M., 1975]. Para realizar esta medición, a 1 mg de proteína del homogeneizado hepático se le agregaron 50 µl de metanol con BHT al 4 % más 1 ml de amortiguador de fosfatos a pH de 7.4, se mezcló vigorosamente en vortex por 5 segundos, se incubó 30 minutos en baño María a 37°C, al final de la incubación, se agregó 1.5 ml deácido tiobarbitúrico al 0.8 M y se incubó una hora en baño maría a 100°C. Después de ese tiempo y para detener la reacción, las muestras se colocaron en hielo y se agregó 1ml de KCL al 5% por muestra más 5ml de n-butanol, se mezcló vigorosamente con vortex por 30 segundos y se centrifugó a 2000 rpm a temperatura ambiente durante 2 minutos. Después de dos minutos se extrajo la fase de n-butanol y se midió la absorbancia en un espectrofotómetro a 532nm. La curva de calibración se realizó utilizando tetraetoxipropano [Pérez–T.I., et al, 2009]. Carbonilación de proteínas. La formación de grupos carbonilo en los residuos de los aminoácidos de las proteínas es una evidencia de una modificación oxidativa, que puede medirse por medio de un complejo hidrazona estable el cual resulta de la unión selectiva del compuesto 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNFH) con los grupos carbonilos de las proteínas [Levine R.L., et al 1990]. Para medir esta oxidación en las proteínas, se le agregó a 1 mg de proteína del homogeneizado hepático, 500μl de ácido clorhídrico 2.5N o 500μl de 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNFH) 10mM, se mezcló vigorosamente en vortex e incubó en obscuridad a temperatura ambiente por una hora agitando en vortex cada 15 minutos. Al término de la incubación, se agregó 500μl de ácido tricloro acético al 20%, se centrifugó a 15,000g por 5 minutos y se desechó el sobrenadante. El precipitado se removió suavemente con un capilar cerrado y se agregaron 1000μl de etanol / etilacetato, dejando reposar 10 minutos para favorecer la eliminación de la DNFH, se mezcló con vortex y centrifugó a 15,000g por 10 minutos, este proceso se repitió dos veces más. Finalmente se agregaron 1000μl de solución de hidrocloruro de guanidina 6M, con 20mM de fosfato monobásico (KH2PO4) a pH 25 de 2.3 y se incubó nuevamente a 37°C por media hora. Se leyó la absorbancia por espectrofotometría a 370nm utilizando aire como blanco y un coeficiente de absorción molar de 22000M-1cm-1 [Levine R.L., et al, 1990; Reznick A.Z. y PackerL., 1994; Dalle-Donne I., et al, 2003] 5.8 Método estadístico. El análisis de los datos obtenidos se realizó con un análisis de varianza aleatorizado de un solo factor a un nivel de significancia de α <0.05, de acuerdo con el siguiente modelo [Ducoing W.A.M., 2013]. Yij =μi + εij Donde: Yij = Respuesta de la unidad experimental j del tratamiento i. μi= Promedio de las respuestas de todas las unidades experimentales que reciben el tratamiento i. εij= Error o residual de la unidad experimental j que recibió el tratamiento i, independientes e idénticamente distribuidos como N(0,σ2). Para evaluar las diferencias entre cada una de las medias estudiadas se realizó una prueba de Tukey con un nivel de significancia de α <0.05, ambas pruebas se realizaron con el programa Sigma Plot (SigmaPlot versión 11, Jandel Corporation, 1986-2005). Los datos se presentarán como la media ± error estándar. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Levine%20RL%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Reznick%20AZ%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dalle-Donne%20I%22%5BAuthor%5D 26 6. RESULTADOS Los resultados obtenidos se presentan mediante cuadros ó gráficos haciendo apartados que engloban las variables estudiadas. 6.1. Efecto del tratamiento con infusión de HSL en las características generales y del suero de los animales. 6.1.1. Presión arterial sistólica En el cuadro 6.1.1 se observa que en el grupo C la PAS fue menor (p <0.001) que la del grupo SM. Mientras que el tratamiento con HSL disminuyó (p <0.001) la PAS en los grupos SM+HSL al 0.75%, 1.5% y 3%. 6.1.2. Peso corporal El peso del grupo C fue menor (p<0.001) que el del grupo SM, sin embargo al comparar el grupo SM con los grupos que recibieron tratamiento de HSL al 0.75%, 3% y 6% se observó que el peso corporal fue menor (p<0.05) (cuadro 6.1.1). 6.1.3. Peso de la grasa intra-abdominal En el cuadro 6.1.1 se observa que el peso de la grasa del grupo SM fue mayor (p <0.001) que el del grupo C, SM+HSL (al 3%) y SM+HSL (al 6%) por 4.51 g (p=0.01) y 7.91 g (p<0.001), respectivamente. 6.1.4. Colesterol No existió diferencia significativa en la concentración del colesterol entre el grupo C y SM, sin embargo al comparar el grupo SM con los grupos que recibieron tratamiento de HSL se observó que la concentración de colesterol fue menor en los grupos SM+HSL al 1.5, 3% y 6% (p <0.001) (cuadro 6.1.1). 6.1.5. Triglicéridos En el cuadro 6.1.1, se puede observar que los triglicéridos séricos en el grupo SM se encuentran elevados (p <0.001) en comparación con el grupo C. El 27 tratamiento con HSL disminuyó (p <0.001) la concentración de triglicéridos en los grupos SM+HSL al 1.5%, 3% y 6% 6.1.6. Glucosa La concentración de glucosa no mostró diferencias (p>0.05) (cuadro 6.1.1). 6.1.7. Insulina Igualmente en el cuadro 6.1.1, se puede observar que la concentración de insulina en el grupo C fue menor (p <0.001) que la del grupo SM. Por otro lado la concentración de insulina disminuyó (p <0.001) en los grupos SM con tratamiento de HSL al 0.75%, 1.5%, 3% y 6% con respecto al grupo SM. 6.1.8. Índice HOMA El índice HOMA calculado para el grupo C fue menor (p <0.001) que en el grupo SM. Sin embargo en los grupos SM con tratamiento de HSL al 0.75% (p= 0.001), 1.5%, 3% y 6% el índice HOMA bajó (p <0.001) con respecto al grupo SM (cuadro 6.1.1). 6.1.9. Glicación avanzada de las proteínas séricas En cuanto a los productos de la glicación avanzada de las proteínas séricas se observó que en el grupo C la concentración sérica de AGEs fue menor (p <0.001) que en el grupo SM. La concentración sérica de AGEs disminuyó (p <0.001) en los grupos SM+HSL al 0.75%, 1.5%, 3% y 6% con respecto al grupo SM sin tratamiento (cuadro 6.1.1). 6.2. Efecto del tratamiento con HSL sobre el sistema antioxidante enzimático 6.2.1 Actividad enzimática de catalasa En la figura 6.2.1, se puede observar que La actividad enzimática de la CAT en el grupo C fue mayor (p=0.01) que la del grupo SM por 26.65 μMol H2O2 x mg -1. Cuando se comparó la actividad enzimática de la CAT de los grupos donde se dio el tratamiento con HSL al 0.75%, 1.5%, 3% y 6% se observó que la actividad enzimática fue mayor que en el grupo sin tratamiento por 26.50 28 (p=0.01), por 30.58 (p=0.005), por 42.01 (p<0.001) y por 82.65 μMol H2O2 x mg-1 (p<0.001), respectivamente. 6.2.2. Actividad enzimática de Superóxido Dismutasa En la figura 6.2.2, puede observarse que no existe diferencia significativa entre la actividad de la enzima SOD Mn entre los grupos C y del SM. No obstante, al comparar la actividad enzimática de SOD Mn del grupo SM con los grupos donde se dio el tratamiento con HSL al 0.75%, 1.5%, 3% y 6% se observó que la actividad enzimática en los grupos con tratamiento fue mayor (p<0.001) por 10.72, por 12.77, por 20.77 y por 16.84 U/mg-1 respectivamente. Con respecto a la actividad de la enzima SOD Cu-Zn, el grupo C presentó una actividad mayor (p= 0.001) que el grupo SM por 7.62 U/mg-1. Por otro lado la actividad enzimática de la SOD Cu-Zn en los grupos donde se dio el tratamiento con HSL al 0.75%, 1.5%, 3% y 6% se observó que la actividad enzimática fue mayor (p <0.001) por 15.97, por 9.07, por 10.71 y por 9.64 U/mg-1 respectivamente en relación al grupo SM (gráfica 6.2.2). 6.2.3. Actividad enzimática de las peroxidasas En la figura 6.2.3, se observa que la actividad enzimática de las peroxidasas del grupo C es mayor (p=0.003) por 1.63 U/mg-1 con respecto al grupo SM. Sin embargo en los grupos SM+HSL al 1.5%, 3% y 6% se aprecia un incremento en la actividad enzimática de 1.20 (p= 0.03), 2.75 (p <0.001) y 3.34 U/mg-1 (p <0.001), respectivamente con relación al grupo SM. 6.2.4. Actividad enzimática de glutatión peroxidasa La actividad de la enzima GPX enel grupo C fue menor (p< 0.001) que en el grupo SM por 0.072 μmol/min/mg NADPH oxidado. No obstante al comparar el grupo SM con los grupos donde se dio el tratamiento con HSL al 0.75%, 1.5%, 3% y 6%, se observó que la actividad enzimática fue menor por 0.064 (p< 0.001), por 0.077 (p< 0.001), por 0.056 (p=0.002) y por 0.080 μmol/min/mg NADPH oxidado (p< 0.001), respectivamente. (Figura 6.2.4) 29 6.3. Efecto del tratamiento con HSL sobre la capacidad antioxidante del sistema no enzimático y los marcadores de estrés oxidante hepático 6.3.1. Sistema no enzimático En el cuadro 6.3.1, se puede apreciar que la capacidad antioxidante en el grupo C es mayor (p= 0.002) que la del grupo SM. Mientras que se observa un incremento en la capacidad en los grupos SM con tratamiento de HSL al 0.75% (p=0.03), 1.5% (p=0.007), 3% (p<0.001) y 6% (p<0.001) con respecto al grupo SM. 6.3.2. Lipoperoxidación Por otro lado, en el cuadro 6.3.1, también se puede observar que el índice de lipoperoxidación en el grupo C es menor (p <0.001) que en el grupo SM, no obstante, se aprecia una disminución en la lipoperoxidación en los grupos SM con tratamiento de HSL al 0.75% (p <0.001), 1.5% (p= 0.01), 3% (p <0.001) y 6% (p <0.001) con respecto al grupo SM. 6.3.3. Carbonilación La carbonilación proteica en el grupo C fue menor (p=0.03) que en el grupo SM, sin embargo se aprecia una disminución (p=0.03) en la carbonilación del grupo SM + HSL al 6% con respecto al grupo SM (cuadro 6.3.1). 30 7. DISCUSIÓN Con el objeto de analizar el efecto de las diferentes concentraciones del extracto de HSL, el primer requisito fue demostrar que la administración de azúcar comercial al 30% en el agua de bebida ocasionó en los roedores un conjunto de alteraciones compatibles con las del SM descritas en humanos. Los resultados de esta investigación y un conjunto de publicaciones previas del grupo de trabajo de la Dra. Baños sustentan la validez del modelo experimental seleccionado [Baños G., et al, 1997; Baños Ga., et al, 2005; Baños Gb., et al, 2005; El Hafidi M. y Baños G., 1997; Pérez I., et al, 1999; Carvajal K., et al, 1999; El Hafidi M., et al, 2000 ; Martínez A.E., 2006; Pérez I., et al, 2007; Pérez-T.I., et al, 2009; Ruiz R.A., et al, 2011]. Asimismo, los datos obtenidos indican que este modelo experimental seleccionado puede ser útil para evaluar las respuestas, eventualmente positivas y de mejoría, debidas al tratamiento con la infusión de HSL, en un cuadro patológico similar al del SM en el humano. El incremento observado en la PAS de los roedores con SM, se ha relacionado con varios factores entre ellos a la baja disponibilidad de NO [Touyz R.M. 2004], esto puede deberse al desacoplamiento de la sintasa del óxido nítrico endotelial (eNOS) por ausencia de sustrato o cofactores provocando, una baja producción de NO; asimismo, el O2 es capaz de oxidar al NO formando NOO- lo que incrementa el estrés oxidante, que a su vez induce un aumento de la PAS [Cai H. y Harrison D.G., 2000]. Un efecto antihipertensivo estadísticamente significativo cercano al 50% se registró con las tres dosis más bajas del tratamiento con infusión de HSL, si bien en el presente trabajo no se exploró experimentalmente el mecanismo de acción de dicho efecto, este podría atribuirse a las antocianinas presentes en los cálices de HSL, como delfinidina y cianidina -3-0-sambubiósidos, éste efecto antihipertensivo se asocia a dos mecanismos de acción sinérgicos y complementarios, el primero es de tipo diurético similar al de los antagonistas de aldosterona (aumenta la eliminación de agua y la natriuresis sin modificación en la http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term= 31 excreción de potasio) [Herrera-Arellano., et al, 2007], el segundo es que son inhibidoras por competencia de la ECA [Ojeda D., et al, 2010]. Algunos autores sugieren que los flavonoides y otros polifenoles actúan como quelantes del átomo de zinc presentes en el centro activo de la ECA [Ojeda D., et al, 2010]. Asimismo, existe evidencia para afirmar que el extracto acuoso de HSL también funciona como bloqueador de los canales para Ca++ en el músculo liso del endotelio, disminuyendo de este modo la vasoconstricción [Ajay M., et al, 2007]. En el modelo de SM, también se observó que hay un incremento en el peso corporal, así como de la grasa intra-abdominal con respecto al grupo de animales control, no obstante el tratamiento con la infusión de HSL al 3% y al 6% disminuyó su peso corporal y la cantidad de grasa intra-abdominal a pesar de tener acceso a una dieta alta en carbohidratos. Los datos previos siguieren que el tratamiento con HSL disminuye la lipogénesis, este efecto podría ser atribuido al (+)- HCA pues otros autores han reportado que éste ácido posiblemente es transformado por la flora intestinal en (-)-HCA [Carvajal-Zarrabal O., et al, 2009] y este tiene la capacidad de inhibir por competencia a la enzima extramitocondrial ATP citrato- liasa la cual cataliza la ruptura del citrato para obtener oxaloacetato y acetil CoA siendo este el paso más importante para la síntesis de ácidos grasos. Asimismo el (-)- HCA inhibe la formación de malonil-CoA que a su vez estimula la actividad de la carnitina transferasa, lo que resulta en la disminución de la lipogénesis y el incremento en la oxidación de los lípidos y/o en la glucogenogénesis [Kovacs E.M., et al, 2001]. Se ha demostrado que en roedores la administración oral del (-)- HCA suprime la ingesta de alimento y reduce la ganancia de peso cuando las ratas son alimentadas con dietas altas en carbohidratos [Leonhardt M. y Langhans W., 2002]. También se ha visto que el (+)- HCA es un inhibidor de la α-amilasa [Hansawasdi C., et al, 2000] y de la α-glucosidasa, en especial esta enzima se encarga de la degradación de los oligosacáridos a monosacáridos antes de ser absorbidos; al inhibir a esta enzima se reduce la absorción de glucosa y en consecuencia la 32 reducción de los niveles postprandiales de la misma [Hansawasdi C., et al, 2001], reduciendo así la generación de Acetil CoA que sirve como sustrato principal para la síntesis de ácidos grasos. En otro trabajo se observó que el extracto acuoso de HSL es capaz de inhibir la diferenciación de los adipocitos in-vitro al bloquear la producción de los factores de transcripción necesarios para este proceso sin afectar con ello la viabilidad de dichas células, asimismo los autores concluyen que el extracto acuoso de HSL inhibe la acumulación de lípidos en 46.6% de los adipocitos [Kim J.K., et al, 2007]. En relación a lo anteriormente descrito el modelo de SM, presentó un aumento en la concentración de los triglicéridos séricos, sin embargo, se observó que las concentraciones séricas de triglicéridos disminuyeron en los grupos SM con tratamiento de HSL al 0.75%, 1.5%, 3% y 6%, esta disminución en la concentración pudiera explicarse en parte por la fibra soluble presente en los cálices de HSL, se ha estimado que por cada 250ml de infusión de HSL se aportan 166mg de este tipo de fibra [Sáyago-Ayerdi S.G., et al, 2007], la cual origina soluciones de gran viscosidad en el intestino delgado, esta viscosidad afecta la recirculación entero-hepática de las sales biliares, lo que disminuye la absorción de los lípidos pues limitan la disponibilidad de estos para la célula del epitelio intestinal [Kristensen M., et al, 2012], por otro lado como ya se mencionó anteriormente el (-)-HCA disminuye la lipogénesis ya sea por reducción en la ingesta, afectando la absorción de glucosa y/o por bloqueo enzimático. Cabe mencionar que el tratamiento con HSL en las ratas SM, además, disminuyó el nivel sérico del colesterol, lo que pudiera explicarse por la presencia de los fitoesteroles asociados a la fibra soluble como el ergosterol y β-sitoesterol, los cuales inhiben la absorción del colesterol porlos enterocitos [Sáyago-Ayerdi S.G., et al, 2010]. En los animales con SM el índice HOMA estuvo incrementado, sin embargo los resultados del presente estudio muestran que el índice HOMA en los animales con SM sometidos al tratamiento con infusión de HSL al 3% y 6% fue <2.5, lo cual http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22S%C3%A1yago-Ayerdi%20SG%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22S%C3%A1yago-Ayerdi%20SG%22%5BAuthor%5D 33 indica que la función biológica de la insulina en los tejidos periféricos es normal. Este efecto podría deberse a la presencia de la cianidina-3-glucósido pues se ha reportado que es capaz de disminuir la expresión de las adiponectinas proinflamatorias MCP1 y TNFα, esto favorece la expresión de transportadores GLUT4 en el tejido adiposo blanco lo que facilita el transporte de glucosa al interior del adipocito lo que reduce la concentración sérica de la proteína RBP4 y se disminuye la actividad de la enzima glucosa 6 fosfatasa, con ello se incrementa el consumo de glucosa por señalización de la insulina en el músculo esquelético, mientras que en el hígado se suprime la gluconeogénesis lo que incrementa la sensibilidad a la insulina así como la disminución tanto de glucosa sérica como del estrés oxidante[Sasaki R., et al, 2007]. Asimismo, la tendencia observada en los animales con el tratamiento de HSL a disminuir la concentración de glucosa sérica, podría explicar la disminución en la concentración de AGEs séricos, dado que estos son el resultado de las reacciones no enzimáticas entre el grupo amino terminal de las proteínas principalmente de los aminoácidos lisina y arginina con el grupo carbonilo de los azúcares reductores como la glucosa, que es el azúcar reductor más abundante en el organismo y el que más participa en los procesos de glicación aunque a una tasa más lenta que otros carbohidratos [Cárdenas L.M., et al, 2009]. Por lo tanto al disminuir la concentración sérica de AGEs con el tratamiento de HSL se evita la formación de ERO mediada por la interacción que existe entre los AGEs y sus receptores específicos, en consecuencia se protege a los componentes celulares de daños por oxidación [Chiung-Huei P., 2011; Wang S.C., 2009], dicho efecto también ha sido descrito por Yamabe N., et al [2006] donde concluye que puede deberse a la presencia del polifenol epigalocatequina-3-O-galato. Por otra parte, en el grupo SM la capacidad antioxidante dada por las enzimas CAT, SOD Cu-Zn y peroxidasas se encontró disminuida, mientras que la actividad de la SOD Mn no presentó cambios y la actividad de la GPX se vio incrementada, sin embargo, al dar el tratamiento con HSL se incrementó la actividad de las 34 enzimas CAT, SOD Mn y SOD Cu-Zn, los resultados concuerdan con otras investigaciones donde se observó que el tratamiento con los extractos de HSL incrementa la actividad de las enzimas CAT y SOD con lo que aumenta la capacidad antioxidante en el hígado, de esta manera se limita la producción de ERO y sus efectos adversos, tales como la expresión de los factores de transcripción Bax, tBib y pJNK, lo que evita la apoptosis hepatocelular inducida por ERO [Liu L.C., et al, 2010] y la consecuente fibrosis por activación de las células estrelladas hepáticas [Liu Y.C., et al, 2006]. Asimismo la actividad de las peroxidasas se incrementó en todos los grupos con tratamiento, con lo cual también se disminuye la producción de ERO, pues se ha descrito que las peroxidasas son capaces de eliminar el H2O2 por medio de una reacción similar a la de las catalasas [Mayes P.A., 1994]. Al contrario de lo observado en la actividad de las otras enzimas antioxidantes, la actividad de la GPX disminuyó en todos los grupos tratados con HSL, lo que probablemente limita la utilización de GHS y de acuerdo con Liu L.C., et al, 2010; Liu J.Y., et al, 2006; Wang C.J., et al, 2000; Ali B.H., et al, 2003 incrementa su concentración intracelular, lo que podría favorecer un ahorro de NADPH en el hígado de los roedores con SM, ya que con el fin de reducir de nuevo el glutatión oxidado, la enzima glutatión reductasa requiere NADPH como cofactor [Mayes P.A., 1994], este ahorro de NADPH podría disminuir el gasto energético celular, ya que se ha descrito que este equivalente reductor se produce en la vía colateral de las pentosas fosfato, donde la oxidación alternativa de glucosa no genera ATP, ya que su propósito es proporcionar ribosa-5-fosfato y NADPH para la síntesis de ácidos grasos y esteroides o, como ya se ha mencionado, como un cofactor para la glutatión reductasa [Mayes P.A., 1994]. Este posible incremento en la concentración de GHS aunado a la presencia de los polifenoles que fueron ingeridos y absorbidos por los animales SM con tratamiento de HSL, podría explicar el aumento de la capacidad antioxidante del sistema no enzimático observada en dichos animales. 35 Cabe destacar que la disminución conjunta tanto en el índice de lipoperoxidación y carbonilación de las proteínas en el hígado, así como de la glicación avanzada de las proteínas séricas observada en los animales tratados con HSL probablemente es debida a la acción sinérgica entre los polifenoles presentes en la infusión de HSL y los sistemas antioxidantes enzimático y no enzimático. 36 8. CONCLUSIONES Con estos resultados, se concluye que las propiedades fitoquímicas de la infusión de los cálices de HSL: 1. Incrementan la capacidad antioxidante celular en el hígado de las ratas con SM de tal forma que previenen la aparición de un cuadro de estrés oxidante como el desarrollado en las ratas con SM sin tratamiento, por medio de: a. Un aumento en la capacidad antioxidante del sistema no enzimático. b. Un aumento en la actividad de las enzimas CAT, SOD Mn, SOD Cu-Zn y peroxidasas c. Una disminución en la actividad de la enzima GPX, lo que probablemente incremente la concentración intracelular de GHS y promueva un ahorro de energía al limitar la utilización de NADPH celular por la enzima glutatión reductasa. 2. Protegen a las células del daño por oxidación, dado que el índice de lipoperoxidación y carbonilación de las proteínas en el hígado, así como de la glicación avanzada de las proteínas séricas, disminuyeron en los animales SM con tratamiento. 3. Poseen un efecto antihipertensivo. 4. Favorecen la pérdida de peso, al disminuir la cantidad de grasa intra- abdominal. 5. Disminuyen la concentración sérica de triglicéridos, colesterol e insulina. 6. Con este trabajo, si bien no se estudiaron los mecanismos de acción de la infusión de HSL, si se encontró que la concentración al 3% tuvo un mejor efecto en el tratamiento del SM. Asimismo, esta concentración se aproxima a la a la que generalmente se usa para preparar agua de jamaica en México, lo cual podría ser beneficioso para la salud de la población si se consumiera con más frecuencia. 37 9. REFERENCIAS Abrams J.J., Webster D.A., Purification,partial characterization and possible role of catalase in the bacterium Vitreoscilla. Acrh. Biochem.Biophys. 1990; 279:54-59. Ajay M., Chai H.J.,Mustafa A.M., Gilani A.H., Mustafa M.R. Mechanisms of the anti- hypertensive effect of Hibiscus sabdariffa l. calyces. J Ethnopharmacol. 2007;109:388-93. Ali B.H., Mousa H.M., Mougy E.I. The effect of a water extract and anthocyanins of Hibiscus sabdariffa l. on paracetamol-induced hepatoxicity in rats. 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