Efecto-de-la-MMP1-en-el-comportamiento-de-celulas-epiteliales-alveolares-de-raton

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS 
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS 
 
 
 
 
EFECTO DE LA MMP1 EN EL COMPORTAMIENTO DE CÉLULAS EPITELIALES 
ALVEOLARES DE RATÓN 
 
 
 
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
DOCTORA EN CIENCIAS 
 
 
 
 
PRESENTA: 
ILIANA HERRERA FUENTES 
 
 
 
DIRECTORA DE TESIS 
DRA. ANNIE PARDO CEMO 
FACULTAD DE CIENCIAS 
COMITÉ TUTOR 
DRA. MARINA MACÍAS SILVA 
INSTITUTO DE FISIOLOGÍA CELULAR 
DR. MOISÉS EDUARDO SELMAN LAMA 
FACULTAD DE MEDICINA 
 
 
 
MÉXICO, D.F. ENERO 2014 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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ÍNDICE 
Pág. 
RESUMEN…………………………………………………………………………………1 
INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………….3 
 Fibrosis pulmonar………………………………………………………………....3 
 Epitelio Alveolar en la Fibrosis Pulmonar Idiopática…………………………..5 
 Metaloproteasas de Matriz Extracelular………………………………………...7 
 Metaloproteasas de matriz y la Fibrosis Pulmonar Idiopática………………12 
OBJETIVO GENERAL………………………………………………………………….14 
 Objetivos particulares……………………………………………………………14 
MATERIAL Y MÉTODOS………………………………………………………….......15 
 Cultivo celular…………………………………………………………………….15 
 Aislamiento mitocondrial………………………………………………………...15 
 Transfección de MMP-1…………………………………………………………16 
 Silenciamiento de MMP-1………………………………………………………16 
 RT-PCR…………………………………………………………………………...17 
 PCR cuantitativa en tiempo real………………………………………………..17 
 Ensayo de actividad de MMP-1………………………………………………...18 
 Ensayo de tasa de crecimiento…………………………………………………18 
 Ensayo de proliferación celular…………………………………………………19 
 Ensayo de herida………………………………………………………………...19 
 Ensayo de migración celular epitelial………………………………………….19 
 Migración de fibroblastos………………………………………………………..20 
 Citometría de flujo………………………………………………………………..20 
 Detección de especies reactivas de oxígeno (ROS)…………………………21 
 Western blot………………………………………………………………………21 
 Medición del consumo de oxígeno (OCR)…………………………………….22 
 Inmunohistoquímica e Inmunofluorescencia………………………………….23 
 Cuantificación de MMP-1 en lavado bronquioalveolar (LBA)……………….24 
 Análisis estadístico………………………………………………………………24 
RESULTADOS…………………………………………………………………………..25 
 Localización de MMP1 en pulmón de pacientes con FPI……………………25 
 Transfección de MMP-1 en células epiteliales de ratón……………………..27 
 Silenciamiento de MMP-1 en células de humano A549……………………..28 
 MMP-1 induce la proliferación de células epiteliales…………………………30 
 MMP-1 promueve la migración de células epiteliales………………………..31 
 MMP-1 protege de apoptosis a células epiteliales…………………………...34 
 MMP-1 influye en la migración de fibroblastos……………………………….36 
 MMP-1 reprime la respiración mitocondrial…………………………………...37 
 MMP-1 estimula la expresión de HIF-1α………………………………….......39 
 La hipoxia induce sobre-expresión de MMP-1 en células epiteliales………41 
 MMP-1 disminuye los niveles de especies reactivas de oxígeno…………..42 
 DISCUSIÓN………………………………………………………………………44 
 BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………….49 
 
 
 
 
 
1 
 
Resumen 
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad progresiva y letal que 
carece de tratamiento eficaz. Aunque los mecanismos patogénicos no se conocen 
con precisión, existen evidencias de que la activación de las células del epitelio 
alveolar (CEA) desempeña un papel importante en su patogénesis ya que 
producen numerosas moléculas incluyendo metaloproteasas de matriz extracelular 
(MMP’s por sus siglas en inglés) que a su vez participan en la activación de 
fibroblastos y la remodelación tisular. La MMP-1 es una enzima altamente 
expresada en CEA de pacientes con FPI pero su papel se desconoce. Por tal 
motivo, el objetivo de éste trabajo fue investigar el papel de la MMP-1 sobre la 
proliferación, migración, apoptosis, así como sus efectos en la respiración 
mitocondrial y la respuesta al estrés inducido por hipoxia en CEA. Con este 
propósito, se utilizaron cultivos de CEA de ratón (MLE12) y de humanos (A549). 
Las células MLE12 fueron transfectadas con MMP-1 humana mientras que las 
A549 (que producen la enzima) se trataron con un shRNA para apagar la 
expresión del gen. Los resultados obtenidos mostraron que las células de ratón 
transfectadas con MMP-1 presentaron un incremento significativo en la tasa de 
crecimiento y proliferación a las 36 y 48 horas (p<0.01). La MMP-1 promovió la 
migración celular a través de colágena y aceleró el cierre de herida in vitro en 
comparación con las células transfectadas con el vector (Mock), incluso en 
presencia de mitomicina C (p<0.01). La transfección de dicha enzima mostró 
también un efecto protector contra la apoptosis (p<0.01). Por otro lado, dichas 
células tuvieron una reducción significativa en el consumo de oxígeno comparadas 
con las células Mock. 
2 
 
Bajo condiciones de hipoxia, el factor inducible de hipoxia 1α (HIF-1α por sus 
siglas en inglés) induce una transición del metabolismo oxidativo a glucolítico, 
motivo por el cual analizamos la activación de HIF-1α, observándose una 
activación mayor en la células transfectadas con MMP-1 tanto en condiciones de 
normoxia como de hipoxia. Por otra parte, las células transfectadas con MMP-1 
mostraron una disminución significativa de ROS tanto mitocondrial como total. En 
contraparte a estos resultados, la inhibición de la expresión de MMP-1 inducida 
por shMMP1 provocó una disminución significativa de la tasa de crecimiento, 
proliferación y migración de células A549 en comparación con los controles 
(p<0.01), sin embargo se observó un incremento en el consumo de oxígeno. Estos 
resultados sugieren que la expresión de MMP-1 en células epiteliales alveolares 
inhibe la respiración mitocondrial, incrementa la expresión de HIF-1α, disminuye la 
producción de ROS, y contribuye a generar un fenotipo migratorio, proliferativo y 
anti-apoptótico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
INTRODUCCIÓN 
Fibrosis Pulmonar 
La fibrosis pulmonar es el resultado final de varios padecimientos respiratorios de 
etiología conocida o desconocida agrupados bajo el término de enfermedades 
intersticiales pulmonares, que se caracterizan por la destrucción de las unidades 
alveolo-capilares responsables del intercambio gaseoso, resultando como 
consecuencia la aparición de insuficiencia respiratoria progresiva. Dentro de este 
grupo de padecimientos, la fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es de etiología 
desconocida y representa la forma más común y agresiva de estas enfermedades 
1,2. Aunque sus mecanismos patogénicos no se conocen con precisión, diferentes 
evidencias experimentales indican que la FPI se caracteriza por una secuencia de 
eventos que comienzan con microdaños al epitelio alveolar seguido por la 
migración y proliferación de fibroblastos, diferenciación a miofibroblastos y éstos a 
su vez pueden provocar el rompimiento de las membranas basales y la apoptosis 
de las células epitelio alveolares, dando como resultado un depósito exagerado de 
matriz extracelular (MEC), el cual conlleva a la destrucción de la arquitectura del 
parénquima pulmonar 3. 
Sin embargo nuestro grupo de trabajo ha propuesto dos vías para el desarrollo de 
la fibrosis pulmonar, la vía inflamatoria y la vía epitelial 1,2. La inflamatoria es la 
hipótesis clásica para explicar las enfermedades intersticialespulmonares, que se 
distinguen por presentar una fase temprana de alveolitis ó inflamación y como 
punto final una fase fibrótica. En este contexto se ha propuesto que un daño en el 
epitelio alveolar y/o el endotelio vascular desencadenan una respuesta 
inflamatoria provocando la perturbación del intersticio y los espacios alveolares. 
4 
 
Esta respuesta persiste hasta dar lugar a una fase caracterizada por la 
proliferación de fibroblastos/miofibroblastos y el depósito de MEC en el intersticio 
pulmonar. Una vez que se ha presentado un daño en los epitelios se desencadena 
una liberación de moléculas quimioatrayentes como MIP-1, MCP-1, IL-8 y 
moléculas de adhesión, que al mismo tiempo provocan el reclutamiento de células 
inflamatorias, tales como macrófagos, linfocitos, eosinófilos y neutrófilos. Así 
mismo, las células inflamatorias, factores de crecimiento y diversas citocinas que 
tienen como blanco células residentes del pulmón favorecerían una respuesta 
inflamatoria prolongada que desencadenaría un proceso fibrótico 2,4. Por otro lado, 
está la vía epitelial, la cual propone que un daño en el epitelio alveolar contribuye 
a la síntesis de citocinas y factores de crecimiento tales como el factor de 
crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento transformante 
beta (TGF-) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-) entre otros, involucrados 
en la migración y proliferación de fibroblastos, así como, en la inducción del 
cambio de fenotipo a miofibroblastos 1. La activación de células epiteliales seguida 
por la formación de focos de fibroblastos se encuentran localizados en sitios 
adyacentes al epitelio dañado, en los cuales el resultado final es la acumulación 
exagerada de proteínas de matriz extracelular (MEC) en el parénquima pulmonar, 
principalmente de colágenas tipos I y III 2,5. Al parecer la conexión entre las células 
epiteliales alveolares y la FPI provoca una red de cambios en dicho epitelio, como 
es la presencia de CEA tipo II hiperpláicas e hipertróficas”, con un citoplasma 
abundante, un núcleo hipercromático grande y un nucléolo prominente, también 
conocido como cuboidalización del epitelio alveolar. También se pueden presentar 
5 
 
fenotipos morfológicos en donde las células epiteliales se muestran elongadas, 
aplastadas y atenuadas, estas células usualmente tienden a cubrir los focos 
fibroblásticos 6. 
 
Epitelio alveolar en la FPI 
La barrera alveolo-capilar representa la superficie más grande del pulmón donde 
se lleva a cabo el intercambio gaseoso y es por default la superficie que separa el 
interior del cuerpo, del ambiente. Dicha barrera está compuesta de células 
epiteliales alveolares tipo I, células endoteliales capilares y sus respectivas 
membranas basales. Más de la mitad de la barrera se encuentra fusionada en sus 
membranas basales y el resto se encuentra separado por una delgada lámina de 
intersticio. Tanto el epitelio como las células endoteliales presentan una morfología 
plana, de gran tamaño y con poco citoplasma 7. En el pulmón, las CEA tipo II son 
las células progenitoras distales putativas, las cuales son las responsables de 
reparar al epitelio una vez que las CEA tipo I han sido dañadas 8, sin embargo se 
ha visto que tanto en la FPI como en las enfermedades intersticiales difusas, la 
habilidad de las CEA tipo II para restaurar a las CEA tipo I es seriamente afectada 
6. Como se mencionó anteriormente, una vez que las CEA tipo II han sido dañadas 
sintetizan una variedad de enzimas, tales como MMP´s, citocinas y factores de 
crecimiento, lo que nos sugiere una contribución tan importante del epitelio en la 
remodelación de la MEC. Por ejemplo, durante el saneamiento de una herida en 
piel, las células epiteliales tienden a migrar rápidamente para intentar restablecer 
la herida, subsecuente a este proceso de reparación tisular los fibroblastos migran 
hacia el espacio dañado en donde se transformarán a miofibroblastos, los cuales 
6 
 
contraerán la herida produciendo nueva MEC, para que mediante el proceso de 
muerte celular programada haya un equilibrio y una disminución de células 
mesenquimatosas y finalmente las células de la epidermis se puedan diferenciar y 
restablezcan la permeabilidad de la barrera. Algo similar a esto, tendría que ocurrir 
en un proceso de reparación de pulmón normal después de un daño, sin embargo 
hay evidencias que sugieren que en padecimientos como la FPI, ocurre 
exactamente lo contario 3. Debido a que los fibroblastos y miofibroblastos juegan 
un papel importante en el depósito de la MEC en la fibrosis pulmonar, el origen de 
dichas células en el pulmón también ha sido de gran interés. Hoy en día existe una 
teoría clásica y dos contemporáneas que intentan explicar dicho origen 9,10. La 
teoría clásica dice que un daño tisular induce la activación de fibroblastos 
residentes para proliferar y expresar los constituyentes de la MEC, la teoría 
contemporánea dice que un daño tisular provocado con TGF-β induce a las 
células epiteliales a una transición fenotípica de epitelio-mesénquima y los 
fibroblastos/miofibroblastos contribuyen subsecuentemente a una fibroproliferación 
11-14. La otra teoría contemporánea dice que los fibrocitos circulantes son células 
progenitoras mesenquimatosas residentes y migran al sitio dañado, 
diferenciándose a fibroblasto/miofibroblasto, y así contribuyen a la generación de 
MEC durante la fibroproliferación 9,10. 
Cabe mencionar que las CEA tipo II sintetizan una variedad de enzimas, tales 
como MMP’s, citocinas y factores de crecimiento, lo que sugiere que el epitelio 
contribuye a la remodelación de la MEC más de lo que se pensaba 3. 
 
 
7 
 
Metaloproteasas de Matriz Extracelular 
Se sabe que en condiciones fisiológicas, hay un equilibrio dinámico entre la 
síntesis y la degradación de los componentes de la matriz extracelular, la cual se 
realiza de una forma programada. Sin embargo cuando se presenta un 
desequilibrio en el metabolismo de las moléculas de la MEC conlleva a diferentes 
procesos patológicos como la artritis reumatoide, la cirrosis hepática, el enfisema 
pulmonar, la fibrosis pulmonar, la ateroesclerosis y algunos tipos de cánceres15. 
Las matrixinas o metaloproteasas de matriz pertenecen a la superfamilia de las 
metzincinas, de igual forma que las astacinas, serralisinas, reprolisinas y 
adamalisinas (ADAM’s por sus siglas en inglés). Las MMP’s son capaces de 
degradar todos los componentes de la MEC y membranas basales. Sin embargo, 
otros estudios han revelado que las MMP’s pueden regular la liberación o 
activación de quimiocinas, citocinas, factores de crecimiento y otras moléculas 
bioactivas, de éste modo participan en procesos fisiológicos tales como, 
inmunidad innata y adaptativa, inflamación, angiogénesis, remodelación de hueso 
y el crecimiento de neuritas, entre otras 16. 
8 
 
 
Fig.1 Funciones de las metaloproteasas de matriz. (Folgueras AR, et al, 2004, Int. J. 
Dev. Biol. 48:411-424) 
 
Las MMP’s son una familia de enzimas que consisten de 25 endopeptidasas 
dependientes de zinc en ratones y 24 en humanos, incluyendo un duplicado de los 
genes que codifican para la MMP-23. La primera metaloproteasa descubierta fue 
en la cola del renacuajo Xenopus en 1962 y la última en descubrirse fue la 
epilisina o MMP-28 17-20. Los miembros de la familia de las MMP’s fueron 
originalmente identificados y clasificadas con un nombre descriptivo con base a la 
especificidad por el substrato y posteriormente en cuanto a la similitud de sus 
dominios estructurales en: a) colagenasas, incluyendo a la MMP-1/-8/-13; b) 
estromelisinas, MMP-3 y -10; c) gelatinasas, MMP-2 y -9; d) matrilisinas, MMP-7 y 
-26; e) MMP’s tipo-membrana (MT-MMP’s por sus siglas en inglés) y f) otras 
9 
 
MMP’s 16,21 que por sus características no pueden ser agrupadas en ninguna de 
las anteriores. Un sistema de numeraciónsecuencial fue usado para nombrarlas 
conforme se fueron describiendo y cabe mencionar que gracias a las aportaciones 
de la secuenciación del genoma humano se ha podido completar la familia de 
MMP’s producidas por las células humanas. Un papel dual se ha propuesto a su 
amplio espectro de substratos que pueden degradar, por un lado participando 
como reguladores para la homeostasis y por el otro en la inmunidad tisular en una 
red de comunicación multidireccional entre el tejido y la célula. La actividad 
catalítica de las MMP’s es controlada a cuatro niveles diferentes: 1) la expresión 
génica con una regulación transcripcional y post-transcripcional, 2) a nivel de 
compartamentalización, 3) a nivel de activación de la pro-enzima debido a la 
remoción del pro-dominio y 4) a nivel de inhibición, llevado a cabo por inhibidores 
tisulares específicos; tales como; los inhibidores tisulares de metaloproteasas 
(TIMP’s por sus siglas en inglés), que en humanos se han descrito cuatro, de los 
cuales sólo el TIMP-1, TIMP-2 y TIMP-4 son secretados extracelularmente, 
mientras que el TIMP-3 se encuentra anclado en la MEC, o por inhibidores no 
específicos, por ejemplo, la α2-macroglobulina. Una vez activadas las MMP’s, 
pueden modular el potencial proteolítico global en el medio extracelular por 
activación del zimógeno (la pro-forma de las MMP’s) y por degradación o 
inactivación de otras proteasas 22-24. 
Todas las MMP’s son sintetizadas como pro-enzimas inactivas y con excepción de 
las MT-MMP’s, son secretadas al espacio extracelular; muestran al menos tres 
dominios estructurales conservados, incluyendo un péptido señal en el extremo N-
terminal, el cual va a ser degradado durante su transporte hacia la vía secretora, 
10 
 
seguido por el pro-dominio, el cual consta cerca de 80 aa y un dominio catalítico. 
Sin embargo, las dos matrilisinas únicamente poseen tres de estos dominios, por 
lo que representan a las MMP’s más pequeñas de la familia. El pro-dominio poseé 
una secuencia consenso PRCGxPD conocido como switch de cisteína (Cys), 
dicho residuo de Cys interactúa con el ión zinc del dominio catalítico, el cual puede 
ser usado de otra manera para llevar a cabo la catálisis. El dominio catalítico tipo 
hemopexina, consta aproximadamente de 160-170 aa, el cual tiene un alto grado 
de similitud entre todas las MMP’s e incluye un motivo de unión a zinc con una 
secuencia consenso altamente conservada HExxHxxGxxH, participa en el 
reconocimiento macromolecular del sustrato con la enzima y en la interacción con 
los inhibidores tisulares de metaloproteasas y se encuentra conectado al dominio 
catalítico mediante una región rica en prolina denominada bisagra. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
11 
 
 
 
 
 
Fig.2 Clasificación estructural de las metaloproteasas de matriz. (Fanjul-
Fernández, et al. (2010) Biochimica et Biophysica Acta). 
 
 
 
 
 
 
 
12 
 
Metaloproteasas de matriz y la FPI 
Durante mucho tiempo se ha postulado que las MMP’s juegan un papel muy 
importante en la patogénesis de la fibrosis pulmonar 25, pero el mecanismo por el 
cual se lleva a cabo sigue siendo incierto. Estudios de expresión múltiple de genes 
a través de microarreglos en pulmones con FPI han revelado el aumento de varias 
metaloproteasas de matriz, entre ellas está; la MMP-7, MMP-1, MMP-2 las cuales 
parecen desempeñar un papel importante en la remodelación tisular 26,27. 
En este sentido, uno de los hallazgos más sorprendentes ha sido la demostración 
de que una de las MMP’s más elevadas a nivel de gen y proteína es la MMP-1 
(colagenasa-1) una enzima capaz de degradar colágenas fibrilares (tipos I y III), 
que son las que se están acumulando en los pulmones con FPI 26,28,29. Más aún, la 
MMP-1 está implicada en enfermedades, que en contraste con la fibrosis, se 
caracterizan por la degradación excesiva de matriz extracelular como la artritis 
reumatoide y el enfisema pulmonar 25,30-34. 
Sin embargo, estudios relacionados con la localización de la MMP-1 han 
dilucidado, al menos parcialmente, esta paradoja. Así, hemos demostrado que la 
MMP-1 se localiza fundamentalmente en el epitelio alveolar reactivo y se 
encuentra prácticamente ausente en el compartimiento intersticial donde las 
colágenas fibrilares están acumulándose 35. Este hallazgo sugiere que el papel de 
la MMP-1 en FPI va más allá de su conocido papel enzimático. 
De hecho, existen fuertes evidencias de que la MMP-1 es una proteasa 
multifuncional que además de degradar colágenas y algunos componentes no 
colagénicos de la matriz extracelular, también procesa citocinas como la 
interleucina (IL-1)-β y el factor de necrosis tumoral (TNF)-α así como a varias 
13 
 
quimiocinas 36-38. Sin embargo, se ha demostrado que la MMP-1 regula la 
actividad migratoria por la unión a integrinas β1 en la membrana celular de 
queratinocitos y monocitos humanos 39. Interesantemente la MMP-1 se ha 
encontrado asociada a organelos intracelulares como mitocondria y núcleo, dicha 
localización se ha presentado en diferentes tipos celulares, lo que nos hace 
pensar que este fenómeno puede ser una característica celular común. Sin 
embargo, también se ha reportado que la MMP-1 intracelular se acumula durante 
la fase mitótica del ciclo celular, sugiriendo que dicha enzima puede tener un role 
en el crecimiento de las células 40. 
En este contexto, la localización epitelial de la MMP-1 en los pulmones con FPI así 
como sus posibles funciones no relacionadas con la degradación de matriz 
sugieren que esta enzima podría ser un potencial regulador de la interacción 
epitelio/mesénquima o influenciar el comportamiento del fenotipo epitelial durante 
la evolución de la fibrosis. Sin embargo, a la fecha se desconoce el papel que 
desempeña la MMP-1 en el epitelio alveolar pulmonar. El papel de la expresión de 
la MMP-1 en la FPI, actualmente se desconoce, aunque podría estar 
contribuyendo a la formación de espacios císticos o “cuboidalización”, la cual es 
una característica principal de este padecimiento. Por lo tanto, la fuerte expresión 
epitelial de la MMP-1 en pulmones de pacientes con FPI podría estar implicada en 
la migración celular, tal y como ocurre con lo queratinocitos de piel cuando se lleva 
a cabo el saneamiento de una herida 41. 
 
 
 
14 
 
Objetivo General 
Evaluar el papel de la MMP-1 en diversas funciones celulares, así como su 
participación en la respiración mitocondrial y la respuesta al estrés inducido por 
hipoxia en CEA. 
 
Objetivos particulares 
 Determinar el efecto de la MMP-1 sobre la migración, la proliferación y la 
apoptosis en células epiteliales alveolares de ratón MLE12. 
 Analizar la participación de MMP-1 sobre la expresión del factor inducible 
de hipoxia (HIF-1α por sus siglas en inglés). 
 Analizar la participación de la MMP-1 en la respiración mitocondrial de 
células epiteliales alveolares de pulmón de ratón MLE12 a través del 
consumo de oxígeno y la generación de especies reactivas de oxígeno 
(ROS). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
15 
 
Material y métodos 
 
Cultivo celular 
Se utilizaron células de epitelio alveolar de ratón (MLE12) y células epiteliales de 
pulmón humano (A549) adquiridas de la ATCC (Manassas, VA). Las células se 
mantuvieron en cultivo en una incubadora de CO2 (5% de CO2-95% de aire) a 37 
°C en medio DMEM-F12 (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) 
suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 2%, 100 U/ml de penicilina, 100 
mg/ml de estreptomicina, 1% de L-glutamina, 1% HEPES, 1% de 
insulina/transferrina/selenito de sodio, 0,01% β-estradiol, y 0,01% de 
hidrocortisona. Las células A549 se cultivaron en medio F12K con 10% de SFB. 
Para condiciones de hipoxia, las células al 75% de confluencia se pusieron con 
medio de cultivo fresco y se mantuvieron en una cámara incubadora modular 
(Billups-Rothenberg Inc. CA.) a 37 °C en un ambiente con una mezclade gas 
hipóxico (1% de O2 - 5 % de CO2, equilibrado con N2) durante 24 h. 
 
Aislamiento mitocondrial 
Las células A549 se crecieron en frascos de cultivo de 75 cm2 hasta confluencia 
completa, se cosecharon con tripsina 5%-EDTA 2% (Sigma) y se centrifugaron 
para recuperar el botón celular. Se utilizaron 1x107 células para obtener las 
fracciones enriquecidas con mitocondrias con el kit de aislamiento mitocondrial 
(Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 
 
 
16 
 
Transfección de MMP-1 
El cDNA completo de la MMP-1 humana clonada dentro del vector pSP64 fue 
adquirido de la ATCC (n º 57684). Para confirmar la orientación de la secuencia, 
este fragmento se escindió con las enzimas de restricción Ava I y Bgl II (New 
England) y se secuenció. El fragmento ya verificado se clonó en el vector pQCXIP 
(Clontech Lab.. Inc., CA) diseñado para expresar el gen diana junto con el 
marcador de selección de puromicina. Los plásmidos pQCXIP/MMP-1 o su control 
(Mock) se transfectaron en células MLE12 con Lipofectamina 2000 (Invitrogen, 
Carlsbad, CA) y se mantuvieron en medio suplementado con puromicina (10 
mg/ml; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Las células resistentes se cultivaron 
en medio de selección, se expandieron y se congelaron hasta su uso posterior. 
 
Silenciamiento de MMP1 
La MMP-1 fue silenciada mediante el procedimiento de transfección con un shRNA 
en células A549. Las células (1.5x105) se sembraron en placas de 12 pozos y se 
incubaron 24 horas con medio F12K que contenía polibrene (5μg/ml) y partículas 
lentivirales de shRNA-MMP1 (1x105) (Santa Cruz, CA). Las células estables para 
la MMP-1 silenciada fueron obtenidas después de 10 días de cultivo en medio que 
contenía puromicina a una concentración final de 2μg/ml. Células A549 
transfectadas con partículas lentivirales control (shRNA) se analizaron en paralelo. 
La eficacia del silenciamiento de MMP-1 se determinó mediante un ensayo de 
PCR en tiempo real (qPCR). 
 
 
17 
 
PCR para MMP-1 
Las células MLE12 que no fueron transfectadas (WT) y las células transfectadas 
con el vector (Mock) o con MMP-1 se sembraron en cajas de cultivo de 35 mm. 
Cuando alcanzaron ~80% de confluencia, las células se cosecharon y el ARN total 
fue aislado utilizando el reactivo Trizol® (Life Technologies, Carlsbad, CA.). El 
ADNc fue sintetizado a partir de 1g de ARN total con el Kit Ambion® 
RETROscript® First Strand Synthesis (Life Technologies). El ARNm que codifica la 
MMP-1 humana se amplificó mediante PCR utilizando 50 ng de cada ADNc y un 
Master Mix 2X (Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA). Los cebadores 
utilizados fueron: 5'-AGGTTATCCAAAATGATAG-3 ' (sentido) y 5'-
TGCAGTTGAACCAGCTATTA-3' (antisentido). Las reacciones de amplificación se 
llevaron a cabo durante 35 ciclos (95 °C 30 segundos, 55 °C 20 segundos, y 72 °C 
20 segundos), seguidos por una extensión a 72 °C durante 7 min. Los productos 
de amplificación se analizaron en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de 
etidio (0.5 g/ml) y se visualizaron en un transiluminador UV. 
 
PCR cuantitativa en tiempo real 
La expresión de MMP-1 en las células A549 se cuantificó por PCR en tiempo real 
utilizando el ensayo de expresión génica TaqMan (Hs00899658_m1) y 
normalizando contra la expresión del gen hipoxantina-guanina 
fosforribosiltransferasa (HPRT1) (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las 
reacciones de amplificación se realizaron en un termociclador Rotor Gene Q 
(Qiagen, EE.UU.) con 60 ng de ADNc en una mezcla de Maxima Probe qPCR 
18 
 
Master Mix (Thermo Fisher Scientific Inc., EE.UU.). Se utilizó el método de 
cuantificación relativa para analizar los resultados de dos experimentos 
independientes que se realizaron por triplicado. 
 
Ensayo de actividad de MMP-1 
La actividad proteolítica de la MMP-1 se midió en el medio de cultivo de células 
MLE12 (Mock y MMP1) utilizando el ensayo fluorescente SensoLyte 520 MMP-1 
Kit (Anaspec, Fremont, CA). Se tomaron 50 µl de medio de cultivo, los cuales 
fueron activados durante 3 horas con APMA 1 mM a 37 º C y después se 
incubaron en una placa de 96 pocillos con el sustrato FRET-MMP1 durante 60 
minutos a 37 °C. La intensidad de fluorescencia de punto final se determinó con un 
lector de microplacas con filtros fijados a Ex/Em=480±20nm/528±20 nm. 
 
Ensayo de tasa de crecimiento 
Células MLE12 transfectadas con MMP-1 (1x104) ó células A549 con la MMP-1 
silenciada con shARN (2.5x103), así como los respectivos controles se sembraron 
en placas de cultivo de 96 pozos. Después de 24 horas, el medio fue reemplazado 
y se determinó la tasa de crecimiento celular a las 12, 24, 36 y 48 horas. El 
crecimiento celular fue analizado con el reactivo WST-1 (Roche Applied Science, 
Mannheim, Ger.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En cada punto 
de análisis, se midió la absorbancia (450 nm - 620 nm) con un lector de placas y 
los resultados se muestran como porcentaje de aumento de la tasa de crecimiento 
relativo a los valores basales (Control día 0). Para este ensayo se realizaron tres 
experimentos independientes por triplicado. 
19 
 
Ensayo de proliferación celular 
Las células se sembraron como se mencionó para el ensayo de la tasa de 
crecimiento y la proliferación se determinó midiendo la incorporación de 
bromodeoxiuridina (BrdU) con el kit Cell Proliferation ELISA (Roche). Después de 
12, 24, 36 y 48 horas en medio DMEM/F-12 suplementado con 2% de FBS, las 
células se incubaron durante 4 horas con la solución para marcar BrdU. El ensayo 
se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los valores de 
absorbancia se midieron a en un lector de placas a 450 nm y los experimentos se 
realizaron dos veces por triplicado. 
 
Ensayo de herida 
Las células que sobre-expresan la MMP-1 y Mock (1x106) se sembraron en cajas 
de cultivo de 35 mm. Después de 24 horas, se creó una herida artificial mediante 
la interrupción de la monocapa celular con una punta de micropipeta de plástico 
estéril de 200 µl. Los cultivos se mantuvieron en cultivo en medio DMEM/F-12 con 
2% de FBS. Se registraron imágenes a las 24, 36 y 48 horas con un microscopio 
invertido (Olympus). El ensayo se realizó dos veces por duplicado. 
 
Ensayo de migración celular epitelial 
Las células que alcanzaron 80% de confluencia fueron cosechadas y se 
resuspendieron en medio DMEM que contenía 5% de BSA o se cosecharon y se 
trataron previamente durante 2 horas con 10 mg/ml de mitomicina C (Sigma). Las 
células (3x105) se añadieron en el inserto superior de cámaras Boyden cuya 
membrana estaba recubierta con colágena (QCM™ Haptotaxis Cell Migration 
20 
 
Assay-Collagen 1, EMD Millipore, MA, EE.UU.). Para cada muestra, células 
añadidas en insertos recubiertos con BSA fueron usadas como controles. Los 
ensayos se hicieron 2 veces por duplicado. 
 
Migración de fibroblastos 
Los co-cultivos de células epiteliales y fibroblastos se realizaron como sigue: 
células MLE12 (MMP-1 o Mock) y células A549 (shControl o shMMP1) se 
sembraron en la parte inferior de placas de 24 pozos y fueron pre-tratadas 18 
horas con 10 nM de PMA. Después de 18 horas, fibroblastos de pulmón humano 
(3x105) (Promocell, Heidelberg, Alemania) se sembraron en insertos Transwell con 
una membrana de policarbonato recubierta de colágena I (CytoSelec 24 Wells Cell 
Haptotaxis Assay; Cell Biolab, CA) y se colocaron inmediatamente en los pozos 
donde se sembraron las células epiteliales y después de 8 horas, los fibroblastos 
que migraron se tiñeron y se cuantificaron de acuerdo con las instrucciones del 
fabricante. Como controles, se utilizaron insertos con fibroblastos que se colocaron 
en pozos que únicamente tenían medio. Se realizaron dos experimentos 
independientes por duplicado. 
 
Citometría de flujo 
Células a ~75% de confluencia en placas de 12 pozos se trataron por 3 horas con 
estaurosporina (1μM)o durante 48 horas con bleomicina (10 mU) (Sigma-Aldrich, 
St Louis, MO) para inducir la muerte celular programada. Después de la 
estimulación, las células se cosecharon y se marcaron con anexina-V conjugada 
con PE y 7AAD (BD Bioscience, San Diego, CA) siguiendo las instrucciones del 
21 
 
fabricante. Las células teñidas se adquirieron con el citómetro de flujo BD 
FACSCalibur (BD Bioscience, San Diego, CA) y los resultados de células en 
apoptosis temprana (Anexina-V+, 7AAD-) se calcularon con el software de análisis 
de citometría de flujo de FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, Oregón). Se realizaron 
dos experimentos independientes. 
 
Detección de especies reactivas de oxígeno (ROS) 
Las especies reactivas de oxígeno intracelular y mitocondrial generadas en células 
transfectadas con MMP-1 y Mock se determinaron con el uso de los reactivos 
H2DCFDA (2',7'-diclorodihidrofluoresceína diacetato) y MitoSOX, respectivamente 
(Molecular Probes, Invitrogen). Las células se sembraron en placas de cultivo de 6 
pozos a una densidad de 3.5x105 y se expusieron a normoxia o hipoxia durante 24 
horas. Después de 45 min de incubación con cada uno de los reactivos (5 mM), 
las células se cosecharon y fueron analizadas mediante citometría de flujo. 
 
Western blot 
Las células expresando la MMP-1 humana y Mock se sembraron en placas de 
cultivo de 100 mm y se hicieron crecer hasta que alcanzaron 75% de confluencia. 
Posteriormente, las células se expusieron a condiciones hipóxicas o normóxicas. 
Para obtener extractos totales, las células se lisaron con buffer RIPA (Sigma-
Aldrich, St Louis, MO) y los lisados de núcleos se obtuvieron con un kit de 
extracción nuclear (Epigentek, Nueva York). En paralelo, los medios 
condicionados libres de suero se obtuvieron a partir de células cultivadas en 
condiciones de normoxia, se concentraron por liofilización y se reconstituyeron en 
22 
 
agua. Las proteínas de los extractos totales (30 µg), los núcleos (20 µg) o medios 
condicionados (50 µg) se mezclaron con buffer Laemmli (V/V) y se separaron en 
geles de poliacrilamida-SDS al 10%. Las proteínas se transfirieron a una 
membrana de nitrocelulosa (Hybond ECL, Amersham Biosciences) y se 
bloquearon con leche al 5% (w/v) en PBS durante 1 hora. Las membranas se 
incubaron toda la noche a 4 °C con un anticuerpo de cabra anti-HIF-1α (1 mg /ml; 
Santa Cruz, CA), con un anticuerpo policlonal de conejo anti-MMP1-dominio 
hemopexina (2 mg/ml; Abcam). Después de lavar con PBS-Tween-20 (0.05%), las 
membranas se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado 
con HRP (1:10000; Jackson, West Grove, PA). Las bandas se detectaron usando 
el sistema de detección de quimioluminiscencia (ECL Thermo Scientific Pierce, 
Rockford, IL.). Como controles de carga se utilizaron anticuerpos para detectar β-
actina (1μg/ml; Santa Cruz, CA) en los lisados totales y un anticuerpo contra la 
histona H3 (2ug/ml; BioVision, Milpitas, CA) para los extractos nucleares. 
 
Medición del consumo de oxígeno (OCR) 
El consumo de oxígeno se estudió con un instrumento Seahorse Biosciences 
(modelo XF24) en placas de 24 pozos. Las células (4x104) se sembraron un día 
antes de realizar el experimento en medio completo. A continuación, las células se 
equilibraron a 37 °C durante 1 hora en una incubadora sin CO2. Para analizar el 
perfil metabólico mitocondrial de las células, se hicieron tres mediciones de la 
concentración de O2 en condiciones basales y después de agregar oligomicina A 
(5 mM), FCCP (10 mM) y antimicina/rotenona (2 mM/2 mM). Las mediciones se 
normalizaron con el número de células en cada pozo. Para sustraer la respiración 
23 
 
no-mitocondrial (fondo), los valores de OCR después de adicionar 
antimicina/rotenona se restaron a cada uno de los datos. 
 
Inmunohistoquímica e Inmunofluorescencia 
Se obtuvieron cortes histológicos de tejido pulmonar de entre 3 y 5 µm de grosor, 
los cuales fueron desparafinados y rehidratados. La inmunodetección se realizó 
incubando los cortes durante 30 minutos con H2O2 (3%) seguido de la 
recuperación de antígenos con buffer de citratos (10 mM, pH 6,0) durante 5 min 
en un horno de microondas. Posteriormente, se procedió a incubar las muestras 
de tejido a 4 °C durante toda la noche con el anticuerpo primario policlonal anti-
MMP-1 de conejo (dilución 1:100; IM35 Calbiochem) o con un anticuerpo Anti-pan 
Citoqueratina (Ab961 Abcam, Cambridge, MA). Para el revelado de la 
inmunorreacción, se utilizó un anticuerpo secundario biotinado seguido de la 
incubación con estreptavidina-HRP (BioGenex, San Ramon, CA). El procedimiento 
que se utilizó fue de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como sustrato 
se utilizó 3-amino-9-etil-carbazol (AEC, BioGenex) en buffer de acetato con H2O2 
0.05% que produce un precipitado de color rojo. Las muestras se contra-tiñeron 
con hematoxilina. 
Para la inmunofluorescencia, las células transfectadas con MMP-1 y Mock se 
sembraron en cubreobjetos de vidrio y se expusieron a normoxia e hipoxia durante 
24 horas. Las células se fijaron con metanol durante 10 min a -20°C y se 
permeabilizaron con Triton X-100 al 0.01% en PBS. Los cubreobjetos se incubaron 
toda la noche a 4 °C con anticuerpos policlonales hechos en conejo anti-MMP1 
(Epitomics 1:100) o anti-HIF-1α (2μg/mL; GeneTex, Irving CA). Después de lavar, 
24 
 
las células se incubaron con anticuerpo secundario Alexa Fluor 546 (1:300) 
durante 1 hora a temperatura ambiente. Los núcleos se marcaron con DAPI y las 
muestras se montaron y se visualizaron en un microscopio confocal (Olympus 
FluoView ™ FV1000). 
 
Cuantificación de MMP-1 en lavado bronquioalveolar (LBA) 
El LBA se realizó a través de broncoscopía con fibra óptica flexible como parte del 
proceso de diagnóstico, como se reportó anteriormente 42. Los sobrenadantes se 
guardaron a -70°C hasta su uso. En este estudio se utilizaron muestras de LBA de 
21 pacientes con FPI y 17 controles sanos. La MMP-1 se analizó con un ensayo 
cuantitativo de ELISA de acuerdo a las recomendaciones del fabricante (R&D 
Systems). 
 
Análisis estadístico 
Los resultados se expresan como media ± desviación estándar. Las diferencias se 
analizaron mediante t de Student o la U de Mann-Whitney. Los valores de p<0.05 
se consideraron estadísticamente significativos. 
 
 
 
 
 
 
 
25 
 
Resultados 
 
Localización de MMP-1 en pulmón de pacientes con FPI 
Para corroborar la localización celular de MMP-1 en FPI, se examinaron pulmones 
de pacientes con FPI (n=5) y tejidos de sujetos control (n=3). Como se ilustra en la 
figura 1A, C y D, se observa una fuerte marca inmunoreactiva para la MMP-1 que 
se localiza predominantemente en las células epiteliales alveolares (identificadas 
por citoqueratina, Figura 1B). Ocasionalmente, las células endoteliales también se 
tiñeron para MMP-1, mientras que en los tejidos control normales fue casi 
imperceptible (Figura 1E). 
Un ensayo de ELISA realizado en lavados bronquioalveolares (LBA), mostró una 
sobre-expresión significativa de MMP-1 en pacientes con FPI (4.02.4 contra 
1.11.4 ng/ml; p <0.01; Figura 1G), confirmando así la sobre-expresión de esta 
enzima en FPI. 
 
26 
 
A
E
DC
B G
F
 
 
Figura 1. Detección inmunohistoquímica de MMP-1 en pulmones de 
pacientes con FPI y controles. Se observa una fuerte marca inmunorreactiva de 
MMP-1 en las células epiteliales alveolares de FPI [A (flecha negra), C y D]. El 
Panel B muestra células epiteliales identificadas con citoqueratina (flecha negra) 
en un corte secuencial de la misma área observada en el panel A. Ocasionalmente 
se observó señal de MMP-1 en las células endoteliales (A, flecha roja). No se 
observó tinción en los pulmones normales (E). En F se muestra un control 
negativo. Las barras representan 50µm. Panel G: Cuantificación de MMP-1 por 
ELISA en fluidos de lavado bronquioalveolar de sujetos normales ypacientes con 
FPI. 
27 
 
Transfección de MMP-1 en células epiteliales de ratón 
Para investigar las consecuencias funcionales de MMP-1 en las células epiteliales, 
la secuencia completa de la MMP-1 se transfectó en la línea celular MLE12 y las 
células seleccionadas con puromicina fueron aisladas. La transfección exitosa fue 
confirmada por RT-PCR (Figura 2A), Western blot de medios condicionados 
(Figura 2B), y de extractos totales (Figura 2C), y por inmunofluorescencia (Figura 
2D). Adicionalmente, la actividad colagenolítica medida en el medio condicionado 
con el ensayo SensoLyte 520 de MMP-1 mostró un aumento de las unidades de 
fluorescencia relativa de 54.7±2 en Mock a 79.0±11 en las células transfectadas 
con MMP-1 (p <0.05). 
 
 
28 
 
Figura 2. Transfección de MMP-1 humana en células epiteliales alveolares de 
ratón (MLE). Detección de MMP-1 por RT-PCR (A) y Western blot de medio 
condicionado (B) y lisados celulares (C). Sólo se observó expresión positiva en las 
células transfectadas con MMP-1 y en fibroblastos humanos (FH) estimulados con 
FGF1 que se utilizaron como control positivo. No se detectó expresión en las 
células de tipo silvestre (WT) o en las células transfectadas con el vector vacío 
(Mock). Se utilizó β-actina como control de carga. (D) Detección de MMP-1 por 
inmunofluorescencia. La MMP-1 inmunorreactiva se detectó con el anticuerpo 
Alexa Fluor 546 y los núcleos se tiñeron con DAPI. Las imágenes de contraste 
diferencial de interferencia (DIC) están incluidas. Las barras representan 16 µm. 
 
Silenciamiento de MMP-1 en células de humano A549 
La transfección de células A549 con un ARN de interferencia (shMMP1) apagó ~3 
veces la expresión del ARNm de MMP-1 analizada por RT-PCR cuantitativa 
(Figura 3A) y redujo la proteína evaluada por Western blot (Figura 3B). Para 
algunos experimentos, las células epiteliales se estimularon con PMA, lo cual 
incremento ~300 veces la expresión de la MMP-1. Bajo estas condiciones, el 
shARN indujo una reducción del 50% en la expresión de MMP1 (Figura 3C). 
 
30 
 
MMP-1 induce la proliferación de células epiteliales 
Para evaluar el efecto de la MMP-1 en el crecimiento de las células MLE12 y A549 
se utilizó el ensayo de WST-1, que mide la actividad metabólica de las células 
viables. Como se muestra en la figura 4A, las células MLE12 transfectadas con 
MMP-1 mostraron un aumento significativo de su tasa de crecimiento a 36 y 48 
horas en comparación con las células silvestres y las células control (Mock). 
Debido a que la medición con WST-1 representa el resultado combinado de la 
proliferación y la muerte celular, también se analizó directamente la proliferación 
celular utilizando el ensayo de incorporación de BrdU. Al igual que con el WST, la 
figura 4B muestra un patrón de respuesta similar, con un incremento significativo 
de la proliferación a 36 y 48 horas en las células transfectadas con la MMP-1 en 
comparación con el control (Mock) y las células sin transfectar (WT). Por el 
contrario, el silenciamiento de MMP-1 con el shARN reduce significativamente la 
proliferación de células A549 examinadas por WST-1 y BrdU en comparación con 
el shControl (p<0.01; Figura 4C y D). 
 
31 
 
 
Figura 4. MMP-1 induce proliferación de células del epitelio alveolar. Células 
MLE12 transfectadas con MMP-1 y células A549 silenciadas con shMMP1 se 
sembraron en placas de 96 pozos y a los tiempos indicados, se analizó la tasa de 
crecimiento con el ensayo de WST-1 (A y B) y la proliferación por incorporación de 
BrdU (C y D). Cada punto representa la media ± DE de 3 experimentos 
independientes realizados por triplicado, * p <0.01. 
 
MMP-1 promueve la migración de células epiteliales 
Para examinar el efecto de la MMP-1 sobre la capacidad migratoria de las células 
epiteliales, se analizaron los efectos de esta proteína sobre el cierre de una herida. 
Para este propósito, células MLE12 transfectadas con MMP-1 y células Mock se 
hicieron crecer hasta confluencia completa y entonces fueron raspadas para crear 
32 
 
una herida desprovista de células. Como se muestra en la figura 5A, la 
transfección de MMP-1 aceleró consistentemente el cierre de la herida en 
comparación con las células Mock a las 24 horas, con un cierre casi completo de 
la herida a las 48 horas. El tratamiento con mitomicina C, un inhibidor irreversible 
de la mitosis, disminuyó la velocidad del cierre de la herida en células Mock y 
transfectadas con MMP-1. Sin embargo, aún con la mitomicina, la velocidad del 
cierre de la herida a 36 y 48 horas fue significativamente mayor en las células que 
fueron transfectadas con MMP-1 en comparación con los controles (Figura 5B). 
Adicionalmente, células MLE12 con MMP-1 y Mock se sometieron a un ensayo de 
migración en cámaras de tipo Boyden recubiertas con colágena, en presencia o 
ausencia de EGF, un potente agente quimiotáctico epitelial. Como se muestra en 
la figura 5C, se observó un aumento significativo en la migración de células 
transfectadas con MMP-1 en comparación con las células control (84±3% en 
MMP-1 vs 57±11% en Mock, p <0.01). El tratamiento de las células con mitomicina 
C, no tuvo ningún efecto sobre la transmigración. Los efectos del apagado de 
MMP-1 con el shARN sobre la migración, también se examinó utilizando el 
sistema Transwell. Los resultados mostraron que la migración celular de las 
células A549 tratadas con shMMP1 se redujo significativamente en comparación 
con las células transfectadas con el control de partículas lentivirales shRNA 
(p<0.01; Figura 5D). 
33 
 
A
C
Mock MMP1 Mock MMP1
0
50
100
150
200
M
ig
ra
c
ió
n
 s
o
b
re
 c
o
n
tr
o
l 
(%
)
*
+ Mitomicina
*
B
0
20
40
60
80
100
120
0 24 36 48
E
x
te
n
s
ió
n
 d
e
 l
a
 h
e
ri
d
a
 (
%
)
Horas
Mock
MMP1
MMP1+Mitomycin*
*
*
*
*
Mock
MMP1
MMP1+Mitomicina
D
0
20
40
60
80
100
Control shMMP1
M
ig
ra
c
ió
n
 s
o
b
re
 c
o
n
tr
o
l 
(%
)
*
shControl shMMP1 
0
24
36
48
horas Mock MMP1
 
 
Figura 5. MMP-1 induce migración de células epiteliales. A y B: ensayo de 
cicatrización de heridas. A: micrografías con contraste de fases que muestran 
imágenes representativas de monocapas de células epiteliales alveolares a las 
cuales se les hizo una herida con una punta de 200µl y se fotografiaron a los 
tiempos indicados después de la herida. B: Gráfica que muestra los valores de la 
extensión de la herida de dos experimentos independientes, p<0.01. Las barras 
punteadas a 36 y 48 horas representan células transfectadas con MMP-1 tratadas 
con mitomicina. C: células MLE12 transfectadas con MMP-1 o Mock y D: células 
A549 shMMP1 y control se sembraron en cámaras Boyden recubiertas con 
colágena y después de 8 horas en presencia de EGF (50 ng / ml) se evaluaron las 
células que migraron. La migración también se analizó en presencia de mitomicina 
34 
 
(C). La gráfica representa los valores de dos experimentos por duplicado, * 
p<0.01. 
 
MMP-1 protege de apoptosis a células epiteliales 
Primero examinamos el efecto de la transfección de la MMP-1 humana en la 
supervivencia de células MLE12 a las que se indujo apoptosis con estaurosporina 
(STS). La STS es un inhibidor de rango amplio de proteínas-cinasas de Ser/Thr y 
Tyr que desencadenan la muerte celular. Como se muestra en la figura 6A, el 
tratamiento con STS aumentó el porcentaje de células marcadas con anexina-V, lo 
cual se redujo significativamente en las células transfectadas con MMP-1 (células 
WT de 2.70.1 a 7.30.1; Mock de 2.40.1 a 6.71.0; MLE12-MMP1 de 2.050.1 
a 3.60.5; p<0.01). Del mismo modo, la exposición de las células Mock a 
bleomicina (un fármaco que causa daño induciendo sitios apurínicos/apirimídinicos 
y rotura de ADN en las células blanco) durante 3 h causó un aumento significativo 
de la apoptosis en las células Mock (desde 1.92± 0.04 a 16.5 ± 3.7) en 
comparación con las células MLE12 transfectadas con la MMP-1 (de 1.7 ± 0.16 a 
5.33 ± 1.9), p<0,01; Figura 6B). 
 
29 
 
 
Figura 3. Silenciamiento de MMP-1 en células epiteliales alveolares humanas 
A549. Las células A549 fueron transfectadas con partículas lentivirales (1x105) de 
shARN contra MMP-1 o partículas control. A: Expresión de MMP-1 por PCR en 
tiempo real normalizada contra la expresión de HPRT. B: Western blot de MMP-1 
en lisados celulares y su análisis densitométrico contra su control de carga β-
actina. C. MMP-1 en células A549 shMMP1 estimuladas con PMA. 
 
 
 
 
 
35 
 
Control Sts (1M)
WT 
Mock
MMP1
0 10
2
10
3
10
4
10
5
0
10
2
10
3
10
4
10
5 2.42 8.27
2.6186.7
0 10
2
10
3
10
4
10
5
0
10
2
10
3
10
4
10
5 2.43 11.7
7.378.6
0 10
2
10
3
10
4
10
5
0
10
2
10
3
10
4
10
5 0.64 4.4
2.2992.7
0 10
2
10
3
10
4
10
5
0
10
2
10
3
10
4
10
5 6.39 21
7.4765.2
0 10
2
10
3
10
4
10
5
0
10
2
10
3
10
4
10
5 4.67 7.7
3.9683.7
Anexina-V
7
-A
A
D Mock
MMP1
Anexina-V
7
-A
A
D
*
0
2
4
6
8
WT Mock MMP-1
A
p
o
p
to
si
s 
( 
%
 )
Ctrl
Sts
*
0
5
10
15
20
25
Mock MMP-1
A
p
o
p
to
si
s 
( 
%
 )
Ctrl
Bleo
A B
Control Bleo (10 mU)
0 10
2
10
3
10
4
10
5
0
10
2
10
3
10
4
10
5 3.44 4.77
1.9789.8
 
Figura 6. MMP-1 previene la apoptosis inducida en células epiteliales. Las 
células se cultivaron durante 3 horas en presencia de estaurosporina (STS) (A) o 
durante 48 horas con bleomicina (Bleo) (B) y la apoptosis se determinó después 
de marcar las células con AnexinaV-PE y 7AAD. Las gráficas de la parte inferior 
representan los valores de la apoptosis de dos experimentos independientes, 
*p<0.01. Paneles superiores: diagramas representativos de los experimentos con 
citometría de flujo. 
 
 
 
 
36 
 
MMP-1 influye en la migración de fibroblastos 
Para determinar si la MMP-1 podría tener un efecto sobre la migración de 
fibroblastos adyacentes, células MLE12 con MMP-1 o células A549 con shRNA-
MMP-1 fueron co-cultivadas con fibroblastos utilizando insertos Transwell. Como 
se muestra en la figura 7A, las células transfectadas con MMP-1 indujeron un 
aumento significativo de la migración de fibroblastos en comparación con las 
células Mock (p <0.01). Apoyando el papel epitelial de MMP-1 sobre la migración 
de fibroblastos, las células A549 con la MMP-1 apagada y estimuladas con PMA, 
producen una disminución en la migración de fibroblastos en comparación con las 
células shControl (p <0,01) (Figura 7B). 
 
37 
 
0
50
100
150
200
250
Mock MMP1
M
ig
ra
ci
ó
n
 s
o
b
re
 c
o
n
tr
ol
 (%
)
A
*
B
*
0
50
100
150
200
250
300
Control shMMP1
M
ig
ra
ci
ó
n
 s
o
b
re
 c
o
n
tr
ol
 (%
)
shControl shMMP1
 
Figura 7. La MMP-1 en células epiteliales induce la migración de fibroblastos 
de pulmón. Las células epiteliales fueron co-cultivadas con fibroblastos y la 
migración de los fibroblastos se analizó a las 8 horas como se describe en 
Métodos. A: Células MLE transfectadas con MMP1. B: Células A549 con la MMP-
38 
 
1 silenciada con shRNA y ahControl estimuladas con PMA. Se realizaron dos 
experimentos independientes por duplicado * p <0,01. 
 
MMP-1 reprime la respiración mitocondrial 
La velocidad del consumo de oxígeno (OCR) se analizó en células tratadas con 
oligomicina, FCCP y antimicina/rotenona. La antimicina y la rotenona son 
inhibidores del complejo mitocondrial III y I, respectivamente, así que cualquier 
respiración adicional bajo la influencia de ambos inhibidores, no se debe a la 
respiración mitocondrial. Entonces, se midió la respiración basal, acoplada, 
máxima y desacoplada. La respiración basal correspondió a las células sin 
tratamiento, la respiración acoplada de la célula está dirigida a la producción de 
ATP y resulta de la diferencia entre la respiración basal y la respiración después 
de añadir oligomicina A, un inhibidor de la F1FoATPasa mitocondrial; en 
consecuencia, la respiración en presencia de oligomicina A es la respiración no 
acoplada. Por último, la adición de FCCP, un agente desacoplante que afecta el 
potencial de membrana mitocondrial, nos permitió conocer la respiración máxima 
de las células. 
Para entender el papel de la MMP-1 en la regulación de la respiración 
mitocondrial, se comparó el perfil de respiración mitocondrial de las células 
epiteliales MLE transfectadas con el vector vacío o con MMP1. La Figura 8A 
muestra que la presencia de MMP-1 reprime la respiración mitocondrial. También 
se observó una disminución de la respiración basal, acoplada y máxima mientras 
que la respiración desacoplada se mantuvo. Estos datos indican que la respiración 
mitocondrial dirigida al recambio de ATP se reduce en presencia de MMP-1. Para 
39 
 
confirmar estos resultados, se midió el OCR de las células A549 que contenían el 
shARN contra la MMP-1 o shARN control. La Figura 8B confirma que la MMP-1 
actúa como un represor de la respiración mitocondrial, ya que el silenciamiento de 
MMP-1 incrementa la respiración basal y acoplada de las células A549. 
BASAL COUPLED MAXIMAL UNCOUP.
0
20
40
60
80
100
120
O
C
R
 (
n
m
o
l/
m
in
)
 Mock
 MMP1
*
**
***
A
B
0
20
40
60
80
100
120
140
O
C
R
 (
n
m
o
l/
m
in
)
sh control
sh MMP1
**
**
**
Basal Coupled Maximal Uncoup.
Basal Coupled Maximal Uncoup.
 
 
Figura 8. MMP-1 reprime la respiración mitocondrial. A. Células MLE12 que 
sobreexpresan MMP-1 y Mock y B: células A549 con la MMP-1 silenciada 
(shMMP1) y control (shControl) se estimularon con PMA, se sembraron en placas 
de 24 pozos y la velocidad del consumo de oxígeno (OCR) se determinó después 
40 
 
de tratar las células con oligomicina A, FCCP, y antimicina / rotenona. * p <0,02; ** 
p <0,001; *** p <0,03. 
 
MMP-1 estimula la expresión de HIF-1. 
Debido a que las células transfectadas con MMP-1 mostraron una disminución de 
la velocidad de respiración, decidimos analizar la activación del factor inducible por 
hipoxia (HIF-1α) en condiciones de normoxia e hipoxia. Como se observa en un 
experimento representativo mostrado en la figura 9A, HIF-1α se encuentra 
activado en extractos totales de células Mock en condiciones de normoxia y como 
se esperaba aumenta en hipoxia. Sin embargo, en comparación con las células 
control, las células transfectadas con MMP-1 tienen una mayor expresión de HIF-
1α, tanto en condiciones de normoxia como en hipoxia, (Figura 9A). Este efecto 
fue más evidente cuando se analizaron los extractos nucleares de estas células 
(Figura 9B). Estos resultados fueron confirmados por inmunofluorescencia de HIF-
1α y como se muestra en la figura 9C, HIF-1α está más expresado en el 
citoplasma y núcleo de las células transfectadas con MMP-1, tanto en condiciones 
de normoxia como en hiperoxia. 
En contraste, el silenciamiento de MMP-1 en las células A549 disminuye la 
activación de HIF-1α en condiciones de normoxia (Figura 9D). 
41 
 
HIF-1α
H3
Nx
Mock MMP1
Hx
Mock MMP1
Nx
C shMMP1
Hx
C shMMP1
HIF-1α
β-actina
B CA
DIC
HIF-1α
DAPI
+
HIF-1α
Mock MMP1
Nx
Mock MMP1
Hx
D
Nx
Mock MMP1
HIF-1α
β-actina
Hx
Mock MMP1
 
 
Figura 9. MMP-1 induce HIF-1α en las células epiteliales alveolares de ratón. 
Células MLE12 se mantuvieron a 37°C en una cámara bajo condiciones de 
normoxia (Nx, 21% O2) o hipoxia (Hx; 1% O2). Después de 24 h, HIF-1α se analizó 
por Western blot en los extractos totales (A) y en la fracción nuclear (B). C: 
Western blot que muestra los niveles de HIF-1α en células A549 control y con la 
MMP-1 silenciada (shMMP1) en condiciones de normoxia e hipoxia. D: Detección 
de HIF-1α por inmunofluorescencia. La presencia HIF-1α inmunorreactivo se 
detectó con un anticuerpo Alexa Fluor 546 y los núcleos se tiñeron conDAPI. Las 
barras representan 16µm. 
 
 
42 
 
 
La hipoxia induce sobre-expresión de MMP-1 en células epiteliales 
Las células A549 fueron expuestas a condiciones de hipoxia y entonces se 
analizaron los niveles de expresión de MMP-1. Como se observa en la figura 10A 
y B, la expresión del gen y de la proteína aumentaron bajo condiciones de hipoxia. 
Así mismo, la MMP-1 se localizó principalmente en la fracción mitocondrial, como 
se ilustra en la figura 10C. 
A
B
β-actina
Nx Hx
MMP1
Nx Hx
HIF-1α
β-actina
C
50 ―
MMP1
Complejo I
β-actina
37 ―
15 ―
0
10
20
30
40
50
Normoxia Hypoxia
(2
^
-(
M
M
P
1
-H
P
R
T
))
*1
0
^
3
*
Nx Hx 
 
 
Figura 10. La hipoxia induce MMP-1 y HIF-1α en las células epiteliales 
alveolares humanas. Células A549 se sembraron en placas de cultivo de 100 mm 
y se expusieron a condiciones de hipoxia (Hx) o normoxia (Nx) durante 24 horas. 
A: Expresión de MMP-1 por PCR en tiempo real. B: Detección de MMP-1 y HIF-1α 
por Western blot en lisados totales. C: Western blot de las fracciones mitocondrial 
y citosol.* p <0,01. 
43 
 
 
MMP-1 disminuye los niveles de especies reactivas de oxígeno 
Los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) se determinaron en células 
transfectadas con MMP-1 y Mock utilizando los reactivos CMH2DCFDA y 
MitoSOX, un indicador selectivo del superóxido mitocondrial. Como se ilustra en la 
figura 11, el análisis de los histogramas de FACS mostró una disminución 
significativa de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de ROS total y 
mitocondrial de las células transfectadas con MMP-1 en comparación con las 
células control. La medición de los niveles de ROS en condiciones de normoxia 
demostró que la sobreexpresión de MMP-1 produce una disminución de 3.6 veces 
de ROS mitocondrial. Cuando las células fueron cultivadas en hipoxia, los niveles 
de ROS mitocondrial en células Mock y con MMP-1 se duplicaron. De modo 
similar a lo ocurrido en normoxia, se observó una disminución de 3.5 veces en los 
niveles de ROS mitocondrial en las células que sobre-expresan la MMP-1 en 
comparación con las células control. Finalmente, el efecto de la transfección de 
MMP-1 en el porcentaje de ROS total fue similar, lo que resulta en una 
disminución de los niveles de ROS, tanto en condiciones de normoxia como en 
hipoxia. 
44 
 
 
Nx Hx
Mock
MMP1
Control sin tinción
 
Figura 11. La sobreexpresión de MMP-1 inhibe la producción de ROS total y 
mitocondrial en normoxia e hipoxia. Células MLE12 transfectadas con el vector 
vacío (Mock) y con MMP-1 se cultivaron durante 24 horas en condiciones de 
normoxia (21% O2) o hipoxia (1% O2). La producción de ROS total y ROS 
mitocondrial se midió con el reactivo CM-H2DCFDA (DCF) y MitoSOX, 
respectivamente y se analizó por citometría de flujo. La figura muestra los 
histogramas representativos de la intensidad de fluorescencia de cada colorante 
(MFI: media de intensidad de fluorescencia). 
45 
 
Discusión 
La FPI es una enfermedad de etiología desconocida, crónica, progresiva, 
irreversible y generalmente letal. Sus mecanismos patogénicos no han sido 
elucidados, pero existen fuertes evidencias experimentales que indican que el 
epitelio alveolar pulmonar aberrantemente activado, produce una variedad de 
mediadores profibrosantes y desempeña un papel clave en el desarrollo de la 
enfermedad 2,3,43. El análisis de la firma transcripcional de la FPI ha demostrado 
que el gen de la MMP-1 es uno de más altamente sobre-expresados y que la 
proteína, como se confirma en el presente estudio, se produce principalmente en 
las células del epitelio alveolar 25. Sin embargo, los posibles efectos funcionales de 
la expresión epitelial (pulmonar) de esta enzima se desconocen. La MMP-1 es el 
arquetipo de las colagenasas de vertebrados que a través de la colaboración de 
su dominio catalítico y del carboxilo terminal tipo hemopexina es capaz de 
degradar las colágenas fibrilares tipos I, II y III. Sin embargo, diferentes estudios 
han mostrado que esta enzima está además involucrada en la liberación de las 
superficies celulares o de la matriz extracelular de varias moléculas como los 
factores de crecimiento transformante α y β. Asimismo, puede procesar y activar 
varios mediadores importantes como el pro-TNF-α, IL-1β, L-selectina, el inhibidor 
de la α1 antitripsina, el factor C1q del complemento y el factor de crecimiento de 
tejido conjuntivo 36-38,44. 
La expresión elevada de la MMP-1 ha sido documentada en otras enfermedades 
del aparato respiratorio asociadas con la exposición al humo de cigarrillo como el 
enfisema y el cáncer pulmonar 30,45, y en este contexto, se ha demostrado que el 
46 
 
humo de cigarrillos induce la sobre-expresión de MMP-1 a través de la vía de 
señalización de MAPK 30. 
La expresión epitelial de MMP-1 también se ha reportado en la piel, donde parece 
participar en la migración de queratinocitos sobre matriz de colágena tipo I y se ha 
sugerido que regula la actividad migratoria a través de su unión a la integrina α2β1 
en la membrana celular de los queratinocitos 39,41,46. En modelos de cicatrización 
de heridas en la piel se ha observado que la disminución de MMP-1 parece ser 
importante para la remodelación normal del tejido mientras que altos niveles de la 
enzima se asocian con heridas crónicas que no curan apropiadamente 47. Sin 
embargo, no existen estudios relacionados con los efectos de esta enzima sobre 
las funciones del epitelio alveolar pulmonar. 
La MMP-1 no parece desempeñar un papel similar en ratones y humanos. El 
ortólogo murino de la MMP-1, Mcol-A, muestra una baja identidad con la MMP-1 
humana (74% en nucleótidos y 58% en aminoácidos) en comparación con las que 
comparten los ortólogos de otras MMP’s en humanos y ratones 48. 
En este contexto, en el presente estudio se evaluaron diferentes funciones de la 
expresión de MMP-1 en células epiteliales alveolares de pulmón transfectadas con 
la MMP-1 humana. Los resultados obtenidos en este trabajo, mostraron que la 
MMP-1 incrementa las capacidades migratorias y proliferativas de estas células 
epiteliales, y las protege de la apoptosis. Confirmando estos hallazgos, el 
silenciamiento de la MMP-1 en células epiteliales alveolares humanas resultó en 
una disminución significativa en migración y proliferación. Además, usando co-
cultivos de células epiteliales alveolares y fibroblastos de pulmón, las dos estirpes 
celulares que desempeñan un papel clave en la patogénesis de la FPI, 
47 
 
observamos que las células epiteliales de ratón transfectadas con la MMP-1 
también indujeron la migración de fibroblastos. 
Los mecanismos específicos por los cuales la MMP-1 impacta sobre la migración, 
proliferación y resistencia a la apoptosis de las células epiteliales se desconoce. 
En relación a su efecto sobre la capacidad migratoria, se ha sugerido que la 
degradación de la colágena tipo I mediada por esta enzima es necesaria para la 
migración de queratinocitos y la curación de heridas lo que indica una típica 
función extracelular de esta proteasa 41. 
Es de interés mencionar que, en los últimos años se han empezado a documentar 
algunas funciones intracelulares de la MMP-1 49. Así por ejemplo, se ha 
demostrado la localización intracelular de la MMP-1 en mitocondrias y núcleo de 
varios tipos celulares como las células gliales de Müller, fibroblastos de córnea y 
células epiteliales de la retina 40. En este contexto, el hallazgo de que la MMP-1 
intracelular se acumula durante la fase mitótica del ciclo celular, ha sugerido su 
participación en la disociación temporal de proteínas de la membrana nuclear que 
promueven el crecimiento celular así como que la asociación intracelular de MMP-
1 a las mitocondrias y núcleos confiere resistencia a la apoptosis 40. Es importante 
destacar que en nuestro estudioencontramos que las células epiteliales alveolares 
de pulmón de ratón transfectadas con MMP-1 tienen un comportamiento similar. 
Asimismo, encontramos que la MMP-1 se encuentra localizada principalmente en 
las mitocondrias de las células epiteliales alveolares del pulmón. Sin embargo, un 
hallazgo relevante fue el demostrar que las células de ratón transfectadas con 
MMP-1 mostraban una represión de la velocidad de consumo de oxígeno 
sugiriendo que esta proteasa podría inhibir la función mitocondrial. Se ha 
48 
 
propuesto que una ventaja importante en la reducción de la tasa respiratoria 
durante la hipoxia es limitar la producción de radicales libres de oxígeno. En este 
contexto, fue muy interesante encontrar que la MMP-1 reduce el consumo de 
oxígeno y también la producción de ROS. Existe evidencia que indica que HIF-1α 
reduce la producción de ROS bajo condiciones de hipoxia a través de varios 
mecanismos. Nuestros datos indican que la expresión epitelial de MMP-1 reprime 
el consumo de oxígeno, induce la expresión de HIF-1α bajo condiciones de 
normoxia y disminuye la producción de ROS. Este hallazgo es similar al descrito 
en células neoplásicas las cuales tienen un incremento del metabolismo de 
glucosa 50. 
De manera interesante se ha reportado recientemente que líneas de células 
tumorales que expresan otra proteasa de esta familia, la MT1-MMP (MMP-14), 
una MMP-tipo membrana, exhiben un aumento en la actividad glucolítica y que la 
transfección de esta enzima en células tumorales que no la expresan, induce el 
efecto Warburg a través de la activación de HIF-1α 51. De manera similar, en 
nuestro estudio encontramos que la MMP-1, además de reprimir el consumo de 
oxígeno, incrementaba la activación de HIF-1α bajo condiciones de normoxia e 
hipoxia. 
El efecto Warburg se caracteriza por un incremento de la actividad de glucólisis 
aeróbica a pesar de la presencia de abundante oxígeno la cual se acompaña de la 
activación de HIF-1α durante normoxia 52,53. El factor de transcripción HIF-1α, un 
regulador esencial de la homeostasis del oxígeno y de la señalización en hipoxia, 
promueve la glucólisis aumentando la expresión de genes que codifican para 
enzimas glucolíticas y transportadores de glucosa mientras inhibe la fosforilación 
49 
 
oxidativa 52-54. De manera importante, HIF-1α también activa la transcripción de 
genes que codifican para proteasas que degradan la matriz extracelular 
incluyendo varias MMP’s tales como MMP-2, MMP-9, y MMP-14 55. En el presente 
estudio, hemos demostrado que la MMP-1 también es sobre-expresada cuando 
HIF-1α se induce por hipoxia en la línea de células epiteliales alveolares humanas. 
En conjunto, nuestros hallazgos indican una probable comunicación bidireccional 
entre MMP-1 y HIF-1α, ya que la transfección de la enzima provoca la activación 
del factor de transcripción mientras que la activación de HIF-1α correlaciona con la 
sobre-expresión de MMP-1. Esta observación puede ser relevante para el 
entendimiento de la patogénesis de la FPI ya que varios estudios que han 
evaluado el perfil transcripcional de los pulmones con FPI incluyendo expresión 
comparativa y una serie de meta-análisis han revelado señalización de hipoxia 
entre las vías más alteradas 56. Aún más, HIF-1α se encontró incrementado en FPI 
y expresado casi exclusivamente en células hiperplásicas del epitelio alveolar 
revistiendo los focos de fibroblastos 55. De la misma manera, la MMP-1 también 
está muy incrementada en los pulmones con FPI y se expresa fundamentalmente 
en el epitelio alveolar hiperplásico, hiperreactivo como confirmamos en este 
estudio 26,27. 
En resumen, en este trabajo hemos demostrado por primera vez que la expresión 
de la MMP-1 en células epiteliales alveolares inhibe la función mitocondrial, 
aumenta la expresión de HIF-1α disminuye la producción de ROS y contribuye a 
generar un fenotipo proliferativo, migratorio y anti-apoptótico. 
 
 
50 
 
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