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I UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA EL INCREMENTO GRADUAL DE CO2 EN LA PRIMER MITAD DE LA INCUBACIÓN Y UN CAMBIO POSTERIOR DE PRESIÓN DE O2 EN CÁMARA DE AIRE MODIFICAN LA TRAYECTORIA DE INCUBACIÓN EN AVES DOMÉSTICAS TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE MÉDICA VETERINARIA ZOOTECNISTA PRESENTA JANET GARCÍA HERRERA Asesor: M.V.Z. M.C. Marco Antonio Juárez Estrada México, D.F. 2012 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. II DEDICATORIA A mis hermanos, mis abuelos, mis padres, mis tíos; a mi novio Jorge Luis y a mis amigos, por su cariño y apoyo. A la Universidad Nacional Autónoma de México A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia III AGRADECIMIENTOS A mis hermanos, mis abuelos y mi padre por su compresión, cariño y apoyo, a mi madre por seguir acompañándome en mi trayecto. A Jorge Luis por quererme tanto, por sus palabras, su apoyo y sobre todo por mostrarme lo maravilloso de lo simple. A mis tíos José Antonio y Silvia por creer en mí y ayudarme incondicionalmente. A Gaby y a Jorge por su cariño y permitirme ser parte de su familia. A mis mejores amigos Rodrigo, Giovanni y Eduardo que a pesar de todo siempre han estado conmigo para escucharme, aconsejarme, regañarme y animarme. Al Dr. Marco Antonio Juárez Estrada, por su apoyo, conocimientos y tiempo durante la última etapa de mi formación profesional. Al MVZ Erik López Ruiz por su ayuda y conocimientos durante la fase experimental de este proyecto. A los miembros del Departamento de Medicina y Zootecnia de Aves. A la Universidad Nacional Autónoma de México y a la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia por permitirme ser parte de una gran institución. Un agradecimiento especial a la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (D.G.A.P.A.- U.N.A.M.) por el financiamiento otorgado al presente estudio y por la beca otorgada para la realización de la presente tesis de licenciatura a través del proyecto PAPIIT IN 220909-3 “Evaluación del incremento de CO2 en la etapa temprana de incubación sobre el desarrollo embrionario en aves domésticas” IV CONTENIDO RESUMEN .............................................................................................................. 1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 2 HIPÓTESIS ............................................................................................................. 8 OBJETIVO GENERAL ............................................................................................ 9 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 9 MATERIAL Y MÉTODOS ...................................................................................... 11 RESULTADOS ...................................................................................................... 20 DISCUSIÓN .......................................................................................................... 26 CONCLUSIONES ................................................................................................. 45 LITERATURA CITADA .......................................................................................... 46 CUADROS ............................................................................................................ 55 1 RESUMEN JANET GARCÍA HERRERA. El incremento gradual de CO2 en la primer mitad de la incubación y un cambio posterior de presión de O2 en cámara de aire modifican la trayectoria de incubación en aves domésticas. (Bajo la dirección del: M.V.Z. M.C. Marco Antonio Juárez Estrada) Se evaluó el efecto de ventilación restringida (VR) con el objetivo de lograr un aumento gradual de CO2 durante la primer mitad de la incubación sobre el desarrollo embrionario (DE). En el primer estudio se utilizaron huevos de aves reproductoras pesadas (Gallus gallus) (Ross 308) de 30 semanas de edad, la mitad se asignó aleatoriamente a un grupo VR y la otra mitad a uno de ventilación estándar (V). El grupo VR al día 10 DE mostró 11,600 ppm de CO2, con 48% de incubabilidad, mayor (P<0.05) al 41% del grupo V. Los pollitos del grupo VR fueron más largos (16.9 cm) y pesados (43.2 g) que los del V. En un segundo estudio se utilizaron 504 huevos de aves Ross 308 de 45 semanas; en un tercer estudio 984 huevos fértiles de codorniz japonesa (Coturnix coturnix japonica), los grupos VR de ambos estudios se incubaron durante la primer mitad del DE con ventilación restringida baja (VRB) y ventilación restringida alta (VRA), después de la primer mitad del DE las condiciones de incubación cambiaron a V. Al momento de la transferencia se efectúo una perforación de 1.3 mm en el cascarón de la cámara de aire, los grupos VR se subdividieron en cascarón sin perforar (CSP) y cascarón perforado (CP). En el segundo experimento el grupo VRB mostró 15,000 ppm de CO2 y el VRA 17,000 ppm; el VRB mostró 82% de incubabilidad, mayor (P<0.05) al 77% del grupo VRA. Hubo más mortalidad en etapa III (14.7%) en el grupo CSP. La eclosión en VRB inició a las 495 horas de DE menor (P<0.05) a las 501 del VRA. El peso de la canal de los pollitos fue mayor (P<0.05) en el CSP que en el CP. En el tercer estudio el grupo VRB con 9,500 ppm CO2 fue menor (P<0.05) al grupo VRA (10,250 ppm). La incubabilidad del factor CSP (72%) fue mayor (P<0.05) al 67% del factor CP. En la etapa III de mortalidad embrionaria el grupo CSP mostró 11.4%, mayor (P<0.05) a 7.7% del grupo CP. La eclosión en el grupo VRB inició a las 384 horas de DE (ventana de 39 hrs), en el VRA inició a las 394 hrs (31 hrs). Los guarnigones del grupo VRB fueron más pesados (8.6 g) y largos (9.8 cm) que los del VRA. La hipercapnia en etapa temprana favorece mejores parámetros de incubación, peso, longitud y calidad de los pollitos. En gallinas de 45 semanas se determinó un perfil óptimo de incubación con VRB a gran altitud sobre el nivel del mar, con un límite para CO2 de 15,000 ppm en comparación a la VRA con 17,000 ppm. La perforación en el cascarón disminuye la mortalidad en la etapa III momento cuando ocurre el cambio de respiración difusiva a convectiva, sin embargo, es importante considerar el balance hídrico previo de los embriones durante la incubación y su correlación con el grado de conductancia del cascarón, además de la altitud sobre el nivel del mar, ya que estos factores son la clave en la óptima presión parcial de O2, CO2 y H2O, en la cámara de aire previamente y durante la eclosión. Palabras clave: INCUBABILIDAD, HIPERCAPNIA, CÁMARA DE AIRE, CALIDAD, PÉRDIDA DE HUMEDAD. 2 INTRODUCCIÓN La industria avícola mexicana se encuentra ante un gran reto de integración productiva y comercial para poder competir en el ámbito de un mercado cada vez más global, que exige productos de mayor calidad a menor precio (UNA, 2011).1 La incubación artificiales clave en la implementación y eficiencia de la avicultura a gran escala, ya que gracias a ella se puede cubrir la demanda de aves para abastecer el mercado de productos de origen avícola. El desarrollo embrionario (DE) de las aves domésticas es un proceso dinámico, requiere de un equilibrio delicado de los factores involucrados; aunque el tamaño del huevo, la viabilidad del embrión y la calidad del cascarón se encuentran influenciados por la genética de los progenitores, su edad y su alimentación; el régimen de incubación, la composición física y química del medio ambiente que rodean al huevo determinan en gran proporción el éxito en su eclosión. El huevo pierde agua a través de las membranas y el cascarón, favoreciendo la formación de la cámara de aire en el polo obtuso del mismo. Dentro de las estructuras extraembrionarias más importantes involucradas en el proceso respiratorio temprano del embrión están la vasculosa (VS) y la membrana corioalantoiodea (MCA), ambas permiten la difusión de oxígeno (O2), bióxido de carbono (CO2) y vapor de H2O entre el medio ambiente y la sangre del embrión, durante el proceso de incubación temprano y medio (Tullett y Deeming, 1982).2 3 El intercambio de gases es fundamental para el DE durante la incubación, ya que si este no es apropiado se puede afectar la viabilidad del embrión (Tona et al, 2007).3 Aunque el O2 es el gas que impulsa la maquinaria metabólica de las células embrionarias con el fin de obtener un desarrollo complejo (Rahn y Ar, 1979),4 la producción y presencia del CO2 es imprescindible en la generación de la presión interna que favorece el intercambio gaseoso. De manera artificial, los huevos de gallina son incubados en un ambiente con 21% de O2 en presencia de 0.04 a 0.5% de CO2 en los diferentes períodos de la incubación. La ventilación de las incubadoras proporciona O2 para el embrión y elimina el exceso de CO2 generado. La presencia y cantidad específica de CO2 a lo largo del proceso incubatorio, ha mostrado ser muy importante en el desarrollo embrionario, se considera que niveles altos de CO2 (superior a 4%) durante todo el proceso de incubación son perjudiciales para el desarrollo del embrión (Sadler et al, 1954; Owen, 1991).5,6 Sin embargo, investigaciones recientes han mostrado que la hipercapnia en determinados periodos a lo largo de todo el proceso incubatorio puede ser benéfica para el DE (Gildersleeve y Boeschen, 1983; De Smit et al, 2006; Willemsen et al, 2008.7,8,9 Por ejemplo, De Smit et al (2006)8 observaron que un aumento gradual de hasta 1.5% de CO2 durante los primeros 10 días de incubación, favorece un mayor desarrollo del embrión, mayor incubabilidad y un mejor desenvolvimiento en el crecimiento de las aves después de la eclosión; mientras que Willemsen et al (2008)9 adicionalmente mencionaron que con un sistema de no-ventilación (NV) durante este mismo periodo se obtuvo una menor 4 proporción de embriones en mala posición y con mayor porcentaje de nacimientos de los huevos fértiles de gallina o pavo. Un incremento de CO2 de hasta 4%, en las primeras 48 horas de incubación mostró un efecto positivo en el DE (Saddler et al, 1954)5 y un diferencial de peso del embrión con relación al grupo testigo (Bruggeman et al, 2007).10 Es decir, la tolerancia de los embriones al CO2 se modifica conforme avanza el DE, los primeros 4 días la concentración de CO2 puede aumentar hasta 1% (Taylor et al, 1956).11 En los días 5 y 8 DE, los embriones sobreviven a concentraciones de 3% de CO2, entre los días 9 y 12 de incubación los embriones pueden sobrevivir a concentraciones de 5% de CO2, sin embargo, los parámetros de incubación pueden verse afectados de forma negativa (Taylor y Kreutziger, 1965).12 Dicha tolerancia se puede deber, a un más rápido establecimiento del sistema respiratorio primero a través de la vasculosa y posteriormente por medio de la MCA, la cual inicia su funcionamiento a las 96 horas de DE y se encuentra completamente funcional a las 150 horas de DE (De Smit et al, 2006; Taylor y Kreutziger, 1965,).8,12 Por lo tanto el incremento de la presión externa al cascarón de CO2, tiende a mostrar efectos de hipoxia, lo cual posiblemente promueve un desarrollo y funcionamiento más precoz y eficiente de la MCA y consecuentemente un mayor desarrollo de determinados órganos del embrión favoreciendo un mayor DE y por lo tanto una eclosión temprana, con una ventana más estrecha y una optimización general en la incubabilidad (De Smit et al, 2006; 5 Tona et al, 2007; Bahadoran et al, 2010).3,8,13 Se ha descrito, que ésta hipercapnia funcional en el entorno del embrión y a nivel de la cámara de aire durante las etapas tempranas reduce el pH de la albúmina, retrasa la ruptura de las chalazas y la capa gruesa de la albúmina; una acción precoz por parte de la anhidrasa carbónica, se encuentra involucrada en la oportuna y precoz formación de líquido sub-embrionario (SEF) lo cual es clave en el desarrollo temprano del embrión (Deeming, 1989).14 Para lograr una uniformidad de parvada es preferible una ventana de nacimiento corta, una concentración de CO2 mayor al 2% estimula a los pollitos a picar el cascarón (French, 2010);15 sin embargo, embriones con mayor peso inicial pueden requerir más tiempo de incubación lo cual reduce la calidad de los pollitos, ya que las altas concentraciones de CO2 al final de incubación pueden afectar negativamente al corazón y el grado de maduración óptimo de los pulmones (Coleman y Coleman, 1991).16 Por lo cual el aumento de CO2 que promueve mayor concentración de corticosterona y T3 en el plasma, aunado a la baja presión de O2, se consideran estímulos clave para la eclosión (Decuypere et al. 2007; Visschedijk, 1968; Tona et al. 2003).17,18,19 Estos estudios indican que si bien el estímulo primordial para disparar el picaje interno, es un incremento de CO2 con un incremento significativo en la concentración de corticosterona y T3/T4, posterior al picaje interno, agotada la reserva de aire de la cámara de aire se requiere contar con una gran disponibilidad de O2, ésta es la etapa más crítica del DE, ya que si el futuro pollito no logra efectuar favorablemente el cambio de respiración difusiva a convectiva en un periodo aproximado de 6 horas se 6 compromete la sobrevivencia del mismo, de acuerdo a diversas investigaciones se ha observado que una disponibilidad de hasta el 23% de O2 durante este periodo puede contribuir a mejorar la tasa de natalidad. Una forma ya descrita para tratar de aumentar el porcentaje de nacimientos, es la utilizada por Meir y Ar (1999),20 la cual consiste en la perforación de diferentes diámetros de la cámara de aire durante la segunda etapa del periodo de incubación de huevos fértiles de gallina y gansa. En esta etapa, la cámara de aire normalmente cubre solo una cuarta parta de la superficie de la MCA, por lo tanto la difusión lateral en las membranas del cascarón se ha descrito que se encuentra muy limitada (Visschedijk et al, 1988; Ar y Girard, 1989),21,22 la perforación tentativamente aumenta la presión parcial de oxígeno (PaO2) de forma interna y lateral a nivel de la MCA, lo cual Meir y Ar (1999)20 indican que mejora el intercambio gaseoso y aumenta la disponibilidad de oxígeno al embrión en una de las etapas más críticas del DE, cuando gradualmente se sustituye la respiración difusiva de la MCA a la forma convectiva de los capilares aéreos de los pulmones. Es posible, que una maduración más temprana eficiente de la MCA promovida por un sistema de no-ventilación los primeros 10 días del DE aunado a este aumento en la biodisponibilidad de O2 a través de una perforación en el cascarón en la etapa crítica de cambio de respiración sea altamente favorable en la eclosión. 7 Correa et al (2006)23 describen un método parainocular embriones, con la principal finalidad de aplicar vacunas in ovo por medio de inyección automática, estos investigadores determinaron que los embriones inoculados después del día 19 con 4 horas y antes del día 19 con 12 horas presentaron mejor incubabilidad, posiblemente por una mejora en el intercambio gaseoso. En el presente trabajo, se describe el efecto de la incubación de huevos fértiles de aves domésticas, bajo condiciones de ventilación limitada y estándar durante la primera mitad del DE, posteriormente al día de la transferencia se efectúo un cambio de presión en la cámara de aire por medio de una perforación de 1.3 mm de diámetro en el cascarón de forma análoga a la posición donde perfora la máquina automática de vacunación in ovo de uso actual en México (Embrex, Inovoject System), se evalúo el efecto de estos dos tipos de variables sobre los parámetros de incubabilidad y la calidad del pollito eclosionado. 8 HIPÓTESIS El incremento en la concentración de CO2 natural durante la incubación, con ventilación restringida en huevos fértiles durante la primera mitad de la incubación aunado a un posterior cambio de la presión de O2 y CO2 en el interior de la cámara de aire al momento de la transferencia por medio de la perforación de una ventana de ventilación sobre la cámara de aire, modifica la trayectoria de incubación. 9 OBJETIVO GENERAL Evaluar el efecto de diferentes niveles de CO2 y O2, en la primer mitad de la incubación por medio de limitar la ventilación y favorecer ésta al momento de la transferencia por medio de una perforación en el cascarón de la cámara de aire, sobre la mejora o deterioro de los parámetros de incubación y calidad de los pollitos eclosionados. OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Determinar la cantidad de CO2 durante los primeros 10 días del desarrollo embrionario, en huevos fértiles de aves domésticas, incubados bajo condiciones de ventilación restringida e incubación estándar. -Evaluar el efecto sobre los parámetros de incubación y calidad de los pollitos eclosionados, cuando se efectúa la incubación con ventilación restringida y ventilación estándar durante la primer mitad del proceso incubatorio. - Efectuar el cambio de presiones de CO2 y O2 en la cámara de aire posterior a la ruptura de la membrana albuminífera de la cámara del huevo, por los embriones incubados durante la primera mitad del desarrollo embrionario bajo condiciones de ventilación restringida. 10 - Evaluar el efecto de cambio de presiones de CO2 y O2 en la cámara de aire, posterior a la ruptura de la membrana albuminífera de la cámara del huevo por los embriones incubados durante la primera mitad del desarrollo embrionario, bajo condiciones de ventilación restringida sobre las cantidades de CO2 y O2 presentes en la máquina de incubación. - Obtener los porcentajes de fertilidad, natalidad e incubabilidad de los huevos fértiles sometidos a un cambio de presiones de O2 / CO2, y que fueron incubados bajo diferentes condiciones de ventilación restringida. - Evaluar la ventana de nacimiento de los pollitos, que eclosionaron de los huevos sometidos a un cambio de presiones de CO2 y O2, mismos que fueron incubados bajo dos diferentes condiciones de ventilación restringida. - Realizar el diagnóstico temporal, gradual y etápico de la mortalidad embrionaria en los huevos fértiles sometidos a un cambio de presiones de CO2 y O2, y que no lograron eclosionar de huevos fértiles incubados bajo dos distintas condiciones de ventilación restringida, esto con la finalidad de documentar las causas de la mortalidad embrionaria. - Calificar y evaluar la calidad de los pollitos nacidos, como resultado de la incubación con un cambio de presiones de CO2 y O2, efectuado posterior a una etapa temprana de incubación bajo condiciones de ventilación restringida. 11 MATERIAL Y MÉTODOS Huevos para incubación Para el primer y segundo estudio, los huevos fértiles aptos para la incubación (descarte de hasta el 5% de huevos rotos, fisurados, defectuosos y sucios), se obtuvieron de aves reproductoras pesadas de la estirpe Ross 308 de 30 y 45 semanas de edad respetivamente, alojadas en una granja comercial ubicada en Jojutla, Morelos (Reproductoras del sur S.P.R. de R.L. MI). Para el tercer estudio los huevos de codorniz japonesa, se obtuvieron de codornices reproductoras de 16 semanas de edad, alojadas en una granja ubicada en el municipio de Acapulco de Juárez, Guerrero. Fueron pesados e identificados de forma progresiva una vez que se encontraron en el sitio de incubación, posteriormente de manera aleatoria se asignaron a cada uno de los tratamientos. Diseño experimental Para el primer estudio se formaron dos grupos experimentales, el primero fue de no ventilación (NV) o ventilación restringida (VR) y el segundo de ventilación estándar (V), utilizando el mismo tipo de maquina incubadora (Hova-Bator® Mod. #1583) cada una con capacidad para incubar 42 huevos. La VR (air thigh) se logró por medio de un sellado completo de las aperturas de exhaucio o salida de aire (dos en la parte superior en este modelo de incubadora) y de un sello parcial de las entradas de aire o Damper (ocho clausuradas de las doce totales que están ubicadas en la parte inferior en el gabinete de este 12 modelo), el sellado se efectúo durante un lapso de 10 días con cinta de poliestireno (P), lo cual permitió un incremento natural en la concentración de CO2 en el interior de la máquina incubadora; el grupo V, se mantuvo bajo condiciones de incubación estándar de acuerdo con lo recomendado por el fabricante de las máquinas de incubación (G.Q.F. Manufacturing Company Inc. Savannah, Georgia, U.S.A.) para efectuar incubaciones en sitios por arriba de los 900 m.s.n.m. (0.5% de CO2 y 21% de O2); después del día 10 de incubación en ambos grupos tanto el VR como el V se continúo el protocolo de incubación bajo las mismas condiciones estándar de incubación. En el segundo estudio, se formaron dos grupos, ventilación restringida baja (VRB) y ventilación restringida alta (VRA) sellando los exhaucios por completo y el Damper de forma parcial pero diferente en ambos gabinetes de incubación con cinta de poliestireno (P), utilizando el mismo modelo de incubadora (SPORTSMAN® Mod. #1502). En cada máquina, se incubaron 252 huevos fértiles de aves reproductoras pesadas, sellando las aperturas de exhaucio o salida de aire (tres ubicadas en la parte inferior y trasera de este modelo) y sellando las entradas de aire (Damper, tres ubicadas en la parte superior y trasera del gabinete, el aire fresco se dirige directamente hacia el ventilador, el cual lo inyecta a la incubadora). Después del día 10 de incubación, los embriones se mantuvieron bajo condiciones de incubación estándar, de acuerdo a las recomendaciones efectuadas por el fabricante de las máquinas de incubación (G.Q.F. Manufacturing Company Inc. Savannah, Georgia, U.S.A.) para situaciones donde se tiene que 13 efectuar la incubación en sitios por arriba de los 900 m.s.n.m. (0.5% de CO2 y 21% de O2). Posterior a las 444 horas de incubación, se realizó un ajuste de HR y cada grupo experimental se dividió en 2 subgrupos (n=126), a un subgrupo se les hizo una perforación (1.3 mm) en el polo obtuso del huevo (Meir y Tazawa, 1999),20 para la perforación se tomó como referencia el método descrito por Correa et al (2006),23 ésta se realizó el día 19 con 8 horas, se ha descrito que esta operación genera un cambio en la presión parcial de O2 dentro de la cámara de aire. Finalmente se obtuvieron 4 subgrupos: VRB con perforación (CP), VRB sin perforación (CSP); VRA con perforación (CP) y VRA sin perforación (CSP). Todos los subgrupos se incubaron bajo el mismo régimen de incubación en dos máquinas incubadorascon características técnicas idénticas (G.Q.F. Manufacturing Company Inc. Savannah, Georgia, U.S.A.), estas se acondicionaron como máquinas nacedoras hasta lograr la eclosión favorable de los embriones. Para el tercer estudio, se utilizó el mismo modelo de máquina incubadora del segundo estudio, en este caso se incubaron 492 huevos de codorniz japonesa en cada incubadora, se siguió la misma metodología que en el segundo estudio. El sellado de las incubadoras se mantuvo hasta el día 8 DE, los pesajes muestra se realizaron los días 8, 10 y 15 DE, la perforación de los huevos se realizó el día 15 con 14 horas y el número de huevos perforados en cada grupo fue de 246 huevos. Condiciones de incubación En el primer y segundo estudio el protocolo de temperatura fue el siguiente; la temperatura del bulbo seco del día 1 al 2 del DE fue de 100.0ºF, del día 3 al 7 fue 14 de 99.9ºF, del día 8 al de 10 fue de 99.7ºF, del día 11 al 13 fue de 99.5ºF, del día 14 al 15 fue de 99.3ºF, del día 16 al 17 fue de 99.0ºF, y del día 18 al 21 fue de 98.4ºF; la temperatura del bulbo húmedo en ambos grupos experimentales del día 1 al 18 del DE se mantuvo en 84.5ºF, los huevos incubados en ambos tratamientos recibieron un movimiento lateral a su eje vertical de 45º cada noventa minutos. De las 444 horas hasta la eclosión no tuvieron movimiento. En el tercer estudio, el protocolo de temperatura fue el siguiente; temperatura del bulbo seco del día 1 al 8 del DE a 100.0ºF, del día 9 al 13 fue de 99.5ºF, del día 14 al 15 fue de 99ºF y del día 16 al 17 fue de 98.5ºF; la temperatura del bulbo húmedo en ambos grupos experimentales del día 1 al 15 del DE se mantuvo en 84-86ºF, los huevos incubados en ambos tratamientos recibieron un movimiento lateral a su eje vertical de 45º cada noventa minutos. De las 360 horas hasta la eclosión no tuvieron movimiento. El manejo del Damper central en el segundo estudio fue el siguiente: del día 1 DE al 4 DE se mantuvo abierto a un cuarto del total, del 4 DE al 5 DE la apertura fue de un tercio de la mitad del Damper, del 5 DE al 9 DE se abrió la mitad de diámetro total del Damper, del 9 DE al 10 DE se cerró solo un tercio del total. Después de la primer mitad de incubación al día 10 DE, se destapo el Damper y el exhaucio centrales, al 11 DE se destapo un exhaucio lateral, el 13 DE se destapo un Damper lateral y el 16 DE se destaparon el Damper y el exhaucio laterales restantes. En el tercer estudio, el Damper central del día 1 DE al 3 DE se mantuvo a una apertura de 0.7mm del total, del 3 DE al 5 DE la apertura fue a la mitad del 15 Damper, del 5 DE al 8 DE se cerró un tercio de la mitad del Damper. Después del día 8 DE se abrió Damper central y dos exhaucio (central y lateral), el día 10 DE se destapo el Damper lateral, el 13 DE se destaparon el Damper y el exhaucio laterales que restaban. Se tomaron 4 lecturas al día de temperatura en grados centígrados (ºC), humedad relativa (%), CO2 (ppm) y O2 (%); tanto del ambiente interno como del externo de las maquinas incubadoras; para la lectura de la temperatura se utilizó un termómetro de columna mercurial (Brannan®), para la obtención de la humedad relativa se utilizó un higrómetro de cabello de tensión variable (Taylor®), en cuanto a la medición de O2 se realizó con una celda galvánica (Analox®), el CO2 se determinó por medio de un sensor infrarrojo (Analox®). Protocolo de incubación En los huevos fértiles, se calculó la pérdida de humedad (%), con base a la diferencia entre el pesaje inicial de los huevos al inicio del experimento y el primer y segundo estudio el pesaje efectuado los días 10 y 18 DE, en el tercer estudio los pesajes fueron los días 8, 10 y 15 DE. Se determinó fertilidad aparente de cada grupo, con base a la metodología de embriodiagnóstico (Juárez et al, 2010).30 Se evaluó el porcentaje de incubabilidad, utilizando la siguiente fórmula: (total de pollitos nacidos ÷ total de huevos fértiles) x 100= Porcentaje de nacidos de huevos fértiles (incubabilidad). 16 El porcentaje de natalidad se cálculo de la siguiente manera: (total de pollitos nacidos ÷ total de huevos incubados) x 100= Porcentaje de nacidos del total de huevos incubados (natalidad). Embriodiagnóstico En el primer y segundo estudio a partir de las 444 horas de incubación, con ayuda del ovoscopio se determinaron huevos no embrionados o aptos, además después de las 510 horas se registró la mortalidad embrionaria para cada grupo; y de acuerdo a la etapa del desarrollo embrionario se determinó su clasificación : Etapa I (día 1 al 7 del DE) Etapa II (día 8 al 17 del DE), etapa III (día 18 al 21 del DE) y etapa IV (Picados no nacidos), se determinó a su vez la proporción parcial de especímenes en mala posición, con deformidad congénita y contaminados (López et al, 2009; Juárez et al, 2010).26,30 En el tercer estudio, al término de la incubación se colectaron los embriones que no eclosionaron para determinar la mortalidad embrionaria de cada grupo, utilizando la misma clasificación. Ventana de nacimientos En el primer y segundo estudio después de efectuar la transferencia y a partir de las 468 horas, se realizaron revisiones cada dos horas para evaluar la ventana de nacimientos, registrando desde el primer hasta el último pollito eclosionado de cada grupo; posteriormente se extrajeron los pollitos eclosionados para evitar su deshidratación y poder evaluar su calidad. En el tercer estudio la ventana se comenzó a evaluar a partir de las 378 horas de incubación. 17 Calificación de la calidad de los pollitos y guarnigones recién nacidos En los tres estudios, se evaluó la calidad de los pollitos y guarnigones eclosionados con base a diez parámetros físicos integrales (Boerjan, 2005, Wolansky et al. 2006, López et al, 2009).24,25,26 Cada parámetro se calificó de acuerdo a la importancia de la característica evaluada, obteniendo como máximo una puntuación de 100 por ave evaluada. De cada subgrupo experimental, se obtuvo un promedio de todos los pollitos y guarnigones evaluados, la puntuación final permitió la siguiente categorización: 90-100 puntos = Excelente; 80 a 89 = Primera; 70 a 79= Segunda; 60 a 69= Deficiente y < 59 = Inaceptable, esta escala fue modificada a partir de la escala propuesta por López et al (2009).26 Medición de los pollitos y guarnigones recién nacidos Al día uno de edad, se medió la longitud total (mm) de pollitos y guarnigones, se pesaron (g) por separado (Willemsen et al, 2008; Wolanski et al, 2006; Tona et al, 2004; Mauldin et al, 2008; Petek et al, 2008).9,25,27,28,29 Peso de los embriones y estructuras anexas En el segundo estudio, se seleccionaron al azar 8 pollitos recién nacidos de cada una de los subgrupos (VRB-CP, VRB-CSP, VRA-CP, VRA-CSP), se les aplicó un procedimiento de eutanasia (IACUC, 2009)32; posteriormente se diseccionaron para obtener el saco vitelino sin ninguna estructura extra embrionaria, se determinó el peso con base a peso húmedo de la canal y el saco vitelino por separado. El corazón y el hígado, se extrajeron por separado para obtener el peso 18 absoluto con base húmeda. Después, la canal y el saco vitelino de cada embrión se desecaron en una cámara a 60°C durante 72 horas, al término de este periodo se determinó su peso individual con base seca. En el caso de la canal se excluyeron los órganos internos y las estructuras extraembrionarias. Análisis estadístico Las variables explicativas primarias fueron la condición de V y VR (primer estudio); VRB y VRA (segundo estudio) durante los primeros 10 días de incubación y 8 primeros días (tercer estudio), las variables explicativas secundarias fueron ventana de ventilación por medio de la perforación del cascarón (CP) y sin perforación (CSP); mientras que las variables de respuesta fueron los parámetros de incubación,la calidad del pollito, su peso y longitud. Estas variables se sujetaron a una prueba de normalidad, las variables con comportamiento paramétrico se analizaron a través de la descomposición cuadrática de la varianza, se utilizó un modelo de dos factores (2 x 2), donde el primer factor fue el tipo de ventilación los primeros diez días de DE (VR o V; y VRB y VRA), y el segundo factor fue si se efectuaba la perforación o no del cascarón (CP y CSP) al día 19 DE (segundo estudio) y a los 15 DE (tercer estudio), cuando se detecto interacción de los factores se consideró el grado de magnitud estadística, con diferencia significativa entre alguno de los grupos experimentales de uno solo de los factores, la diferencia entre medias de grupo se determinó por medio de la técnica de comparación múltiple de medias de Tukey con una significancia de P<0.05 con relación a la unidad. Los datos relativos (porcentuales) y 19 proporcionales en cada grupo de incubación, previo a su análisis estadístico, se transformaron a través de obtener el arcoseno de la raíz cuadrada de la proporción. Para determinar las probables diferencias entre los datos, se sometieron a un análisis de varianza de un solo factor (GLM); las diferencias significativas entre tratamientos se discriminaron por medio de la prueba múltiple de comparación de medias de Tukey (P<0.05) (Gill, 1978).31 Los datos porcentuales de la mortalidad por etapas registrada durante el embriodiagnóstico, se evaluó por medio de la prueba Xi2, lo cual se realizó con una significancia de P<0.05 (Gill, 1978).31 20 RESULTADOS PRIMER ESTUDIO (Estirpe Ross 308, 30 semanas de edad) El grupo de VR mostró una incubabilidad de 48% mayor en 7 puntos porcentuales al grupo V; el grupo de ventilación restringida mostró una mayor (P<0.05) natalidad que el grupo V (Cuadro 1). En la etapa I de mortalidad embrionaria el grupo V mostró 16.2% de mortalidad mayor (P<0.05) al 11.2% del grupo VR, en la etapa II el grupo V mostró una mortalidad de 12.1% mayor (P<0.05) al 9.2% del grupo testigo. Para las etapas III y IV, no hubo diferencia estadística entre grupos (Cuadro 1). El peso inicial promedio de los huevos fue de 60 g para cada grupo, el porcentaje de pérdida de peso al día 10 DE en el grupo V fue mayor 6.5% (P<0.05) al 4.1% del grupo VR, sin embargo, la pérdida de humedad al día 18 DE del grupo V y VR ya no difirió (Cuadro 2). El picaje externo del cascarón en ambos grupos inició a las 505 horas; el término de nacimientos se registró entre las 535 y 539 horas, mostrando una duración de la ventana de nacimiento de 34 horas para el grupo V y de 30 horas para el VR (Cuadro 3). La calidad de los pollitos evaluados al nacimiento no mostró diferencia estadística entre grupos en todas sus categorías; en cuanto al peso de los pollitos, los del grupo VR con 43.2 g fueron más pesados (P<0.05) a los del grupo V (41.7 g). Los pollitos del grupo VR con 16.9 cm fueron más largos (P<0.05) a los pollitos del grupo V con 16.6 cm de longitud (Cuadro 4). 21 La concentración de O2 en el día 10 de incubación, fue de 19.5% para ambos grupos, el comportamiento de este gas en ambos grupos aunque mayor se comportó similar durante el resto del periodo de incubación (Cuadro 5). La concentración de CO2 en el día 10 de incubación en el grupo VR fue de 11,600 ppm mayor (P<0.05), a los 2,072 ppm del grupo V. Después del día 10 y hasta el día 15 DE la concentración de CO2, no difirió entre grupos, sin embargo, en los días 16 y del 18 al 21 DE la concentración de CO2 en el grupo VR de 4,157 ppm fue mayor (P<0.05) a las 3,449 ppm del grupo V (Cuadro 5). La cantidad de gases ambientales en la sala de incubación, durante todo el periodo de evaluación fue de 19.8% de O2 y 952 ppm de CO2, con una temperatura ambiental promedio de 22.93º C y 58.5% de HR (Cuadro 6). SEGUNDO ESTUDIO (Estirpe Ross 308, 45 semanas de edad) No hubo interacción de los factores para incubabilidad, solo se registró un efecto de la ventilación restringida con bajo CO2 con un promedio de 82.3%, el cual fue mayor (P<0.05) al 77.2% de la ventilación restringida con alta concentración de CO2 (Cuadro 7). En natalidad tampoco hubo interacción entre los factores, se observó solo efecto de la variable ventilación restringida con bajo CO2, donde el 74.4% obtenido fue mayor (P<0.05) al 70.2% registrado en la ventilación restringida con alta concentración de CO2 (Cuadro 7). En la etapa de mortalidad embrionaria I, los grupos CP con 4.2% fueron mayores (P<0.05) al 0% del grupo CSP, para las demás etapas, II, III y IV, no existió diferencia estadística entre grupos (Cuadro 8). 22 El peso promedio de los huevos al inicio de la incubación en los grupos VRB y VRA fue de 65g, el pesaje de día 10 DE no mostró diferencia en la pérdida de peso entre grupos; sin embargo, en el pesaje del día 18 DE la pérdida de peso del grupo VRA fue de 12.1% mayor (P<0.05) al 11.4% del grupo VRB (Cuadro 9). El inicio del picaje externo en el grupo VRB fue a las 495 horas, periodo menor (P<0.05) a las 501 horas del inicio de picaje del grupo VRA; ambos grupos finalizaron la eclosión a las 521 horas. La ventana de nacimiento del grupo VRB fue de 25.5 horas mayor (P<0.05) a las 21.5 horas registradas en el grupo VRA (Cuadro 10). La calidad de los pollitos al nacimiento en el grupo VRA, fue excelente con 59.7% de las aves en esta categoría, mayor (P<0.05) al 48.9% observada en el grupo VRB; en la categoría de pollitos con buena calidad el grupo VRB obtuvo 49.4% mayor (P<0.05) al 39.2% del grupo VRA. En las categorías inferiores no hubo diferencia estadística entre grupos (Cuadro 11). El peso y longitud de los pollitos no mostró diferencia estadística entre grupos (Cuadro 11). El promedio de las concentración de O2 del día 1 al 9 en el grupo VRB fue de 20.3% mayor (P<0.05) al 20.2 % del grupo VRA. En el día 10 de incubación el O2 del grupo VRB fue 19.9% mayor (P<0.05) al 19.7 % del grupo VRA; después del día 10 el comportamiento de este gas para ambos grupos fue el mismo, sin mostrar diferencia estadística, a excepción de los días 20 y 21 DE donde el grupo 23 VRB obtuvo 20.0% mayor (P<0.05) al 19.9% del grupo VRA (Cuadro 12). La concentración de CO2 en ambos grupos tuvo la tendencia a aumentar día con día, del día 1 al 9 el promedio de las concentración de CO2 en el grupo VRA fue de 5,807 ppm mayor (P<0.05) a las 5,332 ppm del grupo VRB. Para el día 10 de incubación el grupo VRA obtuvo 17,250 ppm fue mayor (P<0.05), a las 14,975 ppm del grupo VRB. Del día 11 al 14 DE y del 16 al 20 DE la concentración del gas no difirió entre grupos, sin embargo el día 15 el grupo VRA con 5,342 ppm fue mayor (P<0.05) a las 5,027 ppm del grupo VRB; el día 21 DE el grupo VRA con 5,550 ppm fue mayor (P<0.05) a las 5,300 ppm del grupo VRB (Cuadro 12). El promedio de gases ambientales en la sala de incubación fue de 20.82% de O2 y 1,276 ppm de CO2, con temperatura ambiental promedio de 21.8º C y 48% de HR (Cuadro 13). El peso promedio de la canal de los pollitos eclosionados en base húmeda del grupo CSP fue 39.18 g mayor (P<0.05) a los 37.15 g del grupo CP. El peso promedio de la canal en base seca del grupo CSP fue de 8.71 g mayor (P<0.05) a los 7.63 g del grupo CP. El SV residual en base húmeda, base seca, corazón e hígado, no mostró diferencia estadística significativa entre grupos (Cuadro 14). TERCER ESTUDIO (Codornices, 16 semanas de edad) Para incubabilidad no hubo interacción de los factores, solo se registró un efecto de la variable cascarón sin perforación, con un 72% de incubabilidad mayor (P<0.05) a 67% del grupo de cascarones con perforación (Cuadro 15). En 24 natalidad no hubo interacción entre los factores, solo se observó efecto de la variable sin perforación con 66% mayor (P<0.05) al 59% del grupo cascarón conperforación (Cuadro 15). En la etapa de mortalidad embrionaria I, II y IV no existió diferencia estadística entre grupos. En la etapa III de mortalidad el grupo CSP obtuvo 11.4% mayor (P<0.05) al 7.7% del grupo CP (Cuadro 16). El peso promedio de los huevos al inicio de la incubación en los grupos VRB y VRA fue de 12.6 g, el pesaje a los días 8, 10 y 15 DE no mostró diferencia estadística significativa entre grupos (Cuadro 17). El inicio del picaje externo en el grupo VRB fue a las 384 horas, menor (P<0.05) a las 394 horas del inicio del picaje del grupo VRA; el grupo VRB finalizo la eclosión a las 423 horas, menor (P<0.05) a las 425 horas del grupo VRA. La ventana de nacimiento del grupo VRB fue de 39.2 horas mayor (P<0.05) a las 31.2 horas registradas en el grupo VRA (Cuadro 18). La calidad de los guarnigones al nacimiento, no mostró diferencia estadística entre grupos en todas sus categorías; en cuanto al peso los guarnigones del grupo VRB con 8.64 g, fueron más pesados (P<0.05), que los del grupo VRA (8.48 g). Los guarnigones del grupo VRB midieron 9.82 cm, fueron más largos (P<0.05) que los guarnigones del grupo VRA (9.58 cm) (Cuadro 19). El promedio de las concentración de O2 en el día 8 de incubación del grupo VRB fue de 20.1% mayor (P<0.05) al 19.95% del grupo VRA, después del día 8 la 25 concentración de O2 no mostró diferencia estadística entre grupos (Cuadro 20). La concentración de CO2 en ambos grupos tuvo la tendencia a aumentar, del día 1 al 7 el promedio de las concentración de CO2 en el grupo VRA fue de 4,103 ppm mayor (P<0.05) a las 3,881 ppm del grupo VRB. Alcanzando el día 8 de incubación en el grupo VRA una concentración puntual de 10,260 ppm, mayor (P<0.05) a las 9,570 ppm registradas en el grupo VRB. Después del día 8 DE y hasta el término de la incubación el grupo VRA fue mayor (P<0.05) en la cantidad de CO2 producida que los guarnigones del grupo VRB (Cuadro 20). La cantidad promedio de gases ambientales en la sala de incubación fue de 21.0% de O2 y 1,184 ppm de CO2, se registró una temperatura ambiental promedio de 22.95º C y 53.5% de HR (Cuadro 21). 26 DISCUSIÓN La restricción de ventilación durante los primeros 10 días de incubación del grupo VR en el primer estudio, generó una concentración de 1.16% de CO2, el incremento superó los niveles de tolerancia recomendados a nivel comercial (0.3- 0.5%); sin embargo, se ha mostrado que un incremento gradual de CO2 de 0.8 a 1.5% durante los primeros 10 días de incubación acelera el DE y mejora la incubabilidad (De Smit et al, 2006, 2008; Tona et al, 2007; Bruggeman et al, 2007).3,8,10,33 Hogg et al (1997)34 al incubar huevos fértiles de aves reproductoras pesadas (Ross 308), al día 10 DE observaron una concentración de 1.5% de CO2 mejorando en 2% la incubabilidad en comparación con el grupo de incubación estándar. En el presente estudio, el grupo VR superó en 8% la incubabilidad del grupo V, es evidente que existe una mejora de los parámetros de incubación ligado principalmente al efecto del incremento de CO2 durante la primera etapa del DE. Es posible que la mortalidad en la etapa I (16.2%) del grupo ventilado se haya debido a una falta de fortaleza del embrión o bien a factores inapropiados para el DE favorecidos posiblemente por la variabilidad del ambiente interno de la incubadora, que tuvo un sistema de ventilación análogo a las incubadoras de sistemas multietápicos. Mediante el sistema de ventilación restringida durante los primeros 10 días análogo a un sistema unietápico se logra una mejor estabilidad de la temperatura, de la HR y de la ventilación directamente a nivel de cascarón de los huevos fértiles incubados (Lourens et al, 2005),36 logrando un desarrollo embrionario óptimo ya que precisamente estos días corresponden a la fase 27 endotérmica del embrión, la etapa crítica del DE donde se requiere un suministro constante y estable de calor a nivel del cascarón. De acuerdo a Lourens et al (2005)36 y Joseph et al (2006)37 la incubabilidad y el rendimiento posterior del ave se ven afectados negativamente al no existir estabilidad térmica a nivel del cascarón. Si se mantiene un sistema de VR, durante el primer periodo de la incubación la pérdida de humedad de los huevos fértiles en el interior de la incubadora genera una circulación de aire húmedo dentro de esta, creando un ambiente más apropiado y estable para los embriones, lo cual a una gran altitud como la del sitio de incubación es crucial ya que modifica positivamente la trayectoria de incubación durante la fase más crítica del DE que es la fase endotérmica del embrión, ya que se ha mostrado que la humedad relativa dentro de la incubadora, es el principal factor para la transferencia de calor del aire hacia el cascarón (convección térmica), lo cual se vuelve más crítico entre mayor sea la altura del sitio de incubación. El peso y longitud de los pollitos fue mayor en el grupo VR, al igual que los pollitos de buena y excelente calidad; aunque, De Smit et al, (2006)8 no determinó la calidad del pollito a la eclosión, al evaluar un sistema de NV los primeros 10 días DE obtuvieron un crecimiento corporal post-eclosión mucho más alto en los pollos sometidos a este protocolo de incubación durante la primer y tercera semana de edad. Es evidente que en el presente estudio el mejor peso y longitud de los pollitos del grupo VR potencialmente muestra un efecto importante sobre el rendimiento post-eclosión de las aves; Molenaar et al (2007)38 determinaron que la longitud del pollito al nacimiento tiene un valor predictivo alto para el peso al sacrificio y el rendimiento porcentual de pechuga en machos, por lo 28 tanto el sistema NV potencialmente beneficia la vida productiva del pollo de engorda. Los huevos fértiles del primer estudio provenían de reproductoras pesadas (Ross 308) de 30 semanas de edad, por lo cual es importante tomar en cuenta el genotipo y edad de las aves reproductoras ya que de ello depende el peso de los embriones (Janke et al, 2004).39 Druyan (2010)40 al comparar patrones de DE entre aves ligeras y pesadas, determinó que a pesar de la selección genética para rápido crecimiento en las aves pesadas, no existe diferencia significativa en los patrones de crecimiento embrionario, sin embargo, si observó diferencia en su tasa metabólica. De Smit et al (2006),8 Tona et al (2007),3 Willemsen et al (2008),35 Everaert (2008),41 indican que es probable que los efectos de un sistema NV sobre la incubabilidad dependen de las diferencias en el genotipo y edad de las aves reproductoras, la concentración de CO2 alcanzada durante esta etapa de la incubación es un factor importante que explica la mejora en los parámetros observados, sin embargo, aunque ya se ha probado este efecto benéfico durante la primer etapa del DE bajo determinadas circunstancias de genotipo y edad de la parvada, aún se requiere más investigación sobre los niveles óptimos de CO2 a diferentes edades de las aves reproductoras, ya que por ejemplo en el segundo estudio se traza una línea de corte máximo de CO2 durante la incubación de una parvada de 45 semanas de edad, donde el porcentaje probado de VRB fue de 1.5% mucho mejor que el del grupo VRA que fue de 1.7%; el 1.5% obtenido en el presente estudio fue análogo al obtenido por De Smit et al, (2006),8 en aves Cobb de 45 semanas de edad donde obtuvieron los mejores parámetros de incubación en comparación a un 29 grupo de 60 semanas (Cobb) pero con 1% de CO2 natural. Posiblemente la incubación (1-10 DE) con 1.5% de CO2 es mejor para los embriones vivos independientemente de la edad de las aves reproductoras, es factible que la diferencia obtenida por De Smit et al (2006)8 entre huevos de hembras de 45 versus 60 semanas de edad se deba a un factor metodológico, ya queen su incubación al ser air tight no se puede abrir la incubadora durante los primeros 10 días DE y sacar los huevos claros (infértiles o con mortalidad embrionaria temprana), los cuales es evidente existen en mayor cantidad en una parvada de 60 semanas que en una de 45, por lo cual es factible que al haber menos embriones vivos en una parvada de 60 semanas, estos produzcan menos CO2 natural en conjunto que en forma individual, lo cual aún no se sabe, por que DeSmit et al (2006)8 tampoco reporta ningún estudio de embriodiagnóstico en su trabajo, por lo cual la investigación de esta interrogante constituye una nueva propuesta del presente estudio. López (2011)43 delimitó una línea de corte para el nivel óptimo de CO2 durante la primer etapa de DE en aves reproductoras ligeras Bovans White, donde una concentración de CO2 al día 10 DE de 12,000 ppm permitió obtener mejores parámetros que en un grupo donde se incubó con hasta 14,000 ppm de CO2. Las concentraciones de CO2 obtenidas durante los días de restricción en la ventilación, permiten hacer un análisis comparativo con lo descrito por Fasenko et al (2003),42 donde el comportamiento en el incremento de CO2 durante el proceso de incubación en el presente estudio es similar a la tendencia de producción de Fasenko et al (2003),42 sin embargo, es mucho mayor la cantidad obtenida del día 30 6 DE al 10 DE, en contraposición a lo que recomiendan empíricamente algunas empresas fabricantes de máquinas de incubación donde aconsejan abrir el Damper al día 6-7 de DE, lo cual está en completa contraposición a los hallazgos del presente estudio y a los descritos De Smit et al (2006, 2008)8,33 y Tona et al (2007)3 quienes observaron que la producción de CO2 durante los primeros 6 días DE no es significativa, después de este día y hasta el día 10 DE, el incremento es lineal, posteriormente de acuerdo con Fasenko et al (2003)42 el incremento es de forma aguda hasta la etapa conocida como meseta (Plateau), dicha etapa coincide con la transición de respiración difusa (MCA) a convectiva (pulmonar). La máxima concentración de CO2 dentro de una incubadora uniétapica, depende principalmente de la cantidad de huevos fértiles incubados y de la tasa de ventilación, por ejemplo, en el presente estudio se obtuvo más de 1% de CO2, mayor al obtenido por López (2011)43 quienes obtuvieron 0.87% de CO2 al incubar huevos fértiles de reproductoras Ross 308 con una biomasa de 10,416 g, menor a los 16, 380 g de biomasa del segundo estudio del presente trabajo, lo cual indica que el Damper se puede ajustar para obtener la concentración de CO2 deseada con base siempre a la realización de pruebas previas, para lo cual es necesario contar imprescindiblemente con la tecnología de monitoreo continuo de CO2 como la utilizada en el presente estudio. La tolerancia del embrión a la concentración de CO2 a partir del día 4 DE, se debe a la velocidad con la que este logra establecer y utilizar su sistema de respiración temprana (Vasculosa y MCA); utilizando un protocolo de NV, De Smit et al, (2006)8 determinaron que existe una etapa de Plateau, la cual es crítica para la producción 31 de CO2 natural, alrededor de las 100 horas de DE, la acción de difusión por parte de la vasculosa para captar el O2 y remover el CO2 se ve limitada en este momento, a las 144 horas cuando hay contacto directo de la MCA con la membrana albuminífera, en ese instante esta estructura asume la función respiratoria del embrión lo cual adicionalmente coincide con el aumento de CO2 observado en los grupos VRB y VRA durante los días de restricción en la ventilación. Hassanzadeh et al, (2004),44 Chan y Burggren (2005,)45 Bahadoran et al, (2010)13 determinaron que la hipoxia moderada (>17% O2) e hipercapnia moderada durante la etapa temprana del desarrollo embrionario induce un efecto fisiológico sobre el crecimiento de los órganos del embrión, en el presente trabajo se generaron cantidades optimas de O2, considerando además la altitud sobre el nivel del mar del sitio de incubación, el rango fue de 19.2% a 20.5%, siendo benéfico para el peso de los pollitos logrado durante el primer estudio y el peso de los guarnigones durante el tercer estudio. Durante el DE temprano el O2, se utiliza en mayor cantidad para la síntesis de los tejidos y se produce menor cantidad de CO2 (Fasenko et al, 2003; De Smit et al, 2006, 2008; Bahadoran et al, 2010)8,13,33,42 Sahan et al (2006)46 suplementaron O2 durante la etapa final de DE (18-21 DE) en una concentración de 23%, mejorando la capacidad de eclosión de los pollitos y el peso al nacimiento de los mismos, además de aumentar la tasa de crecimiento y eficiencia alimenticia de los pollos de engorda, todo esto debido a que la disponibilidad de O2 es mayor al momento del cambio de respiración corioalantoidea a pulmonar. A diferencia de los trabajos efectuados en el presente 32 estudio a una altitud de 2,230 m.s.n.m., las realizadas en países ubicados a menor altitud sobre el nivel del mar, muestran mejores parámetros de incubabilidad, por lo cual de acuerdo a Ar et al, (1993)47 los nacimientos se afectan principalmente debido a la conductancia intrínseca del cascarón del huevo fértil, sin embargo, el factor más importante que incide después de considerar esta característica es el diferencial en la presión parcial de O2 ambiental existente a bajas y grandes altitudes sobre el nivel del mar, ya que a grandes altitudes esta presión es mucho menor que la existente a nivel del mar, lo cual afecta la capacidad de intercambio gaseoso a través del cascarón. A pesar de que en la práctica de la crianza del pollo de engorda se tiene una idea contraria, se ha observado que las aves nacidas a mayor altitud tienen menor incidencia de mortalidad por ascitis e hipertrofia ventricular derecha, se ha observado por parte de algunos investigadores que la capacidad de adaptación en la etapa temprana del DE es benéfica para el desarrollo en la etapa productiva de las aves (Hassanzadeh, 2009)48 por lo tanto independientemente a los perfiles de concentración de O2 y CO2 durante la primer mitad del proceso de incubación, es evidente que la diferencia en edad, genotipo, especie, altitud del sitio de incubación, concentración de O2, CO2 y el periodo de almacenaje del huevo previo a la incubación muestran efectos específicos sobre el metabolismo embrionario y la incubabilidad. En el segundo estudio se incubaron huevos fértiles de aves reproductoras pesadas (Ross 308) de 45 semanas de edad, se obtuvo mejor porcentaje de incubabilidad y natalidad para el grupo VRB, el cual al día 10 DE mostró un nivel de 15,000 ppm de CO2 de comparado con las 17,000 ppm del grupo VRA; De Smit 33 et al, (2006)8 al incubar huevos fértiles de aves reproductoras pesadas (Cobb 500) de 45 semanas de edad obtuvo 1.5% de CO2, con resultados positivos sobre los parámetros de incubabilidad, además de una aceleración en la tasa de DE, mayor peso absoluto y relativo de los embriones del grupo NV. En otro estudio, con huevos fértiles de reproductoras pesadas (Ross 308) de 37 semanas de edad y efectuado a la misma altitud que el presente estudio (2,230 msnm), López (2011)43 reportó una concentración de 0.87% de CO2, y un porcentaje de incubabilidad de 67%, menor al resultado de este segundo estudio, López (2011)43 incubó además huevos fértiles de aves reproductoras ligeras (Bovans White) obteniendo una concentración de 1.2% de CO2 con 57% de incubabilidad, sin embargo, al aumentar únicamente 0.2% de CO2 en estos 10 días de incubación, la incubabilidad bajó a 39%; por lo tanto en huevos fértiles de reproductoras pesadas los parámetros pueden mejorar si se incrementa de forma gradual la concentración de CO2 durante los primeros 10 días de DE a 1.5%, pero si se aumenta 0.2% de CO2 (1.7%) los resultados no son significativamentemejores, adicionalmente, los embriones de aves reproductoras pesadas de 45 semanas de edad son menos susceptibles a un incremento de hasta 1.5% de CO2 comparado con el 1.4% observado en las aves ligeras. DeSmit et al (2006)8 y Willemsen et al (2008)35 indicaron que los embriones provenientes de reproductoras pesadas son menos susceptibles a la hipercapnia ocasionada en un sistema de ventilación limitada, muestran un aceleramiento en su DE y adicionalmente las aves sobrevivientes presentan mayor fortaleza fisiológica. 34 En el segundo estudio el grupo CSP obtuvo un mayor porcentaje en la etapa III de mortalidad embrionaria, comparado con el grupo CP; Meir y Ar (1996)49 y Moolenar et al (2010)50 al efectuar este tipo de procedimiento no obtuvieron diferencia estadística en mortalidad al comparar los grupos de cascarón perforado y los no perforados; Moolenar et al (2010)50 mencionan que la difusión de O2 se limitó a un nivel no favorable durante el cambio de respiración (18.5 días de DE) por ser solo una perforación; mientras que en el presente estudio en el embriodiagnóstico efectuado en el grupo CSP se observaron embriones en mala posición, con edema en el cuello o bien generalizado (anasarca) por no haber perdido suficiente agua metabólica, lo cual indica que el balance hídrico previo a esta operación, aunque es un factor importante a considerar para que sea favorable, como se observa aquí a pesar de no existir diferencias de pérdida de peso al día 10 DE ó 18 DE los pesos de los embriones en base humedad y seca en el grupo con perforación fueron menores que los del grupo sin perforación, lo cual cuando no se acompaña con un diferencial negativo en el peso y por lo tanto en el aprovechamiento del contenido del saco vitelino, indica que el efecto principal de la apertura es sobre la habilidad del embrión para seguir creciendo y limita su aprovechamiento del saco vitelino, López (2011) 43 determinó que con un sistema de NV el embrión es de mayor peso que uno V, y en contraposición el saco vitelino pesa menos en el grupo NV que en el V. Por lo cual se requiere efectuar un estudio específico que determine exactamente cuál es el factor que ocasiona principalmente este menor peso en los embriones de un grupo VR con perforación. 35 Meir y Ar (1996)49 perforaron de 1 a 5 agujeros de 5 mm de diámetro en la cámara de aire de huevos fértiles de ganso en diferentes días del DE (11, 15, 18, 22, 25) con la finalidad de aumentar la conductancia del cascarón en huevos fértiles con baja y media conductividad, de esta manera esperaban mejorar la pérdida de humedad y favorecer el intercambio gaseoso durante el DE; la perforación en los días 15 a 22 DE mostró mayor porcentaje de nacimientos cuando los embriones perdieron 14% de humedad, observaron que a mayor número de agujeros el porcentaje de pérdida de humedad era mayor, por lo que determinan que el diámetro del agujero y el tiempo en que deben perforase los huevos debe ser calculado en función del incremento requerido de pérdida de peso en forma de vapor de agua. En otro estudio Meir y Tazawa (1999)20 perforaron el cascarón de huevos fértiles de ganso al día 25 DE con diferentes diámetros (de 0.9 mm a 3.3 mm), obtuvieron mejor porcentaje de incubabilidad con 14% de pérdida de humedad. Meir y Tazawa (1999)20 indican que la perforación en la cámara de aire posiblemente aumenta la presión parcial de O2 en el interior de la misma y de la MCA si se mantiene una distribución uniforme dentro del cascarón; existe mejora en el intercambio y la disponibilidad de oxígeno al embrión, aunque consideraron que el factor más importante para obtener buenos resultados fue la pérdida de humedad y que realmente la disponibilidad de O2 tuvo un efecto limitado, es factible que este efecto limitado se debe a la poca área de acción de este incremento parcial de O2 ya que se ha indicado que la difusión lateral a nivel del biofilm del cascarón a nivel de la membrana testácea interna es muy limitado ya que de acuerdo a la ley de Fick existe una alta resistencia a la difusión a nivel de 36 este punto de la membrana (Visschedijk et al, 1988).21 En el presente estudio la perforación en la cámara de aire fue de 1.3 mm de diámetro, se realizó al día 19.8 DE (segundo estudio) y en el tercer estudio al día 15 DE con 14 horas, esto con base a lo recomendado por Correa et al (2006)23 para la vacunación comercial in ovo. Los dos factores más importantes que determinan el éxito de una incubación son: el periodo de incubación total y la pérdida de humedad a través del cascarón, en éste último es importante la conductancia del cascarón con la finalidad de lograr una difusión apropiada de O2, CO2 y H2O a lo largo de todo el proceso incubatorio, al principio limitante al final facilitante (Meir y Ar, 2008).51 En los últimos días del DE la cámara de aire solo cubre un cuarto de la superficie de la MCA, de acuerdo a lo ya indicado la difusión lateral en las membranas del cascarón es limitada (Visschedijk et al, 1988; Ar y Girard, 1989)21,22 y no permite que en la cámara de aire exista una saturación plena de O2. Meir y Tazawa (1999)20 mencionan que el control apropiado en la pérdida de humedad, puede ayudar a evaluar el grado de mejora en el intercambio de gases causado por la perforación. No se logró determinar una diferencia estadística en parámetros de incubación, excepto en mortalidad, el grupo CP obtuvo menor porcentaje de mortalidad en general que el grupo CSP; sin embargo, es probable que el tamaño del agujero de perforación no haya sido suficiente para permitir el intercambio y disponibilidad de O2 que requiere el embrión en la etapa final del DE y por lo tanto dar pauta para la presencia de un efecto positivo sobre la modificación en la última parte del proceso incubatorio. Otra razón importante a considerar es que la 37 concentración de CO2 en la cámara de aire baja agudamente en esta etapa debida al agujero y de acuerdo a De Smit et al (2008)33, esta alta concentración de CO2 es vital para el incremento previo de corticosterona que actúa como disparador del incremento metabólico de la tiroides que responde con la liberación de una alta cantidad de T3 y T4 previo al momento del picaje interno del embrión y hasta la eclosión. La pérdida de agua demasiado alta o baja aumentan la mortalidad embrionaria (Meir y Ar, 2008),51 un porcentaje de pérdida de humedad de 12 a 14%, asegura la concentración iónica y osmótica óptima dentro del cascarón, además de mantener un volumen adecuado de moléculas de aire que favorecen el picaje interno y que ayudan a que el embrión inicie la respiración pulmonar, favoreciendo el porcentaje de incubabilidad con mayor cantidad de pollitos de mejor calidad (Ar et al, 1991).52 Con el fin de lograr este apropiado porcentaje, se requiere aumentar gradualmente la humedad de la incubadora de acuerdo a la edad de las reproductoras, ya que a mayor tamaño de huevo, los poros del cascarón son de mayor diámetro y por lo tanto la conductancia del cascarón aumenta con la edad (Ar y Tullet, 1991).53 En el segundo estudio en los grupos VRB y VRA, los porcentajes de pérdida de peso al día 18 DE fueron 11.5% y 12 % respectivamente, a pesar de que el grupo VRA mostró un mayor porcentaje, la concentración de 17,000 ppm de CO2 mostró mayor efecto sobre el grupo que la pérdida de humedad observada afectando los parámetros de incubación generales. La duración de la ventana de nacimiento debe ser lo más estrecha posible, ya que los pollitos que nacen al principio (470 horas) o al final (510 horas), tienen un 38 menor potencial de crecimiento durante la primera semana comparados con los que nacen durante el periodo pico de las 490 horas de DE (De Smit et al, 2008;Padron et al, 2005);33,54 en el segundo estudio la ventana de nacimiento del grupo VRB inicióa las 495 horas, que coincide con este último periodo mencionado. De acuerdo a la clasificación por etapas del tiempo de nacimiento que Padron et al (2005)54 indica muy temprano (hasta 480 horas), temprano (entre 480-488 horas), intermedio (488-496 horas) y tardío (496-508 horas), el grupo VRA podría clasificarse como tardío ya que el inicio de los nacimientos se reportó a las 501 horas de DE. Bruggeman et al (2007)10 observaron una mejor calidad de los pollitos eclosionados provenientes de un sistema de ventilación restringida, con un consiguiente aumento de tamaño del embrión, el peso de los órganos internos y el saco vitelino, en el segundo estudio el grupo de VRB tuvo 49% de pollitos de excelente calidad y 49.5% de pollitos de buena calidad. En el segundo estudio, se sacrificaron y pesaron pollitos de un día de edad para obtener el peso de la canal y SV en base húmeda y en base seca, además del peso del hígado y corazón, lo relevante de este pesaje fue que en el grupo de CSP los embriones (base húmeda y base seca) fueron más pesados que los del grupo CP, las causas de esto aún son indeterminadas y se requiere efectuar más investigación para saber la causa. Coleman y Coleman (1991)16 mencionan que en embriones provenientes de aves reproductoras pesadas se puede afectar negativamente el corazón y la maduración de los pulmones y por consiguiente el peso y la calidad de los pollitos. En este caso la perforación también pudo haber generado un estrés fisiológico el 39 cual a su vez podría generar aumento de los niveles plasmáticos de cortisol y la proporción T3/T4 indicada ya previamente por De Smit et al (2006, 2008)8,33 para este tipo de grupo de VRB análogo al del segundo estudio del presente trabajo. Al aumentar la tasa metabólica del embrión (1-10 DE), se activa el sistema de retroalimentación positiva del hipotálamo (15 DE), las glándulas hipófisis y tiroides tienen mayor respuesta, ocasionando mayor actividad de la corteza adrenal para producir un alto nivel de corticosterona en sangre (De Smit et al, 2006, 2008),8,33 esta acción estimula la glucolisis y la captación de glucosa por parte de las células al término de la función de la MCA y principios de la respiración pulmonar; (Moran 2007).55 Bahadoran et al (2010)13 y Tona et al (2007)3 atribuyen este aumento hormonal como respuesta al estrés que genera el aumento de la presión de CO2 y a la caída de la presión de O2 en el interior de la cámara de aire previo al picaje interno (16-17 DE). Por lo tanto de acuerdo a los resultados del presente estudio y a lo que mencionan Meir y Ar (1996)49 y Moolenar et al (2010)50 el diámetro del agujero de perforación pudo ser un factor importante para determinar la diferencia observada en esta variable, por lo cual éste debió haber sido de mayor diámetro, o bien haber sido más de una sola perforación para que la presión parcial de O2 dentro de la cámara de aire se incrementará ya que de acuerdo a la ley de Fick esta difusión en los huevos del grupo CP es muy limitada. En el tercer estudio durante los 8 días de restricción de ventilación, se obtuvo diferencia en la concentración de CO2 entre los grupos VRB (9,500ppm) y VRA (10,250 ppm) de solo 750 ppm, sin ser significativa para los parámetros de incubación; aunque las concentraciones alcanzadas no superan los límites 40 establecidos por De Smit et al (2006, 2008),8,33 Tona et al (2007),3 Bruggeman et al (2007)10 y Willemsen et al (2008)35 para gallinas Cobb. La susceptibilidad de los huevos fértiles de codornices a altas concentraciones de CO2 es mayor comparada con los huevos fértiles de gallinas reproductoras pesadas; a una concentración de 9,500 ppm la incubabilidad de las codornices en el presente estudio fue de 69%; Martín (2011)56 al incubar huevos de codorniz a 2,230 m.s.n.m. obtuvo un porcentaje de incubabilidad de 29% cuando la concentración de CO2 al día 8 DE fue de 21,000 ppm. Portillo (2005)57 menciona que las codornices comparadas con las gallinas domésticas tienen una tasa metabólica acelerada. Esto se debe a la selección genética enfocada a mayor eficiencia en la ganancia de peso y en la conversión alimenticia durante su etapa productiva, lo mismo sucede con las estirpes de aves reproductoras pesadas, dicha situación ya estudiada por Janke et al (2004)39 al comparar aves de alta conformación (Ross 308, 508) con aves ligeras (Lohman), donde determinaron diferenciales en la temperatura generada por los embriones de ambos tipos de aves. Los parámetros de incubación en codornices, fueron diferentes a los obtenidos por Seker et al (2005),58 posiblemente esto se debió a la altitud sobre el nivel del mar donde se efectuó el presente estudio, aunado al porcentaje de pérdida de humedad de los embriones observado durante el proceso de incubación y al alto nivel de CO2 utilizado. Latter y Baggot (2002) 59 determinaron que la alta concentración de CO2 facilita la formación en una mayor proporción de fluido sub-embrionario en codornices, lo cual es favorable para el 41 DE, situación establecida ya por Deeming (1989)14 en embriones de gallina doméstica. Al igual que el segundo estudio el porcentaje de mortalidad en etapa III fue mayor en el grupo CSP, esto indica que la perforación no es una causa directa de la mortalidad en esta etapa; sin embargo, como ya se mencionó anteriormente deben realizarse más estudios utilizando diferentes diámetros de perforación o más perforaciones o bien realizarlas en otros momentos del DE previos al PI. En la ventana de nacimiento del tercer estudio, los guarnigones del grupo VRB eclosionaron antes que los del grupo VRA; la eclosión se favorece por factores como la reducción en la presión de O2, aumento en la presión parcial de CO2 dentro de la cámara de aire del huevo y el incremento de corticosterona generado por este estrés (Decupeyre y Bruggeman, 2007, De Smit et al, 2008),33,60 esta hipoxia e hipercapnia temprana posiblemente estimuló a los guarnigones a picar el cascarón y posiblemente contribuyo a acelerar el proceso de desarrollo de los embriones del grupos de VRB, debido a este incremento de corticosterona que favorece el incremento más temprano en la concentración de lípidos surfactantes que resultan en una maduración más rápida de los pulmones y por lo tanto una disminución en el momento del cambio de respiración de difusiva a convectiva que coincide con la disminución de la mortalidad en etapa III observada en los protocolos que incluyen la NV en la primer mitad del proceso de incubación (De Smit et al, 2006, 2008; Bahadoran et al, 2010, López, 2011).8,13,33,43 El peso y longitud de los guarnigones fue mayor en el grupo VRB comparado con el grupo VRA, de acuerdo con Willemsen et al (2008),35 los pollitos provenientes 42 de incubaciones con altas concentraciones de CO2 favorecen el incremento en el peso corporal durante las dos primeras semanas de vida, es importante tomar en cuenta ambas características además de considerar que los mejores resultados en cuanto al peso y longitud se obtienen en la concentración 0.95% de CO2; en el estudio de Martin (2011)56 el peso corporal post-eclosión de las codornices provenientes del sistema de NV a las 5 semanas de edad, fue mayor al obtenido en el grupo V. En el presente trabajo se clasificó un 61% de guarnigones del grupo de VRB como de excelente calidad, al igual que en el segundo estudio se muestra que la hipercapnia en la primer etapa del DE beneficia la calidad de los guarnigones. La tasa metabólica del embrión, se ve afectada también por el tiempo de almacenamiento del huevo fértil, el área de la vasculosa y la MCA se desarrollan a un ritmo diferente, los órganos respiratorios primarios posiblemente sufren una modificación estructural al limitar la ventilación (Fasenko et al, 2003);42 el tiempo de almacenamiento en los tres estudiosfue de 3 días, 5.5 días y 1 día respectivamente. El retraso en el nacimiento se estima en 40 minutos por cada día de almacén mayor a 3 días (Padrón et al, 2005).56 Fasenko et al (2003)42, Petek y Dikmen (2005),61 establecen que huevos almacenados por 4 días tienen una tasa metabólica superior a los almacenados durante 14 días, debido a que en estos últimos la producción de CO2 natural es menor y tardía; para contrarrestar la disminución en el metabolismo en huevos con mayor tiempo de almacenaje Christensen et al (2005)62 establecen que al combinar una mayor temperatura de incubación contribuiría a acelerar el metabolismo, de acuerdo a los resultados del 43 presente estudio el uso de un tratamiento de ventilación limitada posiblemente también podría también beneficiar el desarrollo embrionario en embriones de gallina, pavo y codorniz al acelerar su metabolismo, se requiere efectuar investigación al respecto. En el presente estudio, se utilizaron dos tipos diferentes de maquinas incubadoras, es importante considerar la velocidad del aire y sus efectos en la temperatura a nivel del cascarón, además del papel de la humedad en la trasmisión térmica y su acción sobre la incubabilidad. Si la velocidad de aire a través de la incubadora no es uniforme hay una amplia gama de diferencias en transferencia de calor en la incubadora y por lo tanto de temperaturas del embrión a través de ella, si la velocidad es alta puede que se enfríen de más los embriones, para eliminar estas diferencias en temperatura a nivel de los embriones se debe incrementar la capacidad de calor (aire más húmedo) los huevos más calientes perderán, relativamente, mas calor que los huevos más fríos, el rango de temperaturas debe ser reducido y la temperatura de las máquinas tiene que ser regulada para permitir remover suficiente calor de los huevos (Hybro, 2002)63; es importante destacar que el segundo y tercer estudio se obtuvieron mejores porcentajes en los parámetros de incubación comparados con el primer estudio, debido a diversos factores como fueron el mejor control de la temperatura, humedad y una mejor circulación del aire dentro del gabinete de incubación utilizado en el segundo y tercer estudio. El modelo de incubadora (Sportsman®) permitió la toma de lecturas de O2 y CO2 desde el día 0 de incubación, este monitoreo dio la pauta para abrir y cerrar en diferentes proporciones (1/2, 1/3 , 1/4 del total o de la mitad) el Damper 44 para controlar el nivel de CO2 del día 0 al 10 DE y 8 DE (codorniz), para que la concentración de este gas no rebasara el límite de tolerancia establecido previamente en el protocolo de incubación, de esta manera no se alteró el DE y consecuentemente la calidad de los pollitos, además de no afectar los parámetros de incubación; en el segundo estudio se observó que los niveles de CO2 superaron los límites de tolerancia previamente establecidos por De Smit (2006)43 para aves reproductoras pesadas de 45 semanas de edad, lo cual sirvió para establecer un rango de tolerancia óptimo para huevos fértiles de aves reproductoras pesadas Prime age old en 15,000 ppm. La desinfección de las máquinas incubadoras es un actividad que debe realizarse para evitar la contaminación en los huevos fértiles entre cada incubación, principalmente por hongos, en el presente estudio la desinfección de la sala y las maquinas incubadoras se realizó previo a cada estudio, sin embargo, no se aplicó formalina en la nacedora al momento de la transferencia cómo se efectúa de manera comercial y en consecuencia en el embriodiagnóstico se observaron algunos huevos CP contaminados con hongos. 45 CONCLUSIONES - Un sistema de no-ventilación durante la primer mitad del periodo de incubación es recomendable en la incubación de reproductoras pesadas y codorniz japonesa efectuadas a una gran altitud sobre el nivel del mar. - Al utilizar un sistema de ventilación restringida durante los primeros 10 (gallina) y 8 (codorniz) días de desarrollo embrionario, junto a una perforación del cascarón previo a la trasferencia, no se afectan los parámetros de incubación y el DE, se obtuvo una mejor calidad de los pollitos y guarnigones con peso y longitud favorables, una ventana de nacimiento más estrecha, menor mortalidad en el grupo CP durante la fase de cambio de respiración. - Al manejar dos concentraciones altas de CO2 se pudo establecer un rango de tolerancia óptimo a la hipercapnia durante la primera mitad de la incubación, favoreciendo una mayor tasa de eclosión tanto en pollo de engorda como en codornices japonesas. - El rango de tolerancia óptimo para huevos fértiles de aves reproductoras pesadas en Prime age old fue de 15,000 ppm. - Una sola perforación en el cascarón de 1.3 mm al momento de la transferencia no favorece significativamente los parámetros de incubación, exceptuando la mortalidad, en las incubaciones realizadas a una gran altitud sobre el nivel del mar. - La conductancia del cascarón, el diámetro de la perforación y el momento en que se debe realizar la perforación, son la clave para optimizar la óptima pérdida de humedad e intercambio de gases al momento de la transferencia y la eclosión. 46 LITERATURA CITADA 1. 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