Estandarizacion-e-implementacion-de-Elisa-P35-para-el-diagnostico-de-paratuberculosis-a-partir-de-la-leche-de-cabra

•

Biológicas / Saúde

Medicina Fácil

4/8/2022

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Medicina

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA
Y ZOOTECNIA

ESTANDARIZACIÓN E IMPLEMENTACIÓN DE ELISA-P35 PARA EL
DIAGNÓSTICO DE PARATUBERCULOSIS A PARTIR DE LA LECHE DE
CABRA

TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MÉDICA VETERINARIA ZOOTECNISTA

PRESENTA
ALEJANDRA MONTSERRAT HERNÁNDEZ GUERRA

Asesores
Dr. Gilberto Chávez Gris
M. en C. Victoria Elizabeth Castrellón Ahumada

Ciudad Universitaria, Cd. Mx. 2018

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

DEDICATORIA
A mis padres, Ángeles y Roberto por brindarme todo su amor y por confiar en mí
siempre, porque gracias a sus esfuerzos y apoyo pude lograr esto y soy la
persona que soy.
A mis hermanos, a Pepito y a Daniel por crecer a mi lado y estar para mi siempre.
A mi Diego por llenarme de amor, por confiar en mí y apoyarme en todo momento,
me haces muy feliz.
A mi familia, a mis abuelitos, a mis tíos, a mis tías y a todos mis primos por las
risas, los juegos y toda la diversión a lo largo de mi vida, en especial a Viri y a Alex
por motivarme durante en este trabajo. Los quiero Guerritas.
A mi Jay por enseñarme el amor más puro e incondicional, por su lealtad y por
siempre estar a mi lado, siempre estarás en mi corazón.
A cada uno de los animales que durante la carrera fueron parte de mi formación
académica y humana.

III

AGRADECIMIENTOS
A mis padres, a mis hermanos y a Diego, gracias por todo su apoyo en este logro.
Los amo infinitamente.
A la Universidad Nacional Autónoma de México por permitirme ser parte de ella,
así como a mi querida Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia por formarme
profesionalmente.
A mi asesor, Gilberto Chávez Gris por su guía y la confianza depositada en mí.
A Edith Maldonado Castro por su paciencia y ayuda en el trabajo de laboratorio.
A la Dra. Carolina Segundo por ser un apoyo y una consejera en mis momentos
difíciles, por darme ánimos y tener siempre las palabras indicadas para mí.
Gracias por brindarme su amistad, la quiero mucho.
A cada uno de los miembros de mi jurado, Dr. Jaime Campuzano, Dra. Laura
Cobos, Dr. Alejandro de la Peña y al Dr. Gerardo Salas por sus valiosas
observaciones y correcciones en este trabajo.

CONTENIDO

RESUMEN ................................................................................................................... 1
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 3
1.1 Paratuberculosis ............................................................................................ 3
1.1.1 Definición ................................................................................................. 3
1.1.2 Agente etiológico ..................................................................................... 4
1.1.3 Transmisión ............................................................................................. 9
1.1.4 Patogenia .................................................................................................. 10
1.1.5 Etapas de la paratuberculosis ................................................................... 11
1.1.6 Diagnóstico ............................................................................................... 14
1.1.6.1 Pruebas bacteriológicas ..................................................................... 14
1.1.6.2 Pruebas moleculares .......................................................................... 16
1.1.6.3 Pruebas para la detección de respuesta inmune celular .................... 17
1.1.6.4 Pruebas que detectan respuesta inmune humoral ............................. 18
1.2 Inmunoensayo enzimático (ELISA) .............................................................. 18
1.2.1 ELISA en leche ......................................................................................... 21
2. JUSTIFICACIÓN .................................................................................................... 23
3. OBJETIVO GENERAL ........................................................................................... 24
4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................. 24
5. HIPÓTESIS ............................................................................................................ 24
6. MATERIAL Y MÉTODOS ....................................................................................... 25
6.1 Origen de la muestras .................................................................................. 25
6.1.1 Rebaño A ............................................................................................... 25
6.1.2 Rebaño B ............................................................................................... 25
6.2 Muestras obtenidas. ..................................................................................... 25
6.3 Obtención y transporte de las muestras ...................................................... 25

6.4 Procesamiento de muestras ........................................................................ 26
6.5 Estandarización de ELISA-P35 en leche ..................................................... 27
6.5.1 Determinación de punto de corte, sensibilidad, especificidad y
concordancia .................................................................................................. 29
6.6 Identificación de Map ................................................................................... 30
6.6.1 Frotis a partir de heces .......................................................................... 30
6.6.2 Cultivo bacteriológico a partir de heces ................................................. 30
6.7 Extracción de ADN en muestras clínicas ..................................................... 31
6.7.1 Extracción de ADN micobacteriano a partir de heces............................ 31
6.7.2 Extracción de ADN micobacteriano a partir de leche ............................ 33
6.7.3 Extracción de ADN micobacteriano a partir de leucocitos ..................... 33
6.8 Detección de Map por PCR IS900 ............................................................... 34
6.8.1 Controles ............................................................................................... 34
6.8.2 Iniciadores y condiciones de la PCR ..................................................... 34
6.9 Detección de anticuerpos contra Map a partir de ELISA-P35 ...................... 36
6.9.1 ELISA-P35 en plasma ........................................................................... 36
6.9.2 ELISA-P35 en leche .............................................................................. 38
7. RESULTADOS ....................................................................................................... 39
7.1 Estandarización ELISA-P35 en leche .......................................................... 39
7.2 Determinación de punto de corte, sensibilidad y especificidad .................... 39
7.1 Frotis a partir de heces ................................................................................ 41
7.2 Cultivobacteriológico a partir de heces ....................................................... 41
7.3 PCR IS900 a partir de heces ....................................................................... 43
7.4 PCR IS900 a partir de leche ........................................................................ 43
7.5 PCR IS900 a partir de leucocitos ................................................................. 44
7.6 ELISA-P35 en plasma .................................................................................. 44
7.7 ELISA-P35 en leche ..................................................................................... 44
8. DISCUSIÓN ........................................................................................................... 46
9. CONCLUSIONES .................................................................................................. 58
10. PROSPECTIVA .................................................................................................... 58

11. APÉNDICES ........................................................................................................ 59
Apéndice 1. Reactivos a preparar para ELISA–P35 .......................................... 59
Apéndice 2. Tinción Ziehl-Neelsen. ................................................................... 60
Apéndice 3. Preparación de medio Löwenstein-Jensen .................................... 61
12. REFERENCIAS .................................................................................................... 62

Lista de cuadros

Cuadro 1. Clasificación funcional de las proteínas de Map. ......................................... 6
Cuadro 2. Proteínas inmunodominantes presentes en Map. ....................................... 7
Cuadro 3. Empleo de diversos antígenos específicos de Map en ELISA de suero. .. 21
Cuadro 4. Concentraciones del antígeno P35, diluciones de la muestra y tiempos
de incubación que se trabajaron en los ensayos de la estandarización del ELISA-
P35 en leche. ............................................................................................................. 29
Cuadro 5. Escala de valoración del coeficiente kappa. .............................................. 30
Cuadro 6. Condiciones para realizar PCR. ................................................................ 36
Cuadro 7. Valores de los controles positivos y negativos para determinar el punto
de corte de la prueba. ................................................................................................ 40
Cuadro 8. Resultados de ELISA-P35 en leche. Número total de muestras y
número total de positivos y negativos. ....................................................................... 40
Cuadro 9. Evaluación de ELISA-P35 en leche. .......................................................... 41
Cuadro 10. Resultados de los dos rebaños y su porcentaje de positividad en
diferentes pruebas diagnósticas. ................................................................................ 45
Cuadro 11. Animales positivos por PCR IS900 y/o cultivo fecal, y sus resultados
obtenidos en el ELISA-P35 de plasma y leche. ......................................................... 46

VII

Lista de figuras
Figura 1. Distribución de las diferentes concentraciones del antígeno* y de las
diluciones** utilizadas en la microplaca de ELISA. .................................................... 27
Figura 2. Imagen A: Medio de cultivo Lowenstein-Jensen con micobactina a las 36
semanas de incubación, con las flechas amarillas se señalan las colonias
compatibles con Map. Imagen B: Resiembra de las colonias observadas en la
imagen A en medio de cultivo LJ con micobactina a las 10 semanas de incubación,
con las flechas rojas se señala las colonias compatibles con Map. ........................... 42
Figura 3. Frotis directo a partir de cultivo. Se observan BAAR sugerentes a Map,
tinción Zielh-Neelsen 1000 aumentos. ....................................................................... 42
Figura 4. Productos de PCR IS900 en leche. Gel de agarosa al 1.5 %. En el carril
1 se observa el marcador de peso molecular de 50 pb. En los carriles identificados
del 1 al 6 se muestran bandas de 314 pb indicando resultado positivo. En el carril
7, se observa el control negativo C- (agua destilada) y el carril 8 corresponde a
control positivo C+ (ADN de colonias de Map). .......................................................... 43
Figura 5. Productos de PCR IS900 en leucocitos. Gel de agarosa al 1.5 %. En el
carril 1 se observa el marcador de peso molecular de 50 pb. En los carriles 2 al 6
se observan bandas de 314 pb indicando resultado positivo. En el carril 7 se
observa el control negativo C- (agua destilada) y el carril 8 corresponde al control
positivo C+ (ADN de colonias de Map). ..................................................................... 44

RESUMEN

HERNÁNDEZ GUERRA ALEJANDRA MONTSERRAT. Estandarización e
implementación de ELISA-P35 para el diagnóstico de paratuberculosis a partir de
la leche de cabra. (Bajo la dirección de Dr. Gilberto Chávez Gris y M. en C.
Victoria Elizabeth Castrellón Ahumada).

Los objetivos del trabajo fueron desarrollar y estandarizar un ELISA con el
antígeno P35 (proteína recombinante de 35kDa), para el diagnóstico de
paratuberculosis en muestras de leche de origen caprino. El antígeno se fijó en las
placas a concentraciones de 1, 5, 10 y 20 μg/ ml, se probaron diluciones de los
controles positivos y negativos a paratuberculosis de 1:100, 1:200, 1:400 y
1:1,600. El punto de corte se estableció con un intervalo de confianza del 95 % y
dos desviaciones estándar. Los valores en donde se obtuvo una mayor diferencia
entre los controles positivos y negativos fueron 10 μg/ml en la concentración del
antígeno y 1:100 en la dilución de la leche; el punto de corte se estableció a una
densidad óptica de 0.40 a 450 nm. Para determinar la sensibilidad y especificidad
del ELISA se trabajó con 143 muestras de leche. La sensibilidad que se obtuvo fue
69.23 % y la especificidad de 47.69 %. Por otra parte, se realizaron pruebas
diagnósticas complementarias como ELISA-P35 en plasma, aislamiento
bacteriológico en heces y PCR convencional para identificar la secuencia de
inserción 900 de Map en muestras de heces, sangre y leche. El índice de
concordancia kappa permitió comparar el ELISA-P35 en leche contra el cultivo

fecal y la PCR se obtuvo un valor kappa de 0.053 que se traduce en una
concordancia entre pruebas leve, lo que demostró que el ELISA en leche detecta
una gran porcentaje (47.55 %) de animales falsos positivos y por lo tanto fue
necesario realizar pruebas complementarias para confirmar a los animales
verdaderos positivos.
El realizar distintas pruebas diagnósticas, permitió obtener un diagnóstico más
completo y no solo considerar como positivos a los animales excretores de la
bacteria en heces, sino también a los no excretores pero que fueron identificados
como eliminadores de Map a partir de muestras de leche y sangre. Con base en
los resultados de las pruebas en la que se pudo identificar directamente a Map, la
prevalencia real de los rebaños fue de 1.19 % (1/84) para el rebaño A y del 20.33
% (12/59) para el rebaño B, resultados que concuerdan con las características de
cada rebaño el primero sin antecedentes de la enfermedad y el segundo con
antecedentes serológicos.
Este estudio demostró que el ELISA-P35 es capaz de detectar anticuerpos en
contra de Map en muestras de leche, sin embargo la sensibilidad y la especificidad
obtenidas destacan la necesidad de realizar mejoras en la prueba.

1. INTRODUCCIÓN
1.1 Paratuberculosis
1.1.1 Definición
La paratuberculosis (PTB), es una infección crónica que afecta el tracto intestinal
de rumiantes domésticos y silvestres. Fue descritapor primera vez en 1895 en
Alemania por Johne y Frothingham (Johne & Frothingham, 1895) quienes
realizaron la primera descripción de lesiones macroscópicas y microscópicas en
un caso clínico de la enfermedad e indicaron que se trataba de alguna
micobacteria que producía una de tuberculosis intestinal. Es importante aclarar
que paratuberculosis hace referencia únicamente a la infección por Mycobacterium
avium subsp. paratuberculosis (Map) y enfermedad de Johne a la manifestación
clínica de la enfermedad.
La PTB es de distribución mundial y tiene gran impacto económico negativo en el
sector agropecuario, debido a que disminuye la producción de leche y carne,
reduce la fertilidad, incrementa la matanza temprana de animales enfermos,
favorece el desarrollo de infecciones secundarias y en algunos casos devalúa a
los animales destinados para venta como consecuencia de la pérdida de peso
(Kennedy & Benedictus, 2001).
La paratuberculosis, inicialmente fue reconocida en ganado vacuno, después en
ovejas y posteriormente en cabras, se encuentra comúnmente en rumiantes
domésticos y silvestres, y también ha sido descrita en caballos, cerdos, conejos,
armiños, zorros, comadrejas y otras especies (OIE, 2004).

1.1.2 Agente etiológico
Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (Map) es una bacteria
intracelular, anaerobia facultativa e inmóvil, tiene forma de bacilo ligeramente
curvo, mide de 1 a 2 µm de longitud y 0.5 µm de ancho. Posee una pared con
abundantes ácidos grasos como lipoarabinomanano, peptidoglicano,
arabinogalactano y ácidos micólicos, dichos componentes le confieren la
característica de ácido-alcohol resistente (Juste & Garrido, 2000; Harris & Barletta,
2001). La pared celular está implicada en los mecanismos de restricción de
absorción de nutrientes de Map, ocasionando una baja actividad metabólica que
conlleva a una velocidad de crecimiento en condiciones óptimas, 24 veces inferior
que la de bacterias como Escherichia coli (Juste et al., 1993). Este bajo
metabolismo en combinación con la gruesa pared celular, son dos de los factores
implicados en la resistencia a las condiciones adversas (Juste & Garrido, 2000).
Map pertenece al Complejo Mycobacterium avium (MAC), que está conformado
por micobacterias de desarrollo lento pertenecientes al grupo de “micobacterias no
tuberculosas” o “micobacterias atípicas” al cual también pertenecen M. avium
subsp. avium y M. avium subsp. silvaticum (Inderlied, et al., 1993). Map está
estrechamente relacionado con M. avium, con el cual presenta una analogía
mayor al 90%, distinguiéndose de éste por la presencia de 15-18 copias de la
secuencia de inserción 900 (IS900) cuya función es la de una transposasa muy
similar a la denominada IS900-like presente en M. cookii (Green et al., 1989).
Aunque los miembros de MAC están estrechamente relacionados entre sí, una
diferencia fenotípica de Map es su dependencia a la micobactina (Li et al., 2005),

un sideróforo asociado a la membrana celular producido cuando existen limitadas
cantidades de hierro en el medio. Su función es facilitar el transporte de este
metal a través de la compleja pared celular para su desarrollo, supervivencia y
replicación (del Castillo-Rueda & Khosravi-Shahi, 2010). La dependencia de
micobactina para su desarrollo in vitro es utilizada como un rasgo característico
que distingue a Map. Sin embargo, algunos estudios han demostrado que esta
dependencia también ha sido observada en otras especies como M.
silvaticum y algunos aislamientos primarios de M. avium (Thorel, 1991). Map
también puede crecer sin aporte externo de micobactina, lo cual es posible si el
medio contiene suficiente hierro y otros nutrientes disponibles (Juste et al., 1993).
1.1.2.1 Estructura proteómica de Map
En un estudio realizado por He y De Buck en 2010, se lograron identificar a través
de un análisis proteómico un total de 309 proteínas en Map, de las cuales 157
fueron designadas como proteínas citoplasmáticas, 67 como proteínas
relacionadas con la pared celular y 85 sin ubicación asignada. Asimismo realizaron
una clasificación de las proteínas con base en su función (He & De Buck, 2010)
(Cuadro 1).

Clase Función Proteínas de superficie celular
Proteínas de
pared celular
0 Virulencia, desintoxicación, adaptación 7 17
1 Metabolismo lipídico 7 9
2 Transmisión de información 5 34
3 Pared celular y procesos celulares 4 65
4 Proteínas PE y PPE** 4 1
5 Intermediarios del metabolismo y respiración 11 74
6 Proteínas de actividad desconocida 0 22
7 Proteínas de regulación (indeterminadas) 1 13
8 Proteínas hipotéticas conservadas 0 54

Total 39 309
Cuadro 1. Clasificación funcional de las proteínas de Map. Tomado de (He & De
Buck, 2010). **Proteínas PE: Prolina-ácido glutámico PPE: Prolina-prolina-ácido
glutámico.

Dentro de las proteínas identificadas en Map, existen proteínas inmunodominantes
capaces de producir respuestas inmunes, las cuales pueden ser utilizadas como
reactivo en el serodiagnóstico así como en el desarrollo de vacunas (Dupont et al.,
2005). Diversas proteínas antigénicas se han descrito en Map pero hasta ahora
ningún antígeno específico. Algunas de estas proteínas (Cuadro 2) presentan una
alta homología con antígenos de otras micobacterias, hecho que causa reactividad
cruzada especialmente con el complejo tuberculosis.

Proteína Peso molecular Homología Referencia

GroES

10 kDa
M. avium subsp. avium
M. tuberculosis
M. leprae

(Cobb &
Frothingham, 1999)
GroEL 65 kDa M. avium subsp. avium
M. tuberculosis
M. leprae
(Thole et al., 1987;
El-Zaatari et al.,
1995)
AhpC 45 kDa M. tuberculosis (Olsen et al., 2000)
AhpD 24 kDa M. tuberculosis (Olsen et al., 2000)
Proteína de fusión MBP 19 kDa M. avium subsp. avium

(Huntley et al.,
2005)
Antígeno 14 kDa 14 kDa M. tuberculosis (Olsen et al., 2001)
Antígeno 32 kDa 32 kDa
---------
(Ostrowski et al.,
2003)
Proteina 22 kDa 22 kDa M. leprae
M. tuberculosis
(Dupont et al., 2005)
Complejo Ag85 30-32 kDa M. bovis (Rosseels et al., 2006)
Serin proteasa 34 kDa 34 kDa --------- (Cameron et al., 1994)
Proteína 35 kDa 35 kDa M. leprae
M. avium subsp. avium
(Banasure et al.,
2001)
Cuadro 2. Proteínas inmunodominantes presentes en Map.

1.1.2.2 Proteína P35
La proteína principal de membrana (MMP) por sus siglas en inglés Major
Membrane Protein tiene un peso de 35 kDa, está conformada por 307
aminoácidos y es codificada por el gen map2121c (Winter et al., 1995; Bannantine
et al., 2003; Yakes et al., 2008). Inicialmente fue identificada como antígeno
mediante la unión de anticuerpos monoclonales específicos de Mycobacterium
leprae (Ivanyi et al., 1983). Después se purificó a partir de una fracción de
membrana y se identificó como una proteína de 35 kDa (Hunter et al., 1990).
A partir de su identificación, diversos investigadores han producido proteínas
recombinantes con el fin de explorar su capacidad y utilidad diagnóstica (Triccas
et al., 1996; Bannantine et al., 2003; Basagoudanavar et al., 2004;
Basagoudanavar & Goswami, 2006; Castrellón, 2012; Basagoudanaavar et al.,
2014). La proteína de 35 kDa fue reconocida como un antígeno inmunodominante
de M. leprae, y se demostró que estimula la respuesta inmune de tipo celular en
pacientes enfermos de lepra (Winter et al., 1995; Triccas et al., 1996).
Posteriormente, se encontró en Map y en Maa, y se demostró que está ausente
en M. tuberculosis y M. bovis (Banasure et al., 2001). Más tarde, se constató
mediante microscopía de inmunelectrones que la proteína MMP se encuentra
expuesta en la superficie de la membrana de Map y que está relacionada con la
invasión de células epiteliales bovinas representando un posible factor de
virulencia, además de que se expresaen altos niveles cuando la bacteria se
encuentra en condiciones de baja cantidad de oxígeno y alta osmolaridad,
condiciones presentes en el intestino de los rumiantes (Bannantine et al., 2003).

La proteína de 35 kDa es reconocida por sueros de humanos infectados con M.
leprae y por sueros de ganado infectado con Map; actúa como un antígeno
inmunodominante capaz de estimular la secreción de IFN-γ, la expresión de
linfocitos T y la producción de IgG en etapas tempranas de la infección
(Bannantine et al., 2003; Triccas et al., 1996). Se ha demostrado que en bovinos a
través de ELISA en suero, la proteína de 35 kDa es reconocida en el 100 % de los
animales infectados con presentación clínica y en el 75 % de los animales
infectados con presentación subclínica (Fouad, et al., 1997). Estudios han
demostrado que en ratones provoca una respuesta inmune celular y una reacción
de hipersensibilidad de tipo retardado (Basagoudanavar et al., 2006). Éstas
características le permiten ser utilizada como antígeno para el desarrollo de
pruebas diagnósticas en etapas tempranas o como antígeno vacunal
(Basagoudanavar, et al. 2004; Basagoudanavar, 2006).
1.1.3 Transmisión
El principal mecanismo de transmisión es la vía oral, por ingestión de alimentos
contaminados con heces. Los animales más susceptibles a la infección por Map
son los recién nacidos y los jóvenes, debido a que a nivel intestinal presentan una
mayor área de tejido linfoide asociado a mucosa intestinal (placas de Peyer), el
cual es el punto de entrada para la bacteria (Sweeney, 2011); además requieren
de una menor dosis infectiva para desarrollar la enfermedad. Se ha establecido
que la dosis infectiva es aproximadamente de 1 x 103 bacilos (Brotherston & Mc
Samuel, 1961); teniendo en cuenta que el número de bacilos viables eliminados
en heces de animales infectados es de 106 - 108 UFC/g (Whittington et al., 2000)

una mínima contaminación fecal del ambiente es suficiente para producir la
infección de los animales susceptibles.
Map también puede transmitirse por ingestión de leche o calostro de madres
infectadas (Sweeney et al., 1992), por semen de machos infectados (Sweeney et
al., 1995) y de manera transplacentaria al feto (Larson & Kopecky, 1970).
1.1.4 Patogenia
Una vez que entra al organismo por vía oral llega y coloniza yeyuno e íleon en
donde es endocitada por las células M que se encuentran en la cúpula de las
placas de Peyer (Momotani et al., 1988). Aproximadamente un tercio del tejido
linfoide asociado a mucosas se encuentra en el yeyuno y dos tercios se encuentra
en íleon. La distribución de las células M en el intestino explica la predilección del
íleon como el sitio de lesión primario.
La endocitosis por parte de las células M se realiza a través de la proteína de
unión a fibronectina de Map y las integrinas presentes en las células M (Secott et
al., 2004). Map ingresa a través de las células M y se introduce a la submucosa
en donde es fagocitada por macrófagos subepiteliales e intraepiteliales
adyacentes a las placas de Peyer (Momotani et al., 1988). Dentro del macrófago
Map es capaz de sobrevivir debido a que evita la acidificación del fagosoma; es
resistente a las enzimas lisosómicas, el óxido nítrico y otros mecanismos
bactericidas que producen los macrófagos. Aunado a que posee una envoltura
celular lipídica, en especial por el lipoarabinomanano que le otorga la capacidad
para inhibir la acidificación (Zhao et al., 1997; Harris & Barletta, 2001). La

supervivencia y replicación de Map dentro de los macrófagos depende del grado
de activación y diferenciación de los mismos. La activación de los macrófagos por
citoquinas, tales como el interferón-gamma, producido por los linfocitos T, mejora
la destrucción de los microorganismos intracelulares. Es probable que algunos
animales expuestos e infectados tengan éxito en la eliminación de Map a través de
este mecanismo y no presenten la enfermedad. Sin embargo, muchos animales
expuestos e infectados no tienen éxito en la eliminación de Map, y el organismo
persiste dentro de los macrófagos. Cuando se encuentra la bacteria en grandes
cantidades son citotóxicas, lo que provoca la apoptosis de los macrófagos
(Bannantine & Stabel, 2002) y por lo tanto la diseminación de las micobacterias
hacia otras partes del organismo como linfonodos mesentéricos, hígado y glándula
mamaria tanto por vía linfática como sanguínea (Merkal, 1984; Lugton, 1999). Se
ha detectado la presencia de Map en sangre, hígado, linfonodos retrofaríngeos y
mandibulares, bazo, pulmones, riñones, ubres, glándula mamaria, útero,
testículos, epidídimo, y semen. (Whitlock & Buergelt, 1996).
1.1.5 Etapas de la paratuberculosis
Durante el transcurso de la infección, se pueden distinguir cuatro etapas:
Etapa silenciosa. Se caracteriza por la ausencia de signos clínicos. La bacteria no
se elimina en heces y no es posible la detección de anticuerpos. Los estadios
iniciales de la enfermedad se caracterizan por una alta respuesta inmune celular.
En esta fase ocurre la diseminación de la bacteria a través de intestino y tejido
linfoide asociado. La presencia de Map en la submucosa intestinal atrae a
macrófagos y linfocitos al área afectada, de esta forma comienza la lesión

granulomatosa la cual en un principio logra contener la infección (Sweeney, 2011).
Al inicio de la infección hay una producción de interferón gamma (IFN-ϒ) y una
proliferación de linfocitos en respuesta a la inoculación de antígenos
micobacterianos como el derivado proteico purificado (PPD) lo que indica la
actividad de la inmunidad celular (Chiodini, et al., 1984; Stabel, 2000).
Etapa subclínica. En este estadio se encuentran principalmente animales adultos
portadores de Map. Esta infección temprana "controlada" por la respuesta inmune
celular da como resultado una fase subclínica que puede durar 2 o más años.
Durante este tiempo, el animal no muestra signos clínicos, no hay un efecto
apreciable sobre la producción o disminución de peso y la mayoría de los animales
son negativos a cultivo en heces a pesar de que los animales excretan en heces
una carga microbiana baja de manera intermitente. En ocasiones pueden
presentar anticuerpos circulantes, sin embargo los anticuerpos séricos no son
usualmente detectables. Las pruebas de inmunidad celular mediada por células,
tales como ensayos in vitro que miden la proliferación de linfocitos o la producción
de interferón-gamma, pueden dar resultados positivos, pero estas pruebas rara
vez son prácticas en un entorno clínico. El único método confiable para identificar
animales en esta etapa de infección es por muestreo de íleon o linfonodos
mesentéricos para la detección de Map mediante cultivo o PCR (Sweeney, 2011).
Etapa clínica. Se desarrolla usualmente después de 2 años de infección por Map.
Los signos clínicos característicos son la disminución de la producción láctea, pelo
hirsuto, pérdida de peso y diarrea. La inmunidad mediada por células responsable
de contener la infección comienza a disminuir, y la infección comienza a progresar

rápidamente. Esta pérdida de control de la infección se asocia a menudo a una
transición de una respuesta inmune de tipo Th1 donde predominan las citoquinas
asociadas con la activación de los macrófagos (interferón-gamma), a una
respuesta inmune de tipo Th2 caracterizada por un predominio de citoquinas tales
como IL- 4 e IL-10, que se asocian con el inicio de la producción de anticuerpos
acompañada de la disminución de la inmunidad celular especıfica mediada por
células (Sweeney, 2011). El animal infectado comienza a eliminar la bacteria en
cantidades cada vez mayores en heces. Las lesiones en intestino se agravan y se
vuelven difusas, afectando a yeyuno, íleon, ciego y, en menor medida al colon. La
mucosa del intestino delgado,particularmente en íleon, se vuelve más gruesa
debido a la infiltración celular masiva, y las vellosidades intestinales se acortan y
engrosan reduciendo su capacidad de absorción. La inflamación granulomatosa
provoca una linfangiectasia. Lo anterior se traduce en una mala absorción
intestinal, diarrea pastosa, pérdida de peso e hipoproteinemia (Manning & Collins,
2001).
Etapa clínica avanzada. La pérdida de peso suele acompañar a la diarrea y a
medida que disminuye la concentración plasmática de proteínas, puede
desarrollarse edema submandibular. La producción de leche se reduce en un 20%
o más. En esta etapa avanzada de la enfermedad, la diseminación de Map a los
sitios extraintestinales ocurre con frecuencia y la infección fetal en el útero se
presenta en el 40% o más de estos casos. La excreción de Map da lugar a la
contaminación ambiental significativa. La mayoría de los animales son sacrificados
una vez que los signos clínicos típicos son reconocidos pero, si se les permite

permanecer en el rebaño, avanzarán a un estado de letargo, debilidad y
emaciación que los llevará a la muerte debido a caquexia y deshidratación
(Sweeney, 2011).
1.1.6 Diagnóstico
Como en la mayoría de las enfermedades de curso crónico, en la paratuberculosis
existe lo que se denomina “efecto iceberg”, es decir, en una producción se
considera que por cada animal que se observa con cuadro clínico, es probable
que haya otros 25 animales infectados (Whitlock & Buergelt, 1996). El curso
crónico de la enfermedad hace que sea prácticamente imposible detectar a todos
los animales positivos con una sola prueba diagnóstica en un momento
determinado (Kalis & Collins, 2003). Por ello, si se desea realizar un diagnóstico
eficaz de los animales infectados se recomienda emplear más de una prueba
diagnóstica así como programar fechas para la realización de dichas pruebas a
través del tiempo.
1.1.6.1 Pruebas bacteriológicas
1.1.6.1.1 Tinción Zielh-Neelsen
Se realiza en muestras de heces, tejido y leche. Al ver la tinción, los bacilos suelen
observarse en cúmulos. Es simple, rápida y económica pero tiene la desventaja de
tener una baja sensibilidad del 15% y especificidad del 86% (Soto et al., 2002)
Además, en animales subclínicos que tienen una excreción intermitente aumenta
la probabilidad de obtener resultados falsos negativos (Gilardoni et al., 2012).

1.1.6.1.2 Cultivo bacteriológico
El cultivo bacteriológico a partir de heces es la prueba diagnóstica definitiva para
la identificación de Map debido a su especificidad superior al 99%. Sin embargo, la
sensibilidad no supera el 50% ya que en etapas subclínicas los animales excretan
la bacteria en baja cantidad o de manera intermitente. El límite mínimo de
detección es de 100 UFC en cultivos sólidos, sin embargo se ha reportado que en
medio líquido 7H9+ es capaz de detectar hasta 1 UFC (Pozzato et al., 2011). Es
una técnica de diagnóstico muy lenta, ya que requiere de 12 a 16 e incluso hasta
52 semanas de incubación (Stabel, 2000).
Para realizar un cultivo primario se pueden utilizar muestras de heces, calostro,
leche, macerado de intestino y raspado de mucosa intestinal (Garrido et al., 2000;
OIE, 2004). Con el fin de reducir los costos, el cultivo fecal puede hacerse en
grupos de 3-5 muestras individuales (pooles), sin perder demasiada sensibilidad
(Kalis et al., 2000). Para el aislamiento primario se utilizan cultivos en medios
sólidos a base de huevo como Löwenstein-Jensen (LJ) y Herrold (HEYM por
Herrold Egg Yolk Medium) (Withlock & Rosenberger, 1990), o medios sintéticos
tales como Middlebrook (7H10, 7H11), todos ellos adicionados con micobactina
(Gilardoni et al., 2012). Las colonias formadas son pequeñas, redondas, de
aproximadamente 1 mm de diámetro, lisas y brillantes. Los criterios para identificar
a Map son su lenta tasa de desarrollo, la morfología de las colonias, la tinción de
Z-N y su dependencia de micobactina, principalmente en el cultivo primario
(Gilardoni et al., 2012).

La sensibilidad del cultivo bacteriano en estadios clínicos puede ser del 91%, valor
que se puede reducir de un 45% a un 72% en estadios subclínicos, mientras que
la especificidad es del 100% en todas las etapas (Alinovi et al., 2009). Sin
embargo, estas estrategias son demasiado caras para ser aplicadas
rutinariamente para el diagnóstico de campo o el control de la infección.
1.1.6.2 Pruebas moleculares
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una prueba capaz de amplificar
una secuencia de nucleótidos a partir de un fragmento de ADN que codifica para
una región génica específica (Pérez de Castro, 2005). En el caso de Map, se
utiliza la secuencia de inserción IS900, de la cual tiene entre 14 a 18 copias en su
genoma (Green et al., 1989; Bull et al., 2000). La amplificación de la IS900 por
PCR permite identificar a la bacteria en heces (Kawaji et al., 2007; Irenge et al.,
2009), leche (Kumar et al., 2008; Slana et al., 2008, 2009), sangre y tejidos
(Hermon-Taylor et al., 2000; Bull et al., 2003; Juste et al., 2005) en un tiempo
relativamente corto en comparación con el cultivo fecal. Su sensibilidad es del
100% cuando se usa para confirmar la identidad de bacterias cultivadas (Manning
& Collins, 2001), sin embargo, al aplicarla directamente en muestras biológicas la
sensibilidad disminuye. La muestra en donde se pierde más sensibilidad son las
heces, debido a la presencia de interferencia en los componentes, lo que resulta
en una inhibición de la reacción de PCR dando lugar a resultados falsos negativos
(Stevenson & Sharp, 1997; Englund et al., 1999). Por lo tanto, la sensibilidad de la
PCR a partir de muestras fecales depende en gran medida de los procedimientos
de extracción de ADN que deben garantizar la eliminación eficiente de los

inhibidores como sales biliares, ácido fítico, ácido fenólico, polisacáridos,
detergentes iónicos y alcoholes. Además, la presencia de ADN de la microbiota
intestinal, forrajes, células del hospedador o de otras bacterias reduce aún más la
detección de Map (Bölske & Herthnek, 2010; Pozzato et al., 2011).
Otra limitante que la PCR IS900 presenta, son los falsos positivos que las
secuencias estrechamente relacionadas a IS900 puedan ocasionar. Estas
secuencias denominadas IS900-like se encuentran en otras micobacterias como
M. avium subsp. avium (Naser et al., 1999) y M. cookii (Englund et al., 2002),
hecho que impide que la PCR IS900 sea 100% específica de Map.
1.1.6.3 Pruebas para la detección de respuesta inmune celular
Existen dos pruebas enfocadas a la detección de la infección en sus fases iniciales
donde predomina la respuesta inmune celular. La prueba de interferón gamma
(INF-γ) detecta a esta citoquina producida por los linfocitos T sensibilizados con un
antígeno ya sea Derivado Protéico Purificado (PPD) aviar o Johnina. Esta prueba
tiene una sensibilidad de 70% y una especificidad de 97%, entre sus desventajas
están que es una prueba costosa y puede haber reacciones cruzadas
dependiendo de la especificidad del antígeno empleado (Huda et al., 2003).
La prueba de intradermorreación se basa en la reacción inflamatoria local como
respuesta de hipersensibilidad retardada la cual fue descrita por Robert Koch
(1891). Para esta prueba se mide espesor de la piel, posteriormente se aplica
intradérmicamente el Derivado Proteico Purificado (PPD) de origen aviar o Johnina
en el tercio medio del cuello. La lectura se realiza 72 horas después,

considerándose positivo un incremento en el espesor de la piel igual o mayor a 2
mm (OIE, 2004).
1.1.6.4 Pruebas que detectan respuesta inmune humoral
Se ha demostrado que la inmunidad mediada por anticuerpos puede aparecer
desde las 16 (Chávez, 1993) hasta las 53 semanas post-infección. En la detección
de la respuesta inmune humoral se emplean técnicascomo la fijación del
complemento, la inmunodifusión en gel de agar (IGDA) y el ensayo
inmunoenzimático (ELISA), siendo el ELISA el método que presenta mayor
sensibilidad debido a que permite detectar anticuerpos en bajas concentraciones
(Collins, 2011). Debido a que la respuesta inmune humoral aumenta conforme
avanza la enfermedad, la sensibilidad de estas pruebas es más alta para animales
con signos clínicos y excretores de grandes cantidades de bacterias (Sweeney et
al., 1995; Nielsen & Toft, 2006).
1.2 Inmunoensayo enzimático (ELISA)
Descrito por primera vez por Engvall y Perlmann (1971), el ELISA es una técnica
simple y rápida para detectar y cuantificar anticuerpos o antígenos unidos a una
superficie sólida. Puede realizarse en cuatro formatos diferentes: directo y
competitivo (para detectar antígenos), indirecto (para detectar anticuerpos
específicos), y sándwich (para detectar antígenos o anticuerpos) (Hnasko, 2015).
En el ELISA indirecto que es el utilizado para diagnóstico de la PTB el antígeno de
interés se inmoviliza en placas de microtitulación de poliestireno de 96 pozos
mediante absorción pasiva. Se añade una solución de bloqueo para saturar todos
los sitios no unidos en el pocillo seguido de una incubación con un anticuerpo

primario (del suero problema) específico para el antígeno inmovilizado. Después,
se añade un anticuerpo secundario (de la especie de donde proviene el anticuerpo
primario) conjugado con una enzima (generalmente peroxidasa), el cual se une al
anticuerpo primario. Esta unión es capaz de detectarse agregando un sustrato
cromogénico cuya reacción es medida en un espectofotómetro, donde la densidad
óptica (DO) resulta proporcional a la cantidad de anticuerpos y por lo tanto es
cuantitativa (Hnasko, 2015) .
El ELISA fue empleado por primera vez en el diagnóstico de la paratuberculosis
por Jorgensen y Jensen en 1978 (Jorgensen & Jensen, 1978). En la actualidad es
la técnica serológica más utilizada para el diagnóstico de la PTB debido a que es
una prueba de fácil automatización e interpretación de los resultados, económica,
rápida y reproducible que permite evaluar grandes lotes de muestras ya sean de
suero, plasma y/o leche (Collins et al., 1993). A pesar de lo anterior, la
sensibilidad y especificidad de la prueba son dependientes del antígeno empleado
y de la etapa de la enfermedad en que se encuentre el animal (Gumber et al.,
2006).
Actualmente, muchas de las pruebas basadas en antígeno que detectan
anticuerpos contra Map usan una mezcla compleja y mal definida de proteínas
como un extracto sonicado de bacterias enteras, un extracto de antígenos de
superficie o un derivado proteico purificado. Por ejemplo, se han evaluado
extractos crudos y preparaciones fraccionadas tales como el antígeno
protoplasmático (PPA) y el lipoarabinomano (LAM), los cuales se utilizan en
pruebas de ELISA comerciales (Yokomizo et al., 1983; Sugden et al., 1989). No

obstante, estas preparaciones antigénicas contienen mezclas de proteínas y
antígenos que comparten con el género Mycobacterium los cuales pueden
ocasionar reacciones cruzadas dando resultados falsos positivos (Nielsen & Toft,
2008). Por esta razón, el antígeno ideal para pruebas basadas en detectar la
respuesta humoral debería ser específico de Map.
En el año 2008 Bannantine y colaboradores generaron una matriz de proteínas
parciales que representan las secuencias de codificación de Map y mostraron que
algunas proteínas específicas de la bacteria se detectaron fuertemente en sueros
clínicos pos-infección temprana en un modelo experimental (Bannantine et al.,
2008). Hasta la fecha, se han identificado varios objetivos inmunitarios específicos
de Map, de los cuales se ha evaluado su antigenicidad a través de un ELISA
obteniendo diferentes resultados (Cuadro 3).

Antígeno Sensibilidad % Especificidad % Referencia
P 35 kDa 86 100 (El-Zaatari et al., 1997)
P 35 kDa 93.3 86.4 (Shin et al., 2004)
P 35 kDa 100 92 (Castrellón, 2012)
P 20.8 kDa 73.3 98.3 (Goswami et al., 2017)
MAP1693c
MAP4308c
MAP2677c
94.74 97.92 (Leroy et al., 2007)
Map ech-A
MAP1197c 96.7 96.7 (Nagata et al., 2013)
34 kDa 100 No reportada (Kavid et al., 2012)
Cuadro 3. Empleo de diversos antígenos específicos de Map en ELISA de suero.

1.2.1 ELISA en leche
Esta prueba en leche, es similar al ELISA en suero o plasma en términos de
tiempo y costos de la prueba. Entre ambos existe una correlación moderada
debido a que la concentración de anticuerpos en la leche no sólo depende de los
niveles de anticuerpos séricos, sino también de factores como el nivel genético de
producción lechera, el número de partos y los días de lactancia. La evaluación del
ELISA en leche de vaca reveló que los niveles de anticuerpos en la leche fueron
más altos al comienzo y al final de la lactancia, razón por la cual es más probable
que los animales resulten positivos en dichas etapas (Nielsen, et al., 2002). Es por
eso que se recomienda realizar al menos dos determinaciones de ELISA en leche

en diferentes momentos de la lactancia para establecer no sólo el nivel de
anticuerpos, sino también la consistencia del resultado, para tener una buena
sensibilidad sin pérdida de especificidad (Gilardoni et al., 2012).
La prueba en leche ofrece grandes ventajas sobre la realización en suero; dado
que las muestras de leche individuales se recogen de forma rutinaria en las
granjas, resulta un método menos invasivo para probar animales lecheros ante la
infección con Map. Además, la recolección rutinaria de muestras de leche
facilitaría a los productores examinar sistemáticamente a sus rebaños para
detectar la infección sin la programación adicional de recolección de suero o
heces.
Otro antígeno empleado ha sido el lipoarabinomamano (LAM), que fue el primer
antígeno específico utilizado en este método por Sweeney y colaboradores en
1994 detectando a un 15% de animales positivos con una sensibilidad de 60% y
especificidad de 83% , este estudio indicó que el ELISA en leche fue comparable
con el ELISA realizado en suero (Sweeney, et al. 1994).
El método de ELISA ha sido adaptado por sistemas comerciales para la detección
de anticuerpos contra Map en leche utilizando el antígeno PPA-3. Un estudio
realizado en Alemania indicó una correlación significativa entre los resultados de
ELISA en suero y leche (Svanovir-ELISA de Svanova) mostrando una sensibilidad
y especificidad en leche del 60.9 y 94.6%, respectivamente (Winterhoff et al.,
2002). Por su parte, en Chile se ha utilizado el ELISA comercial de IDEXX como
prueba de diagnóstico de paratuberculosis en leche de cabra teniendo una

sensibilidad de 60% y una especificidad de 99.3% demostrando que el ELISA
puede ser una alternativa precisa y rentable (Salgado et al, 2007).
En la Unidad de Servicios de Diagnóstico y Constatación (USEDICO) (FMVZ-
UNAM) se ha desarrollado una metodología diagnóstica basada en la detección de
anticuerpos mediante ELISA contra una proteína de 35kDa. Esta prueba fue
estandarizada en suero y plasma obteniendo una sensibilidad del 100% y una
especificidad del 92% (Castrellón, 2012). No obstante, su utilidad en muestras de
leche aún no ha sido evaluada; esta prueba permitiría el diagnóstico a partir de
otro tipo de muestras tanto individual como en tanque colector de leche.
2. JUSTIFICACIÓN
En México la PTB representa un problema de salud animal que si bien no ha sido
completamente evaluado, existen estudios que indican un impacto económico
promedio de 10 mil pesos por vaca al año (Miranda, 2005). Otro estudio evaluó el
impacto económico en producciones lecheras caprinas en el estado de
Guanajuato estimando que las pérdidas económicas por animal eran de $454
hasta $852 pesos dependiendo de la prevalencia de la enfermedad (Jorgeet al.,
2011). Para realizar un diagnóstico eficiente y preciso, es necesario utilizar más de
una prueba diagnóstica, a partir de diversas muestras que consideren detectar
tanto la respuesta inmune humoral, como la presencia de la bacteria en los
animales afectados. En el caso del diagnóstico de PTB mediante ELISA a partir de
leche en cabras, no existe suficiente información, sin embargo se han empleado
estuches comerciales de ELISA para realizar su diagnóstico. La estandarización

de una prueba de ELISA-P35 a partir de leche de cabra, pretende obtener
mayores valores tanto de sensibilidad como de especificidad, complementando el
diagnóstico de paratuberculosis, ya que no sólo detectará anticuerpos a nivel
individual animales seropositivos, sino también a nivel de tanque de
almacenamiento para el monitoreo de la presencia de Map en rebaños lecheros.
3. OBJETIVO GENERAL
Estandarizar y evaluar utilidad del ELISA-P35 para el diagnóstico de
paratuberculosis a partir de leche de cabras.
4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Determinar la sensibilidad y especificidad del ELISA-P35 en leche tomando
como referencia el cultivo fecal y la PCR IS900.
• Determinar la prevalencia a partir de muestras de plasma y leche, en dos
rebaños, uno con sospecha y otro sin antecedentes de paratuberculosis mediante
ELISA-P35.
5. HIPÓTESIS
Se podrá determinar la presencia de anticuerpos contra Mycobacterium avium
subsp. paratuberculosis en leche mediante ELISA-P35 en dos rebaños, uno con
sospecha y otro sin antecedentes de paratuberculosis.

6. MATERIAL Y MÉTODOS
6.1 Origen de la muestras
6.1.1 Rebaño A
Sistema de producción intensivo de cabras lecheras, localizada en el municipio El
Marqués del estado de Querétaro. El rebaño cuenta con 84 animales en
producción láctea de las razas Alpino Francés y Toggenburg, no tiene
antecedentes clínicos ni serólogicos de paratuberculosis.
6.1.2 Rebaño B
Sistema de producción lechera caprino semi-intensivo, localizado en el municipio
de Tequisquiapan del estado de Querétaro. El rebaño cuenta con 59 cabras en
producción láctea de la raza Alpino Francés y tiene antecedentes serológicos de
paratuberculosis.
6.2 Muestras obtenidas.
De ambos rebaños se obtuvieron muestras de leche, sangre y heces de los
animales que se encontraban en producción, del rebaño A se obtuvieron muestras
de 84 animales y del rebaño B se obtuvieron muestras de 59 animales.
6.3 Obtención y transporte de las muestras
Muestras de leche. Se emplearon tubos estériles de 15 ml para obtener
manualmente muestras de cada individuo, obteniendo aproximadamente 10 ml de
leche de ambos pezones. Las muestras se obtuvieron durante el ordeño
programado en cada establo, por lo que se realizó después del proceso de

limpieza y desinfección que rutinariamente se maneja en cada sistema de
producción.
Muestras de sangre. Las muestras de sangre se obtuvieron por venopunción
yugular empleando tubos al vacío con anticoagulante EDTA de 6 ml (BD
Vacutainer) y agujas del número 21G (Venojet Multi-Sample).
Muestras de heces. Las muestras de heces se tomaron directamente del recto
empleando bolsas de plástico previamente lubricadas con agua, obteniendo
aproximadamente 5 g de muestra por cada animal.
Todas las muestras fueron transportadas a 4ºC al Laboratorio de Microbiología
Molecular de la USEDICO del CEIEPAA, para su procesamiento dentro de las
primeras 24 horas después se su obtención.
6.4 Procesamiento de muestras
Leche. Las muestras se centrifugaron a 2700 rpm durante 7 minutos con el fin de
obtener tres fases: 1) grasa, 2) interfase (suero) y 3) sedimento (sólidos). La grasa
se desechó, la interfase se congeló en fracciones de 500 µl a -20ºC para
posteriormente realizar ELISA-P35 y el sedimento se mantuvo en congelación a
-20ºC para realizar extracción de ADN y posteriormente PCR IS900.
Sangre. Las muestras fueron centrifugadas en una centrifuga refrigerada
(Eppendorf Centrifuge 5810 R) a 4000 rpm durante 5 minutos para separar la
placa leucoplaquetaria del plasma y de los eritrocitos. El plasma se congeló en
fracciones de 200 µl a -20ºC para posteriormente realizar ELISA-P35. La placa

leucoplaquetaria se utilizó para realizar extracción de ADN a partir de leucocitos y
posteriormente PCR IS900.
Heces. Las muestras se descontaminaron durante tres días con HPC al 0.75%
según lo descrito por Chávez-Gris (1993) para posteriormente de la interfase
realizar cultivo bacteriológico, frotis teñidos con Z-N y obtener muestras para la
extracción de ADN a partir de heces para PCR IS900.
6.5 Estandarización de ELISA-P35 en leche
El antígeno que se utilizó fue la proteína recombinante P35 producido a través de
despliegue en fago (Castrellón, 2012). El antígeno se fijó a microplacas de ELISA
en concentraciones de 1, 5, 10 y 20 μg/ml, diluidos en solución amortiguadora de
carbonatos pH 9.6 (Apéndice 1), colocándose 100 μl de antígeno por pozo,
incubando durante 24 horas a temperatura ambiente (TA) (Figura 1).

Figura 1. Distribución de las diferentes concentraciones del antígeno* y
de las diluciones** utilizadas en la microplaca de ELISA.

Posteriormente, se lavaron tres veces con 200 µl de PBS-Tween 20 al 0.1% (PBS-
T) y se bloquearon agregando 150 µl de PBS-gelatina al 1%, las placas se
incubaron durante hora y media a TA y se lavaron tres veces con 200 µl de PBS-T.
Como controles positivos se utilizaron muestras de leche remitidas al Laboratorio
de Microbiología Molecular (LMM) de la USEDICO, provenientes de animales
confirmados como positivos a paratuberculosis mediante PCR IS900 de leche y/o
heces, y por ELISA-P35 de plasma. Como controles negativos se utilizaron
muestras de leche comercial de vaca. Todos los controles fueron diluidos en
solución amortiguadora de fosfatos (PBS) a diluciones de 1:100, 1:200, 1:400,
1:800 y 1:1600. (Figura 1) Se colocaron en los pozos correspondientes a cada
dilución, 100 μl de los controles positivos y negativos de manera pareada, se
incubaron a TA por hora y media y se lavaron tres veces con 200 µl PBS-T. Se
utilizó un anticuerpo conjugado (anti- IgG de cabra conjugado a peroxidasa de
rábano) Rabbit Anti-Goat IgG Conjugate (INVITROGEN) a una dilución 1:1000
agregando 100 µl por pozo, las placas se incubaron durante hora y media a TA y
se lavaron tres veces con 200 µl PBS-T. Posteriormente se realizaron dos lavados
adicionales con 200 µl de PBS para quitar cualquier residuo; a cada pozo se
agregaron 100 µl de solución de revelado (Apéndice 1) y se mantuvieron a TA. La
lectura de las placas se realizó a los 20, 40 y 60 minutos en un espectofotómetro
ELx800 (BIO-TEK), empleando un filtro de 405 nm.

Concentración del
antígeno P35 Dilución de la muestra
Tiempo de
lectura
1 µg / ml 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600
20 min
40 min
60 min
5 µg / ml 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600
20 min
40 min
60 min
10 µg / ml 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600
20 min
40 min
60 min
20 µg / ml 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600
20 min
40 min
60 min
Cuadro 4. Concentraciones del antígeno P35, diluciones de la muestra y tiempos
de incubación que se trabajaron en los ensayos de la estandarización del ELISA-
P35 en leche.

6.5.1 Determinación de punto de corte, sensibilidad, especificidad y
concordancia
El punto de corte se estableció con la media ± 2 desviaciones estándar, que
considera el cálculo sobre el promedio de los controles negativos más dos
desviaciones estándar de los negativos o bien el promedio de los controles
positivos menos dos desviaciones estándar de los positivos (Singh, 2006). La
sensibilidad, especificidad y los valores predictivos se calcularon con el software
MedCalc® con respecto a los resultados de la PCR IS900 y el cultivo fecal. Para
medir el nivel de concordancia entrepruebas se utilizó el coeficiente kappa de

Cohen con el programa en línea WinEpi 2.0©. La valoración del coeficiente kappa
propuesta por Landis y Koch (1997) se muestra en el cuadro 5.
Coeficiente kappa Fuerza de concordancia
0.00 Sin acuerdo
0.01 – 0.20 Leve
0.21 – 0.40 Aceptable
0.41 – 0.60 Moderado
0.61 – 0.81 Sustancial
0.81 – 1.0 Casi perfecta
Cuadro 5. Escala de valoración del coeficiente kappa.

6.6 Identificación de Map
6.6.1 Frotis a partir de heces
La detección de BAAR se hizo a partir de heces mediante la tinción de Ziehl-
Neelsen (Apéndice 2) y su posterior observación al microscopio.
6.6.2 Cultivo bacteriológico a partir de heces
El protocolo se realizó de acuerdo a lo descrito por Chávez-Gris (1993), con las
siguientes modificaciones descritas:
Se pesaron 2 g de heces y se colocaron en un tubos de fondo cónico de 50 ml, se
agregaron 38 ml de cloruro de N-cetilpiridinio (HCP) al 0.75 %, se homogenizó la
muestra y se dejó reposar durante una noche (18 h) hasta que el material más
grande sedimentó. Después se tomaron 10 ml de la fase intermedia y se colocaron
en tubos de 15 ml estériles. En un campo de esterilidad con mecheros, se inoculó

1 ml de la muestra tomada a partir del fondo del tubo con una pipeta de
transferencia en medio de cultivo Löwenstein-Jensen (Apéndice 3), 2 tubos con
micobactina y uno sin micobactina por muestra. Se flameó la tapa y la boca del
tubo de cultivo ya sembrado, se cerró el tubo sin apretar la tapa y se colocaron los
tubos en una posición inclinada en una incubadora a 37ºC ± 2ºC sin humedad,
esto por una semana o hasta que secara el inóculo. Una vez comprobado que se
evaporó la mayor cantidad de líquido, se cerraron los tubos completamente. Los
cultivos se revisaron cada semana hasta la semana 40 para verificar el desarrollo
de colonias compatibles con Map para posteriormente realizar frotis directo y PCR
IS900.
6.7 Extracción de ADN en muestras clínicas
6.7.1 Extracción de ADN micobacteriano a partir de heces
Se llevó acabo con la técnica descrita por Garrido (Garrido et al., 2000) con
algunas modificaciones. Se pesaron 2 g de heces y se disolvieron en 38 mL de
cloruro de N-cetylpilridinio (HCP) al 0.75%, se dejaron en reposo durante 18 horas.
Se transfirieron 10 ml a partir de la interfase a un tubo de 15 ml y se centrifugó
durante 10 min a 4500 rpm. Se descartó el sobrenadante y se suspendió la pastilla
obtenida en 5 ml de solución amortiguadora de fosfatos (PBS). De igual forma se
realizaron 2 lavados más con PBS. Posteriormente, se disolvió la pastilla en 2 ml
de PBS y se colocaron 1.5 ml en un tubo nuevo de 2 ml, se centrifugó a 14 000
rpm durante 5 min y se eliminó el sobrenadante. La pastilla obtenida se disolvió en
500 µl de TE-Tritón 100X (Tris 50 mM, EDTA 10 mM, pH 8; tritón 50 mM) y se
transfirió a un críotubo. La muestra se colocó a -80 ºC en nitrógeno durante 5 min

e inmediatamente después en calor seco a 100 °C por 5 min, este procedimiento
se repitió tres veces. Después, se agregaron 450 μL de isotiocinato de guanidina
(5M) más 250 μL de acetato de amonio (7.5 M pH 6.3) y se colocó en hielo
durante 15 min. Posteriormente se agregaron 500 μL de cloroformo-alcohol
isoamílico (24:1), se mezcló en vórtex durante 15 s y se centrifugó por 5 min a
14000 rpm. La fase acuosa obtenida se transfirió a un tubo nuevo y nuevamente
se agregaron 500 μL de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) repitiendo los pasos
anteriores hasta transferir la fase acuosa a un tubo nuevo. A la fase acuosa se le
agregaron 450 μL de isopropanol y se dejó reposar toda la noche (18 h) a -20 ºC.
Al día siguiente se centrifugó a 14 000 rpm durante 5 min y se eliminó el
sobrenadante. Después se realizaron dos lavados con 1 ml de etanol al 70 %, se
homogenizó y se centrifugó durante 1 min a 14 000 rpm desechando el
sobrenadante. La pastilla obtenida se dejó secar a temperatura ambiente y
después se suspendió en 30 µl de agua ultra pura. Una vez finalizada la
extracción de ADN se realizó una electroforesis para verificar la existencia de
material genético. Se colocaron 3 µl de ADN junto con 5 µl de solución
amortiguadora de carga en un gel de agarosa al 1% durante una hora a 80 volts.
El gel se tiñó en bromuro de etidio y se visualizó en un transiluminador de luz UV
UV Transilluminator (UVP). La presencia de bandas de alto peso molecular
sugiere que el ADN conserva su integridad. Una vez observado el ADN, las
muestras se colocaron en congelación a -20 ºC hasta su uso.

6.7.2 Extracción de ADN micobacteriano a partir de leche
Se realizó a partir de los sólidos obtenidos de la leche utilizando columnas
comerciales de membrana de sílica QiAmp® DNA Mini Kit (QIAGEN) siguiendo las
instrucciones del fabricante. Al finalizar el proceso de extracción, se llevó a cabo la
electroforesis de 3 µl de ADN con 5 µl de solución amortiguadora de carga en un
gel de agarosa al 1% durante una hora a 80 volts. Posteriormente el gel fue teñido
con bromuro de etidio y visualizado en un transiluminador de luz UV UV
Transilluminator (UVP). La presencia de bandas de alto peso molecular sugiere
que el ADN conserva su integridad. Una vez observado el ADN, las muestras se
colocaron en congelación a -20 ºC hasta su uso en PCR IS900.
6.7.3 Extracción de ADN micobacteriano a partir de leucocitos
Para la extracción de ADN se utilizaron columnas comerciales de membrana de
sílica EZ-10 Spin Column Genomic DNA Kit for Blood Samples (BIO BASIC, INC.)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Al finalizar el proceso de extracción, se
llevó a cabo la electroforesis de 3 µl de ADN con 5 µl de solución amortiguadora
de carga en un gel de agarosa al 1% durante una hora a 80 volts. Posteriormente
el gel fue teñido con bromuro de etidio y visualizado en un transiluminador de luz
UV UV Transilluminator (UVP). La presencia de bandas de alto peso molecular
sugiere que el ADN conserva su integridad. Una vez observado el ADN, las
muestras se colocaron en congelación a -20 ºC hasta su uso en PCR IS900.

6.8 Detección de Map por PCR IS900
6.8.1 Controles
Controles en PCR de leucocitos y leche. Como control positivo se utilizó ADN de
colonias de Map cultivadas a partir de macerado de intestino de un caso clínico
remitido a la USEDICO. La extracción de ADN se realizó mediante choque térmico
de acuerdo al protocolo usado en la USEDICO. En un campo de esterilidad con
mecheros, se tomó con un asa bacteriológica colonias de la superficie del medio
de cultivo y se transifieron por agitación a un microtubo de 0.6 ml con 100 µl de
agua ultra pura. El tubo se colocó en incubación a 100 ºC durante 20 minutos.
Después se centrifugó a 10 000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se
fraccionó en tubos nuevos identificados y se conservaron a -80 ºC hasta su uso.
El control negativo fue agua ultra pura para descartar la posibilidad de
contaminación cruzada.
Controles en PCR de heces. Se utilizó como control positivo una muestra de
heces de un caso remitido a la USEDICO de un ovino del CEIEPAA que resultó
positivo en frotis de heces teñido con Z-N y positivo por PCR IS900 de heces. La
extracción de ADN se realizó con la técnica descrita por Garrido (2000) El control
negativo fue agua ultra pura para descartar la posibilidad de contaminación
cruzada.
6.8.2 Iniciadores y condiciones de la PCR
Se emplearon los iniciadores designados como P3N (5’- GGG TGT GGC GTT
TTC CG-3’) y P5N (5’- ATT TCG CCG CCA CCG CCA CG-3’) (INVITROGEN) a
una concentración de 1 µM diseñados por Ayele (2005) y Fávila (2007).

La detección de la micobacteria en muestras de sangre, heces y leche se realizó a
partir de extracción de ADN empleando la prueba de PCR IS900 para la
amplificación de un fragmento de 314 pares de bases de la secuencia de inserción
900 utilizando untermociclador Hybaid Px2 Gradient Thermal Cycler (THERMO
ELECTRON) En cada serie de reacciones se incluyó un control positivo y un
control negativo. El contenido y las condiciones de cada reacción se especifican
en el cuadro 6.
Una vez finalizada la PCR IS900 se realizó una electroforesis en gel de agarosa al
1% con solución TAE colocando los productos de PCR así como un marcador
molecular de 100 pb [1 µg/µl] 100bp DNA Ladder (INVITROGEN) durante 1 hora
20 minutos a 80 volts. El gel fue teñido en bromuro de etidio durante 15 minutos
para la observación de productos de amplificación en un transiluminador de rayos
UV UV Transilluminator, UVP. Las muestras se consideraron positivas cuando se
observó un fragmento de amplificación de 314 pb.

Cuadro 6. Condiciones para realizar PCR. **Fast Start PCR Master ROCHE.

6.9 Detección de anticuerpos contra Map a partir de ELISA-P35
6.9.1 ELISA-P35 en plasma
Se empleó el método realizado por Castrellón (2012), descrito a continuación:
Sensibilización de microplacas. Se colocaron 100 µl del antígeno P35 a una
concentración de 20 µg/ml en cada pozo y se dejaron reposar 24 horas a
temperatura ambiente (TA).
Condiciones de la PCR para el diagnóstico de paratuberculosis
Secuencia de inserción IS900
Iniciador sentido P5N: 5’-ATT TCG CCG CCA CCG CCA CG-3’
Iniciador contrasentido P3N: 5'-GGG TGT GGC GTT TTC CTT CG-3'
Fragmento amplificado 310 pb
Mezcla para PCR
Mezcla para PCR** 20 µl
Iniciador P5N 1 µl [1 µMol]
Iniciador P3N 1 µl [1 µMol]
ADN de leucocitos ó 3 µl
ADN de leche / heces 10 µl
Condiciones
Etapa Ciclos Temperatura Tiempo
Desnaturalización
inicial

1 94 ºC 5 min
Desnaturalización 94 ºC 40 s
Alineamiento 35 55 ºC 40 s
Extensión 72 ºC 40 s
Extensión final 1 72 ºC 5 min

Bloqueo. Las placas se lavaron tres veces con 200 µl de PBS-Tween 20 al 0.1%
en el lavador automático de microplacas H Washer 1, HLAB. Se bloquearon con
150 µl de PBS-Gelatina al 1% por pozo, se incubaron durante hora y media a TA y
se lavaron tres veces con 200 µl de PBS-Tween 20 al 0.1%.
Dilución de las muestras. Se realizó una dilución 1/1600 tanto de las muestras
como de los controles. Se colocaron 100 µl de la dilución por pozo de forma
pareada en la placa dejando incubar durante hora y media a TA para después
lavar las placas tres veces con 200 µl de PBS-Tween 20 al 0.1%.
Dilución del anticuerpo conjugado. Se realizó una dilución 1/1000 del anticuerpo
conjugado (anti- IgG de cabra conjugado a peroxidasa de rábano) (Rabbit Anti-
Goat IgG Conjugate) (INVITROGEN). Se agregaron 100 µl de la dilución por pozo
y se dejó incubar durante hora y media a TA. Las placas se lavaron tres veces con
200 µl por pozo de PBS-Tween 20 al 0.1%. Posteriormente se realizaron dos
lavados adicionales con 200 µl de PBS para quitar cualquier residuo.
Revelado de microplacas. Se preparó la solución de revelado mezclando 0.0054
mg de ABTS con 38 µl de solución 1/25 de peróxido de hidrógeno en 50 ml de
solución amortiguadora de citratos 0.05 M (Apéndice 1). Se agregaron 100 µl de la
solución de revelado en cada pozo y la placa se incubó durante 40 minutos a TA.
La lectura del valor de absorbancia se realizó en un espectofotómetro de ocho
canales ELx 800 (BIO-TEK) usando un filtro de 405 nm. Se consideraron positivas
las muestras cuyo valor de absorbancia fue igual o mayor a 0.64 (Castrellón,
2012).

6.9.2 ELISA-P35 en leche
Sensibilización de microplacas. Se colocaron 100 µl del antígeno P35 a una
concentración de 10 µg/ml en cada pozo y se dejaron reposar por 24 horas a TA.
Bloqueo. Las placas se lavaron tres veces con 200 µl de PBS-Tween 20 al 0.1%
en el lavador automático de microplacas HLAB H Washer. A cada pozo se
agregaron 150 µl de PBS-Gelatina al 1% y se incubaron durante hora y media a
TA. Posteriormente, se lavaron tres veces con 200 µl de PBS-Tween 20 al 0.1%.
Dilución de las muestras. Se realizó una dilución 1/100 de las muestras y de los
controles. Se colocaron 100 µl de la dilución por pozo de forma pareada en la
placa y se incubó durante hora y media a TA. Las placas se lavaron tres veces con
200 µl de PBS-Tween 20 al 0.1%.
Dilución del anticuerpo conjugado. Se realizó una dilución 1/1000 del anticuerpo
conjugado (anti- IgG de cabra conjugado a peroxidasa de rábano) (Rabbit Anti-
Goat IgG Conjugate) (INVITROGEN). Se agregaron 100 µl de la dilución por pozo
y se incubó durante hora y media a TA. Las placas se lavaron tres veces con 200
µl por pozo de PBS-Tween 20 al 0.1%, Posteriormente se lavaron dos veces más
con 200 µl para quitar cualquier residuo.
Revelado de microplacas. Se preparó la solución de revelado mezclando 0.0054
mg de ABTS con 38 µl de solución 1/25 de peróxido de hidrógeno en 50 ml de
solución amortiguadora de citratos 0.05 M (Apéndice 1).Se agregaron 100 µl de la
solución por pozo y se incubó durante 60 minutos a TA.

Lectura. La lectura del valor de absorbancia se realizó en un espectofotómetro de
ocho canales ELx-800 (BIO-TEK) usando un filtro de 405 nm. Las muestras se
consideraron positivas cuando su valor de absorbancia fue igual o mayor a 0.40.
7. RESULTADOS
7.1 Estandarización ELISA-P35 en leche
La mayor diferencia de densidad óptica entre los controles positivos y negativos
correspondió a una concentración del antígeno P35 de 10 µg/ml, una dilución de la
muestra de 1:100 y un tiempo de incubación para la lectura de la placa de 60
minutos.
7.2 Determinación de punto de corte, sensibilidad y especificidad
El punto de corte se estableció promediando los valores de los controles positivos
y negativos y obteniendo la desviación estándar de cada uno. Para los controles
positivos se obtuvo un valor de 0.49 y una desviación estándar de 0.046; para las
controles negativos se obtuvo un valor de 0.13 y una desviación estándar de
0.037. Al promedio de los controles positivos se restaron dos desviaciones
estándar quedando como punto de corte un valor de 0.40. Todo resultado que
presentó un valor mayor a 0.40 se consideró positivo (Cuadro 7).

Controles
Promedio
densidad
óptica
Desviación
estándar
2
Desviaciones
Estándar
Intervalo
Positivos 0.49 0.046 0.09 0.40 – 0.58
Negativos 0.13 0.037 0.07 0.05 – 0.20
Cuadro 7. Valores de los controles positivos y negativos para determinar el punto
de corte de la prueba. Los intervalos son el resultado del promedio de los
controles tanto positivo como negativo restando dos desviaciones estándar y
sumando dos desviaciones estándar.

Condición PCR IS900 ó cultivo fecal (+)
PCR IS900 ó
cultivo fecal (-) Total
ELISA-P35
leche (+) 9 68 77
ELISA-P35
leche (-) 4 62 66
Total 13 130 143
Cuadro 8. Resultados de ELISA-P35 en leche. Número total de muestras y
número total de positivos y negativos.

El nivel de concordancia entre las pruebas fue κ= 0.053, es decir el ELISA-P35 en
leche tiene una concordancia leve respecto a la PCR y al cultivo fecal. De los
animales considerados como positivos (n=13), 9 fueron positivos a ELISA-P35 en
leche y de los animales que se consideraron como negativos (n=130), 68 fueron
positivos a ELISA-P35 en leche, obteniendo como resultado una sensibilidad del
69.23 % y una especificidad del 47.69 % (Cuadro 9).

Criterio Porcentaje
Sensibilidad 69.23 %
Especificidad 47.69 %
Valor predictivo positivo 11.69 %
Valor predictivo negativo 93.94 %
Coeficiente kappa 0.053
Cuadro 9. Evaluación de ELISA-P35 en leche. Sensibilidad, especificidad, valores
predictivos positivo y negativo y coeficiente kappa.

7.1 Frotis a partir de heces
Del rebaño A se realizaron un total de 84 tinciones Z-N a partir de heces para la
detección de BAAR, en ningún frotis se observó un resultado positivo.
Del rebaño B se realizaron 59 tinciones Z-N a partir de heces para la detecciónde
BAAR, en ningún frotis se observó un resultado positivo.
7.2 Cultivo bacteriológico a partir de heces
Hasta las 36 semanas de incubación se observó desarrollo de colonias
compatibles con Map en dos cultivos (Figura 2), uno del rebaño A y uno del
rebaño B, los cuales se confirmaron realizando frotis directo teñido con Z-N
(Figura 3).

Figura 2. Imagen A: Medio de cultivo Löwenstein-Jensen con micobactina a las 36
semanas de incubación, con las flechas amarillas se señalan las colonias
compatibles con Map a partir de muestras fecales. Imagen B: Resiembra de las
colonias observadas en la imagen A en medio de cultivo LJ con micobactina a las
10 semanas de incubación, con las flechas rojas se señala las colonias
compatibles con Map a partir de muestras fecales.

Figura 3. Frotis directo a partir de cultivo. Se observan BAAR
sugerentes a Map, tinción Zielh-Neelsen 1000 aumentos.

7.3 PCR IS900 a partir de heces
Del total de las muestras trabajadas, en ninguna se obtuvo un resultado positivo.
7.4 PCR IS900 a partir de leche
De un total de 84 muestras del rebaño A, ninguna resultó positiva a Map.
En el rebaño B, de un total de 59 muestras, 6 (10%) mostraron resultado positivo
una banda de 314 pb (Figura 2). Las identificaciones de los animales positivos se
muestran en el siguiente cuadro.
Carril Identificación
1 Mpm 50 pb
2 2424
3 2448
4 2450
5 2464
6 2483
7 3292
Figura 4. Productos de PCR IS900 en leche. Gel de agarosa al 1.5 %.
En el carril 1 se observa el marcador de peso molecular de 50 pb. En los
carriles identificados del 1 al 6 se muestran bandas de 314 pb indicando
resultado positivo. En el carril 7, se observa el control negativo C- (agua
destilada) y el carril 8 corresponde a control positivo C+ (ADN de
colonias de Map).

7.5 PCR IS900 a partir de leucocitos
Del total de las muestras del rebaño A, en ninguna se detectó a Map en sangre.
En el rebaño B, de un total de 59 muestras, 5 (8.33%) resultaron positivas por
PCR IS900 en sangre.
Carril Identificación
1 Mpm 50 pb
2 2422
3 2439
4 2472
5 2474
6 5392
Figura 5. Productos de PCR IS900 en leucocitos. Gel de agarosa al 1.5
%. En el carril 1 se observa el marcador de peso molecular de 50 pb. En
los carriles 2 al 6 se observan bandas de 314 pb indicando resultado
positivo. En el carril 7 se observa el control negativo C- (agua destilada)
y el carril 8 corresponde al control positivo C+ (ADN de colonias de
Map).

7.6 ELISA-P35 en plasma
El rebaño A, obtuvo una seroprevalencia del 50% detectando a 42 animales
positivos de un total de 84; mientras que la seroprevalencia del rebaño B fue de
32.2% con 19 resultados positivos de un total de 59 animales.
7.7 ELISA-P35 en leche
El rebaño A resultó positivo a la presencia de anticuerpos en leche contra de Map
en un 45.23 %. El rebaño B resultó positivo en un 66.10 %.

Los resultados de todas las pruebas diagnósticas realizadas en ambos rebaños se
muestran en el cuadro 10.
Rebaño A
n= 84
Rebaño B
n= 59
Prueba Positivos Negativos %Positivos Positivos Negativos %Positivos
ELISA suero 42 42 50 % 19 40 32.2 %
ELISA leche 38 46 45.23 % 39 20 66.10 %
PCR sangre 0 84 0 % 5 54 8.47 %
PCR leche 0 84 0 % 6 53 10.16 %
PCR heces 0 84 0 % 0 59 0 %
Tinción Z-N 0 0 0 % 0 0 0 %
Cultivo fecal 1 84 1.19 % 1 0 1.69 %
Cuadro 10. Resultados de los dos rebaños y su porcentaje de positividad en
diferentes pruebas diagnósticas.

Los animales con resultados positivos en PCR IS900 ó cultivo fecal y sus
resultados en las demás pruebas se muestran en el cuadro 11.

Identificación
Cultivo
fecal
PCR
sangre
PCR
leche
ELISA
suero
ELISA
leche
A172 + - - + +
2422 - + - - +
2424 - - + + -
2439 - + - - +
2445 + - - + +
2448 - - + - -
2450 - - + - -
2464 - - + - +
2472 - + - - +
2474 - + - - +
2483 - - + - -
3292 - - + - +
5392 - + - - +
Cuadro 11. Animales positivos por PCR IS900 y/o cultivo fecal, y sus resultados
obtenidos en el ELISA-P35 de plasma y leche.
8. DISCUSIÓN
Los resultados del presente estudio demuestran que es posible detectar
anticuerpos en contra de Map usando la prueba de ELISA en leche de cabra tal y
como ha sido descrito por diversos autores (Sweeney et al., 1994; Nielsen et al.,
2002; Winterhoff et al., 2002; Munjal et al., 2004; Salgado et al., 2005; Salgado et
al, 2007; Kumar et al., 2008; Laurin et al., 2016).
En este estudio, de un total de 143 cabras, 66.43 % (95/143) fueron positivas por
ELISA-P35 en suero, mientras que un 53.84 % (77/143) resultaron positivas por
ELISA-P35 en leche. La seroprevalencia y lactoprevalencia son parecidas a las de

diversos estudios en cuanto a que se detecta una mayor prevalencia en muestras
de suero que en muestras de leche según lo descrito por Ngu y colaboradores en
2016, quienes al emplear un ELISA comercial en ovinos describieron prevalencias
de 7.75 % en suero y 5.31 % en leche; y con lo descrito por Hendrick y
colaboradores en 2005 que obtuvieron prevalencias de 18.9 % y 11.1 % en suero
y leche respectivamente usando un ELISA comercial en bovinos. Los resultados
de los experimentos anteriores, indican que al emplearse el mismo antígeno para
ambos ensayos los resultados son similares de acuerdo a lo descrito por varios
autores tanto en caprinos, ovinos y bovinos (Sweeney et al., 1994; Winterhoff et
al., 2002; Lombard et al., 2006; Salgado et al., 2007; Ngu et al., 2016). Es de
destacar que las prevalencias detectadas a través de ELISA tanto en suero como
en leche, pueden variar según la etapa de lactancia en que se encuentren los
animales muestreados. Se ha observado que en animales que se encuentran al
inicio y al final de la lactancia, la prevalencia con ELISA en leche tiende a ser
mayor que la detectada con ELISA en suero; por el contrario, en la parte media de
la lactancia la prevalencia en suero resulta ser mayor que en leche. Se sugiere
que lo anterior, se debe a una exigencia de IgG por transporte pasivo del suero a
la leche debido a la transferencia de anticuerpos para generar una mayor
protección a la cría al inicio de la lactancia (Lombard et al., 2006). A medida de
que la producción láctea aumenta, las IgG que se secretan en leche tienen más
probabilidad de diluirse en un mayor volumen de leche, por lo tanto, la proporción
de animales positivos por ELISA en leche es menor en la parte media de la
lactancia. Al final de lactancia cuando el pico de producción declina y el efecto de
dilución ya ha pasado, nuevamente se detecta una mayor proporción de IgG en

leche que en suero (Nielsen et al., 2002; Lombard et al., 2006; Ngu et al., 2016).
De acuerdo a los resultados obtenidos, es posible que en el momento de la toma
de muestras, los animales se encontraran en la etapa media de la lactación debido
a que se obtuvo un mayor número de animales positivos en suero que en leche,
sin embargo esto no se pudo comprobar debido a que no se tuvo acceso a los
registros de los animales.
El índice de concordancia kappa permitió comparar el ELISA-P35 en leche con la
prueba de oro (cultivo fecal y PCR). Otros estudios han empleado este método
para evaluar y comparar pruebas diagnósticas: Salgado (Salgado et al., 2005)
comparó por un lado un ELISA comercial en suero contra el cultivo fecal que es la
“prueba de oro” obteniendo un valor kappa de 0.425 y por otro lado un ELISA
comercial en leche contra el cultivo fecal donde obtuvo un valor kappa de 0.525,
ambos valores indican una concordancia moderada entre las pruebas. En otro
estudio (Lombard et al., 2006) se analizaron un total de 6349 muestras para
comparar un ELISA en leche contra un ELISA en suero obteniendo un índice de
concordancia de 0.50. Finalmente Ngu (Ngu et al., 2016) comparó igualmente