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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS LA PIROFOSFATASA INORGÁNICA SOLUBLE DE CLOROPLASTOS DE PLANTAS SUPERIORES: ESTUDIO CINÉTICO Y MODELADO DE SU ESTRUCTURA TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: MAESTRO EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS PRESENTA Q. SAMANTHA A. GAYTÁN MONDRAGÓN TUTOR PRINCIPAL DR. ROGELIO RODRÍGUEZ SOTRES FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR DRA. ADELA RODRÍGUEZ ROMERO INSTITUTO DE QUÍMICA, UNAM DR. FELIPE CRUZ GARCÍA FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM MÉXICO, D.F. AGOSTO 2013 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Jurado asignado La presente tesis fue realizada en la Universidad Nacional Autónoma de México, en el laboratorio 115 del Departamento de Bioquímica de la Facultad de Química, dentro del marco del Programa de Maestría en Ciencias Bioquímicas de la misma institución. El comité tutor estuvo conformado por los tutores: Tutor principal y director de la tesis: Dr. Rogelio Rodríguez Sotres (FQ, UNAM). Tutora: Dra. Adela Rodríguez Romero (IQ, UNAM). Tutor: Dr. Felipe Cruz García (FQ, UNAM). El jurado designado por el Comité Académico del Programa está integrado por los sinodales siguientes: Presidente: Dra. Georgina Garza-Ramos Martínez Vocal: Dr. Ismael Bustos Jaimes Vocal: Dra. Lilian González Segura Vocal: Dr. Alejandro Sosa Peinado Secretario: Dr. Enrique Rudiño Piñeira El desarrollo de este trabajo fue apoyado por una beca de posgrado de CONACyT, por el proyecto de CONACyT CB-2008-101186, por los proyectos de PAPIIT-DGAPA-UNAM IN210909 e IN210212 y parcialmente con el apoyo del PAIP-FQ 4290-09. Agradecimientos Quiero agradecer: A la Universidad Nacional Autónoma de México, institución que me formó académicamente y que me ha permitido desarrollarme y crecer en todos los aspectos posibles. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca que me fue otorgada durante la realización de mis estudios de maestría. Al Dr. Rogelio Rodríguez Sotres por su tutoría, ayuda y valiosos consejos. A los miembros de mi comité tutoral, la Dra. Adela Rodríguez Romero y el Dr. Felipe Cruz García, por su asesoría e ideas vertidas durante el desarrollo de este proyecto. Al M. en C. Carlos Mújica, la Dra. Fátima Barreda, y el Dr. Ángel Díaz, por sus invaluables recomendaciones tanto académicas como personales, pero sobre todo por mostrarme siempre su amistad. Todo mi respeto y gratitud. A la Dra. Patricia Coello, el Dr. Rodrigo Guémez y la M. en C. Sara Garza por el apoyo que recibí de su parte durante mi estancia en el Conjunto E. A mis sinodales, por contribuir a mi formación y por sus apreciables comentarios. A Leticia García Gutiérrez, por su disposición y eficiencia inigualables. A mi querida amiga la D.G. Beatriz Camacho, por su contribución y esmero en el mejoramiento de la calidad visual y el diseño de esta tesis. Al M. en C. Óscar González por enriquecer con sus comentarios la discusión de mis resultados. A los Biol. Amalinalli Mejía Góchez y Luis Alberto Herrera Navas, la M. en C. Viridiana Luna Loaiza, el Dr. Félix Morales y la Q.A. Alejandra Alcázar por su agradable compañerismo y estoicismo. A Joel Basilio Velázquez y Alicia, porque sin su ayuda y amistad no podría haber completado los objetivos planteados en este trabajo. A mi familia y todos mis adorados perritos: Chattan, Mermelada, Cajeta, Mustafá, Lutecia, Tantalio, Patrañas y Caesar. A mis amigos. A David. “The World is indeed full of peril, and in it there are many dark places; but still there is much that is fair, and though in all lands love is now mingled with grief, it still grows perhaps the greater.” Haldir of Lothlórien J.R.R. Tolkien “You know a conjurer gets no credit when once he has explained his trick; and if I show you too much of my method of working, you will come to the conclusion that I am a very ordinary individual after all.” Sherlock Holmes Sir Arthur Conan Doyle 1 Abreviaturas aa Residuos de aminoácido ADN Ácido desoxirribonucleico ADPG Glucosa adenosín difosfato AMP Monofosfato de adenosina ARN Ácido ribonucleico ATP Trifosfato de adenosina AtPPiasa1 Pirofosfatasa inorgánica soluble de Arabidopsis thaliana isoforma 1 AtPPiasa4 Pirofosfatasa inorgánica soluble de Arabidopsis thaliana isoforma 4 AtPPiasa6 Pirofosfatasa inorgánica soluble de Arabidopsis thaliana isoforma 6 AtPPiasas Pirofosfatasas inorgánicas solubles de Arabidopsis thaliana bp Pares de bases BSA Albúmina sérica bovina cADN Ácido desoxirribonucleico complementario CRX Cristalografía de rayos X DC Dicroismo circular dNTPs Desoxiribonucleótidos trifosfatados dsADN Ácido desoxirribonucleico de doble hebra EcPPiasa Pirofosfatasa inorgánica de Escherichia coli EK Enterocinasa ER Equilibrio rápido ES Estado estacionario F26DF Fructosa-2,6-difosfato Fw Forward (oligonucleótido 5’-3’) GTP Trifosfato de guanosina H+-PPiasa Pirofosfotasas inorgánicas translocadoras de protones HADSF Superfamilia de proteínas de haloalcanoato deshalogenasa 2 HMM Hidden Markov Models (modelos ocultos de Markov) IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido MD Dinámica molecular NADP Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NDP Nucleótidos difosfatados NMP Nucleótidos monofosfatados NTP Nucleótidos trifosfatados PCR Polymerase chain reaction PDB Protein Data Bank PFK Fosfofructocinasa PFP Fructosa-6-fosfato 1-fosfotransferasa pI Punto isoeléctrico Pi Ortofosfato ó fósforo inorgánico PPDK Piruvato ortofosfato dicinasa PPi Pirofosfato inorgánico PPiasas Pirofosfatasas inorgánicas PvPPiasa6 Pirofosfatasa inorgánica soluble de Phaseolus vulgaris isoforma 6 Rd.HMM Rosetta design HMMer RMSD Desviación cuadrática media Rv Reverse (oligonucleótido 3’-5’) ScPPiasa Pirofosfatasa inorgánica de Saccharomyces cerevisiae SiPPiasas Pirofosfatasas inorgánicas solubles TrxA Tioredoxina A UDP Difosfato de uridina UDPG Glucosa uridin difosfato UTP Trifosfato de uridina UV Radiación ultravioleta WT Wild type X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido 3 Índice 1. Introducción 2 1.1 Pirofosfato inorgánico 2 1.2 Metabolismo de PPi 4 1.3 Pirofosfatasas inorgánicas 10 1.4 Pirofosfatasas inorgánicas asociadas a membranas 10 1.5 Pirofosfatasas inorgánicas solubles 12 1.5.1 Características estructurales de las siPPiasas de la Familia I 15 1.5.2 Características del sitio activo de las siPPiasas 18 2. Antecedentes 21 2.1 Pirofosfatasas inorgánicas solubles de plantas superiores 21 3. Justificación 23 4. Hipótesis 23 5. Objetivo General 24 5.1 Objetivos particulares 24 6. Metodología experimental 25 6.1 Material biológico 25 6.2Extracción de ARN total 25 6.3 Transcripción reversa y síntesis de cADN 26 6.4 Diseño de oligonucleótidos específicos y amplificación por PCR 26 6.5 Reacción de ligación del producto de PCR 27 6.6 Digestión de ADN plasmídico con endonucleasas de restricción 28 6.7 Electroforesis en agarosa para ácidos nucleicos 29 6.8 Purificación de ADN a partir de un gel de agarosa 29 6.9 Extracción y purificación de ADN plasmídico 30 6.10 Transformación bacteriana en células competentes 30 6.11 Ensayos de inducción de la expresión con IPTG 31 4 6.12 Cuantificación de proteína 32 6.13 Electroforesis SDS-PAGE 32 6.14 Tinción de geles de poliacrilamida 33 6.15 Purificación de proteína recombinante con Protino® Ni (II)-TED y proteólisis con enterocinasa 33 6.16 Medición de la actividad de pirofosfatasa 35 6.17 Ensayos cinéticos: Isotermas de activación por Mg (II) 36 6.18 Ensayos de espectroscopia de fluorescencia 37 7. Resultados 38 7.1 Clonación de la isoforma 6 de la AtPPiasa6 38 7.2 Expresión y purificación de la AtPPiasa6 recombinante 42 7.3 Fluorescencia de la AtPPiasa6 pura 51 7.4 Ensayos cinéticos: isotermas de saturación por Mg (II) de la AtPPiasa6 54 8. Metodología in silico 64 8.1 Modelado y dinámica molecular 64 8.2 “Docking” o acoplamiento molecular empleando AutoDock 67 8. 3 Programas adicionales 68 9. Resultados in silico 70 9.1 Parte I 70 9.2 Parte II 80 9.3 Parte III 91 10. Conclusiones 100 11. Comentarios adicionales 102 12. Referencias 103 5 Índice de figuras y tablas Figura 1. Hidrólisis de PPi. 4 Esquema 1. Reacciones del metabolismo energético de células de plantas fotosintéticas. 9 Figura 2. Representación de la estructura cristalográfica de la pirofosfatasa inorgánica putativa BT2127 de Bacteroides thetaiotaomicron. 11 Figura 3. Representación de la estructura cristalográfica del dímero de la pirofosfatasa vacuolar de protones. 12 Figura 4. Estructuras cristalográficas de las pirofosfatasas inorgánicas solubles de la Familia I. 14 Figura 5. Representación de la estructura cristalográfica del dímero de la pirofosfatasa inorgánica soluble de Streptococcus mutans. 15 Figura 6. Diagrama topológico de la ScPPiasa. 16 Figura 7. Traslape estructural de los residuos del sitio activo de la PPiasa de Escherichia coli y la PPiasa de la Familia II de Streptococcus mutans. 17 Figura 8. Superposición estructural de los residuos del sitio activo de la PPiasa de Escherichia coli y la PPiasa de Saccharomyces cerevisiae. 17 Figura 9. Representación 2D de la PPiasa de Escherichia coli en complejo con PPi y con F- como inhibidor. 19 Figura 10. Mecanismo de seis estados de la pirofosfatasa inorgánica de levadura. 20 Tabla I. Composición de la mezcla de reacción empleada para la síntesis de cADN. 26 Tabla II. Componentes de la mezcla de reacción de PCR empleada para la amplificación del marco de lectura abierta del gen codificante de la AtPPiasa6. 27 Tabla III. Componentes de la mezcla de reacción para la ligación de los productos de PCR a pGEM-T Easy. 27 Tabla IV. Componentes de la mezcla de reacción para la ligación del gen codificante de la AtPPiasa6 en el vector pEt32a(+)a. 28 Tabla V. Digestión doble del vector pGEM T-Easy ligado al gen que codifica a la AtPPiasa6 con NotI y BamHI. 28 Tabla VI. Digestión doble del vector pEt32a(+)a ligado al gen que codifica a la AtPPiasa6 con las endonucleasas de restricción NotI y BamHI. 28 Tabla VII. Composición del amortiguador de trabajo usado para la extracción de proteína soluble. 31 Tabla VIII. Constantes de estabilidad global. 36 Figura 11. Resultado de la amplificación por PCR del gen que codifica a la proteína AtPPiasa6. 39 Figura 12. Digestión del vector pGEM T-Easy ligado al inserto que codifica a la AtPPiasa6. 40 Figura 13. Digestión doble del vector pEt32a(+) ligado al gen que codifica a la AtPPiasa6. 41 Figura 14. Amplificación del gen que codifica a la AtPPiasa6 en la colonia At6Col4S2. 42 6 Figura 15. Inducción de la expresión de la pirofosfatasa inorgánica 6 (At6Col4S2). 43 Figura 16. Purificación de la AtPPiasa6 con Ni (II)-TED. 45 Figura 17. Proteólisis de la AtPPiasa6 con enterocinasa. 46 Figura 18. Esquema de la construcción At6Col4S2. 47 Figura 19. Segundo paso de purificación empleando la resina Ni (II)-TED. 48 Figura 20. Secuencia de aminoácidos de la isoforma 6 de la pirofosfatasa inorgánica soluble AtPPiasa6 y composición porcentual de aminoácidos de la misma. 49 Tabla IX. Cálculo de parámetros físicos y químicos empleando la herramienta ProtParam. 50 Figura 21. Espectros de emisión y excitación de fluorescencia. 53 Esquema 2. Ecuación de sistemas BiBi ordenados. 54 Esquema 3. Mecanismo cinético propuesto 57 Gráfica 1. Rapidez de la reacción de hidrólisis del PPi contra la concentración del sustrato MgPPi2- y ajuste por regresión no lineal, unión de MgPPi2- primero. 58 Tabla X. Parámetros cinéticos finales calculados por el ajuste por regresión no lineal al mecanismo Bi Bi ordenado en condiciones de equilibrio rápido, cuando el sustrato MgPPi2- se une primero. 58 Gráfica 2. Rapidez de la reacción de hidrólisis del PPi contra la concentración del sustrato MgPPi2- y ajuste por regresión no lineal, unión de Mg (II) primero. 59 Tabla XI. Parámetros cinéticos finales calculados por el ajuste por regresión no lineal al mecanismo Bi Bi ordenado en condiciones de equilibrio rápido, cuando el sustrato Mg (II) se une primero. 59 Gráfica 3. Rapidez de la reacción de hidrólisis del PPi contra la concentración del sustrato MgPPi2- y ajuste por regresión no lineal, unión de Mg (II) ó MgPPi2- al azar. 60 Tabla XII. Parámetros cinéticos finales calculados por el ajuste por regresión no lineal al mecanismo Bi Bi ordenado en condiciones de equilibrio rápido, cuando el sustrato Mg(II) ó MgPPi2- se une al azar. 60 Gráfica 4. Isoterma de saturación de la proteína con AtPPiasa6-Trx a dos concentraciones del activador Mg (II) y que corresponde a 3.0 mM de MgCl2. 63 Tabla XIII. Parámetros cinéticos calculados con el ajuste a la ecuación de Michaelis-Menten de la proteína de fusión AtPPiasa6-TrxA. 63 Tabla XIV. Calificación y significancia de las siPPiasas de Arabidopsis thaliana obtenidos con Rd.HMM. 65 Figura 22. Modelos finales de AtPPiasa1 y AtPPiasa4 sometidas a MD en presencia de NaCl y MgCl2. 70 Figura 23. Interacciones de los confórmeros en el docking de PvPPiasa6. 72 Tabla XV. Parámetros relevantes incluidos en al archivo de extensión mdp. 73 Figura 24. Estructura 3D de la PvPPiasa6 antes y después de la simulación de 5ns de MD. 74 Figura 25. Alineamiento estructural generado por MultiSeq de la estructura tridimensional del dímero de la siPPiasa de Saccharomyces cerevisiae (2IHP) y en rojo estructura del confórmero final de PvPPiasa6. 75 7 Figura 26. Alineamiento estructural por MultiSeq de la estructura tridimensional de la cadena A del trímero de Pyrococcus horikoshii (IUDE), y en violeta estructura del confórmero final de PvPPiasa6. 75 Figura 27. Estructura tridimensional de la estructura inicial de la proteína AtPPiasa6 (izquierda), y estructura del confórmero rescatado tras 80 ns de simulación (derecha). 76 Figura 28. Alineamiento estructural por MultiSeq del dímero de siPPiasa y la AtPPiasa6. 78 Figura 29. Alineamiento estructural por MultiSeq de la cadena A del trímero de Pyrococcus horikoshii y la estructura refinada de AtPPiasa6. 79 Tabla XVI. Valores de RMSD del alineamientoestructural calculado por TOPOFIT. 79 Figura 30. Superficie de potencial del complejo Mg4PPi, indicando las distancias de enlace entre cationes de Mg (II) y oxígenos del PPi. 80 Figura 31. Clúster de menor energía de enlace mostrando las interacciones entre el complejo Mg4PPi y algunos residuos de aminoácidos del sitio activo putativo en la AtPPiasa6. 82 Figura 32. Clúster alternativo de menor energía de enlace mostrando las interacciones entre el complejo Mg4PPi y algunos residuos de aminoácidos del sitio activo putativo en la AtPPiasa6. 83 Figura 33. Clúster de menor energía de enlace mostrando las interacciones entre el complejo Mg4PPi y algunos residuos de aminoácidos del sitio activo putativo en la PvPPiasa6. 84 Figura 34. Complejos Enzima-Sustrato entre AtPPiasa6, y PvPPiasa6. 85 Figura 35. Energía total del sistema de la PvPPiasa6 en H2O y la energía del subsistema proteína-Mg2+, que incluye a los 4 cationes enlazados al PPi. 86 Figura 36. Gráficos de RMSD. Izquierda: RMSD del backbone de la proteína PvPPiasa6. Derecha: RMSD relativo a los 4 átomos de Mg2+ del sistema. 87 Figura 37. Radio de giro de la PvPPiasa6. 88 Figura 38. Gráfico de energía total con variaciones en 5 ns de MD. 89 Figura 39. Gráfico de RMSD del backbone de la proteína AtPPiasa6 durante 5 ns de MD. 90 Figura 40. Gráfico de RMSF y radio de giro para AtPPiasa6. 90 Tabla XVII. Calificaciones generadas por el protocolo Rd.HMM de los confórmeros finales relajados de la AtPPiasa6 y PvPPiasa6. 91 Figura 41. Geometrías usuales de los complejos de Mg (II) encontrados en los confórmeros finales de AtPPiasa6 y PvPPiasa6. 92 Tabla XVIII. Alineamiento estructural de la estructura tridimensional de la cadena A del dímero de la siPPiasa de Saccharomyces cerevisiae con la PvPPiasa6 y la AtPPiasa6. 92 Figura 42. Alineamiento estructural entre modelo AtPPiasa6 y la PvPPiasa6. 93 Figura 43. Estructuras 3D de los confórmeros de la AtPPiasa6 y PvPPiasa6 en presencia del ligante Mg4PPi. 94 Figura 44. Superficie hidrofóbica de las AtPPiasa6 y PvPPiasa6 en la región de interacción del sustrato. 97 Figura 45. Geometrías del centro metálico Mg (II) en el sitio activo de la AtPPiasa6 y la PvPPiasa6. 99 Abstract Inorganic pyrophosphatases or pyrophosphate hydrolases (PPases) (EC 3.6.1.1) catalyze the irreversible hydrolysis of the phosphoanhydride bond on inorganic pyrophosphate providing the thermodynamic drive for many metabolic reactions in the cell. PPases are divided in two major groups: soluble inorganic pyrophosphatases and membrane associated pyrophosphatases. These enzymes do not form phosphorylated intermediaries during catalysis. Soluble inorganic pyrophosphatases (siPPases) are ubiquitous metal dependent proteins and are found in all three phylogenetic domains. At present, two non-homologous families of siPPases are known: Family I Mg (II)- dependent, and Family II Mn (II)-dependent siPPases. Their primary sequences and tridimensional structures are known to be completely different, but there is a degree of conservation of architecture at the active site between Family I and Family II, so these are considered as one of the best examples of evolutionary convergence. Family I of siPPases comprises Prokaryotic enzymes, whose prototype is the homohexameric protein of Escherichia coli, but also by Eukaryotic proteins, and the best studied enzyme is the Saccharomyces cerevisiae homodimeric siPPase. Sequence alignment of the EcPPase and ScPPase shows only 22-28% identity depending on the type of alignment used. The tridimensional structure of the Family I siPPases include an overall fold that corresponds to a distorted β barrel structure, constituted by 5 strands, flanked by 2 α helixes. In Plants, siPPases were first documented in 1970, however, to date a complete characterization has not been made. In A. thaliana six isoforms are reported, similar in length, molecular weight and isoelectric point, details that complicate their separation by conventional techniques. Kinetic studies had proved plant inorganic PPases to be Mg (II)-dependent and recent reports indicate a high PPi specificity. About 80% of the PPase activity in plant tissues is localized in the chloroplast, despite the fact that most PPases appear to be cytoplasmic. The chloroplastic subcellular localization of the AtPPase6 is due to the presence of a small N-terminal peptide. AtPPase6 has been grouped within Family I Eukaryotic enzymes because it shows a higher degree of identity to yeast PPase than to the other cytoplasmic Arabidopsis isoforms, which in turn, are more similar to the Prokaryotic siPPases. In our laboratory, we characterized the kinetic profiles and Ca (II) inhibition of two isoforms of Arabidopsis thaliana, the AtPPiase1 and AtPPiase4, and we have established that both proteins are obligate monomers. In this work, the recombinant siPPase AtPPase6 was cloned and expressed in order to perform its kinetic and spectroscopic characterization. The Mg (II) saturation kinetics in presence of PPi indicated that the binding of MgPPi2- complex occurs before the Mg (II) enters the active site. This enzyme showed about one order of magnitude higher catalytic constants in comparison to the cytoplasmic isoforms. In addition, using homology- modeling and a recently published protocol named Rd.HMM, three dimensional models of high quality were obtained for the soluble inorganic pyrophosphatases AtPPiasa6 and PvPPiase6 (the chloroplast enzyme of common bean). Its theoretical interaction with Mg (II) and PPi was analyzed in silico. 1 Resumen Las pirofosfatasas inorgánicas o pirofosfato hidrolasas PPiasas (EC 3.6.1.1) hidrolizan los enlaces fosfoanhídrido en el pirofosfato inorgánico y otros esteres de fósforo. Se dividen en dos grupos principales: las pirofosfatasas inorgánicas solubles y las pirofosfatasas asociadas a membranas. Las enzimas pertenecientes a estas familias no forman intermediarios fosforilados durante la catálisis. Las pirofosfatasas inorgánicas solubles (siPPiasas) son proteínas ubicuas, dependientes de metales y encontradas en los tres dominios filogenéticos. Actualmente, se conocen dos familias de pirofosfatasas solubles no homólogas, que difieren entre sí en términos funcionales, ya que la Familia I de siPPiasas emplea como activador fisiológico al catión divalente Mg (II), en tanto que la Familia II preferentemente emplea Mn (II) para alcanzar su máxima actividad catalítica. Aún cuando se aprecian diferencias importantes en la secuencia primaria y estructura tridimensional de dichas proteínas, existe gran conservación de residuos en el sitio activo, lo que se considera uno de los mejores ejemplos de convergencia evolutiva. La Familia I está constituida por enzimas de tipo procariota y eucariota, siendo sus prototipos la proteína homohexamérica de Escherichia coli y la enzima homodimérica de Saccharomyces cerevisiae, respectivamente. El tamaño de una subunidad en las siPPiasas de tipo procariota es de 19-22 kDa y de 30-34 kDa en el caso de los monómeros de tipo eucarionte. En general, el plegamiento de las proteínas de la Familia I corresponde a un barril β distorsionado, constituido por 5 hebras, rodeado o cubierto por dos hélices α. La EcPPiasa y la ScPPiasa presentan una similitud de secuencias de entre el 22 – 28 % dependiendo del tipo de alineamiento. La presencia de siPPiasas en plantas superiores ha sido documentada desde la década de 1970, sin embargo, aún no han sido estudiadas ampliamente. No obstante, actualmente se sabe que las células vegetales presentan un mínimo de 3 a 4 isoformas, semejantes en tamaño y punto isoeléctrico, lo que dificulta su separación por técnicas convencionales. La caracterización cinética de estas actividades ha demostradoque también son dependientes de Mg (II) como activador esencial y son específicas para pirofosfato. Aproximadamente, el 80% de la actividad PPiasa que se encuentra en los tejidos vegetales se localiza en el cloroplasto, a pesar de que la mayor parte de las isoformas de siPPiasas se localizan en el citosol. La localización cloroplástica de la AtPPiasa6 se debe a la presencia de una secuencia señal en el extremo amino. Los residuos del resto de la secuencia permiten agruparla con las proteínas de la Familia I de tipo Eucarionte, por lo que presenta baja identidad con las isoformas restantes de Arabidospsis. La comparación de secuencias primarias ha demostrado que la AtPPiasa6 posee mayor similitud con la proteína de levadura, en tanto que las otras isoformas presentan una secuencia parecida a las enzimas bacterianas de la Familia I. En nuestro laboratorio, recientemente se caracterizaron dos isoformas de Arabidopsis thaliana, a nivel cinético y molecular. Se sabe que estas proteínas son monoméricas y sensibles a la inhibición por Ca (II). En este proyecto se expresó y purificó la proteína recombinante AtPPiasa6 y se estudió la cinética de saturación por Mg (II) y pirofosfato, encontrándose que el mecanismo cinético difiere del que presentan las pirofosfatasas de S. cerevisiae y E. coli, pues la unión del complejo MgPPi2- precede en forma ordenada la unión de al menos un átomo de Mg (II) libre para dar lugar a la forma productiva, además de que el mecanismo es de equilibrio rápido. Esta proteína también fue empleada para análisis espectroscópicos. Además, usando métodos de modelado molecular y un protocolo actual y poderoso de calificación de la relevancia biológica de los modelos 3D de estructura de proteínas, se generaron modelos de la estructura tridimensional de esta proteína que fueron usados para análisis in silico de anclaje molecular, a partir de los cuales fue posible ubicar los residuos que participan en el sitio activo y la geometría de la coordinación de los cationes divalentes. Finalmente, se compararon las características distintivas entre esta isoforma y la isoforma PvPPiasa6. 2 1. Introducción 1.1 Pirofosfato inorgánico El pirofosfato inorgánico fue descubierto en el siglo XIX, al calentar sales de ortofosfato de sodio o potasio, sin embargo, su formación en sistemas biológicos fue reportada hasta 1941 por Cori, al analizar extractos de rata incubados aeróbicamente en presencia de succinato y fructosa. Numerosos procesos biosintéticos están acoplados al consumo de NTP, con la liberación de PPi como subproducto, como la síntesis de ácidos nucleicos, proteínas, di-, tri- y polisacáridos, entre otros. Heinonen [1] publicó una lista de 53 reacciones metabólicas asociadas a la formación de pirofosfato, pero una revisión de la base de datos KEGG (http://www.genome.jp/dbget- bin/www_bget?cpd:C00013) proporciona una lista de 245 enzimas asociadas a este metabolito, de acuerdo con los números internacionales de clasificación. En consecuencia, la velocidad de producción del PPi en una célula en crecimiento resulta particularmente alta. Dicha producción debe estar aparejada con un catabolismo del PPi igualmente rápido, de tal manera que, en términos energéticos, sea posible la reutilización del fósforo. Por otro lado, la constante de equilibro ( , en cualquier reacción bioquímica depende del cambio de energía libre de Gibbs , de acuerdo a la ecuación (i). (i) El equilibrio en reacciones biosintéticas usualmente se encuentra desplazado hacia la formación de los reactivos, con valores de positivos. Por lo tanto, muchos procesos de síntesis están acoplados con la hidrólisis de nucleótidos trifosfatados (NTP), con valores de altamente negativos, para favorecer la reacción de formación de productos. En la mayoría de los casos los NTP son hidrolizados a nucleótidos difosfatados (NDP) y ortofosfato (Pi), con un . Sin embargo, en ocasiones también se observa la producción de nucleótidos (NMP) y pirofosfato inorgánico (PPi), con un . La energía de disociación del enlace fosfoanhídrido hidrolizado durante la síntesis de PPi, aumenta el carácter exergónico de este proceso en comparación con la reacción de producción de ortofosfato, debido a la sobreestabilización del PPi por dos cationes de Mg (II) que interactúan de manera eficiente con dicho anión [1].1 1 La energías estándar de formación de los compuestos se calcularon a 25° C, pH 7 y 1.0 mM de Mg (II). 3 Se estima que la hidrólisis de pirofosfato en condiciones similares a las presentes en células de mamíferos tiene un , en tanto que, en caso de las plantas es de . La hidrólisis de PPi proporciona entonces un impulso termodinámico adicional a la biosíntesis, de manera que al impedir la hidrólisis, el crecimiento se detendría. Ahora bien, la conversión de pirofosfato a ortofosfato inorgánico (Pi) depende de la actividad de pirofosfatasas inorgánicas (Figura 1) [2], sin embargo, no se conoce plenamente el mecanismo de acción de dichas enzimas, la forma en la que son reguladas o compartamentalizadas, o su papel en el control de la concentración del PPi [3-5]. Aún cuando actualmente las enzimas canalizan la energía liberada en la hidrólisis del PPi y ATP hacia las reacciones anabólicas, se ha reportado que los fosfoanhídridos pueden actuar como fuentes energéticas aún en ausencia de enzimas, por ejemplo, durante la formación del enlace peptídico y la fosforilación de nucleósidos [70, 71] En el laboratorio se ha demostrado que tanto la hidrólisis como la transferencia de grupos fosforilo por vías no enzimáticas a partir de PPi y otros polifosfatos es factible y puede ocurrir para dar paso a diversos organofosfatos [61, 72]. Existe evidencia experimental del uso de pirofosfato inorgánico de manera alternativa al ATP tanto en el metabolismo fotosintético como en el fermentativo, por lo que se sugiere que este anhídrido de fósforo pudo haber sido una de las primeras moléculas empleadas como moneda energética y en reacciones de transferencia de grupos fosforilo en el metabolismo de organismos primitivos primordialmente como transportador de energía desde las rutas catabólicas a las anabólicas. Una de las propuestas en favor del PPi como donador de energía se deriva de la capacidad de numerosos organismos existentes en la actualidad de emplear este fosfoanhídrido como energía bioquímica [73- 77]. Sin embargo, dada la limitada disponibilidad de Pi en suelos, los polifosfatos en general devienen fuentes improbables de energía para las primeras formas de vida en la Tierra [72,78]. Además, se ha señalado que, sin la presencia de trasportadores especializados, la internalización de compuestos iónicos como el PPi a través de las membranas primitivas se vuelve poco factible [1]. Fue hasta la década de 1960 que se propuso, de manera independiente por diferentes grupos de trabajo, que la hidrólisis del PPi proporcionaba el impulso termodinámico requerido por gran número de reacciones básicas que pudieran haber ocurrido entre moléculas orgánicas presentes en la Tierra primitiva [51] y, posteriormente, formando parte del metabolismo incipiente de los primeros organismos que evolucionaron. Se ha sugerido además que el PPi pudo ser más abundante que los derivados fosfatados de compuestos heterocíclicos en la corteza terrestre, ya que se puede obtener como un subproducto de la condensación y descomposición parcial de polifosfatos P4O10 [69], sintetizados experimentalmente tras mezclar y calentar a altas temperaturas basalto volcánico y fosfato de calcio Ca3(PO4)2 para luego hidrolizar parcialmente los productos volátiles [79]. Las condiciones de 4 la Tierra primitiva podrían haber favorecido que mineralescomo la apatita dieran paso a polifosfatos bajo ciertas condiciones de reacción, pero adicionalmente, se ha planteado que éste podría haber estado presente en la sopa prebiótica naturalmente, ya que ha sido encontrado en depósitos minerales de canafita CaNa2P2O7•4H2O, hecho notorio, dada la reactividad de los enlaces fosfoanhídrido del PPi frente a la hidrólisis [80]. Muchos autores han propuesto una serie de reacciones que podrían haber producido PPi abióticamente en la Tierra primitiva, a partir por ejemplo, de ácido fosfórico H3PO4 disuelto en piridina ó etil metil cetona e irradiando la mezcla con UV [81]. Propuestas alternativas plantean la oxidación de fosfinas por efecto de descargas eléctricas en disoluciones acuosas diluidas de NH3 [70,71]. La síntesis química del PPi también se ha conseguido en experimentos tipo Miller-Urey, en los que compuestos como el HCN, la dicianamida NaN(CN)2, el cianoacetileno H-C≡C-C≡N y la urea CO(NH2)2 pueden favorecer la formación cuantitativa de PPi en mezclas de reacción acuosas en presencia de fosfatos y cianatos a pH 6.5 y 35 °C. Sin embargo, la única reacción reportada y suficientemente cuantitativa para producir PPi en condiciones prebióticas fue descrita hasta 1975, en un ensayo donde se calentaron sales de fosfato de amonio diácido NH4H2PO4 en presencia de urea [81-84] Figura 1. Hidrólisis de PPi. 1.2 Metabolismo de PPi El metabolismo energético en plantas es posiblemente uno de los más complejos, si se le compara con el resto de los organismos en los tres dominios filogenéticos. Evidentemente, el rasgo más característico del metabolismo de estos organismos es la producción autotrófica de gliceraldehído-3- fosfato a partir de CO2, H2O y Pi empleando radiación electromagnética (hν) en los cloroplastos; no obstante, las plantas también poseen un metabolismo energético no fotosintético, que resulta diferente 5 al resto de los eucariontes. Una de las particularidades encontradas se deriva de que muchos de los procesos implicados en la obtención de energía ocurren en diferentes compartimentos celulares y frecuentemente se conocen numerosas reacciones alternativas para efectuar la misma transformación química. En Viridiplantae se conocen enzimas capaces de emplear el PPi como donador de grupos fosforilo y que participan en el metabolismo energético, estas enzimas son: la fructosa-6-fosfato pirofosfato fosfotransferasa (EC 2.7.1.90), la pirofosfatasa inorgánica translocadora de protones (EC 3.6.1.1) y la UDPG pirofosforilasa (EC 2.7.7.9) [1]. En el Esquema 1 se resumen algunas de las reacciones centrales del metabolismo energético de células de plantas fotosintéticas. La fructosa-6-fosfato 1-fosfotransferasa (PFP) se encuentra ampliamente distribuida en plantas y también ha sido reportada en algas [87-90]; la enzima (un heterotetrámero α2β2) es el principal punto de regulación de la glucólisis y se localiza en el citosol, catalizando la fosforilación reversible de la fructosa-6-fosfato. El Pi inhibe la reacción directa de fosforilación de la fructosa-1,6-fosfato, mientras que el PPi es un inhibidor de la reacción opuesta [91, 92]. La PFP de plantas, pero no la de algas rojas, resulta fuertemente activada en ambas direcciones por la fructosa-2,6-difosfato; este efector regula la glucólisis y gluconeogénesis en el hígado de mamíferos al activar a la ATP-fosfofructocinasa PFK e inhibir a la fructosa-1,6-difosfatasa. En las plantas también se expresa la fosfofructocinasa PFK-1 (la PFP no está presente en células animales), pero ésta es insensible a la fructosa-2,6-difosfato. En hojas de cebada la fructosa-1,6-fosfato sustituye a la F26DF, activando a la PFP en forma similar [88, 93]. Se ha propuesto que bajo condiciones de estrés, la PPi-PFK reemplaza a la ATP-PFK porque constituye una ventaja energética al favorecer el aumento en el rendimiento de ATP durante la glucólisis, particularmente en el metabolismo fermentativo [58, 63]. Desde 1981 se propuso que las pirofosfatasas vacuolares de membrana de plantas actúan como bombas de protones H+ [94], pero no fue hasta 1985 que se demostró que la translocación de protones dependiente de ATP y PPi en vesículas de los tonoplastos de cloroplastos de betabel se llevaba a cabo por diferentes enzimas, debido a los diferentes comportamientos cinéticos observados. La existencia de un translocador de H+ dependiente de PPi ha sido documentada en Viridiplantae y algas, así como en protistas fotosintéticos como Acetabularia acetabulum [95-97]. A diferencia de la ATPasa, la pirofosfatasa del tonoplasto de betabel consiste en un solo polipéptido de 81 kDa [98]. Las pirofosfatasas traslocadoras de protones también han sido identificadas en la membrana mitocondrial interna de células troncales de chícharo [1]. Estas enzimas se describirán posteriormente. 6 Otra de las enzimas capaces de emplear el pirofosfato como sustrato es la UDPG fosforilasa, que se localiza en el citoplasma de células de plantas catalizando la reacción de formación de UDP glucosa y PPi a partir de glucosa-1-fosfato y UTP. La reacción es reversible y procede en dirección de la síntesis de sacarosa y polisacáridos de la pared celular, sin embargo, la UDPG fosforilasa también puede emplear PPi cuando hay UDPG disponible por la degradación de sacarosa. Numerosos grupos de investigación han propuesto que la movilización de reservas de sacarosa en plantas ocurre a través de la serie de reacciones catalizadas por la sacarosa sintasa y UDPG pirofosforilasa [1, 99]. Los ejemplos anteriores demuestran que existe gran redundancia en el metabolismo de células de plantas, misma que no es observada fuera del reino Plantae. Así: La PFP cataliza reacciones tanto de la glucólisis como la gluconeogénesis, pero la ATP-PFK y la fructosa-1,6-difosfatasa también están presentes en el mismo compartimiento celular. La sacarosa sintasa y la UDPG pirofosforilasa pueden sustituir a la invertasa y la hexocinasa en la movilización de sacarosa durante la degradación de carbohidratos. La situación incita a cuestionar el papel evolutivo de estas rutas alternativas; algunas posibilidades consideradas indican que rutas diversas podrían favorecer el ahorro de energía bioquímica al emplear PPi y no ATP, regular la concentración citoplásmica de PPi y facilitar la adaptación a condiciones ambientales cambiantes, pues se debe tener en cuenta que las reacciones impulsadas con la hidrólisis del PPi son reversibles en términos de energía libre, mientras que las dependientes de ATP son irreversibles in vivo [1]. De igual forma, en bacterias se han identificado diversas enzimas que emplean el PPi y no el ATP (ó GTP) encontradas en propionobacterias; algunas de las primeras enzimas caracterizadas fueron la fosfoenolpiruvato carboxitransfosforilasa (EC 4.1.1.38), la fosfofructocinasa dependiente de PPi (PFP) (EC 2.7.1.90) y las proteínas homólogas de la piruvato ortofosfato dicinasa tratada previamente [100]. En otros organismos, como los protistas Euglena gracilis y Entamoeba histolytica, han sido identificadas enzimas homólogas a la piruvato ortofosfato dicinasa PPDK, la PFP, la acetato cinasa dependiente de PPi (EC 2.7.2.12) y la pirofosfatasa translocadora de H+ se ha encontrado en organelos específicos de algunos protistas patógenos como Plasmodium falciparum y Trypanosoma cruzi [101,103]. Ahora bien, en animales prácticamente todas las publicaciones se han enfocado a estudiar el papel del PPi como fuente de energía bioquímica, limitándose al estudio de la fosforilación de la glucosa a expensas del PPi en el hígado de mamíferos [104]; se ha demostrado que tanto la fosforilación de la glucosa como la hidrólisis del PPi son catalizadas por la glucosa-6-fosfatasa (EC 3.1.1.9), una proteína 7 integral del retículo endoplásmico [105-108]. Se hapropuesto que la fosforilación de la glucosa empleando PPi ó carbamoil fosfato y la hidrólisis de la glucosa-6-fosfato no constituye el único papel que desempeña esta enzima, pues su expresión está fuertemente regulada por glucosa y glucosa-2,6- difosfato, que promueve la glucólisis en el hígado de ratas. Adicionalmente, se sabe que el PPi se internaliza al lumen del retículo endoplásmico junto con el carbamoil fosfato por medio de un transportador específico proteico (T2) que simultáneamente bombea Pi al citoplasma [107 - 110]. Otros ejemplos en animales se centran en la fosforilación de proteínas dependientes de PPi in vitro. La reacción es diferente de aquella efectuada con ATP, ya que en este caso los blancos de fosforilación son pocos (casi siempre proteínas de membrana) y la reacción se inhibe en presencia de flúor. Se debe comentar que la fosforilación a partir de PPi también se ha observado en mitocondrias de levadura y cloroplastos de espinaca [1, 111]. Así mismo, se ha documentado que la translocación de protones H+ a expensas de PPi también se ha reportado en el aparato de Golgi y su efectividad es comparable con el transporte de protones dependiente de ATP, pero difiere en cuanto al pH preferencial al que ocurre el proceso y el efecto de algunos cationes inhibidores [112, 113]. Resulta interesante que la concentración del PPi en diversas especies animales sea relativamente baja, en comparación con la concentración del mismo en células de plantas, levaduras y bacterias, en las que oscila entre 200 y 300 M; dicha concentración no sólo es muy elevada, sino que no varía considerablemente aún en condiciones estresantes, en las que se presentan respuestas metabólicas adaptativas acompañadas por la disminución de ATP/ADP ó UTP/UDP [114, 122,134]. Por otra parte, existe evidencia de que en hongos como Phytophthora infestans y en protistas como Trypanosoma cruzi la adquisición de Ca (II) se ve estimulada por la concentración de PPi, e inhibida por la de ATP y Pi [76, 118, 120]. De acuerdo a lo expuesto anteriormente es factible considerar que el pirofosfato efectivamente fuera utilizado como fuente alternativa de energía por organismos que evolucionaron tempranamente, ya que se ha demostrado que organismos de phyla distintos poseen enzimas específicas dependientes de PPi y que participan en rutas de metabolismo energético, aunque existen posturas y algunas evidencias experimentales cuya interpretación se contrapone con esta idea [136]. Cabe destacar que también se conocen algunos ejemplos de enzimas relacionadas con la síntesis de metabolitos secundarios específicos, que dependen de PPi y no de nucleótidos trifosfatados como el ATP y el GTP, en bacterias anaeróbicas y protoctistas como Giardia y Entamoeba. Sin embargo, además de actuar como fuente de energía bioquímica, el PPi regula numerosos procesos bioquímicos. Se ha reportado que puede inhibir cinéticamente y activar enzimas, influenciar 8 la fidelidad de la síntesis de ácidos nucleicos y la síntesis de proteínas, afectar la proliferación celular, la calcificación de tejidos y el transporte de hierro, además de estar involucrado en algunas condiciones patológicas. Uno de los primeros reportes sobre el efecto del PPi (y el catión Mg (II)), fue el de inhibir a la fosfoenol piruvato carboxilasa [135]; otros ejemplos bien documentados son el de la fosforibosiltransferasa, la asparagina sintetasa y la fosfoproteína fosfatasa [1]. El PPi puede modificar la actividad de una enzima al formar complejos específicos con los inhibidores de éstas, casi siempre metales divalentes alcalinos, alcalinotérreos o en algunos casos metales de transición. Como se ha dicho, el PPi es el producto de diversas reacciones biosintéticas que frecuentemente se encuentran cerca del equilibrio químico debido a que los productos formados son altamente energéticos; en estos casos variaciones mínimas en la concentración de pirofosfatato afectan la direccionalidad de dichas reacciones. Por ejemplo, la inhibición cinética por producto se ha identificado en muchas enzimas en donde la salida del PPi es el paso limitante de la reacción directa [1, 100, 119]. Algunos ejemplos documentados son la fosforibosil transferasa que fosforila a las purinas y pirimidinas hacia sus mononucleótidos correspondientes y la ADPG pirofosforilasa (la ADP glucosa es el precursor del glucógeno en bacterias y de celulosa en las plantas) El PPi extracelular también juega un papel importante y se ha documentado que éste estimula particularmente la proliferación de fibroblastos y el crecimiento bacteriano en medios de cultivo líquidos [1]. 9 Esquema 1. Reacciones centrales del metabolismo energético de células de plantas fotosintéticas. Las líneas continuas indican la dirección de las reacciones bioquímicas y las líneas punteadas el transporte vectorial. Las enzimas y sistemas enzimáticos que participan son: (1) Los complejos fotosintéticos en la membrana tilacoidal y en el estroma. (2) ADPG-pirofosforilasa (2.7.7.27). (3) Almidón sintasa (2.4.1.21). (4) Almidón pirofosforilasa (2.4.1.1). (5) Antiportador de triosas fosfasto-ortofosfato. (6) Enzimas glucolíticas y gluconeogénicas. (7) Fructosa difosfatasa (3.1.3.11). (8) Fructosa difosfatasa (3.1.3.11). (9) Pirofosfato fructosa-6- fosfato 1-fosfotransferasa (2.7.1.90). (10) Glucosa-6-fosfato isomerasa (5.3.1.9). (11) Sacarosa-fosfato sintasa (2.4.1.14). (12) Sacarosa fosfatasa (3.1.3.24). (13) Invertasa (3.2.1.26). (14) Sacarosa sintasa (2.4.1.13). (15) UDPG-pirofosforilasa (2.7.7.9). (16) Fosfoglucomutasa (5.4.2.2). (17) Nucleósido-difosfato cinasa (2.7.4.6). (18) Hexocinasa ó fructocinasa en plantas (2.7.1.1). (19) 6- Fosfofructocinasa (2.7.1.11). (20) Piruvato cinasa (2.7.1.40). (21) Fosfoenol piruvato carboxilasa (4.1.1.31). (22) Malato deshidrogenasa (1.1.1.82). (23) Enzima málica (1.1.1.39). (24) Piruvato ortofosfato dicinasa (2.7.9.1). (25) Pirofosfatasa inorgánica translocadora de H+ (3.6.1.1). (26) Complejo de la piruvato deshidrogenasa + el sistema de fosforilación oxidativa en mitocondrias + enzimas del ciclo del ácido cítrico. Tomado de la referencia [1]. 10 1.3 Pirofosfatasas inorgánicas Las pirofosfatasas inorgánicas o pirofosfato hidrolasas PPiasas (EC 3.6.1.1) hidrolizan los enlaces fosfoanhídrido en el pirofosfato inorgánico y otros esteres de fósforo. Se dividen en dos grupos principales: las pirofosfatasas inorgánicas solubles y las pirofosfatasas asociadas a membranas. Las primeras pueden subdividirse en “Familia I” y “Familia II” que corresponden a las pirofosfatasas inorgánicas dependientes de Mg (II) y las dependientes de Mn (II), respectivamente. Frecuentemente se considera como “Familia III” a las pirofosfatasas inorgánicas integrales de membrana. Es importante comentar que las enzimas pertenecientes a estas familias no forman intermediarios fosforilados de la enzima durante la catálisis. En tanto que la función de las pirofosfatasas inorgánicas solubles de las Familias I y II consiste en hidrolizar el PPi disponible sin que este proceso sea sujeto de regulación exhaustiva, excepto en algunas pirofosfatasas inorgánicas de plantas que aparentemente participan en el desarrollo y elongación de tubos polínicos; las pirofosfatasas de la denominada “Familia III”, por otra parte, emplean la energía generada a partir de la hidrólisis del PPi para bombear iones hidronio o iones Na+ a través de una membrana [48, 52]. Recientemente, ha sido reportado un tercer tipo de pirofosfatasa inorgánica soluble, perteneciente a la superfamilia de proteínas de haloalcanoato deshalogenasa (HADSF), que presenta un plegamiento completamente diferente al de las PPiasas de las Familias I y II. La superfamilia HADSF incluye a deshalogenasas, fosfonatasas y fosfomutasas, aunque la gran mayoría de las enzimas anotadas son fosfatasas,con diferentes funciones in vivo. Las fosfatasas mejor caracterizadas hasta la fecha pertenecen a Bacteroides thetaiotaomicron (Figura 2) y a las arqueas Pyrococcus horikoshi y Thermococcus onurinneus, que muestran actividad hidrolítica selectiva por el pirofosfato (en comparación con otros organofosfatos como el glicerol-1-fosfato), y cuyo homólogo estructural más cercano es la β-fosfoglucomutasa [121]. Cabe destacar, que la superfamilia estructural HADSF, en la que se agrupan estas proteínas, es bastante divergente, tanto a nivel de secuencia de aminoácidos, como a nivel de plegamiento tridimensional. 1.4 Pirofosfatasas inorgánicas asociadas a membranas Las pirofosfatasas inorgánicas translocadoras de protones asociadas a membranas emplean PPi y no ATP para bombear iones hidronio formando un gradiente transmembranal acoplado con el transporte 11 secundario de solutos. Estas enzimas se encuentran presentes en plantas, algas, algunos protistas fotosintéticos y bacterias fototróficas como Rhodospirillum rubrum [52], y recientemente se han reportado también en arqueas termofílicas. Las proteínas más estudiadas de esta familia son la H+- PPiasa (V-PPiasa) de plantas, proteínas asociadas a las membranas del aparato de Golgi y de las vacuolas, y cuya actividad hidrolítica depende de K+ en rangos milimolares y la H+-PPi sintasa de R. rubrum encontrada en cromatóforos de algunas α-proteobacterias, es insensible a la presencia de metales monovalentes y se encarga de mantener el gradiente de protones con la energía derivada de la hidrólisis de PPi almacenado. Desde el punto de vista evolutivo, resulta interesante que las pirofosfatasas translocadoras de protones, coloquialmente denominadas “pirofosfatasas vacuolares”, están constituidas por una sola cadena polipeptídica de entre 75 y 81 kDa con 14 ó 16 segmentos transmembranales (Figura 3). Cabe destacar que las H+-PPiasas fueron situadas o enraizadas, mediante el análisis filogenético de los motivos estructuralmente próximos a la región putativa del sitio activo de estas proteínas, en una etapa temprana de la evolución [48, 49, 65]. Figura 2. Representación gráfica de la estructura cristalográfica de la pirofosfatasa inorgánica probable BT2127 (PDB 3QX7) de Bacteroides thetaiotaomicron, perteneciente a la superfamilia de las haloácido deshalogenasas, el cristal fue determinado a 1.6 Å. La imagen fue generada empleando el programa UCSF Chimera versión 1.6.2 [132]. 12 Figura 3. Representación de la estructura cristalográfica del dímero de la pirofosfatasa vacuolar de protones (PDB 4A01) en complejo con imidodifosfato (IDP). Tal como se puede observar en la figura se trata de un manojo de 6 hélices α internas transmembranales, y 12 hélices α transmembranales superficiales. La imagen fue generada empleando el programa UCSF Chimera versión 1.6.2 [132]. 1.5 Pirofosfatasas inorgánicas solubles Las pirofosfatasas inorgánicas solubles (siPPiasas) son proteínas ubicuas, dependientes de metales y encontradas en los tres dominios filogenéticos [6-8]. Las pirofosfatasas inorgánicas solubles se descubrieron inicialmente en tejidos animales, en 1928 [10]; dada su función como reguladores centrales del metabolismo celular son proteínas que se expresan de forma constitutiva en prácticamente todos los tipos o líneas celulares y comprenden aproximadamente entre un 0.1 a 0.5 de la proteína total en una célula. Como se ha dicho antes, actualmente se conocen dos familias de pirofosfatasas solubles no homólogas, clasificadas con base en la similitud de secuencias [6, 7]. Dichas familias difieren entre sí principalmente en términos funcionales, ya que la Familia I de siPPiasas emplea como activador fisiológico al catión divalente Mg (II) [127], en tanto que la Familia II preferentemente emplea Mn (II) para alcanzar su máxima actividad catalítica [9-11]. Aún cuando se aprecian diferencias importantes en 13 la secuencia primaria y estructura tridimensional de dichas proteínas, existe gran conservación de residuos en el sitio activo y en la arquitectura del mismo, lo que se considera uno de los mejores ejemplos de convergencia evolutiva (Figura 7) [7]. Cabe destacar que el Ca (II) y otros cationes divalentes tienen un efecto de inhibición competitiva en las enzimas de la Familia I [12, 13], por lo que se ha propuesto que la concentración intracelular de Ca (II) es un factor relevante para el control de su actividad [14, 15]. Sin embargo, se ha reportado una forma de estas proteínas que utiliza Ca (II) como activador esencial [16]. Este mecanismo parece ser particularmente relevante en la mitocondria de células de levadura, en donde la concentración de Ca (II) varía con la actividad metabólica, ya que este catión está involucrado en la regulación de la actividad respiratoria [15]. Paradójicamente, la concentración intramitocondrial de PPi parece ser muy pequeña, lo que sugiere que las PPiasas son muy activas en este compartimento. Se han identificado diversas enzimas que in vitro son capaces de hidrolizar pirofosfato inorgánico, polifosfatos, y diversas formas de pirofosfatos y polifosfatos orgánicos [17-20] (por ejemplo ADP, ATP y NADP+). La Familia I está constituida por enzimas de tipo procariota, por lo que se encuentran distribuidas ampliamente en Eubacteria y Archaea, y su prototipo es la proteína homohexamérica de Escherichia coli. Además, se conocen las enzimas de tipo eucariota, cuyo prototipo es la enzima homodimérica de Saccharomyces cerevisiae (Figura 4). El tamaño de una subunidad en las siPPiasas de tipo procariota es de 19-22 kDa y de 30-34 kDa en el caso de los monómeros o dímeros de tipo eucarionte [8, 21-23]. La Familia I de siPPiasas engloba a proteínas con alta especificidad por el PPi, aunque con una actividad marginal frente a polifosfato y ADP [12, 14]. Se tiene evidencia de que esta familia de proteínas es capaz de emplear Mn (II), aunque la presencia de este catión en el sitio activo resulta en una disminución de entre 10 y 20 veces la actividad promedio, lo que se traduce en una pérdida de especificidad, ya que también los procesos de hidrólisis de ATP y polifosfatos se ven favorecidos [6, 7, 126]. En general, el plegamiento de las proteínas de la Familia I corresponde a un barril β distorsionado, constituido por 5 hebras, rodeado o cubierto por dos hélices α, como se describirá posteriormente a detalle, así, por ejemplo, la EcPPiasa y la ScPPiasa presentan una identidad de secuencias de entre el 22 – 28 % dependiendo del tipo de alineamiento y, estructuralmente, son idénticas excepto por algunas regiones superficiales y desordenadas, presentando un RMSD de Cα de 1.45 Å. Igualmente, la conservación de los residuos del sitio activo es prácticamente perfecta (como se muestra en la Figura 8) [21]. La Familia II de pirofosfatasas inorgánicas solubles se describió inicialmente en 1998 y se ha encontrado en eubacterias (particularmente en 30 miembros del phylum Firmicutes) y en algunos patógenos como Streptococcus mutans, arqueas y recientemente fue reportada en el protoctista Giardia lamblia. Mediante análisis de secuencias detallado y la inspección de su estructura tridimensional por CRX se determinó que estas enzimas no están relacionadas evolutivamente con las enzimas de la 14 Familia I de PPiasas solubles, sino que pertenecen a la superfamilia DHH de fosfoesterasas de Aravind y Koonin [54, 62]. Estas proteínas presentan un plegamiento típico de proteínas α,β dividido en dos dominios; el extremo N-terminal (1-189) y el C-terminal (196-309), conectados por una cadena de 6 residuos de aa. El dominio amino terminal consiste en una hoja β paralela de 5 hebras y 7 hélices asociadas a la cara convexa de la hoja; el extremo C-terminal está compuesto por una hoja β mixta de5 hebras: un pasador β y tres hebras antiparalelas, además de 5 hélices α (Figura 5). La enzima mejor caracterizada actualmente es la de Bacillus subtilis. Estudios en disolución han demostrado que las enzimas de ésta familia presentan mayor actividad como dímeros; siendo que en la interface de interacción entre subunidades participan 16 residuos de ambos extremos amino terminales [125]. Figura 4. Estructuras cristalográficas de las pirofosfatasas inorgánicas solubles de la Familia I. Arriba se muestra el trímero de la EcPPiasa (PDB 1UDE) y abajo el dímero de la ScPPiasa (PDB 2IHP); las estructuras fueron determinadas a 2.6 y 1.5 Å respectivamente. Es posible observar que el centro de la subunidad se compone de un barril β, tipo llave griega formado por 5 hebras β y cubierto por un segmento del extremo C-terminal. La parte superficial de la proteína está formada por hélices que circundan al barril. También se resaltan los residuos de aminoácidos y moléculas de H2O relevantes para la catálisis, así como los cationes de Mn (II) cocristalizados. Las imágenes fueron generadas empleando el programa UCSF Chimera versión 1.6.2 [132]. 15 Figura 5. Representación de la estructura cristalográfica del dímero de la pirofosfatasa inorgánica soluble de Streptococcus mutans (PDB 2HAW), perteneciente a la Familia II; se presentan los aminoácidos pertenecientes al sitio activo y que coordinan a los metales Mn (II) y Mg (II), así como dos iones sulfato localizados en la región interfacial entre los dominios N-terminal y C- terminal. La imagen fue generada empleando el programa UCSF Chimera versión 1.6.2 [132]. 1.5.1 Características estructurales de las siPPiasas de la Familia I La pirofosfatasa inorgánica soluble de la Familia I de Saccharomyces cerevisiae es una proteína conformada por dos subunidades de forma globular compacta, y cuyos sitios activos se encuentran a una distancia de 40 Å. El núcleo de la subunidad se compone de un barril tipo llave griega, formado por 5 hebras β y cubierto por un segmento del extremo C-terminal. La parte superficial de la proteína está formada por cuatro hélices que circundan al barril. A este respecto, es importante destacar que el acomodo del barril y de las hélices 2 y 3 está bien conservado en diversas siPPiasas, de tal forma que la superposición estructural de la enzima de levaduras con la estructura cristalográfica de la proteína de E. coli revela un alto grado de similitud en el plegamiento de ambos polipéptidos, indicando que las diferencias en la secuencia primaria son resultado de la divergencia evolutiva de dichas PPiasas a partir de un ancestro común [31, 32]. La segunda parte de la subunidad exhibe una hoja amplia compuesta por cuatro hebras β extensas y tres de menor longitud. La hoja β presenta contactos con dos hebras β en el extremo C- terminal; esta región está protegida del disolvente por la hélice 4, en una forma similar a la que se observa en el barril (Figura 6). Se debe señalar que si bien cada subunidad de la PPiasa de levadura está formada por dos regiones de estructura secundaria características, como son el barril β y las hojas β, ambas están empaquetadas de forma cercana y no se trata de dominios 16 separados [31]. Las subunidades de la PPiasa de levadura son compactas y los contactos entre las mismas por lo tanto, son relativamente débiles; prácticamente no hay contactos directos entre átomos pertenecientes a la cadena principal de ambas subunidades, únicamente se han determinado interacciones tipo puente de hidrógeno entre algunas cadenas laterales. La parte central de la interfaz entre las subunidades recae en los residuos de Trp 52, Phe 84, Pro 85, His 86, His 87, y Trp 279, localizados en el extremo C- terminal de la hoja β y las asas que la interconectan [32, 33]. En 1994, se obtuvieron las estructuras cristalográficas de las PPiasas de Thermus thermophilus y dos estructuras de Escherichia coli, revelando que el plegamiento de los monómeros es muy similar al descrito anteriormente para cada subunidad; debe recordarse, no obstante, que las siPPiasas bacterianas son homohexaméricas. La cadena polipeptídica de la PPiasa de T. thermophilus presenta un plegamiento globular y cada subunidad tiene una extensión de 28 x 40 x 42 Å. El núcleo de la subunidad se compone de una hoja β antiparalela altamente distorsionada que da paso a un barril β tipo llave griega, conformado por 5 hebras, que presentan topologías distorsionadas respecto a los barriles clásicos de 5 hebras; el barril se encuentra también protegido por hélices . Se ha sugerido que en realidad las siPPiasas hexaméricas son un dímero de trímeros [21, 31-34]. Figura 6. Diagrama topológico de la ScPPiasa. Las hebras β se muestran como flechas azules, siendo las de azul oscuro las que conforman al barril β. Las hélices α se presentan como cilindros morados, los giros β como líneas curvadas de color rojo. Además, se incluyen los residuos que comprende cada elemento de estructura secundaria [31]. 17 Figura 7. Traslape estructural de los residuos del sitio activo de la PPiasa de Escherichia coli EcPPiasa (verde) y la PPiasa de la Familia II de Streptococcus mutans (azul); puede observarse gran conservación topológica entre ambos sitios activos, superpuestos en la región de los sitios de unión a metales M1 y M2 y los subsitios de unión a ortofosfato [123]. Figura 8. Superposición estructural de los residuos del sitio activo de la PPiasa de Escherichia coli EcPPiasa (amarillo) y la PPiasa de Saccharomyces cerevisiae ScPPiasa (verde); puede observarse gran conservación topológica [123]. 18 1.5.2 Características del sitio activo de las siPPiasas El sitio activo de las siPPiasas es una cavidad de aproximadamente 20 Å de diámetro, localizado en una hendidura superficial. Los análisis han revelado la presencia de cadenas flexibles, que establecen numerosas interacciones no covalentes y que podrían resultar relevantes durante la hidrólisis del PPi. Mediante cristalografía de rayos X, comparación de secuencias y estudios cinéticos se han identificado aproximadamente 13 residuos polares en el sitio activo de la proteína, y que resultan relevantes para la actividad de la enzima de Escherichia coli. Tal como se muestra en la Figura 9, en el sitio activo es posible apreciar seis subsitios de interacción: cuatro sitios específicos para la unión de iones metálicos (M1, M2, M3 y M4) y dos sitios (P1 y P2) para la unión de 2 equivalentes de Pi, como productos de la reacción, siendo que la unión del pirofosfato se presenta directamente sobre dichos subsitios. En el caso de las siPPiasas de levadura, se han obtenido datos de los complejos Mn2E, Mn2E(MnPi)2, y Mn2EFMn2PPi, cuya estructura sugiere la existencia de al menos seis subsitios de interacción, sin embargo, se tiene evidencia sobre un séptimo sitio en la interfase trímero-trímero, con una estequiometria de 1:2 subunidades de la enzima de E. coli [35]. Aunado a lo anterior, se sabe que 2 de los cationes ocupan de manera independiente (en ausencia del PPi) los sitios M1 y M2; sin embargo, se propone que los sitios M3 y M4 antes mencionados, son ocupados de forma simultánea por el complejo Mg2PPi, como verdadero sustrato de la enzima, aún cuando el orden de enlace de los cationes Mg (II) en el sitio activo durante la reacción no se conozca completamente. Existe también evidencia cinética que indica que el complejo de la enzima-ligante es catalíticamente competente cuando tres cationes se encuentran enlazados. El papel de los iones metálicos recae en su capacidad de coordinar a moléculas de H2O y activarlas, además de neutralizar la carga del pirofosfato y estabilizar el estado de transición durante el curso de la reacción. Dependiendo del ambiente químico, la afinidad de los ionesmetálicos se ve modificada, por lo que se espera que cada catión involucrado tenga un papel definido durante la catálisis, en función del número y las características electrónicas de las interacciones entre el PPi y la proteína. Se tiene evidencia, por ejemplo, de que los cationes Mg (II) al interactuar con una molécula de H2O puente localizada entre los subsitios M1 y M2, aumentan la acidez de los H enlazados al O que los coordina, lo que probablemente favorece la generación de un -OH como nucleófilo en las proximidades del centro electrofílico de fósforo en el pirofosfato [23]. Ahora se sabe que los Mg (II) enlazados a la molécula de H2O catalítica son aquellos que ocupan los sitios de mayor afinidad por los metales y que interactúan con el residuo de Asp 70 y el PPi. Los cationes que ocupan los subsitios M3 y M4 son coordinados por Asp 97, Asp 102 y Glu 31 19 respectivamente, además de que interactúan con un fragmento de fosfato del PPi. Adicionalmente, en el sitio activo se encuentran nueve moléculas de H2O que completan la geometría octaédrica de cada uno de los metales divalentes presentes. Por otra parte, los residuos de Lys 29, 141 y Arg 43 estabilizan electrostáticamente el PPi en el sitio activo. El Asp 67 perteneciente a la segunda esfera de coordinación del Mg, probablemente actúa como una base encargada de desprotonar a la molécula de H2O que generará el nucleófilo. Mutaciones en dichos residuos de aminoácidos ocasionan una disminución de la actividad catalítica [36]. Figura 9. Representación 2D del sitio activo de la PPiasa de Escherichia coli en complejo con PPi y con F- como inhibidor. [36]. De igual forma, existe evidencia cinética de que la hidrólisis del PPi se efectúa en varios pasos, y se acompaña por cambios estructurales, particularmente en los residuos de ácidos carboxílicos que interactúan mediante enlaces de coordinación con los metales divalentes. Aunado a lo anterior, se ha determinado que la reacción en presencia de la enzima se acelera en un factor de 1010, en comparación con la reacción en disolución no catalizada. El mecanismo de reacción propuesto [12, 22, 37] sugiere que la reacción de hidrólisis procede directamente vía la transferencia del grupo fosforilo hacia una molécula del H2O, sin la formación de intermediarios fosforilados de la enzima [21]. Un modelo cinético simplificado de la catálisis de las siPPiasas de la Familia I, a un pH de 7.2, se muestra en la Figura 10 (pp. 20); inicialmente se debe destacar la unión de los dos cationes Mg (II) que ocupan los subsitios M1 y M2 en ausencia del sustrato y otros dos Mg (II) en presencia del PPi. 20 Mediante datos cinéticos, combinados con información cristalográfica, se dedujo que el mecanismo catalítico consiste en la activación previa del grupo saliente (Pi) y en la formación de una especie nucleofílica eficiente. El mecanismo de la reacción catalizada por la pirofosfatasa inorgánica de levadura consta de 6 pasos o estados, que se describen a continuación y se ilustran abajo: La enzima, al inicio de la reacción debe contener en su sitio activo dos cationes Mg (II), para enlazar posteriormente otras dos especies metálicas en conjunto con el PPi. Adicionalmente, se sabe que ocurre una isomerización en la enzima [37], en la que una molécula de H2O de las 2 presentes en el sitio activo es desplazada, dejando a la otra molécula coordinando a dos cationes. La generación del nucleófilo (-OH) sucede entre los Mg en M1 y M2, y se ve favorecida por la formación de un puente de hidrógeno de baja energía entre el Asp 117 y el agua catalítica. Después de la hidrólisis, los complejos Mg-Pi se liberan de forma independiente, uno por uno, dejando únicamente dos subsitios de interacción con metales ocupados. El paso determinante de la velocidad para la reacción directa en presencia de Mg (II), es la hidrólisis del PPi y para la reacción inversa (o de síntesis de PPi), se trata de la isomerización de la enzima y no de la condensación de los 2 equivalentes de Pi. Finalmente, pero en relación con lo expuesto antes, se debe mencionar que en levaduras predominan los mecanismos en los que 3 cationes participan en la hidrólisis de PPi, sin embargo, a pH 6.0 (condiciones de cristalización en el caso de la enzima de Sacharomyces cerevisiae) se favorece la catálisis en presencia de 4 iones [21]. Figura 10. Mecanismo cinético de seis estados para el ciclo catalítico realizado por la siPPiasa de levadura (Saccharomyces cerevisiae) [21]. 21 Experimentos de intercambio isotópico han demostrado que en presencia de Mg (II), el fosfato que se comporta como centro electrofílico es el primero en liberarse, pero el segundo en enlazarse al sitio activo en las proximidades a los subsitios M1 y M2 [128, 129], en el subsitio P2, debido a la menor afinidad con la que se une este fragmento del sustrato; en comparación, el ortofosfato unido al subsitio P1 se encuentra más fuertemente unido. En presencia de Mn (II), no obstante, el orden de unión es inverso y es la liberación del producto y no la hidrólisis el paso limitante de la velocidad [130]. La dependencia de la reacción con respecto al pH se ilustra en función de dos constantes de ionización calculadas para el proceso de hidrólisis: una de 7.5 que corresponde al pKa de un ácido general y otra de 5.9 que corresponde al pKa de una base esencial. La identidad de los grupos ionizables se desconoce, pero en la reacción reversa de síntesis de PPi, el pKa de la base esencial se abate a 5.5, por lo que podría corresponder con una molécula de H2O afectada por el ambiente químico. Cambios similares en los valores de pKa ocurren después de la unión del sustrato y los cambios conformacionales de la enzima durante el paso de isomerización. [47, 57, 64, 67] 2. Antecedentes 2.1 Pirofosfatasas inorgánicas solubles de plantas superiores La presencia de siPPiasas en plantas superiores ha sido documentada desde la década de 1970, sin embargo, a diferencia de las PPiasas bacterianas y de levaduras, aún no han sido estudiadas ampliamente. La caracterización de PPiasas en organismos fotosintéticos (Plantae) se ha realizado mediante la purificación de proteínas provenientes de diferentes fuentes y el estudio de su actividad. No obstante, actualmente se sabe que las células vegetales presentan un mínimo de 3 a 4 isoformas, las cuales son semejantes en tamaño y punto isoeléctrico, lo que dificulta su separación por técnicas convencionales [6, 25, 26]. Varias de estas isoformas se expresan de manera constitutiva y, por ello, la purificación de las actividades de pirofosfatasa directamente de los tejidos vegetales puede dar lugar a preparaciones aparentemente puras, pero que contienen más de una isoforma. La caracterización cinética de estas actividades ha demostrado que son también dependientes de Mg (II) como activador esencial y los reportes recientes indican que son específicas para pirofosfato [25]. Se sabe que componen entre el 0.1-0.5 % de las proteínas de células vegetales, y que la actividad de pirofosfatasa cloroplástica es por mucho la más elevada de la célula [27]. Aproximadamente el 80% de la actividad PPiasa que se encuentra en los tejidos vegetales se localiza en el cloroplasto [27, 28], a 22 pesar de que la mayor parte de las PPiasas se localizan en citosol, de acuerdo con estudios de inmunolocalización realizados en varias especies de plantas. Tan sólo en A. thaliana, 5 de las 6 isoformas presentes de la enzima parecen ser citosólicas [11], si bien su localización intracelular exacta aún no se ha resuelto. La localización cloroplástica de la AtPPiasa6 se debe a la presencia de una secuencia señal en el extremo amino. Los residuos del resto de la secuencia permiten agruparla con las proteínas de la Familia I de tipo Eucarionte, por lo que presenta bajaidentidad con las isoformas restantes de Arabidospsis [2, 11, 25, 28]. Además, se ha estimado que su actividad extraíble es entre 10 y 50 veces mayor que la actividad detectada en algunas otras PPiasas [28]. Esta mayor actividad parece estar relacionada directamente con la elevada producción de PPi que hay al interior del cloroplasto. Debido a que una gran cantidad de reacciones metabólicas se llevan a cabo en este compartimento celular (principalmente el inicio de la síntesis de almidón por la ADP-glucosa pirofosforilasa), se produce una gran cantidad de PPi que debe ser expulsado al exterior para garantizar que se mantenga el equilibrio de químico entre productos y reactivos que favorezca la síntesis continua de almidón [28]. Por otra parte, mediante la comparación de secuencias primarias, se ha demostrado que la proteína AtPPiasa6 posee mayor similitud con la proteína de levadura, en tanto que las otras isoformas, en general mejor caracterizadas, presentan una secuencia más parecida a las enzimas bacterianas de la Familia I [6, 7]. Desafortunadamente, tampoco se cuenta con estudios de la estructura de dichas proteínas en plantas, ni para la forma cloroplástica, ni para las formas citosólicas. Nuestro laboratorio caracterizó recientemente dos isoformas de Arabidopsis thaliana, a nivel cinético y molecular [25, 26]. De acuerdo con datos posteriores de plantas transgénicas Arabidopsis que expresaban formas de fusión con proteínas fluorescentes de estas isoformas, se trata de isoformas localizadas, al menos en parte, en el citoplasma [26]. Gracias a trabajos recientes se sabe que estas proteínas son monoméricas [6] y que su mecanismo cinético difiere del que presentan las pirofosfatasas de levadura y E. coli, puesto que la unión del complejo Mg-PPi2- debe estar precedida en forma ordenada por la unión de al menos un átomo de Mg (II) libre para dar lugar a la forma productiva. Estas proteínas son también sensibles a la inhibición por Ca (II) [25, 29]. Dicha inhibición no ha sido estudiada aún con suficiente detalle, pero estudios preliminares en nuestro laboratorio indican que el Ca (II) no inhibe de manera competitiva al Mg (II), como cabría esperar, sino que existe un importante componente acompetitivo, sugiriendo que el complejo Ca-PPi2- es un inhibidor más efectivo que los cationes Ca (II) libres [30]. 23 3. Justificación En plantas, las enzimas AtPPiasa1 y AtPPiasa4 ya se encuentran parcialmente caracterizadas, y parecen ser ambas citosólicas. Aunque existen trabajos de la caracterización de la enzima cloroplástica en varias especies, estos se han realizado con preparaciones purificadas directamente de la planta, con las complicaciones que ello acarrea en la interpretación de los resultados. Adicionalmente, no se cuenta con la estructura tridimensional de ninguna de las siPPiasas de plantas. En el presente proyecto se expresó la proteína AtPPiasa6, con el objetivo de estudiar la cinética de saturación por Mg (II) y pirofosfato, a fin de determinar si su mecanismo cinético y sus afinidades relativas presentan o no diferencias con lo que se ha encontrado para las formas citosólicas de Arabidopsis AtPPiasa1 y AtPPiasa4. Usando métodos de modelado molecular y un protocolo actual y poderoso de calificación de la relevancia biológica de los modelos 3D de estructura de proteínas, que fue desarrollado por nuestro grupo [25], se generaron modelos de la estructura tridimensional de esta proteína, así como de las enzimas AtPPiasa1 y AtPPiasa4. Estos modelos se emplearán para analizar in silico la unión de Mg (II) y el sustrato, a fin de comparar los datos estructurales con los valores experimentales, ubicando así los residuos que participan en el sitio activo. Así mismo, se buscó proponer a partir de dicha información el papel de los residuos involucrados en la unión de sustratos y la catálisis. Finalmente, se compararon algunas de las características distintivas entre esta isoforma y la isoforma PvPPiasa6, para confirmar que no se trata de una característica peculiar de esta proteína en una especie en particular. 4. Hipótesis Debido a las importantes diferencias en su secuencia de aminoácidos y su ubicación intracelular, se espera que la isoenzima 6 de la pirofosfatasa inorgánica soluble de Arabidopsis thaliana tenga características cinéticas y estructurales marcadamente diferentes de las que presentan las isoenzimas 1 y 4, que ya han sido estudiadas. Esta isoforma deberá en cambio ser semejante a la isoforma 6 de Phaseolus vulgaris. 24 5. Objetivo General Clonar y expresar la isoenzima 6 de pirofosfatasa inorgánica soluble vegetal y estudiar las curvas de saturación generadas en presencia del sustrato y activador. Además, modelar su estructura tridimensional para relacionar los datos cinéticos con los estructurales. 5.1 Objetivos particulares Clonar y expresar en bacterias la isoforma 6 de la pirofosfatasa inorgánica soluble de Arabidopsis thaliana. Determinar las características cinéticas básicas (saturación por Mg y pirofosfato) de la isoforma AtPPiasa6 para establecer las diferencias y semejanzas en la actividad de estas isoformas, entre sí y respecto a las ya estudiadas AtPPiasa1 y AtPPiasa4 [11]. Usando modelado por homología y Dinámica Molecular, obtener modelos de la estructura tridimensional de estas proteínas y la de las isoformas AtPPiasa1 y AtPPiasa4. Comparar estos modelos con estructuras cristalográficas y con modelos previamente publicados de pirofosfatasas [8, 38]. Determinar su calidad y relevancia biológica mediante el protocolo Rd.HMM [39]. Utilizando los modelos anteriores, determinar mediante estudios de dinámica (MD) y acoplamiento molecular (docking) los aminoácidos posiblemente involucrados en el sitio activo de estas proteínas y proponer su posible papel en la unión de los ligandos y la catálisis. Usar los datos de modelado para explicar las diferencias en el estado de oligomerización observado entre las proteínas de plantas, bacterias y levaduras. Usar los datos sobre la estructura del posible sitio activo para proponer hipótesis sobre las bases moleculares de las diferencias observadas en la cinética de estas proteínas en comparación con las de levaduras y bacterias, para esto, debe considerarse la posibilidad de caracterizar a la AtPPiasa6 mediante espectroscopia de fluorescencia. 25 6. Metodología experimental 6.1 Material biológico Las plantas Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia empleadas se cultivaron en tierra comercial Metro mix 200®. Se sembraron semillas de plantas silvestres WT en macetas y se colocaron a 4 C, en ausencia de luz, durante dos días, para romper la dormancia y promover el proceso de germinación. Posteriormente, se ubicaron en el invernadero a aproximadamente 20 C, en condiciones de fotoperiodo corto (16 h de oscuridad por 8 h de luz). 6.2 Extracción de ARN total Para obtener ARN en suficiente cantidad para la síntesis de cADN se maceraron 100 mg de tejido foliar de plantas de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia crecidas durante 5 semanas. Las muestras se congelaron al adicionar lentamente N2 (líquido) al mortero, tras lo cual se agregó 1 mL del reactivo TRI® ARN Isolation Reagent de la marca Sigma-Aldrich ®. Los homogenados se incubaron por 5 min, a temperatura ambiente, para favorecer la disociación de complejos de nucleoproteínas. En seguida se procedió a centrifugar las muestras a 12 000 g durante 10 min a 4 °C; el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo estéril. A continuación, se adicionaron 100 mL de 1-Br-3-cloropropano por cada 1 mL del reactivo TRI® a la mezcla, misma que se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. El 1-Br-3- cloropropano puede sustituirse con CHCl3 (libre de alcohol isoamílico), en cuyo caso se recomienda adicionar 280
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