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Estudiando Biologia

4/8/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA

BIOLOGÍA

“LAS NANOPARTÍCULAS DE DIÓXIDO DE TITANIO PROMUEVEN
LA INVASIÓN Y LA PROLIFERACIÓN EN CÉLULAS DE
ADENOCARCINOMA DE PULMÓN”

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
BIÓLOGO

P R E S E N T A
ALEJANDRO DÉCIGA ALCARAZ

DIRECTOR DE TESIS
DRA. YOLANDA IRASEMA CHIRINO LÓPEZ

LOS REYES IZTACALA, EDO. DE MÉXICO, 2014

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
Restricciones de uso

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PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México).
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

AGRADECIMIENTOS
Esta tesis se realizó con el apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (166727).

Agradezco a mi alma mater la Universidad Nacional Autónoma de México por el
respaldo académico y por abrirme las puertas para poder formar parte de ella.

También quiero reiterar mi gratitud a la Facultad de Estudios Superiores Iztacala por todo
el apoyo que me brindo a lo largo de la realización de la tesis ya que sin la beca no
hubiera sido posible llevar a cabo este trabajo de investigación.

Agradezco profundamente a mi directora de tesis la Dra. Yolanda Irasema Chirino López
por aceptarme en su equipo de trabajo y por brindarme su confianza para poder realizar
esta investigación, por su paciencia, dedicación y conocimientos otorgados.
Además, agradezco también a la Dra. Norma Laura Delgado Buenrostro por su ayuda en
la realización de las diferentes técnicas celulares y por compartir su conocimiento.

DEDICATORIA
Dedico esta tesis con todo mi cariño y amor mi madre Araceli por hacer todo para que yo
pudiera concluir esta etapa en mi vida, por motivarme y darme la mano cuando sentía que
el camino se terminaba. Gracias por darme el mayor ejemplo de la vida de seguir siempre
adelante y nunca retroceder. Te agradezco demasiado por estar siempre a mi lado, por
confiar y creer en que lo lograría y por todo tu apoyo incondicional ya que sin ti no hubiera
podido lograr esto. Te amo mamá, eres el motor de mi vida.
A mis hermanas Tania y Laura, por estar siempre conmigo y por darme los mejores
consejos. Aunque en la mayoría de las veces parece que estuviéramos en una batalla,
hay momentos en los que la guerra cesa y nos unimos para lograr nuestros objetivos.
Gracias por no solo ayudarme a concluir el desarrollo de esta tesis, sino por todos los
hermosos momentos que pasamos en el proceso. Las quiero mucho, gracias por estar
siempre a mi lado.
A mis sobrinos Abi, Santi y Sebastián por llegar a llenar de luz mi vida y hacer que mis
días sean menos difíciles con sus besos y abrazos. Los amo mucho enanos.
A mis mejores amigos Belem y Edgar por estar siempre conmigo en los momentos más
difíciles de mi vida. Por brindarme su amistad y por compartir momentos tan increíbles
conmigo. Los quiero mucho.
A mis compañeros de laboratorio Ingrid, Memo e Isma por hacer los días en el laboratorio
tan divertidos y por aprender de ustedes muchas cosas.
A la Dra. Yolanda Irasema que influyó demasiado en mi vida con sus lecciones y
experiencias y por hacerme una persona de bien y preparada para los retos que pone la
vida. Gracias por todo su apoyo porque cuando parecía que todo se terminaba siempre
estuvo usted para iluminar y guiarme de nuevo en mi camino. La quiero mucho Dra.
Yolanda. “Cuando el oído es capaz de oír, entonces vienen los labios que han de llenarlos
con sabiduría”
A la Dra. Norma Laura por estar siempre al pendiente de mí y por hacer del laboratorio un
lugar divertido y agradable. Gracias por todo su cariño y por tenernos tan consentidos. La
quiero mucho Dra. Normita.
A todos ustedes les dedico todas y cada una de las páginas de esta tesis.

El verdadero viaje de descubrimiento no consiste en buscar nuevos paisajes sino
tener nuevos ojos.

Marcel Proust

Abreviaturas
CAM: chorioallantoic membrane TGF-β: transforming growth factor beta
CK8: citoqueratina 8 TIMP: tissue inhibitor of metalloproteinases
CO2: dióxido de titanio TiO2: dióxido de titanio
EGF: epidermal growth factor TNF-α: tumor necrosis factor alpha
EMT: epithelial-mesenchymal transition UV: radiation ultravioleta
EPA: Environmental Protection Agency VEGF: vascular endothelial growth factor
F12K: medio de cultivo
FeTiO3: ilmenita
H&E: hemotoxilina y eosina
H2O2: peróxido de hidrogeno
IHC: immunohistochemistry
IL-8: interleukin 8
ISO: International Organization for
Standardization

MMP: Matrix metalloproteinases
NB: nanobelts
NiO: óxido de níquel
NIOSH: National Institute for Occupational
Safety and Health

NPs: nanopartículas
NS: nanoesferas
NSCLC: Non-Small Cell Lung Carcinoma
O2.-: anión superóxido
PBS: phosphate buffered saline
ROS. Reactive Oxygen Species
RT-PCR: Reverse Transcription
Polymerase Chain Reaction

SCLC: Small Cell Lung Cancer
SEM: scanning electron microscope
SFB: suero fetal bovino

Índice de figuras
Figura 1. Formas cristalinas de TiO2
Figura 2. Formas de exposición a los diferentes tipos de NPs
Figura 3. Acumulación de las TiO2 NPs en el sistema respiratorio
Figura 4. Potencial zeta de las TiO2 NPs
Figura 5. Proceso metastásico de células cancerosas
Figura 6. Selección de imágenes
Figura 7. Selección del área
Figura 8. Duplicación
Figura 9. Binarizar la imagen
Figura 10. Ajuste de escala
Figura 11. Análisis del área
Figura 12. Modelo de la membrana corioalantoide (CAM)
Figura 13. Microscopía electrónica de barrido (SEM)
Figura 14. Tinción H&E de células A549 expuestas 7 días a TiO2 NPs
Figura 15. Ensayo de migración
Figura 16. Porcentaje de migración de células A549
Figura 17. Capacidad invasiva de células A549 en la CAM teñidas con H&E
Figura 18. Inmunolocalización de células A549 usando CK8 como marcador de células
humanas
Figura 19. Cuantificación de CK8
Figura 20. Proliferación de las células A549 dentro de la CAM utilizando Gli1
Figura 21. Proliferación de las células A549 dentro de la CAM utilizando Ki-67
Figura 22. Cuantificación de Gli1
Figura 23.Cuantificación de Ki-67

ÍNDICE
RESUMEN 1
1. INTRODUCCIÓN 2
1.1 Propiedades químicas y físicas del TiO2 2
1.2 Usos del TiO2 3
1.3 Formas de exposición a las TiO2 NPs 4
1.4 Toxicidad de las TiO2 NPs 7
1.5 Proceso invasivo de células cancerosas 10
2. ANTECEDENTES 13
3. JUSTIFICACIÓN 15
4. HIPÓTESIS 15
5. OBJETIVO GENERAL 15
5.1 Objetivos particulares 16
6. MATERIALES Y MÉTODO 17
6.1 Caracterización de TiO2 NPs 17
6.2 Cultivo celular 18
6.3 Exposición de células A549 a TiO2 NPs 18
6.4 Tinción hematoxilina y eosina (H&E) de células A549 19
6.5 Ensayo de migración 19
6.6 Tinción con sulforodamida B 20
6.7 Cuantificación de migración 20
6.8 Ensayo de la membrana corioalantoide (CAM) 25
6.9 Inmunohistoquímica (IHC) 26
7. RESULTADOS 27
7.1 Análisis de las TiO2 NPs 27
7.2 Análisis morfológico de células A549 expuestas a TiO2 NPs 28
7.3 Migración de células A549 29
7.4 Cuantificación del proceso de migración de células A549 31
7.5 Análisis de la capacidad invasiva de células A549 dentro de la CAM 32
7.6 Inmunolocalización de las células A549 dentro de la CAM 33
7.7 Cuantificación de la inmunolocalizaciónanti CK8 de las células A549 34
7.8 Capacidad proliferativa de las células A549 dentro de la CAM 35
7.9 Cuantificación del marcador de proliferación Gli1 37
7.10 Cuantificación del marcador de proliferación Ki67 38
8. DISCUSIÓN 40
9. CONCLUSIONES 47
10. LITERATURA CITADA 48
LAS NANOPARTÍCULAS DE DIÓXIDO DE TITANIO PROMUEVEN LA INVASIÓN Y LA PROLIFERACIÓN EN CÉLULAS DE
ADENOCARCINOMA DE PULMÓN.
Déciga-Alcaraz A.
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RESUMEN
La nanotecnología ha ido en incremento en la última década siendo las nanopartículas de
dióxido de titanio (TiO2 NPs) las más producidas en el mundo. Las TiO2 NPs son utilizadas
en pinturas, bloqueadores solares, pastas de dientes, tintas, cosméticos y como aditivos
en alimentos. Además, las TiO2 NPs han sido clasificadas por la IARC en el grupo 2B
como posiblemente carcinogénico para humanos, sin embargo, otras características
asociadas al proceso carcinogénico, como la habilidad de invasión de células, ha sido
poco investigada.
La hipótesis de este trabajo es que las células tumorales de humano adquieren un
fenotipo de mayor invasión y proliferación cuando son expuestas a TiO2 NPs. Para probar
esto, se utilizaron células de adenocarcinoma de pulmón de la línea A549 las cuales
fueron expuestas a TiO2 NPs de diferentes formas geométricas tales como nanoesferas
(NS) y nanocintas (usadas en este texto como NB por su nombre en inglés, nanobelts).
Se utilizaron concentraciones de 1, 5 y 10 µg/cm2 para las forma de NS y de 10 µg/cm2
para la forma de NB. Las células A549 se mezclaron en colágeno de tipo I y se
depositaron sobre la membrana corioalantoide (CAM) incubándolas durante 5 días.
Inmediatamente, se extrajo la CAM donde fueron depositadas las células A549 y se
realizaron tinciones de hematoxilina y eosina (H&E) e inmunohistoquímicas (IHC) anti
CK8, Gli1 y Ki-67.
Se observó que las NS y los NB formaron aglomerados con un tamaño de 588 y 454 nm
respectivamente en medio de cultivo F12K+10% de suero fetal bovino (SFB). La tinción
H&E y la IHC demostraron que las células A549 expuestas a concentraciones de 5 y 10
µg/cm2 de TiO2 NS y 10 µg/cm2 de TiO2 NB tienen una mayor capacidad de invasión y
proliferación dentro de la CAM. En conclusión las células A549 expuestas a TiO2 NPs en
forma de NS y NB, fueron más invasivas y tuvieron una alta capacidad de proliferar dentro
de la CAM. Esto sugiere que las células expuestas a NS y NB adquieren un fenotipo de
invasividad y una mayor capacidad para proliferar dentro de la CAM.
PALABRAS CLAVE: Nanopartículas (NPs), dióxido de titanio (TiO2), nanotoxicología,
invasión, proliferación, células A549, ensayo de la membrana corioalantoide (CAM).
LAS NANOPARTÍCULAS DE DIÓXIDO DE TITANIO PROMUEVEN LA INVASIÓN Y LA PROLIFERACIÓN EN CÉLULAS DE
ADENOCARCINOMA DE PULMÓN.
Déciga-Alcaraz A.
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1. INTRODUCCIÓN
La nanotecnología ha ido en incremento en la última década, la cual ya está
evolucionando para convertirse en una tecnología de uso general para el año 2020 (Roco,
2011) elaborando diversos nanomateriales. Estos han sido clasificados por la
Organización Internacional de Normalización (ISO) como materiales con cualquier
dimensión superficial, externa o interna que se encuentren dentro de la nanoescala (1-100
nm) (Ponce, 2013). Además, los nanomateriales tienen diferentes y mejores propiedades,
debido a estas mejoras en sus características es la razón por la que mantienen la
promesa de un incremento en la economía (NIOSH, 2013). El nanomaterial mas
producido alrededor del mundo es el TiO2, con una producción de más de 10 000
toneladas por año (Piccinno et al., 2012). El TiO2 es utilizado en diferentes fracciones de
tamaño incluyendo partículas finas y ultrafinas, partículas con un tamaño <100 nm son
definidas como nanopartículas (NPs) (NIOSH, 2011). Las TiO2 NPs es un nanomaterial
que se utiliza en diferentes productos de consumo humano como pinturas, bloqueadores
solares, aditivo para alimentos, cosméticos, tintas, papel, plásticos entre otros. La Agencia
Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) clasificó a las TiO2 NPs como un
agente posiblemente cancerígeno para los humanos, en el grupo 2B (IARC, 2010). La
categoría 2B es utilizada para los agentes en los cuales existe evidencia limitada de
carcinogénesis en humanos y evidencia suficiente de carcinogénesis en animales de
experimentación. Debido a la evidencia limitada acerca de la carcinogénesis que pueden
producir las TiO2 NPs es de gran interés el estudio de las diferentes respuestas biológicas
que se puedan tener al estar expuesto de manera ocupacional a este tipo de
nanomaterial.
1.1 Propiedades químicas y físicas del TiO2
El componente básico del TiO2 es el elemento titanio (Ti), uno de los diez metales más
comunes en la corteza terrestre. La concentración media de Ti en la corteza terrestre es
de 4400 mg/kg (Shi et al., 2013). El Ti no existe en estado metálico de manera natural,
debido a su gran afinidad por el oxígeno y otros elementos. En la naturaleza el TiO2 existe
en tres estructuras cristalinas diferentes: rutilo, anatasa y brookita, siendo las más
comunes anatasa y rutilo (Fig. 1). El TiO2 es un polvo blanco inflamable, inodoro y
LAS NANOPARTÍCULAS DE DIÓXIDO DE TITANIO PROMUEVEN LA INVASIÓN Y LA PROLIFERACIÓN EN CÉLULAS DE
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cristalino además es insoluble en agua, ácido clorhídrico, ácido nítrico o alcohol, y es
soluble en ácido sulfúrico concentrado caliente o fluoruro de hidrógeno (NIOSH, 2011).
De manera industrial el TiO2 puede ser producido a partir de un mineral de Ti que es la
ilmenita (FeTiO3). Existen diferentes procesos para producir el TiO2, como el proceso de
sulfato y el proceso de cloruro. Dependiendo del tipo de proceso las NPs obtenidas
presentaran diferentes características fisicoquímicas como tamaño, la forma, las
características superficiales, la estabilidad, características internas entre otras.

Fig. 1. Formas cristalinas de TiO2. Tres diferentes formas cristalinas del TiO2 encontradas de manera natural
en la corteza terrestre. A) rutilo, B) anatasa y C) brookita (Simkó et al., 2010).
1.2 Usos del TiO2
El pequeño tamaño de los nanomateriales les da propiedades fisicoquímicas específicas,
en comparación con los mismos materiales en la macroescala. Es por esto que se ha
generado un gran interés por su potencial de desarrollo para diferentes usos y productos.
Muchos términos se han utilizado para describir las tecnologías y los materiales
empleados en la nanoescala tales como “nanociencia”, “nanotecnología”,
“nanomateriales” y las “nanopartículas”.
Debido a que los nanomateriales utilizados se emplean en una extensa gama de sectores,
el número de posibles rutas en que los nanomateriales pueden llegar y entrar en los
organismos o acumularse en el ambiente es cada vez mayor. El TiO2 producido en
tamaños <100 nm son denominadas NPs. Las TiO2 NPs son producidas con diferentes
formas como esferas, fibras, tubos, anillos entre otras varias formas (Chen et al., 2007:
Wang et al., 2014). Existe una gran variedad de aplicaciones de las TiO2 NPs que han
sido identificadas en diferentes productos de uso común.
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Una de las principales características por las cuales son utilizadas las TiO2 NPs, es por su
actividad fotocatalíticaen productos para la filtración de luz UV (EPA, 2010). Se ha
estudiado que las TiO2 NPs pueden dispersar la luz visible o la luz UV dependiendo de su
tamaño. Las TiO2 NPs con un tamaño promedio de 230 nm pueden dispersar la luz
visible, mientras que con un tamaño promedio de 60 nm dispersan la luz UV (Skocaj et al.,
2011).
Debido a esta característica que tienen las TiO2 NPs son utilizadas para la filtración de los
rayos UV, como recientemente lo ha investigado la industria textil fabricando telas de
algodón recubiertas con TiO2 NPs para mejorar la resistencia a los rayos UV (Paul et al.,
2010; Sasipriya et al., 2014). Además, las TiO2 NPs son utilizadas en la odontología como
bactericidas debido a que inhiben el crecimiento de bacterias como Streptococcus
mutants y Porphyromonas gingivalis (Liu et al., 2014). También esta actividad bactericida
por la fotocatálisis de las TiO2 NPs es utilizada como una estrategia de desinfección ya
que se ha investigado el efecto que las TiO2 NPs tienen sobre E. coli (Carré et al., 2014).
Las TiO2 NPs también son utilizadas en diferentes productos de uso común debido a su
capacidad para conferir blancura y opacidad (NIOSH, 2011). Debido a esto las formas a
las cuales se puede estar expuesto a las TiO2 NPs es múltiple.
1.3 Formas de exposición a las TiO2 NPs
Debido a la gran cantidad de productos en los cuales son utilizadas las TiO2 NPs, la forma
a la cual podemos estar expuestos es diversa. Las formas de exposición a cualquier tipo
de NPs pueden ser de manera directa e indirecta. Las principales personas expuestas de
manera directa a las NPs son los trabajadores. La exposición de manera ocupacional a
las NPs se puede producir en el laboratorio donde se sintetizan y son manipuladas las
NPs, además de los lugares en donde se fabrican o se procesan los nanomateriales o los
nanoproductos (Ponce, 2013).
La NIOSH ha recomendado límites de exposición de 2.4 mg/m3 para partículas finas o
respirables (partículas entre 0.1 y 3 µm aproximadamente) de TiO2, en un promedio de
tiempo de hasta 10 horas por día durante una semana laboral de 40 horas. Se ha
determinado que las partículas ultrafinas también definidas como NPs (<100 nm) de TiO2
son un carcinógeno ocupacional potencial, pero no hay datos suficientes para clasificar a
las TiO2 NPs como un carcinógeno ocupacional (NIOSH, 2011).
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Los nanomateriales pueden encontrarse en el ecosistema por la difusión de los mismos,
siendo descargados directamente en ríos o en la atmosfera por la industria o ser
difundidos de forma indirecta por productos que son utilizados o desechados en el
ecosistema (RCEP, 2008).
Las pinturas, producto en donde se utilizan las TiO2 NPs son las responsables de causar
una acumulación en los ecosistemas. Estudios han revelado que las TiO2 NPs son
distribuidas homogéneamente en las pinturas al momento de ser aplicadas estando
débilmente unidas a la superficie. Esto hace que las TiO2 NPs sean susceptibles a la
lixiviación durante los eventos de lluvia contaminando principalmente ambientes acuáticos
(Kaegi et al., 2008).
Otra forma de acumulación en el ecosistema y exposición de manera indirecta a las TiO2
NPs, es por medio de la industria textil. Recientemente este sector ha utilizado las TiO2
NPs, las cuales recubren las fibras sintéticas por sus propiedades de absorber la luz UV y
como pigmento. Sin embargo, las TiO2 NPs pueden ser liberadas al ambiente al momento
de realizar un ciclo de lavado a los textiles que contienen dichas nanopartículas (Windler
et al., 2012). Estos son claros ejemplos de las diferentes maneras de exposición a las
TiO2 NPs ya sea de forma directa o indirecta según sea el caso (Fig. 2).
Las NPs pueden entrar al cuerpo de forma inhalatoria, dérmica o vía oral. La principal ruta
de exposición a las NPs de manera ocupacional es por la vía inhalatoria depositándose en
los compartimentos nasofaríngeos, regiones traqueobronquiales y regiones alveolares
(Ponce, 2013).

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Fig. 2. Formas de exposición a los diferentes tipos de NPs. Principalmente los trabajadores son los que se
encuentran expuestos de manera directa y constante a las NPs. La población en general es a la que están
destinados los diversos nanoproductos teniendo así una exposición de forma directa por medio de los mismos
o indirecta por la acumulación de estos en el ambiente.
En la vía inhalatoria las NPs pueden alcanzar diferentes regiones. Estudios realizados en
modelos animales demuestran que la distribución de las TiO2 NPs en el tracto respiratorio
depende de su tamaño. La principal región de acumulación de TiO2 NPs es la región
nasofaríngea, acumulando un 90% de NPs con un tamaño de 1 nm seguida de la región
traqueobronquial con un 10% de las TiO2 NPs con un tamaño de 1 nm. Finalmente, en la
región alveolar se han registrado TiO2 NPs de 20 nm con un 50% (Fig. 3) (Simkó et al.,
2010).

Fig. 3. Acumulación de las TiO2 NPs en el sistema respiratorio. Las TiO2 NPs pueden depositarse en
diferentes regiones del sistema respiratorio dependiendo de su tamaño.

1.4 Toxicidad de las TiO2 NPs
El estudio de los efectos tóxicos de las NPs se ha denominado nanotoxicología, la cual
tiene como objetivo establecer la relación entre las propiedades fisicoquímicas de las NPs
(ej. tamaño, propiedades superficiales y la fase cristalina) y su potencial toxicológico.
En estudios toxicológicos las características más importantes de las NPs son su tamaño,
área superficial, superficie química y carga, cristalinidad, solubilidad, el estado de
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aglomeración y la forma (Skocaj et al., 2011). Esta última característica de las NPs es
muy importante, ya que hoy en día se fabrican NPs con diferentes formas lo que les
confiere nuevas propiedades. En la actualidad la producción de las diferentes formas de
las NPs ha ido en aumento, conociéndose diferentes NPs en forma de esferas, fibras,
cintas, tubos entre otras. Las NPs en forma de cintas han generado gran interés por sus
diferentes usos como las cintas de trisulfuro de circonio que son excelentes
semiconductores y candidatos a ser utilizados en dispositivos optoelectrónicos (Tao et al.,
2014). También las cintas de sulfuro de cadmio son utilizadas para mejorar la luz emitida
por los LED´s (Wang et al., 2014). Debido a esto las NPs en forma de cintas se siguen
produciendo sin conocer los efectos que se puedan tener sobre la salud humana.
Otra característica muy particular de las NPs es la de formar agregados unidos por
enlaces químicos fuertes, o aglomerados por uniones débiles generadas por fuerzas de
van der Waals. Los agregados o aglomerados pueden o no, ser disgregados dependiendo
de su potencial zeta. El potencial zeta es un parámetro fisicoquímico importante en la
descripción de la adsorción de iones y las interacciones electrostáticas entre la carga de
las partículas (Bouhaiket al., 2013).
El potencial zeta y en consecuencia el tamaño hidrodinámico de las TiO2 NPs pueden ser
alterados por cambios en el pH de la solución en que se encuentren. Las TiO2 NPs tienen
un potencial zeta positivo cuando el pH es menor a 6, por lo tanto el potencial zeta será
negativo cuando el pH sea mayor a 6 (Jiang et al., 2009), dependiendo en el medio en el
que se encuentren (Fig. 4).
El potencial zeta y el tamaño hidrodinámico de las NPs son solo unas de las varias
características importantes en la interacción con los organismos. Dependiendo de las
características de las NPs se darán diferentes respuestas toxicológicas dentro de los
organismos (Tedja et al., 2011).
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Fig. 4. Potencial Zeta de las TiO2 NPs. Influencia del pH sobre el potencial Zeta y el tamaño hidrodinámico
de las TiO2 NPs (Jiang et al., 2009).

Debido a que las TiO2 NPs pueden depositarse en el sistema respiratorio, logran producir
diferentes respuestas toxicológicas. Cuando las TiO2 NPs alcanzan la zona alveolar de los
pulmones, estas son internalizadas por las células epiteliales de pulmón a través de
endocitosis. Estudios han demostrado que la viabilidad de las células epiteliales de
pulmón (de la línea A549), no se ve afectada por la exposición de TiO2 NPs, a
concentraciones menores de 50 µg/ml (Moschini et al., 2013; Tang et al., 2013).
Li et al. en el 2013 realizaron un estudio in vivo en donde muestra que la exposición a
TiO2 NPs produce cambios en la expresión de genes. Los genes que presentaron
cambios después de la exposición a TiO2 NPs fueron los genes involucrados con el
citoesqueleto, seguido de señales de transducción, procesos metabólicos, proliferación
celular, respuestas inmunes, apoptosis, respuestas a estrés, estrés oxidante, ciclo celular,
transporte de iones, respuestas inflamatorias y diferenciación celular.
Se ha demostrado también que la exposición a TiO2 NPs induce la producción de
especies reactivas de oxígeno, por sus siglas en inglés (ROS) tales como anión
superóxido (O2.-) y peróxido de hidrógeno (H2O2) en tejido de pulmón de ratón (Li et al.,
2013). Además, también se ha observado de manera in vitro la formación de ROS en
células epiteliales de pulmón de la línea A549 cuando son expuestas a TiO2 NPs (Müller
et al., 2010).
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Las ROS también participan como moduladores importantes de señalización. Por lo tanto
la exposición de las células a TiO2 NPs puede, a través de la producción elevada de ROS
afectar las cascadas de señalización celular que controlan los procesos tales como la
inflamación, muerte celular y la proliferación celular (Skocaj et al., 2011). La producción de
ROS principalmente H2O2, está relacionado con la patogénesis del desarrollo del cáncer.
Se ha demostrado que altos niveles de ROS (H2O2) han sido encontrados en células
epiteliales de pulmón altamente invasivas (Tsai et al., 2014).
Hoy en día existen suficientes investigaciones en donde se prueban los efectos que
pueden tener las TiO2 NPs en forma de NS. Debido a que nuevas formas de NPs se
siguen sintetizando siendo los NB una de ellas, poco se sabe de los efectos que pueden
producir. Sin embargo, se sabe que la forma de las NPs influye en las respuestas
biológicas que se puede tener cuando se está expuesto a esta forma de NPs (Sanchez et
al., 2009).
Poco se ha estudiado si las respuestas biológicas generadas por las TiO2 NPs está
directamente relacionada con el proceso invasivo de células cancerosas. Sin embargo, se
han realizado estudios en donde las TiO2 NPs generan respuestas biológicas que pueden
estar relacionadas con el proceso de invasión. Se ha demostrado que las TiO2 NPs
pueden alterar la expresión de genes relacionados con el citoesqueleto (Li et al., 2013) lo
cual sugiere que exista una remodelación del mismo para presentar una mayor
invasividad. Además, se ha demostrado en células madre que las TiO2 NPs tienen un
fuerte impacto sobre la migración celular (Hou et al., 2013). Estos son solo algunos de los
procesos que se han estudiado por la exposición a TiO2 NPs, los cuales están
relacionados con el proceso de invasión y metástasis.

1.5 Proceso invasivo de células cancerosas
Tras el crecimiento de un tumor primario, la continua proliferación tumoral, la
angiogénesis, las transformaciones genéticas acumuladas y la activación de complejas
vías de señalización desencadenan la cascada metastásica.
La cascada metastásica implica una serie de eventos celulares que están involucrados
tanto temporal como espacialmente. Solo un pequeño porcentaje de las células malignas
poseen las características requeridas del establecimiento de la metástasis.
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La metástasis comienza por un cambio en las interacciones adhesivas entre células que
permite la disociación de las células tumorales desde el tumor primario y es seguido por
una invasión local y la migración en la matriz intersticial (Fig. 5).
La invasión es uno de los principales pasos para el proceso metastásico de cualquier
célula cancerígena. Para que las células cancerosas puedan realizar una invasión se
necesitan diferentes procesos. Uno de los principales procesos es la pérdida de las
proteínas E-caderina y citoqueratinas que provocan cambios dramáticos en las
propiedades físicas y químicas de la célula, reduciendo específicamente la adhesión
intracelular y produciendo cambios morfológicos. Una consecuencia de estos cabios es el
desprendimiento del tumor primario y la adquisición de un fenotipo de motilidad. Además,
las células expresan diferentes moléculas como metaloproteasas (MMP) en su superficie
las cuales son encargadas de degradar la laminína y el colágeno de tipo IV que se
encuentra en la matriz extracelular (Wirtz et al., 2011).
Recientemente se han desarrollado diversos modelos in vitro para el estudio de la
invasión. Sin embargo, un modelo muy bien aceptado es el modelo in vivo de la CAM, el
cual se ha utilizado para el estudio de la angiogénesis (Rosas et al., 2014), invasión
(Bailey et al., 2014) y metástasis (Chakravarthi et al., 2014). Este modelo ha sido muy
utilizado ya que la CAM está compuesta por un epitelio superior, que es de origen
endodérmico, un estroma, de origen mesodérmico, y un epitelio bajo, de origen
endodérmico, en donde se han probado gran cantidad de células tumorales humana para
estudiar la progresión del cáncer (Nowak-Sliwinska et al., 2014).
El modelo de la CAM se ha empleado para el estudio de la invasión ya que presenta
diversas ventajas (Lokman et al., 2012). Además, la CAM ha sido el mejor modelo para el
estudio de la invasión ya que simula la membrana basal de humano debido a que esta
principalmente compuesta por colágeno de tipo IV, además de tener tejido conectivo el
cual contiene colágeno de tipo I, III y vasos sanguíneos (Liu et al., 2013).
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Fig. 5. Proceso metastásico de células cancerosas. En este procesocomplejo, 1) las células cancerosas
se desprenden de un tumor primario, 2) posteriormente penetrarán el tejido circundante, 3) para entrar en los
vasos sanguíneos más cercanos y 4) circular en el sistema vascular. Algunas de esta células que se
intravasaron 4) se adhieren a las paredes de los vasos sanguíneos y son capaces de extravasarse y migrar en
el tejido local, donde formaran un tumor secundario seguido de la angiogénesis para poder obtener los
nutrientes necesarios y finalmente proliferar.

2. ANTECEDENTES
Fukunaga et al., en el 2002 estudiaron la expresión de la proteína citoqueratina 8 (CK8)
en carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y en células pequeñas de
cáncer de pulmón (SCLC). Este estudio fue realizado con el objetivo de relacionar si los
altos niveles de CK8 están involucrados con la progresión y la metástasis. Los autores
demostraron que los niveles de CK8 en suero de pacientes con NSCLC fueron
significativamente altos en comparación con pacientes con SCLC. Además, encontraron
también que los pacientes que presentaron metástasis distante tenían altos niveles de
CK8 en comparación con pacientes que presentaron una metástasis no distante. Por lo
tanto, concluyeron que los altos niveles de CK8 fueron significativamente asociados con la
progresión de tumores y disminución de sobrevivencia en pacientes con NSCLC.
Shen et al., en el 2008 probaron si la hipoxia tenía algún efecto sobre el proceso de
invasión y migración de células A549, evaluando directamente el efecto de la hipoxia
sobre la organización de la proteína actina y la actividad transcripcional de HIF-1 en
células A549. Los autores demostraron que las células incubadas bajo condiciones de
hipoxia tuvieron mayor capacidad de migración y de invasión en comparación con las
células que fueron cultivadas bajo condiciones normales. También demostraron que las
uniones intercelulares disminuían y que existía una desorganización de la proteína actina,
proteína del citoesqueleto, bajo condiciones de hipoxia. Los autores concluyeron que la
inducción de la migración, invasión y la adhesión celular puede ser modulada por la
expresión del gen HIF-1, el cual indujo también un reorganización del citoesqueleto de
actina.
Morimoto et al., en el 2011 investigaron la expresión de los genes de metaloproteasas
(MMP) y el tejido inhibidor de metaloproteasas (TIMP), está regulada por la exposición a
NPs de óxido de níquel (NiO) y TiO2 NPs en ratas Wistar. Los autores demostraron que la
expresión de MMP2 en el pulmón de las ratas Wistar no aumento en presencia de NiO y
TiO2 NPs. También demostraron que la expresión de TIMP no se vio afectada por la
presencia de ambos tipos de NPs. Por lo tanto los autores concluyeron que la exposición
a los dos diferentes tipos de nanopartículas no aumenta la expresión de MMP-2 y TIMP-2
en comparación al grupo control. Lo cual discuten que pudo deberse al corto tiempo de
exposición y a la baja concentración del tratamiento que fue de solo 4 semanas.
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Oyanagi et al., en el 2012 estudiaron la transición epitelio-mesenquimal (EMT) el cual se
piensa que es un evento crucial para la progresión del cáncer. EMT es generalmente
caracterizado por la pérdida de marcadores epiteliales como E-caderina, y la
sobreexpresión de marcadores mesenquimales como N-caderina y vimentina. Para
inducir la EMT probaron tres citosinas como, TGF-β, TNF-α y EGF. Ellos demostraron que
solo TGF-β fue requerido para inducir EMT, así como en la reducción de la expresión de
E-caderina y la inducción de vimentina. Además, demostraron que TGF-β estimula la
expresión de dos marcadores de invasión tumoral tales como MT1-MMP y laminina γ2.
Los autores concluyeron que EMT inducido en células cancerosas adquieren un fenotipo
mesenquimal e invaden dentro de la matriz de colágeno. Además TGF-β induce la EMT
disminuyendo la adhesión célular.
Recientemente Desai et al., 2013 utilizaron células A549 para estudiar los cambios
morfológicos y la relación que tienen con la motilidad e invasión de las mismas al expresar
diferentes moléculas. Utilizando el medio de cultivo condicionado por las mismas células y
medio de cultivo no condicionado, encontraron que las células A549 en el medio
condicionado cambian su morfología. Además, las células A549 expresan moléculas
como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) e interleucina (IL)-8, lo cual
sugiere que la expresión de estas moléculas podría inducir la motilidad y la invasión.

3. JUSTIFICACIÓN
Debido a que la vía inhalatoria es la principal vía de exposición a TiO2 NPs en ambientes
ocupacionales y a su clasificación de las mismas en el grupo 2B como posibles
cancerígenos para humano ha aumentado la preocupación sobre los efectos que se
pueda tener sobre la salud humana. Además, la inhalación de estas partículas podría
incrementar el riesgo para el desarrollo del cáncer de pulmón, la cual es la principal causa
de muerte en todo el mundo.
Por lo anterior es de gran importancia estudiar el efecto que podrían tener las TiO2 NPs
sobre procesos carcinogénicos. Un proceso carcinogénico puede derivar en la formación
de un tumor, dicho tumor puede adquirir características más agresivas mediante la
migración, invasión a otro tejido y proliferación de células en el tejido invadido. Los
procesos anteriormente mencionados han sido poco estudiados en células de pulmón
expuestas a TiO2 NPs.
Por lo anterior en esta tesis se utilizó el modelo de la membrana corioalantoide para
estudiar la capacidad invasiva y proliferativa de células epiteliales de pulmón expuestas a
TiO2 NPs. Además, se utilizaron dos formas de NPs, nanoesferas y nanobelts para
comparar el efecto de la forma geométrica en los procesos anteriormente mencionados,
debido a que la forma es una característica que influye en los efectos celulares.

4. HIPÓTESIS
La exposición de diferentes formas geométricas de TiO2 en forma de NS y NB en células
epiteliales de pulmón genera respuestas biológicas que promueven el proceso de
migración, invasión y proliferación en la membrana corioalantoide.

5. OBJETIVO GENERAL
Evaluar en la CAM la capacidad de invasión y proliferación de las células A549 que fueron
expuestas in vitro a NS y NB durante 7 días.
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5.1 Objetivos particulares

5.1.1 Caracterizar las NS y NB.
5.1.2 Determinar la morfología de los cultivos celulares expuestos a NS y NB.
5.1.3 Evaluar in vitro la capacidad de migración de las células A549 expuestas NS y NB.
5.1.4 Evaluar por medio de marcadores específicos la invasión de las células A549
expuestas a las NS y NB dentro de la CAM. Además de cuantificar el área de la CAM
invadida por las células A549.
5.1.5 Evaluar mediante marcadores específicos la proliferación de las células A549
expuestas a NS y NB y cuantificar elárea de proliferación dentro de la CAM.

6. MATERIALES Y MÉTODO
Diagrama metodológico

6.1 Caracterización de TiO2 NPs
Las TiO2 NPs en sus diferentes formas geométricas NS y NB fueron observadas por
microscopia electrónica de barrido (SEM). Se obtuvieron imágenes a 5000x con 15 kV con
ayuda de un microscopio electrónico de barrido (JEOL 5800-LV, Japan). Para estudiar el
tamaño y forma de los aglomerados formados con las TiO2 NPs primarias se realizó un
análisis por dispersión dinámica de luz (DLS) y una microscopia electrónica de
transmisión (TEM-JEOL-JEM 1010, JEOL, Japan) a 75 000x con 60kV de aceleración,
respectivamente. Para este análisis se utilizaron 10 mg de TiO2 NPs en sus diferentes
formas, las cuales fueron suspendidas en 1 ml de agua desionizada. Enseguida, fueron
sonicadas durante 30 min a 40 Hz. Posteriormente, se tomaron 2.4 µl, los cuales fueron
suspendidos en medio F12K+SFB quedando a una concentración de 3.43 x 10-3 mg/ml.
Finalmente, el Potencial Zeta de los diferentes tipos de TiO2 NPs se midió con el
analizador de Potencial Zeta (Zeta Plus Brookenhaven USA).

6.2 Cultivo celular
Dado que la principal vía de exposición en ambientes ocupacionales a las TiO2 NPs es la
vía inhalatoria se utilizaron células de la línea A549 (neumocitos tipo II) las cuales se
obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Las células A549
fueron cultivadas con medio F12K (In Vitro S.A., #cat. ME-038 D.F. México) suplementado
con 10% de Suero Fetal Bovino (SFB) (Bio West, #cat. US1520 Kansas City, MO) a 37°C
con 95% de humedad y 5% de CO2 hasta obtener un 80% de confluencia. Posteriormente
se les retiró el medio a las células A549 y fueron regresadas a incubación con 5 ml de
solución tripsina- EDTA-4Na (tripsina al 0.05%; EDTA-4Na al 0.02%) (In Vitro S.A, #cat.
EN-008 D.F. México) durante 5 minutos. Finalmente, las células A549 fueron
centrifugadas a 1500 rpm durante 5 minutos y les fue retirado el sobrenadante para
sembrar las células nuevamente en cajas de 75 cm2 para su crecimiento (Stearns et al,
2001).
6.3 Exposición de células A549 a TiO2 NPs
Para exponer las células A549 a las diferentes formas y concentraciones de TiO2 NPs, se
utilizó Oxido de titanio (IV), anatasa, <25nm, 99.7% base de metal, en forma de
Nanoesferas (NS) las cuales se obtuvieron de Sigma Aldrich (Aldrich, #cat 637254-50G,
St. Louis, MO). Además se utilizaron nanocintas por sus siglas en inglés (NB), otra forma
de TiO2 NPs, las cuales fueron sintetizadas a partir de las TiO2 NS por un proceso
hidrotérmico como lo describe (Porter, 2012). Para cada experimento se pesó 1 mg de
TiO2 NPs de las diferentes formas NS y NB por separado, las cuales fueron resuspendidas
de manera estéril en 1 ml de medio F12K+SFB. Una vez obtenido el stock de las
diferentes formas de TiO2 NPs (1 µg TiO2 NPs/1 µl F12K+SFB) fueron sonicados durante
30 minutos a 60 Hz. Posteriormente, las TiO2 NPs fueron diluidas con F12K+SFB para
obtener concentraciones finales de 1, 5 y 10 µg de TiO2 NPs. Para exponer las células
A549 a TiO2 NPs se utilizaron cajas Petri de 24 cm, en donde fueron sembradas a una
densidad de 150 000 células/cm2. Finalmente, las células A549 fueron expuestas a 1, 5 y
10 µg/cm2 de TiO2 NS y a 10 µg/cm2 de TiO2 NB durante 7 días. Se utilizó la
concentración más alta, 10 µg/cm2, para las TiO2 NPs en forma de NB, ya que se observó
si la forma también influye en el proceso de invasión y proliferación de las células A549.

6.4 Tinción hematoxilina y eosina (H&E) de células A549
Para observar la morfología de las células A549 expuestas a TiO2 NPs se realizó una
tinción de hematoxilina y eosina (H&E). Inicialmente, las células A549 fueron sembradas
sobre un cubreobjetos dentro de una caja Petri expuestas a las diferentes formas de TiO2
NPs (1, 5 y 10 µg/cm2 NS y 10 µg/cm2 NB). Una vez transcurridos los 7 días de exposición
a TiO2 NPs las células A549 fueron fijadas con formaldehído 3% (MP Biomedicals, Inc
#cat. 104047, Solon, Ohio) a temperatura ambiente durante una hora. Posteriormente las
células A549 fueron sumergidas en etanol 70% por 2 minutos y lavadas con agua
destilada 4 minutos. Durante 25 minutos las células A549 fueron teñidas con hematoxilina,
seguida por 15 minutos de tinción con eosina a temperatura ambiente. Finalmente las
células fueron lavadas dos veces con agua destilada durante 3 minutos. Una vez teñidas
las células, fueron montadas en un portaobjetos añadiendo entellan (Merck KGaA, #cat.
107960, Darmstadt, Germany) para su conservación. Finalmente, las células A549 fueron
fotografiadas con un microscopio óptico Axio Vert.A1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)
a un aumento de 40x para su análisis morfológico.

6.5 Ensayo de migración
Para observar la migración de las células A549 expuestas a TiO2 NPs se realizó el ensayo
de migración. Utilizando placas de 12 pozos, se sembraron 150,000 células por pozo las
cuales se mantuvieron bajo condiciones estériles a 37°C con 95% de humedad y 5% de
CO2 hasta obtener un 80% de confluencia. Posteriormente, con una punta de pipeta azul
estéril se realizó una herida en el fondo del pozo. Inmediatamente los diferentes pozos
fueron enjuagados 3 veces con PBS para desechar las células A549 que fueron
despegadas por la punta de la pipeta.
Finalmente, las células A549 fueron expuestas a TiO2 NPs en forma de NS a
concentraciones de 1, 5 y 10 µg/cm2. Además, las células A549 fueron expuestas también
a TiO2 NPs en forma de NB utilizando solo la concentración más alta (10 µg/cm2). Con la
finalidad de observar la migración de las células A549 con las diferentes concentraciones,
fueron monitoreadas a diferentes tiempos (0, 24, 48 h y 7 días).

6.6 Tinción con sulforodamida B
Para poder observar claramente la migración de las células A549 expuestas a TiO2 NPs,
se realizó una tinción con sulforodamida B (Voigt, 2005). Brevemente, las células fueron
fijadas con ácido tricloroacético frío al 10% (200 µl/pozo) y se dejaron incubar a 4°C
durante 1 h. Enseguida, se retiró el ácido tricloroacético y cada pozo fue lavado 4 veces
con agua corriente, la placa de 12 pozos se dejó secar a temperatura ambiente.
Posteriormente, se adicionaron 200 µl de sulforodamida B a cada pozo dejando la placa a
temperatura ambiente durante 30 min. Finalmente, se enjuagaron los pozos de cada
tratamiento 4 veces con ácido acético al 1% dejándolos secar a temperatura ambiente
para su posterior análisis y cuantificación con ayuda del programa Image J. V. 1.47 (NIH,
USA).

6.7 Cuantificación de migración
Para poder realizar la cuantificación de las células que migraron dentro del área de la
herida, se utilizó el programa Image J. Una vez obtenidas las imágenes del ensayo de
migración estas fueron abiertas con el programa Image J (Fig. 6).LAS NANOPARTÍCULAS DE DIÓXIDO DE TITANIO PROMUEVEN LA INVASIÓN Y LA PROLIFERACIÓN EN CÉLULAS DE
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Fig. 6. Selección de imágenes. Las imágenes obtenidas del ensayo de migración fueron abiertas con el
programa ImageJ para su análisis.

Una vez abierta la imagen en el programa con la opción *Rectangular*, se selecciona el
área de la imagen que se desea analizar. En este caso el área en donde se realizó la
herida con la punta de la pipeta estéril (Fig. 7).
Seleccionada el área para analizar, se presiona click derecho para seleccionar la opción
*Duplicate*. Esta opción duplicará el área seleccionada, de este modo se obtendrá solo el
área de la herida (Fig. 8).

Fig. 7. Selección del área. La línea punteada indica el área de la herida que fue seleccionada para el
análisis.

Fig. 8. Duplicación. Con la opción *Duplicate* se obtendrá solo el área que se desea analizar.
Automáticamente aparecerá un nuevo recuadro solo con el área seleccionada. La flecha indica el recuadro de
la selección.

Teniendo solo el área que se desea analizar se selecciona la opción *Process*, enseguida
se desplegara un menú en donde se seleccionara la opción *Binary*. Posteriormente se
abrirá un submenú en donde se seleccionará la opción *Make binary*. Esta opción hará
binaria la imagen del área duplicada para poder cuantificar el área (Fig. 9).
Para la cuantificación del área se tiene que ajustar la escala. Para esto se utiliza la opción
*Analyze* >> *Set scale*, en donde se desplegara un recuadro para ajustar la escala. La
escala se ajustará de acuerdo a la barra de escala dependiendo del objetivo utilizado en
el microscopio (Fig. 10).
Finalmente se seleccionará la opción *Analyze* >> *Analyze particles* y nos dara una
tabla con la sumatoria de diferentes valores entre ellos el % de área, el cual fue el que se
utilizó para cuantificar la migración. De esta tabla se extraerán los datos de cada una de
las imágenes analizadas para posteriormente ser graficados (Fig. 11).

Fig. 9. Binarizar la imagen. Para realizar el análisis se utiliza la opción binarizar. A) imagen original. B)
imagen binarizada.
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Fig. 10. Ajuste de escala. Para realizar la medición del área invadida se debe de ajustar la escala con la
barra de escala de la imagen original.

Fig. 11. Análisis del área. Al momento de analizar la imagen binarizada se desplegará un recuadro en donde
da diferentes datos para poder graficar la migración.

6.8 Ensayo de la membrana corioalantoide (CAM)
Para observar la invasión de las células A549 se usó el modelo de la CAM. Para realizar
este ensayo se utilizaron huevos de gallina de la línea Leghorn fértiles obtenidos de Aves
Libres de Patógenos Específicos (ALPES S.A. de C.V., Tehuacán, Puebla) los cuales
fueron incubados a 37°C y 80% de humedad relativa durante 11 días. Enseguida, en
condiciones estériles, se abrió una pequeña ventana en el cascarón con un tamaño
aproximadamente de 1.5 x 1.5 cm del lado de la cámara de aire, localizada en el polo
ancho del huevo. Posteriormente se preparó una mezcla con 40 µl de colágeno tipo I
(Santa Cruz Biotechnology, #cat. sc-136157 Inc. Dallas, Texas) y 30,000 células
A549/10 µl de F12K+SFB expuestas a diferentes formas y concentraciones de TiO2 NPs
por separado (Lokman et al., 2012). La mezcla de colágeno-células se colocó sobre la
CAM, los huevos fueron cerrados y devueltos a la incubadora por 5 días más.
Posteriormente, la CAM fue extraída junto con la mezcla de colágeno-células (Fig. 12).
Finalmente, las muestras fueron fijadas en paraformaldehído al 3% durante 48 horas las
cuales fueron embebidas posteriormente en parafina.

Fig. 12. Modelo de membrana corioalantoide (CAM). Las células A549 una vez expuestas a TiO2 NPs en
forma de NS y NB a diferentes concentraciones (1,5 y 10 µg/cm2) fueron depositadas junto con el colágeno de
tipo I sobre la CAM al día once de incubación. Al día dieciséis las células A549 fueron cosechadas junto con la
CAM para su posterior análisis. La línea punteada muestra la parte de la CAM que fue cosechada para
analizar. Se realizaron tres experimentos independientes. CAM, membrana corioalantoide; TiO2, dióxido de
titanio; NS, nanoesferas; NB, nanocintas.

6.9 Inmunohistoquímica (IHC)
Se realizaron cortes histológicos a las muestras de la CAM con un grosor de 6 µm las
cuales fueron teñidas con H&E para observar la invasión de las células A549 dentro de la
CAM. Para evidenciar la capacidad de invasión de las células A549 expuestas a
diferentes formas y concentraciones de TiO2 NPs en la CAM, se realizó IHC contra CK8
(Santa Cruz Biotechnology, #cat. sc-101459 Inc. Dallas, Texas) para detectar las células
A549 dentro de la CAM, además se utilizaron marcadores de proliferación como Gli1
(Santa Cruz Biotechnology, #cat. sc-20687 Inc. Dallas, Texas) y Ki-67 (BioLegend, #cat.
652402 San Diego, CA) para saber si las células A549 expuestas a TiO2 NPs tienen una
mayor capacidad proliferativa comparadas con las células no expuestas. Para realizar la
IHC con los diferentes anticuerpos las muestras fueron sometidas a una recuperación
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antigénica incubándolas durante 15 min a 120°C con agua destilada. Enseguida las
muestras fueron bloqueadas con una solución de H2O2 0.3% y metanol absoluto durante
30 min. Posteriormente, se usó el kit Mouse/Rabbit ImmunoDetector HRP/DAB Detection
System (Bio SB, #cat. BSB 0003 Santa Barbara, CA, USA) para la incubación de los
anticuerpos.
La incubación de las muestras con los anticuerpos primarios se realizó con el reactivo
Protein Blocker/Antibody diluent (del kit antes mencionado), añadiendo CK8 (1:100), Gli1
(1:500) y Ki-67 (1:500) las cuales fueron incubadas a 4°C durante toda la noche.
Enseguida, las muestras fueron lavadas 3 veces con PBS 1x para posteriormente ser
incubadas con el segundo anticuerpo utilizando el reactivo del kit Mouse/Rabbit
Immunodetector Biotin Link durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, lasmuestras fueron lavadas con PBS 1x durante 5 min y posteriormente fueron contrateñidas
con hematoxilina durante 10 min. Finalmente, las muestras fueron deshidratadas y
montadas con Entellan para ser microfotografíadas con un microscopio Axio Vert.A1 (Carl
Zeiss, Oberkochen, Germany) para su posterior análisis. Se cuantifico el área de tinción
positiva en tres fotografías por cada muestra seleccionando por el programa ImageJ el
área teñida con coloración café. Los resultados se hicieron por triplicado y se reportaron
por µm2 para cada marcador.

7. RESULTADOS
7.1 Análisis de las TiO2 NPs
Basado en las imágenes del SEM se puede corroborar que las TiO2 NPs con las que se
trabajó fueron efectivamente NS y NB (Fig. 13 A y B). Las TiO2 NPs en forma de esferas
tuvieron un tamaño hidrodinámico mayor en comparación con el tamaño de las NPs en
forma de cintas (Tabla 1). El potencial zeta fue determinado y se observó que en el medio
que se utilizó el cual fue F12K complementado con 10% de SFB de ambos tipos de NP,
fueron semi-estables, considerando que una suspensión es estable cuando su potencial
zeta es cercano a +30 o -30 mV.

Fig. 13. Microscopía electrónica de barrido (SEM). Imágenes representativas del SEM de diferentes formas
de TiO2 NPs A) TiO2 NPs en forma de esferas. B) TiO2 NPs en forma de cintas.

Tamaño y estabilidad de lasTiO2 NPs en suspensión
Esferas (NS) Cintas (NB)
Diámetro hidrodinámico (nm) 588 454
Potencial Z (mV) -20.9 -27.4

Tabla 1. Mediante el análisis de DLS se obtuvo un mayor diámetro hidrodinámico en las TiO2 NPs en forma de
esferas en comparación con las cintas. Los valores del Potencial Zeta demuestran que los aglomerados de
ambas formas de NPs son estables en el medio en el cual fueron suspendidos.

7.2 Análisis morfológico de células A549 expuestas a TiO2 NPs
Las células A549 expuestas a TiO2 NPs y teñidas con H&E muestra la morfología de las
mismas y la localización de las TiO2 NPs. Se observó que la morfología de las células
expuestas a las TiO2 NPs no tiene cambios aparentes en comparación a las células no
expuestas a TiO2 NPs. Además, se observaron depósitos de TiO2 NPs dentro de la célula,
esto debido a la capacidad que tienen las células A549 para internalizar TiO2 NPs lo cual
ya se ha reportado (Stearns et al., 2001; Janer et al., 2014) (Fig. 14).

Fig. 14. Tinción H&E de células A549 expuestas 7 días a TiO2 NPs. A) células A549 sin tratamiento. B)
células con 1 µg/cm2 de TiO2 NS. C) células expuestas con 5 µg/cm2 de TiO2 NS. D) células expuestas con 10
µg/cm2 de TiO2 NS, E) células expuestas a 10 µg/cm2 de TiO2 NB. Las flechas indican la localización de TiO2
NPs alrededor del núcleo. Microscopia óptica 40x. Se realizaron tres experimentos independientes. H&E,
hematoxilina y eosina; TiO2 NPs, nanopartículas de dióxido de titanio; TiO2 NS, nanoesferas de dióxido de
titanio; TiO2 NB, nanocintas de dióxido de titanio.

7.3 Migración de células A549
Las células A549 fueron expuestas a diferentes concentraciones y a las diferentes formas
de TiO2 NPs. Inmediatamente después de la exposición a las TiO2 NPs, se realizó el
ensayo de migración lo cual se consideró como el tiempo 0. Las células A549 a este
tiempo no mostraron migración alguna.
Las células A549 que fueron expuestas a 1 y 5 µg/cm2 de TiO2 NPs en forma de NS
durante 24, 48 h y 7 días presentaron mayor migración en comparación con las células no
expuestas a NPs. Por lo contrario las células A549 que fueron expuestas a 10 µg/cm2 de
TiO2 NPs en forma de NS y NB presentaron una menor migración en comparación con las
células A549 expuestas a 1 y 5 µg/cm2 (Fig. 15).
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Fig. 15. Ensayo de migración. Células A549 expuestas a TiO2 NPs en forma de NS (1,5 y 10 µg/cm2) y NB
(10 µg/cm2). Se observa que las células A549 no expuestas a TiO2 NPs no presentan una alta capacidad de
migración a 24 h. Sin embargo, las células A549 expuestas durante 48h a TiO2 NPs en forma de NS a
concentraciones de 1 y 5 µg/cm2 se observa una mayor migración en comparación con las células A549
expuestas a 10 µg/cm2 de NS y NB. Las células que fueron expuestas durante 7 días a TiO2 NPs en forma de
V')
z
N
Control
O
i= 5
N
E
u -~
10
ce
Z
N
O
10 i=
N
E
u -tl.O :::1.
Oh 24 h 48 h 7 días
I '.,
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NS presentaron una mayor migración, sin embargo, las células expuestas NB disminuyeron su número, por lo
tanto presentaron menor migración. Se realizaron tres experimentos independientes. TiO2 NPs,
nanopartículas de dióxido de titanio; NS, nanoesferas; NB, nanocintas.

7.4 Cuantificación del proceso de migración de células A549
La cuantificación de la migración de las células A549 expuestas durante 24 h a 1 y 5
µg/cm2 TiO2 NPs en forma de NS demostró que la migración tuvo una tendencia a
incrementar. Además, cuando las células A549 fueron expuestas a 10 µg/cm2 de TiO2
NPs en forma de NS y NB se observó una disminución en la migración (Fig. 16A). Cuando
las células A549 fueron expuestas durante 48 a TiO2 NPs en forma de NS y NB no se
observó un aumento o una disminución de la migración (Fig. 16B). Sin embargo, cuando
las células A549 fueron expuestas durante 7 días a 1, 5 y 10 µg/cm2 de TiO2 NPs en
forma de NS se observó un incremento en la migración, siendo la concentración más alta
la que promovió mayor migración en las células A549. Además, se observó que cuando
las células A549 fueron expuestas durante 7 días a 10 µg/cm2 de TiO2 NPs en forma de
NB la migración disminuyo significativamente en comparación con las concentraciones de
TiO2 NPs en forma de NS (Fig. 16C).

Fig. 16. Porcentaje de migración de células A549. Se realizó la cuantificación de la migración de las células
A549 en el ensayo de la herida con ayuda del programa Image J. A y B) Las gráficas muestran que las células
A549 que fueron expuestas durante 24 y 48 h tienen una tendencia a incrementar la migración y disminuirla a
concentraciones de 10 µg/cm2 de NS y NB. C) Las células A549 que fueron expuestas durante 7 días a TiO2
NPs en forma de NS tuvieron un incremento en la migración. Sin embargo, las células A549 expuestas a NB
disminuyeron significativamente la migración en comparación con las células A549 expuestas a 10 µg/cm2 de
NS. NS, nanoesferas; NB, nanobelts. *p<0.5 (Media Error Estándar)
7.5 Análisis de la capacidad invasiva de células A549 dentro de la CAM
Con la tinción H&E muestra la estructura normal de la CAM formada por el ectodermo
(ET) capa exterior, mesodermo (M) capa media y el endodermo (ED) capa interna (Fig.
17A). En la muestra con células A549 no expuestas a TiO2 NPs se pudo observara las
células A549 en el ET (Fig. 17B). Las muestras en donde las células A549 fueron
expuestas a 1, 5, y 10 µg/cm2 de TiO2 NPs en forma de NS, se observaron cúmulos de
células en el M, lo cual sugiere que son las células A549 invadiendo el M (Fig. 17C, D y
E). En la muestra con células A549 expuestas a 10 µg/cm2 de TiO2 NPs en forma de NB
se observó el M con una mayor densidad de células en comparación con la muestra
control y con las muestras en donde las células A549 fueron expuestas a diferentes
concentraciones de TiO2 NS (Fig. 17F).

Fig. 17. Capacidad invasiva de células A549 en la CAM teñidas con H&E. A) CAM control en donde se
observa la estructura normal formada por ET, M y ED. B) la flecha indica las células A549 no expuestas a TiO2
NPs sembradas sobre la CAM. C) células expuestas a 1 µg/cm2 TiO2 NPs, la flecha señala la formación de
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pequeños cúmulos por debajo del ET. D) células expuestas a 5 µg/cm2 TiO2 NPs, la flecha señala dentro del
M la formación de un cúmulo. E y F) células expuestas a 10 µg/cm2 TiO2 NPs de diferentes formas NS y NB,
se observa un gran cantidad de células dentro del M. Microscopia óptica 40x. Se realizaron tres experimentos
independientes. ET, ectodermo; M, mesodermo; ED, endodermo; TiO2 NPs, nanopartículas de dióxido de
titanio.

7.6 Inmunolocalización de las células A549 dentro de la CAM
Para poder localizar a las células A549 dentro de la CAM se realizó una IHC contra CK8.
En la muestra control se observó la estructura normal de la CAM formada por las tres
diferentes capas (Fig. 18A). En la muestra donde las células A549 no fueron expuestas a
TiO2 NPs la señalización positiva se observó por encima del ET (Fig. 18B). Las células
A549 que fueron expuestas a 1 µg/cm2 de TiO2 NPs en forma de NS se localizaron por
debajo del ET comenzando a invadir el M (Fig. 18C). Las células A549 expuestas a 5
µg/cm2 de TiO2 NPs tuvieron la capacidad de atravesar el ET y formar pequeños cúmulos
de células dentro del M los cuales dieron una señalización positiva (Fig. 18D). La
exposición de células A549 con la mayor concentración de TiO2 NPs en forma de NS dio
una señalización positiva abarcando gran parte del M (Fig. 18E). Las muestras con
células A549 expuestas a 10 µg/cm2 de TiO2 NPs en forma de NB revelaron una
señalización positiva mucho más diseminada dentro del M en comparación con las células
control y con las diferentes concentraciones de TiO2 NPs en forma de NS (Fig. 18F).
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Fig. 18. Inmunolocalización de células A549 usando CK8 como marcador de células humanas. A)
Muestra control en donde solo se observa tinción con hematoxilina. B) células no expuestas a TiO2 NPs se
observa tinción positiva por encima del ET, las flechas señalan a las células A549 atravesando ligeramente el
ET. C) células A549 expuestas a 1 µg/cm2 TiO2 NPs, se puede observar la inmunolocalización por debajo del
ET invadiendo el M señalado por la flecha, D) células A549 expuestas a 5 µg/cm2 TiO2 NPs, las flechas
señalan pequeños cúmulos con señalización positiva formados dentro del M. E) células A549 expuestas a 10
µg/cm2 TiO2 NPs son inmunolocalizadas dentro del M abarcando una gran área del mismo. F) La
inmunolocalización de las células A549 expuestas a 10 µg/cm2 en forma de NB da una señalización positiva
dentro del M. Se realizaron tres experimentos independientes. ET, ectodermo; M, mesodermo; ED,
endodermo; TiO2 NPs, nanopartículas de dióxido de titanio; NB, nanocintas.

7.7 Cuantificación de la inmunolocalización anti CK8 de las células A549
La cuantificación de la inmunolocalización de las células A549 anti CK8 se realizó de la
misma forma que el análisis del ensayo de migración utilizando el programa Image J. Los
resultados demostraron un incremento el área de la CAM teñida positivamente conforme
aumentaba la concentración de las TiO2 NPs en forma de NS y NB. Las concentraciones
de 1, 5 y 10 µg/cm2 de TiO2 en forma de NS no tuvieron diferencia significativa lo cual
indica que las células A549 expuestas a esta forma de NP tuvieron una tendencia a
incrementar la invasión dentro de la CAM. Sin embargo, las células que fueron expuestas
a TiO2 en forma de NB tuvieron un incremento significativo en comparación con las
diferentes concentraciones de TiO2 NPs en forma de NS (Fig. 19).
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Fig. 19. Cuantificación de CK8. La cuantificación de la inmunolocalización con CK8 mostró una tendencia a
incrementar el área invadida de la CAM cuando las células A549 fueron expuestas a concentraciones de 1, 5
y 10 µg/cm2 de TiO2 NPs en forma de NS. Las células A549 que fueron expuestas a 10 µg/cm2 de TiO2 NPs en
forma de NB demostraron una mayor área invadida de la CAM teniendo un incremento significativo en
comparación con las diferentes concentraciones de TiO2 NPs en forma de NS. Se analizaron las imágenes de
tres experimentos independientes. CK8, citoqueratina 8; CAM, membrana corioalantoide; TiO2 NPs,
nanopartículas de dióxido de titanio; NS, nanoesferas; NB, nanocintas. *p<0.5 (Media Error Estándar).

7.8 Capacidad proliferativa de las células A549 dentro de la CAM
Se realizaron IHC con diferentes marcadores de proliferación tales como Gli1 y Ki-67 para
saber si las células A549 tienen la capacidad de proliferar dentro de la CAM. El primer
marcador de proliferación utilizado en este ensayo fue Gli1, en donde la muestra control
mostró la estructura normal de la CAM sin ninguna señalización positiva (Fig. 20A). Las
células A549 que no fueron expuestas a TiO2 NPs dieron una señalización positiva en el
ET (Fig. 20B). Mientras que la muestra con células A549 expuestas a 1 µg/cm2 de TiO2
NPs en forma de NS dio una señalización positiva por debajo del ET y en el M (Fig. 20C).
Las muestras con células A549 expuestas a 5 µg/cm2 (Fig. 20D) y 10 µg/cm2 de TiO2 NPs
en forma de NS (Fig. 20E) presentaron una señalización positiva dentro del M. Sin
embargo, la concentración más alta de TiO2 NPs en forma de NS la señalización positiva
se presentó en una mayor extensión dentro del M casi alcanzando el ED. Las células
A549 expuestas a 10 µg/cm2 de TiO2 NPs en forma de NB dieron una señalización
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positiva dentro del M abarcando gran parte del mismo, incluso alcanzando el ED (Fig.
20F).

Fig. 20. Proliferación de las células A549 dentro de la CAM utilizando Gli1. A) Estructura norma de la
CAM. B) células A549 no expuestas a TiO2 NPs. La flecha señala a las células A549 en el ET. C) células
expuestas a 1 µg/cm2 de TiO2 NPs proliferando por debajo del ET, la flecha indica la ubicación de las células.
D) células A549 expuestas a 5 µg/cm2 proliferando dentro del M formando pequeños cúmulos de células
señalado por la flecha. E) señalización positiva de células A549 expuestas a 10 µg/cm2 de TiO2 NPs
proliferando dentro del M. F) células expuestas a 10 µg/cm2 de TiO2 NPs en donde se observa señalización
positiva dentro del M hasta el ED. Fig. A, B, C yD células expuestas a TiO2 NPs en forma de NS. Fig. F
células expuestas a TiO2 NPs en forma de NB.

El segundo marcador de proliferación utilizado fue Ki-67 en donde se observó de manera
normal el ET, M y ED que forman la CAM (Fig. 21A). Las células A549 que no fueron
expuestas a TiO2 NPs dieron poca señalización positiva en el ET (Fig. 21B). Muestras con
células A549 que fueron expuestas a 1 Y 5 µg/cm2 de TiO2 NPs tuvieron la capacidad de
atravesar el ET y proliferar dentro del M ya que la señalización positiva se observó en esta
segunda capa (Fig. 21C y D). Las muestras con células A549 que fueron expuestas a 10
µg/cm2 de TiO2 NPs en forma de NS, dieron una señalización positiva de proliferación
dentro del M abarcando gran parte del mismo en comparación con las concentraciones
anteriores. La proliferación de las células A549 expuestas a 10 µg/cm2 de TiO2 NPs en
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forma de NB se observó más diseminada dentro del M, incluso llegando al ED en
comparación con la misma concentración de TiO2 NPs en forma de NS (Fig. 21F).
Estos resultados con los diferentes tipos de marcadores de proliferación revelan que la
concentración y la forma de las TiO2 NPs influye en el proceso proliferativo de las células
A549.

Fig. 21. Proliferación de las células A549 dentro de la CAM utilizando Ki-67. A) Estructura normal de la
CAM. B) células A549 no expuestas a TiO2 NPs, la flecha señala la proliferación por debajo del ET. C) células
A549 expuestas a 1 µg/cm2 de TiO2 NPs en forma de NS, la flecha señala la proliferación dentro del M. D)
células A549 expuestas a 5 µg/cm2 de TiO2 NPs en forma de NS, la flecha señala la proliferación de las
células A549 a lo largo del M. E) células A549 expuestas a 10 µg/cm2 de TiO2 NPs en forma de NS, la flecha
señala la proliferación de las células A549 dentro del M. F) células A549 expuestas a 10 µg/cm2 de TiO2 NPs
en forma de NB, se observa tinción positiva en gran parte del M. Se realizaron tres experimentos
independientes. CAM, membrana corioalantoide; TiO2 NPs, nanopartículas de dióxido de titanio; ET,
ectodermo; M, mesodermo; ED, endodermo; NS nanoesferas; NB nanocintas.

7.9 Cuantificación del marcador de proliferación Gli1
La cuantificación del área teñida positivamente con el marcador de proliferación Gli1
demostró que existe una tendencia de incrementar la proliferación de las células A549
expuestas a TiO2 NPs. Los resultados demostraron que conforme las concentraciones de
TiO2 NPs en forma de NS aumentan, la proliferación de las células A549 es mayor dentro
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de la CAM. Sin embargo, en la cuantificación del área teñida positivamente dentro de la
CAM se observó que la concentración de 10 µg/cm2 de TiO2 NPs en forma de NB tuvo
una tendencia a disminuir pero no presenta diferencias significativas (Fig. 22).

Fig. 22. Cuantificación de Gli1. La grafica demuestra la cuantificación de la proliferación de las células A549
dentro de la CAM una vez expuestas a diferentes concentraciones de TiO2 NPs en forma de NS y NB. Se
puede observar una tendencia a incrementar la proliferación cuando las células son expuestas a 1,5 y 10
µg/cm2 de TiO2 NPs en forma de NS. Además, se observa que hay una disminución de la proliferación cuando
las células A549 son expuestas a TiO2 NPs en forma de NB. *p<0.5 (Media Error Estándar).

7.10 Cuantificación del marcador de proliferación Ki67
Los resultados de la cuantificación del área teñida positivamente con Ki67 demostraron
que hay un incremento en la proliferación de las células A549 dentro de la CAM. Las
diferentes concentraciones con las cuales fueron expuestas las células A549 tuvieron una
tendencia a incrementar la proliferación de las células A549. Sin embargo, las
concentraciones de 5 y µg/cm2 de TiO2 NPs en forma de NS y de 10 µg/cm2 de TiO2 NPs
en forma de NB tuvieron diferencias significativas (Fig. 23).

Fig. 23. Cuantificación de Ki-67. Los resultados demostraron que las diferentes concentraciones de TiO2
NPs en forma de NS tuvieron una tendencia a incrementar la proliferación de las células A549. La
concentración de 10 µg/cm2 de TiO2 NPs en forma de NB fue diferentemente significativa en comparación con
las células no expuestas a TiO2 NPs.*p<0.5 (Media Error Estándar).

8. DISCUSIÓN
La nanotecnología sigue creciendo a un ritmo constante y rápido. En la última década se
han identificado más de 1,300 productos comerciales habilitados por la nanotecnología
disponibles a nivel mundial. Además, se ha estimado que estos productos aumentarán
hasta 3,400 para el año 2020 (Olson et al., 2012).
Los nanomateriales que están siendo utilizando en diferentes productos son producidos a
un ritmo que supera la investigación y la regulación de los mismos. Estos dos últimos
rubros son de gran importancia para poder prevenir posibles daños a la salud humana y al
ambiente.
Se ha estimado un importante incremento en el número de trabajadores involucrados en
la producción de los nanomateriales a 6 millones para el 2020. Este número creciente de
trabajadores están potencialmente expuestos a los nanomateriales en laboratorios de
investigación, empresas de creación, instalaciones de producción y operaciones en donde
se procesan los nanomateriales (NIOSH, 2013).
Sin embargo, las propiedades de las NPs (por ejemplo el tamaño, área superficial,
reactividad) que producen muchas mejoras en los productos pueden ser grandes
amenazas para la salud.
Más del 50% de los productos de la nanotecnología incluyen NPs de plata, seguido de
carbono (incluyendo fulerenos), de titanio (incluyendo TiO2), de sílice, de zinc, (incluyendo
ZnO) y oro (Olson et al., 2012).
Las investigaciones acerca de las respuestas biológicas que ocasionan las TiO2 NPs
demuestran los efectos toxicológicos. Sin embargo, poco se ha estudiado si existe una
relación entre las TiO2 NPs y el proceso de invasión migración y proliferación de células
de adenocarcinoma de pulmón, aunado a que la principal vía de exposición a las NPs es
la vía inhalatoria, el cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte en
muchos países (GLOBOCAN, 2012). Por esta razón es de nuestro interés estudiar la
relación entre las TiO2 NPs y las respuestas que se puedan generar al estar expuestos a
las TiO2 NPs de manera ocupacional principalmente. Una de las formas en las cuales se
pueden estudiar los efectos asociados a la exposición inhalatoria, es por medio de
sistemas in vitro.
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Para este estudio se utilizaron células de adenocarcinoma de pulmón de la línea A549
(neumocitos de tipo II). Las células A549 son células epiteliales

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